ES2320052T3 - Biomoleculas derivadas del polietilenglicol y su empleo en procedimientos heterogeneos de deteccion. - Google Patents
Biomoleculas derivadas del polietilenglicol y su empleo en procedimientos heterogeneos de deteccion. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBE LA UTILIZACION DE REACTIVOS MODIFICADOS CON OXIDO DE POLIALQUILENO EN PROCEDIMIENTOS PARA LA DETECCION DE UN ANALITO O EN EQUIPOS DE REACTIVOS APROPIADOS PARA TALES PROCEDIMIENTOS.
Description
Biomoléculas derivadas del polietilenglicol y su
empleo en procedimientos heterogéneos de detección.
La invención se refiere a procedimientos
heterogéneos para la detección de un analito en una muestra, y los
kits de reactivos apropiados para dichos procedimientos.
Los procedimientos para la detección de un
analito en una muestra en los cuales se emplea una fase sólida,
reciben el nombre de formatos de ensayo heterogéneos. Un problema
que se presenta en dichos procedimientos consiste en que a menudo
tiene lugar en la fase sólida una unión no específica de los
componentes de la muestra o de reactivos del ensayo, por lo cual
pueden obtenerse falsos resultados del ensayo. En particular, se
observan a menudo estas uniones no específicas en las muestras de
líquidos corporales, por ejemplo, el suero o el plasma. Para
impedir estas uniones no específicas, existe la posibilidad de
añadir a los reactivos, substancias tensioactivas como por ejemplo
el Tween 20 (WO88/07683). Es conocida además la funcionalización de
superficies metálicas (Whitesides et al., Science 252
(1991), 1164-1166) y de superficies oxidadas
(EP-A-O 664 452), con derivados
reactivos del polietilenglicol, para minimizar la unión no
específica sobre la superficie.
El estado actual de la técnica para la
disminución de la unión no específica de sustancias tensioactivas
tiene la desventaja de que suprime las moléculas unidas a la fase
sólida, por ejemplo receptores de fase sólida, y de esta manera
perjudican la función de ensayo. Además como sustancias
tensioactivas se emplean por regla general tensioactivos para
detergentes obtenidos de la gran industria, los cuales en su
composición son heterogéneos y ocasionalmente contienen impurezas.
Las oscilaciones de carga resultantes de esto, conducen a menudo a
trastornos y a resultados no reproducibles. Además, moléculas en
fase sólida sensibles, por ejemplo las proteínas, pueden ser
alteradas en su estructura mediante las sustancias tensioactivas, y
finalmente son desnaturalizadas.
La funcionalización conocida a partir del estado
actual de la técnica de superficies metálicas u oxidadas, con
polietilenglicol, está por un lado limitada a determinadas clases de
superficies, y por otra parte, no es suficiente para inhibir la
unión no específica con una capa de biomoléculas aplicada sobre la
superficie de la fase sólida.
La tarea que está en la base de la presente
invención consiste por lo tanto en poner a punto un nuevo
procedimiento para disminuir la unión no específica en una fase
sólida en la detección de un analito en una muestra, en el cual
procedimiento se puedan evitar las desventajas del estado actual de
la técnica.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un procedimiento heterogéneo para la detección de un
analito en una muestra, el cual procedimiento comprende los pasos
siguientes:
(a) Preparación de una fase sólida, que
comprende en una forma inmovilizada, unos reactivos en fase sólida
específicos para un analito, y una biomolécula no específica para el
analito, la cual está copulada con un polialquilenóxido de 2 a 3
átomos de carbono, en donde la fase sólida está recubierta con un
primer socio de un par de unión altamente afín en el cual un
conjugado del reactivo en fase sólida específico del analito, está
inmovilizado con el segundo socio del par de unión, y en donde como
biomolécula no específica del analito se emplea una substancia de
bloqueo, que comprende el segundo socio del par de unión, el cual se
escoge de los conjugados de fórmula estructural general (Ia) ó
(Ib):
- P_{r}[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ia)
- P_{r}-I-[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ib)
en
donde
P es biotina o un derivado de biotina,
I es una biomolécula no específica para el
analito,
r es un número de 1 al 10,
AO es un grupo alquilenóxido de 2 a 3 átomos de
carbono,
n es un número de 5 a 500,
T es un grupo terminal, de preferencia escogido
entre OH, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono y acilo de 1 a 4
átomos de carbono, y
m es un número de 1 a 10,
(b) incubación de la muestra con la fase sólida
y un reactivo de ensayo, y
(c) detección de la existencia o/y de la
cantidad de analito en la muestra.
Mediante el bloqueo de la fase sólida con un
polialquilenóxido, en particular con una biomolécula no específica
del analito modificada con polietilenglicol, pudo alcanzarse una
clara disminución de la unión no específica de componentes de la
muestra en la fase sólida, sin que al mismo tiempo se perjudicara
significativamente la sensibilidad del ensayo. La adición del
reactivo de bloqueo puede efectuarse durante o/y después de la
inmovilización de los reactivos de la fase sólida. Es
particularmente preferida una fase sólida previamente recubierta
con un reactivo de fase sólida específico del analito bloqueada
posteriormente con una biomolecula no específica del analito.
Se obtuvieron buenos resultados con el empleo de
fases sólidas, las cuales tenían "superficies de ensayo
limitadas", es decir con regiones limitadas recubiertas de
reactivos de fase sólida, las cuales están separadas espacialmente
por otras superficies de ensayo. Son particularmente preferidas las
fases sólidas planas recubiertas con un recubrimiento previo no
específico del analito, por ejemplo con estreptavidina, las cuales
contienen por lo menos una superficie localmente limitada,
inmovilizada sobre un reactante en fase sólida específico del
analito. Las superficies de ensayo limitadas tienen de preferencia
un diámetro de 10 \mum hasta 10 mm. Son particularmente
preferidas las superficies de ensayo miniaturizadas con un diámetro
de 10 \mum a 2 mm. Además, son preferidas las fases sólidas con
varias superficies de ensayo las cuales pueden contener diferentes
reactivos de fase sólida específicos del analito y también como
sistemas conjunto (ver por ejemplo las patentes US 5.432.099;
5.516.635 y 5.126.276). Con estos sistemas conjuntos se pueden
efectuar simultáneamente varias determinaciones analíticas en una
muestra.
La fase sólida en el procedimiento según la
invención, comprende un soporte cualquiera, el cual se prefiere que
sea un soporte no poroso, por ejemplo un soporte con superficie de
plástico, de vidrio, de metal u óxido metálico. También son
apropiados los soportes porosos como por ejemplo, las tiras de
ensayo.
Sobre la fase sólida se inmoviliza un reactante
de fase sólida específico del analito es decir una biomolécula, la
cual puede efectuar una interacción específica con el analito que se
va a determinar, o -en el caso de un formato de ensayo competitivo-
con un análogo del analito que se va a determinar. Ejemplos de
reactantes de fase sólida específicos para el analito son los
anticuerpos, antígenos, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos,
análogos de ácidos nucleicos, glico-proteínas,
sacáridos, lipoproteínas y otras biomoléculas.
La inmovilización de un reactante de fase sólida
se efectúa mediante la copulación con pares de unión altamente
afines. Para ello la fase sólida se recubre en primer lugar con un
primer socio de un par de unión altamente afín, y a continuación se
inmoviliza un conjugado del reactante de fase sólida con el segundo
socio del par de unión. Ejemplos de pares de unión altamente afines
son la estreptavidina o la avidina/biotina, o un derivado de la
biotina (por ejemplo destiobiotina, iminobiotina, aminobiotina, u
otra substancia capaz de unirse con alta afinidad a la
estreptavidina o a la avidina). Con particular preferencia se emplea
como par de unión de alta afinidad, la estreptavidina o la avidina/
biotina.
El procedimiento según la invención comprende el
bloqueo de sitios de unión no específicos sobre la fase sólida ya
recubierta con el reactante de fase sólida específico del analito,
mediante incubación con una molécula de unión modificada con
alquilenóxido, la cual actúa como sustancia de bloqueo. El tiempo de
duración y la temperatura de la incubación puede variar dentro de
amplios márgenes, por ejemplo las temperaturas e incubación son de
4ºC a 40ºC y los tiempos de incubación de 1 minuto hasta 1 hora.
Como sustancias de bloqueo se emplean
biomoléculas no específicas para el analito o respectivamente
biomoléculas inertes, las cuales son capaces de unirse con la fase
sólida y no interfieren con el procedimiento de detección, por
ejemplo proteínas como albúminas, anticuerpos no específicos o
fragmentos de los mismos, o polisacáridos como la dextrina, etc..
La unión de la sustancia de bloqueo con la fase sólida tiene lugar
mediante pares de unión altamente afines. Se emplea una sustancia
de bloqueo la cual comprende el segundo socio del par de unión, por
ejemplo una proteína biotinilada que contiene uno o más radicales
polioxialquilenóxido. Alternativamente se prefiere también el
empleo de sustancias de bloqueo mediante las cuales se copula uno o
varios radicales de polialquilenóxido directamente al segundo socio
del par de unión. El segundo socio del par de unión es la biotina o
un derivado de la biotina.
Las sustancias de bloqueo son conjugados con la
fórmula estructural general (Ia) ó (Ib):
- P_{r}[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ia)
- P_{r}-I-[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ib)
en
donde
P es biotina o un derivado de biotina,
I es una biomolécula no específica del
analito,
r es un número de 1 a 10,
AO es un grupo alquilenóxido de 2 a 3 átomos de
carbono,
n es un número de 5 a 500,
T es un grupo terminal de preferencia escogido
entre OH, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono y acilo de 1 al 4
átomos de carbono, y
m es un número de 1 a 10.
I es de preferencia un polipéptido o sacárido.
En los conjugados de fórmula (Ia), r es de preferencia 1.
AO puede ser un grupo alquilenóxido de 2 a 3
átomos de carbono, es decir, un grupo etilenóxido o/y un grupo
propilenóxido. De preferencia, AO es un grupo etilenóxido aunque
también las combinaciones de grupos etilenóxido y propilenóxido son
apropiadas. n es de preferencia un número de 10 a 250, y con
particular preferencia, de 20 a 200.
T es un grupo terminal (inclusive el último
átomo de O de las unidades de polialquilenóxido), el cual es
compatible con otros componentes del ensayo y de la muestra, es
decir no efectúa reacciones significativas que molestan. De
preferencia, T es un grupo hidroxilo, un grupo alquiléter de 1 a 4
átomos de carbono, en particular metoxilo, o un grupo acilo de 1 a
4 átomos de carbono, por ejemplo, un grupo acetilo. En los
conjugados de fórmula estructural (Ia), m es de preferencia 1.
Los conjugados según la fórmula estructural (Ia)
y (Ib) se emplean de preferencia como reactivos de bloqueo en el
procedimiento de detección. Después de la inmovilización sobre una
fase sólida ya no están de preferencia, en situación de unirse
mediante el componente P, formando una unión altamente afín con
biomoléculas disueltas en la muestra o en el reactivo de
ensayo.
Otro objeto de la invención, es una fase sólida
con un recubrimiento que contiene uno o varios conjugados (Ib) y de
preferencia un reactante de fase sólida específico para el analito.
Los conjugados según la invención pueden emplearse para la
disminución de la unión no específica con una fase sólida en un
procedimiento para la detección de un analito, por ejemplo en un
procedimiento inmunológico o un procedimiento de hibridación de
ácidos nucleicos. Otro objeto del primer aspecto de la presente
invención es un kit de reactivos para la detección de un analito,
el cual junto con otros componentes de ensayo contiene un conjugado
según la invención (Ib) ó una fase sólida según la invención.
En una versión particularmente preferida, se
emplean compuestos de biotina-polietilenglicol, en
los cuales se trata de cadenas de polietilenglicol, las cuales
están funcionalizadas en un extremo de la cadena con un radical de
biotina. El otro extremo de la cadena lleva de preferencia un grupo
hidroxilo o un grupo metoxilo. Los conjugados
biotina-poli-etilenglicol se aplican
sobre una fase sólida de estreptavidina después o al mismo tiempo
con un reactante biotinilado de fase sólida específico para el
analito, por ejemplo, un anticuerpo. El conjugado se une en los
puntos de unión de la biotina libres, todavía accesibles de la fase
sólida de la estreptavidina. El conjugado
biotina-polietilenglicol, no unido, puede ser
eliminado por lavado. La fase sólida resultante puede secarse en
este estado, sin que se produzca un perjuicio a la función. La unión
no específica de una superficie tratada con un conjugado según la
invención está, en comparación con una superficie no tratada o en
comparación con una superficie tratada con una sustancia de bloqueo
no modificada con alquilenóxido, fuertemente disminuida. Otra
ventaja es que, la fase sólida según la invención puede ser tratada,
también después de la aplicación del reactivo de fase sólida, con
el conjugado de bloqueo, y con ello puede proveerse de las
propiedades deseadas. En las fases sólidas, las cuales presentan
superficies de ensayo limitadas y un recubrimiento previo
ininterrumpido, se ha encontrado tanto en el interior de las
superficies que ensayo como también en el exterior de estas
superficies de ensayo (por ejemplo fase sólida de estreptavidina
vacía) una clara reducción de la unión no específica. La
posibilidad de la fase sólida de unirse al analito queda
sorprendentemente sin ser afectada.
Un segundo aspecto de la presente invención es
un procedimiento heterogéneo para la detección de un analito en una
muestra, el cual procedimiento comprende los pasos:
(a) Preparación de una fase sólida, sobre la
cual está inmovilizado un reactante de fase sólida mediante un par
de unión altamente afín, en donde se emplea un reactante de fase
sólida universal modificado, el cual está copulado con un
polialquilenóxido de 2 a 3 átomos de carbono,
(b) incubación de la muestra con la fase sólida
y un reactivo de ensayo, y
(c) detección de la existencia o/y de la
cantidad de analito en la muestra.
Según este segundo aspecto de la invención, se
inmoviliza un reactante de fase sólida modificado con un
polialquilenoxido, sobre la fase sólida. El reactante modificado de
fase sólida es un reactante universal de fase sólida, es decir un
reactante inmovilizado sobre la fase sólida mediante un par de unión
altamente afín, el cual no reacciona específicamente con el analito
sino que puede reaccionar con otro reactante de fase sólida.
Ejemplos de reactantes de fase sólida universal son por ejemplo la
estreptavidina o anticuerpos anti-hapteno, los
cuales pueden reaccionar con otro reactivo de fase sólida,
específico para el analito, biotinilado o conjugado con hapteno.
Además el reactante de fase sólida específico para el analito puede
ser también un reactivo de fase sólida modificado con
polialquilenóxido.
Un reactivo de fase sólida universal modificado
puede ser por ejemplo, un socio de un par de unión altamente afín,
o conjugado de una biomolécula no específica para el analito con un
socio de un par de unión altamente afín. Ejemplos de reactivos de
fase sólida universales que representan también el socio de un par
de unión altamente afín, son polipéptidos como la estreptavidina,
avidina, anticuerpos específicos de hapteno, lectinas y conjugados
polímeros de los mismos. Por otro lado, se puede emplear también un
conjugado de una biomolécula no específica para el analito con un
socio de un par de unión altamente afín como reactivo de fase sólida
universal, por ejemplo un polipéptido inerte o un polisacárido
cópulado con biotina, derivados de la biotina, haptenos, o
azúcares.
También en el empleo de un reactante de fase
sólida modificado específico para el analito, se trata de un
conjugado con un socio de un par de unión altamente afín. Ejemplos
de dichos receptores de fase sólida modificados específicos para un
analito son los anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos, análogos
de ácidos nucleicos y lectinas, específicos para un analito.
Además, la invención se demuestra con los
siguientes ejemplos.
Se disolvieron 550 mg de
1-amino-polietilenglicol (de la
firma Shearwater Polymers), en 10 ml de dioxano. A esta solución se
añadieron 60 mg de trietilamina y a continuación, 100 mg de
biotina-OSu-éster (de la firma Boehringer
Mannheim). La mezcla se agitó durante 2,5 horas a temperatura
ambiente. A continuación se purificó el producto mediante una
columna cromatográfica. El rendimiento fue del 30%.
Se disolvieron 150 mg de
aminometoxi-polietilenglicol (de la firma Sigma) en
100 ml de dioxano y a continuación se mezclaron con 2 g de
biotina-OSu-éster, disuelto en 60 ml de DMF. Después
de la adición de 40 mg de trietilamina, se agitó durante 3 horas a
temperatura ambiente, y otras 3 horas a 70ºC. A continuación se
evaporaron los disolventes y el producto se purificó mediante una
columna cromatográfica. El rendimiento fue del 57%.
Sobre una fase sólida de estreptavidina
(p-estireno re-cubierta con una
albúmina de suero bovino (RSA) térmicamente polimerizado, se
aplicaron mediante una técnica de
micro-dosificación, anticuerpos biotinilados
dirigidos contra la TSH, en forma de superficies con un diámetro de
aproximada-mente 0,1 mm. Esta fase sólida, después
de la aplicación de las superficies de anticuerpos, fue
ulteriormente tratada con tampón de fosfato de pH 7,5, el cual
contenía 50 \mug/ml de Bi-polietilenglicol.
Después de una incubación de 2 minutos se lavó y se secó.
La fase sólida obtenida según el procedimiento
descrito en el ejemplo 3, se valoró con el siguiente sistema:
después de la incubación con material de la muestra exento de
analito (suero humano exento de p24, ó respectivamente Enzymun®-TSH
O-standard), y el subsiguiente paso de lavado, se
incubaron las fases sólidas incubadas con suero humano, con
reactivo de detección digoxigenilado (conjugado
p24-Dig, así como con el conjugado anticuerpo IgG
anti-humano-Dig). Los reactivos
digoxigenilados no son específicos frente a los anticuerpos
anti-TSH, es decir, no contienen ningún analito,
aunque representan marcadores para la magnitud del enlace no
específico. Después de un paso de lavado la unión no específica se
determinó mediante un látex coloreado por fluorescencia marcado con
anticuerpos anti-Dig. Las señales obtenidas mediante
las técnicas de fluorescencia microscópica, fueron cuantificadas
con una evaluación óptica de la imagen, y expresadas en
cuentas/segundo. Se midió la intensidad de la fluorescencia en el
interior de las superficies de ensayo (con anticuerpos TSH
biotinilados) así como en el exterior de las superficies de ensayo
(fondo sin recubrimiento de anticuerpos).
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos, la adición de
Bi-PEG conduce a una clara disminución de la unión
no específica sobre la fase sólida.
Se disuelven la estreptavidina y el
PEG-OSu en tampón de fosfato, y se unen en la
correspondiente estequiometría, de preferencia 1:1 a 1:5. Después
de 2 horas de reacción a temperatura ambiente (?) se dializó la
mezcla de reacción frente a tampón de fosfato con azida de sodio
0,05% y se almacenó a 4ºC.
Se llenó un recipiente de reacción con una
solución que contenía proteína soporte biotinilada
(RSA-biotina o Thermo RSA-biotina),
en una concentración de 100 \mug/ml, y se incubó durante cinco
minutos a temperatura ambiente. A continuación se separó la
solución por aspiración y el recipiente de reacción recubierto con
tampón de fosfato, se enjuagó y se aspiró de nuevo.
A continuación se añadió
estreptavidina-PEG en una concentración de 50
\mug/ml en tampón de fosfato con RSA 1%, y se incubó durante 15
minutos. A continuación se separó la solución por aspiración y se
lavó mediante la adición de tampón de fosfato con RSA 1% y sacarosa
2%. Después de una nueva separación por aspiración, y secado, se
almacenó la fase sólida a 4ºC en un envase hermético al aire.
Se llenó un recipiente de reacción con una
solución que contenía proteína soporte biotinilada en una
concentración de 100 \mug/ml, y se incubó durante cinco minutos.
Se separó la solución mediante aspiración, se enjuagó con tampón de
fosfato y de nuevo se separó por aspiración. A continuación se
añadió estreptavidina-PEG (50 \mug/ml) en tampón
de fosfato con RSA 1% y se incubó durante 15 minutos. La solución se
separó por aspiración, se enjuagó con tampón de fosfato y de nuevo
se separó por aspiración.
A continuación se añadió una anticuerpo
biotinilado, por ejemplo un fragmento Fab'_{2} de anticuerpo anti
TSH monoclonal, y se incubó durante 15 minutos. La solución se
separó por aspiración, mediante adición de tampón de fosfato con
RSA 1%, saca-rosa 2%, y se separó de nuevo por
aspiración. Después de secar se almacenó la fase sólida a 4ºC en un
envase hermético al aire.
Un recipiente de reacción con la fase sólida del
ejemplo 6 ó 7, se incubó a temperatura ambiente con una muestra
exenta de analito previamente diluida (suero de caballo 1:1 diluido
con tampón de carga 50 mM de Tris/HCl pH 7,5, 0,5% de RSA, 0,05% de
Tween 20, 0,9% de NaCl) durante 20 minutos. Después de lavar, se
incubó durante 20 minutos en presencia de un conjugado anticuerpo
de señal (1 \mug/ml de conjugado IgG anticuerpo anti TSH
monoclonal - digoxigenina, en tampón de carga) y se lavó de
nuevo.
Después de la adición de reactivo de detección
(solución 0,01% de perlas de flúor recubiertas con IgG anticuerpo
anti-digoxigenina monoclonal), se incubó durante 20
minutos, se lavó y se midió la señal de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Un recipiente de reacción con la fase sólida del
ejemplo 6 ó 7, se llenó, como se ha descrito en el ejemplo 8.2, con
una muestra de suero de caballo, y se lavó. A continuación se
añadieron 0,2 \mug/ml de p24-digoxigenina en
tampón de carga, se incubaron durante 20 minutos, y se lavó. A
continuación se añadió el reactivo de detección (véase 8.1), de
nuevo se incubó durante 20 minutos, se lavó y se midió la señal de
fluorescencia. Los resultados están resumidos en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Un recipiente de reacción con las fases sólidas
obtenidas en el ejemplo 6 y 7, se llenó como se ha descrito en
8.1, con una muestra, y se lavó. La muestra era suero humano,
diluido 1:19 con tampón de carga.
A continuación se añadió 1,0 \mug/ml de
conjugado anticuerpo IgG antihumano monoclonal - digoxigenina, en
tampón de carga, y se lavó. A continuación se añadió el reactivo de
detección, se incubó durante 20 minutos, se lavó de nuevo, y se
midió la señal de fluorescencia. Los resultados están resumidos en
la siguiente tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
La obtención de conjugados
PEG-anticuerpos tuvo lugar como se ha descrito en el
ejemplo 5, a excepción de que en lugar de la estreptavidina se
emplea un anticuerpo biotinilado.
\vskip1.000000\baselineskip
Un recipiente de reacción, con una solución, la
cual contenía 100 \mug/ml de proteína soporte biotinilada
(RSA-biotina o tRSA-biotina), se
incubó durante 5 minutos. A continuación se separó la solución por
aspiración, se enjuagó con tampón de fosfato y se separó de nuevo
por aspiración.
A continuación se añadieron 50 \mug/ml de
estreptavidina en tampón de fosfato con RSA 1%, y se incubaron
durante 15 minutos. Esta solución se separó por aspiración, se
enjuagó con tampón de fosfato, y se separó de nuevo por aspiración.
A continuación se añadieron 5 \mug/ml de anticuerpo IgG
biotinilado, por ejemplo un fragmento de anticuerpo Fab'_{2} anti
TSH monoclonal, y se incubó durante 15 minutos. La solución se
separó por aspiración, y se efectuó un paso de enjuagado con tampón
de fosfato, RSA 1%, sacarosa 2%. Después de separar de nuevo por
aspiración se secó el recipiente de reacción y se almacenó a 4ºC en
un envase hermético al aire.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de un blanco de la fase sólida
obtenida en el ejemplo 10 tuvo lugar como se ha descrito en el
ejemplo 8.1. Los resultados están resumidos en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión no específica de componentes del tampón
con la fase sólida obtenida en el ejemplo 10 se determinó como se
ha descrito en el ejemplo 8.2. Los resultados están resumidos en la
tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la unión no específica de
anti-cuerpos IgG humanos de la fase sólida obtenida
en el ejemplo 10, tuvo lugar como se ha descrito en el ejemplo 8.3.
Los resultados están resumidos en la tabla 8 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Sobre un soporte de poliestireno, se aplicó
sobre una superficie de ensayo de aproximadamente 100 \mum de
diámetro, un antígeno, el cual representaba e1 gp41 del virus
HIV-I. Sobre la superficie de ensayo se pipetearon
30 \mul de muestra previamente diluida con tampón de muestra, y se
incubaron durante 20 minutos con agitación a temperatura ambiente.
Después de separar por absorción la muestra y lavar el campo de
ensayo con tampón de lavado se pipetearon 30 \mul de solución de
reactivo con un antígeno del HIV I representante del gp41 marcado
con Dig, y de nuevo se incubó durante 20 minutos con agitación a
temperatura ambiente. Después de separar por aspiración la solución
de reactivo y lavar el campo de ensayo con tampón de lavado, se
pipetearon 30 \mul de reactivo de detección sobre el campo de
ensayo. Como reactivo de detección se utilizaron partículas de
látex de un tamaño de 100 nm coloreadas por fluorescencia, las
cuales están recubiertas covalentemente con un anticuerpo
anti-dig.
Este reactivo de detección se incubó de nuevo
durante 20 minutos con agitación a temperatura ambiente, a
continuación se separó por aspiración, se lavó y se secó por
aspiración. El campo del ensayo se irradió con un láser
He-Ne con una longitud de onda de 633 nm, y la
fluorescencia se midió a una longitud de onda de 670 nm con una
cámara CCD.
Se emplearon los siguientes reactivos
específicos del ensayo:
Antígeno de fase sólida: polihapteno del péptido
gp41
Antígeno de detección: polihapteno del péptido
gp41, marcado con dig.
Se midieron los siguientes valores de medición
(cuentas):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla anterior muestra de nuevo un fragmento
de un estudio de especificidad. En este estudio se midieron
aproximadamente 240 <HIV I> muestras negativas. La mayor parte
de las muestras (por ejemplo, las muestras negativas
1-4), no mostraron ninguna reacción sobre los campos
de ensayos y fueron con ello claramente negativas. De todas formas
se encontraron 4 muestras (muestras negativas 5-8),
que mostraron una fuerte reacción no específica sobre los campos de
ensayo y por ello fueron detectados como falsos positivos.
\newpage
Ejemplo
13
En este estudio se efectuó un ensayo <HIV
I> análogo al ejemplo 12. A diferencia del mismo, se aplicó
sobre el idéntico soporte de ensayo junto al antígeno HIV I
adicionalmente, un antígeno idéntico, el cual había sido
derivatizado en la relación estequiométrica 1:1 con PEG 500.
Se obtuvieron los siguientes valores de
medición:
Este resultado muestra que la unión no
específica de las muestras que producen perturbaciones en la
superficie de ensayo <HIV I>, se reduce drásticamente
mediante el empleo del nuevo antígeno derivatizado con PEG, de
manera que las 4 muestras que perturban son negativas.
Sorprendentemente la derivatización con PEG puede conducir incluso
a un fuerte aumento de la señal de las muestras positivas (ver
control positivo y muestra positiva 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre un soporte de poliestireno se aplicó a una
superficie de ensayo de aproximadamente 100 \mum de diámetro, un
anticuerpo monoclonal contra el antígeno HBs. En otra superficie de
ensayo se aplicó el mismo anticuerpo en forma de un conjugado con
PEG (obtención según el ejemplo 9). Sobre la superficie de ensayo se
pipetearon a continuación 30 \mul de la muestra diluida
previamente con tampón de muestra, y se incubó durante 20 minutos
con agitación a temperatura ambiente. Después de separar por
aspiración la muestra y lavar la superficie de ensayo con tampón de
lavado, se añadieron, pipeteando, 30 \mul de solución de reactivo
con anticuerpo anti HBsAg marcado con digoxigenina, y de nuevo se
incubó durante 20 minutos con agitación a temperatura ambiente.
Después de separar por aspiración la solución y los lavados de la
superficie de ensayo con tampón de lavado, se pipetearon 30 \mul
de reactivo de detección (ejemplo 8.3) sobre la superficie de
ensayo.
La detección tuvo lugar como se ha descrito en
el ejemplo 8.1.
Fueron investigados un estándar positivo, un
estándar negativo, así como cinco sueros negativos, que no contenían
ningún HBsAg, pero en el ensayo sin embargo dieron unas señales
significativamente positivas las cuales se atribuyen a
interacciones específicas del analito con la fase sólida. En la
tabla 9 están resumidos los resultados de estos estudios. Es
claramente evidente, que las uniones no específicas con los
anticuerpos derivatizados con PEG, fallan mucho menos que con los
anticuerpos sin tratar.
Claims (8)
1. Procedimiento heterogéneo para la detección
de un analito en una muestra, el cual procedimiento comprende los
pasos:
(a) preparación de una fase sólida que comprende
en forma inmovilizada un reactivo de fase sólida específico para el
analito, y una biomolécula específica para el analito, que está
copulada con un polialquilenóxido de 2 a 3 átomos de carbono, en
donde la fase sólida está recubierta con un primer socio de un par
de unión altamente afín, en la cual un conjugado del reactivo de
fase sólida específico para el analito está inmovilizado con el
segundo socio del par de unión, y en donde como biomolécula
específica para el analito se emplea una sustancia bloqueante la
cual comprende el segundo socio del par de unión, y se elige de los
conjugados de fórmula estructural general (Ia) ó (Ib):
- P_{r}[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ia)
- P_{r}-I-[-(AO_{n})T]_{m}
- (Ib)
en
donde
P es biotina o un derivado de biotina,
I es una biomolécula no específica para el
analito,
r es un número de 1 al 10,
AO es un grupo alquilenóxido de 2 a 3 átomos de
carbono,
n es un número de 5 a 500,
T es un grupo terminal escogido de preferencia
entre OH, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono y acilo de 1 al 4
átomos de carbono, y
m es un número de 1 a 10,
(b) incubación de la muestra con la fase sólida
y un reactivo del ensayo, y
(c) detección de la existencia o/y de la
cantidad de analito en la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
se emplea una fase sólida, la cual presenta por
lo menos una superficie de ensayo limitada.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o
2,
caracterizado porque,
se emplea una substancia bloqueante en la cual
uno o varios radicales polialquilenóxido están copulados
directa-mente al segundo socio del par de
unión.
4. Conjugado de fórmula estructural general
(Ib):
(Ib)P_{r}-I-[-(AO_{n})T]_{m}
en
donde
P es biotina o un derivado de biotina,
I es una biomolécula no específica para el
analito,
r es un número de 1 a 10,
AO es un grupo alquilenóxido de 2 a 3 átomos de
carbono,
n es un número de 5 a 500,
T es un grupo terminal escogido de preferencia
entre OH, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono y acilo de 1 al 4
átomos de carbono, y
m es un número de 1 a 10.
5. Fase sólida con un recubrimiento que contiene
un conjugado según la reivindicación 4.
6. Empleo de un conjugado según la
reivindicación 4, para la disminución de la unión no específica con
una fase sólida en un procedimiento heterogéneo para la detección
de un analito.
7. Kit de reactivos para la detección de un
analito, el cual junto a otros componentes del ensayo contiene un
conjugado según la reivindicación 4, ó una fase sólida según la
reivindicación 5.
8. Procedimiento heterogéneo para la detección
de un analito en una muestra, el cual procedimiento comprende los
pasos:
(a) preparación de una fase sólida sobre la cual
está inmovilizado un reactivo de fase sólida mediante un par de
unión altamente afín, en donde se emplea un reactivo de fase sólida
universal modificado, el cual está copulado con un
polialquilenóxido de 2 a 3 átomos de carbono,
(b) incubación de la muestra con la fase sólida
y un reactivo de ensayo, y
(c) detección de la existencia o/y de la
cantidad del analito en la muestra.
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