CN110637027A - 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开总体上涉及包含与药代动力学增强子连接的非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽，如修饰的人松弛素2多肽，以及这样的多肽的治疗用途，例如用于治疗心血管病症(例如心力衰竭)和/或与纤维化相关的病症。

Description

包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途
相关申请公开
本申请要求2018年2月7日提交的美国临时申请号62/627,411和2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456,161的优先权，将以上列出的所有申请的公开内容通过提述完整并入本文。
序列公开
本申请包括作为其公开内容的一部分的生物序列表，其被包含在名称为“46561o2413.txt”的文件中，大小为150,746字节，建立于2018年2月8日，将其通过提述完整并入本文。
公开背景
本公开总体上涉及包含药代动力学增强子(pharmacokinetic enhancer)的修饰的松弛素多肽，如修饰的人松弛素2多肽，以及这样的多肽的治疗用途，如用于治疗心血管病症(例如心力衰竭)和/或与纤维化相关的病症。在示例性实施方案中，药代动力学增强子与非天然编码氨基酸连接，所述氨基酸可以通过核糖体掺入到松弛素多肽中。
心力衰竭(HF)对当今的医疗保健体系来说是一个巨大的负担，据估计美国的患病率为580万，而全世界超过2300万(Roger et al.,2012.Circulation,125(1):e2-e220)。HF的症状是心输出量不足的结果，视疾病晚期阶段的情况而定可能导致虚弱。HF的主要症状和体征包括：1)呼吸困难(在呼吸方面的困难)，这是由于来自左心室的无效前向流和肺毛细血管床压力增高导致肺水肿所致；2)下肢水肿，当右心室不能适应全身静脉回流时出现；3)疲劳，这是由于心脏衰竭不能维持足够的心输出量以满足身体的新陈代谢需要所致(Kemp&Conte,2012.Cardiovascular Pathology,21:365-371)。
许多促因性疾病、风险因子和病理变化可能最终导致心力衰竭(Jessup&Brozena,2003.N Engl J Med,348(20):2007-2018)。被认为涉及HF的病理生理学的伤害事件的范围包括非常急性(如心肌梗死)到更长期的损伤(如终生高血压)。死亡率仍然很高，其中约50％的HF患者在诊断后5年内濒临死亡(Roger等人，2012.Circulation,125(1):e2-e220；Roger等人，2004.Jama,292(3):344-50)。心力衰竭显然存在突出的未满足的医疗需求。
人松弛素2激素(也称为H2松弛素)是由53个氨基酸组成的6-kDa肽，已知其在分娩前负责重塑生殖道，从而促进分娩过程。虽然松弛素主要是妊娠激素，但在非怀孕女性和男性中也检测到松弛素。人松弛素是胰岛素肽家族的成员，胰岛素肽家族包括胰岛素、许多胰岛素样肽(INSL3-6)和胰岛素样生长因子(IGFI和IGFII)(Van Der Westhuizen et al.,2007.Curr Drug Targets,8(1):91-104)。这些异二聚体肽在结构上都是相关的，每种肽均由两条通过两个二硫键连接的肽链(A和B)组成，并且A链含有单个分子内二硫键。松弛素2(H2)的受体，称为松弛素家族肽受体1(RXFP1)，在小鼠和人之间是保守的，具有85％的氨基酸同一性，并且基本上在人和其他物种中普遍表达(Halls et al.,2007.Br J Pharmacol,150(6):677-91)。
在人类妊娠期间，为了满足胎儿对其施加的营养需求，女性身体的全身血管阻力(SVR)显著降低约30％，伴随心输出量增加约50％(Jeyabalan,2010:Renal andElectrolyte Disorders.Lippincott Williams&Wilkins.462-518；Clapp and Capeless,1997.Am J Cardiol,80(11):1469-73)。其他血管适应改变包括全局动脉顺应性增加约30％，这对于维持有效的心室-动脉偶联是重要的；以及肾血流量(RBF)和肾小球滤过率(GFR)两者都增加约50％，这对于代谢废物消除是重要的(Jeyabalan,2010:Renal andElectrolyte Disorders.Lippincott Williams&Wilkins.462-518；Poppas et al.,1997.Circulation,95(10):p.2407-15)。在啮齿动物中的临床前研究以及在各种患者环境中进行的临床研究都提供证据证明，松弛素至少在一定程度上涉及介导这些适应性生理变化(Conrad,2011.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,301(2),R267-275；Teichman et al.,2009.Heart Fail Rev,14(4),321-329.)。这些适应性反应中的许多可能对HF患者有益，因为过度纤维化、动脉顺应性差和肾功能差都是心力衰竭患者常见的特征(Mohammed et al.,2015.Circulation,131(6),550-559),(Wohlfahrt et al.,2015.Eur J Heart Fail,17(1),27-34；Dammon et al.,2011.Prog Cardiovasc Dis,54(2),144-153)。据估计，30％的HF患者具有中度至重度肾功能损害(Triposkiadis和Skoularigis，2012.Curr Heart Fail Rep,(4):354-62)，通过改善血流和电解质处理，诸如松弛素等药剂对于HF患者可能特别有益。
松弛素肽具有短的药代动力学半衰期：Serelaxin，一种开发用于治疗HF的重组人松弛素肽，具有5-15分钟的短的第一相药代动力学半衰期，并且为了治疗效用需要48小时连续静脉注射(REASANZ(serelaxin)Briefing Document Prepared by Novartis for FDACardiovascular and Renal Drugs Advisory Committee Meeting.February 26,2014)。对于像心力衰竭之类的慢性疾病，具有改善的药代动力学特征的松弛素分子提供了除了连续静脉内输注之外的替代药物施用途径的机会，其可能更适合作为患有慢性疾病的患者的治疗剂。
发明概述
本文中提供了包含非天然编码氨基酸的经修饰的松弛素多肽，其中(a)松弛素多肽包含松弛素A链多肽SEQ ID NO:4和松弛素B链多肽SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，其在选自下组的位置被非天然编码氨基酸取代：A链残基1、A链残基2、A链残基5、A链残基13、A链残基18、B链残基5、B链残基7和B链残基25，并且任选地在所述松弛素A链和/或所述松弛素B链中具有最多两个另外的氨基酸取代、插入和/或缺失；(b)所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中R基团是除在丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸中发现的侧链以外的任何取代基；并且(c)所述非天然编码氨基酸与药代动力学增强子连接，所述药代动力学增强子包含2至30个氨基酸的肽组分和延长半衰期的模块。
本文中还提供了包含AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的修饰的松弛素多肽，其具有以下结构：
其中所述AQ1-松弛素包含与SEQ ID NO:35具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素A链多肽和与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素B链多肽，其中式III中描绘的修饰的对-乙酰基-苯丙氨酸位于所述松弛素A链多肽的N末端。
本文中还提供了包含AQ1-松弛素-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的修饰的松弛素多肽，其具有本文所述的式III的结构，其中AQ1-松弛素包含松弛素A链多肽SEQID NO:35和松弛素B链多肽SEQ ID NO:6，其中式III中描绘的修饰的对-乙酰基-苯丙氨酸位于所述松弛素A链多肽的N末端。
本文中还提供了包含图8所示结构的修饰的松弛素多肽。
本文中还提供了包含图9所示结构的修饰的松弛素多肽。
在另一方面，本文中提供了包含如本文所述的修饰的松弛素多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本文中提供了包含有效量的用于治疗松弛素相关疾患的如本文所述的修饰的松弛素多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本文中提供了治疗与松弛素相关的疾病的方法，其包括施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了治疗心血管疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了治疗或减轻心力衰竭症状的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了治疗与纤维化相关的疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了治疗或预防肾衰竭的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了改善、稳定或恢复有此需要的患者的肾功能的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本文中提供了制造如本文所述的修饰的松弛素多肽的方法，其包括：(a)提供包含所述松弛素A链和所述松弛素B链的多肽，其中所述多肽包含所述非天然编码氨基酸；和(b)将所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接。
若干附图视图简述
图1.不含非天然编码氨基酸的人松弛素2多肽的序列。A链(SEQ ID NO:4)和B链(SEQ ID NO:6)多肽如图5描绘通过二硫键连接。已观察到相对于人松弛素2多肽B链(SEQID NO:5)修饰B链中的位置1(下划线位置，如所示用天冬氨酸被丙氨酸取代)可改善制造，而不会给效力造成显著的不利影响。在本文的工作实施例中，该多肽被称为“野生型”或WT-RLX。
图2.一种人松弛素2多肽RLX-AQ1(“AQ1”)的序列，其中A链位置1被非天然编码氨基酸对-乙酰基-苯丙氨酸(pAcF，下划线)取代。A链(SEQ ID NO:35)和B链(SEQ ID NO:6)在如图5描绘的位置通过二硫键连接。
图3.一种人松弛素2多肽RLX-BM25/AN1(“BM25/AN1”)的序列，其中B链位置25被非天然编码氨基酸对-乙酰基-苯丙氨酸(pAcF，下划线)取代，并且进一步地A链位置1含有谷氨酰胺到天冬酰胺的取代(取代下划线)。A链(SEQ ID NO:36)和B链(SEQ ID NO:37)在如图5描绘的位置通过二硫键连接。
图4.用于表达RLX-AQ1的前原松弛素多肽的示意图。前原松弛素多肽(SEQ ID NO:38)在大肠杆菌或另一个表达系统中表达。非天然编码氨基酸例如pAcF可以经核糖体掺入到前原松弛素多肽序列中，从而便于随后与药代动力学增强子(“PK延长剂”)连接。灰色圆形指示对大肠杆菌表达特异的前导序列。黑色圆形指示C肽(连接肽)，其衍生自胰岛素原，且添加有肽切割位点和Lys至Gly的取代。通过酶切割(通过未标记的箭头指示的切割位点)去除前导序列和C肽。B链残基1(“B1”)处的丙氨酸取代(存在于SEQ ID NO:6中)有助于去除前导序列。指示了供位点特异性PK增强子附接的pAcF残基。A链和B链可与名为RLN2的HUGO比对，它们衍生自松弛素2转录物变体1cDNA(refseq NM_134441)。
图5.包含A链(SEQ ID NO:36)和B链(SEQ ID NO:6)的成熟RLX-AQ1的结构描绘，其通过A链位置1的非天然编码氨基酸与药代动力学增强子(“PK延长剂”)连接。
图6A-6B.WT-RLX(图6A)和AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH(图6B)对TGF-β处理的人心脏成纤维细胞中平滑肌α-肌动蛋白基因表达的变化的影响，其中mRNA浓度使用qRT-PCR测量。竖条上方的数字指示相对于TGF-β的降低百分比，其中将单独的溶媒设定为基线。均值±SEM；*P<0.05。Veh＝溶媒。nM＝纳摩尔。
图7A-7D.雌性Sprague Dawley大鼠中PEG相关的肾皮质小管上皮空泡形成。来自每天一次用载体或松弛素类似物皮下(SQ)处理的大鼠的肾脏。含有PEG的松弛素类似物(图7B和7C)显示出明显的皮质小管空泡形成，其特征为大的聚结空泡的存在。在溶媒(图7A)或非聚乙二醇化松弛素(图7D)处理的动物中未观察到空泡。图7A：用载体(在pH 5.5的10mM柠檬酸盐缓冲液中的150mM Arg)皮下处理10天。图7B：用AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH(1.5kDPEG)以40mg/kg/天皮下处理7天。图7C：用AQ1-20-kDa-PEG(20kD PEG)以15mg/kg/天皮下处理10天。图7D：用AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH以40mg/kg皮下处理7天。放大40倍，H&E。
图8.描绘在式III中的AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的结构。
图9.描绘在式III中的AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的结构。
发明详述
定义
如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确地指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“松弛素”、“松弛素多肽”或“修饰的松弛素多肽”是指一种或多种这样的蛋白质，并且包括本领域普通技术人员已知的其等同物，等等。
除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“药代动力学延长剂”、“药代动力学增强子”、“PK延长剂”和“PK增强子”可互换使用，均指这样的药学上可接受的模块、结构域或分子，其与本文所述的修饰的松弛素多肽共价连接(“缀合”或“融合”)，任选地通过非天然编码氨基酸连接；与比较对象，例如未缀合形式的修饰的松弛素多肽或野生型松弛素多肽相比，其可防止、延迟或减轻修饰的松弛素多肽的体内蛋白水解降解或其他减弱活性的化学修饰，增加半衰期(血清半衰期和/或治疗半衰期)，和/或改善或改变其他药代动力学或生物物理特性，包括但不限于增加修饰的松弛素多肽的吸收速率、降低毒性、改善溶解度、减少聚集、增加生物活性和/或靶选择性、和/或降低修饰的松弛素多肽的免疫原性。本文所述的PK增强子可包括包含一个或多个氨基酸的肽组分和半衰期延长模块。
术语“半衰期延长模块”是指这样的药学上可接受的模块、结构域或分子，其直接地或通过接头(例如肽组分或PEG)与本文所述的修饰的松弛素多肽共价连接(“缀合”或“融合”)，任选地通过非天然编码氨基酸共价连接，例如作为PK延长剂的组分；与比较对象(例如未缀合形式的修饰的松弛素多肽或野生型松弛素多肽)相比，其增加半衰期(血清半衰期和/或治疗半衰期)，和/或改善或改变其他药代动力学或生物物理特性，包括但不限于增加修饰的松弛素多肽的吸收速率、降低毒性、改善溶解度、减少聚集、增加生物活性和/或靶选择性、增加可制造性，和/或降低修饰的松弛素多肽的免疫原性。半衰期延长模块一词包括但不限于非蛋白质性的半衰期延长模块，例如脂肪酸或其衍生物、水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或离散PEG、羟乙基淀粉(HES)、脂质、支链或非支链酰基、支链或非支链C8-C30酰基、支链或非支链烷基和支链或非支链C8-C30烷基；蛋白质性半衰期延长模块，例如血清白蛋白、转铁蛋白、adnectin(如白蛋白结合性或药代动力学延长(PKE)adnectin)、Fc结构域和非结构化多肽，例如XTEN和PAS多肽(例如由氨基酸Pro、Ala和/或Ser组成的构象无序的多肽序列)和任何前述者的片段。术语“接头”或“间隔物”可以是任何将半衰期延长模块与修饰的松弛素多肽连接的组分。示例性接头包括但不限于小有机化合物，各种长度的水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)或聚葡聚糖，以及例如具有长度为至多50、40、30、25、20、15、10个或至多6个氨基酸的肽或多肽。
术语“肽组分”是指PK延长剂的组分，并且包含长度为至多50个氨基酸的肽。示例性肽组分包括但不限于长度为至多40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的肽。这样的肽组分可以将半衰期延长模块与本文所述修饰的松弛素多肽共价连接。在一些实施方案中，肽组分可包含2-50个氨基酸。在一些实施方案中，肽组分可包含2-30个氨基酸。在一些实施方案中，肽组分可包含3-20个氨基酸。在一些实施方案中，肽组分可包含5-10个氨基酸。
术语“稳定性”或“热稳定性”是指多肽在被加热时抵抗解折叠的能力。通常，分子的热稳定性越高，多肽解折叠所需的温度就越高。确定多肽的热稳定性的示例性方法是差示扫描量热法(DSC)和热扫描荧光法。可以相对于比较对象化合物来确定热稳定性，例如，以鉴定具有增加的热稳定性的多肽。
术语“聚集”是指多肽与其他分子(例如相同多肽的其他分子)形成非共价连接的复合物从而形成高分子量复合物的趋势。测量聚集体形成的示例性方法包括分析型尺寸排阻色谱法。可以相对于比较对象化合物来确定相对聚集量，例如，以鉴定具有减少的聚集的多肽。
术语“脱酰胺”是指多肽内的氨基酸残基自发地经历脱酰胺反应由此改变氨基酸的化学结构并可能影响多肽的功能的倾向。测量脱酰胺作用的示例性方法包括成像毛细管等电聚焦(icIEF)。可以相对于比较对象化合物来确定脱酰胺的相对量，例如，以鉴定具有减少的脱酰胺的多肽。
术语“体内蛋白水解”是指当多肽被引入活体系统时(例如，当注射到生物体中时)可能由所述生物体中存在的蛋白酶引起的切割。蛋白水解可能潜在地影响多肽的生物活性或半衰期。例如，野生型松弛素可能经历切割，产生截短的无活性多肽。测量松弛素的体内蛋白水解的示例性方法是基于Meso Scale Discovery(MSD)的电化学发光免疫吸附测定(ECLIA)。可以相对于比较对象化合物来确定体内蛋白水解的相对量，例如，以鉴定具有减少的体内蛋白水解的多肽。
术语“溶解度”是指一种物质可以溶解在另一种物质中的量，例如可以溶解在水溶液中的未修饰或修饰的松弛素多肽的量。测量未修饰或修饰的松弛素多肽的溶解度的示例性方法是活塞流溶解度测试。可以相对于比较对象化合物来确定相对溶解度，例如，以鉴定具有增加的溶解度的多肽。
术语“生物学活性”或“生物活性”是指分子影响与生物有关的生物系统、途径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的能力，所述生物包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。例如，在未修饰或修饰的松弛素的背景下，生物活性包括由松弛素执行的任何功能。例如，“生物活性”修饰的松弛素多肽可以表现出野生型松弛素的一种或多种生物活性，包括但不限于：包括人和非人RXFP1直向同源物在内的松弛素2受体RXFP1的活化、包括人和非人直向同源物在内的另一种松弛素受体例如RXFP2的活化、体外或体内抗纤维化活性、治疗心力衰竭或纤维化疾病的功效(无论是在人类、非人类动物和/或模型系统中)以及本文中公开的其他生物活性，例如，降低全身血管阻力(SVR)，增加心输出量，增加总体动脉顺应性，增加肾血流量(RBF)和/或肾小球滤过率(GFR)。确定分子是否具有野生型松弛素(例如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的野生型松弛素多肽)的至少一种生物活性的示例性方法可包括体外活性测定法或受体结合测定法，例如，细胞内cAMP积累测定法。可以相对于比较对象化合物确定生物活性的相对水平，例如，鉴定具有生物活性或具有用于预期治疗用途的足够高的生物活性的多肽，例如其在体外或体内活性测定法中具有相对于比较物的EC50高出不到5倍、10倍、不到20倍、不到50倍或不到100倍的EC50。
本文所述的比较对象化合物可以是缺乏修饰(例如本文所述的修饰)的另一个序列。例如，比较对象化合物可以是未与PK延长剂连接的相同的修饰的松弛素多肽序列。示例性的比较对象化合物包括但不限于具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的野生型松弛素多肽、具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的修饰的松弛素多肽、具有SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:6的修饰的松弛素多肽、具有SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:6的修饰的松弛素多肽或另一种比较对象化合物。在一些实施方案中，比较对象化合物可含有至少一个非天然编码氨基酸，其可与接头、聚合物、生物活性分子、肽、多肽或本文所述的半衰期延长模块(例如PEG或脂肪酸)连接。在一些实施方案中，比较对象化合物可含有至少一个非天然编码氨基酸，其可以与或可以不与接头、聚合物、生物活性分子、肽、多肽或本文所述的半衰期延长模块连接。在一些实施方案中，比较对象化合物可含有另外的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，可以用多肽的酰化或非酰化形式进行比较；在前一种情况下，可以用包含或不包含非天然编码氨基酸的多肽进行比较。
术语“对应”是指多肽或多核苷酸序列内通过与参考序列比较而鉴定的位置(“对应的位置”或“对应位置”)或区域(“对应的区域”或“对应区域”)。参考序列可以是野生型或未修饰的序列，例如具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的野生型松弛素多肽。可以通过序列与参考序列的比对来鉴定对应的位置或区域。例如，“对应于松弛素A链中氨基酸1的位置”是指当序列与SEQ ID NO:4比对时，所述序列中与SEQ ID NO:4中的氨基酸1在同一比对列中的位置。在比对中，氨基酸或核苷酸与参考序列中对应位置的氨基酸或核苷酸可以匹配或不匹配。
使用常规比对算法，例如Blast(Altschul等人，J Mol Biol.1990 Oct 5；215(3):403-10)、Smith-Waterman(Smith和Waterman,J Mol Biol.1981 Mar 25；147(1):195-7)或Needleman-Wunsch(Needleman和Wunsch,J Mol Biol.1970Mar；48(3):443-53)，可以获得用于鉴定对应位置或对应区域的比对。为了获得评分最高的全局比对(即，包含两个序列中的每个残基的比对，但比对可以从空位开始和/或结束)，可以使用Needleman-Wunsch算法。无论是使用Blast、Smith-Waterman还是Needleman-Wunsch，都可以使用“默认”参数来鉴定最高评分比对，例如使用BLOSUM62评分矩阵、空位开放罚分11、空位延伸罚分1和(当使用Blast进行成对比对时)字大小3。
术语“与纤维化相关的疾病”包括这样的疾病、疾患和病症，其中已经观察到纤维化发生，或已知或认为纤维化关联或促成疾病病因、进展或症状，或已知或认为纤维化随着疾病的进展而发生。纤维化可以影响器官或组织，例如胰腺、肺、心脏、肾、肝、眼、神经系统、骨髓、淋巴结、心肌内膜或后腹膜。与纤维化相关的示例性疾病包括但不限于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、前肝硬化、肝硬化、弥漫性实质性肺疾病、囊性纤维化、肺或肺部纤维化、进行性大块纤维化、特发性肺纤维化、注射纤维化、肾或肾的纤维化、慢性肾病、糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾病、IgA肾病、骨髓纤维化、心力衰竭、代谢性心力衰竭、心肌纤维化、白内障纤维化、白内障、眼部瘢痕形成、胰腺纤维化、皮肤纤维化、肠纤维化、肠狭窄、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵隔纤维化、克罗恩病、腹膜后纤维化、瘢痕疙瘩、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、Peyronie综合征、杜普伊特伦(Dupuytren)挛缩、糖尿病神经病变、粘连性关节囊炎、酒精性肝病、肝脂肪变性、病毒性肝炎、胆道疾病、原发性血色素沉着症、药物相关性肝硬化、隐源性肝硬化、威尔逊(Wilson)病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、间质性肺病(ILD)、人纤维化肺病、黄斑变性、视网膜视网膜病变、玻璃体视网膜病变、心肌纤维化、格雷夫斯(Grave)眼病、药源性麦角中毒、心血管疾病、动脉粥样硬化/再狭窄、肥厚性瘢痕、原发性或特发性骨髓纤维化和炎性肠病(包括但不限于胶原性结肠炎)。在一些实施方案中，与纤维化相关的疾病可包括肝纤维化、肾或肾的纤维化、肺或肺的纤维化、以及心脏或心脏的纤维化。在一些实施方案中，与纤维化相关的疾病可以是肝纤维化。在一些实施方案中，与纤维化相关的疾病可以是NASH。
术语“基本上纯化的”是指未修饰或修饰的松弛素多肽，其可基本上或实质上不含通常伴随在其天然存在的环境(即幼稚细胞)或在重组产生的未修饰或修饰的松弛素多肽的情况下的宿主细胞中发现的蛋白质或与所述蛋白质相互作用的组分。可以基本上不含细胞物质的未修饰或修饰的松弛素多肽包括蛋白质的制剂，其具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(干重或湿重)的污染蛋白质。因此，通过本公开的方法产生的“基本上纯化的”未修饰或修饰的松弛素多肽可具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体地说，至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更具体地至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更高的纯度水平，正如通过适当的方法例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳确定的。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包含外源多核苷酸的细胞，而不管用于插入的方法如何，例如，直接摄取、转导、f-交配或本领域已知的建立重组宿主细胞的其他方法。外源多核苷酸可以被维持为非整合载体例如质粒的形式，或者可以整合到宿主基因组中。
如本文中使用的，术语“真核生物”是指属于系统发育域真核生物域(Eucarya)的生物，例如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文中使用的，术语“非真核生物”是指非真核的生物或原核生物。例如，非真核生物可以属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等)系统发育域，或古细菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、盐杆菌属例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和盐杆菌属物种NRC-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrumpernix等)系统发育域。
如本文中使用的，术语“培养基”或“介质”包括可以支持或含有任何宿主细胞以及细胞内容物的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支持物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌宿主细胞。因此，该术语可涵盖其中已经生长宿主细胞的培养基，例如其中已经分泌未修饰或修饰的松弛素多肽的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。该术语还可涵盖含有宿主细胞裂解物的缓冲液或试剂，例如在未修饰或修饰的松弛素多肽在细胞内产生并且将宿主细胞裂解或破坏以释放未修饰或修饰的松弛素多肽的情况下。
如本文中使用的，术语“松弛素”是指人松弛素，特别是人松弛素2(也称为H2松弛素或RLN2)，除非上下文另有指示，其氨基酸序列和空间结构是熟知的。人松弛素由通过二硫键交联的二十四个氨基酸的A链和二十九个氨基酸的B链组成(参见图5)。正确交联的野生型松弛素含有三个二硫桥：一个位于A链的位置11和B链的位置11之间，第二个位于A链的位置24和B链的位置23之间，第三个位于A链的位置10和15之间。
如本文中使用的，“修饰的松弛素多肽”或“修饰的松弛素”可互换使用，包括与野生型松弛素(例如，具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的野生型人松弛素)不同并且通常具有松弛素2的至少一种生物活性的那些多肽和蛋白质，以及松弛素类似物、松弛素同种型、松弛素模拟物、多态性(例如，天然存在的松弛素序列变体)、松弛素片段、杂合松弛素蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、其同源物、糖基化模式变体、变体、剪接变体和突变蛋白。术语“修饰的松弛素多肽”和“修饰的松弛素”包括包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的松弛素多肽。
可以在天然存在的松弛素中的众多氨基酸位置引入取代，以产生修饰的松弛素多肽。取代包括但不限于调节溶解度或稳定性、增加激动剂活性、增加体内或体外半衰期、增加蛋白酶抗性、降低免疫原性或毒性、促进纯化或可制造性等的取代，并且为术语“修饰的松弛素多肽”或“修饰的松弛素”所涵盖。在一些实施方案中，本文所述的非天然编码氨基酸取代可与修饰的松弛素多肽内的其他添加、取代或缺失组合以影响修饰的松弛素多肽相对于另一种松弛素多肽(例如，具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的野生型松弛素多肽，或另一种松弛素多肽例如没有所述添加、取代或缺失的相同的松弛素多肽，或另一种未修饰或修饰的松弛素或未修饰或修饰的多肽)的生物学性状。在一些实施方案中，其他添加、取代或缺失可以增加修饰的松弛素多肽的稳定性(包括但不限于对蛋白水解降解的抗性)或增加修饰的松弛素多肽对其受体的亲和力。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可以增加修饰的松弛素多肽的药物稳定性。在一些实施方案中，其他添加、取代或缺失可以增加修饰的松弛素多肽的溶解度(包括但不限于，当在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达时)，增加可制造性或减少聚集。在一些实施方案中，添加、取代或缺失可以增加多肽在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后的溶解度。在一些实施方案中，可以选择用天然编码或非天然氨基酸取代的位点，此外还有用于掺入非天然氨基酸导致多肽在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后溶解度增加的另一位点。
在一些实施方案中，修饰的松弛素多肽进一步包含调节所述修饰的松弛素多肽的生物活性的另外的插入、取代或缺失。例如，添加、取代或缺失可以调节修饰的松弛素的一种或多种特性或活性。例如，添加、取代或缺失可调节对松弛素多肽受体、结合蛋白或相关配体的亲和力，调节与松弛素受体结合后的信号转导，调节体内或循环半衰期，调节治疗半衰期，调节所述多肽的稳定性，调节蛋白酶的切割，调节剂量，调节释放或生物利用度，促进纯化，减少脱酰胺作用，减少聚集，改善保质期或体外半衰期，或改善或改变特定的给药途径。类似地，修饰的松弛素多肽可包含蛋白酶切割序列、反应基团、抗体结合结构域(包括但不限于FLAG或多聚组氨酸(poly-His))或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、谷胱甘肽-S转移酶(GST)等)或改善所述多肽的检测(包括但不限于GFP)、纯化或其他性状的连接分子(包括但不限于生物素)。
术语“修饰的松弛素多肽”还包括天然存在的松弛素的生物活性片段、生物活性变体和立体异构体以及天然存在的松弛素的激动剂、模拟物和拮抗剂变体及其多肽融合物。在氨基末端、羧基末端或两者处包含另外的氨基酸的融合物被术语“修饰的松弛素多肽”涵盖。示例性融合物包括但不限于例如甲硫氨酰松弛素，其中甲硫氨酸与松弛素A链和/或B链的N末端连接，所述松弛素A链和/或B链由缺乏前导序列或信号肽的松弛素的成熟形式或其部分的重组表达产生(例如，甲硫氨酸与例如在大肠杆菌中重组表达产生的松弛素A链和/或B链的N末端连接)；用于纯化目的的融合物(包括但不限于多聚组氨酸或亲和表位)；具有血清白蛋白结合肽(例如PKE adnectin)的融合物和具有血清蛋白(例如血清白蛋白)的融合物；以及包含松弛素和一种或多种其他分子(“融合配偶体”)的融合蛋白，所述其他分子包括但不限于血清白蛋白、Fc结构域、免疫球蛋白恒定区、非结构化多肽和adnectin及其片段。任何这样的片段可以通过标准生物化学方法从蛋白质制备或通过表达编码所述片段的多核苷酸加以制备。
除非另外指出，否则如本文中使用的术语“松弛素多肽”和“松弛素”涵盖未修饰的(即野生型)松弛素和修饰的松弛素多肽。
术语“修饰的松弛素多肽”包括与聚合物(例如PEG或PK增长剂)缀合的多肽，并且任选地包含一个或多个半胱氨酸、赖氨酸或其他残基的衍生化。在一些实施方案中，修饰的松弛素多肽可包含接头、聚合物或PK延长剂，其中与接头、聚合物或PK延长剂缀合的氨基酸可以是根据本公开的非天然氨基酸或利用本领域已知的技术(例如与赖氨酸或半胱氨酸偶联)的天然编码氨基酸(例如赖氨酸或半胱氨酸)。
术语“修饰的松弛素多肽”还包括通过松弛素多肽中的天然编码氨基酸(例如半胱氨酸或赖氨酸)与本文所述的PK延长剂缀合或连接的松弛素多肽。在一些实施方案中，天然编码氨基酸可以是松弛素多肽中的取代或插入。
术语“修饰的松弛素多肽”还包括糖基化修饰的松弛素，例如但不限于在任何氨基酸位置糖基化的多肽、多肽的N-连接或O-连接糖基化形式。另外，还包括剪接变体。
除非另有说明，否则本文中所有对未修饰或修饰的松弛素中氨基酸位置的提述均基于SEQ ID NO:4的A链或SEQ ID NO:5的B链中的对应位置。本领域技术人员将理解的是，可以容易地鉴定任何其他松弛素分子(例如松弛素融合物、变体、片段等)中的与SEQ IDNO:4或5或另一个松弛素序列中的位置对应的氨基酸位置。例如，可以使用序列比对程序(例如BLAST)来比对和鉴定蛋白质中与SEQ ID NO:4或5或其他松弛素序列中的位置对应的特定位置。参考SEQ ID NO:4或5或其他松弛素序列，本文所述氨基酸取代、缺失或添加还预期在本文所述或本领域中已知的松弛素融合物、变体、片段等中的对应位置的取代、缺失或添加，并且被本公开明确地涵盖。
术语“修饰的松弛素多肽”还涵盖经由融合配偶体(例如Fc结构域)形成或连接的同二聚体、异二聚体、同源多聚体和异源多聚体，所述连接包括但不限于经由非天然编码氨基酸侧链(相同或不同的非天然编码氨基酸侧链)、天然编码氨基酸侧链直接连接，或经由接头间接连接。示例性接头包括但不限于小有机化合物，各种长度的水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)或聚葡聚糖，或者例如具有长度为至多50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2个或至多1个氨基酸的肽或多肽。
如本文中使用的，术语“修饰的”是指对给定多肽进行的任何改变，例如多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变、多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。术语“翻译后修饰的”是指在天然或非天然氨基酸掺入多肽链中之后发生在这个氨基酸上的任何修饰。仅作为示例，该术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(例如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
“非天然编码氨基酸”是指“氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸之一的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然氨基酸”、“非自然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”，以及它们的各种带连字符和非带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”还包括但不限于这样的氨基酸，它们通过天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)的修饰(例如翻译后修饰)而发生，但它们本身并不天然地通过翻译复合物掺入到增长的多肽链中。这样的非天然编码氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
在修饰的松弛素多肽的背景下，如本文中使用的术语“对-乙酰基-苯丙氨酸”和“对-乙酰基-L-苯丙氨酸”(包括缩写pAcF和pAF)也包括这样的化学反应产物，所述产物中对位的乙酰基不存在，取而代之的是与另一分子的连接。因此，例如，在包含对-乙酰基-苯丙氨酸(例如对-乙酰基-L-苯丙氨酸)的修饰的松弛素多肽中，对-乙酰基-苯丙氨酸可以在对位上包含肟、三唑、酰胺或其他连接，例如在对位上具有由对-乙酰基-L-苯丙氨酸的羰基与氨氧基反应而产生的肟连接，而且没有羰基碳。这样的对-乙酰基-苯丙氨酸可以称为“修饰的对-乙酰基-苯丙氨酸”，例如“修饰的对-乙酰基-L-苯丙氨酸”。
示例性非天然编码氨基酸是对-乙酰基-苯丙氨酸(pACF)。可以使用先前在Zhang,Z.,Smith,B.A.C.,Wang,L.,Brock,A.,Cho,C.&Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)42,6735-6746中描述的程序合成该氨基酸，将该文献通过提述完整并入本文。
“氨基末端修饰基团”是指可以附接至多肽的氨基末端的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基团”是指可以附接至多肽的羧基末端的任何分子。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、甲硫氨酸、肽或蛋白质，例如血清白蛋白、Fc结构域、免疫球蛋白恒定区、非结构化多肽、adnectin或其片段、脂肪酸或其衍生物，或增加多肽的血清(体内)半衰期的其他模块。
术语“官能团”、“活性模块”、“活化基团”、“离去基团”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性模块”在本领域和本文中用于指分子中明显可区分的、可限定的部分或单元。这些术语在化学领域中在一定程度上是同义的，并且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性、并且能够与其他分子反应的部分。
术语“连接”在本文中用于指通常通过化学反应形成的基团或键，并且典型地是共价连接。水解稳定的连接表示所述连接在水中基本上是稳定的，并且在有用的pH值下(包括但不限于在生理条件下长时间，甚至可能无限期地)不与水反应。水解不稳定或可降解的连接表示所述连接可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的连接表示所述连接可被一种或多种酶降解。如本领域所理解的，PEG、脂肪酸和其他聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接基团中可包括可降解连接。例如，可以通过羧酸或活化的羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯连接通常在生理条件下水解以释放所述生物活性剂。其他可水解降解的连接包括但不限于碳酸酯键；亚胺键，可以由胺和醛的反应产生；磷酸酯键，可以通过使醇与磷酸基反应形成；腙键，可以是酰肼和醛的反应产物；缩醛键，可以是醛和醇的反应产物；原酸酯键，可以是甲酸酯和醇的反应产物；肽键，可以由包括但不限于在聚合物的末端的胺基和肽的羧基形成；肟或缩氨基脲键，可以是羰基官能团和含羟胺、或含氨基脲的试剂的反应产物；和寡核苷酸键，可以由包括但不限于在聚合物末端的亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5'羟基形成。
在取代基通过它们的常规化学式加以详细说明的情况下，将其从左到右书写，它们同样涵盖从右到左书写结构所产生的化学上相同的取代基，例如，结构CH2O等价于结构-OCH2。本文中提供的组合物可包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子取代。本文中提供的组合物可包括异构体，包括但不限于非对映异构体、对映异构体及其混合物，例如L-氨基酸和/或D-氨基酸(例如对乙酰基-D-苯丙氨酸和/或对-乙酰基-L-苯丙氨酸)。
术语“取代基”包括但不限于“非干扰性取代基”。“非干扰性取代基”是产生稳定化合物的那些基团。适合的非干扰性取代基或基团包括但不限于卤素、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、取代的苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧烷基、C2-C12烷氧芳基、C7-C12芳氧烷基、C7-C12氧芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)，其中m是1-8，芳基、取代的芳基、取代的烷氧基、氟烷基、杂环基、取代的杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫代烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)—CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)，其中m各自是1至8，--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2，其盐，等等。本文中使用的R各自是H、烷基或取代的烷基、芳基或取代的芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，表示直链或支链或环状烃基或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括具有指定碳原子数的二价和多价基团(即C1-C10表示1-10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同源物和异构体等基团。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级的同源物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意指包括下面更详细定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基称为“同烷基”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分表示衍生自烷烃的二价基团，例如但不限于，结构–CH2CH2和–CH2CH2CH2CH2–，并且进一步包括下面描述为“杂亚烷基(heteroalkylene)”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团是本文所述方法和组合物的特定实施方案。“低级烷基”或“低级亚烷基”是链较短的烷基或亚烷基，通常具有8个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其传统意义加以使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分附接的那些烷基。
除非另有说明，术语“杂烷基”单独或与另一术语组合，是指由所述数目的碳原子和至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链或环烃基或其组合，所述杂原子选自O、N、Si和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且氮杂原子任选地被季铵化。杂原子O、N和S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子的其余部分附接的位置。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如像-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分表示衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，相同或不同的杂原子也可占据链末端的任一个或两个(包括但不限于亚烷氧基、亚烷二氧基(alkylenedioxy)、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基(aminooxyalkylene)等)。更进一步地，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向并非由书写连接基团的化学式的方向来暗示。例如，式–C(O)2R’表示–C(O)2R’和R’C(O)2两者。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和的、部分不饱和的和完全不饱和的环连接。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子的其余部分附接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，该术语包括二环和三环结构。类似地，术语“杂环亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分表示衍生自杂环烷基的二价基团，术语“环亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分表示衍生自环烷基的二价基团。
除非另有说明，术语“芳基”表示多不饱和芳族烃取代基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多个环(包括但不限于1至3个环)。术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的其余部分附接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基的组。
为简洁起见，当术语“芳基”与其他术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时，其包括如上定义的芳基环和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意指包括其中芳基与烷基(包括但不限于苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)附接的那些基团，包括其中碳原子(包括但不限于亚甲基)已经被例如氧原子替换的那些烷基(包括但不限于，苯氧甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述术语中的每一个(包括但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括所指示的基团的取代和未取代形式。以下提供每种基团类型的示例性取代基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是多种基团中的一种或多种，其选自但不限于下列基团：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、NR C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、NRSO2R’、-CN和–NO2，数目范围为0至(2m’+1)，其中m'是这种基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当多于一个的这些基团存在时，每个R基团独立地选自各个R’、R”、R’”和R””基团。当R'和R”与同一个氮原子附接时，它们可与氮原子结合形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上述对取代基的讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括包括与氢基团以外的基团键合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括但不限于-CF3和–CH2CF3)和酰基(包括但不限于-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于针对烷基描述的取代基，芳基和杂芳基的取代基是多种多样的，并且选自但不限于：卤素、OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、OC(O)R’、-C(O)R’、CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、NR C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、NRSO2R’、-CN和–NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量范围为0至芳环体系上的开放价总数；其中R’、R”、R”’和R””独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当多于一个的这些基团存在时，每个R基团独立地选自各个R’、R”、R’”和R””基团。
术语“脂肪酸”是指具有6-20个碳原子的饱和或不饱和的酰基链或其衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸可以与本文所述的PK增强子的肽组分连接，并以羧酸或甲基封端。在一些实施方案中，与PK增强子的肽组分连接的脂肪酸可以以羧酸封端。在一些实施方案中，脂肪酸可通过酰胺键与肽组分连接。在一些实施方案中，脂肪酸可具有10个到18个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸可具有12个到17个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸可具有14个、15个或16个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸可具有15个碳原子。
如本文中使用的，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与修饰的松弛素多肽的连接可导致多种变化，包括但不限于：相对于未修饰形式的增加或调节的血清(体内)半衰期或增加或调节的治疗半衰期、降低或受调节的免疫原性或毒性、受调节的物理缔合特征(例如减少的聚集和多聚体形成)、改变的受体结合、改变的与一种或多种结合配偶体的结合、改变的受体二聚化或多聚化。水溶性聚合物可以具有或不具有其自身的生物活性，并且可以用作将修饰的松弛素附接至其他物质的接头，上述其他物质包括但不限于一种或多种未修饰或修饰的松弛素多肽或一种或多种生物活性分子。适合的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利No.5,252,714，将其通过提述并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、离散的PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、两个或更多个氨基酸的多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等等，或其混合物。这样的水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中使用的，术语“聚亚烷基二醇”(PEG)或“聚(烯烃二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”包括线性和支链聚合物，平均分子量为0.1kDa至100kDa。其他示例性实施方案列于例如商业供应商目录中，例如Shearwater Corporation的目录"Polyethylene Glycol and Derivatives forBiomedical Applications"(2001)。
如本文中使用的，术语“受调节的血清半衰期”或“受调节的体内半衰期”以及类似术语，是指修饰的松弛素的循环半衰期相对于比较对象(例如其未修饰形式或野生型松弛素)的正或负变化。血清半衰期可以通过在施用修饰的松弛素之后的不同时间点采集血液样品，确定每个样品中该分子的浓度来测量。血清浓度与时间的关联允许计算血清半衰期。血清(体内)半衰期的增加理想地可以是至少约2倍，但是更小的增加可能是有用的，例如在其能够实现令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况下。在一些实施方案中，增加可以是至少约三倍、至少约五倍、至少约十倍、至少约二十倍或至少约五十倍。
如本文中使用的术语“受调节的治疗半衰期”表示本文所述的治疗有效量的修饰的松弛素多肽的血清或体内半衰期的相对于比较对象(例如其未修饰形式或野生型松弛素)的正或负变化。治疗半衰期通过在施用之后的不同时间点测量分子的药代动力学和/或药效学特性来测量。增加的治疗半衰期理想地为实现特定的有益给药方案、特定的有益总剂量，或避免不期望的作用提供可能。在一些实施方案中，导致增加的治疗半衰期的是：增加的效力、增加或减少的修饰分子与其靶标的结合、增加或减少的分子被酶(例如蛋白酶)分解、或非修饰分子的另一参数或作用机制的上升或下降、或受体介导的分子的清除的增加或减少。在一些实施方案中，治疗半衰期的增加可以是至少约二倍、至少约三倍、至少约五倍、至少约十倍、至少约二十倍或至少约五十倍。
术语“分离的”，当应用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质至少不含某些在天然状态下与之相关的细胞组分，或核酸或蛋白质已被浓缩至比其体内或体外生产的浓度更高的水平。它可以处于同质状态。分离的物质可以是干燥或半干燥状态，或者是溶液，包括但不限于水溶液。它可以是包含另外的药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物的组分。通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来确定纯度和均匀性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。具体而言，分离的基因与开放阅读框分开，所述开放阅读框位于基因侧翼并编码除感兴趣的基因之外的蛋白质。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。具体地，它可以意指核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更纯。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外特别限制，否则该术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中使用的，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
“保守修饰的变体”是指含有保守取代的氨基酸序列。示例性保守修饰的变体包括核酸、肽、多肽或蛋白质序列的取代、缺失或插入，其改变、添加或删除多肽序列或编码的多肽序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，例如，多肽序列或编码的多肽序列中的至多1、2、3、4个或5个氨基酸，或至多0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3.5％的氨基酸，任选地，可以是或可以包括化学上相似的氨基酸的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。这样的保守修饰的变体外加于，而不排除，所公开的修饰的松弛素多肽的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。以下八个组各自含有在彼此之间为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A或Ala)、甘氨酸(G或Gly)；
2)天冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)；
3)天冬酰胺(N或Asn)、谷氨酰胺(Q或Gln)；
4)精氨酸(R或Arg)、赖氨酸(K或Lys)、组氨酸(H或His)；
5)异亮氨酸(I或Ile)、亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、缬氨酸(V或Val)；
6)苯丙氨酸(F或Phe)、酪氨酸(Y或Tyr)、色氨酸(W或Trp)；
7)丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)；和
8)半胱氨酸(C或Cys)、甲硫氨酸(M或Met)
(参见，例如Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月)
在两个或更多个核酸或多肽序列的语境下，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口上比较和比对最大对应性时，或如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可用的其他算法)之一或通过手工比对和目测检查来测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上具有约60％同一性，约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，则所述序列“基本上相同”。同一性可存在于长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域或比较窗口上，或长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或者在未指定时可存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。如本文中使用的，“比较窗口”包括对具有连续位置例如至少或约10、15、20、25个或30个氨基酸的任何区段的提述，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对这两个序列进行比较。可适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410，以及Smith-Waterman(Smith和Waterman,J Mol Biol.1981Mar25；147(1):195-7)或Needleman-Wunsch(Needleman和Wunsch,J Mol Biol.1970Mar；48(3):443-53)算法，这些算法可以使用默认参数来运行，例如，如这些对应的出版物中所述的。
如本文中使用的术语“受试者”是指动物，在一些实施方案中是哺乳动物，在其他实施方案中是人，其是治疗、观察或实验的对象。动物可以是伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)或实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文中使用的术语“有效量”是指所施用的化合物(例如，本文所述的修饰的松弛素多肽)的量可预防、治愈、减轻、缓解被治疗的疾病、病症或疾患的一种或多种症状，延迟其发作，降低其严重性或使其在一定程度上减轻。可以施用含有本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物用于预防性治疗、增强治疗和/或治疗性治疗。
术语“增强”意指增加或延长期望效果的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用而言，术语“增强”是指增加或延长其他治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。
在预防性应用中，将含有修饰的松弛素多肽的组合物施用于对特定疾病、疾患或病症易感或有其他风险的患者。这样的量被定义为“预防有效量”。
在治疗性应用中，将包含修饰的非天然氨基酸多肽的组合物施用于已经患有疾病、病症或疾患的患者，其量足以治愈或至少部分地阻止或减轻疾病、疾患或病症的症状。这样的量被定义为“治疗有效量”，并且可取决于疾病、疾患或病症的严重性和病程、先前的治疗、患者的健康状况和对药物的反应、以及治疗医师的判断。通过常规的实验(例如，剂量递增临床试验)确定这样的治疗有效量被认为是本领域技术人员熟知的。
术语“治疗”用于指预防性和/或治疗性治疗。
如本文中关于蛋白质再折叠所使用的“还原剂”被定义为任何使巯基保持还原状态并减少分子内或分子间二硫键的化合物或物质。适合的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。对于本领域普通技术人员显而易见的是，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物。
如本文中关于蛋白质再折叠使用的“氧化剂”被定义为任何能够从被氧化的化合物中除去电子的化合物或物质。适合的氧化剂包括但不限于氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧。对于本领域普通技术人员显而易见的是，多种氧化剂适用于本发明的方法。
如本文中使用的“变性剂”(“Denaturing agent”或“denaturant”)被定义为将引起蛋白质的可逆解折叠的任何化合物或物质。变性剂的强度将由具体变性剂的性质和浓度决定。适合的变性剂可以是离液剂、洗涤剂、有机溶剂、水混溶性溶剂、磷脂或两种或更多种此类药剂的组合。适合的离液剂包括但不限于尿素、胍和硫氰酸钠。有用的洗涤剂可包括但不限于强洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠，或聚氧乙烯醚(例如吐温或Triton洗涤剂)、十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)、温和的非离子洗涤剂(例如，洋地黄皂苷)、温和的阳离子洗涤剂，例如N->2,3--(二油氧基)-丙基-N,N,N-三甲铵、温和的离子洗涤剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)或两性离子洗涤剂，包括但不限于磺基甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。有机水混溶性溶剂例如乙腈、低级链烷醇(特别是C2-C4链烷醇如乙醇或异丙醇)、或低级链烷二醇(特别是C2-C4链烷二醇如乙二醇)可用作变性剂。可用于本发明的磷脂可以是天然存在的磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成的磷脂衍生物或变体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文中使用的“再折叠”描述了将含二硫键的多肽从不正确折叠或解折叠状态转化为相对于二硫键的天然或正确折叠构象的任何过程、反应或方法。
如本文中使用的“共折叠”特别指的是采用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，所述多肽彼此相互作用并导致解折叠或不正确折叠的多肽转化为天然的正确折叠的多肽。
术语“受保护的”是指“保护基团”或存在这样的模块，其防止化学反应性官能团在某些反应条件下的反应。保护基团将根据受保护的化学反应性基团的类型而变化。例如，如果化学反应性基团是胺或酰肼，则保护基团可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。如果化学反应性基团是硫醇，则保护基团可以是正吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团是羧酸，例如丁酸或丙酸，或羟基，则保护基团可以是苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。本领域已知的其他保护基团也可用于本文所述的方法和组合物中或与本文所述的方法和组合物一起使用，包括诸如Nvoc和MeNvoc的光不稳定基团。本领域已知的其他保护基团也可用于本文所述的方法和组合物中或与本文所述的方法和组合物一起使用。
仅作为示例，封闭/保护基团可以选自：
其他保护基团描述于Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis,3rd Ed.,John Wiley&Sons,New York,NY,1999，将其通过提述完整并入本文。
术语“心血管系统疾患”或“心血管疾患”包括例如以下疾患：高血压(血压升高)、外周和心血管疾患、冠心病、稳定和不稳定型心绞痛、心脏病发作、心肌功能不全、异常心律(或心律失常)、持续性缺血功能障碍(“冬眠心肌”)、短暂性缺血后功能障碍(“顿抑心肌”)、心力衰竭、外周血流障碍、急性冠状动脉综合征、心力衰竭、心肌疾病(心肌病)、心肌梗死和血管病(血管疾病)。
术语“心力衰竭”包括心力衰竭的急性和慢性表现，以及更具体或相关的疾病类型，例如晚期心力衰竭、急性期后心力衰竭、心肾综合征、心力衰竭伴肾功能损害、慢性心力衰竭、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、代偿性心力衰竭、失代偿性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、与先天性心脏缺陷相关的心力衰竭、心脏瓣膜缺损、与心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣关闭不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、与联合心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精性心肌病、与心脏贮积症相关的心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心力衰竭急性加重期、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数保留的慢性心力衰竭(HFpEF)、心肌梗死后重塑、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。
术语“纤维化疾患”包括以纤维化为特征的疾病和疾患，尤其是包括以下疾病和疾患：肝或肝脏的纤维化、肝硬化、NASH、肺部纤维化或肺纤维化、心脏纤维化、心内膜心肌纤维化、肾病、肾小球肾炎、间质性肾纤维化、糖尿病引起的纤维化损伤、骨髓纤维化和类似的纤维化疾患、硬皮病、硬斑病、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕形成(也在手术后)、痣、糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变和结缔组织疾患(例如结节病)。
术语“松弛素相关疾患”和“与松弛素相关的疾病”涵盖可以通过调节体内松弛素水平(例如增加血清松弛素蛋白水平)进行预防、治疗、减轻或以其他方式受到影响的疾病和疾患。松弛素相关疾患包括但不限于本文所述的心血管系统疾患和纤维化疾患。
本文中提供的包含非天然编码氨基酸的多肽可包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子取代。可掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，例如分别为2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文所述的某些同位素标记的化合物(例如其中掺入放射性同位素例如3H和14C的那些化合物)在药物和/或底物组织分布测定法中是有用的。此外，用诸如氘(即2H)的同位素取代可以提供由于代谢稳定性更高而产生的某些治疗优势，例如体内半衰期延长或剂量要求降低。
I.概述
本公开提供了与PK增强子连接的修饰的松弛素分子。与其他修饰的或野生型松弛素多肽相比，示例性实施方案被证明表现出至少一种有利特性，所述有利特性选自体内半衰期延长、肾空泡形成减少、肾血流量增加、溶解度更高、聚集减少、粘度降低、可制造性增加。
在一个方面，本公开提供了包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽，其中：
(a)修饰的松弛素多肽包含松弛素A链多肽SEQ ID NO:4和松弛素B链多肽SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6，其在选自下组的位置被非天然编码氨基酸取代：A链残基1、A链残基2、A链残基5、A链残基13、A链残基18、B链残基5、B链残基7和B链残基25，并且任选地在所述松弛素A链和/或所述松弛素B链中具有最多两个另外的氨基酸取代、插入和/或缺失；
(b)所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中R基团是除了在下列氨基酸中发现的侧链以外的任何取代基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；
(c)所述非天然编码氨基酸与药代动力学增强子连接，所述药代动力学增强子包含2至30个氨基酸的肽组分和半衰期延长模块。
在一些实施方案中，所述松弛素A链多肽可包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代，并且任选地具有最多两个另外的氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ ID NO:4。所述松弛素A链多肽可包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代，并且任选地具有一个另外的氨基酸取代、插入或缺失的SEQ ID NO:4。所述松弛素B链多肽可包含任选地具有最多两个另外的氨基酸取代、插入或缺失的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。所述松弛素B链多肽可包含任选地具有一个另外的氨基酸取代、插入或缺失的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。所述松弛素A链多肽可包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代的SEQ ID NO:4，并且所述松弛素B链多肽可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，所述至少一个非天然编码氨基酸可包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。所述非天然编码氨基酸可包括苯丙氨酸衍生物。所述非天然编码氨基酸可选自对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸。所述非天然编码氨基酸可选自对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸，其包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。所述非天然编码氨基酸可包括对-乙酰基-L-苯丙氨酸。所述非天然编码氨基酸可以与所述药代动力学增强子连接。例如，所述非天然编码氨基酸可通过肟连接或三唑连接(例如肟连接)与所述药代动力学增强子连接。
在一些实施方案中，所述松弛素A链多肽可包含SEQ ID NO:35，所述松弛素B链多肽可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，并且其中所述松弛素A链或B链任选地可具有最多两个另外的氨基酸取代、插入或缺失。所述修饰的松弛素多肽可包含与SEQ ID NO:35具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素A链多肽和与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素B链多肽。所述松弛素A链多肽可与SEQ ID NO:35具有至少95％氨基酸序列同一性。所述松弛素B链多肽可与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少95％氨基酸序列同一性。所述松弛素A链多肽可包含SEQ ID NO:35，并且松弛素B链多肽可包含SEQID NO:5或SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述松弛素A链多肽可包含SEQ ID NO:35，并且松弛素B链多肽可包含SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，所述肽组分可包含1至25个氨基酸，例如2至20个氨基酸、3至10个氨基酸或4至8个氨基酸。所述肽组分可包含Glu、Gluγ、GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)、DRDDRD(SEQ ID NO:102)、KKKKKK-Gluγ(SEQ ID NO:103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:104)、GGGEEE-Gluγ(SEQ ID NO:105)、EEEGGG-Gluγ(SEQ ID NO:106)、KKKGGG-Gluγ(SEQ IDNO:107)、GETGSSGEGT-Gluγ(SEQ ID NO:108)、GGGKKK-Gluγ(SEQ ID NO:109)、GSHHHHHGS-Gluγ(SEQ ID NO:110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Gluγ(SEQ ID NO:111)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ(SEQ ID NO:112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ(SEQ ID NO:113)、KKKSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:118)、KKSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:114)、KKSGGSGG-Gluα(SEQ ID NO:115)、KKSAGSAG-Gluγ(SEQ ID NO:116)、KSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:117)、KKSGGSGGEE-Gluγ(SEQ ID NO:119)、dKdKdKdKdKdK-Gluγ(SEQ ID NO:120)、EESGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:121)、GSGSGSGS-Gluγ(SEQ ID NO:123)、EEEGGG-dGluγ(SEQ ID NO:128)、EGGGGSK-Gluγ(SEQ ID NO:130)、EEEEEE-Gluγ(SEQ ID NO:131)、EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Gluγ(SEQ ID NO:133)、EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG(SEQ ID NO:135)、EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Gluγ(SEQ ID NO:136)、KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:137)、EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-Gluγ(SEQ ID NO:138)、KK-Gluγ(SEQ ID NO:140)、Gluγ、KGPKGP-Gluγ(SEQ ID NO:146)、SGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:147)、KGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:148)、KGGGSE-Gluγ(SEQ ID NO:149)、GSPGSP-Gluγ(SEQ ID NO:150)、GGGGP-Gluγ(SEQ ID NO:151)、EGGS-Gluγ(SEQ ID NO:152)、EGGGP-Gluγ(SEQ ID NO:153)、KGPGSE-Gluγ(SEQ IDNO:154)、精胺-Gluγ或KKGGS-Gluγ(SEQ ID NO:156)。
所述肽组分可包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)、DRDDRD(SEQ ID NO:102)、KKKKKK-Gluγ(SEQ ID NO:103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:104)、GGGEEE-Gluγ(SEQID NO:105)、EEEGGG-Gluγ(SEQ ID NO:106)、KKKGGG-Gluγ(SEQ ID NO:107)、GGGKKK-Gluγ(SEQ ID NO:109)、GSHHHHHGS-Gluγ(SEQ ID NO:110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ(SEQ IDNO:112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ(SEQ ID NO:113)或KSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:117)。
所述肽组分可包含Gluγ。例如，所述肽组分可包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)。
在示例性实施方案中，所述修饰的松弛素多肽可包含松弛素A链多肽SEQ ID NO:4和松弛素B链多肽SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，其在A链残基1处被非天然编码氨基酸取代，其中所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接，并且所述药代动力学增强子包含肽组分GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)。在一些实施方案中，肽组分可与所述非天然编码氨基酸共价连接，例如，通过肟连接。
在示例性实施方案中，所述半衰期延长模块可包含脂肪酸或其衍生物，其中脂肪酸或其衍生物可与肽组分共价连接。所述半衰期延长模块可包含饱和脂肪酸或其衍生物。所述半衰期延长模块可包含以羧酸封端的脂肪酸。所述半衰期延长模块可包含式I的脂肪酸：-Cn-COOH(式I)，其中n可以为10-18，例如12-17，或13、14、15或16。在一些实施方案中，式I的-Cn-可包含第一羰基碳和-(CH2)n-1-。例如，-C13-可以是-(C＝O)-(CH2)12-；-C14-可以是–(C＝O)-(CH2)13-；-C15-可以是-(C＝O)-(CH2)14-。在一些实施方案中，脂肪酸的第一羰基碳可任选地通过酰胺键与(γ)Glu残基键合。在一些实施方案中，脂肪酸的第一羰基碳可通过酰胺键与γGlu残基键合。
在进一步的示例性实施方案中，所述半衰期延长模块可包含-C14-COOH。
在进一步的示例性实施方案中，所述药代动力学增强子可包含以下结构：
其中式II的氨氧基与所述修饰的松弛素多肽中的非天然氨基酸连接，例如通过肟连接。
在进一步的示例性实施方案中，所述半衰期延长模块可通过酰胺键与所述肽组分缀合。
在进一步的示例性实施方案中，所述松弛素多肽可包含松弛素A链多肽SEQ IDNO:4和松弛素B链多肽SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，其在A链残基1处被非天然编码氨基酸取代；其中所述非天然编码氨基酸包括对-乙酰基-L-苯丙氨酸；其中所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接，所述药代动力学增强子包含：含有GGGGS-Gluγ(SEQ IDNO:139)的肽组分；和含有-C14-COOH例如–(C＝O)-(CH2)13-COOH的半衰期延长模块。
在进一步的实施方案中，本公开提供了修饰的松弛素多肽，其包含以下结构：
其中所述AQ1-松弛素包含与SEQ ID NO:35具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素A链多肽和与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素B链多肽，其中式III中描绘的对-乙酰基-L-苯丙氨酸位于所述松弛素A链多肽的N末端。所述松弛素A链多肽可与SEQ ID NO:35具有至少95％氨基酸序列同一性。所述松弛素B链多肽可与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少95％氨基酸序列同一性。所述AQ1-松弛素可包含松弛素A链多肽SEQ ID NO:35和松弛素B链多肽SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
在进一步的实施方案中，本公开提供了包含松弛素缀合物“AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQID NO:139)-C14-COOH”的修饰的松弛素多肽，其包含松弛素A链多肽SEQ ID NO:35和松弛素B链多肽SEQ ID NO:6，其中位于所述松弛素A链多肽的N末端的对-乙酰基-L-苯丙氨酸可与PK增强子GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH连接，如式III中描绘：
在进一步的实施方案中，修饰的松弛素多肽包含图8中所示的结构。
在进一步的实施方案中，修饰的松弛素多肽包含图9中所示的结构。
在示例性实施方案中，所述修饰的松弛素多肽可具有生物活性。所述修饰的松弛素多肽对于治疗与松弛素相关的一种或多种疾病或病症可以有治疗效果。与比较对象化合物(例如AQ1-20kDa PEG(缀合至PEG的AQ1松弛素，平均MW为20kDa)相比，所述修饰的松弛素多肽可表现出肾空泡形成减少。与比较对象化合物例如AQ1-20kDa PEG相比，所述修饰的松弛素多肽可表现出无肾功能损害或肾功能损害降低。可通过确定估算的肾小球滤过率、肌酸清除率、菊粉肾小球滤过率或同位素肾小球滤过率中的一者或多者来测量所述肾功能。
在示例性实施方案中，所述修饰的松弛素多肽在施用后未表现出肾血流量减少，和/或能够增加肾血流量。可以通过确定对氨基马尿酸盐清除率来测量肾血流量。
与比较对象化合物(例如野生型松弛素)相比，所述修饰的松弛素多肽可表现出延长的体内半衰期，例如，延长至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍。
在另一方面，本公开提供了包含如本文所述的修饰的松弛素多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本公开提供了包含有效量的用于治疗或预防松弛素相关疾患的如本文所述的修饰的松弛素多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本公开提供了治疗或预防与松弛素相关的疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本公开提供了治疗或预防心血管疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。所述心血管疾病可选自冠状动脉疾病、心脏病发作、心律失常、心力衰竭、心肌病和血管疾病。
在另一方面，本公开提供了治疗、预防或减轻心力衰竭症状的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。所述心力衰竭可选自晚期心力衰竭、心肾综合征、心力衰竭伴肾功能损害、慢性心力衰竭、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭、代偿性心力衰竭、失代偿性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、与先天性心脏缺陷相关的心力衰竭、与心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、与联合心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、糖尿病性心力衰竭、酒精性心肌病、与心脏贮积症相关的心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心肌梗死后重塑、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。
在一些实施方案中，所述心力衰竭可选自慢性心力衰竭、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数保留的慢性心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心肌梗死后重塑、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。
在一些实施方案中，所述心力衰竭可选自急性期后心力衰竭、晚期心力衰竭、心肾综合征和心力衰竭伴肾功能损害。
所述治疗方法可进一步包括与所述修饰的松弛素多肽联合、同时或依次施用至少一种另外的治疗剂，其选自ACE抑制剂、β-阻滞剂、利尿剂、盐皮质激素受体拮抗剂、兰尼碱受体调节剂、SERCA2a激活剂、肾素抑制剂、钙通道阻滞剂、腺苷A1受体激动剂、部分腺苷A1受体、多巴胺β-羟化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、对选择的细胞信号传导途径具有偏向激动作用的血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂和中性内肽酶抑制剂的组合、中性内肽酶抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、肌球蛋白ATP酶激活剂、rho激酶1抑制剂、rho激酶2抑制剂、apelin受体激动剂、硝酰基供体化合物、钙依赖性激酶II抑制剂、抗纤维化药、半乳糖凝集素-3抑制剂、血管加压素受体拮抗剂、FPR2受体调节剂、利钠肽受体激动剂、瞬时受体电位香草素-4通道阻滞剂、抗心律失常药、If“起搏电流”(“funnycurrent”)通道阻滞剂、硝酸盐、洋地黄化合物、正性肌力药和β-受体激动剂、细胞膜再密封剂例如泊洛沙姆188、抗高血脂药、血浆HDL升高剂、抗高胆固醇血症药、胆固醇生物合成抑制剂(例如HMG CoA还原酶抑制剂)、LXR激动剂、FXR激动剂、普罗布考、雷洛昔芬、烟酸、烟酰胺、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、阴离子交换树脂、季胺、消胆胺、考来替泊、低密度脂蛋白受体诱导剂、氯贝特、非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、吉非罗齐(gemfibrizol)、维生素B6、维生素B12、抗氧化维生素、抗糖尿病药、血小板聚集抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂、阿司匹林和纤维酸衍生物、PCSK9抑制剂、阿司匹林和P2Y12抑制剂如氯吡格雷。
在另一方面，本公开提供了治疗、预防或减轻与纤维化相关的疾病的症状的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。与纤维化相关的所述疾病可包括心脏、肺、肾、骨髓或肝脏的纤维化、皮肤纤维化或纤维化眼病。所述与纤维化相关的疾病可选自肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、前肝硬化、弥漫性实质性肺疾病、囊性纤维化、肺纤维化、进行性大块纤维化、特发性肺纤维化、注射纤维化、肾纤维化、慢性肾病、糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾病、IgA肾病、骨髓纤维化、心力衰竭、代谢性心力衰竭、心肌纤维化、白内障纤维化、白内障、眼部瘢痕形成、胰腺纤维化、皮肤纤维化、肠纤维化、肠狭窄、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵隔纤维化、克罗恩病、腹膜后纤维化、瘢痕疙瘩、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、Peyronie综合征、杜普伊特伦(Dupuytren)挛缩、糖尿病神经病变、粘连性关节囊炎、酒精性肝病、肝脂肪变性、病毒性肝炎、胆道疾病、原发性血色素沉着症、药物相关性肝硬化、隐源性肝硬化、威尔逊(Wilson)病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、间质性肺病(ILD)、人纤维化肺病、黄斑变性、视网膜视网膜病变、玻璃体视网膜病变、心肌纤维化、格雷夫斯(Grave)眼病、药源性麦角中毒、心血管疾病、动脉粥样硬化/再狭窄、肥厚性瘢痕、原发性或特发性骨髓纤维化、炎性肠病和胶原性结肠炎。
治疗与纤维化相关的疾病的所述方法可以进一步包括将所述修饰的松弛素多肽与至少一种抗纤维化药联合、同时或依次施用于所述患者。所述抗纤维化药可选自尼达尼布、吡非尼酮、LPA1拮抗剂、LPA1受体拮抗剂、GLP1类似物、曲乐金单抗(tralokinumab)(IL-13，AstraZeneca)、维莫德吉(vismodegib)(刺猬拮抗剂，Roche)、PRM-151(正五聚蛋白-2，TGFβ-1，Promedior)、SAR-156597(双特异性Mab IL-4&IL-13，Sanofi)、斯图珠单抗(simtuzumab)((抗赖氨酰氧化酶样2(抗LOXL2)抗体，Gilead)、CKD-942、PTL-202(PDE吸入/己酮可可碱/NAC口服控制释放，Pacific Ther.)、奥米利塞(omipalisib)(口服PI3K/mTOR抑制剂，GSK)、IW-001(口服溶液，修饰的牛V型胶原蛋白，ImmuneWorks)、STX-100(整合素αV/β-6抗体，Stromedix/Biogen)、Actimmune(IFNγ)、PC-SOD(中度歧化酶；吸入，LTT Bio-Pharma/CKD Pharm)、来金珠单抗(lebrikizumab)(抗IL-13 SC人源化mAb，Roche)、AQX-1125(SHIP1激活剂，Aquinox)、CC-539(JNK抑制剂，Celgene)、FG-3019(FibroGen)、SAR-100842(Sanofi)和奥贝胆酸(OCA或INT-747，Intercept)。
在另一方面，本公开提供了治疗或预防肾衰竭的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
在另一方面，本公开提供了改善、稳定或恢复有此需要的患者的肾功能的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的修饰的松弛素多肽或包含如本文所述的修饰的松弛素多肽的组合物。
另一方面，本公开提供了制造如本文所述的修饰的松弛素多肽的方法，其包括：(a)提供包含松弛素A链和松弛素B链的多肽，其中所述多肽包含非天然编码氨基酸；和(b)将所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接。所述非天然编码氨基酸可通过肟连接与所述药代动力学增强子连接，例如，将所述非天然编码氨基酸与药代动力学增强子的肽组分连接。可以通过羰基和氨氧基的反应形成所述肟连接。所述羰基可以是所述非天然编码氨基酸的取代基，并且所述氨氧基可以是所述药代动力学增强子的组分。所述氨氧基可以是所述非天然编码氨基酸的取代基，并且所述羰基可以是所述药代动力学增强子的组分，例如所述药代动力学增强子的肽组分的组分。所述非天然编码氨基酸可以经核糖体掺入到所述多肽中。
II.与公开的修饰的松弛素多肽一起使用的通用重组核酸和方法
在本公开的实施方案中，可以使用重组方法分离、克隆并且经常改变编码感兴趣的修饰的松弛素多肽的核酸。包括但不限于用于蛋白质表达或在衍生自修饰的松弛素多肽的变体、衍生物或其他序列的产生过程中可以使用这样的实施方案。在一些实施方案中，编码本公开的修饰的松弛素多肽的序列与异源启动子可操作连接。在一些实施方案中，可以使用本领域熟知的技术将编码修饰的松弛素多肽的多核苷酸序列中的DNA密码子使用针对大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如CHO)表达进行优化。
本文中提供了编码松弛素A链(SEQ ID NO:10)、松弛素B链(SEQ ID NO:11)、松弛素A和B链(SEQ ID NO:12)和前导序列(SEQ ID NO:13-14)的示例性多核苷酸。
可以基于亲本多肽的氨基酸序列来合成编码本文所述的修饰的松弛素多肽的核苷酸序列，所述亲本多肽包括但不限于具有SEQ ID NO:4、5、6、35、36或37中所示的氨基酸序列，然后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即掺入或取代)或去除(即缺失或取代)。可以根据常规方法通过定点诱变合宜地修饰核苷酸序列。或者，可以通过化学合成(包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪)制备核苷酸序列，其中基于期望的多肽的氨基酸序列来设计寡核苷酸，并且优选地选择在其中将产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。
另外，可以将编码非天然编码氨基酸的选择子密码子掺入到多核苷酸序列中，如本文进一步描述的。
本公开还涉及用于通过正交tRNA/RS对进行非天然氨基酸的体内掺入的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物。用本公开的多核苷酸或包含本公开的多核苷酸的构建体对宿主细胞进行基因工程改造(包括但不限于，转化、转导或转染)，所述构建体包括但不限于本公开的载体，其可以是，例如，克隆载体或表达载体。例如，正交tRNA、正交tRNA合成酶和待衍生化的蛋白质的编码区与在期望的宿主细胞中起作用的基因表达控制元件可操作连接。载体可以是例如质粒、粘粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或缀合的多核苷酸的形式。可以通过标准方法将载体引入到细胞和/或微生物中。
III.选择子密码子(selector codon)
本公开的选择子密码子扩展了蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。例如，选择子密码子包括但不限于独特的三碱基密码子、无义密码子，例如终止密码子，包括但不限于琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA)；非天然密码子、四个或更多个碱基的密码子、稀有密码子等。对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以引入到期望的基因或多核苷酸中的选择子密码子的数目范围很广，包括但不限于，在编码修饰的松弛素多肽的至少一部分的单个多核苷酸中有一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。
在一个实施方案中，所述方法涉及使用选择子密码子，所述选择子密码子是终止密码子，用于一个或多个非天然(即，非天然编码)氨基酸的体内掺入。例如，产生识别终止密码子(包括但不限于UAG)的O-tRNA，并用带有期望的非天然氨基酸的O-RS将其氨酰基化。这种O-tRNA不被天然存在的宿主的氨酰tRNA合成酶识别。可以使用常规的定点诱变在感兴趣的多肽中感兴趣的位点处引入终止密码子，包括但不限于TAG。参见例如Sayers,J.R.等人(1988),Nucleic Acids Res,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码感兴趣的多肽的核酸在体内组合时，响应于UAG密码子掺入非天然氨基酸，从而产生在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
非天然氨基酸的体内掺入可以在不显著扰乱真核宿主细胞的条件下进行。例如，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括但不限于琥珀抑制基因tRNA)和真核释放因子(包括但不限于eRF)(其结合至终止密码子并启动生长的肽从核糖体释放)之间的竞争，可以通过(包括但不限于)提高O-tRNA和/或抑制基因tRNA的表达水平来调节所述抑制效率。
也可以用稀有密码子编码非天然氨基酸。例如已证明，当体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，稀有精氨酸密码子AGG高效地通过丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。参见例如Ma等人，Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下，合成tRNA与在大肠杆菌中的天然存在的tRNA Arg竞争，后者作为次要种类存在。
选择子密码子还包含延长密码子，包括但不限于四个或更多个碱基的密码子，例如四个、五个、六个或更多个碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。
在一个实施方案中，基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子可用于本公开中，其可减少其他不需要位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统，在内源系统不使用(或很少使用)一种天然三碱基密码子的场合，选择子密码子还可以包括该密码子。例如，这包括缺乏识别天然该三碱基密码子的tRNA的系统，和/或其中三碱基密码子是稀有密码子的系统。
可以使用本领域普通技术人员已知的和本文所述的方法诱变编码感兴趣的蛋白质或多肽(例如修饰的松弛素多肽)的基因，以纳入例如一个或多个选择子密码子，用于掺入非天然氨基酸。例如，诱变感兴趣的蛋白质的核酸以使之包括一个或多个选择子密码子，从而提供一个或多个非天然氨基酸的掺入。本公开包括任何这样的变体，包括但不限于任何蛋白质的突变体版本，例如包括至少一个非天然氨基酸者。
对编码感兴趣的蛋白质例如修饰的松弛素多肽的核酸分子可以容易地加以突变，以在多肽的任何期望的位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将活性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其他分子引入到感兴趣的蛋白质上。
IV.非天然编码氨基酸
很多种非天然编码氨基酸适合在本公开中使用。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入到修饰的松弛素多肽中。一般而言，引入的非天然编码氨基酸对20种常见的遗传编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)基本上是化学惰性的。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包括有效地和选择性地与在20种常见氨基酸中发现的官能团反应以形成稳定的共轭物的侧链官能团(包括但不限于叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)。例如，包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽可以与聚合物或PK延长剂反应，或者，可以与含有炔烃模块的第二多肽反应以形成稳定的缀合物，从而导致叠氮化物和炔烃官能团的选择性反应，以形成Huisgen[3+2]环加成产物。
α-氨基酸的通用结构如下所示(式IV)：
IV
非天然编码氨基酸通常是具有以上列出的化学式的任何结构并且可以适用于本公开的修饰的松弛素多肽，其中R基团是除二十种天然氨基酸中使用的取代基之外的任何取代基。因为本公开的非天然编码氨基酸通常仅在侧链结构中不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸以它们在天然存在的多肽中形成的相同方式与其他氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的)形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有将它们与天然氨基酸区分开的侧链基团。例如，R任选地包括烷基-、芳基-、酰基-、酮-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸盐、硼酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。
可以适用于本公开并且可用于与PK延长剂和聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔烃反应性基团的那些。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含糖模块。这样的氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。
本文中提供的许多非天然编码氨基酸是可商购的，例如，购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(a division of EMD Biosciences,Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)。任选地如本文中所提供来合成不可商购的那些氨基酸，或使用本领域普通技术人员已知的标准方法进行合成。对于有机合成技术，参见例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982年，第二版，Willard Grant Press,Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第三版，1985年，Wiley和Sons,NewYork)；以及Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第三版，部分A和B，1990年，Plenum Press,New York)。还参见美国专利No.7,045,337和7,083,970，将其通过提述并入本文。除了含有新侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本公开的非天然氨基酸还任选地包含修饰的主链结构，包括但不限于，如式V和VI的结构所示：
V
VI
其中Z通常包括OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可以相同或不同，通常包括S或O，并且R和R'(任选地相同或不同)通常选自以上针对具有式I的非天然氨基酸描述的R基团的相同组分列表以及氢。例如，本公开的非天然氨基酸任选地包含氨基或羧基中的取代，如式V和VI所示。这种类型的非天然氨基酸包括但不限于α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，包括但不限于具有对应于常见的二十种天然氨基酸的侧链或非天然侧链。此外，在α-碳上的取代任选地包括但不限于L,D或α-α-二取代的氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸，等。其他结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物，β和γ氨基酸，例如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等，并且适合于在本公开中使用。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中取代的酪氨酸包含，包括但不限于酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，还考虑了多取代的芳环。可适用于本公开的谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物、γ-取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本公开的示例性苯丙氨酸类似物包括但不限于对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本公开的非天然氨基酸的具体实例包括但不限于对-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸，以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。
在一个实施方案中，提供了包含非天然氨基酸(例如对-乙酰基-L-苯丙氨酸)的修饰的松弛素多肽的组合物。还提供了包含对-乙酰基-L-苯丙氨酸以及包括但不限于蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一个方面，包含对-乙酰基-L-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物还包含正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键合(包括但不限于共价键合)，包括但不限于通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键合、与正交tRNA的末端核糖的3’OH或2’OH共价键合等。
本文所述的修饰的松弛素多肽可包含在名称为“包含非天然编码氨基酸的松弛素多肽”的美国专利No.8,735,539中描述的非天然编码氨基酸，将其通过提述完整并入本文。
V.非天然氨基酸的结构和合成
在一些实施方案中，本公开提供了通过肟键或连接与PK延长剂(例如包含脂肪酸)连接的修饰的松弛素多肽。许多类型的非天然编码氨基酸适合于形成肟连接。这些包括但不限于含有羰基、二羰基、羰基样基团、掩蔽的羰基、保护的羰基或羟胺基的非天然编码氨基酸。这样的氨基酸、它们的结构和合成描述于美国专利No.8,012,931和8,735,539中，将其通过提述完整并入本文。
非天然编码氨基酸(包括含有羟胺的氨基酸)的示例性结构和合成方法是本领域已知的，例如公开于美国专利No.7,332,571、美国专利公开号2006/0194256、2006/0217532和2006/0217289以及WO 2006/069246中，将其各自完整地并入本文。
非天然编码氨基酸的化学合成
适用于本公开的许多非天然氨基酸是可商购的，例如购自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。不可商购的那些氨基酸任选地如本文中所提供或如各种出版物中所提供来合成，或使用本领域普通技术人员已知的标准方法进行合成。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸尤其允许经由亲核加成或羟醛缩合反应来连接分子(包括但不限于PEG或其他水溶性分子，例如肽组分)的各种反应。
在Zhang,Z.等人，Biochemistry 42:6735-6746(2003)中描述了对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成，将其通过提述并入本文。本领域普通技术人员可类似地制备其他含羰基的氨基酸。
在一些实施方案中，可以化学方式修饰包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽以生成反应性羰基官能团。例如，可以从具有相邻的氨基和羟基的官能团生成可用于缀合反应的醛官能团。
在本公开中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可以作为“掩蔽的”醛官能团掺入到多肽中。例如，5-羟赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于生成醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其他位点处的氧化。氧化反应的pH通常为约7.0。典型的反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中温育约10分钟。参见例如美国专利No.6,423,685，将其通过提述并入本文。
羰基官能团可以在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应，分别形成在生理条件下稳定的相应的腙、肟或缩氨基脲连接。参见例如Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.and Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其他氨基酸侧链存在下的选择性修饰。参见例如Cornish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人，Science 276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团例如肼、酰肼或氨基脲的非天然编码氨基酸允许与各种亲电子基团反应形成缀合物。
含有酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可从商业来源获得。例如，L-谷氨酸γ-酰肼可从Sigma Chemical(St.Louis,MO)获得。其他不可商购获得的氨基酸是本领域普通技术人员能够制备的。参见例如美国专利No.6,281,211，将其通过提述并入本文。
含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽可以与含有醛或具有相似化学反应性的其他官能团的各种分子高效且选择性地反应。参见，例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基和N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使得它们对醛、酮和其他亲电子基团具有显著更高的反应性。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)基团的非天然编码氨基酸允许与各种亲电子基团反应形成缀合物(包括但不限于与PEG或肽组分反应)。与肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性使其能够与含有醛或具有相似化学反应性的其他官能团的各种分子高效且选择性地反应。参见，例如Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应的腙，但氨氧基与含羰基的基团(例如酮)的反应通常产生肟。
可由可容易获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备含氨氧基的氨基酸。参见，例如M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。已经从天然来源分离某些含氨氧基的氨基酸，例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(Rosenthal,G.,LifeSci.60:1635-1641(1997)。本领域普通技术人员可制备其他含氨氧基的氨基酸。
D.叠氮化物和炔烃反应性基团
叠氮化物和炔烃官能团的独特反应性使它们可用于多肽和其他生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(特别是脂肪族叠氮化物)和炔烃通常对常见的反应性化学条件是稳定的。具体而言，叠氮化物和炔烃官能团两者对天然存在的多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链(即R基团)都是惰性的。然而，当使叠氮基与炔基靠近时，它们的“弹簧受载(spring-loaded)”性质就会显露，经由Huisgen[3+2]环加成反应选择性且高效地反应，以生成相应的三唑。参见，例如Chin J.等人，Science 301:964-7(2003)；Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参见，例如，Padwa,A.,COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost,B.M.编辑，1991)，第1069-1109页；Huisgen,R.1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(Padwa,A.19编辑，1984)，第1-176页)而不是亲核取代，所以带有叠氮化物和含炔侧链的非天然编码氨基酸的掺入使得所得到的多肽能够选择性在该非天然编码氨基酸的位置处被修饰。涉及含叠氮化物或含炔的修饰的松弛素多肽的环加成反应可在室温、水性条件及催化量的还原剂[催化剂用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)]的存在下添加Cu(II)(包括但不限于催化量的CuSO4的形式)来进行。参见，例如Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等人，J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。示例性还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+以及外加电势。
在一些情况下，在期望叠氮化物和炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应时，修饰的松弛素多肽可以包含含有炔模块的非天然编码氨基酸，并且有待与所述氨基酸附接的PK增强子可以包含叠氮化物模块。或者，也可进行逆向反应(即，在氨基酸上存在叠氮化物模块，而在水溶性聚合物上存在炔模块)。
叠氮化物官能团也可与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性地反应，并且经芳基膦模块适当地官能化从而生成酰胺连接。芳基膦基团使叠氮化物原位还原，并且所得胺随后与接近的酯连接高效反应从而生成相应的酰胺。参见，例如E.Saxon和C.Bertozzi,Science287,2007-2010(2000)。含叠氮化物的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
叠氮化物官能团也可与含有硫酯的水溶性聚合物选择性地反应，并且经芳基膦模块适当地官能化从而生成酰胺连接。芳基膦基团使叠氮化物原位还原，并且所得胺随后与硫酯连接有效反应从而生成相应的酰胺。
含炔氨基酸可商购获得。或者，可以根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，例如可以如Deiters,A.等人，J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，并且可以如Kayser,B.等人，Tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。本领域普通技术人员可制备其他含炔氨基酸。
含有叠氮化物的氨基酸可从商业来源获得。对于那些不可商购获得的含有叠氮化物的氨基酸，可相对容易地使用本领域普通技术人员已知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包括但不限于通过置换适合的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或通过打开经适当保护的内酯。参见，例如March的Advanced Organic Chemistry(第三版，1985,Wiley and Sons,New York)。
可以通过[3+2]环加成添加到本公开的蛋白质中的分子几乎包括具有叠氮化物或炔基衍生物的任何分子。所述分子包括但不限于染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括但不限于包含聚乙二醇的聚合物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记物、生物素衍生物、树脂、珠子、肽、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括但不限于DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可以添加到具有炔基的非天然氨基酸，包括但不限于对-炔丙氧基苯丙氨酸中，或添加到具有叠氮基的非天然氨基酸，包括但不限于对-叠氮基-苯丙氨酸中。
E.氨基硫醇反应性基团
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使得它们可用于通过形成噻唑烷来选择性修饰含有醛基的多肽和其他生物分子。参见，例如J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施方案中，可以将β-取代的氨基硫醇氨基酸掺入到修饰的松弛素多肽中，然后与包含醛官能团的PK增强子反应。在一些实施方案中，PK增强子、药物缀合物或其他有效载荷可以通过形成噻唑烷而与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的修饰的松弛素多肽偶联。
F.另外的反应性基团
可掺入到本公开的修饰的松弛素多肽中的另外的反应性基团和非天然编码氨基酸描述于以下专利申请中，所有这些专利申请均通过提述完整并入本文：美国专利公开号2006/0194256、美国专利公开号为2006/0217532、美国专利公开号2006/0217289和国际专利申请公开号WO/2007/070659。
VI.包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽的体内生成
本公开的修饰的松弛素多肽可以通过使用修饰的tRNA和tRNA合成酶来添加或替换上在天然存在的系统中不编码的氨基酸来体内生成。这样的方法描述于美国专利No.8,735,539中，将其通过提述完整并入本文。
利用在天然存在的系统中不编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的生成方法描述于例如美国专利No.7,045,337和7,083,970中，将其通过提述并入本文。这些方法涉及生成一套翻译机器，其独立于翻译系统的内源合成酶和tRNA(因此有时称为“正交”)发挥作用。通常，此翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先利用该翻译系统中的至少一种非天然存在的氨基酸将O-tRNA氨酰化，而O-tRNA识别至少一个不被该系统中的其他tRNA识别的选择子密码子。因此，翻译系统响应于编码的选择子密码子而将非天然编码氨基酸插入到在所述系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸“替换上”到编码多肽的一定位置中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及编码非天然编码氨基酸的特定密码子的选择。虽然可以使用任何密码子，但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少使用或从不使用的密码子。例如，示例性密码子包括无义密码子，例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)、四个或更多个碱基的密码子，和其他很少使用或从不使用的天然三碱基密码子。
可使用本领域已知的诱变方法(包括但不限于位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特异性选择子密码子引入到修饰的松弛素多核苷酸编码序列的适当位置中。
VII.在非真核生物和真核生物中表达
表达系统、培养和分离
未修饰或修饰的松弛素多肽可以在任何数目的适合的表达系统中表达，包括例如酵母、昆虫细胞(例如杆状病毒感染的昆虫细胞)、哺乳动物细胞和细菌。以下提供了示例性表达系统的描述。
酵母：如本文中使用的，术语“酵母”包括能够表达编码修饰的松弛素多肽的基因的各种酵母的任何一种，包括但不限于巴斯德毕赤酵母、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和多形汉逊酵母(H.polymorpha)。通过提述并入本文的WO 2005/091944描述了松弛素在酵母中的表达。
大肠杆菌、假单胞菌属物种和其他原核生物：
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA的接受者的细菌。该术语包括已被转染的原始细菌宿主细胞的后代。应当理解，由于意外或故意突变，单个亲本细胞的后代在形态学上或在与原始亲本互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与将以相关特性(例如编码未修饰或修饰的松弛素多肽的核苷酸序列的存在)表征的亲本充分相似的亲本细胞的后代被包括在由这个定义所意指的后代中。
在选择用于表达的细菌宿主时，适合的宿主可包括那些显示特别是具有良好的包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳健性的宿主。工业/药物发酵通常使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。适合的大肠杆菌宿主的其他实例包括但不限于BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本公开的方法的另一个实施方案中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括但不限于OMP-和LON-。宿主细胞株可以是假单胞菌属物种，包括但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知命名为菌株MB101的荧光假单胞菌生物型1可用于重组生产，并且可用于治疗性蛋白质生产过程。
一旦建立了重组宿主细胞株(即，已将表达构建体引入宿主细胞中并分离出具有适当表达构建体的宿主细胞)，在适于产生修饰的松弛素多肽的条件下培养所述重组宿主细胞株。
可以分批或连续形式培养重组宿主细胞，其中细胞收获(在修饰的松弛素多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的收获以分批或连续形式进行。
在细菌宿主细胞中产生的修饰的松弛素多肽可能是难溶或不溶的(呈包涵体形式)。在本公开的一个实施方案中，可以在修饰的松弛素多肽中容易地进行为了增加重组产生的蛋白质的溶解度而选择的氨基酸取代。可以用例如尿素或盐酸胍增溶修饰的松弛素多肽。
在可溶性的修饰的松弛素蛋白的情况下，松弛素可以分泌到周质空间或培养基中。例如，通过使用编码包含八个不同的前导序列(包括在SEQ ID NO:39-44中列出的那些)的构建体的质粒，将这些质粒转化到W3110-B2细胞中，然后使细胞在37℃生长直至OD达到约0.8，此时用0.01％阿拉伯糖诱导表达，从而修饰的松弛素被分泌到W3110-B2细胞的周质空间中。五个小时后，可以从培养物制备周质释放样品。另外，可溶性的修饰的松弛素可以存在于宿主细胞的细胞质中。可能希望在进行纯化步骤之前浓缩可溶性的修饰的松弛素。
当以融合蛋白形式产生修饰的松弛素多肽作时，可去除融合序列。可通过酶促或化学切割来完成融合序列的去除。可以使用本领域普通技术人员已知的方法来完成融合序列的酶促去除。如对于本领域普通技术人员将显而易见的，用于去除融合序列的酶的选择可由融合物的特性决定，并且反应条件可通过酶的选择来指定。可以使用本领域普通技术人员已知的试剂来完成化学切割，所述试剂包括但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其他试剂。可以通过本领域普通技术人员已知的方法从切割的融合序列中纯化出切割的修饰的松弛素多肽。
一般而言，有时需要使表达的多肽变性和还原并且然后使多肽再折叠成优选的构象。例如，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到感兴趣的翻译产物中。可在含有(包括但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其他方式移动以使其与一种或多种多肽或其他表达产物接触，或反之亦然。
在进行修饰的松弛素多肽的原核生产的情况下，如此产生的修饰的松弛素多肽可能被错误折叠，并且因此而缺乏生物活性或生物活性降低。可以通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般而言，通过使用例如一种或多种离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(在修饰的松弛素多肽也是不溶的情况下)、展开并还原多肽链使错误折叠的未修饰或修饰的松弛素多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，然后添加氧化剂(例如氧、胱氨酸或胱胺)，以允许二硫键再形成。可以使用本领域已知的标准方法使修饰的松弛素多肽再折叠，例如在美国专利No.4,511,502、4,511,503和4,512,922中描述的那些方法，将其通过提述并入本文。修饰的松弛素多肽也可以与其他蛋白质共折叠而形成异二聚体或异源多聚体。
在再折叠之后，可进一步纯化修饰的松弛素。可以使用本领域普通技术人员已知的多种技术完成修饰的松弛素的纯化，所述技术包括疏水性相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、亲和色谱法等或其任何组合。另外的纯化也可包括干燥或沉淀纯化蛋白质的步骤。
纯化后，可通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括但不限于，渗滤和透析，将修饰的松弛素交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。可使以单一纯化蛋白质形式提供的修饰的松弛素经历聚集和沉淀。
纯化的修饰的松弛素可以为至少90％纯(如通过反相高效液相色谱法RP-HPLC、或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量)、或至少95％纯、或至少98％纯或至少99％纯或更纯。无论修饰的松弛素的纯度的确切数值如何，所述修饰的松弛素对于用作药物产品或用于进一步处理，例如与PK增强子缀合来说都是足够纯的。
某些修饰的松弛素分子可以在不存在其他活性成分或蛋白质(除赋形剂、载体和稳定剂、血清白蛋白等以外)的情况下用作治疗剂，或者它们可与另一种蛋白质或聚合物复合。
在本公开的一些实施方案中，在每个纯化步骤之后修饰的松弛素的产率可以为每个纯化步骤的起始材料中的未修饰或修饰的松弛素的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
VIII.在替代系统中表达
可以使用无细胞(例如，体外)翻译系统表达本公开的修饰的松弛素多肽。翻译系统可以是细胞系统或无细胞系统，并且可以是原核的或真核的。细胞翻译系统包括但不限于其中期望的核酸序列可被转录为mRNA并且所述mRNA可被翻译的全细胞制备物，例如透化细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统可商购获得，并且许多不同的类型和系统是熟知的。无细胞系统的实例包括但不限于原核裂解物，例如大肠杆菌裂解物；以及真核裂解物，例如小麦胚芽提取物、昆虫细胞裂解物、兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物和人细胞裂解物。还可获得膜提取物，例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物，其可用于翻译分泌蛋白。
IX.含有修饰的松弛素多肽的融合蛋白
本公开还提供了修饰的松弛素多肽或其片段，其包含修饰的松弛素多肽序列和融合配偶体。融合配偶体可赋予功能特性，包括但不限于半衰期延长、促进蛋白质纯化和/或制造、增强的生物物理特性(例如增加溶解度或稳定性)、和降低的免疫原性或毒性，或任何其他目的。例如，融合蛋白可以表现出延长的体内半衰期，由此便于在治疗方案中以较低频率给药(例如每周两次、每周一次或每隔一周一次给药等)。示例性融合蛋白包含与融合配偶体融合的修饰的松弛素，所述融合配偶体例如白蛋白(例如人血清白蛋白)、PK延长(PKE)adnectin、XTEN、Fc结构域、免疫球蛋白恒定区，或任何前述项的片段，或任何前述项的组合。可以通过表达在同一个阅读框中的编码修饰的松弛素多肽序列和编码融合伴侣序列的核酸来产生融合蛋白，所述两个序列任选地被编码连接肽的序列分开。融合蛋白可以包含任何顺序的修饰的松弛素多肽和融合伴侣，例如，一个或多个融合伴侣与修饰的松弛素多肽序列的N末端和/或C末端连接，或者，一个或多个融合伴侣与N末端和C末端两者都连接。
X.修饰的和未修饰的松弛素多肽的糖基化
本公开包括包含一个或多个带有糖残基的非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽。糖残基可以是天然的(包括但不限于N-乙酰葡糖胺)或非天然的(包括但不限于3-氟代半乳糖)。糖可以通过N-或O-连接的糖苷键(包括但不限于N-乙酰半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括但不限于肟或相应的C-或S-连接的糖苷)与非天然编码氨基酸连接。
可以在体内或体外将糖(包括但不限于糖基)模块添加到修饰的松弛素多肽中。在本公开的一些实施方案中，可以用经氨氧基衍生化的糖来修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽，以生成通过肟键连接的相应的糖基化多肽。一旦与非天然编码氨基酸附接，可以通过用糖基转移酶和其他酶处理来进一步将糖精细加工，以产生与修饰的松弛素多肽结合的寡糖。参见，例如H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
XI.施用与药物组合物
本文中还提供了包含治疗有效量的本文所述的修饰的松弛素多肽和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。这样的载体或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、蔗糖、组氨酸、水、甘油、PS80(聚山梨醇酯80)、乙醇和/或其组合。将制剂制成为适合于给药方式。
例如，可以按照约0.1至100mg/kg受体患者体重的浓度将本文所述的修饰的松弛素多肽施用于患者。在一个实施方案中，可以按照约0.5-5mg/kg受体患者体重的浓度将本文所述的修饰的松弛素多肽施用于患者。在另一个实施方案中，可以按照每天一次至每两周、三周或四周一次，例如每周一次、每周两次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、或每六天一次的频率将本文所述的修饰的松弛素多肽施用于受体患者。在另一个实施方案中，将本文所述的修饰的松弛素多肽以每周一次施用于患者。
应当理解的是，施用于给定患者的修饰的松弛素多肽的浓度可高于或低于以上列出的示例性给药浓度。
基于本公开中提供的信息，本领域技术人员将能够通过常规的实验确定有效剂量和给药频率，例如以本文的公开内容和Goodman等人(2006).Goodman&Gilman's thepharmacological basis of therapeutics.New York:McGraw-Hill；或Howland等人，(2006).Pharmacology.Lippincott's illustrated reviews.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins的教导作为指南。
修饰的松弛素的平均量可以变化，特别是应该基于有资格医师的推荐和处方。修饰的松弛素的确切量是一个偏好问题，取决于诸如被治疗病症的确切类型、被治疗患者的状况以及组合物中的其他成分等因素。本公开还提供了治疗有效量的另一种活性剂的给药。有待给予的量可以由本领域普通技术人员容易地确定。
“药物组合物”是指适合施用于哺乳动物的化学或生物组合物。这样的组合物可以具体地配制为用于通过多种途径中的一种或多种进行施用，所述途径包括但不限于口腔、表皮、硬膜外、吸入、动脉内、心内(intracardial)、脑室内、真皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、肠胃外、直肠(经由灌肠剂或栓剂)、皮下、真皮下、舌下、透皮和经粘膜。另外，可以通过注射、粉末、液体、凝胶、滴剂或其他给药方式进行给药。
如本文中使用的，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理学上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂。在一个实施方案中，载体适合于肠胃外给药。在另一个实施方案中，载体适合于皮下给药。或者，载体可适用于静脉内、腹膜内、肌内或舌下给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。
在一些实施方案中，药物组合物可以冻干形式存在。可将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。在一些实施方案中，药物组合物包含稳定剂。可以例如通过维持在分散体情况下所需的粒径和通过使用表面活性剂而维持适当的流动性。
在一些实施方案中，药物组合物包含等渗剂，例如组合物中的糖(例如蔗糖)、多元醇例如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过包含诸如单硬脂酸盐和明胶等试剂，可以延长可注射组合物的吸收。而且，可以将多肽配制在定时释放制剂中，例如在包含缓释聚合物的组合物中。活性化合物可与可保护该化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。
本公开的修饰的松弛素多肽和组合物可以通过适用于蛋白质或肽的任何常规途径施用，包括但不限于胃肠外，例如注射，包括但不限于皮下或静脉注射或任何其他形式的注射或输注。多肽组合物可通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含修饰的松弛素的组合物也可以通过脂质体施用。修饰的松弛素多肽可以单独使用或与其他适合的组分例如药物载体组合使用。修饰的松弛素多肽可以与本文所述的其他药剂组合使用。
适合于肠胃外给药例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径的制剂包括含水性和非水性等渗无菌注射溶液(其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以将修饰的松弛素的制剂提供在单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶中。
在本公开的语境中，施用于患者的剂量足以在患者中随时间或其他适当的活动而具有有益的治疗反应，这取决于应用。剂量取决于制剂的功效、所采用的修饰的松弛素多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况以及待治疗患者的体重或表面积。
例如，对70千克患者施用的剂量通常在相当于针对相关组合物的改变的活性或血清半衰期进行调整的目前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内。
对于施用，以通过相关制剂的LD-50或ED-50和/或各种浓度的修饰的松弛素多肽的任何副作用的观察所确定的速率(包括但不限于适用于患者的体重和总体健康状况)施用本公开制剂。可以通过单剂量或分次剂量完成施用。
本公开的修饰的松弛素多肽可直接施用于哺乳动物受试者。可以利用药学上可接受的载体将本公开的修饰的松弛素多肽制备成单位剂量可注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)的混合物。还可以通过连续输注(使用，包括但不限于，微泵，例如渗透泵)、单次推注或缓释储库制剂来施用本公开的修饰的松弛素多肽。
适合于给药的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备溶液和悬浮液。
药学上可接受的载体包括但不限于含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量多肽，包括但不限于少于约10个残基的多肽；蛋白质，包括但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂包括但不限于EDTA和乙二胺四乙酸(edentate)二钠；二价金属离子，包括但不限于锌、钴或铜；糖醇，包括但不限于甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，包括但不限于钠和氯化钠；和/或非离子表面活性剂，包括但不限于TweenTM(包括但不限于吐温80(聚山梨醇酯80或PS80)和吐温20(聚山梨醇酯20)、PluronicsTM和其他普朗尼克酸，包括但不限于，以及其他普朗尼克酸，包括但不限于普朗尼克酸F68(泊洛沙姆188)或PEG。适合的表面活性剂包括例如但不限于基于聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)即(PEO-PPO-PEO)或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)即(PPO-PEO-PPO)或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO可以通过商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.)商购获得，并在美国专利No.4,820,352中有进一步描述，将该专利通过提述完整并入本文。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可以是适合的表面活性剂。可以使用表面活性剂或表面活性剂的组合来稳定修饰的松弛素以抵抗一种或多种应力，包括但不限于由搅拌产生的应力。以上载体中的一些可被称为“填充剂”。有些也可称为“张力调节剂”。为了产品稳定性和抗微生物效果也可应用抗微生物防腐剂；适合的防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵、间甲酚、羟苯甲酯/羟苯丙酯、甲酚和苯酚，或其组合。在一些实施方案中，药物组合物可包含含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和/或其他有机酸的缓冲剂；碳水化合物(例如单糖、二糖和其他碳水化合物)，例如海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；和表面活性剂，例如TweenTM80(聚山梨醇酯80或PS80)或吐温20(聚山梨醇酯20)。在一些实施方案中，药物组合物可包含含有组氨酸的缓冲剂、碳水化合物(例如蔗糖)；和表面活性剂(例如PS80)。
本公开的修饰的松弛素多肽(包括与PK增强子连接的那些)也可以通过缓释系统或作为缓释系统的一部分施用。缓释组合物包括(包括但不限于)呈成形物品形式的半透性聚合物基质，包括但不限于薄膜或微胶囊。缓释基质包括生物相容性材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、乙烯乙酸乙烯酯(或聚-D-(-)-3-羟基丁酸、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酸酐、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。缓释组合物还包括脂质体包埋的化合物。
在本公开的背景下，施用于患者的剂量应足以在受试者中随时间推移而引起有益的反应。通常，每剂量肠胃外(例如，静脉内或皮下)施用的本公开的修饰的松弛素多肽的总药学有效量的范围可以在约0.01μg/kg至约500mg/kg、约0.01μg/kg至约100mg/kg、约0.05mg/kg至约50mg/kg、约100μg/kg至约40mg/kg、约0.2mg/kg至约20mg/kg、或约0.5mg/kg至约10mg/kg，或为约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、或约100mg/kg患者体重，尽管这取决于治疗决定。在一些实施方案中，每剂量肠胃外(例如，静脉内或皮下)施用的本公开的修饰的松弛素多肽的范围可以在约0.2mg/kg至约5mg/kg、0.5mg/kg至约3mg/kg或1mg/kg至约3mg/kg，或为约0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、50mg/kg或80mg/kg。在一些实施方案中，每剂量肠胃外(例如，静脉内或皮下)施用的本公开的修饰的松弛素多肽可为约1mg/kg。在一些实施方案中，每剂量肠胃外(例如，静脉内或皮下)施用的本公开的修饰的松弛素多肽可以是约0.1mg至约10,000mg、约1mg至约5,000mg、约10mg至约2,500mg、约100mg至约1,000mg、约200mg至约800mg、约400mg至约600mg、约1mg至约10mg、约10mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约300mg、约300mg至约500mg、约500mg至约700mg、约700mg至约900mg、900mg至约1,200mg、约1,000mg至约2,000mg、约2,000mg至约3,000mg、约3,000mg至约4,000mg、约4,000mg至约5,000mg、约5,000mg至约6,000mg、约6,000mg至约7,000mg、约7,000mg至约8,000mg、约8,000mg至约9,000mg、或约9,000mg至约10,000mg范围内的单一剂量。
XII.修饰的松弛素多肽的治疗用途
本公开提供了修饰的松弛素多肽在治疗疾病中的用途，所述疾病包括心血管疾病或纤维化疾病，例如心力衰竭、胰腺炎、炎症、癌症、硬皮病、肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化或心脏纤维化。
所述心血管疾病可包括但不限于冠状动脉疾病、心脏病发作、心律失常或心律异常、心力衰竭、心脏瓣膜疾病、先天性心脏病、心肌病(心肌疾病)、心包疾病、主动脉疾病、马凡综合征、或血管疾病(血管病)。
在一些实施方案中，所述心力衰竭可包括下列一种或多种：晚期心力衰竭、心肾综合征、心力衰竭伴肾功能损害、慢性心力衰竭、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭例如急性期后失代偿性心力衰竭、代偿性心力衰竭、失代偿性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、与先天性心脏缺陷相关的心力衰竭、与心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣关闭不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、心绞痛、高血压、肺性高血压或肺动脉高压、与联合心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精性心肌病、与心脏贮积症相关的心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、舒张功能障碍、心肌梗死后重塑、射血分数保留的慢性心力衰竭(HFpEF)或射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)。
在一些实施方案中，所述心力衰竭选自慢性心力衰竭、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数保留的慢性心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心肌梗死后重塑、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。在一些实施方案中，所述心力衰竭选自急性期后心力衰竭、晚期心力衰竭、心肾综合征和心力衰竭伴肾功能损害。
纤维化是器官或组织中过量纤维结缔组织形成。纤维组织的过量沉积与可导致器官或组织功能受损的病理状况相关。受累器官可包括肺(肺或肺的纤维化)、肝(肝或肝的纤维化)、肾(肾或肾的纤维化)和心脏(心脏纤维化)。纤维化还可能影响其他组织和器官，包括关节、皮肤、肠、骨髓等。示例性纤维化病症或疾病包括但不限于影响肝脏的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；影响肾脏的糖尿病性肾脏疾病和糖尿病肾病；和影响心脏的代谢性心力衰竭。例如，NASH的特征是在消费很少或不消费酒精的人的肝脏中的脂肪、炎症和损伤，并且可导致肝硬化。NASH倾向于在超重或肥胖的中年人中被诊断，其常常有血脂水平升高、糖尿病或糖尿病前期。
可以使用标准或已知的体外或体内测定法确定用于潜在治疗用途的修饰的松弛素多肽的生物活性。可以通过本领域已知的适合方法分析松弛素多肽的生物活性。这样的测定法包括但不限于受体结合测定法。
至于疾病例如心力衰竭和纤维化疾病，可以使用一种或多种体内测定法确定修饰的松弛素的活性。所述测定法通常涉及在所述疾病的动物模型中施用松弛素，并确定对疾病进展、严重性或有效治疗的其他指标的影响。这样的测定法可用于确定模型系统中的有效剂量和治疗方案，并且在此基础上预测用于临床用途例如用于人类患者的给药方案。可以使用的示例性HF测定法包括：1)小鼠左前降支(LAD)冠状动脉结扎模型，其模拟患有心肌梗死和进展为HF的患者的心脏变化(Samuel等人，Lab.Investigation 91:675-690,2011)；2)有限的AngII输注模型，其中利用最小浓度AngII诱导心脏纤维化(Xu等人，J.Cardiovasc.Pharmacol.51:62–70,2008)；3)Dahl盐敏感大鼠模型，其特征在于高血压、肾损害和血容量超负荷(Sakata等人，Circulation 109:2143-2149,2004)；4)心脏和肾纤维化的老年自发性高血压大鼠(SHR)模型，其先前用于证明WT-RLX功效(Lekgabe等人，Hypertension 46:412-418,2005)；和5)压力超负荷的大鼠胸主动脉收缩模型(Kuster等人，Circulation 111:420-427,2005)。除了这些模型之外，还可以在狗模型中例如在正常和快速起搏(tachypacing)诱导的HF狗中确定修饰的松弛素的活性。另外，可以进行这些测定法来确定当不仅以预防模式而且还以治疗方式给予修饰的松弛素时是否有效。此外，可以在纤维化模型中测试修饰的松弛素，所述模型包括肾纤维化(Yoshida等人，Nephrol.Dialysis Transplant 27:2190–2197,2012)、肺纤维化(Huang等人，Am.J.Pathol.179:2751–2765,2011)和肝纤维化(Williams等人，Gut 49:577–583,2001)。例如，可以将修饰的松弛素的功效与野生型松弛素(例如，野生型人松弛素)的功效进行比较。
本发明的松弛素、松弛素多肽和/或松弛素类似物的施用量可以变化，特别是应该基于有资格医师的推荐和处方。本发明的松弛素、松弛素多肽和/或松弛素类似物的确切量是一个偏好问题，取决于诸如被治疗病症的确切类型和/或严重性、被治疗患者的状况以及组合物中的其他成分等因素。本发明可进一步包括治疗有效量的另一种活性剂的给药。基于松弛素疗法、可用的松弛素疗法和/或其他松弛素类似物，本领域普通技术人员可以容易地确定待给予的量。
本公开的化合物可用于减小受梗死影响的心肌区域，并用于预防继发性梗死。进一步提供了本公开的化合物的用途，其用于预防和/或治疗血栓栓塞疾患、缺血后再灌注损伤、微血管和大血管病变(血管炎)、动脉和静脉血栓形成、水肿、缺血(例如心肌梗死、中风和短暂性脑缺血发作)，用于与冠状动脉搭桥术(冠状动脉旁路移植术，CABG)、直接经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、溶栓后PTCA、补救性PTCA、心脏移植和心内直视手术相关的心脏保护，以及用于与移植、旁路手术、导管检查和其他外科手术相关的器官保护。进一步提供了本公开化合物用于预防和/或治疗呼吸疾患的用途，所述呼吸疾患例如像慢性阻塞性肺病(慢性支气管炎，COPD)、哮喘、肺气肿、支气管扩张、囊性纤维化(粘稠物阻塞症)和肺性高血压，特别是肺动脉高压。
本公开的示例性实施方案提供了本公开的修饰的松弛素作为预防和/或治疗肾脏疾病的药物的用途，所述肾脏疾病包括但不限于急性和慢性肾脏疾病及急性和慢性肾功能不全、以及急性和慢性肾衰竭(包括有和没有透析需求的急性和慢性肾衰竭阶段)，以及潜在或相关的肾脏疾病，例如肾脏低灌注、透析诱导的低血压、肾小球病、肾小球性蛋白尿和肾小管性蛋白尿、肾性水肿、血尿；原发性、继发性、以及急性和慢性肾小球肾炎；膜性肾小球肾炎和膜性增生性肾小球肾炎、奥尔波特综合征(Alport-syndrome)、肾小球硬化、肾小管间质性疾病；肾病疾病(nephropathic disease)，例如原发性和先天性肾脏疾病、肾脏炎症；肾移植排斥、免疫复合物诱导的肾脏疾病等免疫性肾脏疾病；以及中毒诱导的肾病疾病、糖尿病性和非糖尿病性肾病、肾盂肾炎、囊性肾、肾硬化、高血压性肾硬化、肾病综合征，其特征以及在诊断方面与以下情况相关：肌酐清除率和/或水排泄异常降低、尿素、氮、钾和/或肌酐的血液浓度异常增加、肾酶例如谷氨酰合成酶(glutamylsynthetase)活性、尿渗透压和尿量的改变；微量白蛋白尿、巨量白蛋白尿、肾小球和小动脉病变、肾小管扩张、高磷血症和/或透析需求增加。
另外，本公开的修饰的松弛素可用作预防和/或治疗下列疾病的药物：肾癌、肾不完全切除后、过度使用利尿剂后脱水、伴有恶性高血压的不受控的血压升高、尿路梗阻和感染、淀粉样变性、以及与肾小球损害有关的系统性疾病(例如红斑狼疮、风湿性免疫性系统性疾病)，以及肾动脉狭窄、肾动脉血栓形成、肾静脉血栓形成、止痛药诱导的肾病和肾小管酸中毒。
另外，本公开提供了本公开的修饰的松弛素作为预防和/或治疗造影剂诱导的和药物诱导的急性和慢性间质性肾病、代谢综合征和血脂异常的药物的用途。
另外，本公开提供了本公开的修饰的松弛素作为用于预防、减轻和/或治疗与急性和/或慢性肾脏疾病相关的后遗症或症状的药物的用途，所述后遗症或症状例如肺水肿、心力衰竭、尿毒症、贫血、电解质紊乱(如高钾血症、低钠血症)、以及骨和碳水化合物代谢紊乱。
另外，本公开提供了本公开的修饰的松弛素作为用于改善、稳定或恢复有此需要的患者(例如，具有如上所述的肾脏疾病的患者)的肾功能的药物的用途。
进一步的示例性实施方案提供了修饰的松弛素用于治疗和/或预防肺部疾病的用途，所述肺部疾病尤其是哮喘病、肺动脉高压(PAH)和其他形式的肺动脉高压(PH)(包括左心疾病)、HIV、镰状细胞贫血、血栓栓塞(CTEPH)、结节病、COPD或肺纤维化相关肺动脉高压、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺纤维化、肺气肿(例如由香烟烟雾引起的肺气肿)和囊性纤维化(CF)。
进一步的示例性实施方案提供了修饰的松弛素用于治疗和/或预防纤维化疾患的用途，所述纤维化疾患包括内脏器官例如肺、心脏、肾、骨髓，特别是肝脏的纤维化疾患，还有皮肤纤维化和纤维化眼病。
此外，本公开提供了修饰的松弛素用于制备治疗和/或预防疾患，特别是上述疾患的药物的用途。
此外，本公开提供了使用有效量的至少一种本公开的修饰的松弛素治疗和/或预防疾患，特别是上述疾患的方法。
此外，本公开提供了用于治疗和/或预防冠心病、急性冠状动脉综合征、心力衰竭(例如急性心力衰竭、慢性心力衰竭或晚期心力衰竭)和心肌梗死的方法的修饰的松弛素。
适合用于本公开的方法和组合物的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现预期目的(例如治疗心力衰竭)的组合物。鉴于本公开，有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于任何化合物，可以初步在体外测定法中(例如，RXFP1受体激活、离体地在离体灌注的大鼠心脏中)或者在动物模型(通常是小鼠、大鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效剂量。动物模型也用于实现期望的浓度范围和给药途径。然后，这样的信息可用于确定人体给药的有用剂量和途径。
治疗有效剂量是指改善症状或病症的修饰的松弛素的量。这样的化合物的治疗效果和毒性可以通过体外或实验动物的标准药学程序来确定，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。在疗效与毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率ED50/LD50。示例性药物组合物表现出大的治疗指数。从体外测定法和动物研究获得的数据用于配制供人类使用的剂量范围。这样的化合物的剂量例如在循环浓度范围内，其包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量取决于所采用的剂型、患者的敏感性以及给药途径在该范围内变化。
正常剂量根据给药途径可以在0.1至100,000毫克总剂量之间变化。文献中提供了关于具体剂量和递送方法的指南。参见美国专利No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。
XIII.组合制剂
本公开的修饰的松弛素可以单独施用或与其他活性化合物联合施用。在这个背景下，术语联合包括任何同时或依次施用的方式，无论修饰的松弛素和其他药剂是包含在同一个组合物中还是分开施用，可以通过相同或不同的给药方式施用。本公开提供了用于治疗和/或预防上述疾患的在药物组合物中包含至少一种修饰的松弛素和一种或多种其他活性成分的药物，其中所述药物组合物与赋形剂或药学上可接受的载体混合。
用于联合的适当活性成分可包括，例如：调节脂质代谢的活性成分、抗糖尿病药、降血压药、增强灌注和/或抗血栓形成剂、抗氧化剂、趋化因子受体拮抗剂、p38-激酶抑制剂、NPY激动剂、食欲素激动剂、减食欲剂(anorectics)、PAF-AH抑制剂、抗炎药(COX抑制剂，LTB4受体拮抗剂)、镇痛药例如阿司匹林、P2Y12抑制剂例如氯吡格雷、PCSK9抑制剂例如依洛尤单抗(REPATHA)或阿利珠单抗(PRALUENT)、抗抑郁药和其他精神药物。
本公开进一步提供了至少一种修饰的松弛素与至少一种改变脂质代谢的活性成分、抗糖尿病药、降血压活性成分和/或具有抗血栓形成作用的药剂的联合。
修饰的松弛素可与一种或多种调节脂质代谢的活性成分联合，所述活性成分例如HMG-CoA还原酶抑制剂、HMG-CoA还原酶表达抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、ACAT抑制剂、LDL受体诱导剂、胆固醇吸收抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸重吸收抑制剂、MTP抑制剂、脂肪酶抑制剂、LpL活化剂、贝特类、烟酸、烟酸受体激动剂、CETP抑制剂、PPAR-a、PPAR-γ和/或PPAR-δ激动剂、RXR调节剂、FXR调节剂、LXR调节剂、甲状腺激素和/或甲状腺模拟物(thyroid mimetics)、ATP柠檬酸裂解酶抑制剂、Lp(a)拮抗剂、大麻素受体1拮抗剂、瘦素受体激动剂、铃蟾肽受体激动剂、PCSK9抑制剂、组胺受体激动剂和抗氧化剂/自由基清除剂。
在一些实施方案中，修饰的松弛素与来自他汀类的HMG-CoA还原酶抑制剂例如洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀或匹伐他汀联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与角鲨烯合成抑制剂例如BMS-188494或TAK-475联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与ACAT抑制剂例如阿伐麦布、美利胺、帕替麦布、依鲁麦布或SMP-797联合施用。在另一个实施方案中，其他修饰的松弛素与胆固醇吸收抑制剂例如依折麦布、替奎安或帕马苷联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与MTP抑制剂例如英普他派、BMS-201038、R-103757或JTT-130联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与脂肪酶抑制剂例如奥利司他联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与甲状腺激素和/或甲状腺模拟物例如D-甲状腺素或3,5,3'-三碘甲状腺原氨酸(T3)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与烟酸受体激动剂例如烟酸、阿西莫司、阿西弗兰或酒石酸烟醇(radecol)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与CETP抑制剂例如达塞曲匹(dalcetrapib)、BAY 60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或CETP疫苗(CETi-1)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与PPAR-γ激动剂例如噻唑啉二酮类(例如吡格列酮或罗格列酮)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与PPAR-δ激动剂例如GW-501516或BAY 68-5042联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与聚合胆汁酸吸附剂例如消胆胺、考来替泊、考来维仑、考来胶(CholestaGel)或考来替兰(colestimide)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与胆汁酸再吸收抑制剂，例如ASBT(＝IBAT)抑制剂，例如AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与抗氧化剂/自由基清除剂例如普罗布考、AGI-1067、BO-653或AEOL-10150联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与大麻素受体1拮抗剂例如利莫那班或SR-147778联合施用。
修饰的松弛素可以与一种或多种抗糖尿病药联合，所述抗糖尿病药例如胰岛素和胰岛素衍生物、磺酰脲类、双胍类、氯茴苯酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂、PPAR-γ激动剂、二肽基肽酶IV抑制剂(DPP-IV抑制剂)、噁二唑烷二酮类(oxadiazolidinones)、噻唑啉二酮类、GLP1受体激动剂、胰高血糖素拮抗剂、胰岛素增敏剂、CCK1受体激动剂、瘦素受体激动剂、涉及糖原异生和/或糖原分解刺激的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂以及钾通道开放剂。
在一些实施方案中，修饰的松弛素与胰岛素或胰岛素衍生物联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与磺酰脲类例如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪或格列齐特联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与双胍(例如二甲双胍)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与氯茴苯酸衍生物例如瑞格列奈或那格列奈联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与葡糖苷酶抑制剂例如米格列醇或阿卡波糖联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与DPP-IV抑制剂例如西格列汀和维格列汀联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与PPAR-γ激动剂例如噻唑烷二酮类(例如吡格列酮或罗格列酮)联合施用。
修饰的松弛素可与一种或多种降血压活性成分组合，所述活性成分例如钙拮抗剂、血管紧张素II拮抗剂、ACE抑制剂、肾素抑制剂、β-受体阻滞剂、α-受体阻滞剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、盐皮质激素受体拮抗剂、ECE抑制剂、ACE/NEP抑制剂和血管肽酶抑制剂。
在一些实施方案中，修饰的松弛素与钙拮抗剂例如硝苯地平、氨氯地平、维拉帕米或地尔硫卓联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与血管紧张素II拮抗剂例如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、恩布沙坦、奥美沙坦或替米沙坦联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与ACE抑制剂例如依那普利、卡托普利、赖诺普利、雷米普利、地拉普利、福辛普利、喹诺普利(quinopril)、培哚普利或群多普利(trandopril)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与β-受体阻滞剂例如普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿普洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、布拉洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、甲吲洛尔、卡拉洛尔(carazalol)、索他洛尔、美托洛尔、倍他洛尔、塞利洛尔(celiprolol)、比索洛尔、卡替洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛(carvedilol)、阿达洛尔、兰地洛尔、奈比洛尔、依泮洛尔(epanolol)或布新洛尔(bucindolol)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与α-受体阻滞剂例如哌唑嗪联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与利尿剂例如呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮、吲哒帕胺、美托拉宗、喹乙宗、乙酰唑胺、二氯磺胺、醋甲唑胺、甘油、异山梨酯、甘露醇、阿米洛利或氨苯蝶啶(triamteren)联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与醛固酮或盐皮质激素受体拮抗剂例如螺内酯或依普利酮联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与血管加压素受体拮抗剂例如考尼伐坦、托伐普坦、利伐普坦或SR-121463联合施用。
修饰的松弛素可以与下列一者或多者联合：抗血栓形成剂，例如血小板聚集抑制剂或抗凝血剂；利尿剂；加压素受体拮抗剂；有机硝酸酯和NO供体；具有正性肌力活性的化合物；抑制环磷酸鸟苷(cGMP)和/或环磷酸腺苷(cAMP)降解的化合物，例如磷酸二酯酶(PDE)1,2,3,4和/或5的抑制剂，特别是PDE 5抑制剂，例如西地那非、伐地那非和他达拉非，以及PDE 3抑制剂，例如米力农；利钠肽，例如，“心房利钠肽”(ANP，阿那立肽)、“B型利钠肽”或“脑利钠肽”(BNP，奈西立肽)、“C型利尿钠肽”(CNP)以及还有尿钠素；前列环素受体(IP受体)激动剂，例如伊洛前列素、贝前列素、西卡前列素；If(起搏通道)通道的抑制剂，例如伊伐布雷定；钙增敏剂，例如左西孟旦；钾补充剂；不依赖于NO但依赖于血红素的鸟苷酸环化酶刺激剂，例如在WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301和WO 03/095451中描述的化合物；NO-和血红素非依赖性鸟苷酸环化酶活化剂，例如在WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/197780、WO 02/070462和WO 02/070510中描述的化合物；人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)抑制剂，例如西维来司他和DX-890(Reltran)；抑制信号转导级联的化合物，例如酪氨酸激酶抑制剂，例如索拉非尼、伊马替尼、吉非替尼和厄洛替尼；和/或调节心脏能量代谢的化合物，例如依托莫司、二氯乙酸盐、雷诺嗪和曲美他嗪。
在一些实施方案中，修饰的松弛素与有机硝酸酯或NO供体例如硝普钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、吗多明(molsidomin)或SIN-1联合或与吸入性NO联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与正性肌力化合物，例如强心苷(地高辛)、β-肾上腺素能和多巴胺能激动剂，例如异丙肾上腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺或多巴酚丁胺联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与抗交感神经药例如利血平、可乐定或α-甲基多巴，或与钾通道激动剂例如米诺地尔、二氮嗪、双肼屈嗪或肼苯哒嗪，或与释放氮氧化物的物质例如甘油硝酸盐或硝普钠联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与血小板聚集抑制剂例如阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定或双嘧达莫联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与凝血酶抑制剂例如希美加群、美拉加群、达比加群、比伐卢定或克赛联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与GPIIb/IIIa拮抗剂例如替罗非班或阿昔单抗联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与因子Xa抑制剂例如利伐沙班(BAY59-7939)、DU-176b、阿哌沙班、奥米沙班、非地沙班、雷扎沙班、磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物联合施用。在另一个实施方案中，修饰的松弛素与维生素K拮抗剂例如香豆素(华法林)联合施用。
此外，本公开提供了包含通常与一种或多种惰性无毒的药学上适合的助剂一起的至少一种修饰的松弛素的药物以及它们用于上述目的的用途。任选地，所述药物可包含所述修饰的松弛素和另一种活性成分(例如上文鉴定的那些)。例如，所述药物可包含有效量的所述修饰的松弛素和另一种活性成分，其用于治疗或预防心力衰竭和/或与纤维化相关的疾病。
实施例
实施例1：非天然编码氨基酸经核糖体掺入到PreproRelaxin中
本实施例例示了包含非天然编码氨基酸的松弛素多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。
用于克隆松弛素的方法是本领域普通技术人员已知的。针对松弛素的多肽和多核苷酸序列以及松弛素到宿主细胞中的克隆详述于美国专利No.4,758,516；美国专利No.5,166,191；美国专利No.5,179,195、5,945,402和5,759,807中；将所有这些专利通过提述并入本文。
编码松弛素的cDNA显示为SEQ ID NO:12，成熟的多肽氨基酸序列显示为SEQ IDNO:1。表1中提供了示例性松弛素序列。
表1：松弛素序列
使用一个引入的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的松弛素或松弛素类似物，该系统包含正交的tRNA(O-tRNA)和正交的氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。该O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰化。进而，该翻译系统响应于编码的选择子密码子而将非天然编码氨基酸插入到松弛素或松弛素类似物中。适合的O-RS和O-tRNA序列描述于名称为“氨酰基tRNA合成酶的组合物及其用途”的WO 2006/068802中(E9；SEQ ID NO:16)和名称为“tRNA的组合物及其用途”的WO 2007/021297中(F13；SEQ ID NO:17)，将它们通过提述完整并入本文。表2中展示了可以利用的示例性序列。
表2：在表达系统中利用的序列
用含有修饰的松弛素或松弛素类似物基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对期望的非天然编码氨基酸特异的)的质粒转化大肠杆菌允许非天然编码氨基酸到松弛素多肽中的位点特异性掺入，如美国专利No.8,735,539中所述，将该专利完整并入本文。
使用标准方案经cDNA合成反应通过PCR扩增野生型成熟松弛素，并将其克隆到质粒载体例如pET30(NcoI-BamHI)中。将松弛素序列亚克隆到抑制载体中，所述抑制载体含有在衍生自大肠杆菌脂蛋白启动子序列的合成启动子的组成型控制下的来自詹氏甲烷球菌的琥珀抑制基因酪氨酰tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)中(Miller,J.H.,Gene,1986)以及在大肠杆菌GlnRS启动子控制下的正交酪氨酰-tRNA合成酶(MjTyrRS)(例如E9)。在T7启动子控制下表达松弛素，所述T7启动子由L-阿拉伯糖间接诱导。使用标准快速变化突变方案(Stratagene；La Jolla,California)引入琥珀突变。构建体经过序列验证。
用对-乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)抑制
使用含有包含琥珀突变的修饰的松弛素基因(编码在A链残基1处具有pAcF的SEQID NO:38，参见图4)和如上所述的正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对的质粒，转化到大肠杆菌菌株W3110B55[F-IN(rrnD-rrnE)lambdaaraB::g1tetA fhuA::dhfr proS W375R::cat]中，从而产生其中T7聚合酶的表达受阿拉伯糖诱导型启动子控制的大肠杆菌菌株。将过夜细菌培养物以1:100稀释到含有2X YT培养基的摇瓶中，并在37℃下生长至OD600为约0.8。通过添加阿拉伯糖(最终0.2％)和对-乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)至终浓度4mM来诱导蛋白质表达。将培养物在37℃下温育5小时。使细胞沉淀并重悬于B-PER裂解缓冲液(Pierce)100ul/OD/ml+10ug/ml DNA酶中，并在37℃下温育30分钟。通过离心除去细胞物质，并除去上清液。将沉淀重悬于等量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中。将所有样品加载到具有MES和DTT的4-12％的PAGE凝胶上。通过SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾电离离子阱质谱法等证实松弛素的表达。
修饰的松弛素基因序列可包括N末端His标签，例如HHHHHHSGG(SEQ ID NO:55)。可以使用本领域普通技术人员已知的方法纯化带有His标签的突变松弛素蛋白。可通过由制造商提供的带有His标签的标准蛋白质纯化程序使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可通过本领域中已知的方法、本申请和并入的参考文献中提供的方法进行蛋白质的功能性测量，或者，可开发在活细胞上的ELISA来评估本发明的松弛素多肽。
实施例2：含有非天然编码氨基酸的成熟松弛素的产生和纯化
通过在大肠杆菌细胞中发酵产生包涵体形式的PreproRelaxin(SEQ ID NO:38，在A链残基1处具有pAcF，参见图4)。使用实施例1中提供的通用方法经核糖体掺入非天然编码氨基酸(对-乙酰基-苯丙氨酸)。
使含有表达修饰的松弛素多肽的质粒的大肠杆菌细胞在含有发酵培养基的发酵罐中生长。将卡那霉素添加到发酵罐中以促进质粒稳定性。将L-丙氨酸-L-对-乙酰基-苯丙氨酸盐酸盐(L-Ala-pAcF)添加发酵罐中，使得对-乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)能够掺入到PreproRelaxin氨基酸序列中。最后，添加L-阿拉伯糖诱导PreproRelaxin表达。在细胞内产生的PreproRelaxin导致不溶性包涵体(IB)形成。在诱导后的持续时间之后收获发酵液。发酵效价为每L发酵约4.5g PreproRelaxin。
通过在高剪切下裂解细胞，将包涵体(IB)与完整细胞分离。通过离心回收完整的IB。回收后，将IB沉淀重悬于水中，并再次离心以除去杂质。洗涤的IB在pH 8.5下在含有5mM二硫苏糖醇(DTT)的5M胍/Tris缓冲液中溶解。通过在含有5mM DTT和8.5mM胱胺的冷的pH8.5Tris缓冲液中将溶解的IB溶液缓慢稀释大约4.5倍至来实现PreproRelaxin的再折叠。在继续处理之前，将再折叠溶液温育最少12小时。在温育期结束后，通过添加乙酸和盐酸将pH降至3.5-4.0，以促进杂质沉淀。通过离心除去沉淀的物质，然后进行深层过滤。
将深层过滤的再折叠溶液用pH为4的乙酸盐缓冲液稀释大约6.5倍，以降低准备加载到Tosoh Bioscience SP550C阳离子交换柱上的电导率。加载后，洗涤SP550C柱，然后使用含有1M NaCl的10％-90％梯度的50mM乙酸盐pH 5.5缓冲液洗脱PreproRelaxin。用净化水稀释SP550C洗脱液，直至PreproRelaxin浓度为1.5mg/mL时为止。通过添加2M Tris(pH8.0)将pH调节至8.0，然后添加2mM CaCl2以准备酶促转化。
将野生型胰蛋白酶用琥珀酸酐修饰(即琥珀酰化)，以便在胰蛋白酶处理步骤完成时从PreproRelaxin/胰蛋白酶反应混合物中除去。将10mMHCl、20mM CaCl2中的浓缩野生型胰蛋白酶用纯净水稀释至5mg/mL，然后添加1M pH 7.6硼酸盐缓冲液至终浓度为0.2M。将相对于胰蛋白酶100倍摩尔过量的固体琥珀酸酐通过三次等摩尔添加(3×33.3摩尔过量添加)添加到稀释的pH调节的胰蛋白酶溶液中，两次添加之间混合10分钟。
将琥珀酰化胰蛋白酶添加到PreproRelaxin溶液中，在22℃温育4小时，以确保PreproRelaxin分子的连接肽和前导序列完全酶促去除。得到的松弛素-R分子在B链上含有C末端精氨酸。接着将胰蛋白酶处理过的材料通过可结合琥珀酰化胰蛋白酶的SartobindPA阴离子交换过滤器进行处理，同时将Relaxin-R收集在穿透液中。将羧肽酶B(CPB)添加到PA滤液中并在搅拌下温育2小时以确保B链C末端精氨酸残基的完全酶促去除。通过将反应混合物的pH降至2.8-3.2来终止CPB反应。
使用Tosoh Bioscience SP-5PW阳离子交换树脂纯化成熟的松弛素。将成熟的松弛素加载到柱上，然后将柱洗涤三次：1)pH 5.5的50mM乙酸盐；2)pH 5.5的50mM乙酸盐、0.1M NaCl；3)pH 4.0的50mM乙酸盐。使用0％至100％2M KCl的线性梯度以20个柱体积在pH4下洗脱结合的松弛素。在进一步处理之前，使用1M HCl将洗脱的松弛素溶液调整pH至3.0。或者，通过沉淀从反应混合物中除去胰蛋白酶。在室温下将反应混合物的pH升高至8.0持续1小时之后，松弛素析出。然后通过离心回收析出的松弛素。通过将离心沉淀重悬于pH8Tris缓冲液中再离心而将离心沉淀洗涤3次。在最后一次洗涤之后，将沉淀再溶解在20mM乙酸中。纯化的松弛素未显示任何胰蛋白酶活性。终产物是成熟的松弛素。
使用基本上相同的合成方法来产生RLX-AQ1(“AQ1”)(图2)和RLX-BM25/AN1(“BM25/AN1”)(图3)，其中适当修饰PreproRelaxin序列。
实施例3：松弛素与包含与脂肪酸连接的肽的PK增强子的缀合
通过超滤将纯化的松弛素浓缩至大约10mg/mL。将包含肽和C15脂肪酸(例如GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH)的氨氧基活化的PK增强子以对松弛素1.5倍摩尔过量添加到反应混合物中。然后以对松弛素45倍摩尔过量添加酰肼添加剂(即4氨基-苯并酰肼)。根据需要用1M HCl调节溶液以维持pH在3.5至4.0之间，并将温度控制在30℃。缀合反应在连接于C15脂肪酸的肽接头(例如，GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH)(如按照实施例4中描述的程序制备)和松弛素中的对-乙酰基-苯丙氨酸残基之间形成稳定的肟键。反应在16小时之内完成。
用10mM pH 4.0乙酸盐缓冲液将缀合反应混合物稀释至≤4mS/cm，然后加载到GEHealthcare SP HP阳离子交换柱上。加载完成后，用20mM组氨酸(pH 6.0)洗涤柱以除去杂质。然后用50mM碳酸氢铵(pH 8.5)洗脱松弛素-C15缀合物(包含例如AQ1-松弛素-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH)。成熟松弛素的结构示意性地示于图5和式III中：
将纯化的松弛素-C15缀合物浓缩，然后渗滤到适当的最终制剂缓冲液中。缀合物的一个示例性组合物是在20mM组氨酸、0.25M蔗糖、0.05％(w/v)聚山梨醇酯-80(pH 5.5)中的8mg/mL的松弛素-C15缀合物。将组合物冷冻保存在≤-60℃。
可使用相似的过程制备其他松弛素-脂肪酸缀合物。
实施例4：PK增强子的固相合成
可以使用以下举例说明的程序制备本文中公开的PK增强子。
在本申请中使用的缩写，尤其包括以下说明性方案和实施例中的缩写，是本领域技术人员已知的。使用的一些缩写如下：min：分钟；h：小时；rt：室温；sat.：饱和；TFA：三氟乙酸；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DCM：二氯甲烷；Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化六氟磷酸盐；DIEA或DIPEA：二异丙基乙胺；NMP：N-甲基吡咯烷酮；EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；DMSO：二甲基亚砜；MeOH：甲醇；EtOAc：乙酸乙酯；Et3N：三乙胺；MeCN或ACN：乙腈。
分析数据：质谱法：“ESI-MS(+)”表示在正离子模式下进行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示在负离子模式下进行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示在正离子模式下进行的高分辨率电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示在负离子模式下进行的高分辨率电喷雾电离质谱。按照“m/z”单位指配来报告检测到的质量。精确质量大于1000的化合物通常作为双电荷离子、三电荷离子和/或四电荷离子被检测。CAD：荷电气溶胶检测器。ELSD：蒸发光散射检测器。
分析LCMS条件A：柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含0.05％TFA的水；流动相B：95:5的乙腈:含0.05％TFA的水；温度：50℃；梯度：3分钟内0-100％B，然后以100％B保持1.0分钟；流速：1mL/min；检测：质量。
分析LCMS条件B：柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5的乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：3分钟内0-100％B，然后以100％B保持1.0分钟；流速：1.0mL/min；检测：质量。
分析UHPLC-CAD条件A：柱：Waters BEH Phenyl,150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到15分钟的10％B至35％B，从16分钟到25分钟的35％B至95％B，然后以95％B保持1.0分钟；运行后时间：4分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：3μL 2mg/mL在DMSO中的样品；检测：在100PA范围和35psi气体的CAD。
分析UHPLC-CAD条件B：柱：Waters BEH Phenyl,150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到25分钟的10％B至95％B，然后以95％B保持1.0分钟；运行后时间：4分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：3μL 2mg/mL在DMSO中的样品；检测：在100PA范围和34psi气体的CAD。
通用程序：
所有操作均在Prelude肽合成仪(Protein Technologies)的自动化下进行。除非说明，所有程序均在装有底部玻璃料(frit)的40mL聚丙烯反应容器中进行。通过容器的底部和顶部将所述容器连接到Prelude肽合成仪。可以通过容器的顶部和底部加入DMF，DMF均匀地在容器的侧面上下洗过。仅通过容器的底部添加试剂，并使其向上穿过玻璃料以接触树脂。所有溶液通过容器底部除去。“周期性搅拌”描述了通过底部玻璃料的短暂N2气脉冲；脉冲持续大约5秒，每30秒发生一次。通常不使用制备后超过两周的氨基酸溶液。HATU溶液在制备两周之内使用。DMF＝二甲基甲酰胺；HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺；2-氯三苯甲基氯树脂＝2-氯三苯基甲基氯树脂(Chem-Imprex，100-200目，黄色珠，1.1meg/g)。所使用的常见氨基酸列于下面，其中括号内指示了侧链保护基团。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH。以下脂肪酸衍生物用于最后的偶联步骤，HO2C(CH2)nCH3，n＝10-18和HO2C(CH2)n(CO2 tBu)，n＝10-18。
该通用程序描述了以0.4mmol规模进行的实验，该规模是通过与树脂结合的(9H-芴-9-基)甲基(2-(氨氧基)乙基)氨基甲酸酯的量确定的。这个规模相当于大约364mg的上述树脂。然而，基于加载效率46％的假设，使用了800mg树脂。在加载反应结束时，用甲醇淬灭过量的2-氯三苯基甲基氯。通过用规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序从0.400mmol按比例缩小。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都以接头加载程序和树脂溶胀程序开始，这些程序在下面描述为“接头加载程序”和“树脂溶胀程序”。然后，氨基酸与伯胺N末端的偶联使用下面描述的“伯胺偶联程序”。氨基酸与仲胺N末端的偶联使用下面描述的“仲胺偶联程序”。树脂的全局脱保护和切割使用下面描述的“全局脱保护程序”。最后，含有用于LC-MS纯化的粗产物的澄清溶液的制备使用下面描述的“样品制备程序”。
接头加载程序：使用规模0.4mmol准备六个反应容器(RV)，其中针对每个RV中的树脂加载0.4mmol的(9H-芴-9-基)甲基(2-(氨氧基)乙基)氨基甲酸酯。将DIEA(2.95mL，16.9mmol)添加到在0℃的CH2Cl2(72mL)中的(9H-芴-9-基)甲基(2-(氨氧基)乙基)氨基甲酸盐酸盐(化合物4，0.803g，2.4mmol)的混合物中。在它变得均匀后，立即将12mL该澄清溶液添加到含有800mg 2-氯三苯甲基氯树脂的30mL小瓶中。将所有6个小瓶放置在750rpm的摇床上75分钟。然后，一次向一个小瓶中添加0.2mL MeOH，各自以750rpm摇动2分钟。将树脂转移至40mL RV中，用CH2Cl2(8mL×3)、DMF(8mL×3)、CH2Cl2(10mL×3)洗涤。将该过程(MeOH淬灭和CH2Cl2/DMF/CH2Cl2洗涤)施加于另外5个小瓶，从而在六个RV中得到树脂结合的接头化合物5。
树脂溶胀程序：将含有来自前一步骤的树脂的RV与Prelude肽合成仪连接，并如下洗涤(溶胀)三次：向RV中添加DMF(10mL)，之后周期性搅拌混合物10分钟，然后通过玻璃料排出溶剂。
伯胺偶联程序：
向含有来自前一步骤的树脂的RV中添加哌啶:DMF(20:80v/v，10.0mL)。周期性搅拌混合物5分钟，然后通过玻璃料排出溶液。再次向RV中添加哌啶:DMF(20:80v/v，10.0mL)。周期性搅拌混合物5分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从底部洗涤一次：通过容器底部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。依次向RV中添加氨基酸或脂肪酸(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)、HATU(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)和DIPEA(0.8M，在DMF中，2.0mL，4eq)。周期性搅拌混合物15分钟或30分钟，然后通过玻璃料排出反应混合物溶液(对第一偶联反应仅使用15分钟反应时间以在Prelude合成仪上形成第一个酰胺键；对于所有其他序列，应用30分钟反应时间)。如下将树脂连续洗涤三次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(8.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向RV中添加DMF(3.3mL)、DIPEA(0.8M，在DMF中，1.5mL，3eq)。将混合物搅拌30秒后，添加乙酸酐(1.0M，在DMF中，5.0mL，12.5eq)。周期性搅拌混合物10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从底部洗涤一次：通过容器底部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一个步骤。
仲胺偶联程序：
向含有来自前一步骤的树脂的RV中添加哌啶:DMF(20:80v/v，10.0mL)。周期性搅拌混合物5分钟，然后通过玻璃料排出溶液。再次向RV中添加哌啶:DMF(20:80v/v，10.0mL)。周期性搅拌混合物5分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从底部洗涤一次：通过容器底部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。依次向反应容器中添加氨基酸或脂肪酸(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)、HATU(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)和DIPEA(0.8M，在DMF中，2.0mL，4eq)。周期性搅拌混合物30分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤三次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(8.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。依次向反应容器中再次添加氨基酸或脂肪酸(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)、HATU(0.2M，在DMF中，4.0mL，2eq)和DIPEA(0.8M，在DMF中，2.0mL，4eq)。周期性搅拌混合物30分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤三次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(8.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向RV中添加DMF(3.3mL)、DIPEA(0.8M，在DMF中，1.5mL，3eq)。将混合物搅拌30秒后，添加乙酸酐(1.0M，在DMF中，5.0mL，12.5eq)。周期性搅拌混合物10分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从底部洗涤一次：通过容器底部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂从顶部连续洗涤四次：对于每次洗涤，通过容器顶部添加DMF(10.0mL)，并将所得混合物周期性搅拌2分钟，然后通过玻璃料排出溶液。所得树脂直接用于下一个步骤。
全局脱保护程序：
在Prelude上的程序完成之后，用CH2Cl2(8mL×6)洗涤每个RV，并使其风干。一旦树脂自由流动，将其转移到30mL小瓶中，并添加8mL切割溶液(见下文)。将小瓶在摇床中以750rpm搅拌75分钟后，过滤反应混合物。将得到的透明黄褐色溶液分装到四个各自含有16mL二乙醚的25mL试管中，导致形成白色悬浮液。将每个试管离心，用二乙醚洗涤两次，在每个试管中形成白色固体。如下制备切割溶液(50mL)：在250ml锥形瓶中添加500mg二硫苏糖醇、46mL TFA、2.5mL水和1.0mL三异丙基硅烷，搅拌形成澄清溶液。
样品制备程序：
向每个含有从前一步骤获得的粗产物的试管中依次添加0.4mL DMSO和0.4mLMeOH。搅拌1分钟后，在许多情况下形成澄清溶液。然而，如果试管中仍存在固体，则添加更多DMSO(0.2mL)，并将混合物搅拌2分钟。此时，如果剩余固体，则除去澄清溶液并添加更多DMSO(至多1.0mL)。将得到的澄清溶液进行制备型LC-MS，每次进样2.0mL。
化合物A的合成
将DMAP(2.80g，23.0mmol)添加到十五烷二酸(25.0g，92.0mmol)在2-Me-THF(250mL)中的混合物中。在室温下搅拌10分钟后，添加叔丁醇(13.2mL，138mmol)并在室温下继续搅拌10分钟。所得悬浮液在60℃加热10分钟之后，变成澄清的无色溶液。在压力均衡的加料漏斗中，在2小时内在60℃下将BOC-酸酐(26.0g，119mmol)的THF(100mL)溶液添加到上述反应混合物中。在添加结束时，反应混合物变成浅粉色透明溶液。在60℃下继续搅拌18小时。冷却至0℃后，在5分钟内添加100mL的1.5N HCl。然后，将混合物加温至室温并搅拌15分钟。分离之后，将有机层用盐水(250mL x 2)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后浓缩。将得到的物质悬浮在乙腈(250mL)中，在室温下搅拌1小时，过滤除去未反应的二酸起始材料。然后，将滤液浓缩至大约125mL。将所得悬浮液在0℃下搅拌2小时，其随时间变得更加混浊。过滤所得固体，用冷(0℃)乙腈(2x 15mL)洗涤，干燥，得到15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(化合物1，8.20g，25.0mmol，27.2％)产率)，为灰白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ2.35(t,J＝7.58Hz,2H),2.20(t,J＝7.46Hz,2H),1.68–1.54(m,4H),1.45(s,9H),1.34–1.24(m,18H).13C NMR(125MHz,CDCl3,ppm)δ179.91,173.44,79.93,35.64,34.08,29.57,29.48,29.46,29.41,29.39,29.29,29.23,29.09,29.06,28.12,25.12,24.70。
根据上述程序制备下列化合物：HO2C(CH2)nCO2 tBu,n＝10-18。在每种情况下通过利用它们在乙腈中的不同溶解度实现期望产物-单酯HO2C(CH2)nCO2 tBu与未反应的二酸HO2C(CH2)nCO2H和过度反应的二酯tBuO2C(CH2)nCO2 tBu的分离。
使用机械搅拌器在10分钟内将氢氧化钾(74.1g，1122mmol)分批添加到0℃下的N-羟基氨基甲酸叔丁酯(50.0g，376mmol)的无水乙醇(500mL)的澄清溶液中。在0℃下搅拌10分钟、然后在室温下搅拌20分钟之后，将反应混合物冷却至0℃，并在15分钟内分批添加2-溴乙胺氢溴酸盐(100g，488mmol)。在0℃下搅拌30分钟、然后在室温下搅拌5小时之后，将得到的白色悬浮液过滤，并用EtOH(40mL×2)洗涤滤饼。将合并的滤液浓缩至100mL体积，用t-BuOMe(500mL)和H2O(250mL)萃取。在分离之后，将水层用t-BuOMe(200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2×200mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，在高真空下浓缩并干燥，得到非常粘稠的液体(20.0g)。将所得液体溶解在t-BuOMe(300mL)中。在室温下将HCl(3M，在环戊基甲醚中)(40mL，120mmol)滴加到上述澄清溶液中。形成白色悬浮液。在室温下搅拌4小时后，过滤所得白色固体，用t-BuOMe洗涤，并在真空下干燥45分钟，得到2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(化合物2，15.5g，72.9mmol，19.4％产率)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.21(br s,1H),8.27(br s,2.6H),3.92(t,J＝5.26Hz,2H),2.98(t,J＝5.26Hz,2H),1.41(s,9H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6,ppm)δ157.10,80.79,72.00,37.46,28.46.
将碳酸氢钠(8.00g，95mmol)添加到2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(化合物2，13.5g，63.5mmol)、Fmoc-OSu(25.7g，76.0mmol)的THF(450mL)和水(150mL)的搅拌混合物中。在室温下搅拌过夜之后，在真空下除去所有挥发性组分。在水层用固体NaCl饱和之后，用EtOAc(400mL，200mL)萃取残余物。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。使残余物在硅胶上进行快速色谱，用EtOAc/己烷洗脱。合并较纯的级分，浓缩，并使用上述条件再次纯化残余物。再次，将较纯的级分合并浓缩。使用完全相同的条件第三次纯化残余物。合并纯的级分，浓缩，并在高真空下干燥，得到化合物3(19.2g，48.2mmol，76％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ7.78(d,J＝7.32Hz,2H),7.65(d,J＝7.32Hz,2H),7.63,(s,1H),7.42(t,J＝7.32Hz,2H),7.33(t,J＝7.232Hz,2H),6.00(br s,1H),4.40(d,2H),4.26(t,J＝7.10Hz,1H),3.91(t,J＝4.20Hz,2H),3.49–3.46(m,2H),1.52(s,9H).13C NMR(125MHz,CDCl3,ppm)δ157.54,156.90,144.06,141.32,127.68,127.08,125.23,119.96,82.11,75.66,66.91,47.30,39.23,28.24.
在室温下将HCl(100mL，400mmol，4M，在二噁烷中)添加到化合物3(8.6g，21.6mmol)、1,4-二甲氧苯(7.46g，54.0mmol)在乙醚(100mL)中的搅拌溶液中。在室温下搅拌过夜之后，混合物变成几乎不能被搅拌的浓稠的悬浮液。添加更多的乙醚(400mL)并将所得悬浮液在室温下搅拌30分钟。然后在氮气下过滤，用乙醚(3×100mL)洗涤固体，得到化合物4(6.36g，19.0mmol，87％产率)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ11.10(br,s,2.60H),7.89(d,J＝7.58Hz,2H),7.70(d,J＝7.34Hz,2H),7.54(br t,J＝5.5Hz,1H),7.42(t,J＝7.32Hz,2H),7.34(t,J＝7.32Hz,2H),4.31(d,J＝6.6Hz,2H),4.23(t,J＝6.6Hz,1H),4.06(t,J＝5.38Hz,2H),3.28(q,J＝5.22Hz).13C NMR(125MHz,DMSO-d6,ppm)δ156.74,144.32,141.22,128.11,127.57,125.64,120.60,73.50,66.08,47.17,38.91.
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：柱：XBridge CSH C18,19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：23分钟内0-34.9％B，然后以100％B保持2分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将得到的含有期望产物的水溶液在氮气流下冷却至-78℃并冻干，得到标题化合物A，为白色固体(88mg，25.9％产率，LC-CAD纯度98.6％)。
分析条件A：保留时间＝1.24分钟；ESI-MS(M+H)+＝775.30。
分析条件B：保留时间＝1.05分钟；ESI-MS(M+H)+＝775.25。
使用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗物质：柱：XBridge C18,19x 200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：20分钟内20％-70％B，然后以100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将得到的含有期望产物的水溶液在氮气流下冷却至-78℃并冻干，得到标题化合物，为白色固体(47mg，3.4％产率，LC-CAD纯度72％)。
分析条件A：保留时间＝1.14分钟；ESI-MS(M+3H)+3＝1166.90，(M+3H)+4＝875.45。
分析条件B：保留时间＝0.991分钟；ESI-MS(M+3H)+3＝1166.90，(M+3H)+4＝875.50。
实施例5：PK增强子的溶液相合成
可以使用以下举例说明的程序制备本文中公开的PK增强子。
苄基(2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙基)氨基甲酸酯，3.将DBU(26.3ml，174mmol)分批添加到(2-溴乙基)氨基甲酸苄酯(30g，116mmol)和羟基氨基甲酸叔丁酯(24.76g，186mmol)的THF(75ml)中的搅拌混合物中。将反应混合物在室温下搅拌过夜(观察到沉淀物)。LCMS显示仅留下痕量的起始材料。将反应混合物浓缩，用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯相，用水、盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥。在浓缩之后，获得45g粗产物，进行色谱分离(己烷中的0-20％丙酮)。在分离之后，获得(2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(32.9g，106mmol，91％产率)，为非常粘稠的淡黄色油。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ7.43-7.30(m,5H),5.75(br.s.,1H),5.32(s,1H),5.14(s,2H),3.94-3.85(m,2H),3.54-3.42(m,2H),1.50(s,9H).
(2-氨基乙氧基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐，4。将(2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(16.4g，52.8mmol)溶解在MeOH(161ml)中，并添加氯仿(5.33ml，66.1mmol)。在仔细添加Pd/C(2.81g，2.64mmol)之前，用氮气吹扫溶液。然后将溶液冷却至0℃并缓慢滴加三乙基硅烷(76ml，476mmol)。在添加过程中观察到H2析出，并且它是放热的。在添加之后，然后使反应逐渐加温过夜至室温。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用另外的甲醇洗涤，然后真空蒸发。然后将残余物用己烷研磨，过滤所得固体，用另外的己烷洗涤，并在抽吸下干燥，给出2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(10.2g，48.0mmol，91％产率)，为浅粉红色固体。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ8.78(br.s.,1H),8.31(br.s.,2H),4.24(s.,2H),3.39(s.,2H),1.48(s,9H).
((3,6,9-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十二烷-12-基)氧基)氨基甲酸叔丁酯，5.将N-甲基吗啉(5.17ml，47.0mmol)滴加到2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(4g，18.81mmol)、2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)乙酸(5.01g，18.81mmol)和HATU(7.87g，20.69mmol)的无水DMF(75ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释反应物并用1N HCl洗涤。然后用另外部分的乙酸乙酯萃取分离的水溶液，然后将合并的有机物用1N HCl、盐水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后再加入盐水洗涤。然后将有机层干燥(Na2SO4)，并且真空蒸发。然后将粗产物通过柱色谱法纯化，使用乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，给出6.25g(78％)的标题化合物。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ7.69(s,1H),7.41-7.28(m,6H),7.00-6.87(m,1H),5.81(br s,1H),5.14(s,2H),3.98(dd,J＝16.7,5.7Hz,4H),3.86(t,J＝4.8Hz,2H),3.55-3.46(m,2H),1.46(s,9H).MS m/e 447.0(M+Na+).
(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐，6.将5(6.25g，14.72mmol)溶于无水甲醇(58.9ml)中，添加氯仿(1.782ml，22.09mmol)，然后添加Pd-C(1.567g，1.472mmol)。然后用氢气(气囊)吹扫反应烧瓶并搅拌6小时，然后通过硅藻土过滤，蒸发，给出2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(4.87g，14.90mmol，101％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.00(br s,1H),8.71(br t,J＝5.7Hz,1H),8.18-7.99(m,4H),3.77(d,J＝5.7Hz,2H),3.69(t,J＝5.9Hz,2H),3.59(s,2H),3.36-3.23(m,3H),1.41(s,9H).
2-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(((S)-3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基)氨基)-5-氧代戊酸-(S)-叔丁酯，8.将(S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(7.，购自ChemImpex)(15g，44.5mmol)和(S)-2-氨基-3-羟基丙酸甲酯盐酸盐(6.92g，44.5mmol)溶解在DMF(148ml)中，将溶液冷却至0℃。添加HATU(18.60g，48.9mmol)，然后添加N-甲基吗啉(12.22ml，111mmol)。将反应物在0℃下在N2下搅拌12小时。将反应混合物用EtOAc稀释，用1N HCl淬灭，然后用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥，然后真空浓缩。通过色谱纯化(0-40％丙酮/己烷)纯化粗产物，给出2-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(((S)-3-羟基-)1-甲氧基-1-氧代丙-2-基)氨基)-5-氧代戊酸-(S)-叔丁酯(16.31g，36.5mmol，82％产率)，为灰白色固体。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.37(m,5H),6.5(bs,1H),5.53(m,1H)；5.1(s,2H),4.7(m,1H),4.28(m,1H),4.1(bs,1H),3.95(m,1H),3.8(s,3H),2.4(m,2H),2.3(M,1H),1.7(m,1H),1.5(s,9H)；MS m/e 439.2(M+H+).
(S)-2-((S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酰胺基)-3-羟基丙酸，9.将2-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(((S)-3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基)氨基)-5-氧代戊酸-(S)-叔丁酯(14g，31.9mmol)溶于THF(106ml)和水(53.2ml)中并冷却至0℃。搅拌30分钟后，添加LiOH(0.688g，28.7mmol)。将反应混合物在此温度下在N2下搅拌。在反应完成之后，在0℃下将反应混合物的pH调节至约4。用EtOAc(3x150ml)萃取反应混合物。将合并的有机相在无水Na2SO4上干燥，并在旋转蒸发下浓缩，给出(S)-2-((S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-(氧代戊酰胺基)-3-羟基丙酸(13.01g，30.7mmol，96％产率)，为灰白色固体。MS m/e 425.0(M+H+).
(5S,10S)-5-(叔丁氧基羰基)-10-(羟甲基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,9,12,15-四氮杂十七烷酸-17-甲酯，10.将2-(2-氨基乙酰氨基)乙酸甲酯盐酸盐(5g，27.4mmol)溶于DMF(116ml)中，并充入(S)-2-((S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酰胺基)-3-羟基丙酸(11.62g，27.4mmol)。向该反应混合物中添加HATU(11.45g，30.1mmol)和N-甲基吗啉(7.53ml，68.5mmol)。将反应混合物在室温下在N2下搅拌12小时。LC/MS和HPLC指示反应完成。将反应混合物用EtOAc(150mL)稀释，并用1N HCl淬灭。分离有机层，用盐水(50mL)、NaHCO3水溶液(50mL)并且最后用盐水(3×50mL)洗涤。将有机层在无水Na2SO4上干燥并真空蒸发，给出期望的产物，为稠油，将其进行色谱纯化(0-10％MeOH/DCM)，得到期望的产物(5S,10S)-5-(叔丁氧基羰基)-10-(羟甲基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,9,12,15-四氮杂十七烷酸-17-甲酯(14g，25.3mmol，93％产率)，为稠油。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ7.38(m,5H),5.1(m,2H),4.0(m,6H),3.7(s,3H),2.4(m,2H),2.2(M,1H),1.9(m,1H),1.45(s,9H)；MS m/e 553.2(M+H+).
(5S,10S)-5-(叔丁氧基羰基)-10-(羟甲基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,9,12,15-四氮杂十七烷-17-酸，11.将(5S,10S)-甲基(5S,10S)-甲基-5-(叔丁氧基羰基)-10-(羟甲基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,9,12,15-四氮杂十七烷-17-酸酯(20g，36.2mmol)溶于THF(193ml)和水(97ml)中并冷却至0℃。搅拌30分钟后，添加LiOH(0.780g，32.6mmol)。将反应混合物在0℃在N2下搅拌5小时。通过LC/MS和HPLC监测反应的进程。在反应完成之后，将其用EtOAC(150mL)稀释，并用1N HCl中和。分离有机相，水相用EtOAc(3×50mL)萃取，经无水Na2SO4干燥，真空浓缩，高真空干燥12小时，得到期望的产物，为灰白色固体(18g，96％产率)。MS m/e 539.1(M+H+).
15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸，13.将十五烷二酸(20.2g，70.5mmol)的乙酸酐(70ml)悬浮液在Ar下加热至128℃。将所得溶液在此温度下搅拌6.0h，并且然后冷却至室温。将溶液用甲苯(100mL)稀释并蒸发。将残余物用甲苯(4×80mL)汽提并在真空下干燥6.5小时，给出27.53g灰白色固体。在室温和Ar下，在15分钟时间内分三批向上述固体(27.53g)和叔丁醇(235ml)的混合物中添加4-二甲基氨基吡啶(34.8g，282mmol)。将混合物加热至50℃，并将所得溶液在此温度下搅拌34.0小时。冷却至室温后，将混合物用甲苯(50mL)稀释，然后蒸发。将残余物用甲苯(2x100mL)汽提，然后溶于9/1的乙醚/CH2Cl2(600mL)中。将溶液用1M HCl(400mL)、0.5M HCl(400mL)、水(300mL)和盐水(300mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)并蒸发。将粗品溶于CH2Cl2(50mL)中并予以超声处理。将所得悬浮液通过中等玻璃料漏斗过滤，用两个小部分的CH2Cl2冲洗漏斗中的固体。将滤液和冲洗液合并，然后蒸发。将浓缩物进行色谱分离(120g快速柱筒，CH2Cl2到9/1CH2Cl2/i-PrOH)，得到下列物质(按洗脱顺序)：
-十五烷二酸二叔丁酯和15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸的约5/1混合物(7.19g，无色油)。
-15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(4.38g，19％产率)，为白色固体：LC/MS[M-H]-1＝327；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.37(t,J＝7.4Hz,2H),2.22(t,J＝7.5Hz,2H),1.63(m,4H),1.47(s,9H),1.28(m,18H).
-15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸和十五烷二酸的约4/1混合物(4.42g，灰白色固体)。
通过色谱法(120g快速柱筒，CH2Cl2到9/1 CH2Cl2/i-PrOH)分离二-和单叔丁酯的混合物(7.19g)，得到额外量的15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(0.8g，4％产率)，为白色固体。
通过色谱法(330g快速柱筒，Hex到4/1 Hex/丙酮)分离单叔丁酯和二酸的混合物(4.42g)，得到额外量的15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(2.92g，13％产率)，为白色固体。
15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸的总分离量为8.1g(36％产率)。
N2-((苄氧基)羰基)-N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,6-二氧杂-5,9-二氮杂十一烷-11-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-羟基-1-氧代丙烷-2-基)-L-谷氨酰胺叔丁酯，14.在室温在氮气氛下，将2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(3.73g，11.41mmol)和(5S,10S)-5-(叔丁氧基羰基)-10-(羟甲基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,9,12,15-四氮杂十七烷-17-酸(5.85g，10.87mmol)溶于DMF(36.2ml)中。将溶液冷却至0℃，然后添加HATU(4.55g，11.96mmol)，然后滴加N-甲基吗啉(2.99ml，27.2mmol)。将反应物加温过夜至室温。将反应物冷却至0℃，然后用冰水淬灭，并且在冰融化时剧烈搅拌。当在烧瓶周围的所有冰熔化时，形成沉淀(ppte)，然后抽吸过夜(缓慢)过滤。将得到的蜡状固体溶解在甲醇(200mL)中，然后蒸发。用甲醇(约20mL)处理，接着添加二乙醚，然后使产物沉淀(ppted)，通过抽吸收集，给出(23S,28S)-28-(((苄氧基)羰基)氨基)-23-(羟甲基))-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24-七氮杂二十九烷酸-29-叔丁酯6.4g(73％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.96(br s,1H),8.24-8.01(m,5H),7.87(br t,J＝5.6Hz,1H),7.62(br d,J＝7.8Hz,1H),7.40-7.30(m,5H),5.10-4.96(m,3H),4.30-4.24(m,1H),4.10(q,J＝5.3Hz,3H),3.93-3.84(m,1H),3.80-3.53(m,13H),3.31-3.23(m,2H),3.17(d,J＝5.3Hz,7H),2.90(s,1H),2.75-2.67(m,1H),2.35-2.20(m,2H),1.98-1.86(m,1H),1.82-1.71(m,1H),1.42-1.24(m,20H).MS m/e 811.4(M+H+)。
N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,6二氧杂-5,9-二氮杂十一烷-11-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-羟基-1-氧代丙烷-2-基)-L-谷氨酰胺叔丁酯，15.将甲醇(158ml)一次性添加到(23S,28S)28-(((苄氧基)羰基)氨基)-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24-七氮杂二十九烷酸-29-叔丁酯(6.4g，7.89mmol)，并且在氮气氛下搅拌固体直到胺溶解(约3小时)。然后添加Pd/C(0.840g，0.789mmol)，然后通过气囊引入氢气气氛。将反应物在室温下搅拌，然后通过玻璃滤纸过滤，蒸发滤液，给出(23S，28S)28-氨基-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24-七氮杂二十九烷酸-29-叔丁酯4.8g(90％产率)，为灰白色脆性固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.96(br s,1H),8.29-8.19(m,1H),8.17-7.96(m,3H),7.87(br t,J＝5.7Hz,1H),5.00(br s,1H),4.28-4.08(m,1H),3.78-3.56(m,10H),3.30-3.14(m,3H),2.90(s,1H),2.75-2.67(m,1H),2.34-2.06(m,3H),1.87-1.74(m,1H),1.68-1.50(m,1H),1.41(d,J＝4.3Hz,15H),1.10(s,1H).
(23S,28S)-28-(叔丁氧基羰基)-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮杂四十四烷酸-44-叔丁酯，16.
在0℃在氮气氛下将N-甲基吗啉(1.950ml，17.73mmol)滴加到(23S,28S)28-氨基-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24-七氮杂二十九烷酸-29-叔丁酯(4.8g，7.09mmol)、15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(2.446g，7.45mmol)和HATU(2.97g，7.80mmol)的部分溶液中。添加另外20mL DMF以增溶反应混合物，然后将反应混合物缓慢加温过夜至室温。然后使反应物在冰块(ice batch)中冷却，然后用冰淬灭，并在剧烈搅拌混合物的同时使其融化。然后过滤固体，得到胶状固体(6.1g)，将其转移到SFC中进行纯化。SFC纯化产生(23S,28S)-28-(叔丁氧基羰基)-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮杂四十四烷酸-44-叔丁酯(2.5g，2.53mmol，35.7％产率)，为白色固体，其用于下一个步骤。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.96(br s,1H),8.23-8.02(m,1H),7.97(br d,J＝7.5Hz,1H),7.84(t,J＝5.8Hz,1H),4.96(t,J＝5.6Hz,1H),4.32-4.21(m,1H),4.17-4.03(m,1H),3.85(d,J＝6.0Hz,1H),3.76(br d,J＝5.1Hz,1H),3.72-3.55(m,1H),3.30-3.24(m,1H),2.27-2.07(m,1H),2.01-1.86(m,1H),1.80-1.65(m,1H),1.49-1.38(m,5H),1.35(br s,1H),1.29-1.16(m,4H).MS m/e 987.7(M+H+).
(17S,22S)-1-(氨氧基)-22-羧基-17-(羟甲基)-4,7,10,13,16,19,24-七氧代-3,6,9,12,15,18,23-七氮杂三十八烷-38-酸，化合物A.将(23S,28S)28-(叔丁氧基羰基)-23-(羟甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八氧代-3,6-二氧杂-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮杂四十四烷酸-44-叔丁酯(2.5g，2.53mmol)溶于25mL+10mL冷却的92:8TFA:TIPS的洗涤混合物中。将溶液直接添加到所述白色固体中，并在室温下搅拌3小时。将溶液冷却至0℃，添加320mL庚烷:40mL MTBE，然后转移至冰箱中过夜。透明的油已经分离并且在烧瓶底部可见。除去上清液，添加冷二乙醚(1L)。将所得白色固体搅拌2小时，然后在布氏漏斗中快速过滤并干燥，给出(17S,22S)-1-(氨氧基)-22-羧基-17-(羟甲基)-4,7,10,13,16,19,24-七氧代-3,6,9,12,15,18,23-七氮杂三十八烷-38-酸2.1g(产率95％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.42-8.34(m,1H),8.20-7.95(m,3H),4.81-4.74(m,1H),4.61(dd,J＝10.9,4.6Hz,1H),4.48(dd,J＝10.8,7.5Hz,1H),4.30-4.03(m,1H),3.93-3.30(m,10H),2.47-2.39(m,1H),2.33(dt,J＝3.7,1.9Hz,1H),2.27-2.08(m,3H),2.05-1.91(m,1H),1.82-1.69(m,1H),1.52-1.43(m,2H),1.24(s,9H),1.21-1.00(m,1H).用CAD检测的HPLC分析表明纯度为81％，Agilent 1100LC/UV/CAD，ACE C18-300 300X 4.6mm ID，5μm,A：水-0.05％TFA；B:ACN-0.05％TFA。
实施例6：另外的PK增强子的溶液相合成
分析LCMS条件A：柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含0.05％TFA的水；流动相B：95:5的乙腈:含0.05％TFA的水；温度：50℃；梯度：3分钟内0-100％B，然后以100％B保持1.0分钟；流速：1mL/min；检测：质量。
分析LCMS条件B：柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5的乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：3分钟内0-100％B，然后以100％B保持1.0分钟；流速：1.0mL/min；检测：质量。
分析UHPLC-ELSD条件A：HPLC条件：柱：Waters BEH C18，150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到15分钟的10％B至50％B，从16分钟到20分钟的50％B至60％B，从21分钟到26分钟的60％B至95％B，然后以95％B保持4.0分钟；运行后时间：4分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL 1mg/mL在50/50MeCN/水中的样品；MS条件：质量范围m/z 120-2000。电离和模式：电喷雾电离，正离子模式。ELSD条件：增益：20。漂移管温度：60℃。气体流速：40psi。
分析UHPLC-ELSD条件B：HPLC条件：柱：Waters BEH CSH C18，150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到24分钟的10％B至95％B，然后以95％B保持3.0分钟；运行后时间：4分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：2μL 1mg/mL在50/50MeCN/水中的样品；MS条件：质量范围m/z 120-2000。电离和模式：电喷雾电离，正离子模式。ELSD条件：增益：50。漂移管温度：60℃。气体流速：40psi。
分析UHPLC-CAD条件C：HPLC条件：柱：Waters BEH Phenyl，150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到25分钟的10％B至95％B，然后以95％B保持2.0分钟；运行后时间：4分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL 1mg/mL在MeOH中的样品；
MS条件：质量范围m/z 120-2000。电离和模式：电喷雾电离，正离子模式。
CAD条件：范围：100PA。气体流速：35psi。
分析UHPLC-CAD条件D：HPLC条件：柱：Waters BEH Phenyl，150x 2.1mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含0.05％TFA的水，流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：35℃；梯度分布：从0分钟到15分钟的10％B至35％B，从16分钟到25分钟的35％B至95％B，然后以95％B保持2.0分钟；运行后时间：3分钟(在初始流动相条件下)；流速：0.35mL/min；进样体积：2μL 1mg/mL在50/50MeOH/水中的样品；MS条件：质量范围m/z 120-2000。电离和模式：电喷雾电离，正离子模式。CAD条件：范围：100PA。气体流速：35psi。
PEG36-Gluγ-C13-CH3(8)的合成。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基十四烷酸酯(1)。将CH2Cl2中的DCC(1M，99mL，99mmol)添加到DMF(100mL)中的十四烷酸(20.55g，90mmol)的搅拌溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，过滤，浓缩并在高真空下干燥。将所得固体悬浮在乙醚/己烷(1:3，80mL)中45分钟，过滤收集并干燥，得到2,5-二氧代吡咯烷-1-基十四烷酸酯(1)(16.96g，52.1mmol，58％产率)，为白色固体，其不经进一步纯化直接用于下一步。
(S)-5-(叔丁氧基)-5-氧代-4-十四烷酰胺戊酸(2).将水(150ml)添加到(S)-4-氨基-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(10.5g，51.7mmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基十四烷酸酯(1)(16.81g，51.7mmol)和NaHCO3(5.21g，62.0mmol)在DME(450mL)中的搅拌混合物中。将所得澄清溶液在室温下搅拌4小时。在真空下除去DME，然后添加HCl水溶液(1M，67.2ml，67.2mmol)将pH调节至2-3。将所得悬浮液在0℃下搅拌30分钟，然后过滤。将所得白色固体用DME(2x)共沸干燥，然后在室温下在乙醚/己烷1:3(160mL)中悬浮1小时。过滤收集所得白色固体，并在高真空下干燥，得到(S)-5-(叔丁氧基)-5-氧代-4-十四烷酰胺戊酸(2)(8.5g，21mmol，40％产率)，其不经进一步纯化直接用于下一步。
(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-十四烷酰胺戊二酸-1-叔丁酯(3).在室温下将CH2Cl2中的DCC(1M，26.6mL，26.6mmol)添加到(S)-5-(叔丁氧基)-5-氧代-4-十四烷酰胺戊酸(2)(10.0g，24.2mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(3.06g，26.6mmol)在DMF(30mL)中的搅拌混合物中。将反应混合物在室温下搅拌过夜，过滤并浓缩。将残余物溶解在CH2Cl2中并通过硅胶快速色谱法纯化，用EtOAc/己烷(1:2)洗脱，得到(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-十四烷酰胺戊二酸-1-叔丁酯(3)(8.95g，17.5mmol，73％产率)，为白色固体。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ6.29(d,J＝8.0Hz,1H),4.58(m,1H),2.82(s,4H),2.70(m,1H),2.63(m,1H),2.29(m,1H),2.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.06(m,1H),1.60(m,2H),1.46(s,9H),1.25(m,20H),0.86(t,J＝6.3Hz,3H).13C-NMR(CDCl3,100MHz)δppm 173.0,170.3,168.7,167.6,82.4,51.2,36.0,31.5,29.29.29.27,29.25,29.11,28.97,28.92,27.6,27.15,27.10,25.21,25.11,22.3,13.7.
化合物5.在室温下将水(4.5mL)添加到化合物4(750mg、0.448mmol)、(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-十四烷酰胺戊二酸-1-叔丁酯3(297mg，0.582mmol)和NaHCO3(75mg，0.90mmol)在DME(13.5mL)中的搅拌混合物中。在将所得澄清溶液在室温下搅拌过夜之后，添加HCl水溶液(1M，0.896mL，0.896mmol)，并将混合物真空浓缩。通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4OAc洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物5(610mg，66％产率)，为白色固体。(M+2H)2+1036,(M+3H)3+691。
化合物6.将CH2Cl2中的DCC(1M，0.32mL，0.32mmol)添加到化合物5(550mg，0.266mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(36.7mg，0.319mmol)在CH2Cl2(12mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜，过滤，并在真空下浓缩，得到化合物6，为白色固体，将其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
化合物7.在室温下将水(2.5mL)添加到化合物6(577mg，0.266mmol)、2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯(Miao,Z.；Liu,J.；Norman,T.；Driver,R.WO 2006/069246)(70.3mg，0.399mmol)和NaHCO3(33.5mg，0.40mmol)在DME(7.5mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜，并浓缩。通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4Cl洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物7(360mg，61％产率)，为白色固体。(M+2H)2+1115,(M+3H)3+743。
化合物8.在室温下将TFA(2mL)添加到化合物7(274mg，0.123mmol)、1,4-二甲氧基苯(155mg，1.12mmol)在CH2Cl2(2mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌4小时，然后浓缩。通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4Cl洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物8(228mg，84％产率)，为白色固体。使用分析UHPLC-ELSD条件A确定其UHPLC-ELSD纯度为93.3％。(M+2H)2+1037,(M+3H)3+691。
PEG36-Gluγ-C13-CO2H(16)的合成.
14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酸(9).向1L火焰干燥的圆底烧瓶中充入十四烷二酸(21g，81mmol)、DMAP(9.93g，81mmol)和甲苯(300mL)。在室温下将混合物搅拌15分钟后，添加2-甲基丙-2-醇(11.7mL，122mmol)和二碳酸二叔丁酯(26.6g，122mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，然后在116℃下加热15小时。将混合物浓缩，残余物在硅胶上经历快速色谱，用含1％HOAc的EtOAc/己烷(1:2)洗脱，得到14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酸(9)(9.0g，29mmol，35％产率)。通过1H-NMR，该物质的纯度大约为80％(主要杂质是二叔丁酯)，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
1-叔丁基14-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十四烷二酸酯(10).将CH2Cl2中的DCC(1M，59.6mL，59.6mmol)添加到14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酸(9)(12.5g，39.8mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(6.86g，59.6mmol)在CH2Cl2(200mL)中的搅拌溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用CH2Cl2洗脱，得到14-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-十四烷二酸-1-叔丁酯(10)(6.2g，15mmol，38％产率)，为白色固体。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ2.84(br s,4H),2.60(t,J＝7.2Hz,2H),2.20(t,J＝7.5Hz,2H),1.74(m,2H),1.57(m,2H),1.44(s,9H),1.40(m,2H),1.26(m,14H).13C-NMR(CDCl3,100MHz)d173.4,169.2,168.7,79.9,35.6,31.0,29.54,29.51,29.47,29.34,29.31,29.09,28.8,28.1,25.6,25.1。
(S)-5-(叔丁氧基)-4-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)-5-氧代戊酸(11).将水(40ml)添加到(S)-4-氨基-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(1.600g，7.87mmol)、14-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十四烷二酸-1-叔丁酯(10)(3.6g，7.87mmol)和NaHCO3(0.794g，9.45mmol)在DME(120mL)中的搅拌混合物中。将所得澄清溶液在室温下搅拌过夜。在真空下除去DME，添加HCl水溶液(1M，9.45ml，9.45mmol)将pH调节至2-3。将混合物用CH2Cl2(1×250mL，2×50mL)萃取，同时将水层用固体NaCl饱和。将合并的有机层在Na2SO4上干燥，过滤，浓缩，并在高真空下干燥，得到(S)-5-(叔丁氧基)-4-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)-5-氧代戊酸(11)(5.14g，10.3mmol)，为白色固体，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)戊二酸-1-叔丁酯(12).将CH2Cl2中的DCC(1M，11.8mL，11.8mmol)添加到(S)-5-(叔丁氧基)-4-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)-5-氧代戊酸(11)(3.93g，7.87mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(1.359g，11.81mmol)在CH2Cl2(100mL)中的搅拌溶液中。将混合物在室温下搅拌20小时，然后过滤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用EtOAc/CH2Cl2(1:19)洗脱，得到((S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1)-基)2-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)戊二酸-1-叔丁酯(12)(3.2g，68％产率)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ6.27(d,J＝7.8Hz,1H),4.59(m,1H),2.84(s,4H),2.71(m,1H),2.63(m,1H),2.31(m,1H),2.22(d,J＝8.2Hz,2H),2.18(d,J＝7.8Hz,2H),2.08(m,1H),1.58(m 4H),1.47(s,9H),1.43(s,9H),1.25(m,16H).13C-NMR(CDCl3,100MHz)d 173.41,173.37,170.7,169.1,168.0,82.8,79.9,51.6,36.4,35.6,29.58,29.47,29.35,29.30,29.10,28.12,27.99,27.55,27.50,25.59,25.48,25.13。
化合物13.将水(4mL)添加到化合物4(750mg、0.448mmol)(购自QuantaBioDesign,Powell,Ohio)、(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-(14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酰胺)戊二酸-1-叔丁酯(12)(401mg，0.672mmol)和NaHCO3(45.1mg，0.537mmol)的DME(12mL)溶液的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜后，添加HCl水溶液(1M，0.537mL，0.537mmol)。将混合物真空浓缩，并通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4Cl洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物13(870mg，90％产率)，为白色固体。(M+2H)2+1079,(M+3H)3+719。
化合物14.在室温下将CH2Cl2中的DCC(1M，0.605mL，0.605mmol)添加到化合物13(870mg，0.403mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(69.6mg，0.605mmol)在CH2Cl2(10mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜，过滤，浓缩并在高真空下干燥，得到化合物14，为白色固体，将其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
化合物15.在室温下将水(4mL)添加到化合物14(908mg，0.403mmol)和2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯(2)(142mg，0.806mmol)在DME(12mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜，浓缩，并通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4Cl洗脱(柱：Teledyne Isco C18 Redi SepRf High performance Gold；检测器：ELSD；流速：60mL/min；溶剂A：95％H2O、5％MeCN、10mM NH4OAc；溶剂B：5％H2O、95％MeCN、10mM NH4OAc)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物15(730mg，78％产率)，为白色固体。(M+2H)2+1158,(M+3H)3+772。
化合物16.在室温下将TFA(8mL，104mmol)添加到化合物15(420mg，0.181mmol)和1,4-二甲氧基苯(201mg，1.451mmol)在CH2Cl2(8mL)中的搅拌混合物中。将混合物在室温下搅拌3小时，浓缩，并通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.NH4Cl洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机物。将所得含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物16(240mg，63％产率)，为白色固体。使用分析UHPLC-ELSD条件B确定其UHPLC-ELSD纯度为75.2％。(M+2H)2+1052,(M+3H)3+701。
精胺-Gluγ-C14-CO2H(27)的合成
(4-((3-氨基丙基)(叔丁氧基羰基)氨基)丁基)(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(18).将水(100mL)添加到N-(苄氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(16.6g，66.4mmol)、丁烷-1,4-二基双((3-氨基丙基)氨基甲酸二叔丁酯)(17)(K；I；Andersen,K；Brierley,M.J.；Rizoli,S.；Eldursi,N；Mellor,I,.R.；4Peter N.R.Usherwood,P.N.R.；Hansen,S.H.；Krogsgaard-Larsen,P.；Jaroszewski,J.W.Chirality,2000,12,93)(19.1g，47.4mmol)在THF(300mL)的混合物中。在室温下搅拌过夜后，真空除去所有THF，用CH2Cl2(350ml，100ml×2)萃取混合物，同时用固体NaCl饱和水层。将合并的有机层在Na2SO4上干燥，过滤，在真空下浓缩，并通过快速色谱法纯化，用2MNH3-MeOH/CH2Cl2(从1:19到1:9)洗脱，得到(4-((3-(氨基丙基)(叔丁氧基羰基)氨基)丁基)(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(18)(5.19g，9.67mmol，产率20.4％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.22-7.40(m,5H),5.01-5.12(m,2H),3.34-3.48(m,4H),3.01-3.31(m,5H),2.65(br t,J＝6.60Hz,2H),1.86-2.19(m,4H),1.55-1.75(m,4H),1.43-1.50(m,4H),1.43(s,9H),1.42(s,9H).由于存在旋转异构体，13C-NMR谱非常复杂。
15-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十五烷二酸-1-(叔丁)酯(19).在室温下将15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酸(实施例4中的化合物1)(3.28g，10.0mmol)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(1.73g，15.0mmol)和EDC(2.88g，15.0mmol)在CH2Cl2(100mL)中的混合物搅拌16小时。然后将其用CH2Cl2(200mL)稀释，并用盐水/水(1:1)洗涤两次，经Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并在高真空下干燥，得到15-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十五烷二酸-1-叔丁酯(19)(4.26g，10.0mmol，100％产率)，其直接用于下一步骤。
(S)-5-(叔丁氧基)-4-(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰胺)-5-氧代戊酸(20).将水(30mL)中的NaHCO3(1.01g，12.0mmol)溶液添加到(S)-4-氨基-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(2.44g，12.0mmol)和15-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十五烷二酸-1-叔丁酯(19)(4.26g，10.0mmol)在DME(90mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌16小时后，在真空下除去所有DME，将pH调节至2-3，并将混合物用CH2Cl2(350mL，150mL)萃取。将合并的有机层在Na2SO4上干燥，过滤，浓缩，并在高真空下干燥，得到(S)-5-(叔丁氧基)-4-(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰胺)-5-氧代戊酸(20)(5.14g，10.0mmol，100％产率)，其直接用于下一步骤。
5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰基)-L-谷氨酸-1-(叔丁)酯(21).在室温下将(S)-5-(叔丁氧基)-4-(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰胺)-5-氧代戊酸(20)(5.14g，10.0mmol)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(1.73g，15.0mmol)和EDC(2.88g，15.0mmol)在CH2Cl2(100mL)中的混合物搅拌16小时。然后将其用CH2Cl2(200mL)稀释，并用盐水/水(1:1)洗涤两次。有机层经Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，使残余物经历快速色谱，用EtOAc/CH2Cl2洗脱，得到(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰胺)戊二酸-1-叔丁酯(21)(3.41g，5.58mmol，55.8％产率)(3步产率55.8％)，为白色固体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 6.20(brd,J＝7.82Hz,1H),4.62(td,J＝7.95,4.89Hz,1H),2.80-2.91(m,4H),2.56-2.79(m,2H),2.29-2.42(m,1H),2.17-2.28(m,4H),2.02-2.16(m,1H),1.54-1.69(m,4H),1.48-1.53(m,9H),1.44-1.48(m,9H),1.21-1.39(m,18H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.35,173.33,170.66,168.95,168.01,82.82,79.85,51.66,36.46,35.66,29.61,29.49,29.35,29.31,29.12,28.15,28.00,27.62,27.54,25.60,25.48,25.15。
(S)-8,13,21-三(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,8,13,17,22-五氮杂三十七烷酸-37-叔丁酯(22).将水(20mL)添加到(4-((3-氨基丙基)(叔丁氧基羰基)氨基)丁基)(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(18)(1.42g，2.65mmol)、(S)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-(15-(叔丁氧基)-15-氧代十五烷酰胺)戊二酸-1-叔丁酯(21)(1.62g，2.65mmol)在DME(60mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜后，在高真空下除去所有挥发性组分(包括水)，并将残余物用MeOH(2x)共沸干燥。将残余物溶于MeOH/CH2Cl2(1:9，<10mL)中并进行快速色谱，用MeOH/CH2Cl2洗脱，得到8,13,21-三(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,8,13,17,22-五氮杂三十七烷酸-37-(S)-叔丁酯(22)(2.74g，2.65mmol，100％产率)，为粘性液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.29-7.39(m,5H),7.12-7.25(m,1H),6.69-6.89(m,1H),5.67-5.95(m,1H),5.03-5.15(m,2H),4.30-4.47(m,1H),3.38-3.54(m,8H),3.05-3.32(m,8H),2.12-2.35(m,6H),1.86-2.05(m,1H),1.51-1.76(m,7H),1.45(s,9H),1.44(s,27H),1.17-1.33(m,20H)。由于存在旋转异构体，13C-NMR谱非常复杂。
(S)-5-(3-氨基丙基)-10,18-双(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三氧代-3-氧杂-5,10,14,19-四氮杂三十四烷酸-34-叔丁酯(23).在室温下将8,13,21-三(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,8,13,17,22-五氮杂三十七烷酸-37-(S)-叔丁酯(22)(1.36g，1.32mmol)和Pd-C(0.140g，10％重量)在乙醇(100mL)中的混合物在Parr振荡器(H2，30psi)中氢化18小时。过滤混合物，用EtOH洗涤，浓缩并在高真空下干燥，得到5-(3-氨基丙基)-10,18-双(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三氧代-3-氧杂-5,10,14,19-四氮杂三十四烷酸-34-(S)-叔丁酯(23)(1.19g，1.32mmol，100％产率)，将其直接用于下一步骤。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 6.91-7.09(m,1H),6.46-6.73(m,1H),4.34-4.54(m,1H),3.66-3.81(m,1H),3.10-3.36(m,10H),2.82-2.93(m,2H),2.58-2.67(m,3H),2.13-2.36(m,6H),1.55-1.72(m,6H),1.49-1.53(m,4H),1.48(s,9H),1.47(d,J＝3.18Hz,27H),1.22-1.37(m,20H)。由于存在旋转异构体，13C-NMR谱非常复杂。
(S)-20,28,33-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四氧代-3-氧杂-19,24,28,33,37-五氮杂四十一烷-41-酸(24).将吡啶(13mL)添加到5-(3-氨基丙基)-10,18-双(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三氧代-3-氧杂-5,10,14,19-四氮杂三十四烷酸-34-(S)-叔丁酯(23)(1.19g，1.32mmol)和二氢呋喃-2,5-二酮(0.66g，6.6mmol)的混合物中。将混合物在室温下搅拌16小时后，在真空下除去所有挥发性组分，并将残余物进行快速色谱，用含有0.5％AcOH的MeOH/CH2Cl2洗脱，得到(S)-20,28,33-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四氧代-3-氧杂-19,24,28,33,37-五氮杂四十一烷-41-酸(24)(1.32g，1.32mmol，100％产率)，为粘性液体。1H-NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm 4.38-4.50(m,1H),3.47-3.58(m,1H),3.09-3.32(m,9H),2.75(s,4H),2.64-2.73(m,2H),2.46-2.59(m,2H),2.27-2.35(m,2H),2.17-2.27(m,4H),2.07-2.14(m,4H),1.83-2.04(m,1H),1.67-1.80(m,3H),1.55-1.66(m,4H),1.41-1.54(m,38H),1.19-1.37(m,20H)。
1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(S)-8,13-双(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-4,8,13,17,22-五氮杂三十六烷-1,21,36-三羧酸-21,36-二叔丁酯(25).将CH2Cl2中的DCC(1.0M，2.0mL，2.0mmol)添加到(S)-20,28,33-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四氧代-3-氧杂-19,24,28,33,37-五氮杂四十一烷-41-酸(24)(1.32g，1.32mmol)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(0.23g，2.0mmol)在CH2Cl2(20mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌16小时后，将其过滤，浓缩，并在高真空下干燥，得到1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(S)-8,13-双(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-4,8,13,17,22-五氮杂三十六烷-1,21,36-三羧酸-21,36-二叔丁酯(25)(1.45g，1.32mmol，100％产率)，其直接用于下一步骤。
(S)-18,23,31-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五氧代-3,6-二氧杂-5,9,14,18,23,27,32-七氮杂四十七烷酸-47-叔丁酯(26).在室温下将NaHCO3(0.233g，2.77mmol)的水(4mL)溶液添加到1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)8,13-双(叔丁氧基羰基)-3,18,23-三氧代-4,8,13,17,22-五氮杂三十六烷-1,21,36-三羧酸-(S)-21,36-二叔丁酯(25)(1.45g，1.32mmol)和2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(0.561g，2.64mmol)在DME(12mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌6小时后，在真空下除去所有挥发性组分(包括水)，并将残余物用THF共沸干燥。将残余物进行快速色谱，用MeOH/CH2Cl2洗脱，得到(S)-18,23,31-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五氧代-3,6-二氧杂-5,9,14,18,23,27,32-七氮杂四十七烷酸-47-叔丁酯(26)(0.87g，0.75mmol，57％产率)，为粘性液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.33-4.48(m,1H),3.80-3.94(m,4H),3.42-3.55(m,14H),3.08-3.32(m,7H),2.68-2.77(m,4H),2.50-2.63(m,4H),2.13-2.34(m,4H),1.54-1.74(m,6H),1.43-1.53(m,45H),1.22-1.35(m,20H).由于存在旋转异构体，13C-NMR谱非常复杂。
(S)-1-(氨氧基)-25-羧基-4,7,22,27-四氧代-3,8,12,17,21,26-六氮杂四十一烷-41-酸(27).向18,23,31-三(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五氧代-3,6-二氧杂-5,9,14,18,23,27,32-七氮杂四十七烷酸-47-(S)-叔丁酯(26)(0.50g，0.43mmol)和DTT(0.067g，0.43mmol)在TFA(1.5ml)中的混合物中添加三乙基硅烷(0.10ml，0.63mmol)和水(0.10mL，5.6mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，然后使用N2气流过夜除去所有挥发性组分。使用以下条件通过制备型LC/MS对残余物进行纯化：柱：Waters CSH C18，19x200mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5的乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：25分钟内0-35％B，然后以100％B保持5分钟；流速：20mL/min。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机组分。将得到的含有期望产物的水溶液在氮气流下冷却至-78℃并冻干，得到标题化合物(27)，为白色固体(72mg，21％产率)。使用分析UHPLC-CAD条件C确定其LC-CAD纯度为94.9％。[MH]+745.09。
分析条件A：保留时间＝1.27分钟；ESI-MS(MH)+＝744.55。
分析条件B：保留时间＝1.20分钟；ESI-MS(MH)+＝744.40。
化合物39的合成：
18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷二酸-1-(叔丁)酯(29).将EDC(1.406g，7.33mmol)添加到18-(叔丁氧基)-18-氧代十八烷酸(28)(通过与用于制备实施例4中的化合物1的方法相似的方法制备)(2.09g，5.64mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(0.844g，7.33mmol)在CH2Cl2(40mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜，用CH2Cl2(100mL)稀释并用NaHCO3洗涤。在分离之后，将水层用CH2Cl2(80mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。使残余物经历快速色谱，用CH2Cl2洗脱，得到18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-十八烷二酸-1-叔丁酯(29)(2.13g，4.55mmol，81％产率)，为白色固体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ2.85(br s,4H),2.62(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(t,J＝7.6Hz,2H),1.77(quin,J＝7.5Hz,2H),1.67-1.54(m,3H),1.50-1.37(m,10H),1.37-1.21(m,22H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.33,169.12,168.67,79.85,35.67,30.98,29.65(br s),29.62(brs),25.61,29.55,29.50,29.36,29.31,29.12,29.09,28.81,28.15,25.15,24.60。
(S)-18-((6-(((苄氧基)羰基)氨基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸叔丁酯(30).将NaHCO3(0.41g，4.83mmol)添加到18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷二酸-1-叔丁酯(29)(1.13g，2.416mmol)和Lys(Nε-CBZ)-OtBu盐酸盐(1.17g，3.14mmol)在DME(60mL)和水(20mL)中的混合物中。将所得轻质悬浮液在室温下搅拌过夜。在真空下除去DME，然后添加HCl水溶液(1M，4.83mL，4.83mmol)将pH调节至2-3。将混合物用EtOAc(200mL，100mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，在真空下浓缩，进行快速色谱，用EtOAc/CH2Cl2洗脱，得到18-((6-(((苄氧基)羰基)氨基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸-1-(S)-叔丁酯(30)(1.66g，2.42mmol，100％产率)，为无色粘性液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.29-7.38(m,5H),6.08(br d,J＝7.34Hz,1H),5.06-5.19(m,2H),4.84-5.02(m,1H),4.48(td,J＝7.70,5.14Hz,1H),3.07-3.27(m,2H),2.15-2.24(m,4H),1.75–1.88(m,1H),1.49-1.70(m,7H),1.46(s,9H),1.44(s,9H),1.20-1.34(m,26H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.30,172.87,171.81,171.05,156.49,136.67,128.47,128.03,82.03,79.82,66.55,60.35,52.24,40.66,36.65,35.64,32.35,29.67,29.64,29.61,29.50,29.48,29.44,29.33,29.29,29.10,28.13,28.00,25.63,25.13,22.25,21.00,14.19.[MH]+689.62。
(S)-18-((6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸叔丁酯(31).使18-((6-(((苄氧基)羰基)氨基)-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸-(S)-叔丁酯(30)(1.060g，1.2mmol)和Pd-C(0.128g，1.200mmol)在EtOH(50mL)中的混合物在室温下氢化(气囊)过夜。在用氮气真空吹扫几个循环后，仔细地过滤反应混合物，并用EtOH洗涤。浓缩滤液并在高真空下干燥，得到(31)18-((6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸-(S)-叔丁酯(0.67g，1.2mmol，100％产率)，为无色液体，其直接用于下一步骤。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm6.40-6.59(m,1H),4.30-4.50(m,1H),3.16-3.37(m,2H),2.65-2.81(m,2H),2.10-2.25(m,4H),1.72-1.84(m,1H),1.47-1.67(m,7H),1.43(s,9H),1.41(s,9H),1.22-1.36(m,26H).13C-NMR(CDCl3)δppm173.53,173.48,171.90,82.10,79.95,52.47,50.19,40.80,36.50,35.62,32.11,30.66,29.63,29.60,29.56,29.48,29.44,29.33,29.25,29.05,28.07,27.94,25.66,25.09,22.41.[MH]+555.63。
(S)-19-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,21-三氧代-2,7,10-三氧杂-4,14,20-三氮杂三十八烷酸-38-叔丁酯(32).将NaHCO3(0.202g，2.40mmol)添加到2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸(0.715g，1.44mmol)、18-((6-氨基-1-(叔丁氧基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-18-氧代十八烷酸-(S)-叔丁酯(31)(0.67g，1.2mmol)在DME(15mL)和水(5)中的混合物中。在室温下搅拌过夜后，在真空下除去所有挥发性组分，并将残余物进行快速色谱，用EtOAc/CH2Cl2洗脱，得到19-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,21-三氧代-2,7,10-三氧杂-4,14,20-三氮杂三十八烷酸-38-(S)-叔丁酯(32)(1.12g，1.20mmol，100％产率)，为无色粘稠液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.78(d,J＝7.58Hz,2H),7.63(d,J＝7.34Hz,2H),7.37-7.47(m,2H),7.30-7.36(m,2H),6.21-6.37(m,1H),6.00-6.17(m,1H),5.43-5.63(m,1H),4.40-4.54(m,3H),4.19-4.33(m,1H),3.75(t,J＝5.87Hz,2H),3.53-3.68(m,6H),3.42(br d,J＝4.89Hz,2H),3.22(q,J＝6.28Hz,2H),2.44(br t,J＝5.38Hz,2H),2.22(t,J＝7.58Hz,4H),1.75-1.89(m,1H),1.55-1.69(m,7H),1.47(s,9H),1.46(s,9H),1.20-1.35(m,26H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.34,173.01,171.82,171.38,156.56,143.99,141.34,127.70,127.05,125.06,119.98,82.07,79.87,70.25,70.12,70.05,67.29,66.63,52.27,47.33,40.86,38.99,37.03,36.67,35.67,32.45,29.70,29.67,29.64,29.63,29.53,29.51,29.38,29.33,29.13,29.03,28.15,28.04,25.68,25.16,22.47.[MH]+936.80。
(S)-1-氨基-15-(叔丁氧基羰基)-9,17-二氧代-3,6-二氧杂-10,16-二氮杂三十四烷酸-34-叔丁酯(33).将Et3N(2.5mL，18mmol)添加到19-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,21-三氧代-2,7,10-三氧杂-4,14,20-三氮杂三十八烷酸-38-(S)-叔丁酯(32)(1.12g，1.20mmol)在DMF(10mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜后，添加更多的Et3N(1.0mL，7.2mmol)。将混合物在室温下搅拌另外7小时。在真空下除去所有挥发性组分，并将残余物在高真空下干燥，得到1-氨基-15-(叔丁氧基羰基)-9,17-二氧代-3,6-二氧杂-10,16-二氮杂三十四烷酸-34-(S)-叔丁酯(33)(0.857g，1.20mmol，100％产率)，为无色液体，其直接用于下一步骤。[MH]+714.70。
(S)39-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,23,33,41-五氧代-2,7,10,17,20,27,30-七氧杂-4,14,24,34,40-五氮杂五十八烷酸-58-叔丁酯(34).将NaHCO3(0.20g，2.4mmol)添加到2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸酯(0.715g，1.44mmol)、1-氨基-15-(叔丁氧基羰基)-9,17-二氧代-3,6-二氧杂-10,16-二氮杂三十四烷酸-34-(S)-叔丁酯(33)(0.857g，1.20mmol)在DME(15mL)和水(5mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜后，在真空下除去所有挥发性组分，并加入HCl水溶液(1M，2.4mL，2.4mmol)将pH调节至2-3。将所得混合物用EtOAc(200mL，100mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。将残余物进行快速色谱(硅胶)，用MeOH/CH2Cl2洗脱，得到29-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,23,31-四氧代-2,7,10,17,20-五氧杂-4,14,24,30-四氮杂四十八烷酸-48-(S)-叔丁酯(34)(1.03g，0.940mmol，78％产率)，为无色粘性液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.78(d,J＝7.58Hz,2H),7.63(br d,J＝7.34Hz,2H),7.39-7.46(m,2H),7.30-7.36(m,2H),6.74(br s,1H),6.27-6.39(m,1H),6.05-6.24(m,1H),5.60-5.78(m,1H),5.19-5.40(m,3H),4.38-4.55(m,3H),4.17-4.32(m,1H),3.74-3.79(m,2H),3.72(t,J＝5.99Hz,2H),3.61-3.67(m,4H),3.54-3.61(m,8H),3.48-3.54(m,6H),3.37-3.47(m,4H),3.17-3.29(m,2H),2.49(br t,J＝5.87Hz,2H),2.43(t,J＝5.87Hz,2H),2.18-2.26(m,4H),1.76-1.90(m,1H),1.51-1.73(m,7H),1.48(s,9H),1.46(s,9H),1.18-1.37(m,26H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.34,173.04,171.80,171.43,171.34,156.62,144.00,141.35,127.69,127.05,125.04,119.97,82.05,79.87,77.55,70.22,70.18,70.16,70.07,69.92,67.23,66.51,53.40,52.29,50.86,47.34,40.99,39.18,39.04,37.04,36.95,36.67,35.67,32.42,29.70(br s),29.68(br s),29.65(br s),29.63(br s),29.54,29.51,29.38,29.34,29.32,29.12,29.01,28.15,28.0,25.68,25.16,22.51.[MH]+1254.90。
(S)-1-氨基-25-(叔丁氧基羰基)-9,19,27-三氧代-3,6,13,16-四氧杂-10,20,26-三氮杂四十四烷酸-44-叔丁酯(35).将Et3N(1.2mL，8.61mmol)添加到29-(叔丁氧基羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,13,23,31-四氧代-2,7,10,17,20-五氧杂-4,14,24,30-四氮杂四十八烷酸-48-(S)-叔丁酯(34)(330mg，0.301mmol)在DMF(3mL)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌20小时后，在高真空下除去所有挥发性组分。将残余物进行快速色谱，用2MNH3-MeOH/CH2Cl2(1:9)洗脱，得到1-氨基-25-(叔丁氧基羰基)-9,19,27-三氧代-3,6,13,16-四氧杂-10,20,26-三氮杂四十四烷酸-44-(S)-叔丁酯(35)(164mg，0.188mmol，62.3％产率)，为无色液体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 6.78-6.92(m,1H),6.48-6.62(m,1H),6.15-6.35(m,1H),4.35-4.53(m,1H),3.75(q,J＝6.11Hz,4H),3.59-3.68(m,8H),3.54-3.59(m,2H),3.49-3.54(m,2H),3.40-3.48(m,3H),3.16-3.29(m,2H),2.80-2.92(m,2H),2.38-2.57(m,4H),2.12-2.32(m,4H),1.75-1.87(m,1H),1.49-1.75(m,8H),1.47(s,9H),1.45(s,9H),1.20-1.38(m,26H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δppm 173.32,173.04,171.80,171.47,171.37,81.99,79.85,74.86,73.34,70.30,70.23,70.12,70.08,69.88,67.30,52.31,50.60,41.74,39.18,39.00,37.05,37.00,36.64,35.65,32.35,29.67,29.66,29.61,29.52,29.48,29.33,29.31,29.31,29.11,29.04,28.13,28.03,25.68,25.13,22.51.[MH]+873.75。
(S)-23-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五氧代-3,32,35,42,45-五氧杂-22,28,38,48-四氮杂五十二烷-52-酸(36).在室温下将吡啶(5.0mL)添加到1-氨基-25-(叔丁氧基羰基)-9,19,27-三氧代-3,6,13,16-四氧杂-10,20,26-三氮杂四十四烷酸-44-(S)-叔丁酯(35)(164mg，0.188mmol)和二氢呋喃-2,5-二酮(94mg，0.939mmol)的混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜后，在高真空下除去所有挥发性组分。通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.TFA洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机组分。将得到的含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物(S)-23-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五氧代-3,32,35,42,45-五氧杂-22,28,38,48-四氮杂五十二烷-52-酸(36)(123mg，0.126mmol，67.3％产率)，为无色液体。[MH]+973.81。
1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(S)-3,13,23,31-四氧代-7,10,17,20-四氧杂-4,14,24,30-四氮杂四十七烷-1,29,47-三羧酸-29,47-二叔丁酯(37).向(S)-23-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五氧代-3,32,35,42,45-五氧杂-22,28,38,48-四氮杂五十二烷-52-酸(36)(123mg，0.126mmol)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(21.8mg，0.190mmol)和EDC(31.5mg，0.164mmol)的混合物中添加CH2Cl2(5mL)。将得到的澄清溶液在室温下搅拌过夜后，LC/ELSD-MS显示出大约70％的转化率。添加更多的1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(21.8mg，0.190mmol)和EDC(31.5mg，0.164mmol)，并将混合物在室温下搅拌3.5小时。LC/ELSD-MS显示完全转化。将混合物用CH2Cl2(150mL)稀释，用水/盐水(2:1)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，在高真空下浓缩，得到1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3,13,23,31-四氧代-7,10,17,20-四氧杂-4,14,24,30-四氮杂四十七烷-1,29,47-三羧酸-(S)-29,47-二叔丁酯(37)(135mg，0.126mmol，100％产率)，为无色液体，其直接用于下一步骤。[MH]+1070.93。
(S)-39-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六氧代-3,6,17,20,27,30-六氧杂-5,9,14,24,34,40-六氮杂五十八烷酸-58-叔丁酯(38).将NaHCO3(21.2mg，0.252mmol)添加到1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3,13,23,31-四氧代-7,10,17,20-四氧杂-4,14,24,30-四氮杂四十七烷-1,29,47-三羧酸-(S)-29,47-二叔丁酯(37)(135mg，0.126mmol)和2-氨基乙氧基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(53.6mg，0.252mmol)在DME(4.5mL)和水(1.5mL)中的混合物中。将所得澄清溶液在室温下搅拌过夜。在真空下除去所有挥发性组分，并通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.TFA洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机组分。将得到的含有期望产物的水溶液冻干，得到标题化合物39-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六氧代-3,6,17,20,27,30-六氧杂-5,9,14,24,34,40-六氮杂五十八烷酸-58-(S)-叔丁酯(38)(118mg，0.104mmol，83.0％产率)。[MH]+1131.99。
(S)-1-(氨氧基)-33-羧基-4,7,17,27,35-五氧代-11,14,21,24-四氧杂-3,8,18,28,34-五氮杂五十二烷-52-酸(39).在0℃下将TFA(2mL)添加到39-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六氧代-3,6,17,20,27,30-六氧杂-5,9,14,24,34,40-六氮杂五十八烷酸-58-(S)-叔丁酯(38)(118mg，0.104mmol)和1,4-二甲氧基苯(144mg，1.043mmol)的CH2Cl2(2mL)中的混合物中。将混合物在0℃搅拌5分钟，然后在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，然后在高真空下干燥30分钟。通过中压反相色谱法在C-18柱上纯化残余物，用MeCN/aq.TFA洗脱(通过ELSD-MS监测)。合并含有期望产物的级分，使用氮气流除去挥发性有机组分。将得到的含有期望产物的水溶液在氮气流下冷却至-78℃并冻干，得到(S)-1-(氨氧基)-33-羧基-4,7,17,27,35-五氧代-11,14,21,24-四氧杂-3,8,18,28,34-五氮杂五十二烷-52-酸(39)(60.0mg、0.064mmol，61.3％产率)，为白色固体。使用分析UHPLC-CAD条件D确定其LC-CAD纯度为98.0％。[MH]+919.88,[M+2H]+/2 460.69。
实施例7：细胞内cAMP积累测定
H2松弛素的作用是通过其同源G蛋白偶联受体即松弛素家族肽受体(RXFP1)介导的，导致细胞类型依赖性细胞信号传导途径的组合刺激，所述信号传导途径可包括腺苷酸环化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3-激酶和细胞外信号调节激酶(Erk1/2)。Bathgate等人，2006.Pharmacol.Rev.58,7–31。这里描述的细胞内cAMP积累测定用于评估松弛素的生物活性和效力。测试化合物基于WT-RLX(图1)、AQ1(图2)和BM25/AN1(图3)。如实施例3中所述，通过肟连接将所示的PK延长剂与包含在AQ1和BM25/AN1中的对-乙酰基-苯丙氨酸缀合。
将稳定表达人RXFP1受体(基因座号LOC59350)的CHO-K1细胞(ATCC目录号CRL-9618)接种到96孔板中(10,000个/孔)，并在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天，从孔中除去培养基，并通过添加在50μL缓冲液(1X HBSS、5mM HEPES(7.2)、0.5mM IBMX、0.1％BSA)中的配体(松弛素多肽)来刺激细胞；在37℃下温育10分钟。利用未刺激细胞作为参考对照。终止反应，使用均相时间分辨荧光(HTRF)Dynamic 2cAMP试剂盒(CisBio，#62AM4PEC)根据制造商的方案测量细胞cAMP水平。使用EnVision 2104 Multilablel Reader(PerkinElmer)分析平板。用荧光强度@665nm/荧光强度@620nm x 10,000的比率表示信号。通过与根据已知浓度的cAMP生成的标准曲线比较，确定样品中cAMP的浓度。使用以一式两份进行的十点浓度反应曲线确定每种松弛素的效力。使用Microsoft Excel,Version 2013 Xlfit软件分析数据。使用允许可变斜率的四参数逻辑方程计算有效浓度50(EC 50)值，即反应为半最大值的点(表3)。
表3.细胞内cAMP积累测定结果.该表中使用的缩写：dK：D-赖氨酸；Sar：肌氨酸(N-甲基甘氨酸)；dGlu：D-谷氨酸；20kDa PEG：聚(乙二醇)，分子量20kDa；PEGn(例如，n为2、12、24或36)：-(O-CH2-CH2)n-O-；-C13-：-(C＝O)-(CH2)12-；-C14-：-(C＝O)-(CH2)13-；-C15-：-(C＝O)-(CH2)14-(这些缩写说明但不限制式I的-Cn-或这些术语在该表之外的使用)。在表3中的Gluγ-C13-、Gluγ-C14-、Gluγ-C15-和Gluγ-C17-中，脂肪酸的第一羰基碳通过酰胺键与(γ)Glu残基键合。
a松弛素缀合物AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH包含松弛素A链多肽SEQID NO:35和松弛素B链多肽SEQ ID NO:6，其中位于所述松弛素A链多肽的N末端的修饰的对-乙酰基-L-苯丙氨酸与包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的PK增强子连接，如式III中描绘
实施例8：体内药代动力学(PK)研究
雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝3)接受单次静脉内(IV)或皮下(SC)剂量(1mg/kg)的松弛素构建体(如上文实施例7中所述)，所述松弛素构建体配制在适合的缓冲液(例如20mM组氨酸、750mM NaCl，pH 6.0)中。在不同的时间点通过颈静脉采集血液样品至72小时。使血液样品在室温下凝固(30-60分钟)，然后在4℃下离心(1500-2000)，获得血清。离心后，将血清样品转移到96孔板中并储存在-80℃，一直到生物分析时为止。通过ELISA测量血清的松弛素浓度。
使用来自个体动物的松弛素浓度-时间曲线进行分析。使用Phoenix WinNonlin(版本6.4)或Kinetica(版本5)通过非房室方法计算药代动力学参数。报道了平均药代动力学参数Cmax、AUCinf、C24和半衰期(表4)。
表4.体内PK数据(缩写如表3).
a从0.2mpk调整
b从0.3mpk调整
c从0.5mpk调整
实施例9：大鼠肾血流量研究
用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(约250-300g)，用PE-205管进行气管插管以保持气道通畅性，并用加热的手术板将温度维持在37℃。将1.4F压力导管(Millar Inc.,Houston,TX)推进到右颈动脉中测量主动脉血压。将右颈静脉用PE-50管插管，以便施用测试品。通过腹膜后切口暴露左肾，并将多普勒血流探头(型号0.5VB,Transonic System Inc.,Ithaca,NY)附接至左肾动脉以监测血流量。在完成这些外科操作后补充戊巴比妥钠(15mg/kg，腹膜内)。在平衡10-15分钟后，通过输注泵(HarvardApparatus,Holliston,Ma)在30秒内以0.15至1.82mL/kg的给药体积以1mg/kg静脉内施用松弛素。使用连接到运行LabChart 7-Pro数据采集软件(ADInstruments,Dunedin,NewZealand)的台式计算机的Millar MPVS Ultra信号调节单元，在松弛素施用之后连续记录血压、心率和肾血流量45分钟(表5)。
表5.大鼠肾血流量变化(缩写如表3).
a动物在化合物施用后不久死亡。尸体剖检显示肾脏颜色苍白，表明血流完全丧失。
b观察到化合物难溶。
上面列表的结果展示了缀合物结构和位置之间的复杂关系及其所导致的肾血流量。单独的WT-RLX引起肾血流量比基线增加大约25％，这是基于松弛素的已知血管活性可以预期的。预期各个测试化合物，因为是松弛素激动剂(参见实施例7)，同样会引起肾血流量的增加。然而，令人惊讶的是，观察到一些化合物引起肾血流量减少。这种肾血流量损害可能是临床上显著的禁忌症，尤其是在经常观察到肾损害的心力衰竭中。化合物BM25/AN1、BM25/AN1-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3、AQ1和AQ1-Glu-C13-CH3均导致肾血流量受损(表5，见上文)。
这些结果是出乎意料且不可预测的。结构近似的化合物对肾血流量表现出不同的影响。一种FDA批准用于治疗糖尿病的市售长效形式的胰岛素，是一种胰岛素-C13-CH3缀合物，其安全性已被证明(Novo Nordisk A/S的NDA 21-878，第1页)。而与之相反，结构上与相似的BM25/AN1-C13-CH3的施用在大鼠中是致命的，并且尸体剖检显示肾脏苍白，表明肾血流被阻断。另外，AQ1松弛素，其在A链的位置处1含有对-乙酰基-苯丙氨酸的单个氨基酸取代，降低了肾血流量，而含有相同的非天然氨基酸取代但与20kDa PEG缀合的AQ1-20kDa PEG化合物则增加了肾血流量。此外，BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3降低了肾血流量，但AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3增加了肾血流量。上述引起肾血流量减少的化合物中有几种含有以甲基结尾的PK增强子，例如BM25/AN1-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-C13-CH3和AQ1-Glu-C13-CH3。然而，用AQ1-EEEGGG-Gluγ-C15-CH3和AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3处理的动物表现出良好的肾血流量，表明甲基并不总是引起肾血流量低下。与之相反，AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH和与包含肽组分和-C13-COOH、-C14-COOH或-C15-COOH脂肪酸的PK增强子缀合的其他测试的AQ1松弛素分子通常显示出改善的肾血流量(上文表5)。
实施例10：大鼠毒性研究
通过以1、5和15mg/kg/天的剂量皮下施用10天向大鼠给予AQ1-20kDa-PEG。在最终剂量后，对动物实施安乐死，解剖，并进行肾脏组织病理学检查。在所有剂量下在肾小管上皮细胞中都观察到空泡(图7C)。相比之下，在用溶媒(在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.5的150mM Arg)皮下给药10天的大鼠的肾小管上皮细胞中未观察到空泡(图7A)。
通过以10和40mg/kg/天的剂量皮下施用7天向大鼠给予AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH。在最终剂量后，对动物实施安乐死，解剖，并进行肾脏组织病理学检查。在所有剂量下在肾小管上皮细胞中都观察到空泡(图7B)。
通过以5、20和40mg/kg/天的剂量皮下施用7天向大鼠给予AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQID NO:139)-C14-COOH。在最终剂量后，对动物实施安乐死，解剖，并进行肾脏组织病理学检查。在所有剂量下，肾小管上皮细胞看起来正常，没有测试品相关空泡的迹象(图7D)。
化合物AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH也显示出良好的肾血流量结果(实施例9)、有利的溶解度曲线(数据未显示)和比AQ1-20kDa PEG显著更低的粘度。
实施例11：松弛素对人原代心脏成纤维细胞的影响
原代人心脏成纤维细胞(NHCF-V)购自Lonza,Fairlawn,NJ(目录号：CC-2904)。从正常成人心脏组织的心室分离NHCF-V细胞。细胞的平滑肌α-肌动蛋白染色呈阳性，表达≥90％的胶原蛋白I和≤10％的冯·维勒布兰德(Von Willibrand)因子VIII。将第3代至第6代的细胞用于实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)研究。将细胞在含有10％FBS完全培养基的FGMTM-3 BulletKitTM(目录号：CC-4526，Lonza)中培养。在汇合时，将细胞分散并在6孔板中以150,000/孔的密度在完全培养基中培养24小时。随后将细胞更换到无血清培养基(目录号：CC-3131，成纤维细胞基础培养基，Lonza)中24小时，然后在0.5ng/mL TGF-β(目录号：240-B，R&D Systems)存在下用人H2松弛素(目录号：3596-RN，R&D Systems)或AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH另外处理24小时。针对特征分析和处理持续时间的TGF-β浓度是基于先前的报告选择的。收获6孔板中的细胞用于总RNA提取和qRT-PCR分析。
使用RNeasy Mini Kit(目录号：74106，Qiagen)根据制造商的方案(包括基因组cDNA的柱上去除)提取总RNA。实时qRT-PCR以两步方式进行：cDNA合成和实时检测，其分别在PTC-100热循环仪(MJ Research)和ABI Prism 7700序列检测系统(AppliedBiosystems)中进行。根据制造商的方案，将TaqMan通用PCR母液混合物(AppliedBiosystems)用于随后的PCR反应中。所有qRT-PCR反应均一式两份进行。基于公开的序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，使用Primer Express第2版软件(Applied Biosystems)设计用于平滑肌α-肌动蛋白的序列特异性引物(有义：5’-AAATACTCTGTCTGGATCGGTGGCTCC-3’(SEQID NO:51)；反义：5’-CACATAGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGCTA-3’(SEQ ID NO:52))和管家基因L30的序列特异性引物(有义：5’-GCTGGAGTCGATCAACTCTAGG-3'(SEQ ID NO:53)；反义：5’-CCAATTTCGCTTTGCCTTGTC-3’(SEQ ID NO:54))。将平滑肌α肌动蛋白的表达水平对管家基因L30的表达水平归一化。使用Student’s T检验(Microsoft Excel，2013版)分析用AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH处理的人心脏成纤维细胞与载体处理的细胞的显著性差异，其中≤0.05的P值视为是显著的。
证明AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH在TGF-β处理的(0.5ng/mL；24小时)原代人心脏成纤维细胞中降低了促纤维化基因、平滑肌α-肌动蛋白的表达。如图6A-6B所示，基因表达的降低是浓度依赖性，并且对于人H2松弛素和AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH两者同样稳健。AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH可用作用于治疗纤维化疾病例如心脏纤维化的抗纤维化剂。
实施例12：PK增强子的其他实例
通常根据上文实施例4、5和6中描述的方法制备如下表6中所示的PK增强子。使用实施例3中描述的方法将这些PK增强子与包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽(例如，在A链位置1，例如RLX-AQ1)缀合，并进行表征，包括测试生物活性、药代动力学性质、对肾血流量、空泡形成的影响和对心脏成纤维细胞的影响，如实施例7-11中所述。
表6.示例性PK增强子(缩写如表3，并且如下所示)。
X＝Gluγ、(D)-Gluγ、Aspα、Aspβ、(D)-Aspα或(D)-Aspβ
Z＝(D)-Gluγ、Aspα、Aspβ、(D)-Aspα或(D)-Aspβ
FA＝脂肪酸＝例如C13-COOH、C14-COOH或C15-COOH；除非另外说明
大体上根据本文实施例3-5中描述的方法合成下表7中所示的PK增强子。使用实施例3中描述的方法将这些PK增强子与包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽(例如，在A链位置1，例如在RLX-AQ1中)缀合，并表征这些PK增强子，包括测试生物活性、药代动力学性质、对肾血流量、空泡形成的影响和对心脏成纤维细胞的影响，如实施例7-11中所述。
表7.示例性PK增强子(缩写：N-MeK：6-N-甲基赖氨酸；Dap：2,3-二氨基丙酸；其他如表3中所示)。
可以理解的是，在本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，依照它们的各种修改或改变将对本领域普通技术人员作出暗示并且将被包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。还应当理解的是，本文中使用的术语是仅仅出于描述示例性实施方案的目的，而不意图限制本公开的范围，所述范围仅由所附权利要求书限定。在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请、和/或其他文献出于所有目的通过提述完整并入本文，在程度上就像每一单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文献被单独地指出出于所有目的通过提述并入一样。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途
<130> 46561.2413
<150> 62/627,411
<151> 2018-02-07
<150> 62/456,161
<151> 2017-02-08
<160> 279
<210> 1
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser
50
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Ala Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser
50
<210> 3
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Arg Arg Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
50 55 60
Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
65 70 75 80
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
85
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
20
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser
20 25
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ala Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser
20 25
<210> 7
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
20 25 30
Gln Lys Arg
35
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Ile Glu Gly Gly Arg
1 5
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
caactctaca gtgcattggc taataaatgt tgccatgttg gttgtaccaa aagatctctt 60
gctagatttt gc 72
<210> 11
<211> 87
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
gactcatgga tggaggaagt tattaaatta tgcggccgcg aattagttcg cgcgcagatt 60
gccatttgcg gcatgagcac ctggagc 87
<210> 12
<211> 159
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
caactctaca gtgcattggc taataaatgt tgccatgttg gttgtaccaa aagatctctt 60
gctagatttt gcgactcatg gatggaggaa gttattaaat tatgcggccg cgaattagtt 120
cgcgcgcaga ttgccatttg cggcatgagc acctggagc 159
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttaaa cgg 33
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
atgattgaag gtggtcgt 18
<210> 15
<211> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Ile Glu Gly Gly Arg Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
1 5 10 15
Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
20 25 30
Thr Trp Ser Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu
35 40 45
Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu
50 55 60
Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys
65 70 75 80
Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
85 90
<210> 16
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii
synthetase
<400> 16
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His
145 150 155 160
Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 17
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA
<400> 17
ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60
tccagcccgc cggacca 77
<210> 18
<211> 77
<212> DNA
<213> Methanococcus jannaschii
<400> 18
ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60
tccggcccgc cggacca 77
<210> 19
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An optimized amber supressor tRNA
<400> 19
cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60
gagggttcga atcccttccc tgggacca 88
<210> 20
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An optimized AGGA frameshift supressor tRNA
<400> 20
gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60
cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89
<210> 21
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-L-phenylalanine
<400> 21
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 22
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-benzoyl-L-phenylalanine
<400> 22
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 23
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
propargyl-phenylalanine
<400> 23
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr
145 150 155 160
Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His
165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn
180 185 190
Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys
195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile
225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg
245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu
260 265 270
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn
275 280 285
Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg
290 295 300
Leu
305
<210> 24
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
propargyl-phenylalanine
<400> 24
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ile Pro Tyr
145 150 155 160
Leu Pro Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His
165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn
180 185 190
Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys
195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile
225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg
245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu
260 265 270
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn
275 280 285
Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg
290 295 300
Leu
305
<210> 25
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
propargyl-phenylalanine
<400> 25
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Lys Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr
145 150 155 160
Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His
165 170 175
Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn
180 185 190
Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys
195 200 205
Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile
225 230 235 240
Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg
245 250 255
Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu
260 265 270
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn
275 280 285
Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg
290 295 300
Leu
305
<210> 26
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 26
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His
145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 27
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 27
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
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115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 28
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 28
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
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115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 29
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 29
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His
145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 30
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-acetyl-phenylalanine
<400> 30
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His
145 150 155 160
Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 31
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl
-phenylalanine
<400> 31
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His
145 150 155 160
Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 32
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-acetyl-phenylalanine
<400> 32
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 33
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 33
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His
145 150 155 160
Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 34
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of
p-azido-phenylalanine
<400> 34
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 35
<211> 24
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Modified relaxin polypeptide A chain
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is a non-naturally encoded amino acid such as
para-acetyl-L-phenylalanine
<400> 35
Xaa Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
20
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Modified relaxin polypeptide A chain
<400> 36
Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
20
<210> 37
<211> 29
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Modified relaxin polypeptide B chain
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa is a non-naturally encoded amino acid such as
para-acetyl-L-phenylalanine
<400> 37
Ala Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Xaa Ser Thr Trp Ser
20 25
<210> 38
<211> 94
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Modified relaxin polypeptide (prepro sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa is a non-naturally encoded amino acid such as
para-acetyl-L-phenylalanine
<400> 38
Met Ile Glu Glu Gly Arg Ala Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
1 5 10 15
Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
20 25 30
Thr Trp Ser Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu
35 40 45
Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu
50 55 60
Gly Ser Leu Gln Gly Arg Xaa Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys
65 70 75 80
Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
85 90
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Exemplary insulin leader amino acid sequence
<400> 39
Met Ile Glu Glu Gly Arg
1 5
<210> 40
<400> 40
000
<210> 41
<400> 41
000
<210> 42
<400> 42
000
<210> 43
<400> 43
000
<210> 44
<400> 44
000
<210> 45
<400> 45
000
<210> 46
<400> 46
000
<210> 47
<400> 47
000
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<400> 50
000
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PCR Primer
<400> 51
aaatactctg tctggatcgg tggctcc 27
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PCR Primer
<400> 52
cacataggta acgagtcaga gctttggcta 30
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PCR Primer
<400> 53
gctggagtcg atcaactcta gg 22
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> PCR Primer
<400> 54
ccaatttcgc tttgccttgt c 21
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Polyhistidine purification tag
<400> 55
His His His His His His Ser Gly Gly
1 5
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<400> 57
000
<210> 58
<400> 58
000
<210> 59
<400> 59
000
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<400> 62
000
<210> 63
<400> 63
000
<210> 64
<400> 64
000
<210> 65
<400> 65
000
<210> 66
<400> 66
000
<210> 67
<400> 67
000
<210> 68
<400> 68
000
<210> 69
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
<400> 104
Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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Gly Gly Gly Lys Lys Lys Glu
1 5
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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such as C13-COOH
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Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Glu
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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such as C13-COOH
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Xaa Xaa Xaa Glu Glu Glu
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
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such as C13-COOH
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Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
1 5
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<211> 9
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<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
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such as C13-COOH
<400> 115
Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
1 5
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<211> 9
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<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
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such as C13-COOH
<400> 116
Lys Lys Ser Ala Gly Ser Ala Gly Glu
1 5
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<211> 8
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<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
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such as C13-COOH
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Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
1 5
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<211> 10
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<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 118
Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
1 5 10
<210> 119
<211> 11
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<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 119
Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 120
<211> 7
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<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..6
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 120
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu
1 5
<210> 121
<211> 9
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<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 121
Glu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu
1 5
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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such as C15-COOH
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 123
<211> 9
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<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 123
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 124
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C17-COOH
<400> 125
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-CH3
<400> 126
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-CH3
<400> 127
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> D-amino acid(s)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 128
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 129
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 130
Glu Gly Gly Gly Gly Ser Lys Glu
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 131
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 132
<400> 132
000
<210> 133
<211> 20
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 20
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-CH3
<400> 133
Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu
20
<210> 134
<211> 20
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 20
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-CH3
<400> 134
Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu
20
<210> 135
<211> 20
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 20
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-CH3
<400> 135
Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Glu
1 5 10 15
Glu Gly Gly Gly
20
<210> 136
<211> 20
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 20
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-CH3
<400> 136
Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu
20
<210> 137
<211> 27
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 27
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 137
Lys Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Pro Lys Gly
1 5 10 15
Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
20 25
<210> 138
<211> 22
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 22
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 138
Glu Ala Gln Lys Ala Gln Ala Glu Ala Gln Lys Ala Gln Ala Glu Ala
1 5 10 15
Gln Lys Ala Gln Ala Glu
20
<210> 139
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 139
Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 140
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 140
Lys Lys Glu
1
<210> 141
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 141
Lys Lys Glu
1
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 142
Lys Lys Glu
1
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-CH3
<400> 143
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 144
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-CH3
<400> 144
Lys Lys Glu
1
<210> 145
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 145
Lys Gly Pro Glu
1
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 146
Lys Gly Pro Lys Gly Pro Glu
1 5
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 147
Ser Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 148
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 148
Lys Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 149
Lys Gly Gly Gly Ser Glu Glu
1 5
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 150
Gly Ser Pro Gly Ser Pro Glu
1 5
<210> 151
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 151
Gly Gly Gly Gly Pro Glu
1 5
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 152
Glu Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 153
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 153
Glu Gly Gly Gly Pro Glu
1 5
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 154
Lys Gly Pro Gly Ser Glu Glu
1 5
<210> 155
<400> 155
000
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 156
Lys Lys Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 157
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..4
<223> Sarcosine (N-methyl glycine)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 157
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Glu
1 5
<210> 158
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..3
<223> Sarcosine (N-methyl glycine)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 158
Xaa Xaa Xaa Glu Glu Glu
1 5
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<400> 159
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 160
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 160
Ala Ala Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 161
Ala Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 162
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Xaa
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 163
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Xaa
1 5 10
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 164
Ala Ala Ser Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 165
Ala Ala Ser Ser Ala Xaa
1 5
<210> 166
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 166
Ala Ala Ser Xaa
1
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 167
Ala Gly Ala Gly Ser Xaa
1 5
<210> 168
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 168
Ala Gly Ala Gly Ser Xaa
1 5
<210> 169
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 169
Ala Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 170
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 170
Ala Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 171
Ala Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 172
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 172
Ala Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 173
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 173
Ala Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 174
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 174
Ala Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 175
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 175
Ala Ser Xaa
1
<210> 176
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1..5
<223> joined by beta linkages
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 176
Ala Ala Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1..4
<223> joined by beta linkages
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 177
Ala Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 178
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1..3
<223> joined by beta linkages
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 178
Ala Ala Ser Xaa
1
<210> 179
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1..2
<223> joined by beta linkage
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 179
Ala Ser Xaa
1
<210> 180
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 180
Glu Gly Gly Glu Gly Gly Xaa
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 181
Glu Gly Gly Glu Gly Pro Xaa
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 182
Glu Gly Pro Glu Gly Pro Xaa
1 5
<210> 183
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 183
Gly Gly Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 184
Gly Gly Ala Ala Ser Xaa
1 5
<210> 185
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 185
Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 186
Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 187
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 187
Gly Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 188
Gly Gly Gly Ala Ser Xaa
1 5
<210> 189
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 189
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 190
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 190
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 191
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 192
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 5..6
<223> joined by -PEG2-PEG2- linkage
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 192
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 193
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
having malonic acid tail
<400> 194
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH having
a succinic acid tail
<400> 195
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 196
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 197
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 197
Gly Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 198
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 198
Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 199
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 199
Gly Gly Gly Ser Gly Xaa
1 5
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 200
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Xaa
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 201
Gly Gly Gly Ser Ser Xaa
1 5
<210> 202
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 202
Gly Gly Gly Ser Ser Xaa
1 5
<210> 203
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 203
Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 204
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 204
Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Xaa
1 5
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<223> Synthetic linker
<220>
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<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 206
<211> 12
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<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
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<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 206
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Xaa
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<210> 207
<211> 10
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
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<221> MOD_RES
<222> 10
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
<222> 10
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 207
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Xaa
1 5 10
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<211> 7
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<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
<222> 7
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
<222> 6
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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1 5
<210> 210
<211> 6
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<221> MOD_RES
<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
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<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Gly Ser Xaa
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<210> 211
<211> 6
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<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Gly Xaa
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<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<222> 7
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Ser Ser Xaa
1 5
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<211> 6
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<222> 6
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Ser Xaa
1 5
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<211> 5
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<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
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<222> 5
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Xaa
1 5
<210> 215
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
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<221> MOD_RES
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Xaa
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<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Ser Xaa
1 5
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<211> 4
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
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para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
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<222> 4
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or (D)-Asp-beta
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<221> MOD_RES
<222> 4
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Ser Xaa
1
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<211> 7
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
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Gly Gly Thr Thr Thr Thr Xaa
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<211> 6
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<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 219
Gly Gly Thr Thr Thr Xaa
1 5
<210> 220
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 220
Gly Gly Thr Thr Xaa
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 221
Gly Ser Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 222
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 222
Gly Ser Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 223
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5 10
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
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such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 224
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5
<210> 225
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
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(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 225
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5
<210> 226
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 226
Gly Ser Gly Ser Gly Xaa
1 5
<210> 227
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 227
Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5
<210> 228
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 228
Gly Ser Pro Xaa
1
<210> 229
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 229
Gly Ser Ser Ser Ser Xaa
1 5
<210> 230
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 230
Gly Ser Ser Ser Xaa
1 5
<210> 231
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 231
Gly Ser Ser Xaa
1
<210> 232
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 232
Gly Ser Xaa
1
<210> 233
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 233
Gly Thr Thr Thr Xaa
1 5
<210> 234
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 234
Gly Thr Thr Xaa
1
<210> 235
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 235
Lys Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 236
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 236
Lys Gly Gly Lys Gly Gly Xaa
1 5
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 2..3
<223> joined by -PEG2-PEG2- linkage
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 237
Lys Lys Xaa
1
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 238
Lys Lys Ser
1
<210> 239
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 239
Lys Lys Ser Xaa
1
<210> 240
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 240
Lys Lys Thr
1
<210> 241
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 241
Lys Lys Thr Xaa
1
<210> 242
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a malonic acid tail
<400> 242
Lys Lys Xaa
1
<210> 243
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a succinic acid tail
<400> 243
Lys Lys Xaa
1
<210> 244
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 244
Lys Lys Xaa
1
<210> 245
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 245
Lys Pro Lys Ser Xaa
1 5
<210> 246
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 246
Lys Ser Gly Gly Gly Ser Lys Xaa
1 5
<210> 247
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta, (D)-Asp-alpha,
or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 247
Lys Ser Gly Lys Ser Gly Xaa
1 5
<210> 248
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 248
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 249
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 249
Ser Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 250
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 250
Ser Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 251
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 251
Ser Gly Gly Gly Ser Xaa
1 5
<210> 252
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 252
Ser Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 253
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 253
Ser Gly Gly Xaa
1
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Glu-gamma, (D)-Glu-gamma, Asp-alpha, Asp-beta,
(D)-Asp-alpha, or (D)-Asp-beta
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as a fatty acid, such as C13-COOH, C14-COOH, or C15-COOH
<400> 254
Ser Gly Xaa
1
<210> 255
<211> 3
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 255
Gly Ser Glu
1
<210> 256
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 256
Gly Gly Ser Glu
1
<210> 257
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 257
Gly Ser Pro Glu
1
<210> 258
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 258
Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu
1 5
<210> 259
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1..2
<223> joined by gamma linkage
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 259
Glu Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 260
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 260
Glu Gly Gly Glu Gly Pro Glu
1 5
<210> 261
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C14-COOH
<400> 261
Glu Gly Pro Glu Gly Pro Glu
1 5
<210> 262
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 262
Lys Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 263
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 263
Lys Ser Gly Gly Gly Ser Lys Glu
1 5
<210> 264
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 264
Lys Ser Gly Lys Ser Gly Glu
1 5
<210> 265
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 265
Lys Gly Gly Lys Gly Gly Glu
1 5
<210> 266
<211> 5
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 266
Lys Pro Lys Ser Glu
1 5
<210> 267
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..6
<223> D-amino acid(s)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 267
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu
1 5
<210> 268
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..6
<223> 2,3-diaminopropionic acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 268
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5
<210> 269
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..6
<223> 6-N-methyllysine
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 269
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5
<210> 270
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..3
<223> D-amino acid(s)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 270
Lys Lys Lys Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 271
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C15-COOH
<400> 271
Gly Gly Gly Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 272
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C17-COOH
<400> 272
Gly Gly Gly Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 273
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 273
Lys Lys Lys Lys Pro Glu
1 5
<210> 274
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 274
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 275
<211> 8
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 275
Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Glu
1 5
<210> 276
<211> 10
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 276
Lys Lys Lys Lys Pro Lys Lys Lys Lys Glu
1 5 10
<210> 277
<211> 10
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-COOH
<400> 277
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Gly Glu
1 5 10
<210> 278
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> D-amino acid(s)
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-CH3
<400> 278
Glu Glu Glu Gly Gly Gly Glu
1 5
<210> 279
<211> 6
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> Synthetic linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> optionally linked to side-chain carbonyl group of a
para-acetyl-phenylalanine residue of a modified relaxin polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> gamma carbon optionally linked to a half-life extending moiety
such as C13-CH3
<400> 279
Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5

Claims (75)

1.一种包含非天然编码氨基酸的修饰的松弛素多肽，其中：
(a)所述修饰的松弛素多肽包含SEQ ID NO:4的松弛素A链多肽和SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的松弛素B链多肽，且在选自下组的位置被非天然编码氨基酸取代：A链残基1、A链残基2、A链残基5、A链残基13、A链残基18、B链残基5、B链残基7和B链残基25，并且任选地，在所述松弛素A链和/或所述松弛素B链中具有最多两个额外的氨基酸取代、插入和/或缺失；
(b)所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中R基团是除了在下列氨基酸中发现的侧链以外的任何取代基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；和
(c)所述非天然编码氨基酸与药代动力学增强子连接，所述药代动力学增强子包含2至30个氨基酸的肽组分和半衰期延长模块。
2.权利要求1的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素A链多肽包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代、并且任选地具有最多两个额外的氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQID NO:4。
3.权利要求1的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素A链多肽包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代、并且任选地具有一个额外的氨基酸取代、插入和/或缺失的SEQ IDNO:4。
4.权利要求3的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素B链多肽包含任选地具有一个额外的氨基酸取代、插入或缺失的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
5.权利要求1的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素A链多肽包含在残基1处被所述非天然编码氨基酸取代的SEQ ID NO:4，且所述松弛素B链多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6。
6.权利要求1-5中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
7.权利要求1-5中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包括苯丙氨酸衍生物。
8.权利要求1-5中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸选自对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸。
9.权利要求1-5中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸选自包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基的对位取代、邻位取代或间位取代的苯丙氨酸。
10.权利要求1-5中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含对-乙酰基-L-苯丙氨酸。
11.权利要求1-10中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸与所述肽组分连接。
12.权利要求1-11中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸通过肟连接或三唑连接与所述药代动力学增强子连接。
13.权利要求1-11中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述非天然编码氨基酸通过肟连接与所述药代动力学增强子连接。
14.权利要求1的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素A链多肽包含SEQ ID NO:35，所述松弛素B链多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，并且其中所述松弛素A链或B链任选地具有最多两个额外的氨基酸取代、插入或缺失。
15.权利要求13的修饰的松弛素多肽，其中修饰的松弛素多肽包含：包含与SEQ ID NO:35具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素A链多肽、和与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素B链多肽。
16.权利要求15的修饰的松弛素多肽，其中松弛素A链多肽与SEQ ID NO:35具有至少95％氨基酸序列同一性。
17.权利要求15的修饰的松弛素多肽，其中松弛素B链多肽与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6具有至少95％氨基酸序列同一性。
18.权利要求15的修饰的松弛素多肽，其中松弛素A链多肽包含SEQ ID NO:35，并且松弛素B链多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
19.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含2至25个氨基酸。
20.权利要求19的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含2至20个氨基酸。
21.权利要求19的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含3至10个氨基酸。
22.权利要求19的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含4至8个氨基酸。
23.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含Glu、Gluγ、GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)、DRDDRD(SEQ ID NO:102)、KKKKKK-Gluγ(SEQ ID NO:103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:104)、GGGEEE-Gluγ(SEQ ID NO:105)、EEEGGG-Gluγ(SEQID NO:106)、KKKGGG-Gluγ(SEQ ID NO:107)、GETGSSGEGT-Gluγ(SEQ ID NO:108)、GGGKKK-Gluγ(SEQ ID NO:109)、GSHHHHHGS-Gluγ(SEQ ID NO:110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Gluγ(SEQ ID NO:111)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ(SEQ ID NO:112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ(SEQ ID NO:113)、KKKSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:118)、KKSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:114)、KKSGGSGG-Gluα(SEQ ID NO:115)、KKSAGSAG-Gluγ(SEQ ID NO:116)、KSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:117)、KKSGGSGGEE-Gluγ(SEQ ID NO:119)、dKdKdKdKdKdK-Gluγ(SEQ ID NO:120)、EESGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:121)、GSGSGSGS-Gluγ(SEQ ID NO:123)、EEEGGG-dGluγ(SEQ ID NO:128)、EGGGGSK-Gluγ(SEQ ID NO:130)、EEEEEE-Gluγ(SEQID NO:131)、EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Gluγ(SEQ ID NO:133)、EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG(SEQID NO:135)、EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Gluγ(SEQ ID NO:136)、KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:137)、EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-Gluγ(SEQID NO:138)、KK-Gluγ(SEQ ID NO:140)、Gluγ、KGPKGP-Gluγ(SEQ ID NO:146)、SGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:147)、KGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:148)、KGGGSE-Gluγ(SEQ ID NO:149)、GSPGSP-Gluγ(SEQ ID NO:150)、GGGGP-Gluγ(SEQ ID NO:151)、EGGS-Gluγ(SEQ ID NO:152)、EGGGP-Gluγ(SEQ ID NO:153)、KGPGSE-Gluγ(SEQ ID NO:154)、精胺-Gluγ或KKGGS-Gluγ(SEQ IDNO:156)。
24.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)、DRDDRD(SEQ ID NO:102)、KKKKKK-Gluγ(SEQ ID NO:103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ(SEQ ID NO:104)、GGGEEE-Gluγ(SEQ ID NO:105)、EEEGGG-Gluγ(SEQID NO:106)、KKKGGG-Gluγ(SEQ ID NO:107)、GGGKKK-Gluγ(SEQ ID NO:109)、GSHHHHHGS-Gluγ(SEQ ID NO:110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ(SEQ ID NO:112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ(SEQ ID NO:113)或KSGGSGG-Gluγ(SEQ ID NO:117)。
25.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含Gluγ。
26.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述肽组分包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)。
27.权利要求1-18中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含SEQ IDNO:4的松弛素A链多肽和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的松弛素B链多肽，且在A链残基1处被非天然编码氨基酸取代，其中所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接，并且所述药代动力学增强子包含肽组分GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)。
28.权利要求1-27中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块包含脂肪酸或其衍生物，其中所述脂肪酸或其衍生物与所述肽组分共价连接。
29.权利要求1-27中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块包含饱和脂肪酸或其衍生物。
30.权利要求1-29中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块包含以羧酸封端的脂肪酸。
31.权利要求1-30中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块包含式I的脂肪酸：
-Cn-COOH (式I)
其中n在10至18之间。
32.权利要求31的修饰的松弛素多肽，其中n在12至17之间。
33.权利要求31的修饰的松弛素多肽，其中n为13、14或15。
34.权利要求1-33中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块包含-C14-COOH。
35.权利要求1-34中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述药代动力学增强子包含：
其中氨氧基与所述修饰的松弛素多肽中的非天然氨基酸连接。
36.权利要求1-35中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述半衰期延长模块通过酰胺键与所述肽组分缀合。
37.权利要求1的修饰的松弛素多肽，其中所述松弛素多肽包含SEQ ID NO:4的松弛素A链多肽和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的松弛素B链多肽，且在A链残基1处被非天然编码氨基酸取代。
其中所述非天然编码氨基酸包含与所述药代动力学增强子连接的对-乙酰基-L-苯丙氨酸，所述药代动力学增强子包含
包含GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)的肽组分；和
包含-C14-COOH的半衰期延长模块。
38.一种修饰的松弛素多肽，其包含：
其中所述AQ1-松弛素包含与SEQ ID NO:35具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素A链多肽和与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％氨基酸序列同一性的松弛素B链多肽，其中式III中描绘的修饰的对-乙酰基-苯丙氨酸位于所述松弛素A链多肽的N末端。
39.权利要求38的修饰的松弛素多肽，其中松弛素A链多肽与SEQ ID NO:35具有至少95％氨基酸序列同一性。
40.权利要求38的修饰的松弛素多肽，其中松弛素B链多肽与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6具有至少95％氨基酸序列同一性。
41.权利要求38的修饰的松弛素多肽，其中AQ1-松弛素包含SEQ ID NO:35的松弛素A链多肽和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的松弛素B链多肽。
42.一种包含AQ1-GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH的修饰的松弛素多肽，其包含图8所示的结构，包含图9所示的结构，或包含SEQ ID NO:35的松弛素A链多肽和SEQ IDNO:6的松弛素B链多肽，其中位于所述松弛素A链多肽的N末端的修饰的对-乙酰基-L-苯丙氨酸与PK增强子GGGGS-Gluγ(SEQ ID NO:139)-C14-COOH连接，如式III中描绘：
43.权利要求1-42中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述修饰的松弛素多肽具有生物活性。
44.权利要求1-43中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述修饰的松弛素多肽在治疗与松弛素相关的一种或多种疾病或病症中具有治疗效果。
45.权利要求1-44中任一项的修饰的松弛素多肽，其中与AQ1-20kDa PEG相比，所述修饰的松弛素多肽导致较少的肾空泡形成。
46.权利要求1-45中任一项的修饰的松弛素多肽，其中与AQ1-20kDa PEG相比，所述修饰的松弛素多肽不导致肾功能损害，或导致的肾功能损害减少。
47.权利要求46的修饰的松弛素多肽，其中通过确定估算的肾小球滤过率、肌酸清除率、菊粉肾小球滤过率或同位素肾小球滤过率中的一者或多者来测量所述肾功能。
48.权利要求1-47中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述修饰的松弛素多肽在施用后不降低肾血流量。
49.权利要求1-48中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述修饰的松弛素多肽能够在施用后增加肾血流量。
50.权利要求48或49的方法，其中通过确定对氨基马尿酸盐清除率来测量所述肾血流量。
51.权利要求1-50中任一项的修饰的松弛素多肽，其中所述修饰的松弛素多肽表现出增加的体内半衰期。
52.权利要求51的修饰的松弛素多肽，其中所述体内半衰期增加至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍。
53.一种药物组合物，其包含权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽，和药学上可接受的载体。
54.一种药物组合物，其包含有效量的用于治疗松弛素相关病症的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽，和药学上可接受的载体。
55.一种治疗与松弛素相关的疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
56.一种治疗心血管疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
57.权利要求56的方法，其中所述心血管疾病选自冠状动脉疾病、心脏病发作、心律失常、心力衰竭、心肌病和血管疾病。
58.一种治疗或减轻心力衰竭症状的方法，其包括对有此需要的患者施用有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
59.权利要求58的方法，其中所述心力衰竭选自晚期心力衰竭、心肾综合征、心力衰竭伴肾功能损害、慢性心力衰竭、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭、代偿性心力衰竭、失代偿性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、与先天性心脏缺陷相关的心力衰竭、与心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、与联合心脏瓣膜缺损相关的心力衰竭、糖尿病性心力衰竭、酒精性心肌病、与心脏贮积症相关的心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心肌梗死后重塑、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)、射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。
60.权利要求58的方法，其中所述心力衰竭选自慢性心力衰竭、急性心力衰竭、急性期后心力衰竭、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数保留的慢性心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型慢性心力衰竭(HFmEF)、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心肌梗死后重塑、心绞痛、高血压、肺性高血压和肺动脉高压。
61.权利要求58的方法，其中所述心力衰竭选自急性期后心力衰竭、晚期心力衰竭、心肾综合征和心力衰竭伴肾功能损害。
62.权利要求55-61中任一项的方法，进一步包括与所述修饰的松弛素多肽同时或依次地联合施用至少一种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂选自ACE抑制剂、β-阻滞剂、利尿剂、盐皮质激素受体拮抗剂、兰尼碱受体调节剂、SERCA2a激活剂、肾素抑制剂、钙通道阻滞剂、腺苷A1受体激动剂、部分腺苷A1受体、多巴胺β-羟化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、对选择的细胞信号传导途径具有偏向激动作用的血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂和中性内肽酶抑制剂的组合、中性内肽酶抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、肌球蛋白ATP酶激活剂、rho激酶1抑制剂、rho激酶2抑制剂、apelin受体激动剂、硝酰基供体化合物、钙依赖性激酶II抑制剂、抗纤维化药、半乳糖凝集素-3抑制剂、血管加压素受体拮抗剂、FPR2受体调节剂、利钠肽受体激动剂、瞬时受体电位香草素-4通道阻滞剂、抗心律失常药、If“起搏电流”通道阻滞剂、硝酸盐、洋地黄化合物、正性肌力药、β-受体激动剂、细胞膜再密封剂例如泊洛沙姆188、抗高血脂药、血浆HDL升高剂、抗高胆固醇血症药、胆固醇生物合成抑制剂(例如HMG CoA还原酶抑制剂)、LXR激动剂、FXR激动剂、普罗布考、雷洛昔芬、烟酸、烟酰胺、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸螯合剂、阴离子交换树脂、季胺、消胆胺、考来替泊、低密度脂蛋白受体诱导剂、氯贝特、非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、吉非罗齐(gemfibrizol)、维生素B6、维生素B12、抗氧化维生素、抗糖尿病药、血小板聚集抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂、阿司匹林和纤维酸衍生物、PCSK9抑制剂、阿司匹林和P2Y12抑制剂如氯吡格雷。
63.一种治疗与纤维化相关的疾病的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
64.权利要求62的方法，其中与纤维化相关的所述疾病包括心脏、肺、肾、骨髓或肝脏的纤维化、皮肤纤维化或纤维化眼病。
65.权利要求63的方法，其中与纤维化相关的所述疾病选自肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、前肝硬化、弥漫性实质性肺疾病、囊性纤维化、肺纤维化、进行性大块纤维化、特发性肺纤维化、注射纤维化、肾纤维化、慢性肾病、糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾病、IgA肾病、骨髓纤维化、心力衰竭、代谢性心力衰竭、心肌纤维化、白内障纤维化、白内障、眼部瘢痕形成、胰腺纤维化、皮肤纤维化、肠纤维化、肠狭窄、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵隔纤维化、克罗恩病、腹膜后纤维化、瘢痕疙瘩、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、Peyronie综合征、杜普伊特伦(Dupuytren)挛缩、糖尿病神经病变、粘连性关节囊炎、酒精性肝病、肝脂肪变性、病毒性肝炎、胆道疾病、原发性血色素沉着症、药物相关性肝硬化、隐源性肝硬化、威尔逊(Wilson)病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、间质性肺病(ILD)、人纤维化肺病、黄斑变性、视网膜视网膜病变、玻璃体视网膜病变、心肌纤维化、格雷夫斯(Grave)眼病、药源性麦角中毒、心血管疾病、动脉粥样硬化/再狭窄、肥厚性瘢痕、原发性或特发性骨髓纤维化、炎性肠病和胶原性结肠炎。
66.权利要求63-65中任一项的方法，其进一步包括将所述修饰的松弛素多肽与至少一种抗纤维化药同时或依次地联合施用于所述患者。
67.权利要求66的方法，其中所述至少一种抗纤维化药选自尼达尼布、吡非尼酮、LPA1拮抗剂、LPA1受体拮抗剂、GLP1类似物、曲乐金单抗(IL-13，AstraZeneca)、维莫德吉(hedgehog拮抗剂，Roche)、PRM-151(正五聚蛋白-2，TGFβ-1，Promedior)、SAR-156597(双特异性抗体IL-4&IL-13，Sanofi)、斯图珠单抗(抗赖氨酰氧化酶样2(抗LOXL2)抗体，Gilead)、CKD-942、PTL-202(PDE吸入/己酮可可碱/NAC口服控制释放，Pacific Ther.)、奥米利塞(口服PI3K/mTOR抑制剂，GSK)、IW-001(口服溶液，修饰的牛V型胶原蛋白，ImmuneWorks)、STX-100(整合素αV/β-6抗体，Stromedix/Biogen)、Actimmune(IFNγ)、PC-SOD(中度歧化酶；吸入，LTT Bio-Pharma/CKD Pharm)、来金珠单抗(抗IL-13 SC人源化单克隆抗体，Roche)、AQX-1125(SHIP1激活剂，Aquinox)、CC-539(JNK抑制剂，Celgene)、FG-3019(FibroGen)、SAR-100842(Sanofi)和奥贝胆酸(OCA或INT-747，Intercept)。
68.一种治疗或预防肾衰竭的方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
69.一种改善、稳定或恢复有此需要的患者的肾功能的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽或根据权利要求53-54中任一项的组合物。
70.一种制造根据权利要求1-52中任一项的修饰的松弛素多肽的方法，其包括：
(a)提供包含所述松弛素A链和所述松弛素B链的多肽，其中所述多肽包含所述非天然编码氨基酸；和
(b)将所述非天然编码氨基酸与所述药代动力学增强子连接。
71.权利要求70的方法，其中所述非天然编码氨基酸通过肟连接与所述药代动力学增强子连接。
72.权利要求71的方法，其中所述肟连接是通过羰基和氨氧基的反应形成的。
73.权利要求72的方法，其中所述羰基是所述非天然编码氨基酸的取代基，并且所述氨氧基是所述药代动力学增强子的组分。
74.权利要求72的方法，其中所述氨氧基是所述非天然编码氨基酸的取代基，并且所述羰基是所述药代动力学增强子的组分。
75.权利要求70-74中任一项的方法，其中所述非天然编码氨基酸经由核糖体掺入到所述多肽中。
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