CN105085313A - 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途 - Google Patents

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Abstract

本文揭示非天然氨基酸和包括至少一个非天然氨基酸的多肽，以及制备所述非天然氨基酸和多肽的方法。所述非天然氨基酸本身或作为多肽的一部分可包括多种可能的官能团，但通常具有至少一个杂环、醛醇基、二羰基和/或二胺基。本文还揭示进一步经翻译后修饰的非天然氨基酸多肽、实现所述修饰的方法以及纯化所述多肽的方法。所述经修饰非天然氨基酸多肽通常包括至少一个杂环、醛醇基、二羰基和/或二胺基。进一步揭示使用所述非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的方法，包括治疗、诊断和其它生物技术用途。

Description

含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
分案说明
本申请案是申请日为2006年12月27日，申请号为200680049995.4(国际申请号为PCT/US2006/049397)，发明名称为“含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽”的用途的专利申请的分案申请。
相关申请案
本申请案主张2005年12月30日申请的美国临时申请案第60/755,338号、2005年12月30日申请的第60/755,711号和2005年12月30日申请的第60/755,018号的权利，所有所述专利都以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文描述制备、纯化、表征和使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的化合物、组合物、技术和策略。
背景技术
将非基因编码的氨基酸(即，“非天然氨基酸”)并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能团(诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的基因编码的氨基酸中所见的官能团呈惰性，但完全且有效地与可并入于非天然氨基酸上的官能团反应以形成稳定键。
多种方法现可用于选择性引入未见于蛋白质中、对20种常见的基因编码的氨基酸中所见的所有官能团呈化学惰性并且可用于与包含某些官能团的试剂有效且选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团。
发明内容
本文描述制备、纯化、表征和使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。一方面为使非天然氨基酸和/或非天然氨基酸多肽衍生化的方法、组合物、技术和策略。在一个实施例中，所述方法、组合物、技术和策略涉及化学衍生化；在其它实施例中，涉及生物衍生化；在其它实施例中，涉及物理衍生化；在其它实施例中，涉及衍生化的组合。在其它或额外实施例中，所述衍生化具区域选择性。在其它或额外实施例中，所述衍生化具区域特异性。在其它或额外实施例中，所述衍生化在含有非天然氨基酸的试剂与衍生化试剂中为化学计量或近化学计量。在其它或额外实施例中，所述衍生化在环境温度下是快速的。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在水溶液中发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在介于约2与约10之间的pH值下发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在介于约3与约8之间的pH值下发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在介于约2与约9之间的pH值下发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在介于约4与约9之间的pH值下发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化是在约4的pH值下发生。在另一实施例中，所述衍生化是在约8的pH值下发生。在其它或额外实施例中，所述衍生化在含有非天然氨基酸的试剂与衍生化试剂中为化学计量、近化学计量或类化学计量。在其它或额外实施例中，提供将所需基团化学计量、近化学计量或类化学计量并入非天然氨基酸多肽上的方法。在其它或额外实施例中，提供允许将所需基团化学计量、近化学计量或类化学计量并入非天然氨基酸多肽上的策略、反应混合物、合成条件。
一方面为基于二羰基的反应性使肽和蛋白质化学衍生化的非天然氨基酸，所述二羰基包括含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸和/或至少一个硫酯基的基团，且其中所述二羰基可为1,2-二羰基、1,3-二羰基或1,4-二羰基。其它或额外方面为基于二胺基的反应性使肽和蛋白质化学衍生化的非天然氨基酸，所述二胺基包括肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。在其它或额外实施例中，将至少一个上述非天然氨基酸并入多肽中，亦即，所述实施例为非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，在非天然氨基酸的侧链上使其官能化，以致其与衍生化分子反应产生键，包括基于杂环(包括含氮杂环)的键和/或基于醛醇的键。其它或额外实施例为可与衍生化分子反应以产生含有键的非天然氨基酸多肽的非天然氨基酸多肽，所述键包括基于杂环(包括含氮杂环)的键和/或基于醛醇的键。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸选自具有二羰基和/或二胺侧链的氨基酸。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含经遮蔽侧链，其包括经遮蔽二胺基和/或经遮蔽二羰基。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含选自以下各物的基团：酮-胺(即，含有酮与胺的基团)、酮-炔(即，含有酮与炔的基团)和烯-二酮(即，含有二羰基与烯烃的基团)。
在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含二羰基侧链，其中所述羰基选自酮、醛、羧酸或酯(包括硫酯)。另一实施例为含有在用适当的官能化试剂处理后能够形成杂环(包括含氮杂环)的官能团的非天然氨基酸。在另一实施例中，非天然氨基酸的结构类似于天然氨基酸，但含有上述官能团中的一个。在另一实施例中，非天然氨基酸类似于苯丙氨酸或酪氨酸(芳香族氨基酸)；而在另一实施例中，非天然氨基酸类似于丙氨酸和亮氨酸(疏水性氨基酸)。在一个实施例中，非天然氨基酸具有与天然氨基酸截然不同的特性。在一个实施例中，所述截然不同的特性为侧链的化学反应性，在另一实施例中，此截然不同的化学反应性允许即使在多肽中的天然存在的氨基酸单元的侧链不进行反应的情况下，作为同一多肽的单元的非天然氨基酸的侧链也进行上述反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在的氨基酸的侧链正交的化学性质。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电基团部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电基团部分可进行亲核攻击以产生杂环衍生化蛋白质，包括含氮杂环衍生化蛋白质。在此段落的任一上述实施例中，非天然氨基酸可作为单独分子存在或者可并入任何长度的多肽中；如果为后者，那么多肽可另外并有天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。
另一方面为经二胺取代的分子，其用于制备基于杂环(包括含氮杂环)键的衍生化非天然氨基酸多肽，其中所述二胺基选自肼、脒、亚胺、1,1-二胺、1,2-二胺、1,3-二胺和1,4-二胺基团。另一实施例为经二胺取代的分子，其用于经由在衍生化分子与含二羰基的非天然氨基酸多肽之间形成杂环(包括含氮杂环)键来使含二羰基的非天然氨基酸多肽衍生化。在其它实施例中，上述含二羰基的非天然氨基酸多肽为含二酮的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，含二羰基的非天然氨基酸包含所述羰基选自酮、醛、羧酸或酯(包括硫酯)的侧链。在其它或额外实施例中，经二胺取代的分子包含选自所需官能团的基团。在其它或额外实施例中，经二胺取代的分子为经二胺取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在的氨基酸正交的化学性质，其使得非天然氨基酸能够与经二胺取代的分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包含与含二胺分子选择性反应的含亲电基团部分；在另一实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电基团部分可进行亲核攻击以产生杂环衍生化蛋白质，包括含氮杂环衍生化蛋白质。与此段落中所述的实施例相关的另一方面为经修饰非天然氨基酸多肽，其是由衍生化分子与非天然氨基酸多肽反应得到。其它实施例包括已经修饰的非天然氨基酸多肽的任何其它修饰。
另一方面为基于杂环(包括含氮杂环)键制备衍生化非天然氨基酸多肽的经二羰基取代的分子。另一实施例为经二羰基取代的分子，其用于经由形成杂环(包括含氮杂环基)使含二胺的非天然氨基酸多肽衍生化。另一实施例为可在介于约4与约8之间的pH值范围内与含二胺的非天然氨基酸多肽形成所述杂环(包括含氮杂环基)的经二羰基取代的分子。另一实施例为经二羰基取代的分子，其用于经由在衍生化分子与含二胺的非天然氨基酸多肽之间形成杂环(包括含氮杂环)键来使含二胺的非天然氨基酸多肽衍生化。在另一实施例中，经二羰基取代的分子为经二酮取代的分子，在其它方面中为经酮醛取代的分子，在其它方面中为经酮酸取代的分子，在其它方面中为经酮酯取代的分子，包括经酮硫酯取代的分子。在其它实施例中，经二羰基取代的分子包含选自所需官能团的基团。在其它或额外实施例中，经醛取代的分子为经醛取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在的氨基酸正交的化学性质，其使得非天然氨基酸能够与经羰基取代的分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包含与含二羰基的分子选择性反应的部分(例如，二胺基)；在另一实施例中，非天然氨基酸侧链上的亲核部分可进行亲电攻击以产生杂环衍生化蛋白质，包括含氮杂环衍生化蛋白质。与此段落中所述的实施例相关的另一方面为经修饰非天然氨基酸多肽，其是由衍生化分子与非天然氨基酸多肽反应得到。其它实施例包括已经修饰的非天然氨基酸多肽的任何其它修饰。
另一方面为基于杂环(包括含氮杂环)和/或醛醇键产生衍生化非天然氨基酸多肽的单、双和多官能连接基。一个实施例为可用于将含二羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子连接的分子连接基(双官能和多官能)。另一实施例为可用于将含二胺的非天然氨基酸多肽与其它分子连接的分子连接基(双官能和多官能)。在另一实施例中，含二羰基的非天然氨基酸多肽包含酮、醛、羧酸、酯或硫酯侧链。在利用含二胺的非天然氨基酸多肽的实施例中，分子连接基在其一个末端含有羰基；在其它实施例中，所述羰基选自醛基、酯基、硫酯基或酮基。在其它或额外实施例中，经二胺取代的连接基分子为经二胺取代的聚乙二醇(PEG)连接基分子。在其它或额外实施例中，经二羰基取代的连接基分子为经二羰基取代的聚乙二醇(PEG)连接基分子。在其它实施例中，短语“其它分子”包括(仅举例来说)蛋白质、其它聚合物和小分子。在其它或额外实施例中，含二胺的分子连接基在所有末端包含相同或相当的基团，以致在与含二羰基的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含二羰基的非天然氨基酸多肽的同多聚化。在其它实施例中，同多聚化为同二聚化。在其它或额外实施例中，含二羰基的分子连接基在所有末端包含相同或相当的基团，以致在与含二胺的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含二胺的非天然氨基酸多肽的同多聚化。在其它实施例中，同多聚化为同二聚化。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在的氨基酸正交的化学性质，其使得非天然氨基酸能够与经二胺取代的连接基分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在的氨基酸正交的化学性质，其使得非天然氨基酸能够与经二羰基取代的连接基分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包含与含二胺的连接基分子选择性反应的含亲电基团部分；在另一实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电基团部分可通过含二胺的连接基分子进行亲核攻击以产生杂环衍生化蛋白质，包括含氮杂环衍生化蛋白质。与此段落中所述的实施例相关的另一方面为经连接(经修饰)非天然氨基酸多肽，其是由连接基分子与非天然氨基酸多肽反应得到。其它实施例包括已经连接(经修饰)的非天然氨基酸多肽的任何其它修饰。
一方面为经由二羰基和二胺反应物反应使蛋白质衍生化以产生杂环衍生化蛋白质，包括含氮杂环衍生化蛋白质的方法。此方面内包括基于含二羰基和二胺的反应物的缩合使蛋白质衍生化以产生杂环衍生化蛋白质加合物(包括含氮杂环衍生化蛋白质加合物)的方法。额外或其它实施例为利用二胺官能化聚乙二醇(PEG)分子使含二酮蛋白质或含酮醛蛋白质或含酮酸蛋白质或含酮酯蛋白质或含酮硫酯蛋白质衍生化的方法。在额外或其它方面中，经二胺取代的分子可包括蛋白质、其它聚合物和小分子。
另一方面为化学合成用于使经二羰基取代的蛋白质衍生化的经二胺取代的分子的方法。在一个实施例中，经二胺取代的分子可包含肽、其它聚合物(非分枝和分枝)和小分子。一个实施例为制备适于使含二羰基的非天然氨基酸多肽衍生化的经二胺取代的分子的方法，仅举例来说，所述含二羰基的非天然氨基酸多肽包括含二酮、含酮醛、含酮酸、含酮酯和/或含酮硫酯的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，在活体内翻译蛋白质期间位点特异性地并入非天然氨基酸。在其它或额外实施例中，经二胺取代的分子允许经由亲核攻击各羰基来使含二羰基的非天然氨基酸位点特异性衍生化，从而以位点特异性方式形成杂环衍生化多肽，包括含氮杂环衍生化多肽。在其它或额外实施例中，制备经二胺取代的分子的方法提供得到多种位点特异性衍生化多肽的方式。其它或额外实施例为合成二胺官能化聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为化学合成用于使经二胺取代的非天然氨基酸多肽衍生化的经二羰基取代的分子的方法。在一个实施例中，经二羰基取代的分子为经二酮、酮醛、酮酸、酮酯和/或酮硫酯取代的分子。在另一实施例中，经二羰基取代的分子包括蛋白质、聚合物(非分枝和分枝)和小分子。在其它或额外实施例中，所述方法补充在活体内翻译蛋白质期间能够位点特异性并入非天然氨基酸的技术。其它或额外实施例为制备适于与含二胺的非天然氨基酸多肽反应从而提供位点特异性衍生化非天然氨基酸多肽的经二羰基取代的分子的方法。其它或额外实施例为合成经二羰基取代的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为使用含二胺双官能连接基使经二羰基取代的非天然氨基酸多肽化学衍生化的方法。一个实施例为经由缩合反应连接经二胺取代的连接基与经二羰基取代的蛋白质从而产生杂环(包括含氮杂环)键的方法。在其它或额外实施例中，经二羰基取代的非天然氨基酸为经二酮、酮醛、酮酸、酮酯和/或酮硫酯取代的非天然氨基酸。在其它或额外实施例中，使用含二胺的双官能连接基使非天然氨基酸多肽位点特异性地衍生化和/或同时精确控制三维结构。在一个实施例中，使用所述方法将分子连接基(单、双和多官能)与含二羰基(例如包括含二酮、酮醛、酮酸、酮酯和/或酮硫酯)的非天然氨基酸多肽连接，其中至少一个连接基末端含有二胺基，其可经由杂环(包括含氮杂环)键与含二羰基的非天然氨基酸多肽连接。在其它或额外实施例中，使用这些连接基将含二羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子连接，所述其它分子包括例如蛋白质、其它聚合物(分枝和非分枝)和小分子。
在一些实施例中，将非天然氨基酸多肽与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，聚乙二醇分子为双官能聚合物。在一些实施例中，将双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽与第一多肽相同，在其它实施例中，第二多肽为不同多肽。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽对受体的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加宿主细胞中所产生的非天然氨基酸多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含相对于无取代、添加或缺失的氨基酸多肽调节蛋白酶抗性、血清半衰期、免疫原性和/或表达的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽为激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物连接的非天然氨基酸的多肽可防止相应受体二聚化。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物连接的非天然氨基酸的多肽调节多肽与结合搭配物、配体或受体的结合。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物连接的非天然氨基酸的多肽调节一种或一种以上多肽特性或活性。
在一些实施例中，选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
本文还描述制备与水溶性聚合物连接的非天然氨基酸多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然氨基酸的经分离多肽与包含与所述非天然氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，所并入的非天然氨基酸对另外对20种常见氨基酸中的任一种无反应性的水溶性聚合物具反应性。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。
本文还描述组合物，其包含包括至少一个本文所述的非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，将非天然氨基酸与水溶性聚合物连接。本文还描述包含医药学上可接受的载剂和多肽的医药组合物，其中至少一个氨基酸经非天然氨基酸取代。在一些实施例中，非天然氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，通过糖部分将水溶性聚合物与多肽连接。本文中还描述非天然氨基酸的前药、非天然氨基酸多肽和/或经修饰非天然氨基酸多肽；本文中还描述包含所述前药和医药学上可接受的载剂的组合物。本文中还描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或经修饰非天然氨基酸多肽的代谢物；所述代谢物可具有补充或协同加强非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或经修饰非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本文还描述本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或经修饰非天然氨基酸多肽用于向有机体(包括需要所述代谢物的患者)提供所需代谢物的用途。
本文还描述包含编码包含选择密码子的多肽的聚核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含正交RNA合成酶和/或正交tRNA以将非天然氨基酸取代入多肽。在一些实施例中，细胞是在细胞培养物中，而在其它实施例中，细胞为多细胞有机体(包括两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)的部分。在任何细胞实施例中，其它实施例包括表达聚核苷酸以产生非天然氨基酸多肽。其它实施例为可利用本文所述的非天然氨基酸产生非天然氨基酸多肽(包括经修饰非天然氨基酸多肽)的有机体。其它实施例为含有本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或经修饰非天然氨基酸多肽的有机体。所述有机体包括单细胞和多细胞有机体，包括两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在活体外产生。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在细胞溶解产物中产生。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是通过核糖体翻译产生。
本文还描述制备包含非天然氨基酸的多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许表达多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码所述多肽的聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基中纯化所述多肽。
本文还描述本文所述的非天然氨基酸的文库，或本文所述的非天然氨基酸多肽的文库，或本文所述的经修饰非天然氨基酸多肽的文库，或其组合文库。本文还描述含有至少一个非天然氨基酸、至少一个非天然氨基酸多肽和/或至少一个经修饰非天然氨基酸的阵列。本文还描述含有至少一个编码多肽的包含选择密码子的聚核苷酸的阵列。可使用本文所述的阵列针对有机体中非天然氨基酸多肽的产生进行筛选(通过检测编码多肽的聚核苷酸的转录或通过检测多肽的翻译)。
本文还描述针对所需活性筛选本文所述的文库，或使用本文所述的阵列筛选本文所述的文库，或针对所需活性筛选化合物和/或多肽和/或聚核苷酸的其它文库的方法。本文还描述来自文库筛选的所述活性数据用于开发和发现新颖治疗剂以及治疗剂本身的用途。
本文还描述增加多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。在一些实施例中，所述方法包含用至少一个非天然氨基酸取代天然存在的多肽中的任一个或一个以上氨基酸，和/或将多肽与水溶性聚合物偶合。
本文还描述用有效量的医药组合物治疗需要所述治疗的患者的方法，所述医药组合物包含包括非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，将非天然氨基酸与水溶性聚合物偶合。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个选自由以下各物组成的群组的非天然氨基酸：含杂环非天然氨基酸、含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸、含二胺非天然氨基酸、含酮炔非天然氨基酸或含酮胺非天然氨基酸。在其它实施例中，已通过生物合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它实施例中，已通过合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它或替代性实施例中，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-LXVII的氨基酸的非天然氨基酸。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的生物可用性增加。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的安全性特征增加。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的水溶性增加。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的治疗半衰期增加。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的血清半衰期增加。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的循环时间延长。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽调节多肽的生物活性。
其它或替代性实施例为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述多肽包含至少一个含杂环非天然氨基酸且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
本文还描述检测患者体内多肽的存在的方法，其包含投与多肽和医药学上可接受的载剂。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸选自由以下各物组成的群组：含杂环非天然氨基酸、含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸、含二胺非天然氨基酸、含酮炔非天然氨基酸或含酮胺非天然氨基酸。在其它实施例中，已通过生物合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它实施例中，已通过合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它或替代性实施例中，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-LXVII的氨基酸的非天然氨基酸。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的生物可用性增加。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的安全性特征增加。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的水溶性增加。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的治疗半衰期增加。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的血清半衰期增加。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽使多肽的循环时间延长。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽调节多肽的生物活性。
其它或替代性实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与包含至少一个含杂环非天然氨基酸的多肽，且所得含杂环非天然氨基酸多肽相对于同源的天然存在的氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
应了解本文所述的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，且因此可变化。还应了解，本文所使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并且不打算限制本文所述的方法和组合物的范围，其将仅受随附权利要求限制。
除非上下文另作明确指示，否则如本文和随附权利要求中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个参考物。
除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语具有与本文所述的本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。尽管可将与本文所述的方法、装置和材料类似或相当的任何方法、装置和材料用于本文所述的本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。
本文所提及的所有公开案和专利都是以全文引用的方式并入本文中以达到描述和揭示例如所述公开案中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文所讨论的公开案仅提供本申请案申请日期之前的揭示内容。本文在任何方面都不应解释为承认本发明的发明者无权由于现有发明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。
术语“基于醛醇的键”或“基于混合醛醇的键”是指一种羰基化合物与另一种可相同或可不相同的羰基化合物的烯醇化物/烯醇的酸或碱催化型缩合，其用于产生β-羟基羰基化合物(醛醇)。
如本文所使用，术语“亲和标记”是指可逆或不可逆地结合另一分子以对其进行修饰、将其破坏或与其形成复合物的标记。举例来说，亲和标记包括酶和其底物，或者抗体和其抗原。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)是以其常规含义使用，并且是指分别经由氧原子、氨基或硫原子与分子连接的烷基。
除非另作说明，否则术语“烷基”本身或作为另一分子的部分意思是指具有指定碳原子数量(即，C1-C10意思是1到10个碳)的直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单或多不饱和的并且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构物等。不饱和烷基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物和异构物。除非另作说明，否则术语“烷基”还打算包括本文更为详细地定义的烷基衍生物，诸如“杂烷基”、“卤烷基”和“同系烷基”。
术语“亚烷基”本身或作为另一分子的部分意思是指衍生自烷烃的二价基团，例如(-CH2-)n，其中n可为1到约24。仅举例来说，所述基团包括但不限于具有10个或更少碳原子的基团，诸如结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”为通常具有8个或更少碳原子的链较短的烷基或亚烷基。除非另作说明，否则术语“亚烷基”还打算包括本文描述为“亚杂烷基”的基团。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，仅举例来说，α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合。所述类似物可具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者可具有经修饰的肽主链，同时仍保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸类似物的非限制性实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。
氨基酸可在本文中以其名称、其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(BiochemicalNomenclatureCommission)所推荐的单字母符号提及。此外，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码提及。
“氨基末端修饰基团”是指可与末端胺基连接的任何分子。举例来说，所述末端胺基可在聚合物分子的末端处，其中所述聚合物分子包括但不限于多肽、聚核苷酸和多糖。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说，末端修饰基团包括聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合物分子的治疗特征，包括但不限于增加肽的血清半衰期。
“抗体片段”意思是除全长形式外的抗体的任何形式。本文中的抗体片段包括作为存在于全长抗体内的较小组分的抗体，以及已经工程改造的抗体。抗体片段包括但不限于Fv、Fc、Fab和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双功能性杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区、重链、轻链和可变区，以及替代支架非抗体分子、双特异性抗体等(Maynard&Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。另一功能结构为单链Fv(scFv)，其包含通过肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区(S-zHu等人,1996,CancerResearch,56,3055-3061)。这些小(Mr25,000)蛋白质通常在单一多肽中保持对抗原的特异性和亲和性并且能够提供较大抗原特异性分子的便利结构单元(buildingblock)。除非另作明确指示，否则使用术语“抗体”的陈述和权利要求中特别包括“抗体片段”。
如本文所使用，术语“芳香族”或“芳基”是指一种闭环结构，其具有至少一个具有共轭π电子系统的环并且包括碳环芳基和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香族”)。碳环或杂环芳香族基团可含有5到20个环原子。所述术语包括单环、共价连接或稠环多环(即，共用相邻碳原子对的环)基团。芳香族基团可未经取代或经取代。“芳香族”或“芳基”的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、蒽基和菲基。上述芳基和杂芳基环系统中每一者的取代基选自本文所述的可接受取代基的群组。
简言之，术语“芳香族”或“芳基”当与其它术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时包括如上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”或“烷芳基”打算包括芳基与烷基连接的基团(包括但不限于苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括但不限于亚甲基)已经杂原子(仅举例来说，氧原子)置换的烷基。所述芳基的实例包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等。
如本文所使用，术语“亚芳基”是指二价芳基。“亚芳基”的非限制性实例包括亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基和亚噻吩基。亚芳基的取代基选自本文所述的可接受取代基的群组。
“双官能聚合物”(也称为“双官能连接基”)是指包含两个能够与其它部分特异性反应以形成共价或非共价键的官能团的聚合物。所述部分可包括但不限于天然或非天然氨基酸或者含有所述天然或非天然氨基酸的肽上的侧基。仅举例来说，双官能连接基可具有可与第一肽上的基团反应的官能团和可与第二肽上的基团反应的另一官能团，从而形成包括第一肽、双官能连接基和第二肽的连结物。已知许多将各种化合物与肽连接的程序和连接基分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，所述专利以全文引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”(也称为“多官能连接基”)是指包含两个或两个以上能够与其它部分反应的官能团的聚合物。所述部分可包括但不限于用于形成共价或非共价键的天然或非天然氨基酸或者含有所述天然或非天然氨基酸的肽上的侧基(包括但不限于氨基酸侧基)。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需长度或分子量，并且可经选择以在连接到化合物的一个或一个以上分子与其所结合的分子或化合物之间提供特定所需间隔或构象。
如本文所使用，术语“生物可用性”是指物质或其活性部分自医药剂型传递并且在作用部位或在全身循环中变得可用的速率和程度。生物可用性增加是指物质或其活性部分自医药剂型传递并且在作用部位或在全身循环中变得可用的速率和程度的增加。举例来说，生物可用性的增加可通过当与其它物质或活性部分比较时物质或其活性部分在血液中的浓度的增加来指示。用于评估生物可用性增加的方法的非限制性实例提供于实例21-25中。此方法可用于评估任何多肽的生物可用性。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”当用于本文中时意思是指可影响与有机体(包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类)有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质。具体来说，如本文所使用，生物活性分子包括但不限于预期用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或者以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡聚核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。适用于本文所述的方法和组合物的生物活性剂的种类包括但不限于药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素等。
“调节生物活性”意思指增加或降低多肽的反应性、改变多肽的选择性、增强或减弱多肽的底物选择性。可通过将非天然多肽的生物活性与天然多肽的生物活性相比较来进行经改变生物活性的分析。
如本文所使用，术语“生物材料”是指生物来源的材料，包括但不限于由生物反应器和/或重组方法和技术获得的材料。
如本文所使用，术语“生物物理探针”是指可检测或监测分子结构改变的探针。所述分子包括但不限于蛋白质，并且“生物物理探针”可用于检测或监测蛋白质与其它大分子的相互作用。生物物理探针的实例包括但不限于自旋标记、荧光团和可光活化的基团。
如本文所使用，术语“通过生物合成方法”是指利用翻译系统(细胞或无细胞)的任何方法，包括使用至少一种以下组件：聚核苷酸、密码子、tRNA和核糖体。举例来说，可使用本文“活体内产生包含非天然氨基酸的多肽”和非限制性实例20中所述的方法和技术将非天然氨基酸“通过生物合成方法并入”非天然氨基酸多肽中。此外，选择可“通过生物合成方法并入”非天然氨基酸多肽中的有用非天然氨基酸的方法描述于非限制性实例20中。
如本文所使用，术语“生物素类似物”(或者也称为“生物素模拟物”)为除生物素外的任何分子，其以高亲和力与抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白链菌素结合。
如本文所使用，术语“羰基”是指含有选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-和-C(S)-组成的群组的部分的基团，包括但不限于含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸基团和/或至少一个硫酯基的基团。所述羰基包括酮、醛、羧酸、酯和硫酯。此外，所述基团可为直链、支链或环状分子的部分。
术语“羧基末端修饰基团”是指可与末端羧基连接的任何分子。举例来说，所述末端羧基可在聚合物分子的末端处，其中所述聚合物分子包括但不限于多肽、聚核苷酸和多糖。末端修饰基团包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说，末端修饰基团包括聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合物分子的治疗特征，包括但不限于增加肽的血清半衰期。
如本文所使用，术语“可化学裂解的基团”(也称为“化学不稳定”基团)是指当暴露于酸、碱、氧化剂、还原剂、化学引发剂或辐射引发剂时断裂或裂解的基团。
如本文所使用，术语“化学发光基团”是指在不加热的情况下因化学反应而发光的基团。仅举例来说，鲁米诺(luminol)(5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)与如过氧化氢(H2O2)的氧化剂在存在碱和金属催化剂的情况下反应以产生激发态产物(3-氨基邻苯二甲酸酯，3-APA)。
如本文所使用，术语“发色团”是指吸收可见波长、UV波长或IR波长的光线的分子。
如本文所使用，术语“辅因子”是指对大分子的作用至关重要的原子或分子。辅因子包括但不限于无机离子、辅酶、蛋白质或酶活性必需的一些其它因子。实例包括血色素中的血红素、叶绿素中的镁和蛋白质的金属离子。
如本文所使用，“共折叠”是指使用至少两个分子的再折叠过程、反应或方法，所述分子彼此相互作用并且导致展开或不恰当折叠的分子转化成适当折叠的分子。仅举例来说，“共折叠”使用至少两个多肽，其彼此相互作用并且导致展开或不恰当折叠的多肽转化成天然的适当折叠的多肽。所述多肽可含有天然氨基酸和/或至少一个非天然氨基酸。
如本文所使用，“比较窗”是指在最佳比对两个序列后用于将具有相同数量的邻近位置的序列与参考序列相比较的邻近位置中任一者的区段。所述邻近位置包括但不限于由约20到约600个连续单元、包括约50到约200个连续单元和约100到约150个连续单元组成的群组。仅举例来说，所述序列包括多肽以及含有非天然氨基酸的多肽，其中连续单元包括但不限于天然和非天然氨基酸。此外，仅举例来说，所述序列包括聚核苷酸，其中核苷酸为相应连续单元。所属领域众所周知用于比较的序列的比对方法。可通过(包括但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)；或者人工比对和目测(例如参看Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology(1995增补版))来进行供比较的序列的最佳比对。
举例来说，可用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1997)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。进行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公共可用。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3且期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl,Acad.Sci.USA89:10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及比较两条链。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”筛选程序。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性测量法为最小总和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。举例来说，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2或小于约0.01或小于约0.001，那么认为核酸与参考序列类似。
术语“保守修饰变体”适用于天然与非天然氨基酸以及天然与非天然核酸序列以及其组合。就特定核酸序列来说，“保守修饰变体”是指编码相同或基本上相同的天然和非天然氨基酸序列的天然和非天然核酸，或者当天然和非天然核酸不编码天然和非天然氨基酸序列时，也指基本上相同的序列。举例来说，由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸将编码任何指定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每一位置处，密码子可在不改变所编码多肽的情况下变成任何相应的密码子。所述核酸变异为“沉默变异(silentvariation)”，其为保守修饰变异的一种。因此，举例来说，编码天然或非天然多肽的本文中的每个天然或非天然核酸序列也描述天然或非天然核酸的每个可能的沉默变异。所属领域技术人员将认识到，天然或非天然核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG除外)可经修饰以得到功能相同的分子。因此，编码天然和非天然多肽的天然和非天然核酸的每一沉默变异是每一所述序列中所固有的。
对于氨基酸序列来说，改变、添加或缺失单一天然和非天然氨基酸或经编码序列中小百分比的天然和非天然氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守修饰变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化学上类似的氨基酸对天然和非天然氨基酸的取代。所属领域众所周知提供功能类似的天然氨基酸的保守取代表。所述保守修饰变体除为多形态变体外且不排除多形态变体，还为本文所述方法和组合物的种间同系物和等位基因。
所属领域技术人员已知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。以下八个群组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，
(例如参看Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(WHFreeman&Co.；第2版(1993年12月))。
除非另作说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合时分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环键。此外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的剩余部分连接的位置。杂原子可包括但不限于氧、氮或硫。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，所述术语涵盖多环结构，包括但不限于双环和三环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”本身或作为另一分子的部分意思是指衍生自杂环烷基的二价基团，并且术语“亚环烷基”本身或作为另一分子的部分意思是指衍生自环烷基的二价基团。
如本文所使用，术语“环糊精”是指在环形成过程中由至少6个到8个葡萄糖分子组成的环状碳水化合物。环的外侧部分含有水溶性基团；在环中心处为能够容纳小分子的相对非极性腔。
如本文所使用，术语“细胞毒性”是指危害细胞的化合物。
如本文所使用，“变性剂”是指将引起聚合物可逆展开的任何化合物或材料。仅举例来说，“变性剂”可引起蛋白质可逆展开。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。举例来说，变性剂包括但不限于离液剂、清洁剂、水混溶性有机溶剂、磷脂或其组合。离液剂的非限制性实例包括但不限于脲、胍和硫代氰酸钠。清洁剂的非限制性实例可包括但不限于强清洁剂(诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚)(例如，Tween或Triton清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、温和的非离子清洁剂(例如，毛地黄皂苷)、温和的阳离子清洁剂(诸如，N->2,3-(二油酰基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵)、温和的离子清洁剂(例如，胆酸钠或去氧胆酸钠)或两性离子清洁剂(包括但不限于硫代甜菜碱(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO))。水混溶性有机溶剂的非限制性实例包括但不限于乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(C2-C4烷二醇，诸如乙二醇)可用作变性剂。磷脂的非限制性实例包括但不限于天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱。
如本文所使用，术语“所需官能团”是指选自以下各物的任何基团：标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树突状聚合物、环糊精、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂(在此情况下，生物活性剂可包括具有治疗活性的试剂，且非天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸可与所连接的治疗剂一起充当辅助治疗剂或用作将治疗剂传递到有机体内的所需部位的方式)、可检测标记、小分子、抑制性核糖核酸、放射性核苷酸、中子捕获剂、生物素衍生物、量子点、纳米递质、放射性递质、抗体酶、活性复合活化剂、病毒、佐剂、苷元、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂草苷、穿梭载体、大分子、模拟表位、受体、反胶束、和其任何组合。
如本文所使用，术语“二胺”是指包含至少两个胺官能团的基团/分子，包括但不限于肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。此外，所述基团可为直链、支链或环状分子的部分。
如本文所使用，术语“可检测标记”是指可使用分析技术观察的标记，所述分析技术包括但不限于荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见光吸收光谱、质谱、核磁共振、磁共振和电化学方法。
如本文所使用，术语“二羰基”是指含有至少两个选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-和-C(S)-组成的群组的部分的基团，包括但不限于1,2-二羰基、1,3-二羰基和1,4-二羰基，以及含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸基团和/或至少一个硫酯基的基团。所述二羰基包括二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯。此外，所述基团可为直链、支链或环状分子的部分。二羰基中的两个部分可相同或不同，且可在两个部分的任一个处包括将产生(仅举例来说)酯、酮、醛、硫酯或酰胺的取代基。
如本文所使用，术语“药物”是指用于预防、诊断、缓和、治疗或治愈疾病或病状的任何物质。
如本文所使用，术语“染料”是指含有发色团的可溶性着色物质。
如本文所使用，术语“有效量”是指所投与的药剂或化合物的充足量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病状的一种或一种以上症状。结果可为疾病的病征、症状或病因的减轻和/或缓和，或者生物系统的任何其它所需改变。举例来说，所投与的药剂或化合物包括但不限于天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽。可投与含有所述天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以供预防性、增强性和/或治疗性治疗。任何个别情况中的适当“有效”量可使用诸如剂量递增研究的技术来确定。
如本文所使用，术语“电子致密基团”是指当用电子束照射时散射电子的基团。所述基团包括但不限于钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉(99％)、碳酰肼、六水合氯化铁、六亚甲基四胺(98.5％)、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银(silverproteinate)(Ag检定：8.0-8.5％)“强”、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫脲(TSC)、乙酸双氧铀、硝酸双氧铀和硫酸氧钒。
如本文所使用，术语“能量转移剂”是指可向另一分子提供能量或从另一分子接受能量的分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过所述过程荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发的受体分子，随后荧光性地以较长波长发射所提供能量。
术语“增强”意思是增加或延长所需作用的功效或持续时间。举例来说，“增强”治疗剂的作用是指增加或延长疾病、病症或病状的治疗期间治疗剂作用的功效或持续时间的能力。如本文所使用，“增强有效量”是指足以增强疾病、病症或病状的治疗中治疗剂的作用的量。当用于患者时，用于此用途的有效量将视疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的反应以及主治医生的判断而定。
如本文所使用，术语“真核生物”是指属于系统发生真核领域的有机体，包括但不限于动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物和藻类)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫和原生生物。
如本文所使用，术语“脂肪酸”是指具有约C6或较长烃侧链的羧酸。
如本文所使用，术语“荧光团”是指在激发后发射光子并且由此发荧光的分子。
如本文所使用，术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”是指分子发生化学反应的部分或单元。所述术语在化学领域中于一定程度上同义，并且在本文中用于指示执行某种功能或活性并且可与其它分子反应的分子的部分。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
如本文所使用，术语“卤酰基”是指含有卤素部分的酰基，包括但不限于-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等。
如本文所使用，术语“卤烷基”是指含有卤素部分的烷基，包括但不限于-CF3和-CH2CF3等。
如本文所使用，术语“杂烷基”是指直链或支链或环状烃基或其组合，其是由烷基和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置处或烷基与分子剩余部分连接的位置处。实例包括但不限于-CH2-CH2-OCH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。此外，至多两个杂原子可为连续的，诸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
术语“基于杂环的键”或“杂环键”是指由二羰基与二胺基反应所形成的部分。所得反应产物为杂环，包括杂芳基或杂环烷基。所得杂环基充当非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽与另一官能团之间的化学连接。在一个实施例中，杂环键包括含氮杂环键，仅举例来说，包括吡唑键、吡咯键、吲哚键、苯并二氮杂卓键和吡唑啉酮键。
类似地，术语“亚杂烷基”是指衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括但不限于亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。另外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说，连接基团的化学式所书写的方向并不暗示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-。
如本文所使用，术语“杂芳基”或“杂芳香族”是指含有至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基；其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮原子可经季铵化。杂芳基可经取代或未经取代。杂芳基可通过杂原子与分子的剩余部分连接。杂芳基的非限制性实例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
如本文所使用，术语“同系烷基”是指为烃基的烷基。
如本文所使用，术语“一致”是指两个或两个以上序列或子序列相同。此外，如本文所使用，术语“实质上一致”是指当使用比较算法或通过手工比对和目测在比较窗或指定测量的区域上比较和比对最大相应性时，两个或两个以上具有相同的连续单元百分比的序列。仅举例来说，如果特定区域内的连续单元约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上序列可“实质上一致”。所述百分数用于描述两个或两个以上序列的“一致性百分比”。序列的一致性可存在于至少约75-100个连续单元长的区域、约50个连续单元长的区域或(未指定时)整个序列。此定义也是指测试序列的互补性。仅举例来说，当氨基酸残基相同时，两个或两个以上多肽序列一致；而如果指定区域内的氨基酸残基约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上多肽序列“实质上一致”。一致性可存在于至少约75到约100个氨基酸长的区域、约50个氨基酸长的区域或(未指定时)多肽序列的整个序列。此外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或两个以上聚核苷酸序列一致；而如果指定区域内的核酸残基约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上聚核苷酸序列“实质上一致”。一致性可存在于至少约75到约100个核酸长的区域、约50个核酸长的区域或(未指定时)聚核苷酸序列的整个序列。
对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定替代参数。随后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文所使用，术语“免疫原性”是指对投与治疗药物的抗体反应。可使用供检测生物流体中抗非天然氨基酸多肽抗体的定量和定性检定来获得对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性。所述检定包括但不限于放射免疫检定(RIA)、酶联免疫吸附剂检定(ELISA)、发光免疫检定(LIA)和荧光免疫检定(FIA)。对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性的分析涉及将投与治疗性非天然氨基酸多肽后的抗体反应与投与治疗性天然氨基酸多肽后的抗体反应相比较。
如本文所使用，术语“插入剂”(也称为“插入基团”)是指可插入分子的分子内间隙或者分子之间的分子间间隙中的化学物。仅举例来说，插入剂或基团可为插入DNA双螺旋的堆叠碱基内的分子。
如本文所使用，术语“经分离”是指使所关注的组分与非所关注的组分分离并且将所关注的组分从非所关注的组分中去除。经分离物质可为干燥状态或半干燥状态，或者为溶液(包括但不限于水溶液)的形式。经分离组分可为均质态，或经分离组分可为医药组合物的一部分，所述医药组合物包含额外的医药学上可接受的载剂和/或赋形剂。可使用分析化学技术(包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)测定纯度和均质性。此外，当分离所关注的组分并且所关注的组分是制剂中所存在的主要物质时，本文将组分描述为实质上经纯化。如本文所使用，术语“经纯化”可指至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更纯的所关注的组分。仅举例来说，当核酸或蛋白质无至少某些在其天然状态下与其缔合的细胞组分或者已将核酸或蛋白质浓缩到高于其在活体内或活体外制造的浓度的程度时，所述核酸或蛋白质为“经分离”的。同样，举例来说，当从与基因侧接并且编码除所关注的基因外的蛋白质的开放式阅读框分离时，基因为经分离的。
如本文所使用，术语“标记”是指并入化合物中并且易于检测，借此其物理分布可经检测和/或监测的物质。
如本文所使用，术语“键”是指由连接基的官能团与另一分子之间的化学反应而形成的键结或化学部分。所述键结可包括但不限于共价键和非共价键，而所述化学部分可包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键。水解稳定的键意思是指所述键在水中实质上稳定并且在有用pH值下(包括但不限于在生理学条件下)一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键意思是所述键可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键意思是所述键可由一种或一种以上酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物可在聚合物主链内或聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基内包括可降解键。所述可降解键包括但不限于由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键，其中所述酯基通常在生理学条件下水解以释放生物活性剂。其它水解可降解键包括但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由(包括但不限于)聚合物(诸如PEG)末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；以及由(包括但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
如本文所使用，术语“培养基”是指用于生长和采集细胞和/或所述细胞所表达和/或分泌的产物的任何培养基。所述“培养基”包括但不限于溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或容纳任何宿主细胞，例如包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内容物。所述“培养基”包括但不限于已生长宿主细胞、已分泌多肽的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。所述“培养基”还包括但不限于含有宿主细胞溶解产物(例如，细胞内产生的多肽)的缓冲液或试剂并且宿主细胞经溶解或破裂以释放多肽。
如本文所使用，术语“代谢物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽)的衍生物，其是当所述化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽)代谢时形成。术语“医药活性代谢物”或“活性代谢物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽)的生物活性衍生物，其是当所述化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽)代谢时形成。
如本文所使用，术语“代谢”是指有机体改变特定物质的过程的统称。所述过程包括但不限于水解反应和酶催化的反应。有关代谢的其它信息可从ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版,McGraw-Hill(1996)获得。仅举例来说，天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽的代谢物可通过以下方式来鉴别：对宿主投与天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽并分析来自宿主的组织样本；或者在活体外培养天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰天然氨基酸多肽或经修饰非天然氨基酸多肽与肝细胞并分析所得化合物。
如本文所使用，术语“金属螯合剂”是指与金属离子形成金属络合物的分子。举例来说，所述分子可与中心金属离子形成两个或两个以上配位键并且可形成环结构。
如本文所使用，术语“含金属部分”是指含有金属离子、原子或粒子的基团。所述部分包括但不限于顺铂(cisplatin)、螯合金属离子(诸如，镍、铁和铂)和金属纳米粒子(诸如，镍、铁和铂)。
如本文所使用，术语“并有重原子的部分”是指并有通常比碳重的原子的离子的基团。所述离子或原子包括但不限于硅、钨、金、铅和铀。
如本文所使用，术语“经修饰”是指存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。可通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰，或者通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的共翻译修饰或翻译后修饰来获得所述改变或修饰。形式“(经修饰)”意思指所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可经修饰或不经修饰。
如本文所使用，术语“经调节的血清半衰期”是指经修饰生物活性分子的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。举例来说，经修饰生物活性分子包括但不限于天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，通过在投与生物活性分子或经修饰生物活性分子后各个时间点时取得血液样本，并且测定各样本中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。举例来说，经调节血清半衰期可为增加的血清半衰期，其能够促成改进的给药方案或避免有毒作用。血清中的所述增加可为至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。评估血清半衰期增加的方法的非限制性实例提供于实例33中。此方法可用于评估任何多肽的血清半衰期。
如本文所使用，术语“经调节的治疗半衰期”是指治疗有效量的经修饰生物活性分子的半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。举例来说，经修饰生物活性分子包括但不限于天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，通过测量投药后各个时间点时分子的药物动力学和/或药效学特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期能够促成特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或者避免不合需要的作用。举例来说，可通过增加功效、增加或减少经修饰分子与其标靶的结合、增加或降低另一参数或未经修饰分子的作用机制或者增加或降低酶(仅举例来说，蛋白酶)对分子的降解来引起治疗半衰期的增加。评估治疗半衰期增加的方法的非限制性实例提供于实例33中。此方法可用于评估任何多肽的治疗半衰期。
如本文所使用，术语“纳米粒子”是指粒径介于约500nm到约1nm之间的粒子。
如本文所使用，术语“近化学计量”是指参与化学反应的化合物的摩尔数的比率为约0.75到约1.5。
如本文所使用，术语“非真核生物”是指非真核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真菌系统发生域，包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)、极端嗜热细菌(Thermusthermophilics)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluoresceins)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；或古菌系统发生域，包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、超嗜热古菌(Archaeoglobusfulgidus)、强烈嗜热球菌(Pyrococcusfuriosus)、堀越火球菌(Pyrococcushorikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrumpernix)或嗜盐菌(Halobacterium)(诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌属NRC-1(HalobacteriumspeciesNRC-1))。
“非天然氨基酸”是指不为20种常见氨基酸中的一种或者吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。可与术语“非天然氨基酸(non-naturalaminoacid)”同义使用的其它术语为“非天然编码的氨基酸”、“非天然氨基酸(unnaturalaminoacid)”、“非天然存在的氨基酸”以及其各种以连字符连接和未用连字符连接的形式。术语“非天然氨基酸”包括但不限于通过修饰天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在，但本身未通过翻译复合物并入生长的多肽链中的氨基酸。并非天然编码的天然存在的氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。此外，术语“非天然氨基酸”包括但不限于天然不存在并且可通过合成方式获得或者可通过修饰非天然氨基酸而获得的氨基酸。
如本文所使用，术语“核酸”是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。仅举例来说，所述核酸和核酸聚合物包括但不限于(i)天然核苷酸的类似物，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢；(ii)寡核苷酸类似物，包括但不限于PNA(肽基核酸)、用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)；(iii)其保守修饰变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确描述的序列。举例来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
如本文所使用，术语“氧化剂”是指能够从经氧化的化合物中移除电子的化合物或物质。举例来说，氧化剂包括但不限于经氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、经氧化二硫苏糖醇、经氧化赤藓醇和氧。各种氧化剂适用于本文所述的方法和组合物中。
如本文所使用，术语“医药学上可接受”是指不会消除化合物的生物活性或特性且相对无毒(即，可将物质投与个体而不会引起不合需要的生物作用或以有害方式与含有所述物质的组合物的任何组分相互作用)的物质，包括但不限于盐、载剂或稀释剂。
如本文所使用，术语“光亲和标记”是指具有当曝光时与标记对其具有亲和性的分子形成键的基团的标记。仅举例来说，所述键可为共价键或非共价键。
如本文所使用，术语“光笼蔽部分”是指当以某种波长照明时共价或非共价结合其它离子或分子的基团。
如本文所使用，术语“可光裂解基团”是指当曝光时断裂的基团。
如本文所使用，术语“光交联剂”是指包含两个或两个以上官能团的化合物，所述官能团可在曝光时反应并且与两个或两个以上单体或聚合分子形成共价或非共价键。
如本文所使用，术语“可光异构化部分”是指当用光照明时由一种异构形式变为另一种异构形式的基团。
如本文所使用，术语“聚亚烷基二醇”是指线性或分枝聚合聚醚多元醇。所述聚亚烷基二醇包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。其它例示性实施例例如列于商业供应商目录中，诸如ShearwaterCorporation目录"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)。仅举例来说，所述聚合聚醚多元醇具有介于约0.1kDa到约100kDa之间的平均分子量。举例来说，所述聚合聚醚多元醇包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。
如本文所使用，术语“聚合物”是指由重复亚单元构成的分子。所述分子包括但不限于多肽、聚核苷酸或多糖或者聚亚烷基二醇。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，并且针对肽的描述和蛋白质的描述也适用于多肽的描述。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然氨基酸的氨基酸聚合物。此外，所述“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。
术语“翻译后修饰”是指当天然或非天然氨基酸已通过翻译并入多肽链后发生的对所述氨基酸的任何修饰。所述修饰包括但不限于共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如，在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。
如本文所使用，术语“前药”或“医药学上可接受的前药”是指在活体内或活体外转化成母体药物的药剂，其中其不会消除药物的生物活性或特性且相对无毒(即，可将物质投与个体而不会引起不合需要的生物作用或以有害方式与含有所述物质的组合物的任何组分相互作用)。前药通常为药物前体，其在投与个体且随后吸收后，经由特定过程转化(诸如通过代谢路径转化)为活性或更具活性的物质。一些前药具有存在于前药上使其具有较低活性和/或赋予药物溶解性或某种其它特性的化学基团。将化学基团从前药中裂解和/或修饰后，产生活性药物。前药在体内通过酶促或非酶促反应转化成活性药物。前药可提供改良的生理化学特性，诸如较好的溶解性、增强的传递特征(诸如，特异性靶向特定细胞、组织、器官或配体)和改良的药物治疗价值。所述前药的益处包括但不限于(i)与母体药物相比易于投药；(ii)前药可通过经口投与而为生物利用，而母体药物不行；和(iii)与母体药物相比，前药在医药组合物中还可具有改良的溶解性。前药包括药理学上无活性或活性降低的活性药物衍生物。前药可经设计成通过操纵药物特性(诸如，生理化学、生物医药或药物动力学特性)来调节到达所需作用部位的药物或生物活性分子的量。前药的非限制性实例为非天然氨基酸多肽，其是以酯(“前药”)的形式投与以促进跨越其中水溶性对迁移率不利的细胞膜传送，但进入其中水溶性有益的细胞内侧后随后经代谢水解成为羧酸，即活性实体。可将前药设计成可逆的药物衍生物以用作增强药物至位点特异性组织的输送的修饰剂。
如本文所使用，术语“预防有效量”是指预防性地应用于患者的含有至少一个非天然氨基酸多肽或至少一个经修饰非天然氨基酸多肽的组合物的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。在所述预防应用中，所述量可视患者的健康状态、体重等而定。所属领域技术人员将理解，通过常规实验(包括但不限于剂量递增临床试验)可确定所述预防有效量。
如本文所使用，术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。仅举例来说，(i)如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；(ii)如果反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物；且(iii)如果化学反应性基团为羧酸(诸如，丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或烷基(诸如，甲基、乙基或叔丁基)。
仅举例来说，封端/保护基可选自：
此外，保护基包括但不限于光不稳定基团，诸如Nvoc和MeNvoc以及所属领域已知的其它保护基。其它保护基描述于Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,1999中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。
如本文所使用，术语“放射性部分”是指其核自发放出核辐射(诸如，α、β或γ粒子)的基团；其中α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能光子。
如本文所使用，术语“反应性化合物”是指在适当条件下可与另一原子、分子或化合物反应的化合物。
术语“重组宿主细胞”(也称为“宿主细胞”)是指包括外源聚核苷酸的细胞，其中用于将外源聚核苷酸插入细胞中的方法包括但不限于直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的产生重组宿主细胞的其它方法。仅举例来说，所述外源聚核苷酸可为非整合载体，包括但不限于质粒；或可整合到宿主基因组中。
如本文所使用，术语“氧化还原活性剂”是指氧化或还原另一分子的分子，由此氧化还原活性剂变成还原或氧化态。氧化还原活性剂的实例包括但不限于二茂铁、醌、Ru2+/3+络合物、Co2+/3+络合物和Os2+/3+络合物。
如本文所使用，术语“还原剂”是指能够将电子加到所还原的化合物中的化合物或物质。举例来说，还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和经还原谷胱甘肽。所述还原剂可用于(仅举例来说)使巯基保持在还原态并且还原分子内或分子间二硫键。
如本文所使用，“再折叠”描述将未适当折叠或展开状态转化成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。仅举例来说，就二硫键来说，再折叠将含有二硫键的多肽由未适当折叠或展开状态转化成天然或适当折叠的构象。所述含有二硫键的多肽可为天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。
如本文所使用，术语“树脂”是指高分子量的不可溶聚合物珠粒。仅举例来说，所述珠粒可用作固相肽合成的支撑物或在纯化前连接分子的部位。
如本文所使用，术语“糖”是指一系列碳水化合物，包括但不限于糖、单糖、寡糖和多糖。
如本文所使用，术语“安全性”或“安全性特征”是指可能与药物投与有关(涉及已投与药物的次数)的副作用。举例来说，认为已投与多次且仅产生轻微副作用或不产生副作用的药物具有优良的安全性特征。评估安全性特征的方法的非限制性实例提供于实例26中。此方法可用于评估任何多肽的安全性特征。
如本文所使用，短语“与…选择性杂交”或“与…特异性杂交”是指当特定核苷酸序列存在于包括但不限于全细胞或者文库DNA或RNA的复杂混合物中时，分子与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
如本文所使用，术语“自旋标记”是指含有展现可通过电子自旋共振光谱检测的未配对电子自旋(即，稳定的顺磁性基团)的原子或一组原子并且可与另一分子连接的分子。所述自旋标记分子包括但不限于硝酰基和硝基氧(nitroxide)并且可为单自旋标记或双自旋标记。
如本文所使用，术语“化学计量”是指参与化学反应的化合物的摩尔数的比率为约0.9到约1.1。
如本文所使用，术语“类化学计量”是指在改变反应条件时或者在存在添加剂的情况下变为化学计量或近化学计量的化学反应。所述反应条件的改变包括但不限于温度的增加或pH值的改变。所述添加剂包括但不限于加速剂。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在低离子强度和高温条件下的杂交。举例来说，在严格条件下，探针将与其在核酸的复杂混合物(包括但不限于全细胞或文库DNA或RNA)中的靶序列杂交，但不与在复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件为序列依赖性的并且将随不同环境而不同。举例来说，较长的序列在较高温度下特异性杂交。严格杂交条件包括但不限于(i)在指定离子强度和pH值下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃；(ii)在约pH7.0到约pH8.3下盐浓度为约0.01M到约1.0M，且对于短探针(包括但不限于约10到约50个核苷酸)来说温度为至少约30℃，且对于长探针(包括但不限于大于50个核苷酸)来说温度为至少约60℃；(iii)加入去稳定剂，包括但不限于甲酰胺；(iv)50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、约1％SDS，在65℃下培育，且在65℃下在0.2×SSC和约0.1％SDS中洗涤，达介于约5分钟到约120分钟之间的时间。仅举例来说，选择性或特异性杂交的检测包括但不限于至少两倍于背景的正信号。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。
如本文所使用，术语“个体”是指为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，个体可为(但不限于)哺乳动物，包括但不限于人类。
如本文所使用，术语“实质上经纯化”是指所关注的组分可实质上或基本上无在纯化前通常伴随所关注的组分或与所关注的组分相互作用的其它组分。仅举例来说，当所关注的组分的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)污染组分时，所关注的组分可为“实质上经纯化”的。因此，“实质上经纯化”的所关注的组分可具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。仅举例来说，可从天然细胞或在重组产生天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的情况下从宿主细胞中纯化出天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)污染物质时，所述制剂可为“实质上经纯化”的。举例来说，当通过宿主细胞重组产生天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以占细胞干重约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更低比率存在。举例来说，当通过宿主细胞重组产生天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以占细胞干重约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低量存在于培养基中。举例来说，如通过适当方法(包括但不限于SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定，“实质上经纯化”的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可具有约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的纯度水平。
术语“取代基”(也称为“无干扰取代基”)是指可用于置换分子上的另一基团的基团。所述基团包括但不限于卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12环烷基、C4-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。前述列表中的各R基团包括但不限于H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基或烷芳基。当通过从左向右书写的常规化学式说明取代基时，其同样涵盖由从右向左书写结构所得到的在化学上相同的取代基，例如，-CH2O-与-OCH2-相同。
仅举例来说，烷基和杂烷基(包括称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基包括但不限于：-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN和-NO2。前述列表中的各R基团包括但不限于氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基。当将两个R基团连接到相同氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR2打算包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。
举例来说，芳基和杂芳基的取代基包括但不限于-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NR-C(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量为零到芳香族环系统上开放价态的总数；且其中前述列表中的各R基团包括但不限于氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指投与已罹患疾病、病状或病症的患者的含有至少一个非天然氨基酸多肽和/或至少一个经修饰非天然氨基酸多肽的组合物的量，其足以治愈或至少部分遏制或在一定程度上缓解所治疗的疾病、病症或病状的一种或一种以上症状。所述组合物的效用视包括但不限于以下因素的条件而定：疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的反应以及主治医生的判断。仅举例来说，治疗有效量可通过常规实验(包括但不限于剂量递增临床试验)来确定。
如本文所使用，术语“硫烷氧基”是指经由氧原子与分子连接的含硫烷基。
术语“热熔点”或Tm为平衡时50％与标靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)。
如本文所使用，术语“有毒部分”是指可造成危害或死亡的化合物。
如本文所使用，术语“治疗”包括缓和、减轻或改善疾病或病状的症状；预防其它症状；改善或预防症状的潜在代谢病因；抑制疾病或病状，例如使疾病或病状的发展停滞；缓解疾病或病状；引起疾病或病状的消退；缓解由疾病或病状引起的症象；或者停止疾病或病状的症状。术语“治疗”包括但不限于预防性和/或治疗性治疗。
如本文所使用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。所述水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇和其衍生物、聚亚烷基二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。举例来说，所述水溶性聚合物与天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽偶合可导致改变，包括但不限于水溶性增加、血清半衰期增加或经调节、治疗半衰期相对于未经修饰的形式增加或经调节、生物可用性增加、生物活性经调节、循环时间延长、免疫原性经调节、物理缔合特征(包括但不限于聚集和多聚体形成)经调节、受体结合改变、与一个或一个以上结合搭配物的结合改变和受体二聚化或多聚化改变。此外，所述水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性。
除非另作说明，否则所属领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法都可使用。
本文所提供的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、经修饰非天然氨基酸多肽以及制造上述化合物的试剂)包括同位素标记的化合物，其与本文所提供的各个化学式和结构中所述者相同，但一个或一个以上原子经原子质量或质量数与自然界常见的原子质量或质量数不同的原子置换。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别诸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文所述的某些同位素标记的化合物(例如，并有诸如3H和14C的放射性同位素的化合物)可用于药物和/或基质组织分布检定中。此外，用同位素(诸如氘，即2H)取代可因较高的代谢稳定性(例如，增加的活体内半衰期或降低的剂量需求)而提供某些治疗优势。
本文中的某些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)具有不对称碳原子并且因此能够以对映异构体或非对映异构体形式存在。可根据物理化学差异通过已知方法(例如，色谱法和/或分级结晶)将非对映异构体混合物分成其个别非对映异构体。可通过与适当的光学活性化合物(例如，醇)反应将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，分离非对映异构体和将个别非对映异构体转化(例如，水解)成相应的纯对映异构体，从而分离对映异构体。认为所有所述异构体(包括非对映异构体、对映异构体和其混合物)都为本文所述的组合物的部分。
在额外或其它实施例中，将本文所述的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)以前药的形式使用。在额外或其它实施例中，本文所述的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)在投与有需要的有机体后代谢以产生代谢物，所述代谢物随后用于产生所需作用，包括所需治疗作用。其它或额外实施例为非天然氨基酸和“经修饰或未经修饰”的非天然氨基酸多肽的活性代谢物。
本文所述的方法和调配物包括使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的N-氧化物、结晶形式(也称为多晶形物)或医药学上可接受的盐。在某些实施例中，非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。所有互变异构体都包括在本文所提供的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的范围内。此外，本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。认为本文所提供的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的溶剂化形式也在本文中有所揭示。
本文所述的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)可以若干互变异构形式存在。认为所有所述互变异构形式都为本文所述的组合物的部分。而且，例如认为本文中的任何化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)的所有烯醇-酮基形式为本文所述的组合物的部分。
本文所述的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)为酸性并且可与医药学上可接受的阳离子形成盐。本文所述的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽，以及制造上述化合物的试剂)可为碱性且因此可与医药学上可接受的阴离子形成盐。所有所述盐(包括二盐)都在本文所述的组合物的范围内并且其可通过常规方法制备。举例来说，可通过使酸性和碱性实体在水性介质、非水性介质或部分水性介质中接触来制备盐。通过使用以下技术中的至少一种来回收盐：过滤、用非溶剂沉淀随后过滤、蒸发溶剂或在水溶液的情况下冻干。
当母体非天然氨基酸中存在的酸性质子经金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换或与有机碱配位时，可形成本文所揭示的非天然氨基酸多肽的医药学上可接受的盐。此外，可使用原材料或中间物的盐制备所揭示的非天然氨基酸多肽的盐形式。可通过使游离碱形式的本文所述的非天然氨基酸多肽与医药学上可接受的无机或有机酸反应来将本文所述的非天然氨基酸多肽制备成医药学上可接受的酸加成盐(其为一种类型的医药学上可接受的盐)。或者，可通过使游离酸形式的本文所述的非天然氨基酸多肽与医药学上可接受的无机或有机碱反应来将本文所述的非天然氨基酸多肽制备成医药学上可接受的碱加成盐(其为一种类型的医药学上可接受的盐)。
医药学上可接受的盐的类型包括但不限于：(1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-亚基-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)当母体化合物中存在的酸性质子经金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换或者与有机碱配位时所形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
可使用各种方法分析和鉴别非天然氨基酸多肽的医药学上可接受的盐的相应平衡离子，所述方法包括但不限于离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、感应耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱或其任何组合。此外，可使用实例87-91中所述的技术和方法测试所述非天然氨基酸多肽的医药学上可接受的盐的治疗活性。
应了解，当提到盐时包括其溶剂加成形式或晶体形式，尤其溶剂化物或多晶形物。溶剂化物含有化学计量或非化学计量的量的溶剂，并且通常是在结晶过程中利用医药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。多晶形物包括具有相同化合物元素组成的不同晶体填装排列。多晶形物通常具有不同的X射线衍射图形、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶形、光学和电学特性、稳定性和溶解性。诸如再结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可导致单晶形式占优势。
可使用多种技术实现非天然氨基酸多肽的医药学上可接受的盐的多晶形物和/或溶剂化物的筛选和表征，所述技术包括但不限于热分析、x射线衍射、光谱学、蒸汽吸附和显微镜学。热分析方法针对热化学降解或热物理过程(包括但不限于多晶形转变)，且所述方法用于分析各多晶形形式之间的关系、测定重量损失、发现玻璃转变温度或用于赋形剂可相容性的研究。所述方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、调制式差示扫描量热法(MDCS)、热重分析(TGA)和热重红外联用分析(TG/IR)。X射线衍射法包括但不限于单晶和粉末衍射仪和同步辐射源(synchrotronsource)。所使用的各种光谱技术包括但不限于拉曼光谱(Raman)、FTIR、UVIS和NMR(液态和固态)。各种显微镜学技术包括但不限于偏光显微镜学、利用能量色散X射线分析(EDX)的扫描电子显微镜学(SEM)、利用EDX的环境扫描电子显微镜学(在气体或水蒸气气氛中)、IR显微镜学和拉曼显微镜学。
附图说明
可通过参考以下陈述说明性实施例的实施方式和其随附图式来获得对于本发明方法和组合物的特征和优势的较好理解，其中利用本发明方法、组合物、装置和设备的原理：
图1提供本文所述的方法、组合物、策略和技术的某些方面的关系的非限制性示意图。
图2提供本文所述的含二胺的非天然氨基酸的类型的说明性非限制性实例。
图3提供本文所述的含二羰基的非天然氨基酸的类型的说明性非限制性实例。
图4提供本文所述的含酮炔的非天然氨基酸的类型的说明性非限制性实例。
图5提供用于制备本文所述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实例。
图6提供用于制备本文所述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实例。
图7提供用于制备本文所述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实例。
图8提供用于制备本文所述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实例。
图9提供利用含二羰基试剂翻译后修饰含二胺的非天然氨基酸多肽从而形成经修饰的含杂环非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实例。
图10提供利用含二羰基试剂翻译后修饰含二胺的非天然氨基酸多肽从而形成经修饰的含杂环非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实例。
图11A)提供本文所述的杂环键的形成的说明性非限制性实例。
图11B)提供本文所述的含经遮蔽二羰基的非天然氨基酸以及去保护后杂环键的形成的说明性非限制性实例。
图12提供利用含二胺试剂翻译后修饰含二羰基的非天然氨基酸多肽从而形成经修饰的含杂环非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实例。
图13提供利用含二胺试剂翻译后修饰含二羰基的非天然氨基酸多肽从而形成经修饰的含杂环非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实例。
图14提供使用本文所述的组合物、方法、技术和策略的蛋白质修饰的说明性非限制性实例。
图15提供使用本文所述的组合物、方法、技术和策略的蛋白质修饰的说明性非限制性实例。
图16提供使用本文所述的组合物、方法、技术和策略的蛋白质修饰的说明性非限制性实例。
图17提供使用本文所述的组合物、方法、技术和策略的蛋白质聚乙二醇化的说明性非限制性实例。
图18提供含PEG试剂的合成的说明性非限制性实例，所述试剂可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经杂环连接的非天然氨基酸多肽。
图19提供含PEG试剂的合成的说明性非限制性实例，所述试剂可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经杂环连接的非天然氨基酸多肽。
图20提供含双官能PEG试剂的合成的说明性非限制性实例，所述试剂可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经杂环连接的非天然氨基酸多肽。
图21提供双官能连接基的合成的说明性非限制性实例，所述连接基可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成经杂环连接的非天然氨基酸多肽。
图22提供含三官能PEG试剂的合成的说明性非限制性实例，所述试剂可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经杂环连接的非天然氨基酸多肽。
图23提供通过使用本文所述的组合物、方法、技术和策略将非天然氨基酸多肽与PEG基团连接来使蛋白质聚乙二醇化的说明性非限制性图示。
图24提供双官能连接基的用途的说明性非限制性图示，其使用本文所述的组合物、方法、技术和策略经由PEG连接基修饰和连接非天然氨基酸多肽。
图25提供双官能连接基的用途的说明性非限制性图示，其使用本文所述的组合物、方法、技术和策略经由连接基修饰和连接非天然氨基酸多肽。
图26提供三官能连接基的用途的说明性非限制性图示，其使用本文所述的组合物、方法、技术和策略经由PEG连接基修饰和连接非天然氨基酸多肽并且使所述连接基聚乙二醇化。
图27提供双官能连接基的用途的说明性非限制性图示，其使用本文所述的组合物、方法、技术和策略修饰非天然氨基酸多肽并使所述多肽与PEG基团连接。
图28提供含吡唑化合物的合成的说明性非限制性图示。
图29提供使用本文所述的组合物、方法、技术和策略合成非天然氨基酸多肽与PEG基团的说明性非限制性图示。
具体实施方式
I.引言
近来已报导了蛋白质科学中的全新技术，它提供了克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限的前景。具体来说，已将新颖组件加到原核生物大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)(例如参看L.Wang等人,(2001),Science292:498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromycescerevisia，S.cerevisiae)(例如J.Chin等人,Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，所述机器能够在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中。已使用这种方法响应琥珀密码子TAG将多种具有新颖化学、物理或生物特性的新颖氨基酸有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母的蛋白质中，所述新颖氨基酸包括光亲和标记和可光异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸。例如参看J.W.Chin等人,(2002),Journalof theAmericanChemicalSociety124:9026-9027(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin等人,(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99(71):11020-11024(以全文引用的方式并入)；和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1-11(以全文引用的方式并入)。这些研究已证实，有可能选择性且常规地引入未见于蛋白质中、对20种常见的基因编码的氨基酸中所见的所有官能团呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团。
II.综述
图1为本文所述的组合物、方法、技术和策略的非限制性实例。一方面，本文描述用于产生和使用包含至少一个非天然氨基酸或具有二羰基、二胺、酮炔、酮胺或杂环(包括含氮杂环基)的经修饰非天然氨基酸的多肽的工具(方法、组合物、技术)。二羰基包括但不限于二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯，且二胺基包括但不限于肼、脒、亚胺、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。所述非天然氨基酸可含有其它官能团，包括但不限于所需官能团。应注意，上述各种官能团并不打算暗示一个官能团的成员不能归类为另一官能团的成员。事实上，视特定情形将存在重叠。仅举例来说，水溶性聚合物与聚乙二醇衍生物在范围上重叠，然而，所述重叠并不完全且因此两个官能团在上文中都有引用。
如图1所示，一方面为使用本文所述的方法、组合物和技术选择和设计待修饰的多肽的方法。可从头设计新颖多肽，包括(仅举例来说)作为高通量筛选方法的部分(在所述情况下可设计、合成、表征和/或测试多种多肽)或建立在研究人员的兴趣的基础上。也可以根据已知或部分表征的多肽的结构来设计新颖多肽。仅举例来说，生长激素基因超家族(参看下文)已成为科学界深入研究的主题；可根据此基因超家族的一个或一个以上成员的结构来设计新颖多肽。选择取代和/或修饰哪一个(哪些)氨基酸的原理将于本文中单独描述。本文中还将描述使用何种修饰的选择，并且所述选择可用于满足实验者或终端用户的需要。所述需要可包括但不限于操控多肽的治疗功效；改进多肽的安全性特征；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学，诸如(仅举例来说)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间。此外，所述修饰包括(仅举例来说)对多肽提供其它官能团；将标签、标记或可检测信号并入多肽中；使多肽的分离特性便利；和上述修饰的任何组合。
本文还描述已经修饰成含有二胺、二羰基、酮炔、酮胺或杂环(包括含氮杂环基)或者可经修饰以含有二胺、二羰基、酮炔、酮胺或杂环(包括含氮杂环基)的非天然氨基酸。二羰基可包括但不限于二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯，且二胺可包括但不限于肼、脒、亚胺、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。此方面包括产生、纯化、表征和使用所述非天然氨基酸的方法。另一方面，本文描述将至少一个所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技术。此方面还包括产生、纯化、表征和使用所述含有至少一个所述非天然氨基酸的多肽的方法。此方面还包括产生、纯化、表征和使用寡核苷酸(包括DNA和RNA)的组合物和方法，所述寡核苷酸可用于至少部分产生含有至少一个非天然氨基酸的多肽。此方面还包括产生、纯化、表征和使用细胞的组合物和方法，所述细胞可表达可用于至少部分产生含有至少一个非天然氨基酸的多肽的所述寡核苷酸。
因此，本文提供并描述包含至少一个非天然氨基酸或具有二胺、二羰基、酮炔、酮胺或杂环(包括含氮杂环基)的经修饰非天然氨基酸的多肽。经二羰基修饰的非天然氨基酸可包括但不限于二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯，且经二胺修饰的非天然氨基酸可包括但不限于肼、脒、亚胺、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。在某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸或含有二胺、二羰基、酮炔、酮胺或杂环(包括含氮杂环基)的经修饰非天然氨基酸的多肽包括至少一个在多肽某个位置处的共翻译或翻译后修饰。在所述实施例中，经二羰基修饰的非天然氨基酸可进一步包括但不限于二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯，且经二胺修饰的非天然氨基酸可进一步包括但不限于肼、脒、亚胺、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。在一些实施例中，共翻译或翻译后修饰是经由细胞机器发生(例如，糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等)，在许多情况下，所述基于细胞机器的共翻译或翻译后修饰是在多肽上天然存在的氨基酸位点处发生，然而，在某些实施例中，基于细胞机器的共翻译或翻译后修饰是在多肽上的非天然氨基酸位点处发生。
在其它实施例中，翻译后修饰不利用细胞机器，而是利用本文所述的化学方法或其它适用于特定反应性基团的方法通过将包含第二反应性基团的分子(包括但不限于所需官能团)与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸(包括但不限于含有二羰基、二酮、酮醛、酮酸、酮酯、酮硫酯、酮炔、酮胺、二胺、肼、脒、亚胺、1,1-二胺、1,2-二胺、1,3-二胺、1,4-二胺或杂环(包括含氮杂环)官能团的非天然氨基酸)连接来提供官能团。在某些实施例中，共翻译或翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中于活体内进行。在某些实施例中，共翻译或翻译后修饰在不利用细胞机器的情况下在活体外进行。此方面还包括产生、纯化、表征和使用所述含有至少一个所述经翻译后修饰的非天然氨基酸的多肽的方法。
本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围内还包括能够与作为多肽的部分的非天然氨基酸(含有二羰基、二酮、酮醛、酮酸、酮酯、酮硫酯、酮炔、酮胺、二胺、肼、脒、亚胺、1,1-二胺、1,2-二胺、1,3-二胺、1,4-二胺或其经保护形式)反应从而产生上述翻译后修饰中的任一种的试剂。一般来说，所得经翻译后修饰的非天然氨基酸将含有至少一个杂环(包括含氮杂环)或醛醇基；所得经修饰杂环或醛醇基非天然氨基酸可经历后续的修饰反应。此方面还包括产生、纯化、表征和使用能够对所述非天然氨基酸进行任何所述翻译后修饰的所述试剂的方法。
在某些实施例中，多肽包括至少一个在活体内通过一种宿主细胞进行的共翻译或翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，多肽包括至少一个通过真核细胞在活体内进行的共翻译或翻译后修饰，其中所述共翻译或翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行。所述共翻译或翻译后修饰的实例包括但不限于糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，共翻译或翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡糖与天冬酰胺连接(包括但不限于寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形)。在另一实施例中，共翻译或翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。分泌信号序列的实例包括但不限于原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、针对细菌表达5'-优化的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸裂解酶分泌信号序列、OmpA分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括但不限于STII(原核生物)、FdGIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。在某些实施例中，蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。此方面还包括产生、纯化、表征和使用所述含有至少一个所述共翻译或翻译后修饰的多肽的方法。在其它实施例中，糖基化非天然氨基酸多肽是以非糖基化的形式产生。可通过多种方法产生糖基化非天然氨基酸的所述非糖基化形式，所述方法包括从经分离或实质上经纯化或未经纯化的糖基化非天然氨基酸多肽中以化学或酶促方式去除寡糖基团；在不使所述非天然氨基酸多肽糖基化的宿主中产生非天然氨基酸(所述宿主包括经工程改造或经突变而不使所述多肽糖基化的原核生物或真核生物)；将糖基化抑制剂引入细胞培养基中，其中所述非天然氨基酸多肽是通过通常会使所述多肽糖基化的真核生物产生；或任何所述方法的组合。本文还描述通常糖基化的非天然氨基酸多肽(通常糖基化意思是指当在使天然存在的多肽糖基化的条件下产生时将糖基化的多肽)的所述非糖基化形式。当然，通常糖基化的非天然氨基酸多肽的所述非糖基化形式可为未经纯化的形式、实质上经纯化的形式或经分离形式。
非天然氨基酸多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者十个或十个以上含有二羰基、二酮、酮醛、酮酸、酮酯、酮硫酯、酮炔、酮胺、二胺、肼、脒、亚胺、1,1-二胺、1,2-二胺、1,3-二胺、1,4-二胺、杂环(包括含氮杂环基)、醛醇基或其经保护形式的非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如可在蛋白质中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同位点处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，天然存在形式的蛋白质中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。
本文所提供和描述的方法和组合物包括多肽，其包含至少一个含有二羰基、二酮、酮醛、酮酸、酮酯、酮硫酯、酮炔、酮胺、二胺、肼、脒、亚胺、1,1-二胺、1,2-二胺、1,3-二胺、1,4-二胺、杂环(包括含氮杂环基)、醛醇基或其经保护或经遮蔽形式的非天然氨基酸。将至少一个非天然氨基酸引入多肽中可允许应用连结化学，其涉及(包括但不限于)与一个或一个以上非天然氨基酸的特异性化学反应，而不与通常存在的20种氨基酸反应。并入后，还可通过利用本文所述或适用于天然编码的氨基酸中所存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰非天然存在的氨基酸侧链。
本文所述的非天然氨基酸方法和组合物提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与包括但不限于所需官能团的其它物质的连结物。
在某些实施例中，本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、连接基和试剂(包括式I-LXVII的化合物)在适度酸性的条件(包括但不限于约pH2到约pH8)下可在水溶液中稳定。在其它实施例中，所述化合物在适度酸性的条件下可稳定至少1个月。在其它实施例中，所述化合物在适度酸性的条件下可稳定约至少2周。在其它实施例中，所述化合物在适度酸性的条件下可稳定约至少5天。
本文所述的组合物、方法、技术和策略的另一方面为研究或使用任何上述经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的方法。仅举例来说，此方面内包括治疗、诊断、基于检定、工业、化妆品、植物学、环境、能量产生、消费品和/或军事用途，其将从包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽或蛋白质的多肽获益。
III.多肽中非天然氨基酸的位置
本文所述的方法和组合物包括将一个或一个以上非天然氨基酸并入多肽中。可将一个或一个以上非天然氨基酸并入一个或一个以上不破坏多肽活性的特定位置处。这可以通过进行“保守”取代实现，包括但不限于用非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸；用非天然或天然庞大氨基酸取代庞大氨基酸；用非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸；和/或将非天然氨基酸插入活性不需要的位置中。
可使用多种生物化学和结构方法来选择多肽内供非天然氨基酸取代的所需位点。多肽链的任何位置都适用于选择以并入非天然氨基酸，并且选择可建立在合理设计的基础上或者通过随机选择以实现任何或并非特别需要的目的。所需位点的选择可基于产生具有任何所需特性或活性的非天然氨基酸多肽(其可经进一步修饰或保持未经修饰)，包括但不限于激动剂、超级激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物的结合的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂；二聚体或多聚体形成；与天然分子相比活性或特性无改变；或者操控多肽的任何物理或化学特性(诸如，溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可使用包括但不限于点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描方法的方法来鉴别多肽中为多肽生物活性所需的位置。除通过包括但不限于丙氨酸或同系物扫描诱变的方法鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然氨基酸取代的良好候选物。或者，经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然氨基酸取代的良好候选物。另一替代方法将为在多肽链上的个别位置中利用非天然氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。选择用于将非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法都适用于本文所述的方法、技术和组合物中。
也可检查多肽的含有缺失的天然存在突变体的结构和活性以确定很可能耐受非天然氨基酸的取代的蛋白质区域。在已去除可能无法耐受非天然氨基酸的取代的残基后，可使用包括但不限于相关多肽以及任何缔合的配体或结合蛋白的三维结构的方法检查所推荐的取代在各剩余位置处的影响。许多多肽的X射线结晶学和NMR结构都可从蛋白质数据库(ProteinDataBank，PDB；www.rcsb.org)得到，PDB为含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的中央数据库且可用于鉴别可经非天然氨基酸取代的氨基酸位置。此外，如果无法得到三维结构数据，那么可建立研究多肽二级结构和三级结构的模型。因此，可容易地获得可经非天然氨基酸取代的氨基酸位置的身份。
并入非天然氨基酸的例示性位点包括但不限于：不包括在潜在受体结合区域或用于与结合蛋白或配体结合的区域中的位点；可完全或部分暴露于溶剂的位点；与邻近残基具有最小或无氢键相互作用的位点；可最低限度暴露于邻近反应性残基的位点；和/或可在如通过特定多肽与其缔合受体、配体或结合蛋白的三维晶体结构所预计的高度可弯曲的区域中的位点。
多种非天然氨基酸可取代多肽中的特定位置或并入多肽中的特定位置中。举例来说，根据多肽与其缔合配体、受体和/或结合蛋白的三维晶体结构的检查来选择供并入的特定非天然氨基酸，优选保守取代。
在一个实施例中，本文所述的方法包括将非天然氨基酸并入多肽中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述多肽与包含第二反应性基团的分子(包括但不限于所需官能团)接触。在某些实施例中，第一反应性基团为羰基或二羰基部分且第二反应性基团为二胺部分，由此形成杂环键。在某些实施例中，第一反应性基团为二胺部分且第二反应性基团为羰基或二羰基部分，由此形成杂环键。
在一些情况下，将一个或一个以上非天然氨基酸取代或并入与多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响其它化学、物理、药理学和/或生物特性。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加多肽的稳定性(包括但不限于对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其适当受体、配体和/或结合蛋白的亲和力。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性(包括但不限于当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，出于增加多肽溶解性的目的，在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后，选择除并入非天然氨基酸的另一位点外的其它位点以供天然编码或非天然氨基酸取代。在一些实施例中，多肽包含另一添加、取代或缺失，其调节对缔合配体、结合蛋白和/或受体的亲和力；调节(包括但不限于增加或降低)受体二聚化；使受体二聚体稳定；调节循环半衰期；调节释放或生物可用性；利于纯化；或者改进或改变特定投药途径。类似地，非天然氨基酸多肽可包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于FLAG或多聚组氨酸)或含其它亲和性的序列(包括但不限于FLAG、多聚组氨酸、GST等)，或者连接分子(包括但不限于生物素)，所述连接分子改进检测(包括但不限于GFP)、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、尺寸减小、纯化或多肽的其它特性。
IV.作为样本的生长激素超基因家族
本文所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或家族。事实上，几乎任何多肽都可经设计或经修饰以包括至少一个本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗性蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白(apolipoprotein)、脱辅基蛋白(apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎症蛋白-1α、单核细胞炎症蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、群落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、脱落毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、任何类干扰素分子或IFN家族成员、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M(oncostatinM)、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、pleiotropin、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热性外毒素A、致热性外毒素B、致热性外毒素C、pyy、松驰素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素(somatomedin)、生长抑素(somatostatin)、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原(superantigen)、葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin)、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺肽α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾丸酮受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮(在下文中称为“所需多肽”)。
因此，出于说明性目的并且仅借助实例提供以下有关生长激素(GH)超基因家族的描述，并且不应理解为限制本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围。此外，本申请案中提及GH多肽打算使用所述通用术语作为GH超基因家族的任何成员的实例。因此，应了解本文关于GH多肽或蛋白质所述的修饰和化学同样可应用于GH超基因家族的任何成员，包括本文中特别列出的成员。
以下蛋白质包括由生长激素(GH)超基因家族的基因所编码的蛋白质(Bazan,F.,ImmunologyToday11:350-354(1990)；Bazan,J.F.Science257:410-411(1992)；Mott,H.R.和Campbell,I.D.,CurrentOpinioninStructuralBiology5:114-121(1995)；Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.,SIGNALLINGBYTHEHEMATOPOIETICCYTOKINERECEPTORS(1996))：生长激素、泌乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、抑瘤素M、纤毛神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)和心营养素-1(cardiotrophin-1)(“GH超基因家族”)。预期将来将通过基因克隆和测序来鉴别此基因家族的其它成员。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，尽管其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征使得易于鉴别基因家族的新成员且本文所述的非天然氨基酸方法和组合物同样适用。
已通过X射线衍射和NMR研究测定多种细胞因子的结构，所述细胞因子包括G-CSF(Zink等人,FEBSLett.314:435(1992)；Zink等人,Biochemistry33:8453(1994)；Hill等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5167(1993))、GM-CSF(Diederichs,K.等人Science154:1779-1782(1991)；Walter等人,J.Mol.Biol.224:1075-1085(1992))、IL-2(Bazan,J.F.和McKay,D.B.Science257:410-413(1992))、IL-4(Redfield等人,Biochemistry30:11029-11035(1991)；Powers等人,Science256:1673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人,Nature363:172-176(1993))，且尽管缺乏显著的一级序列同源性，但所述结构仍展示GH结构惊人的保守。根据建模和其它研究，认为IFN为此家族的成员(Lee等人,J.Interferon.CytokineRes.15:341(1995)；Murgolo等人,Proteins17:62(1993)；Radhakrishnan等人,Structure4:1453(1996)；Klaus等人,J.Mol.-Biol.274:661(1997))。大量其它细胞因子和生长因子(包括纤毛神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、抑瘤素M、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和粒细胞群落刺激因子(G-CSF)，以及IFN，诸如α干扰素、β干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素和γ干扰素)都属于此家族(综述于Mott和Campbell,CurrentOpinioninStructuralBiology5:114-121(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)SIGNALLINGBYTHEHEMATOPOIETICCYTOKINERECEPTORS中)。现认为所有上述细胞因子和生长因子构成一个大基因家族。
除共有相似的二级和三级结构外，此家族的成员还共有一种特性，即其必须寡聚化细胞表面受体以活化细胞内信号转导路径。一些GH家族成员(包括但不限于GH和EPO)结合单一类型的受体并且使其形成同二聚体。其它家族成员(包括但不限于IL-2、IL-4和IL-6)结合一种以上类型的受体并且使受体形成异二聚体或更高级的聚集物(Davis等人,(1993)Science260:1805-1808；Paonessa等人,1995)EMBOJ.14:1942-1951；Mott和Campbell,CurrentOpinioninStructuralBiology5:114-121(1995))。诱变研究已显示，与GH一样，这些其它细胞因子和生长因子含有多个(通常两个)受体结合位点，并且依次结合其同源受体(Mott和Campbell,CurrentOpinioninStructuralBiology5:114-121(1995)；Matthews等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9471-9476)。与GH一样，这些其它家族成员的主要受体结合位点主要出现在四个α螺旋和A-B环中。参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸在家族成员之间有所不同。与GH超基因家族成员相互作用的大部分细胞表面受体在结构上相关并且包含另一较大多基因家族。例如参看美国专利第6,608,183号，其以全文引用的方式并入本文中。
从有关GH超基因家族各个成员的突变研究得到的一般结论为：连接α螺旋的环通常倾向于与受体结合无关。具体来说，短B-C环似乎对于大部分(如果并非全部)家族成员的受体结合并不重要。出于此原因，在GH超基因家族成员中，B-C环可经如本文所述的非天然氨基酸取代。A-B环、C-D环(和GH超家族的类干扰素/IL-10成员的D-E环)也可经非天然氨基酸取代。最接近螺旋A并且远离最后一个螺旋的氨基酸也倾向于与受体结合无关并且还可为引入非天然氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然氨基酸经取代于环结构内任何位置处，包括但不限于A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7个或更多氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸经取代于A-B、B-C、C-D或D-E环的最后1、2、3、4、5、6、7个或更多氨基酸内。
GH家族的某些成员(包括但不限于EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12、p35、IL-13、IL-15和β干扰素)含有N连接和/或O连接糖。蛋白质中的糖基化位点几乎只出现在环区域中并且不出现在α螺旋束中。由于环区域通常与受体结合无关，并且由于其为糖基共价连接的位点，故其可为将非天然氨基酸取代引入蛋白质的有用位点。由于蛋白质中包含N连接和O连接糖基化位点的氨基酸表面暴露，故这些氨基酸可为非天然氨基酸取代的位点。因此，天然蛋白质可容许庞大糖基在这些位点处连接到蛋白质，并且糖基化位点倾向于远离受体结合位点。
可能将在将来发现GH基因家族的其它成员。可通过所预测蛋白质序列的计算机辅助二级和三级结构分析以及经设计以鉴别与特定标靶结合的分子的选择技术来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有四个或五个通过非螺旋氨基酸(环区域)连接的两亲螺旋。蛋白质可在其N末端含有疏水信号序列以促进细胞分泌。所述新发现的GH超基因家族成员也包括在本文所述的方法和组合物内。
V.非天然氨基酸
用于本文所述的方法和组合物中的非天然氨基酸具有以下四个特性中的至少一个：(1)非天然氨基酸侧链上的至少一个官能团具有至少一种与20种常见的基因编码的氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的化学反应性正交或者至少与存在于包括非天然氨基酸的多肽中的天然存在的氨基酸的化学反应性正交的特征和/或活性和/或反应性；(2)所引入的非天然氨基酸实质上在化学上对20种常见的基因编码的氨基酸呈惰性；(3)可将非天然氨基酸稳定地并入多肽中，优选具有与天然存在的氨基酸相当的稳定性或在典型生理条件下稳定，并且另外优选所述并入可经由活体内系统发生；以及(4)非天然氨基酸包括二羰基、二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基、酮硫酯基、酮炔基、酮胺基、二胺、醛醇基、二胺基、肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基、1,4-二胺基、杂环(包括含氮杂环基)，或者可通过与试剂优选在不破坏包括非天然氨基酸的多肽的生物特性(当然，除所述生物特性的破坏是修饰/转化的目的的情形外)的条件下反应而转化成二羰基、二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基、酮硫酯基、酮炔基、酮胺基、二胺、醛醇基、二胺基、肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基、1,4-二胺基、杂环(包括含氮杂环基)的官能团，或者优选其中所述转化可在水性条件下于介于约4与约10之间的pH值下或者介于约3与约8之间或介于约2到约9之间或介于约4与约9之间的pH值下发生，或优选其中非天然氨基酸上的反应性位点为亲电位点。可用于本文所述的组合物和方法的满足非天然氨基酸这四种特性的氨基酸的说明性非限制性实例提供于图2-4中。可将任何数量的非天然氨基酸引入多肽中。非天然氨基酸还可包括经保护或经遮蔽的二羰基、杂环(包括含氮杂环基)、酮炔、酮胺、醛醇基、二胺基，或者在使经保护基团去保护或使经遮蔽基团去遮蔽后可转化成二羰基、杂环(包括含氮杂环基)、酮炔、酮胺、醛醇基或二胺基的经保护或经遮蔽基团。
可用于本文所述的方法和组合物中的非天然氨基酸包括但不限于包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如，糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或其它聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸(包括但不限于聚醚或长链烃，包括但不限于大于约5或大于约10个碳)、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间天然存在的N键或O键经自然界中不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫酯、酰胺、杂环(包括含氮杂环)、二羰基等)置换的实例。所述氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
经由将非天然氨基酸并入多肽中而并入所述多肽中的化学部分提供所述多肽的多种优势和操纵。举例来说，独特的非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和叠氮芳基(包括但不限于叠氮苯侧链)的氨基酸)例如允许在活体内和活体外有效地光交联蛋白质。光反应性非天然氨基酸的实例包括但不限于对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过激发提供光反应性基团的临时对照使具有光反应性非天然氨基酸的多肽随意交联。在一非限制性实例中，非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学探针(包括但不限于使用核磁共振和振动光谱)的同位素标记(包括但不限于)甲基取代。
A.非天然氨基酸的结构和合成：二胺基、类二胺基、经遮蔽二胺基和经保护二胺基
具有亲核反应性基团的氨基酸允许尤其经由亲电加成反应来连接分子的各种反应。所述亲核反应性基团包括二胺基(包括肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基)、类二胺基(其具有与二胺基类似的反应性并且在结构上类似于二胺基)、经遮蔽二胺基(其可容易地转化成二胺基)或经保护二胺基(其在去保护后具有与二胺基类似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(I)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为 其中：
R8和R9独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T2为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基；
其中各可选取代基独立地选自低碳烷基、经取代低碳烷基、低碳环烷基、经取代低碳环烷基、低碳烯基、经取代低碳烯基、炔基、低碳杂烷基、经取代杂烷基、低碳杂环烷基、经取代低碳杂环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或环芳基或杂环烷基；
或-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的单环或双环环烷基或杂环烷基；
其中-A-B-J-R上至少一个胺基视情况为经保护的胺。
一方面为包含结构1或2的化合物：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
T1为键结或CH2；且T2为CH；
其中各可选取代基独立地选自低碳烷基、经取代低碳烷基、低碳环烷基、经取代低碳环烷基、低碳烯基、经取代低碳烯基、炔基、低碳杂烷基、经取代杂烷基、低碳杂环烷基、经取代低碳杂环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-含二胺部分一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环环烷基或杂环烷基；
或-B-含二胺部分基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或环芳基或杂环烷基；
其中-A-B-含二胺部分上至少一个胺基视情况为经保护胺；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
一个实施例为结构1或2的化合物，其中A为经取代或未经取代的低碳亚烷基，或未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳基。另一实施例为结构1或2的化合物，其中B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。另一实施例为结构1或2的化合物，其中B为-O(CH2)-、-NHCH2-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。另一实施例为结构1或2的化合物，其中R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苯甲氧羰基(Cbz)。根据权利要求1所述的化合物，其中R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。另一实施例为结构1或2的化合物，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。另一实施例为结构1或2的化合物，其中R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。另一实施例为结构1或2的化合物，其中R2为聚核苷酸。另一实施例为结构1或2的化合物，其中R2为核糖核酸(RNA)。其它实施例为结构1或2的化合物，其中R2为tRNA。另一实施例为结构1或2的化合物，其中tRNA特异性地识别选择密码子。另一实施例为结构1或2的化合物，其中选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。其它实施例为结构1或2的化合物，其中R2为抑制tRNA。
包括具有式(I)结构的氨基酸的以下非限制性实例：
所述非天然氨基酸也可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中和/或视情况经翻译后修饰。
在某些实施例中，式(I)化合物在温和的酸性条件下可在水溶液中稳定至少1个月。在某些实施例中，式(I)化合物在温和的酸性条件下可稳定至少2周。在某些实施例中，式(I)化合物在温和的酸性条件下可稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为约2到约8的pH值。
在式(I)化合物的某些实施例中，B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、C(R')＝NN(R')-、-N(R')CO-、C(O)-、-C(R')＝N-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、CON(R')(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(I)化合物的某些实施例中，B为-O(CH2)-、-CH＝N-、CH＝NNH-、-NHCH2-、-NHCO-、C(O)-、C(O)(CH2)-、CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在式(I)化合物的某些实施例中，R为C1-6烷基或环烷基。在式(I)化合物的某些实施例中，R为-CH3、-CH(CH3)2或环丙基。在式(I)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苯甲氧羰基(Cbz)。在式(I)化合物的某些实施例中，R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为tRNA。在式(I)化合物的某些实施例中，所述tRNA特异性地识别选择密码子。在式(I)化合物的某些实施例中，选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。
此外，具有式(I)结构的氨基酸包括具有式(II)结构的氨基酸：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
其它或额外实施例为与结构3或4对应的化合物：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R")2、-C(O)N(R")2、-OR"和-S(O)kR"，其中k为1、2或3，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基。
还包括具有式(II)结构的氨基酸的以下非限制性实例：
所述非天然氨基酸也可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中和/或视情况经翻译后修饰。
具有式(I)结构的氨基酸还可为具有式(III)结构的经保护形式：
其中，Prot为胺保护基，包括但不限于：
在一些实施例中，基团J的至少一个胺基可经保护；或在其它实施例中，两个胺基都经保护。
此外，具有式(III)结构的经保护氨基酸包括具有式(IV)结构的氨基酸：
具有式(IV)结构的经保护氨基酸的非限制性实例包括：
所述非天然氨基酸也可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中和/或视情况经翻译后修饰。
另一实施例为并有至少一个具有结构1或2的化合物的多肽。
另一实施例为多肽，其中所述多肽为与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源的蛋白质。
含二胺非天然氨基酸的其它非限制性实例展示于图2中。含二胺氨基酸的非限制性例示性合成描述于本文中且提供于图7和图8中。
B.非天然氨基酸的结构和合成：二羰基、类二羰基、经遮蔽二羰基和经保护二羰基
具有亲电反应性基团的氨基酸允许尤其经由亲核加成反应来连接分子的各种反应。所述亲电反应性基团包括二羰基(包括二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基和酮硫酯基)、类二羰基(其具有与二羰基类似的反应性并且在结构上类似于二羰基)、经遮蔽二羰基(其可容易地转化成二羰基)或经保护二羰基(其在去保护后具有与二羰基类似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(V)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为 其中
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
其中各可选取代基独立地选自低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
T2选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
T3为其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
或-A-B-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基。
此外，具有式(V)结构的氨基酸包括具有式(VI)结构的氨基酸：
其中：
M1为键结、-C(R3)(R4)-、-O-、-S-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-O-、-C(R3)(R4)-S-、-O-C(R3)(R4)-、-S-C(R3)(R4)、-C(R3)＝C(R3)-或-C(R4)＝C(R4)-；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，
或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
具有式(VI)结构的氨基酸包括具有式(VII)结构的氨基酸：
其中：
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
具有式(VII)结构的氨基酸还包括具有式(VIII)和式(IX)结构的氨基酸：
其中包括具有式(VIII)或式(IX)结构的以下非限制性氨基酸：
所述非天然氨基酸也可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中和/或视情况经翻译后修饰。
其它含二羰基的氨基酸包括具有式(X)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
M2为
其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与各个羰基的键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
具有式(X)结构的氨基酸包括具有式(XI)和式(XII)结构的氨基酸：
其中：
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
此外，具有式(XI)和式(XII)结构的氨基酸包括具有式(XIII)和式(XIV)结构的氨基酸：
还包括以下具有式(XIV)结构的氨基酸：
所述非天然氨基酸可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中并且视情况经翻译后修饰。
其它含二羰基的氨基酸包括具有式(XV)结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，并且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-C(O)R"-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R")C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
M1为键结、-C(R3)(R4)-、-O-、-S-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-O-、-C(R3)(R4)-S-、-O-C(R3)(R4)-、-S-C(R3)(R4)、-C(R3)＝C(R3)-或-C(R4)＝C(R4)-；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8。
还包括以下具有式(XV)结构的氨基酸：
所述非天然氨基酸可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中并且视情况经翻译后修饰。
具有经保护羰基的氨基酸
还包括具有至少一个经保护羰基的具有式(XVI)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
M1为键结、-C(R3)(R4)-、-O-、-S-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-O-、-C(R3)(R4)-S-、-O-C(R3)(R4)-、-S-C(R3)(R4)、-C(R3)＝C(R3)-或-C(R4)＝C(R4)-；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；且
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下基团组成的群组：O、S、NH、NR'、N-Ac和N-OMe；且X2为O-R、O-Ac、SR、S-Ac、N(R')(R')、N(R')(Ac)、N(R')(OMe)或N3。
具有式(XVI)结构的氨基酸包括具有式(XVII)、式(XVIII)和式(XIX)结构的氨基酸：
其中：
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
此外，包括具有式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)和式(XXV)结构的具有经保护羰基的氨基酸：
其中：
X1为O、S、NH、NR'、N-Ac或N-OMe；且
各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
此外，包括以下含有经保护羰基的氨基酸：
所述非天然氨基酸可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中并且视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下具有式(XXVI)结构且具有至少一个经保护羰基的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
Q为
M2为 其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与各个羰基的键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基，且
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下基团组成的群组：O、S、NH、NR'、N-Ac和N-OMe；且X2为O-R、O-Ac、SR、S-Ac、N(R')(R')、N(R')(Ac)、N(R')(OMe)或N3。
具有式(XXVI)结构的氨基酸包括具有式(XXVII)、式(XXVIII)和式(XXIX)结构的氨基酸：
其中：
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
此外，包括以下具有经保护羰基且具有式(XXX)结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，并且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R")C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
M1为键结、-C(R3)(R4)-、-O-、-S-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-O-、-C(R3)(R4)-S-、-O-C(R3)(R4)-、-S-C(R3)(R4)、-C(R3)＝C(R3)-或-C(R4)＝C(R4)-；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下基团组成的群组：O、S、NH、NR'、N-Ac和N-OMe；且X2为O-R、O-Ac、SR、S-Ac、N(R')(R')、N(R')(Ac)、N(R')(OMe)或N3；
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8。
包括以下根据式(XXX)的具有经保护羰基的氨基酸：
所述非天然氨基酸可为盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中并且视情况经翻译后修饰。
所属领域技术人员已知合成含羰基或二羰基氨基酸的方法。此外，含羰基或二羰基氨基酸的各种合成描述于美国临时专利申请案第60/638,418号中，其以全文引用的方式并入本文中。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其也以全文引用的方式并入。
含二羰基非天然氨基酸的其它非限制性实例展示于图3中。含二羰基氨基酸的非限制性例示性合成描述于本文中且提供于图5和图6中。
在一些实施例中，对包含非天然氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说，可用于连结反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其通常存在或者可经由化学或酶促消化暴露)以在温和氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.&Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域已知的方法局限于肽或蛋白质N末端处的氨基酸。,
此外，举例来说，可将具有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸以“经遮蔽”醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸具有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠以避免多肽内其它位点处的氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型的反应涉及将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠加入多肽缓冲溶液中，随后在暗处培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号。
C.非天然氨基酸的结构和合成：酮炔、类酮炔、经遮蔽酮炔和经保护酮炔基团
含有具有类二羰基反应性的反应性基团的氨基酸允许经由亲核加成反应连接分子。所述亲电反应性基团包括酮炔基、类酮炔基(其具有类似于酮炔基的反应性且在结构上类似于酮炔基)、经遮蔽酮炔基(其可容易地转化成酮炔基)或经保护酮炔基(其在去保护后具有类似于酮炔基的反应性)。所述氨基酸包括具有式(XXXI)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
具有式(XXXI)结构的氨基酸包括具有式(XXXII)和式(XXXIV)结构的氨基酸：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
含酮炔非天然氨基酸的其它非限制性实例展示于图4中。
D.非天然氨基酸的结构和合成：酮胺、类酮胺、经遮蔽酮胺和经保护酮胺基团
含有具有类二羰基反应性的反应性基团的氨基酸允许经由亲核加成反应连接分子。所述反应性基团包括酮胺基、类酮胺基(其具有类似于酮胺基的反应性且在结构上类似于酮胺基)、经遮蔽酮胺基(其可容易地转化成酮胺基)或经保护酮胺基(其在去保护后具有类似于酮胺基的反应性)。所述氨基酸包括具有式(XXXIV)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T1为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R')-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR'、-N(R')2、-N(R')(Ac)、-N(R')(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
具有式(XXXIV)结构的氨基酸包括具有式(XXXV)和式(XXXVI)结构的氨基酸：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
E.非天然氨基酸的结构和合成：含杂环氨基酸
本文所述的某些实施例为具有包含杂环基、经遮蔽杂环基(其可容易地转化成杂环基)或经保护杂环基(其可容易地去保护成为杂环基)的侧链的非天然氨基酸。所述氨基酸包括具有式(XXXVII)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
Q为视情况经取代的杂环或视情况经取代的杂芳基，其中各可选取代基独立地选自低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
所述具有式(XXXVII)结构的非天然氨基酸的形成包括但不限于(i)含二胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应或者含二胺非天然氨基酸与含酮炔试剂的反应；(ii)含二羰基非天然氨基酸与含二胺试剂的反应或者含二羰基非天然氨基酸与含酮胺试剂的反应；(iii)含酮炔非天然氨基酸与含二胺试剂的反应；或(iv)含酮胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应。
用所述反应修饰本文所述的非天然氨基酸具有任一种或全部以下优势。第一，二胺在约5到约8的pH值范围内(且在其它实施例中在约4到约10的pH值范围内；在其它实施例中在约3到约8的pH值范围内；在其它实施例中在约4到约9的pH值范围内；且在其它实施例中在约4到约9的pH值范围内；在其它实施例中在约4的pH值下；且在其它实施例中在约8的pH值下)与含二羰基化合物经历缩合以产生杂环(包括含氮杂环)键。在这些条件下，天然存在的氨基酸的侧链不具反应性。第二，所述选择性化学使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能：衍生化蛋白质现可作为指定同源产物制备。第三，实现本文所述的二胺与本文所述的含二羰基多肽的反应所需的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除反应目的是破坏所述三级结构的情形外)。第四，反应在室温下迅速发生，这允许使用将在较高温度下不稳定的许多类型的多肽或试剂。第五，反应易于在水性条件下发生，这也允许使用与非水溶液不相容(在任何程度上)的多肽和试剂。第六，即使当多肽或氨基酸与试剂的比率为化学计量、近化学计量或类化学计量时，反应也易于发生，从而不需要加入过量的试剂或多肽来获得有用量的反应产物。第七，可视反应物中二胺和二羰基部分的设计而区域选择性和/或区域特异性地产生所得杂环。最后，二胺与含二羰基分子缩合产生在生物条件下稳定的杂环(包括含氮杂环)键。
(i)含二胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应或者含二胺非天然氨基酸与含酮炔 试剂的反应
含有二胺基的非天然氨基酸允许与各种亲电基团反应以形成连结物(包括但不限于与PEG或其它水溶性聚合物的连结物)。二胺基的亲核性使其能够在温和条件下有效且选择性地与各种含有羰基或二羰基官能团或者具有类似化学反应性的其它官能团的分子在水溶液中反应以形成相应亚胺键。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。
包含杂环侧链且具有式(XXXVII)结构的所述非天然氨基酸包括具有式(XXXVIII)和式(XXXIX)结构的氨基酸：
其中：
Z1为键结、CR7R7、O、S、NR'、CR7R7-CR7R7、CR7R7-O、O-CR7R7、CR7R7-S、S-CR7R7、CR7R7-NR'、NR'-CR7R7；
Z2选自由以下各基团组成的群组：键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、-O-、-S-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R')-；
R'为H、烷基或经取代烷基；
各R5独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R6和各R7独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或任何两个相邻的R7基一起形成视情况经取代的5元到8元杂环、环烷基或芳环；其中所述可选取代基选自卤素、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤基-C1-6烷基、卤基-C1-6烷氧基、芳基、卤芳基和杂芳基；
条件是Z1加Z2向杂环结构提供不超过3个环原子。
另外，包括以下具有式(XL)、式(XLI)和式(XLII)结构的氨基酸：
其中：
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括以下具有式(XL)、式(XLI)或式(XLII)结构的氨基酸：
(ii)含二羰基非天然氨基酸与含二胺试剂或含酮胺试剂的反应
具有亲电反应性基团的非天然氨基酸允许尤其经由亲核加成反应来连接分子的各种反应。所述亲电反应性基团包括二羰基(包括二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基和酮硫酯基)、类二羰基(其具有与二羰基类似的反应性并且在结构上类似于羰基)、经遮蔽二羰基(其可容易地转化成二羰基)或经保护二羰基(其在去保护后具有与二羰基类似的反应性)。含有二羰基的非天然氨基酸允许与各种亲核基团反应以形成连结物(包括但不限于与PEG或其它水溶性聚合物的连结物)。二羰基的亲电性使其能够有效且选择性地与各种含有胺、二胺、酮胺或其它具有类似化学反应性的官能团的分子反应。
因此，本文所述的某些实施例为具有包含杂环基、经遮蔽杂环基(其可容易地转化成杂环基)或经保护二胺基(其在去保护后具有反应性以进行其它化学反应)的侧链的非天然氨基酸。其中所述杂环基是通过含二羰基非天然氨基酸与各种含有胺、二胺、酮胺或其它具有类似化学反应性的官能团的分子反应而形成。
具有式(XXXVII)结构的所述氨基酸包括具有式(XLIII)、式(XLIV)、式(XLV)、式(XLVI)、式(XLVII)和式(XLVIII)结构的氨基酸：
Z1为键结、CR5R5、CR5R5-CR5R5、CR5R5-O、O-CR5R5、S-CR5R5、NR5-CR5R5、CR5R5-S、CR5R5-NR5；
Z2选自由以下各基团组成的群组：视情况经取代的C1-C3亚烷基、视情况经取代的C1-C3亚烯基、视情况经取代的杂烷基和N；
M2为 其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与杂环基内个别位置的键结；
M3为
其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与杂环基内个别位置的键结；
M4为其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与杂环基内个别位置的键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R6选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基；
条件是Z1加Z2对杂环结构提供不超过3个环原子，或Z2加Z3对杂环结构提供不超过3个环原子；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
此外，具有式(XLIII)、式(XLIV)、式(XLV)、式(XLVI)、式(XLVII)或式(XLVIII)结构的氨基酸包括以下具有式(XLIX)、式(L)、式(LI)、式(LII)、式(LIII)和式(LIV)结构的氨基酸：
其中Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3。
此外，包括以下根据式(XXXVII)的氨基酸：
其中：
各R6独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基。
还包括通过含二羰基氨基酸与酮胺反应所形成的具有杂环侧基的非天然氨基酸。所述氨基酸包括具有式(LV)和式(LVI)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R6选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基。
此外，包括以下根据式(LV)或式(LVI)的氨基酸：
图11中提供经由含二羰基非天然氨基酸与含二胺试剂反应的含杂环非天然氨基酸的非限制性例示性合成。
(iii)含酮炔非天然氨基酸与含二胺试剂的反应
含有具有类二羰基反应性的反应性基团的非天然氨基酸允许经由亲核加成反应连接分子。所述亲电反应性基团包括酮炔基、类酮炔基(其具有类似于酮炔基的反应性且在结构上类似于羰基)、经遮蔽酮炔基(其可容易地转化成酮炔基)或经保护酮炔基(其在去保护后具有类似于酮炔基的反应性)。含有酮炔基的非天然氨基酸允许与各种基团(诸如(但不限于)二胺基)反应以与(但不限于)PEG或其它水溶性聚合物形成连结物。
因此，本文所述的某些实施例为具有包含杂环基、经遮蔽杂环基(其可容易地转化成杂环基)或经保护二胺基(其在去保护后具有反应性以进行其它化学反应)的侧链的非天然氨基酸。其中所述杂环基是通过含酮炔非天然氨基酸与各种含有胺、二胺或其它具有类似化学反应性的官能团的分子反应而形成。
具有式(XXXVII)结构的所述氨基酸包括具有式(LVII)到式(LX)结构的氨基酸：
其中：
Z1为键结、CR5R5、CR5R5-CR5R5、CR5R5-O、O-CR5R5、S-CR5R5、NR5-CR5R5、CR5R5-S、CR5R5-NR5；
Z3选自由以下各基团组成的群组：键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、-O-、-S-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R')-；
R6选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
图13中提供经由含酮炔非天然氨基酸与含二胺试剂反应的含杂环非天然氨基酸的非限制性例示性合成。
(iv)含酮胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应
含有具有类二羰基反应性的反应性基团的非天然氨基酸允许经由亲核加成反应连接分子。所述反应性基团包括酮胺基、类酮胺基(其具有类似于酮胺基的反应性且在结构上类似于酮胺基)、经遮蔽酮胺基(其可容易地转化成酮胺基)或经保护酮胺基(其在去保护后具有类似于酮胺基的反应性)。含有酮胺基的非天然氨基酸允许与各种基团(诸如(但不限于)二羰基)反应以与(但不限于)PEG或其它水溶性聚合物形成连结物。
因此，本文所述的某些实施例为具有包含杂环基、经遮蔽杂环基(其可容易地转化成杂环基)或经保护杂环基(其在去保护后具有反应性以进行其它化学反应)的侧链的非天然氨基酸。其中所述杂环基是通过含酮胺非天然氨基酸与各种含有二羰基或其它具有类似化学反应性的官能团的分子反应而形成。
所述具有式(XXXVII)结构的氨基酸包括具有式(LXII)和式(LXIII)结构的氨基酸：
其中：
R6选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基和经取代芳烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
F.非天然氨基酸的结构和合成：含烯-二酮氨基酸
具有亲电反应性基团的非天然氨基酸允许尤其经由亲核加成反应来连接分子的各种反应。所述亲电反应性基团包括二羰基(包括二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基和酮硫酯基)、类二羰基(其具有与二羰基类似的反应性并且在结构上类似于羰基)、经遮蔽二羰基(其可容易地转化成二羰基)或经保护二羰基(其在去保护后具有与二羰基类似的反应性)。含有二羰基的非天然氨基酸允许与各种亲核基团反应以形成连结物(包括但不限于与PEG或其它水溶性聚合物的连结物)。二羰基的亲电性使其能够在醛醇反应或醛醇型反应中反应以形成“基于醛醇的键”或“基于混合醛醇的键”。
因此，本文所述的某些实施例为具有包含由醛醇反应、混合醛醇反应或醛醇型反应中所涉及的二羰基产生的基团的侧链的非天然氨基酸。所述氨基酸包括具有式(LXIV)结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
T3为键结、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
此外，包括以下根据式(LV)到式(LVII)的氨基酸：
G.非天然氨基酸的细胞摄取
真核细胞对非天然氨基酸的摄取是当设计和选择(包括但不限于)用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明，这些化合物不可能渗透细胞。天然氨基酸是经由一系列基于蛋白质的转运系统吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以评定哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如参看，例如名为“ProteinArrays”的美国专利公开案第2004/198637号(其以全文引用的方式并入本文中)以及Liu,D.R.&Schultz,P.G.(1999)Progresstowardtheevolutionofanorganismwithanexpandedgeneticcode.PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性检定。尽管易于利用各种检定分析摄取，但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方法是提供生物合成路径以在活体内产生氨基酸。
通常，经由如本文所述的细胞摄取所产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括但不限于天然细胞量)但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度来产生。以此方式所产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。
H.非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成路径已存在于细胞中以供产生氨基酸和其它化合物。特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括但不限于细胞)中，而本文所述的方法和组合物提供所述方法。举例来说，在宿主细胞中通过加入新颖酶或改变现存的宿主细胞路径可产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新颖酶包括天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的WO2002/085923中的实例所提供)依赖于加入来自其它有机体的已知酶的组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。视情况加入的酶类型的实例提供于本文中。其它酶序列见于例如Genbank中。可以相同方式将人工开发的酶加入细胞中。以此方式，利用细胞机器和细胞资源产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成路径或发展现存路径中的新颖酶。举例来说，可将(包括但不限于)如Maxygen,Inc.所开发的递归重组(recursiverecombination)(可在万维网www.maxygen.com上获得)用于开发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994),RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling,Nature370(4):389-391；和Stemmer,(1994),DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91:10747-10751。类似地，视情况将Genencor开发的DesignPathTM(可在万维网genencor.com上获得)用于代谢路径工程改造，包括但不限于工程改造路径以在细胞中产生非天然氨基酸。这项技术使用新基因(包括但不限于通过功能性基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主有机体中重建现存路径。Diversa公司(可在万维网diversa.com上获得)也提供迅速筛选基因文库和基因路径(包括但不限于建立新路径)的技术以供生物合成产生非天然氨基酸。
通常，利用如本文所述的经工程改造的生物合成路径所产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括但不限于天然细胞量)但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度来产生。在活体内以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸产生。
I.其它合成方法
可使用所属领域中所述的方法或使用本文所述的技术或其组合来合成本文所述的非天然氨基酸。作为辅助，下表中提供可组合产生所需官能团的各种起始亲电试剂和亲核试剂。所提供的信息打算说明而非限制本文所述的合成技术。
表1：共价键和其前体的实例
共价键产物 亲电试剂 亲核试剂
羧酰胺 活性酯 胺/苯胺
羧酰胺 酰基叠氮 胺/苯胺
羧酰胺 酰卤 胺/苯胺
酯 酰卤 醇/酚
酯 酰基腈 醇/酚
羧酰胺 酰基腈 胺/苯胺
亚胺 醛 胺/苯胺
腙 醛或酮 肼
肟 醛或酮 羟胺
烷基胺 烷基卤 胺/苯胺
酯 烷基卤 羧酸
硫醚 烷基卤 硫醇
醚 烷基卤 醇/酚
硫醚 磺酸烷基酯 硫醇
酯 磺酸烷基酯 羧酸
醚 磺酸烷基酯 醇/酚
酯 酐 醇/酚
羧酰胺 酐 胺/苯胺
苯硫酚 芳基卤 硫醇
芳胺 芳基卤 胺
硫醚 吖啶 硫醇
硼酸酯 硼酸酯 二醇
羧酰胺 羧酸 胺/苯胺
酯 羧酸 醇
肼 酰肼 羧酸
N-酰基脲或酐 碳化二亚胺 羧酸
酯 重氮烷烃 羧酸
硫醚 环氧化物 硫醇
硫醚 卤代乙酰胺 硫醇
氨基三嗪 卤代三嗪 胺/苯胺
三嗪基醚 卤代三嗪 醇/酚
脒 酰亚胺酯 胺/苯胺
脲 异氰酸酯 胺/苯胺
氨基甲酸酯 异氰酸酯 醇/酚
硫脲 异硫代氰酸酯 胺/苯胺
硫醚 马来酰亚胺 硫醇
亚磷酸酯 氨基磷酸酯 醇
硅烷基醚 硅烷基卤 醇
烷基胺 磺酸酯 胺/苯胺
硫醚 磺酸酯 硫醇
酯 磺酸酯 羧酸
醚 磺酸酯 醇
磺酰胺 磺酰卤 胺/苯胺
磺酸酯 磺酰卤 酚/醇
一般来说，碳亲电试剂易于受包括碳亲核试剂的互补亲核试剂攻击，其中攻击性亲核试剂将电子对运送到碳亲电试剂，以便在亲核试剂与碳亲电试剂之间形成新键。
碳亲核试剂的非限制性实例包括但不限于烷基、烯基、芳基和炔基格利雅试剂(Grignard)；有机锂；有机锌；烷基、烯基、芳基和炔基锡试剂(有机锡烷)；烷基、烯基、芳基和炔基硼烷试剂(有机硼烷和有机硼酸盐)，这些碳亲核试剂具有在水或极性有机溶剂中动力学稳定的优势。碳亲核试剂的其它非限制性实例包括磷叶立德(phosphorusylid)、烯醇和烯醇化物试剂，这些碳亲核试剂具有相对易于由合成有机化学领域技术人员众所周知的前体产生的优势。当与碳亲电试剂组合使用时，碳亲核试剂在碳亲核试剂与碳亲电试剂之间产生新的碳碳键。
适于与碳亲电试剂偶合的非碳亲核试剂的非限制性实例包括但不限于伯胺和仲胺、硫醇、硫醇盐和硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、氨基脲等。当与碳亲电试剂组合使用时，这些非碳亲核试剂通常产生杂原子键(C-X-C)，其中X为杂原子，包括但不限于氧、硫或氮。
VI.具有非天然氨基酸的多肽
为方便起见，已一般性地和/或利用特定实例描述本节中所述的化合物的形式、特性和其它特征。然而，本节中所述的形式、特性和其它特征不应仅限于本节中所提供的基本描述或特定实例，而是本节中所述的形式、特性和其它特征同样适用于在式I-LXVII范围内的所有化合物，包括在本说明书、权利要求书和本文图式中所述的式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物。
本文所述的组合物和方法使至少一个非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基酸可存在于多肽上的任何位置处，包括多肽的任何末端位置或任何内部位置。非天然氨基酸相对于天然存在的同源氨基酸多肽优选不会破坏多肽的活性和/或三级结构，除非所述活性和/或三级结构的破坏是将非天然氨基酸并入多肽的目的之一。此外，在不完全引起活性和/或三级结构破坏的情况下，将非天然氨基酸并入多肽中可相对于天然存在的同源氨基酸多肽在某种程度上改变多肽的活性(例如，操控多肽的治疗功效；改进多肽的安全性特征；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间)；为多肽提供其它官能团；将标签、标记或可检测信号并入多肽中；便利多肽的分离特性；和上述改变的任何组合)和/或三级结构。所述活性和/或三级结构的改变通常为实现所述并入的目标之一，但将非天然氨基酸并入多肽中相对于天然存在的同源氨基酸多肽也可对多肽的活性和/或三级结构具有极小影响。相应地，认为非天然氨基酸多肽；包含非天然氨基酸多肽的组合物；制备所述多肽和多肽组合物的方法；纯化、分离和表征所述多肽和多肽组合物的方法；以及使用所述多肽和多肽组合物的方法都在本揭示案的范围内。另外，还可将本文所述的非天然氨基酸多肽与另一多肽(例如包括，非天然氨基酸多肽或天然存在的氨基酸多肽)接合。
本文所述的非天然氨基酸多肽可通过生物合成或非生物合成方法产生。生物合成方法意思是指利用翻译系统(细胞或无细胞)的任何方法，包括使用以下组件中的至少一种：聚核苷酸、密码子、tRNA和核糖体。非生物合成方法意思指不利用翻译系统的任何方法，此方法可进一步分成利用固态肽合成方法、固相肽合成方法的方法；利用至少一种酶的方法；和不利用至少一种酶的方法。此外，此细分方法中任一种可重叠并且许多方法可利用这些细分方法的组合。
本文所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或家族。事实上，几乎任何多肽都可包括至少一个本文所述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源。在相关或其它实施例中，非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
可另外如本揭示案其它地方所述对非天然氨基酸多肽进一步修饰或者可在不经进一步修饰的情况下使用非天然氨基酸多肽。将非天然氨基酸并入多肽中可出于多种目的进行，包括但不限于定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点的可接近性；靶向部分(包括但不限于用于多肽阵列)等。包括非天然氨基酸的多肽可具有增强的或者甚至全新的催化或生物物理特性。仅举例来说，可通过将非天然氨基酸包涵入蛋白质内来改变以下特性：毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括但不限于血清半衰期)、与其它分子反应(包括但不限于共价或非共价)的能力等。具有包括至少一个非天然氨基酸的多肽的组合物可用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括但不限于抗体)以及包括但不限于蛋白质结构和功能研究的研究。例如参看Dougherty,(2000)UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction,CurrentOpinioninChemicalBiology.4:645-652。
此外，多肽中非天然氨基酸组分的侧链可为多肽提供多种其它官能团；仅举例来说(但不作为限制)，多肽中非天然氨基酸部分的侧链可包括以下所需官能团中的任一个。
一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多)非天然氨基酸的多肽。所述非天然氨基酸可相同或不同。此外，可在多肽中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同位点处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同或者相同的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括多肽中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的多肽。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，非天然氨基酸可相同或不同(仅举例来说，多肽可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或者可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定多肽来说，非天然氨基酸可相同或不同，或相同类别的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。
尽管可经由固相肽合成方法(仅举例来说，在固体树脂上)、溶液相肽合成方法和/或在无酶辅助的情况下经化学方法合成本文所述的非天然氨基酸多肽的实施例，但本文所述的非天然氨基酸多肽的其它实施例允许经由细胞膜、细胞提取物或溶解产物系统或者经由活体内系统(仅举例来说，使用原核或真核细胞的细胞机器)来合成。在其它或额外实施例中，本文所述的非天然氨基酸多肽的重要特征之一在于，其可利用核糖体予以合成。在本文所述的非天然氨基酸多肽的其它或额外实施例中，可通过包括但不限于固体树脂的组合、在无酶辅助的情况下、经由核糖体辅助和/或经由活体内系统的方法组合来合成非天然氨基酸多肽。
经由核糖体和/或活体内系统合成非天然氨基酸多肽具有与在固体树脂或无酶辅助的情况下所合成的非天然氨基酸多肽截然不同的优势和特征。这些优势或特征包括不同的杂质分布：利用核糖体的系统和/或活体内系统将具有源于所用生物系统的杂质，包括宿主细胞蛋白质、膜部分和脂质；而来自利用固体树脂和/或无酶辅助的系统的杂质分布可包括有机溶剂、保护基、树脂材料、偶合试剂和其它用于合成程序中的化学物。此外，经由使用核糖体和/或活体内系统所合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映细胞所利用的原料的同位素模式；另一方面，在固体树脂上和/或无酶辅助的情况下所合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映合成中所利用的氨基酸的同位素模式。此外，经由使用核糖体和/或活体内系统所合成的非天然氨基酸可实质上不含氨基酸的D异构体，和/或能够容易地将内部半胱氨酸氨基酸并入多肽结构中，和/或可极少提供内部氨基酸缺失多肽。另一方面，经由固体树脂和/或不使用酶的情况下所合成的非天然氨基酸多肽可具有较高的氨基酸D异构体含量和/或较低的内部半胱氨酸氨基酸含量和/或较高的内部氨基酸缺失多肽百分比。此外，所属领域技术人员将能够区分使用核糖体和/或活体内系统所合成的非天然氨基酸多肽与通过固体树脂和/或不使用酶的情况下所合成的非天然氨基酸多肽。
VII.包含核酸和寡核苷酸的组合物和方法
A.用于本文中的通用重组核酸方法
在本文所述方法和组合物的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆和通常改变编码所关注的多肽(包括例如GH多肽)的核酸。所述实施例用于(包括但不限于)蛋白质表达或产生源于多肽的变体、衍生物、表达盒或其它序列的过程中。在一些实施例中，将编码多肽的序列可操作地连接到异源启动子。
本文还描述可产生非天然氨基酸多肽的细胞，其中多肽上的至少一个非天然氨基酸包含具有二羰基、二胺、杂环(包括含氮杂环)键或基于醛醇的键的侧链。所述细胞使用本文所述的方法或其变体产生所述非天然氨基酸多肽，而以生物合成方法产生至少一个非天然氨基酸。可使用本文所述的技术、方法、组合物和策略或其变体来产生生物合成至少一个非天然氨基酸的细胞。
可基于母体多肽的氨基酸序列，且随后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或去除(即，缺失或取代)来合成编码包含非天然氨基酸的多肽的核苷酸序列。可根据常规方法通过定点诱变便利地修饰核苷酸序列。或者，核苷酸序列可由化学合成来制备，所述化学合成包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列来设计)且优选选择在将产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如参看Barany等人,Proc.Natl.Acad,Sci.88:189-193(1991)；U.S.6,521,427，其以引用方式并入本文中。
本文所述的非天然氨基酸方法和组合物利用重组遗传学领域的常规技术。揭示本文所述的非天然氨基酸方法和组合物的一般使用方法的基础文章包括Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3版，2001)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990)；和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人,编,1994)。
描述分子生物技术的常见文章包括Berger和KimmelGuidetoMolecularCloning Techniques.MethodsinEnzymology第152卷AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(Berger)；Sambrook等人,MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)第1-3卷.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook")和Current ProtocolsinMolecularBiology.F.M.Ausubel等人,编,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.与JohnWiley&Sons,Inc.的合资公司,(1999增刊)("Ausubel")。这些文章描述诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关课题，所述相关课题涉及(包括但不限于)包括用于产生包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对的聚核苷酸的产生。
将多类诱变方法用于本文所述的非天然氨基酸方法和组合物中以用于各种目的，包括但不限于产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的聚核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码所关注蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括但不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用缺口双螺旋DNA的诱变等或其任何组合。其它适当方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双股断裂修复等。(包括但不限于)涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本文所述的非天然氨基酸方法和组合物中。在一个实施例中，可通过天然存在分子或者改变或突变的天然存在分子的已知信息(包括但不限于序列比较、物理特性、晶体结构等)指导诱变。
本文中所见的文章和实例描述这些和其它相关程序。其它信息见于文中所引用的以下公开案和参考文献：Ling等人,ApproachestoDNAmutagenesis:anoverview,Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人,Oligonucleotide-directedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod,MethodsMol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,Invitromutagenesis,Ann.Rev-Genet.19:423-462(1985)；Botstein&Shortle,Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis,Science229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis,NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J.编,SpringerVerlag,Berlin))(1987)；Kunkel,Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985)；Kunkel等人,Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection,MethodsinEnzymol.154,367-382(1987)；Bass等人,MutantTrprepressorswithnewDNA-bindingspecificities,Science242:240-245(1988)；MethodsinEnzymol.100:468-500(1983)；Methodsin Enzymol.154:329-350(1987)；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directedmutagenesisusingM13-derivedvectors:anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment,NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982)；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors,Methods inEnzymol.100:468-500(1983)；Zoller&Smith,Oligonucleotide-directedmutagenesis:asimplemethodusingtwooligonucleotideprimersandasingle-strandedDNAtemplate,MethodsinEnzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人,Theuseofphosphorothioate-modifiedDNAinrestrictionenzymereactionstopreparenickedDNA,Nucl. AcidsRes.13:8749-8764(1985)；Taylor等人,Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphosphorothioate-modifiedDNA,Nucl.AcidsRes.13:8765-8785(1985)；Nakamaye&Eckstein,InhibitionofrestrictionendonucleaseNciIcleavagebyphosphorothioategroupsanditsapplicationtooligonucleotide-directedmutagenesis,Nucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986)；Sayers等人,5'-3'Exonucleasesinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis,Nucl. AcidsRes.16:791-802(1988)；Sayers等人,Strandspecificcleavageofphosphorothioate-containingDNAbyreactionwithrestrictionendonucleasesinthepresenceofethidiumbromide,(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814；Kramer等人,ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedmutationconstruction,Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984)；Kramer&FritzOligonucleotide-directedconstructionofmutationsviagappedduplexDNA,MethodsinEnzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人,ImprovedenzymaticinvitroreactionsinthegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedconstructionofmutations,Nucl.AcidsRes.16:7207(1988)；Fritz等人,Oligonucleotide-directedconstructionofmutations:agappedduplexDNAprocedurewithoutenzymaticreactionsinvitro,Nucl.AcidsRes.16:6987-6999(1988)；Kramer等人,PointMismatchRepair,Cell38:879-887(1984)；Carter等人,Improvedoligonucleotidesite-directedmutagenesisusingM13vectors,Nucl.AcidsRes.13:4431-4443(1985)；Carter,Improvedoligonucleotide-directedmutagenesisusingM13vectors,MethodsinEnzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh&Henlkoff,Useofoligonucleotidestogeneratelargedeletions,Nucl.AcidsRes.14:5115(1986)；Wells等人,Importanceofhydrogen-bondformationinstabilizingthetransitionstateofsubtilisin,Phil.Trans.R.Soc.Loud.A317:415-423(1986)；Nambiar等人,TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein,Science223:.1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana,Totalsynthesisandexpressionofageneforthealpha-subunitofbovinerodoutersegmentguaninenucleotide-bindingprotein(transducin),Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988)；Wells等人,Cassettemutagenesis:anefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites,Gene34:315-323(1985)；Grundstrom等人,Oligonucleotide-directedmutagenesisbymicroscale'shot-gun'genesynthesis,Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directeddouble-strandbreakrepairinplasmidsofEscherichiacoli:amethodforsite-specificmutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:7177-7181(1986)；Arnold,Proteinengineeringforunusualenvironments,CurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993)；Sieber,等人,NatureBiotechnology,19:456-460(2001).W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994)；和I.A.Lorimer,I.Pastan,NucleicAcidsRes.23,3067-8(1995)。关于众多所述方法的其它细节可见于MethodsinEnzymology第154卷，其也描述对于各种诱变方法引起的故障检修问题的有用控制。
本文所述的方法和组合物也包括使用经由正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和有机体。宿主细胞经与本文所述的多肽对应的聚核苷酸或包括与本文所述的多肽对应的聚核苷酸的构筑体(包括但不限于与本文所述的多肽对应的载体，其可为例如克隆载体或表达载体)进行基因工程改造(包括但不限于转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区域与在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件可操作地连接。载体可为例如质粒、科斯质粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸聚核苷酸或连结聚核苷酸的形式。可通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道穿透(Klein等人,Nature327.70,70-73(1987))等。
可在经调节适用于诸如筛选步骤、活化启动子或选择转化株的活动的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。这些细胞可视情况培养入转基因有机体中。用于(包括但不限于)细胞分离和培养(例如用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版,Wiley-Liss,NewYork及其中所引用的参考文献；Payne等人(1992)PlantCellandTissueCulturein LiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)以及Atlas和Parks(编)TheHandbookof MicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。
可使用将靶核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本文所述的方法和组合物中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和经病毒载体(在本文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有与本文所述的多肽对应的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外，可购得多个试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看都来自PharmaciaBiotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；和来自Qiagen的QIAprepTM)。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒，其用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括但不限于穿梭载体)和用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参看Gillam&Smith,Gene8:81(1979)；Roberts等人,Nature,328:731(1987)；Schneider,E.等人,ProteinExpr.Purif.6(1)10-14(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。例如，ATCC(例如由ATCC出版的TheATCCCatalogueofbacteriaandbacteriophage(1992)Gherna等人(编))提供可用于克隆的细菌和噬菌体的目录。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks,NY。另外，基本上任何核酸(和几乎任何标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX，mcrc.com)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGenInc.(Chicago,IL，可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和许多其它来源。
B.选择密码子
本文所述的方法和组合物内所涵盖的选择密码子扩展蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括但不限于独特的三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，其包括但不限于琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。可引入所需基因或聚核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，其包括但不限于在编码至少一部分所关注多肽的单一聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为用于在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸的终止密码子的选择密码子。举例来说，产生识别终止密码子(包括但不限于UAG)的O-tRNA，且通过具有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。此O-tRNA并不由天然存在的宿主的氨酰基tRNA合成酶所识别。常规定点诱变可用于在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括但不限于UAG)。例如参看Sayers,J.R.等人,(1988),5',3'Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis.NucleicAcidsRes,16(3):791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
也可用稀有密码子编码非天然氨基酸。举例来说，当降低活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度时，已证实稀有精氨酸密码子AGG对于用经丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala有效。例如参看Ma等人,Biochemistry.32:7939(1993)。在此情况下，合成tRNA与作为大肠杆菌中的次要物质存在的天然存在tRNAArg竞争。一些有机体不使用所有三联体密码子。已利用藤黄微球菌(Micrococcusluteus)中的未指定密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参看Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组分以在活体内使用这些稀有密码子。
可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下在活体内进行非天然氨基酸的并入。举例来说，由于对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括但不限于琥珀抑制tRNA)与真核释放因子(包括但不限于eRF)(其与终止密码子结合且启动核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节抑制效率。
选择密码子还包含延长密码子，其包括但不限于四个或四个以上碱基的密码子，诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本文所述的方法和组合物的特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在突变O-tRNA(包括但不限于)具有反密码子环(例如，具有至少8-10个核苷酸的反密码子环)的特定移码抑制tRNA)的情况下，四个或四个以上的碱基密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。由于存在256种可能的四碱基密码子，故可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多种非天然氨基酸。参看Anderson等人,(2002)ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize,ChemistryandBiology.9:237-244；Magliery,(2001)ExpandingtheGeneticCode:SelectionofEfficientSuppressorsofFour-baseCodonsandIdentificationof"Shifty"Four-baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli.J.Mol.Biol.307:755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人,(1993)Biochemistry,32:7939-7945；和Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:34-40。CGGG和AGGU用于在活体外用两种化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生物素蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194-12195。在活体内研究中，Moore等人检查具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％至26％的效率解码，其中在0或-1框架中几乎无解码。参看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195-205。在一个实施例中，可将以稀有密码子或无义密码子为基础的延长密码子用于本文所述的方法和组合物中，其可降低在其它不需位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现存的遗传代码。一个额外碱基对将三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真度有效地酶促并入DNA中以及在合成新生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如Hirao等人,(2002)Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanaloguesintoprotein,NatureBiotechnology,20:177-182，且也参看Wu,Y.等人(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。
对于活体内使用来说，非天然核苷可透过膜且经磷酸化以形成相应三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶破坏。Benner等人的先前努力利用不同于标准Watson-Crick对中的氢键模式，其最值得注意的实例为iso-C:iso-G对。例如参看Switzer等人,(1989)J.Am.Chem.Soc,111:8322-8322；和Piccirilli等人,(1990)Nature,343:33-37；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602-608。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水填充相互作用可替代氢键来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602-608；和Guckian及Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36(24):2825-2828。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成和研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-11586；以及Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:3274-3278。可通过KF以对于生物功能足够的效率和选择性合成3MN:3MN自身对。例如参看Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803-8804。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身对。此外，可复制7AI自身对。例如参看Tae等人,(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439-7440。也已研发新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定对。参看Meggers等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714-10715。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本文所述的非天然氨基酸方法可利用此特性自其产生正交tRNA。
翻译旁路系统(translationalbypassingsystem)也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跃过序列的线索且继续插入下游的翻译的结构。
在某些实施例中，在本文所述的方法和/或组合物中的所关注蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域技术人员众所周知且在本文中在“诱变和其它分子生物学技术”下描述的方法诱变编码所关注蛋白质或多肽的基因以包括例如一个或一个以上用于并入非天然氨基酸的选择密码子。举例来说，使所关注蛋白质的核酸诱变以包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本文所述的方法和组合物包括例如包含至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变体(包括但不限于突变体)形式。类似地，本文所述的方法和组合物也包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码或允许活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码所关注的多肽(仅举例来说，包括GH多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域中众所周知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，诸如在美国专利第6,608,183号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的那些方法以及标准诱变技术。可将使用所述半胱氨酸引入和利用技术与本文所述的非天然氨基酸引入和利用技术组合使用。
VIII.活体内产生包含非天然氨基酸的多肽
为方便起见，已一般性地和/或利用特定实例描述本节中所述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生。然而，本节中所述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生不应仅限于本节中所提供的基本描述或特定实例，而是本节中所述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生同样适用于在式I-LXVII范围内的所有化合物，包括在本说明书、权利要求书和本文图式中所述的式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物。
可使用经修饰tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本文所述的多肽以添加或取代天然存在的系统中不编码的氨基酸。
使用天然存在的系统中不编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法例如描述于名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号以及名为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的美国专利第7,083,970号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于对于翻译系统为内源性的合成酶和tRNA起作用(且因此有时称为“正交”)的翻译机器。在一个实施例中，翻译系统包含编码多肽的聚核苷酸；聚核苷酸可为由相应DNA转录的mRNA，或者mRNA可来自RNA病毒载体；聚核苷酸另外包含与非天然氨基酸的预先设计的并入位点对应的选择密码子。翻译系统另外包含针对且也在适当时包含非天然氨基酸的tRNA，其中tRNA对上述选择密码子具特异性或特异性识别上述选择密码子；在其它实施例中，非天然氨基酸经氨酰基化。非天然氨基酸包括具有本文所述的式I-LXVII中任一式的结构的非天然氨基酸。在其它或额外实施例中，翻译系统包含对tRNA具特异性的氨酰基合成酶，且在其它实施例中，翻译系统包含正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。在其它或额外实施例中，翻译系统包含下述中至少一者：包含上述聚核苷酸(仅举例来说，DNA形式)的质粒、包含上述聚核苷酸(仅举例来说，DNA形式)的基因组DNA或其中已整合有上述聚核苷酸(在其它实施例中，整合为稳定整合)的基因组DNA。在翻译系统的其它或额外实施例中，选择密码子选自由以下密码子组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。在翻译系统的其它或额外实施例中，tRNA为抑制tRNA。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸多肽是由核糖体合成。
在其它或额外实施例中，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先使翻译系统中具有至少一个非天然氨基酸的O-tRNA氨酰基化，并且O-tRNA识别至少一个不被所述系统中的其它tRNA所识别的选择密码子。因此，翻译系统响应所编码的选择密码子将非天然氨基酸插入系统中所产生的多肽中，从而将氨基酸“取代”入所编码多肽的某一位置中。
所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且其通常适用于本文所述的方法中以产生本文所述的非天然氨基酸多肽。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶描述于Wang,L等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(1):56-61(2003)和Zhang,Z.等人,Biochem.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由聚核苷酸序列编码并且包括名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号和名为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-arninoacyltRNAsynthetasepairs”的美国专利第7,083,970号(各自以全文引用的方式并入本文)中所揭示的氨基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号以及名为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的美国专利第7,083,970号中，所述专利以全文引用的方式并入本文。此外，Mehl等人J.Am.Chem.Soc.2003；125:935-939和Santoro等人NatureBiotechnology2002年10月；20:1044-1048(以全文引用的方式并入本文中)论述用于将对氨基苯丙氨酸并入多肽中的筛选方法以及氨酰基tRNA合成酶和tRNA分子。
适用于本文中所述的方法中的例示性O-tRNA序列包括但不限于如名为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-arninoacyltRNAsynthetasepairs”的美国专利第7,083,970号中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:1-3，所述专利以引用的方式并入本文中。对特定非天然氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例描述于名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号中，其以全文引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氨基酸与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人,Science301:964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但一般需要选择很少或从未用于表达O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的细胞中的密码子。仅举例来说，例示性密码子包括无义密码子，诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基的密码子；和很少使用或未经使用的其它天然三碱基密码子。
可使用所属领域中已知的诱变方法(包括但不限于位点特异性诱变、盒式诱变、限制性选择性诱变等)将特定的选择性密码子引入聚核苷酸编码序列的适当位置中。
用于产生可用于并入非天然氨基酸的蛋白质合成机器组分(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang,L.等人,Science292:498-500(2001)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)；Zhang,Z等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然氨基酸的方法和组合物描述于名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号中，其以全文引用的方式并入本文中。用于选择有机体活体内翻译系统中使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于名为“Invivoincorporationofunnaturalaminoacids”的美国专利第7,045,337号和名为“MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs”的美国专利第7,083,970号中，且所述专利以全文引用的方式并入本文中。此外，名为“SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins”的PCT公开案第WO04/035743号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。名为“ExpandingtheEukaryoticGeneticCode”的PCT公开案第WO04/094593号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
产生至少一种重组正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)由第一有机体产生来源于至少一种氨酰基tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS文库，所述第一有机体包括但不限于原核有机体(仅举例来说，詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热细菌等)或真核有机体；(b)在RS(视情况突变RS)文库中选择(和/或筛选)在存在非天然氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和/或(c)在所述集合中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括但不限于突变RS)，从而提供所述至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然氨基酸的O-tRNA氨酰基化。
在一个实施例中，RS为无活性RS。可通过使活性RS突变产生无活性RS。仅举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或更多个氨基酸突变成不同氨基酸(包括但不限于丙氨酸)来产生无活性RS。
可使用所属领域已知的各种技术产生突变RS文库，所述技术包括但不限于基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。仅举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计和本文所述或所属领域已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)文库中选择活性成员(和/或筛选)(包括但不限于在存在非天然氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化者)包括但不限于：将阳性选择或筛选标记(包括但不限于抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记中的所述至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS的集合的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛选剂浓度。
一方面，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。其它选择标记包括但不限于新霉素(neomycin)抗性基因、灭瘟素(blasticidin)抗性基因、潮霉素(hygromycin)抗性基因或所属领域中众所周知且描述的任何其它可用的抗性基因。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且选择密码子为β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记(包括但不限于细胞表面标记)。
在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛选活性RS(视情况突变)(包括但不限于在不存在非天然氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS)包括但不限于：将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于抗生素抗性基因，其包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在未补充非天然氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有所述至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。仅举例来说，CAT鉴别方案在测定适当O-RS重组体中视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然氨基酸的情况下于含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此认为仅在含有非天然氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一与第二有机体不同。因此，第一和/或第二有机体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记。
在另一个实施例中，在集合中筛选或选择(包括但不限于阴性选择)活性(视情况突变)RS包括但不限于：自阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛选标记和活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括但不限于核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在补充有非天然氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包括所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且第一与第二有机体不同(包括但不限于各有机体视情况为(包括但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严格度的变化。
在另一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包括但不限于)至少约两次。一方面，可通过诱变(包括但不限于随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
上述方法中选择/筛选步骤(包括但不限于阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛选严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是由荧光活化细胞分选法(FACS)检测或其中报告基因是由发光检测。视情况，报告基因是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等且根据涉及非天然氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括但不限于：(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA(包括但不限于抑制tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括但不限于阴性选择)或筛选在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供tRNA(视情况突变)的集合；以及(c)在所述tRNA(视情况突变)集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况从第二有机体引入第一有机体中。在各种实施例中，第一与第二有机体相同或不同且视情况选自(包括但不限于)原核生物(包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然氨基酸视情况氨酰基化，其中非天然氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。视情况将非天然氨基酸加到至少第一或第二有机体的生长培养基中，其中所述非天然氨基酸能够达到适当的细胞内浓度以允许并入非天然氨基酸多肽中。
一方面，在所述文库中选择(包括但不限于阴性选择)或筛选由氨酰基tRNA合成酶氨酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二有机体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(staticagent)的基因或有机体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA的集合。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在本文所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在另一个实施例中，在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA的集合引入来自第二有机体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括但不限于β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或有机体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；和鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括但不限于抗生素)的情况下生长的存活或筛选细胞，从而提供具有所述至少一种重组tRNA的细胞的集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化且响应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括但不限于：(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA的集合；(c)在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三有机体产生来源于至少一种氨酰基tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在突变RS文库中选择或筛选在存在非天然氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和(f)在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(视情况突变)RS，从而提供所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。本文所述的范围和方法内包括由本文所述的方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一与第三有机体相同(其包括但不限于詹氏甲烷球菌)的情形。
在本文所述的方法中也包括选择用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括但不限于：将标记基因、tRNA和从第一有机体分离或获得的氨酰基tRNA合成酶(RS)引入来自第二有机体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；和选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长，其中存活或筛选细胞包含用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检定。可改变选择剂或筛选剂的浓度。
本文所述的有机体包含多种有机体和多种组合。在一个实施例中，有机体视情况为原核有机体，其包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，有机体为真核有机体，其包括但不限于植物(包括但不限于复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括但不限于酵母等)、动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。
A.非真核生物和真核生物中的表达
本节中所揭示的技术可应用于在非真核生物和真核生物中表达本文所述的非天然氨基酸多肽。
为获得克隆聚核苷酸的高水平表达，通常将编码所需多肽的聚核苷酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果就编码蛋白质的核酸来说)供翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。适当的细菌启动子例如描述于Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表达多肽的细菌表达系统可在(包括但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillussp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)中获得(Palva等人,Gene22:229-235(1983)；Mosbach等人,Nature302:543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在市面上有售。在将正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(本文别处所述)用于表达多肽的情况中，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力加以选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括但不限于短小芽孢杆菌(B.brevis)或枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌或荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
如本文所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。一方面，组合物视情况包括但不限于至少约10微克、至少约50微克、至少约75微克、至少约100微克、至少约200微克、至少约250微克、至少约500微克、至少约1毫克、至少约10毫克、至少约100毫克、至少约1克或更多包含非天然氨基酸的多肽，或可通过活体内多肽制备方法所实现的量(关于重组蛋白质制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，多肽视情况以于(包括但不限于)细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于体积在任何地方都为约1nl到约100L或更多)中的(包括但不限于)每升至少约10微克多肽、每升至少约50微克多肽、每升至少约75微克多肽、每升至少约100微克多肽、每升至少约200微克多肽、每升至少约250微克多肽、每升至少约500微克多肽、每升至少约1毫克多肽或每升至少约10毫克多肽或更高的浓度存在于组合物中。在包括至少一个非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包括但不限于大于用其它方法(包括但不限于活体外翻译)通常可能获得的量)蛋白质是本文所述的方法、技术和组合物的特征。
如本文所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。举例来说，可以于细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中的(包括但不限于)至少约10微克/升、至少约50微克/升、至少约75微克/升、至少约100微克/升、至少约200微克/升、至少约250微克/升或至少约500微克/升、至少约1毫克/升、至少约2毫克/升、至少约3毫克/升、至少约4毫克/升、至少约5毫克/升、至少约6毫克/升、至少约7毫克/升、至少约8毫克/升、至少约9毫克/升、至少约10毫克/升、至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900毫克/升、约1克/升、约5克/升、约10克/升或更大的蛋白质浓度产生包含非天然氨基酸的多肽。
1.表达系统、培养和分离
本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的表达系统、培养和分离。非天然氨基酸多肽可在任何数目的适当表达系统(包括但不限于酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于本文中。
酵母如本文中所用，术语“酵母”包括能够表达编码非天然氨基酸多肽的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成，即Schizosaccharomycoideae(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如，毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属(Candida))。
在某些实施例中，将毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种用于本文所述的方法、技术和组合物中，所述物种包括但不限于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
选择用于表达非天然氨基酸多肽的适合酵母是在所属领域技术人员的技术范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包括但不限于显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的酵母宿主。酵母通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加州伯克利)(YeastGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。所述术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与欲以相关特性(诸如存在编码非天然氨基酸多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指的后代中。
已研发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以用于转化入许多酵母宿主中。举例来说，已研发用于以下各有机体的表达载体：酿酒酵母(Sikorski等人,GENETICS(1998)122:19；Ito等人,J.BACTERIOL.(1983)153:163；Hinnen等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75:1929)；白色念珠菌(Kurtz等人,MOL.CELL.BIOL.(1986)6:142)；麦芽糖假丝酵母(Kunze等人,J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141)；汉森酵母(Gleeson等人,J.GEN.MICROBIOL.(1986)132:3459；Roggenkamp等人,MOL.GEN.GENET.(1986)202:302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人,J.BACTERIOL.(1984)158:1165)；乳酸克鲁维酵母(DeLouvencourt等人,J.BACTERIOL.(1983)154:737；VandenBerg等人,BIO/TECHNOLOGY(1990)8:135)；谷勒氏酵母(Kunze等人,J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人,MOL.CELL.BIOL.(1985)5:3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach等人,NATURE(1982)300:706)和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人,BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112:284-89；Tilburn等人,GENE(1983)26:205-221；和Yelton等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81:1470-74)；黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes,EMBOJ.(1981)4:475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EP0244234)；和诸如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO91/00357)的丝状真菌，其中各文献以全文引用的方式并入本文中。
用于酵母载体的控制序列包括但不限于来自诸如以下基因的启动子区域：醇脱氢酶(ADH)(EP0284044)；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供有用的启动子序列(Miyanohara等人,PROCNATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它适合启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,J.BIOL.CHEM.(1980)255:(4):12073-12080)和其它糖解酶(诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人,BIOCHEMISTRY(1978)17(23):4900-4907；Hess等人,J.ADV.ENZYMEREG.(1969)7:149-167))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱发酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP0073657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以全文引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列与糖解酶基因(诸如GAP或PyK)的转录活化区组成的启动子。参看EP0164556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合且起始转录的能力的非酵母来源的天然存在的启动子。
可构成酵母表达载体的部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人,J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适当选择基因为酵母质粒中所存在的trp1基因。参看Tschumper等人,GENE(1980)10:157；Kingsman等人,GENE(1979)7:141。trp1基因对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)是由带有Leu2基因的已知质粒补充。
将外源DNA引入酵母宿主中的方法包括但不限于转化原生质球状体或转化经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和VanSolingen等人,J.BACT.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如SAMBROOK等人,MOLECULARCLONING:ALAB.MANUAL(2001)中通常所述使用将DNA引入细胞中的其它方法，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。随后可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法描述于美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO99/07862；WO98/37208；和WO98/26080；欧洲专利申请案EP0946736；EP0732403；EP0480480；WO90/10277；EP0460071；EP0340986；EP0329203；EP0324274；和EP0164556中。也参看Gellissen等人,AntonieVanLeeuwenhoek(1992)62(1-2):79-93；Romanos等人,Yeast(1992)8(6):423-488；Goeddel,MethodsinEnzymology(1990)185:3-7，各自以全文引用的方式并入本文中。
在使用标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可用于解释特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。仅举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充，而甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人,J.ProteinChem.(1990)9:95；和Fieschko等人,Biotech.Bioeng.(1987)29:1113，各自以全文引用的方式并入本文中。
然而，这些发酵方法可具有与所用酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增阶段期间，可将限制生长的养分(通常为碳)加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，各自以全文引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与欲以相关特性(诸如存在编码非天然氨基酸多肽的核苷酸序列)表征的母体足够类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指的后代中。
所属领域技术人员众所周知用于表达所需多肽的合适昆虫细胞的选择。若干种昆虫物种在所属领域中得以充分描述且在市面上有售，其包括但不限于埃及伊蚊(Aedesaegypti)、桑蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适宿主可包括但不限于显示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的那些宿主。昆虫通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加州伯克利)(InsectGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。
通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括：转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；野生型杆状病毒，其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(此允许异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术且可使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装重组病毒并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。说明性技术描述于SUMMERSANDSMITH,TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN第1555期(1987)中，其以引用的方式并入本文中。还参看RICHARDSON,39METHODSINMOLECULARBIOLOGY:BACULOVIRUSEXPRESSIONPROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE,THEBACULOVIRUSSYSTEM:ALABORATORYGUIDE(1992)；和O'REILLY等人,BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL(1992)。
使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质描述于以下参考文献中，并且所述技术可经修改以制备本文所述的非天然氨基酸多肽。例如参看，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO02/06305；WO01/90390；WO01/27301；WO01/05956；WO00/55345；WO00/20032；WO99/51721；WO99/45130；WO99/31257；WO99/10515；WO99/09193；WO97/26332；WO96/29400；WO96/25496；WO96/06161；WO95/20672；WO93/03173；WO92/16619；WO92/02628；WO92/01801；WO90/14428；WO90/10078；WO90/02566；WO90/02186；WO90/01556；WO89/01038；WO89/01037；WO88/07082，各自以全文引用的方式并入本文中。
可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体包括但不限于从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参看Reilly等人,BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构筑体(intermediatetransplacementconstruct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(诸如细菌)中的复制子(诸如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此允许其保持在供克隆和扩增用的合适宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人,ANN.REV.MICROBIOL(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核抗氨比西林(ampicillin)(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域技术人员已知的许多其它载体进行设计，其包括例如pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由ATG变为ATT，且其将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参看Luckow和Summers,Virology170:31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的例示性方法描述于SUMMERS和SMITH,TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN第1555期(1987)；Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156；Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31-39中。举例来说，可通过同源双交叉重组插入诸如多角体蛋白基因的基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程改造的限制酶位点中。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91。
可使用TROTTER和WOOD,39METHODSINMOLECULARBIOLOGY(1995)；Mann和King,J.GEN.VIROL(1989)70:3501中所述的方法通过电穿孔来实现转染。或者，脂质体可用于以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看，Liebman等人,BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36；Graves等人,BIOCHEMISTRY(1998)37:6050；Nomura等人,J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570；Schmidt等人,PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATIONx1998)12:323；Siffert等人,NATUREGENETICS(1998)18:45；TILKINS等人,CELLBIOLOGY:ALABORATORYHANDBOOK145-154(1998)；Cai等人,PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION(1997)10:263；Dolphin等人,NATUREGENETICS(1997)17:491；Kost等人,GENE(1997)190:139；Jakobsson等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203；Rowles等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(37):22376；Reverey等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10；Stanley等人,J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121；Sisk等人,J.VIROL.(1994)68(2):766；和Peng等人,BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂质体包括例如和(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外，也可使用磷酸钙转染。参看TROTTER和WOOD,39METHODSINMOLECULARBIOLOGY(1995)；Kitts,NAR(1990)18(19):5667；以及Mann和King,J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合且起始编码序列(例如，结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调控或为组成性。
在感染周期末期大量转录的结构基因提供特别有用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(FRIESEN等人,TheRegulationofBaculovirusGeneExpression,THEMOLECULARBIOLOGYOFBACULOVIRUSES(1986)；EP0127839和0155476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人,J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中且随后可通过诸如Miller等人,BIOESSAYS(1989)4:91；SUMMERS和SMITH,TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN第1555期(1987)中所述技术的技术来纯化所生长的斑块。
已开发用于感染到若干种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看WO89/046,699；Wright,NATURE(1986)321:718；Carbonell等人,J.VIROL.(1985)56:153；Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人,INVITROCELL.DEV.BIOL(1989)25:225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括但不限于Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(InvitrogenCorp.,目录号11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTMBTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于在杆状病毒表达载体中异源多肽的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售。
大肠杆菌、假单胞菌和其它原核生物所属领域中众所周知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在关于载体的丰富文献、许多载体的商业可用性以及甚至描述载体和其限制酶图谱和特征的手册，无需在本文中广泛讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵子的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调控(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵子且由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(诸如操纵子)的情况下可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现正调控，当存在时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌(E.coli)中lac操纵子的转录[Raibaud等人,ANNU.REV.GENET.(1984)18:173]。因此，调控表达可为正向或负向，由此增强或减弱转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人,NATURE(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(诸如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,Nuc.ACIDSRES.(1980)8:4057；Yelverton等人,NUCL.ACIDSRES.(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；IFNPub第036776号和第121775号，各自以全文引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."Interferon3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake等人,NATURE(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号](所述文献各自以全文引用的方式并入本文中)启动子系统也提供有用的启动子序列。本文中所涵盖的优选方法利用强启动子(诸如T7启动子)以诱导高水平的多肽产生。这些载体的实例包括但不限于来自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其以全文引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调控[Amann等人,GENE(1983)25:167；deBoer等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人,J.MOL.BIOL.(1986)189:113；Tabor等人,ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成(欧洲公开案第267851号)。
除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点还可用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人,NATURE(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人,"GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA",BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger,1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli",MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与欲以相关特性(诸如存在编码所需多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。
所属领域技术人员众所周知用于表达所需多肽的适当宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括但不限于显示具有以下特征中至少一种且优选具有以下特征中至少两种的宿主：(尤其)良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性、良好的分泌能力、良好的可溶性蛋白质产生能力和总体稳固性。细菌宿主通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加州伯克利)(BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。在本文所述且涵盖的方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主包括但不限于菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本文所述并涵盖的方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括但不限于OMP-和LON-。在另一个实施例中，细菌宿主为假单胞菌属，诸如荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。假单胞菌表达菌株的另一实例为荧光假单胞杆菌生物型I，菌株MB101(DowChemical)。
细胞或细胞系表达系统细胞或细胞系表达系统是指能够表达编码非天然氨基酸多肽的基因的细胞、细胞系和转基因有机体(包括两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)。此外，转基因有机体表达可包括产生分泌或排泄形式的多肽(诸如乳汁或蛋)，可对其加以收集，并且必要时可使用所属领域和本文所述的标准方法提取和进一步纯化所表达的非天然氨基酸多肽。
有用宿主细胞和/或细胞系的实例包括但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Balb/3T3、RIN、MT2、小鼠NS0和其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异种杂交瘤(heterohybridoma)细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0和MDCK细胞。适用于无血清培养基的细胞系也可用，并且所述细胞系因不存在血清蛋白质而利于从细胞培养基中纯化所分泌的蛋白质。一种此类实例为(但不限于)无血清EBNA-1细胞系(Pham等人,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42)。此外，可选择调节插入序列表达或以所需方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。所述对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能至关重要。不同的宿主细胞、细胞系、宿主系统或有机体针对蛋白质的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可选择适当的细胞、细胞系、宿主系统或有机体以确保正确修饰和加工所表达的外来蛋白质。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶和/或分别在tk-、hgprt-、aprt-或dhfr-细胞中的二氢叶酸还原酶基因。另外，可将抗代谢物抗性用作选择赋予霉酚酸抗性的gpt、赋予氨基糖苷G418抗性的neo和赋予潮霉素抗性的hygro的基础。其它选择系统已为所属领域技术人员众所周知并且可视各种制备考虑因素(包括但不限于宿主细胞类型、所需的翻译后修饰、载体选择、制备规模、制备成本和纯化的简便性)而加以利用。
在形成重组宿主细胞株(即，已将表达构筑体引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)后，在适于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞株。培养重组宿主细胞株的方法将取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属领域中众所周知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和无机盐源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域中众所周知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物(包括但不限于用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。
重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞采集(在所需多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备来说，优选分批培养和细胞采集。在经由细胞或细胞系表达系统实现蛋白质表达的情况下，可在活体外以多种模式使细胞繁殖，包括但不限于在大部分培养期间始终于悬浮液中生长的非锚着依赖性细胞(non-anchoragedependentcell)，或需要附着于固体基质上以供其繁殖的锚着依赖性细胞(即，单层类型的细胞生长)。来自连续产生的细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养是大规模产生细胞和细胞产物的最广泛使用的方式。而且，可基于如上文所述的各种制备考虑因素选择细胞类型和繁殖模式。
在一个实施例中，在于重组系统中表达之后纯化本文所述的非天然氨基酸多肽。可通过所属领域已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化多肽。通常，细菌宿主细胞中所产生的许多多肽具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在一个实施例中，利用本文中所揭示的方法以及所属领域已知的方法，可容易地在多肽中进行出于增加重组产生的多肽的溶解性的目的而选择的氨基酸取代。在不溶性多肽的情况下，可通过离心或过滤从宿主细胞溶解产物收集多肽，且其后可接着进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的多肽的情况下，可加入包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性多肽的沉淀。随后可通过离心或过滤便利地收集沉淀多肽。可使用所属领域技术人员众所周知的多种方法使重组宿主细胞破裂或均质化以自细胞内部释放包涵体。可使用众所周知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括但不限于酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(douncehomogenization)或高压释放破裂。在本文所述并涵盖的方法的一个实施例中，使用高压释放技术来使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放多肽包涵体。在处理多肽包涵体时，有利的是使均质化时间的重复最小化以便最大化包涵体产率而不会由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因素造成损失。
随后可使用所属领域已知的众多适合增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀多肽。举例来说，利用脲或盐酸胍来溶解多肽。应使溶解多肽的体积最小化，从而可使用可方便操作的批量大小制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，那么应避免可损害机器和容器的苛性化学品(harshchemicals)或多肽产物本身。在本文所述并涵盖的方法中已证实，较温和的变性剂脲可代替较苛刻的变性剂盐酸胍用于溶解多肽包涵体。脲的使用在有效溶解多肽包涵体的同时显著降低对在多肽的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备造成损害的风险。
在可溶性多肽的情况下，可将肽分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性肽可存在于宿主细胞的细胞质中。可在进行纯化步骤之前浓缩可溶性肽。可使用标准技术(包括但不限于本文所述的技术)浓缩来自例如细胞溶解产物或培养基的可溶性肽。另外，标准技术(包括但不限于本文所述的技术)可用于使宿主细胞破裂并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性肽。
当制备呈融合蛋白形式的多肽时，优选去除融合序列。可通过包括但不限于酶促裂解或化学裂解的方法实现融合序列的去除，其中优选酶促裂解。可使用所属领域技术人员众所周知的方法来实现融合序列的酶促去除。用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，且反应条件将由酶的选择指定。可使用包括但不限于溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂的试剂来实现化学裂解。视情况通过众所周知的方法从裂解的融合序列中纯化经裂解多肽。这些方法将由融合序列和多肽的身份和特性决定。用于纯化的方法可包括但不限于尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也视情况纯化多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。可通过所属领域已知的任何适合方法(包括但不限于沉淀或离子交换色谱)去除DNA。在一个实施例中，通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括但不限于离心或过滤的众所周知的标准方法使多肽与沉淀DNA分离。在欲将多肽用于治疗人类的情况中，宿主核酸分子的去除是重要因素，且本文所述的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的含量。
用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、馈料分批或连续模式过程进行。
通常可使用所属领域中的标准方法来回收本文所述的非天然氨基酸多肽的人类形式。举例来说，可将培养基或细胞溶解产物离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或者透滤到适当缓冲液中以调节制剂以供进一步纯化。本文所述的非天然氨基酸多肽的进一步纯化包括但不限于从相应完整形式分离脱酰胺化和剪短形式的多肽变体。
以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本文所述的非天然氨基酸多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于DEAESEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEXG-75)；疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括但不限于硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE；或萃取；或其任何组合。
根据所属领域技术人员已知且使用的标准程序，可将本文所述的方法和组合物内涵盖的多肽(包括但不限于包含非天然氨基酸的多肽、针对包含非天然氨基酸的多肽的抗体、包含非天然氨基酸的多肽的结合搭配物)部分或实质上纯化到均质。因此，可通过所属领域中众所周知的众多方法中的任一种来回收和纯化本文所述的多肽，这些方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳和其任何组合。必要时，在制备正确折叠的成熟蛋白质时可使用蛋白质再折叠步骤。可将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合方法用于需要高纯度的最后纯化步骤中。在一个实施例中，将针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的多肽)制成的抗体用作纯化试剂(包括但不限于)以用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的以亲和性为基础的纯化。必要时，在部分纯化或达到均质后，视情况将多肽用于多种应用，包括但不限于作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为抗体产生的免疫原。
除了本文中所提到的其它参考文献外，所属领域中众所周知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括但不限于以下文献中所述的那些：R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,MethodsinEnzymology第182卷:GuidetoProteinPurification.AcademicPress,Inc.N.Y.(1990)；Sandana,(1997)BioseparationofProteins.AcademicPress,Inc.；Bollag等人(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,Harris和Angal,(1990)Protein PurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England；Harris和Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England；Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY；Janson和Ryden,(1998)ProteinPurification:Principles.High ResolutionMethodsandApplications,第2版Wiley-VCH,NY；和Walker(1998),Protein ProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ；以及其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生包含至少一个非天然氨基酸的多肽的一个优点在于，通常所述多肽将以其天然构象折叠。然而，在本文所述方法和组合物的某些实施例中，在合成、表达和/或纯化之后，多肽可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本文所述方法和组合物的一个方面中，经表达蛋白质视情况经变性且随后复性。此可选变性和复性是利用所属领域中已知的方法来实现，包括但不限于通过将伴侣蛋白(chaperonin)加入所关注多肽中，和通过将多肽溶解于包括但不限于盐酸胍的离液剂中以及利用蛋白质二硫键异构酶。
一般来说，有时候需要变性和还原经表达多肽且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可通过将胍、脲、DTT、DTE和/或伴侣蛋白加到所关注的翻译产物中来实现所述再折叠。所属领域技术人员众所周知还原、变性和复性蛋白质的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人,(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；以及Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可在含有(包括但不限于)氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者一种或一种以上多肽或其它表达产物可流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
在原核产生非天然氨基酸多肽的情况下，由此产生的多肽可能错误折叠且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。在一个实施例中，通过使用例如一种或一种以上离液剂(包括但不限于脲和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(包括但不限于二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中多肽也不可溶)、展开和还原多肽链而使错误折叠的多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后加入氧化剂(包括但不限于氧、胱氨酸或胱胺)，其允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法将未折叠或错误折叠的多肽再折叠，诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法，所述专利各自以全文引用的方式并入本文中。多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。在再折叠或共折叠之后，视情况进一步纯化多肽。
可使用多种技术来实现非天然氨基酸多肽的纯化，包括但不限于本文所述的技术，例如疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化还可包括干燥或沉淀纯化蛋白质的步骤。
纯化后，将非天然氨基酸多肽交换到不同缓冲液中和/或通过所属领域中已知的多种方法中的任一种浓缩，所述方法包括但不限于透滤和透析。作为单一纯化蛋白质提供的hGH可经历聚集和沉淀。在某些实施例中，经纯化非天然氨基酸多肽可为至少90％纯(如通过反相高效液相色谱RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE所测量)。在某些其它实施例中，经纯化非天然氨基酸多肽可为至少95％纯，或至少98％纯，或至少99％纯或更高纯度。不管非天然氨基酸多肽的纯度的确切数值如何，非天然氨基酸多肽对于用作医药产品或用于进一步处理(包括但不限于与诸如PEG的水溶性聚合物连结)来说都足够纯。
在某些实施例中，可在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等外)的情况下将非天然氨基酸多肽分子用作治疗剂，且在非天然氨基酸多肽分子的某些实施例中，其可与另一多肽或聚合物复合。
2.非天然氨基酸多肽的纯化
通用纯化方法：本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的一般纯化。
可以任何适当次序对包含所需多肽的细胞溶解产物提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或者对由任何分离步骤产生的任何多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述分离步骤包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。
用于进行本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统可自例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)和AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)获得。包括但不限于交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可自这些公司获得。
可使用专用设备(诸如泵)更迅速地实现平衡和本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(诸如洗涤和洗提)。市售泵包括但不限于泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。
可使用任何市售监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、荧光、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监测器UV-1、SII、监测器UV-MII、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。实际上，整个系统在市面上有售，包括来自AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各种系统。
在本文所述方法和组合物的一个实施例中，例如，可通过首先在脲中使所得经纯化多肽变性，接着在合适pH值下于含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原多肽且使其变性。在另一个实施例中，多肽是以介于约2M到约9M之间的浓度范围于脲素中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中稀释。可随后培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，在室温下将再折叠混合物培育4小时到24小时。随后可将还原且变性的多肽混合物进一步分离或纯化。
如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调整第一多肽混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓缩第一多肽混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域技术人员众所周知的技术将包含第一多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液换成适用于下个分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的离子色谱。
在一个实施例中且作为可选的额外步骤，可对第一多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY:PRINCIPLESANDMETHODS(目录号18-1114-21,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括和柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，诸如QFastFlow、QHighPerformance和QXL；强阳离子交换剂，诸如SPHighPerformance、SPFastFlow和SPXL；弱阴离子交换剂，诸如DEAEFastFlow；和弱阳离子交换剂，诸如CMFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的多肽。可使用任何适合阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包括但不限于纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括但不限于纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。在将多肽吸附到阳离子交换基质上之后，可通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以从所述基质中置换多肽，来洗提实质上经纯化的多肽。用于实质上经纯化的多肽的高pH值洗提的适当缓冲液包括但不限于浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱：本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的反相色谱。
可根据所属领域技术人员已知的适合方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人,ANALBIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)；Rivier等人,J.CHROM.(1983)268:112-119；Kunitani等人,J.CHROM.(1986)359:391-402。可对多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的多肽。在这点上，可使用具有多种长度(包括但不限于至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者，可使用聚合性树脂。举例来说，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合性树脂。此外，可用诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。含有离子配对剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗提缓冲液可用于从RP-HPLC柱洗提多肽。最常用的离子配对剂包括但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。用于本文中的合适洗提缓冲液的实例可包括但不限于乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术：本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的疏水相互作用色谱纯化。
可对多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参看HYDROPHOBICINTERACTIONCHROMATOGRAPHYHANDBOOK:PRINCIPLESANDMETHODS(目录号18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))，其以引用的方式并入本文中。适合HIC基质可包括但不限于经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括但不限于聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括但不限于和柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。简单地说，在装载之前，可使用所属领域技术人员已知的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。可将硫酸铵用作装载HIC柱的缓冲液。在装载多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的材料，但将多肽留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的不断降低的线性盐梯度来洗提多肽分子。随后可例如通过过滤(诸如透滤或超滤)来浓缩洗出液。可利用透滤来去除用于洗提多肽的盐。
其它纯化技术：本节中所揭示的技术可应用于本文所述的非天然氨基酸多肽的其它纯化技术。
可对第一多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GELFILTRATION:PRINCIPLESANDMETHODS(目录号18-1022-18,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其以全文引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(适合基质包括但不限于HA-Ultrogel、HighResolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-GelHTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐且用适合缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。本文中所述的各步骤中可使用各种技术(包括但不限于本文所述的技术)来监测多肽(包括实质上经纯化的多肽)的产率。这些技术也可用于在最后分离步骤后评估实质上经纯化的多肽的产率。举例来说，可使用具有多种烷基链长度的若干反相高压液相色谱柱(诸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC中的任一种来监测多肽的产率。
还可使用亲和纯化技术来纯化或增强非天然氨基酸多肽制剂的纯度。亲和纯化利用抗体、受体、凝集素和/或增加纯化的特异性的其它分子。蛋白质制剂穿过含有对靶蛋白或者靶蛋白上或靶蛋白内所见的表位具特异性的抗体或分子的基质，且随后将所保留的靶蛋白洗提以回收高度纯化的蛋白质制剂。还可工程改造用于产生非天然氨基酸多肽的表达构筑体以添加亲和标签(诸如myc表位、GST融合体或His标签)且分别利用相应的myc抗体、谷胱甘肽树脂或Ni树脂进行亲和纯化。所述抗体、配体和亲和标签的使用只是举例来说并且不会限制可用于非天然氨基酸多肽的亲和纯化的选择。可使用多种亲和分子和基质(即，柱、珠粒、浆液等)并且为所属领域众所周知。
可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量多肽来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。
在某些实施例中，在各纯化步骤后多肽的产率可为各纯化步骤的原材料中的多肽的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)是由硅胶粒子组成，其表面带有C4烷基链。多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗提。使用不锈钢柱(填充约2.8到约3.2升VydacC4硅胶)进行制备型HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液且将其装载于VydacC4柱上。对于洗涤和洗提来说，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提部分且立即用磷酸盐缓冲液将其中和。汇集在IPC限度内的多肽洗提部分。
DEAESepharose(Pharmacia)材料是由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子相互作用来介导多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提多肽。用DEAESepharosefastflow填充柱。调节柱体积以确保多肽装载量在每毫升凝胶约3到约10毫克多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装载汇集的HPLC洗出液洗提部分且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)将多肽从柱洗提且根据标准洗提曲线收集于单一洗提部分中。将DEAESepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中且在-70℃下储存。
可使用多种方法和程序评定含有一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的产率和纯度，包括但不限于与蛋白质染色方法联合的SDS-PAGE、免疫印迹、质谱、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色性。举例来说，所述用于表征蛋白质的方法和程序包括但不限于Bradford检定、SDS-PAGE和银染色SDS-PAGE、考马斯染色SDS-PAGE。其它方法包括但不限于去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性(Gram-negative)宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的外侧膜上的脂多糖(LPS)。用于降低内毒素含量的方法包括但不限于使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术；反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱；疏水相互作用色谱；这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(诸如共迁移蛋白质)。用于测量内毒素含量的方法已为所属领域技术人员所知且包括但不限于鲎变形细胞溶解物(LimulusAmebocyteLysate，LAL)检定。
在某些实施例中，可将式I-LXVII的氨基酸(包括在式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物)通过生物合成方法并入多肽中，从而产生非天然氨基酸多肽。在其它实施例中，将所述氨基酸并入多肽内特定位点处。在其它实施例中，使用翻译系统将所述氨基酸并入多肽中。在其它实施例中，所述翻译系统包含：(i)编码多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含与上述氨基酸的预先设计的并入位点对应的选择密码子；和(ii)包含所述氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对选择密码子具特异性。在所述翻译系统的其它实施例中，聚核苷酸为在翻译系统中产生的mRNA。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含包括聚核苷酸的质粒或噬菌体。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含包括聚核苷酸的基因组DNA。在所述翻译系统的其它实施例中，将聚核苷酸稳定整合到基因组DNA中。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含对选自由以下密码子组成的群组的选择密码子具特异性的tRNA：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。在所述翻译系统的其它实施例中，tRNA为抑制tRNA。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含针对上述氨基酸氨酰基化的tRNA。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含对tRNA具特异性的氨酰基合成酶。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含正交tNRA和正交氨酰基tRNA合成酶。在所述翻译系统的其它实施例中，多肽是通过核糖体合成，且在其它实施例中，翻译系统为包含选自由细菌细胞、古细菌细胞和真核细胞组成的群组的细胞的活体内翻译系统。在其它实施例中，细胞为大肠杆菌细胞、酵母细胞、来自假单胞菌属的细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。在所述翻译系统的其它实施例中，翻译系统为包含来自细菌细胞、古细菌细胞或真核细胞的细胞提取物的活体外翻译系统。在其它实施例中，细胞提取物来自大肠杆菌细胞、来自假单胞菌属的细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。在其它实施例中，至少一部分多肽是通过固相或溶液相肽合成或其组合来合成，而在其它实施例中，进一步包含将多肽与另一多肽接合。在其它实施例中，可将式I-LXVII的氨基酸(包括在式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物)通过生物合成方法并入多肽中，其中所述多肽为与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源的蛋白质。
B.活体内翻译后修饰
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注多肽，所述多肽可包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，多肽包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡糖(包括但不限于(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬酰胺连接在一起。参看表1，其列出真核蛋白质的N连接寡糖的一些实例(也可存在其它未展示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接在一起。
第1.01节表1：通过GlcNAc键连接的寡糖的实例
另一方面，翻译后修饰包括前体(包括但不限于降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、前胰岛素、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解处理；组装成多亚单元蛋白质或大分子组装物；翻译到细胞中另一位点处(包括但不限于细胞器，诸如内质网、高尔基体(golgiapparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加额外分子的额外化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间的共价键形成，包括但不限于α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本文所述或使用本文所述的方法所产生的多肽中，可在活体外或活体内使用其它更具选择性的反应，包括但不限于非天然二羰基氨基酸与二胺的反应。说明性实例可见于以下参考文献中。例如参看Cornish等人,(1996)J. Am.Chem.Soc.118:8150-8151；Mahal等人,(1997)Science.276:1125-1128；Wang等人,(2001)Science292:498-500；Chin等人,(2002)Am.Chem.Soc.124:9026-9027；Chin等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024；Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci100:56-61；Zhang等人,(2003)Biochemistry.42:6735-6746；和Chin等人,(2003)Science.300:964-967。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。还参看2003年1月16日申请的名为“Glycoproteinsynthesis”的美国专利第6,927,042号，其以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括但不限于通过叠氮基氨基酸)也可通过施陶丁格接合(Staudingerligation)(包括但不限于用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人,(2002)IncorporationofazidesintorecombinantproteinsforchemoselectivemodificationbytheStaudingerligtation,PNAS99(1):19-24。
IX.产生非天然氨基酸多肽的替代系统
已使用若干种策略以在非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。本节中所揭示的替代系统可应用于产生本文所述的非天然氨基酸多肽。举例来说，氨基酸经诸如Lys、Cys和Tyr的反应性侧链衍生化会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。利用肽片段的酶促接合和天然化学接合的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)。化学肽接合和天然化学接合描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO03/042235中，其以全文引用的方式并入本文中。已使用将经所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将100个以上非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34:621-633(1995)；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,Ageneralmethodforsite-specificincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteins,Science244:182-188(1989)；和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosyntheticsite-specificincorporationofanon-naturalaminoacidintoapolypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究。
已提出称作选择性压力并入的活体内方法以利用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB J.,13:41-51(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而靶基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白质表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩峰，例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29-34(2000)；已使用三氟甲硫氨酸代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过19FNMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404-3416(1997)；且已并入三氟亮氨酸代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.40(8):1494-1496(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白质中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBOJ.,9(5):1665-1672(1990)；J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol..1:283-284(1994)；N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem..230:788-796(1995)；和N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol..270:616-623(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett.,428:68-70(1998)；J.C.MvanHest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J. Am.Chem.Soc.122:1282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487-9493(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其以全文引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数目的情况下实现。仅举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参看，M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107-7112(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸替代苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett..364:272-275(1995)；以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett.,467:37-40(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许比酪氨酸有效地并入重氮酪氨酸。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275(51):40324-40328(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。近来已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere,Science,292:501-504(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团在Abu中经-CH3置换)，因此当使这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中所引用的如下参考文献：Crick,F.J.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.Generalnatureofthegeneticcodeforproteins.Nature,192(4809):1227-1232(1961)；Hofmann,K.,Bonn,H.Studiesonpolypeptides.XXXVI.Theeffectofpyrazole-imidazolereplacementsontheS-proteinactivatingpotencyofanS-peptidefragment,J.AmChem,88(24):5914-5919(1966)；Kaiser,E.T.Syntheticapproachestobiologicallyactivepeptidesandproteinsincludingenyzmes,AceChemRes,22(2):47-54(1989)；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptidesegmentcouplingcatalyzedbythesemisyntheticenzymethiosubtilisin,JAmChemSoc,109,3808-3810(1987)；Schnolzer,M.,Kent,SBH.Constructingproteinsbydovetailingunprotectedsyntheticpeptides:backbone-engineeredHIVprotease,Science,256,221-225(1992)；Chaiken,I.M.Semisyntheticpeptidesandproteins,CRCCritRevBiochem,255-301(1981)；Offord,R.E.Proteinengineeringbychemicalmeans？ProteinEng.,1(3):151-157(1987)；和Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.ADesignedPeptideLigaseforTotalSynthesisofRibonucleaseAwithUnnaturalCatalyticResidues,Science,266,243-247(1994)。
已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看，Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generationofahybridsequence-specificsingle-strandeddeoxyribonuclease,Science,238,1401-1403(1987)；Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.,Rokita,S.E.Thechemicalmodificationofenzymaticspecificity,Ann.RevBiochem,54,565-595(1985)；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemicalmutationofenyzmeactivesites,Science,226,.505-511(1984)；Neet,K.E.,NanciA,Koshland,D.E.Propertiesofthiol-subtilisin,JBiol.Chem,243(24):6392-6401(1968)；Polgar,L.B.,M.L.Anewenzymecontainingasyntheticallyformedactivesite.Thiol-subtilisin.J.AmChemSoc,88(13):3153-3154(1966)；和Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introductionofnucleophilesandspectroscopicprobesintoantibodycombiningsites,Science,1(242):1038-1040(1988)。
或者，使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将若干种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner,J.NewPhotolabelingandcrosslinMngmethods,Aium.RevBiochem,483-514(1993)；和Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinkingofthesignalsequenceofnascentpreprolactinofthe54-kilodaltonpolypeptideofthesignalrecognitionparticle,Proc.Natl.Acad.Sci,83,8604-8608(1986)。
先前已证实，通过将以化学方式氨酰基化的抑制tRNA加入经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应，可在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.Ageneralmethodforsite-specificincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteins,Science,244:182-188(1989)；M.W.Nowak等人,Science268:439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosyntheticsite-specificIncorporationofanon-naturalaminoacidintoapolypeptide,J.AmChemSoc,111:8013-8014(1989)；N.Budisa等人,FASEBJ.13:41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosyntheticmethodforintroducingunnaturalaminoacidssite-specificallyintoproteins,MethodsinEnz.,第202卷,301-336(1992)；和Mendel,D.,Cornish,V.W.&Schultz,P.G.Site-DirectedMutagenesiswithanExpandedGeneticCode,AnnuRevBiophys.BiomolStruct.24,435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5',3'Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis,NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验和使用α-羟基酸的实验证实，在UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且未在蛋白质中的任何其它位点处并入此氨基酸。例如参看，Noren等人,同上文；Kobayashi等人,(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432；和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specificincorporationofnovelbackbonestructuresintoproteins,Science,255,197-200(1992)。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看，M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439-442(1995)；以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopusoocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共注射：在所关注氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制tRNA。随后卵母细胞的翻译机器将非天然氨基酸插入UAG所指定的位置处。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整合膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括但不限于将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271(33):19991-19998(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4(10):739-749(1997)；使用经笼蔽酪胺酸类似物以实时监测离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619-624(1998)；以及使用α羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如参看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Cell,96:89-98(1999)；以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4(3):239-246(2001)。
活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点，包括但不限于突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白于治疗性治疗中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能并且产生具有新颖特性的新蛋白质或有机体。
在位点特异性地并入p-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,ProteinSci.,7:419-426(1998)。
使用无细胞(活体外)翻译系统获得所需聚核苷酸的表达也是可能的。翻译系统可为细胞或无细胞翻译系统，并且可为原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括但不限于全细胞制剂，诸如可将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译mRNA的渗透细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统在市面上有售并且众所周知多种不同类型和系统。无细胞系统的实例包括但不限于原核细胞溶解产物，诸如大肠杆菌溶解产物；和真核细胞溶解产物，诸如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人类细胞溶解产物。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式修饰时，由于许多修饰仅可能在真核系统中发生，故真核提取物或溶解产物可为优选的。这些提取物和溶解产物中有一些在市面上有售(Promega；Madison,Wis.；Stratagene；LaJolla,Calif.；Amersham；ArlingtonHeights,Ill.；GIBCO/BRL；GrandIsland,N.Y.)。膜提取物(诸如含有粘膜的犬胰腺提取物)也可用，其可用于翻译分泌蛋白质。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合式活体外转录与翻译)的这些系统中，活体外合成是由核糖体指导。已进行相当多的尝试来研发无细胞蛋白质表达系统。例如参看，Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyandBioengineering,74(4):309-316(2001)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyLetters,22,1537-1542,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyProgress,16,385-390,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,BiotechnologyandBioengineering,66(3):180-188,(1999)；以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,Biotechniques24(5):862-868,(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353；WO90/05785，其以全文引用的方式并入本文中。可用于表达包含非天然氨基酸的多肽的另一种方法包括但不限于mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Proc.NatlAcad.Sci.(USA)94:12297-12302(1997)；A.Frankel等人,Chemistry&Biology10:1043-1050(2003)。在本方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽连结物在活体外检定中具有引人关注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可筛选包含一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的文库，以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人,Proc.NatlAcad.Sci.(USA)100(11):6353-6357(2003)。
还可使用重构翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶解产物或补充有经纯化翻译因子(诸如，起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3、延长因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可为偶合式转录/翻译系统，其中如CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编辑,WileyInterscience,1993)(其以引用的方式特别并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或者5'端戴帽(7-甲基鸟苷)且3'端加多聚腺苷酸尾巴的成熟mRNA(其可在某些翻译系统中具有优势)的形式。举例来说，在网织红细胞溶解产物系统中，以高效率翻译戴帽的mRNA。
可通过任何方法或技术(包括但不限于化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸将tRNA氨酰基化。
氨酰基化可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括但不限于核糖酶)实现。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事(Cech,1987,Science.236:1532-1539；McCorkle等人,1987,ConceptsBiochem.64:221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在的RNA(核糖酶)。然而，尽管仅证实这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物作用以供裂解和剪接，但近来核糖酶人工开发的发展已将催化谱系扩大到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'末端氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人,1995Science267:643-647)，以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个的RNA分子(Lohse等人,1996,Nature381:442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述构建核糖体的方法和其于利用天然编码和非天然编码的氨基酸使tRNA氨酰基化的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括但不限于核糖酶)的基质固定形式使得能够有效亲和纯化氨酰基化产物。适当基质的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰基化的基质固定形式核糖酶的制备和用途描述于ChemistryandBiology2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。
化学氨酰基化方法包括但不限于避免在氨酰基化过程中使用合成酶的由下述文献中介绍的方法：Hecht和同事(Hecht,S.M.Acc.Chem.Res.1992,25,545；Heckler,T.G.；Roesser,J.R.；Xu,C；Chang,P.；Hecht,S.M.Biochemistry1988,27,7254；Hecht,S.M.；Alford,B.L.；Kuroda,Y.；Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)；和Schultz,Chamberlin,Dougherty等人(Cornish,V.W.；Mendel,D.；Schultz,P.G.Angew.Chem.Int. Ed.Engl.1995,34,621；Robertson,S.A.；Ellman,J.A.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722；Noren,C.J.；Anthony-Cahill,S.J.；Griffith,M.C.；Schultz,P.G.Science1989,244,182；Bain,J.D.；Glabe,C.G.；Dix,T.A.；Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等人Nature1992,356,537；Gallivan,J.P.；Lester,H.A.；Dougherty,D.A:Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等人J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等人Science,1995,268,439；Saks,M.E.等人J.Biol.Chem.1996,271,23169；Hohsaka,T.等人J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)。所述方法或其它化学氨酰基化方法都可用于使tRNA分子氨酰基化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生随机核糖酶序列的单独集合；对所述集合进行定向演化；针对所需氨酰基化活性筛选所述集合；和选择展现所需氨酰基化活性的核糖酶序列。
核糖酶可包含促进酰基化活性的基序和/或区域，诸如GGU基序和富集U的区域。举例来说，已报导富集U的区域可促进氨基酸底物的识别，且GGU基序可与tRNA的3'末端形成碱基对。GGU基序与富集U区域的组合可促进同时识别氨基酸与tRNA，且因此促进tRNA的3'末端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsnCCCG连结的部分随机r24mini进行活体外选择，随后系统工程改造活性克隆中所见的一致序列来产生核糖酶。通过此方法获得的例示性核糖酶称为“Fx3核糖酶”并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号中，其内容以引用的方式并入本文中，所述核糖酶充当合成载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基tRNA的通用催化剂。
在基质上固定可用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和纯化。适当基质的实例包括但不限于琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可通过利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，诸如，RNA核糖上的3'-顺-二醇可经高碘酸盐氧化以得到相应的二醛，以便促进RNA于树脂上的固定。可使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原胺化使得树脂与核糖酶之间相互作用形成不可逆键。可通过此项柱上氨酰基化技术来显著促进氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人Methods2005；36:239-4中描述一种基于柱的氨酰基化系统。
氨酰基化tRNA的分离可以多种方式实现。一种适当的方法是利用缓冲液(诸如含10mMEDTA的乙酸钠溶液；含有50mMN-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKCl(pH7.0)、10mMEDTA的缓冲液；或者简单地EDTA缓冲的水(pH7.0))从柱中洗提氨酰基化tRNA。
可将氨酰基化tRNA加到翻译反应中以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括但不限于细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA活体外翻译多肽所需的反应组件。所述反应组件的实例包括但不限于核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延长因子以及其它与翻译有关的因子。此外，翻译系统可为批量翻译或分隔翻译(compartmentalizedtranslation)。批量翻译系统组合单一隔室中的反应组件，而分隔翻译系统使翻译反应组件与可抑制翻译效率的反应产物分离。这些翻译系统在市面上有售。
此外，可使用偶合式转录/翻译系统。偶合式转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，而mRNA又经反应组件翻译。市售偶合式转录/翻译的实例为RapidTranslationSystem(RTS,RocheInc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物以提供诸如核糖体和翻译因子的翻译组件。此外，包括RNA聚合酶以将输入DNA转录成mRNA模板以用于翻译。RTS可经由插入反应隔室(包括供应/废料隔室和转录/翻译隔室)之间的膜分隔反应组件。
可通过包括但不限于转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等的其它试剂进行tRNA的氨酰基化。
Stephan于Scientist2005年10月10日第30-33页中描述将非天然编码的氨基酸并入蛋白质中的其它方法。Lu等人于MolCell.2001年10月；8(4):759-69中描述一种以化学方式将蛋白质接合到含有非天然氨基酸的合成肽的方法(经表达蛋白质接合)。
X.多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰
为方便起见，已一般性地和/或利用特定实例描述本文所述多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰。然而，本文所述多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰不应仅限于所提供的基本描述或特定实例，而是本文所述多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰同样适用于在式I-LXVII范围内的所有化合物，包括在本说明书、权利要求书和本文图式中所述的式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物。
已开发出在活体内翻译蛋白质期间位点特异性并入非天然氨基酸的方法、组合物、技术和策略。通过并入具有与天然存在的氨基酸正交的侧链化学的非天然氨基酸，此技术使得可能位点特异性地衍生化重组蛋白质。因此，本文所述方法、组合物、技术和策略的主要优势在于，衍生化蛋白质现在可作为指定同源产物制备。然而，本文所述的方法、组合物、反应混合物、技术和策略不限于通过活体内蛋白质翻译技术形成的非天然氨基酸多肽，而是包括由任何技术(仅举例来说，包括经表达蛋白质接合、化学合成、基于核糖酶的技术)形成的非天然氨基酸多肽(例如参看本文中名为“替代系统的表达”一节)。
将非天然氨基酸并入重组蛋白质中的能力广泛扩展可实施翻译后衍生化的化学，其中所述衍生化是在活体内或活体外发生。更具体说来，利用二羰基与二胺的反应以在多肽的非天然氨基酸部分上形成杂环(包括含氮杂环)键的多肽衍生化提供若干优势。首先，天然存在的氨基酸(a)不含有可与二胺基反应以形成杂环(包括含氮杂环)键的二羰基；且(b)不含有可与二羰基反应以形成杂环(包括含氮杂环)键的二胺基，且因此经设计以形成所述键的试剂将与多肽的非天然氨基酸组分位点特异性地反应(当然，假定非天然氨基酸和相应试剂已经设计以形成所述键)，由此与使用现有技术产生的衍生化蛋白质混合物相反，位点选择性衍生化蛋白质的能力提供单一同源产物。其次，所述杂环(包括含氮杂环)键在生物条件下稳定，表明经所述杂环(包括含氮杂环)键衍生化的蛋白质为治疗应用的有效候选物。第三，可基于已形成杂环(包括含氮杂环)键的非天然氨基酸的身份(即，官能团和/或结构)操纵所得杂环(包括含氮杂环)键的稳定性。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽的杂环(包括含氮杂环)键具有小于约1小时的分解半衰期，在其它实施例中小于约1天，在其它实施例中小于约2天，在其它实施例中小于约1周且在其它实施例中大于约1周。在其它实施例中，所得杂环(包括含氮杂环)在温和的酸性条件下可稳定约至少2周，在其它实施例中，所得杂环(包括含氮杂环)键在温和的酸性条件下可稳定约至少5天。在其它实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与约8之间的pH值下、在其它实施例中在约2到约6的pH值下、在其它实施例中在约2到约4的pH值下可稳定约至少1天。在其它实施例中，使用本文所述的策略、方法、组合物和技术，所属领域技术人员将能够合成分解半衰期经调节以满足所属领域技术人员需要(例如，用于诸如持续释放的治疗用途，或诊断用途，或工业用途或军事用途)的非天然氨基酸多肽的杂环(包括含氮杂环)键。
上述非天然氨基酸多肽可用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括但不限于抗体和抗体片段)以及(包括但不限于)蛋白质结构和功能研究。例如参看Dougherty,(2000)UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction,CurrentOpinioninChemicalBiology.4:645-652。仅举例来说，上述非天然氨基酸多肽的其它用途包括基于检定的用途、化妆品、植物学、环境、能量产生和/或军事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可经历进一步修饰，从而并入新颖或经修饰的官能团，包括：操控多肽的治疗功效；改进多肽的安全性特征；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或者延长循环时间)；为多肽提供其它官能团；将标签、标记或可检测信号并入多肽中；便利多肽的分离特性；和上述改变的任何组合。
某些实施例为使多肽的分离特性便利的方法，其包含利用包含至少一个选自由以下各物组成的群组的非天然氨基酸的同源非天然氨基酸多肽：含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸、含二胺非天然氨基酸、含酮胺非天然氨基酸和含酮炔非天然氨基酸。在其它实施例中，已通过生物合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它或替代性实施例中，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-LXVII的氨基酸的非天然氨基酸。
本文所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽的特定类型、种类或家族。事实上，几乎任何多肽都可包括至少一个本文所述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源。非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
所述修饰包括将其它官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上，所述其它官能团包括但不限于所需官能团。
本文所述的非天然氨基酸多肽可含有可转化成其它官能团的部分，其中所述部分包括但不限于羰基、二羰基、二胺、酮胺或酮炔。所述非天然氨基酸多肽可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。可使用如本文所述的技术或使用如例如March,AdvancedOrganicChemistry第5版,(Wiley2001)；以及Carey和Sundberg,AdvancedOrganicChemistry第4版,第A和B卷(Plenum2000,2001)(所有文献都以全文引用的方式并入本文中)中所述的技术将所述部分化学转化成其它官能团(仅举例来说，杂环部分)。
因此，仅举例来说，可使用本文所述的方法和组合物进一步修饰含有以下氨基酸中任一种的非天然氨基酸多肽：
(a)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为 其中：
R8独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
R9独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T2为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基；
其中各可选取代基独立地选自低碳烷基、经取代低碳烷基、低碳环烷基、经取代低碳环烷基、低碳烯基、经取代低碳烯基、炔基、低碳杂烷基、经取代杂烷基、低碳杂环烷基、经取代低碳杂环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或环芳基或杂环烷基；
或-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的单环或双环环烷基或杂环烷基；
其中-A-B-J-R上至少一个胺基视情况为经保护的胺；
(b)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为 其中
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
其中各可选取代基独立地选自低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷基芳基、经取代亚烷基芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
T2选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
T3为其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
或-A-B-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
(c)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
M2为
其中(a)表示与B基团的键结，且(b)表示与各个羰基的键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
(d)
其中：
B为可选的，并且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R")C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
M1为键结、-C(R3)(R4)-、-O-、-S-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-O-、-C(R3)(R4)-S-、-O-C(R3)(R4)-、-S-C(R3)(R4)、-C(R3)＝C(R3)-或-C(R4)＝C(R4)-；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；且n为0到8；以及
(e)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
(f)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T1为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
本文所述的方法和组合物的一个方面为包括至少一种具有至少一个(包括但不限于至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多)已经翻译后修饰的非天然氨基酸的多肽的组合物。经翻译后修饰的非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于可在蛋白质中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同位点处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多不同的经翻译后修饰的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括多肽中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经翻译后修饰的非天然氨基酸取代的多肽。对于具有一个以上翻译后修饰的非天然氨基酸的指定多肽来说，翻译后修饰的非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于多肽可包括两个或两个以上不同类型的翻译后修饰的非天然氨基酸，或者可包括两个相同的翻译后修饰的非天然氨基酸)。对于具有两个以上翻译后修饰的非天然氨基酸的指定多肽来说，翻译后修饰的非天然氨基酸可相同或不同，或为相同类别的多个翻译后修饰的非天然氨基酸与至少一个不同的翻译后修饰的非天然氨基酸的组合。
翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法
图14和图17为使用本文所述的方法和技术翻译后修饰非天然氨基酸多肽的说明性实施例。这些和其它翻译后修饰描述于下文中。
A.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含二羰基非天然氨基酸与含二胺试剂的反应
天然存在的氨基酸的侧链缺乏高亲电性位点。因此，并入具有含亲电基团侧链的非天然氨基酸(仅举例来说，包括含有二羰基的氨基酸，所述二羰基诸如二酮、酮醛、酮酯、酮酸或酮硫酯)使得可能经由亲核攻击所述羰基中的至少一种使所述侧链位点特异性衍生化。在攻击性亲核基团为二胺的情况下，将产生经杂环衍生化的蛋白质，包括经含氮杂环衍生化的蛋白质。可利用在衍生化步骤前或在衍生化步骤后纯化的多肽进行衍生化和/或进一步修饰的方法。此外，可利用在所述修饰之前或之后经纯化的合成聚合物、多糖或聚核苷酸进行衍生化和/或进一步修饰的方法。此外，衍生化步骤可在适度酸性到轻微碱性的条件下发生，例如包括pH值介于约2到约8之间、pH值介于约4到约8之间、pH值介于约3到约8之间或pH值介于约2到约9之间，或pH值介于约4到约9之间，或pH值介于约4到约10之间。
建立在含二羰基蛋白质与经二胺取代的分子的反应的基础之上的蛋白质衍生化方法具有独特优势。第一，二胺在约5到约8的pH值范围内(且在其它实施例中在约4到约10的pH值范围内；且在其它实施例中在约3到约8的pH值范围内；或在其它实施例中在约2到约9的pH值范围内；或在其它实施例中在约4到约9的pH值范围内)与含二羰基化合物经历缩合以产生杂环(包括含氮杂环)键。在这些条件下，天然存在的氨基酸的侧链不具反应性。第二，所述选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白质成为可能：衍生化蛋白质现可制备为指定的同源产物。第三，实现本文所述的二胺与本文所述的含二羰基多肽的反应所需的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除反应目的是破坏所述三级结构的情形外)。第四，反应在室温下迅速发生，这允许使用将在较高温度下不稳定的许多类型的多肽或试剂。第五，反应易于在水性条件下发生，这也允许使用与非水溶液不相容(在任何程度上)的多肽和试剂。第六，即使当多肽或氨基酸与试剂的比率为化学计量、近化学计量或类化学计量时，反应也易于发生，从而不需要加入过量的试剂或多肽来获得有用量的反应产物。第七，可视反应物中二胺和二羰基部分的设计而区域选择性和/或区域特异性地产生所得杂环。最后，二胺与含二羰基分子的缩合产生在生物条件下稳定的杂环(包括含氮杂环)键。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为可与本文所述的可用于进一步修饰含二羰基非天然氨基酸多肽的含二胺试剂反应的含二羰基氨基酸的类型：
(a)
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为 其中：
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
其中各可选取代基独立地选自低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷基芳基、经取代亚烷基芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
T2选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地选自H、烷基或经取代烷基；
T3为其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
或-A-B-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-K-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基。
实际上，包含所述含二羰基非天然氨基酸的多肽的类型不受限制，只要含二羰基非天然氨基酸位于多肽中，从而使二胺试剂可与二羰基反应并且不产生破坏多肽三级结构(当然，除所述破坏是反应的目的的情形外)的所得经修饰非天然氨基酸即可。
仅举例来说，以下含二胺试剂为可与本文所述的含二羰基非天然氨基酸反应并且可用于进一步修饰含二羰基非天然氨基酸多肽的含二胺试剂的类型：
其中：
各X独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；
各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R")C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
L1为可选的，且当存在时，L1为-C(R')P-NR'-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2；
各R'独立地为H、烷基、经取代烷基或氨基保护基；
W为
Z2和Z3独立地选自由以下各基团组成的群组：键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、-O-、-S-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R')-；且
n为1到3。
式(LVVIII)化合物的某些实施例为具有式(LXIX)结构的化合物：
式(LXIX)化合物的某些实施例为选自由以下各物组成的群组的化合物：
在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有在约5到约30kDa范围内的分子量。在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有在约2到约50kDa范围内的分子量。在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有为约5kDa的分子量。
式(LXIX)化合物的某些实施例为具有式(LXX)结构的化合物：
式(LXIX)化合物的某些实施例为具有式(LXXI)结构的化合物：
在式(XXII)化合物的某些实施例中，所述m-PEG基团具有在约5到约30kDa范围内的分子量。在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有在约2到约50kDa范围内的分子量。在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有为约5kDa的分子量。
式(LXIX)化合物的某些实施例为具有式(LXXII)结构的化合物：
式(LXIX)化合物的某些实施例为具有式(LXXIII)结构的化合物：
在式(XXII)化合物的某些实施例中，所述m-PEG基团具有在5到30kDa范围内的分子量。
式(LXIX)化合物的某些实施例为具有以下结构的化合物：
使二胺与多肽上的含二羰基非天然氨基酸偶合的方法的说明性实施例提供于图12、图15和图16中。在这些说明性实施例中，将二胺衍生化试剂加到含二羰基非天然氨基酸多肽的缓冲溶液(pH值为约2到约9)中。反应在环境温度下进行，且可通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱纯化所得的含杂环非天然氨基酸多肽。
在其它实施例中，多个连接基化学物可与经二羰基取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有二胺官能团的连接基(单、双或多官能性)。二胺衍生化连接基与经二羰基取代的蛋白质缩合产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(也称为异官能性连接基)(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的二胺)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(也称为同官能性连接基)(在所有末端均经二胺取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得有可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
B.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含二羰基非天然氨基酸与含酮胺试剂的反应
还可将上文所述的翻译后修饰技术和组合物用于可与含酮胺试剂反应的含二羰基非天然氨基酸以产生经修饰的含杂环(包括含有含氮杂环)非天然氨基酸多肽。
仅举例来说，上文第A节中所述的含二羰基非天然氨基酸也可与本文所述的可用于进一步修饰含二羰基非天然氨基酸多肽的含酮胺试剂反应。
仅举例来说，以下含酮胺试剂为可与本文所述的含二羰基非天然氨基酸反应并且可用于进一步修饰含二羰基非天然氨基酸多肽的含酮胺试剂的类型：
其中：
各X独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；
各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
L1为可选的，且当存在时，L1为-C(R')P-NR'-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2，且各R'独立地为H、烷基、经取代烷基或氨基保护基；
W为
G为
T3为键结、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R")-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR"、-OAc、-SR"、-N(R")2、-N(R")(Ac)、-N(R")(OMe)或N3，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；且
n为1到3。
在一些实施例中，多个连接基化学物可与经二羰基取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有酮胺官能团的连接基(单、双或多官能性)。酮胺衍生化的连接基与经二羰基取代的蛋白质的反应产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(也称为异官能性连接基)(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的酮胺)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(也称为同官能性连接基)(在所有末端均经酮胺取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得有可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
C.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含二胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应
还可将上文所述的翻译后修饰技术和组合物用于可与含二羰基试剂反应的含二胺非天然氨基酸以产生经修饰的含杂环(包括含有含氮杂环)非天然氨基酸多肽。
建立在含二胺蛋白质与经二羰基取代的分子的反应的基础之上的蛋白质衍生化方法具有独特优势。第一，二胺在约4到约10的pH值范围内(且在其它实施例中在约4到约10的pH值范围内；且在其它实施例中在约3到约8的pH值范围内；或在其它实施例中在约2到约9的pH值范围内；或在其它实施例中在约4到约9的pH值范围内)与含二羰基化合物经历反应以产生杂环(包括含氮杂环)键。在这些条件下，天然存在的氨基酸的侧链不具反应性。第二，所述选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白质成为可能：衍生化蛋白质现可制备为指定的同源产物。第三，实现本文所述的含二羰基试剂与本文所述的含二胺多肽的反应所需的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除反应目的是破坏所述三级结构的情形外)。第四，反应在室温下迅速发生，这允许使用将在较高温度下不稳定的许多类型的多肽或试剂。第五，反应易于在水性条件下发生，这也允许使用与非水溶液不相容(在任何程度上)的多肽和试剂。第六，即使当多肽或氨基酸与试剂的比率为化学计量、近化学计量或类化学计量时，反应也易于发生，从而不需要加入过量的试剂或多肽来获得有用量的反应产物。第七，可视反应物中二胺和二羰基部分的设计而区域选择性和/或区域特异性地产生所得杂环。最后，含二羰基试剂与含二胺氨基酸的反应产生在生物条件下稳定的杂环(包括含氮杂环)键。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为可与本文所述的可用于进一步修饰含二胺非天然氨基酸多肽的含二羰基试剂反应的含二胺氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为 其中：
R8独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
R9独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T2为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基；
其中各可选取代基独立地选自低碳烷基、经取代低碳烷基、低碳环烷基、经取代低碳环烷基、低碳烯基、经取代低碳烯基、炔基、低碳杂烷基、经取代杂烷基、低碳杂环烷基、经取代低碳杂环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-B-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或环芳基或杂环烷基；
或-J-R基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的单环或双环环烷基或杂环烷基。
实际上，包含所述含二胺非天然氨基酸的多肽的类型不受限制，只要含二胺非天然氨基酸位于多肽中，从而使含二羰基试剂可与二胺基反应并且不产生破坏多肽三级结构(当然，除所述破坏是反应的目的的情形外)的所得经修饰非天然氨基酸即可。
仅举例来说，以下含二羰基试剂为可与本文所述的含二胺非天然氨基酸反应并且可用于进一步修饰含二胺非天然氨基酸多肽的含二羰基试剂的类型：
其中：
各X独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；
各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
L1为可选的，且当存在时，L1为-C(R')P-NR'-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2；
各R'独立地为H、烷基、经取代烷基或氨基保护基；
W为其中各R'独立地为H；
各G独立地为
Z1为键结、CR7R7、O、S、NR'、CR7R7-CR7R7、CR7R7-O、O-CR7R7、CR7R7-S、S-CR7R7、CR7R7-NR'、NR'-CR7R7；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R")-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR"、-N(R")2、-N(R")(Ac)、-N(R")(OMe)或N3，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
M2为 且
n为1到3。
使含二羰基试剂与多肽上的含二胺非天然氨基酸偶合的方法的说明性实施例提供于图9和图10中。在此说明性实施例中，将二羰基衍生化试剂加到含二胺非天然氨基酸多肽的缓冲溶液(pH值为约3到约8)中。反应在环境温度下进行，且可通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱纯化所得的含杂环非天然氨基酸多肽。
在其它实施例中，多个连接基化学物可与经二胺取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有二羰基官能团的连接基(单、双或多官能性)。二羰基衍生化的连接基与经二胺取代的蛋白质的缩合产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的二羰基)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(在所有末端均经二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
D.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含二胺非天然氨基酸与含酮炔试剂的反应
还可将上文所述的翻译后修饰技术和组合物用于可与含酮炔试剂反应的含二胺非天然氨基酸以产生经修饰的含杂环(包括含有含氮杂环)非天然氨基酸多肽。仅举例来说，上文第C节中所述的含二胺非天然氨基酸也可与本文所述的可用于进一步修饰含二羰基非天然氨基酸多肽的含酮炔试剂反应。
仅举例来说，以下含酮炔试剂为可与第C节中所述的含二胺非天然氨基酸反应并且可用于进一步修饰含二胺非天然氨基酸多肽的含酮炔试剂的类型：
其中：
各X独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或各X独立地选自由所需官能团组成的群组；
各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R')C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
L1为可选的，且当存在时，L1为-C(R')P-NR'-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2，各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为
G为T4为羰基保护基，包括但不限于其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R")-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR'、-N(R")2、-N(R")(Ac)、-N(R")(OMe)或N3，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基，且n为1到3。
在其它实施例中，多个连接基化学物可与经二胺取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有酮炔官能团的连接基(单、双或多官能性)。酮炔衍生化的连接基与经二胺取代的蛋白质的反应产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的酮炔)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(在所有末端均经酮炔取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
E.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含酮炔非天然氨基酸与含二胺试剂的反应
还可将上文所述的翻译后修饰技术和组合物用于可与含二胺试剂反应的含酮炔非天然氨基酸以产生经修饰的含杂环(包括含有含氮杂环)非天然氨基酸多肽。
建立在含酮炔蛋白质与经二胺取代的分子的反应的基础之上的蛋白质衍生化方法具有独特优势。第一，酮炔在约4到约10的pH值范围内与含二胺化合物反应以产生杂环(包括含氮杂环)键。在这些条件下，天然存在的氨基酸的侧链不具反应性。第二，所述选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白质成为可能：衍生化蛋白质现可制备为指定的同源产物。第三，实现本文所述的含二胺试剂与本文所述的含酮炔多肽的反应所需的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除反应目的是破坏所述三级结构的情形外)。第四，反应在室温下迅速发生，这允许使用将在较高温度下不稳定的许多类型的多肽或试剂。第五，反应易于在水性条件下发生，这也允许使用与非水溶液不相容(在任何程度上)的多肽和试剂。第六，即使当多肽或氨基酸与试剂的比率为化学计量、近化学计量或类化学计量时，反应也易于发生，从而不需要加入过量的试剂或多肽来获得有用量的反应产物。第七，可视反应物中二胺和二羰基部分的设计而区域选择性和/或区域特异性地产生所得杂环。最后，含二胺试剂与含酮炔氨基酸的反应产生在生物条件下稳定的杂环(包括含氮杂环)键。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为可与本文所述的含二胺试剂反应且可用于进一步修饰含酮炔非天然氨基酸多肽的含酮炔氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
在一个实施例中，多个连接基化学物可与经酮炔取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有二胺官能团的连接基(单、双或多官能性)。二胺衍生化的连接基与经酮炔取代的蛋白质的反应产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的二胺)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(在所有末端均经二胺取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
F.翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含酮胺非天然氨基酸与含二羰基试剂的反应
还可将上文所述的翻译后修饰技术和组合物用于可与含二羰基试剂反应的含酮胺非天然氨基酸以产生经修饰的含杂环(包括含有含氮杂环)非天然氨基酸多肽。
建立在含酮胺蛋白质与经二羰基取代的分子的反应的基础之上的蛋白质衍生化方法具有独特优势。第一，酮胺在约4到约10的pH值范围内(且在其它实施例中在约4到约10的pH值范围内；且在其它实施例中在约3到约8的pH值范围内；或在其它实施例中在约2到约9的pH值范围内；或在其它实施例中在约4到约9的pH值范围内)与含二羰基化合物经历反应以产生杂环(包括含氮杂环)键。在这些条件下，天然存在的氨基酸的侧链不具反应性。第二，所述选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白质成为可能：衍生化蛋白质现可制备为指定的同源产物。第三，实现本文所述的含二羰基试剂与本文所述的含酮胺多肽的反应所需的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除反应目的是破坏所述三级结构的情形外)。第四，反应在室温下迅速发生，这允许使用将在较高温度下不稳定的许多类型的多肽或试剂。第五，反应易于在水性条件下发生，这也允许使用与非水溶液不相容(在任何程度上)的多肽和试剂。第六，即使当多肽或氨基酸与试剂的比率为约1:1或大致接近1:1时，反应也易于发生，从而不需要加入过量的试剂或多肽来获得有用量的反应产物。第七，可视反应物中酮胺和二羰基部分的设计而区域选择性和/或区域特异性地产生所得杂环。最后，含二羰基试剂与含酮胺氨基酸的反应产生在生物条件下稳定的杂环(包括含氮杂环)键。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为可与本文所述的含二羰基试剂反应且可用于进一步修饰含酮胺非天然氨基酸多肽的含酮胺氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
G为
T1为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T4为羰基保护基，包括但不限于 其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR、-OAc、-SR、-N(R)2、-N(R)(Ac)、-N(R)(OMe)或N3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
在一个实施例中，多个连接基化学物可与经酮胺取代的非天然氨基酸多肽位点特异性反应。在一个实施例中，本文所述的连接基方法利用在至少一个连接基末端含有二羰基官能团的连接基(单、双或多官能性)。二羰基衍生化的连接基与经酮胺取代的蛋白质的反应产生稳定的杂环(包括含氮杂环)键。双和/或多官能性连接基(例如，具有一个或一个以上其它连接化学物的二羰基)允许位点特异性连接不同分子(例如，其它蛋白质、聚合物或小分子)与非天然氨基酸多肽，而单官能性连接基(在所有末端均经二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接基策略与本文所述的活体内翻译技术组合，使得可能指定经化学操作的蛋白质的三维结构。
G.添加官能团的实例：与非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物
可使用本文所述的组合物、方法、技术和策略实现对本文所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。所述修饰包括将其它官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括但不限于所需官能团。作为本文所述的组合物、方法、技术和策略的说明性非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同时应了解相关组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时利用适当修饰且所属领域技术人员可利用本文的揭示内容进行)添加其它官能团，包括但不限于上文所述的官能团。
可将多种大分子聚合物和其它分子与本文所述的非天然氨基酸多肽偶合，以调节非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)的生物特性和/或对非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)提供新颖生物特性。可将这些大分子聚合物经由非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能取代基或者添加到非天然氨基酸的任何取代基或官能团与非天然氨基酸多肽偶合。
可将水溶性聚合物与并入本文所述的多肽(天然或合成)、聚核苷酸、多糖或合成聚合物中的非天然氨基酸偶合。可通过并入多肽中的非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能团或取代基或者添加到非天然氨基酸的任何官能团或取代基偶合水溶性聚合物。在一些情况下，本文所述的非天然氨基酸多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物偶合的非天然氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物偶合的天然存在的氨基酸。亲水性聚合物与生物活性分子的共价连接代表着增加生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水分子)的水溶性(诸如，在生理环境下)、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的一种方法。所述亲水聚合物的其它重要特征包括生物可相容性、无毒性和无免疫原性。对于最终产品制剂的治疗用途来说，聚合物优选将为医药学上可接受的。
亲水性聚合物的实例包括但不限于聚烷基醚和其烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羟基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖、纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；壳多糖和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基壳多糖、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸酯；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉(pullulan)和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物、聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。水溶性聚合物可为任何结构形式，包括但不限于线性、叉状或分枝形式。在一些实施例中，具有约2到约300个末端的水溶性聚合物主链特别有用。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的线性聚合物，各末端与可相同或不同的官能团键结。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。所属领域技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表决不详尽且仅为说明性的，并且预期具有上述质量的所有聚合物材料都适用于本文所述的方法和组合物中。
如上文所述，亲水性聚合物的一个实例为聚乙二醇，缩写为PEG，其已广泛用于医药或人工移植物中以及生物可相容性、无毒性和无免疫原性相当重要的其它应用中。本文所述的聚合物:多肽实施例将PEG用作亲水性聚合物的实例，同时应了解可类似地将其它亲水性聚合物用于所述实施例中。
PEG为众所周知的水溶性聚合物，其可在市面上有售或可根据所属领域众所周知的方法通过使乙二醇开环聚合来制备(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3卷,第138-161页)。PEG通常澄清，无色，无臭，可溶于水，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质并且通常无毒。认为聚(乙二醇)为生物可相容的，据悉PEG能够与活组织或有机体共存而不引起危害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，据悉PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有某种所需功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于遮蔽试剂并且可减少或消除任何免疫反应，从而使有机体可忍受所述试剂的存在。PEG连结物不倾向于产生实质免疫反应或引起凝固或其它不合需要的作用。
术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑PEG的尺寸或其末端的修饰)，并且可由下式表示为与非天然氨基酸多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为约2到约10,000且X为H或末端修饰，包括但不限于C1-4烷基、保护基或末端修饰基。术语PEG包括但不限于任何形式的聚乙二醇，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、分枝PEG(各链具有约1kDa到约100kDa、约1kDa到约50kDa或约1kDa到约20kDa的分子量)、侧接PEG(即，具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)或具有可降解键的PEG。在一个实施例中，n为约20到约2000的PEG适用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。PEG聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da和约1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。在其它实施例中，支链PEG的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括但不限于)ShearwaterPolymers,Inc.目录、NektarTherapeutics目录中，其以引用方式并入本文中。
文献中末端官能团的特定实例包括但不限于碳酸N-琥珀酰亚胺基酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看，Buckmann等人Makromol.Chem.182:1379(1981)；Zalipsky等人Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看，Andresz等人Makromol.Chem.179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如参看，Olson等人PolyethyleneglycolChemistry&BiologicalApplications,第170-181页,Harris&Zalipsky编,ACS,Washington,D.C.,1997；还参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如参看，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看，美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看，美国专利第5,650,234号)、缩水甘油基醚(例如参看，Pitha等人Eur.JBiochem.94:11(1979),Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参看，Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983)；Tondelli等人J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看，Veronese,等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；和Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(例如参看，Harris等人J.Polym.Sci.Chem.编22:341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看，Goodson等人BioTechnology8:343(1990)；Romani等人ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984))和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、原吡啶基二硫化物(例如参看，Woghiren等人Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看，Sawhney等人,Macromolecules,26:581(1993))、乙烯基亚砜(例如参看，美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都以全文引用的方式并入本文中。
在一些情况下，PEG在一个末端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括但不限于马来酰亚胺基、活性碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然氨基酸中所存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括但不限于二胺和二羰基)。
应注意，在上式中以Y表示的PEG的另一末端将直接或经由非天然氨基酸间接连接到多肽(合成或天然)、聚核苷酸、多糖或合成聚合物。当Y为二胺基时，那么含二胺的PEG试剂可与多肽中含二羰基的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。当Y为二胺基时，那么含二胺的PEG试剂还可与多肽中含酮炔的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。当Y为二羰基时，那么含二羰基的PEG试剂可与多肽中含二胺的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。当Y为二羰基时，那么含二羰基的PEG试剂还可与多肽中含酮胺的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。当Y为酮炔基时，那么含酮炔基的PEG试剂可与多肽中含二胺的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。当Y为酮胺基时，那么含酮胺的PEG试剂可与多肽中含二羰基的非天然氨基酸反应以形成经由杂环(包括含氮杂环)键与多肽连接的PEG基团。适当反应条件、纯化方法和试剂的实例描述于本说明书全文和附图中。图17提供以下实例：i)含二羰基非天然氨基酸多肽与含二胺的PEG试剂形成与PEG基团连接的含杂环非天然氨基酸多肽的反应；ii)含二胺非天然氨基酸多肽与含二羰基的PEG试剂形成与PEG基团连接的含杂环非天然氨基酸多肽的反应；和iii)含酮炔非天然氨基酸多肽与含二胺的PEG试剂形成与PEG基团连接的含杂环非天然氨基酸多肽的反应。此外，图23提供蛋白质聚乙二醇化的非限制性实例，其中含二胺的PEG试剂与并入蛋白质中的含二羰基非天然氨基酸反应，从而形成杂环键。
仅举例来说且不打算限制可用于本文所述的组合物、方法、技术和策略的PEG试剂的类型或类别，图18提供形成含二胺的PEG试剂或经保护形式的含二胺PEG试剂或经遮蔽形式的含二胺PEG试剂的合成方法的说明性实例。此外，图19提供形成含二羰基PEG试剂或经保护形式的含二羰基PEG试剂或经遮蔽形式的含二羰基PEG试剂的合成方法的说明性实例。另外，图20提供形成双官能PEG试剂或经保护形式的双官能PEG试剂或经遮蔽形式的双官能PEG试剂的合成方法的说明性实例，而图21提供形成双官能连接基或经保护形式的双官能连接基或经遮蔽形式的双官能连接基的合成方法的说明性实例。此外，图22提供形成三官能PEG试剂或经保护形式的三官能PEG试剂或经遮蔽形式的三官能PEG试剂的合成方法的说明性实例。
当需要将不同分子与聚合物各末端连接时，异双官能衍生物也特别有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许将具有活性亲电基团(诸如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)的分子与PEG的一个末端连接并且将具有乙炔基的分子与PEG的另一末端连接。
在一些实施例中，亲核基团(包括但不限于二胺)可与非天然氨基酸中所存在的二羰基反应以形成杂环(包括含氮杂环)，其在一些情况下可通过用适当的试剂处理而经历进一步反应。或者，可经由非天然氨基酸将亲核基团并入多肽中并且将其用于优先与水溶性聚合物中所存在的二羰基反应。一般来说，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然氨基酸反应。
因此，在一些实施例中，经由非天然氨基酸侧链将包含非天然氨基酸的多肽与水溶性聚合物(诸如，聚乙二醇(PEG))连接。本文所述的非天然氨基酸、方法和组合物提供利用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的特别有效的方法，其涉及响应选择密码子将非天然氨基酸(包括但不限于含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸)选择性并入蛋白质中，且随后利用适当的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。各种已知的化学方法都适用于本文所述的非天然氨基酸方法和组合物以将水溶性聚合物并入蛋白质中。
聚合物主链可为线性或分枝。所属领域一般已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中央分枝核心部分和与中央分枝核心连接的多个线性聚合物链。PEG是以分枝形式使用，所述分枝形式可通过将环氧乙烷与各种多元醇(诸如，甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成来制备。中央分枝部分也可从若干氨基酸(诸如，赖氨酸)衍生。分枝聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R是自核心部分衍生，诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇，且m表示臂的数量。多臂PEG分子(诸如，美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596、WO96/21469和WO93/21259中所述的分子，各专利以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为以PEG(-YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为连接基，且Z为通过指定长度的原子链与CH连接的活性末端基团。另一分枝形式侧接PEG具有沿PEG主链而不是在PEG链末端的反应性基团(诸如羧基)。
除这些形式的PEG外，聚合物还可经制备成在主链中具有弱键或可降解键。举例来说，PEG可经制备成在聚合物主链中具有易于水解的酯键。如本文所示，此水解导致聚合物裂解成具有较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包括所属领域已知的所有形式，包括但不限于本文所揭示的形式。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
为使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常PEG聚合物连接相关的有利特征，诸如增加的水溶性和循环半衰期，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
本文所述的方法和组合物可用于产生实质上均质的聚合物:蛋白质连结物制剂。如本文所使用，“实质上均质”意思指据观察聚合物:蛋白质连结物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质连结物具有生物活性并且本文所提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化多肽制剂为足够均质以展现均质制剂的优势(例如，便利临床应用中每批与每批之间药物动力学的可预计性)的多肽制剂。
还可选择制备聚合物:蛋白质连结物分子的混合物，且本文所提供的优势在于可选择欲包括在混合物中的单一聚合物:蛋白质连结物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数量的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物并且将所述连结物与使用本文所述的方法制备的单一聚合物:蛋白质连结物组合，且得到具有预定的单一聚合物:蛋白质连结物比例的混合物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，它们在反应混合物中的浓度也将变化。一般来说，可通过所选择的聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量确定最佳比率(就反应效率来说，因为存在极少量过量的未反应的蛋白质或聚合物)。就分子量来说，通常聚合物的分子量越高，那么可与蛋白质连接的聚合物分子的数量就越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑聚合物的分枝情况。一般来说，分子量越高(或分枝越多)，那么聚合物:蛋白质的比率就越高。
如本文所使用且当涵盖亲水性聚合物:多肽/蛋白质连结物时，术语“治疗有效量”进一步指使对患者的所需益处增加的量。所述量将随个体的不同而不同，且将视多种因素(包括患者的总体身体情况和欲治疗的疾病、病症或病状的潜在病因)而定。可由所属领域技术人员使用公开可用的材料和程序来容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
可调节本文所述的与经修饰或未经修饰非天然氨基酸多肽连接的水溶性聚合物的数量(即，聚乙二醇化或糖基化的程度)以提供改变(包括但不限于增加或降低)的药理学、药物动力学或药效学特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，多肽的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约2倍、约5倍、约10倍、约50倍或至少约100倍。
在一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端二胺部分的PEG衍生物修饰包含含羰基或二羰基非天然氨基酸的多肽。在另一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端二胺部分的PEG衍生物修饰包含含酮炔非天然氨基酸的多肽。
在一些实施例中，二胺末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-CH2-NH-MH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为约2到约10且n为约100到约1,000(即，平均分子量介于约5到约40kDa之间)。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端酮胺部分的PEG衍生物修饰包含含二羰基非天然氨基酸的多肽。
在一些实施例中，酮胺末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C(O)-CH2-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为约2到10且n为约100到约1,000(即，平均分子量介于约5到约40kDa之间)。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端二羰基部分的PEG衍生物修饰包含含二胺氨基酸的多肽。在另一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端二羰基部分的PEG衍生物修饰包含含酮胺氨基酸的多肽。
在一些实施例中，二羰基末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-CH2-C(O)-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为约2到约10且n为约100到约1,000(即，平均分子量介于约5到约40kDa之间)。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端酮炔部分的PEG衍生物修饰包含含二胺氨基酸的多肽。
在一些实施例中，酮炔末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-C≡C-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为约2到约10且n为约100到约1,000(即，平均分子量介于约5到约40kDa之间)。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一实施例中，用含有末端二胺部分的分枝PEG衍生物修饰包含含羰基或二羰基氨基酸的多肽，其中分枝PEG的各条链的分子量在约10到约40kDa的范围内且在其它实施例中为约5到约20kDa。分枝聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用含有末端二羰基部分的分枝PEG衍生物修饰包含含二胺非天然氨基酸的多肽。分枝聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用含有末端二羰基部分的分枝PEG衍生物修饰包含含酮胺非天然氨基酸的多肽。分枝聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用含有末端二胺部分的分枝PEG衍生物修饰包含含酮烷基非天然氨基酸的多肽。分枝聚合物的分子量可在广泛范围内，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于约100,000Da、约95,000Da、约90,000Da、约85,000Da、约80,000Da、约75,000Da、约70,000Da、约65,000Da、约60,000Da、约55,000Da、约50,000Da、约45,000Da、约40,000Da、约35,000Da、约30,000Da、约25,000Da、约20,000Da、约15,000Da、约10,000Da、约9,000Da、约8,000Da、约7,000Da、约6,000Da、约5,000Da、约4,000Da、约3,000Da、约2,000Da、约1,000Da、约900Da、约800Da、约700Da、约600Da、约500Da、约400Da、约300Da、约200Da和约100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约2,000Da到约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含二羰基非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有二胺基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-CH2-MH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含二羰基非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有酮胺基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CN2CH2O)n-O-(CH2)m-C(O)-CH2-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含二胺非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有二羰基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-CH2-C(O)-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含二胺非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有酮炔基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-C≡C-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含酮胺非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有二羰基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-CH2-C(O)-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
在另一个实施例中，用至少一种具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含含酮烷基非天然氨基酸的多肽。在一些实施例中，含有二胺基的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-CH2-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为约2到约10且n为约100到约1,000。
可使用有关PEG官能化和连结的若干评论和专题文章。例如参看Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,MethodsinEnzymology135:30-65(1987)；Wong等人,EnzymeMicrob.Technol.14:866-874(1992)；Delgado等人,CriticalReviewsinTherapeutic.DrugCarrierSystems9:249-304(1992)；Zalipsky,BioconjugateChem.6:150-165(1995)。
聚合物活化的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189，且有关活性聚合物与酶之间的连结，所述酶包括但不限于凝结因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:141-152(1985))，所有文献都以全文引用的方式并入本文中。
必要时，可通过一种或一种以上所属领域技术人员已知的程序进一步纯化由疏水性色谱获得的本文所述的聚乙二醇化非天然氨基酸多肽，所述程序包括但不限于亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(包括但不限于使用DEAESEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(包括但不限于使用SEPHADEXG-75)、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差示溶解(包括但不限于硫酸铵沉淀)或萃取。可通过GPC经由与球蛋白标准物比较来估算表观分子量(PrenetaAZ,PROTEIN PURIFICATIONMETHODS,APRACTICALAPPROACH(Harris&Angal编)IRLPress1989,293-306)。可通过蛋白水解降解(包括但不限于胰蛋白酶裂解)随后质谱分析来评定非天然氨基酸多肽:PEG连结物的纯度。PepinskyR.B.等人,J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
与本文所述多肽的非天然氨基酸连接的水溶性聚合物可在不受限制的情况下经进一步衍生化或取代。
G.增强对血清白蛋白的亲和力
还可将各种分子与本文所述的非天然氨基酸多肽融合以调节血清半衰期。在一些实施例中，将分子与本文所述的经修饰或为经修饰的非天然氨基酸多肽连接或融合以增强对动物体内的内源血清白蛋白的亲和力。
举例来说，在一些情况下，制备多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括但不限于来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277(1):534-542(1996)和Sjolander等人,J,Immunol.Methods201:115-123(1997))或白蛋白结合肽(诸如Dennis等人,J.Biol.Chem.277(38):35035-35043(2002)中所述的肽)。
在其它实施例中，利用脂肪酸将本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人,Biochem.J.312:725-731(1995)。
在其它实施例中，将本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽与血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白)直接融合。所属领域技术人员将认识到，还可将多种其它分子与如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽连接以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
H.本文所述的非天然氨基酸多肽的糖基化
本文所述的方法和组合物包括并入一个或一个以上带有糖残基的非天然氨基酸的多肽。糖残基可为天然(包括但不限于N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包括但不限于3-氟半乳糖)。可通过N-或O-连接配糖键(包括但不限于N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括但不限于杂环(包括含氮杂环)键或相应的C-或S-连接糖苷)将糖与非天然氨基酸连接在一起。
可将糖(包括但不限于糖基)部分在活体内或活体外添加到非天然氨基酸多肽中。在一些实施例中，用经二胺基衍生化的糖修饰包含含二羰基非天然氨基酸的多肽以产生经由杂环(包括含氮杂环)键连接的相应糖基化多肽。在其它实施例中，用经二羰基衍生化的糖修饰包含含二胺非天然氨基酸的多肽以产生经由杂环(包括含氮杂环)键连接的相应糖基化多肽。与非天然氨基酸连接后，可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步修饰糖以产生与非天然氨基酸多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人,J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
I.连接基的用途和应用，包括多肽二聚体和多聚体
除将官能团直接添加到非天然氨基酸多肽外，还可首先用多官能性(例如，二、三、四)连接基分子修饰多肽的非天然氨基酸部分，随后进一步修饰。也就是说，多官能性连接基分子的至少一个末端与多肽中的至少一个非天然氨基酸反应且多官能性连接基的至少另一末端可用于进一步官能化。如果多官能性连接基的所有末端相同，那么(视化学计量条件而定)可形成非天然氨基酸多肽的同多聚体。如果多官能性连接基的末端具有不同的化学反应性，那么多官能性连接基的至少一个末端将与非天然氨基酸多肽结合且另一末端可随后与不同官能团反应，仅举例来说，所述官能团包括所需官能团。
多官能性连接基具有以下通用结构：
其中：
各X独立地为-J-R、-K-R、-G-C≡-R或-C(O)-CH2-NR2；其中；
J为 其中：
R8独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
R9独立地选自H、烷基、经取代烷基、环烷基、经取代环烷基或胺保护基；
T1为键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基或视情况经取代的杂烷基；
T2为视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基；
其中各可选取代基独立地选自低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
K为
G为
各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
T1和T2独立地为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
L和M独立地为键结、H、低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基，或者L和M可一起形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基；
T3为键结、C(R)(R)、O或S；
T4为其中各X1独立地选自由以下各基团组成的群组：-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-N(Ac)-和-N(OMe)-；X2为-OR'、-OAc、-SR、-N(R')2、-N(R')(Ac)、-N(R')(OMe)或N3；
各L独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR'C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-N(R")C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-；
L1为可选的，且当存在时，L1为-C(R')P-NR'-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p为0、1或2；
W为-J-R、-K-R、-G-C≡C-R或-C(O)-CH2-NR2；且n为1到3。
图20提供合成双官能同型连接基(homolinker)的说明性实例，其中所述连接基具有两个相同的末端，即二胺基。所述连接基可用于形成含二羰基非天然氨基酸多肽的同二聚体以形成两个杂环键。或者，如果所述连接基的一个末端经保护，那么可使用所述经部分保护的连接基以经由杂环键将未经保护的二胺末端与含二羰基非天然氨基酸多肽结合，从而留下可用于在去保护后的其它连接反应的另一经保护末端。另外，尽管会出现所需异二聚体将很可能被一些同二聚体污染的结果，但小心处理化学计量的试剂可提供类似结果(异二聚体)。
图24提供通过将两种蛋白质经由双官能同型连接基偶合来进行蛋白质衍生化的说明性实例，其中仅举例来说，所述连接基为PEG连接基。
图21提供合成异双官能连接基的说明性实例，其中所述连接基具有两个不同的末端，仅举例来说，二胺基和羟胺基。此外，图25和图27提供在多步骤合成中使用异双官能连接基将PEG基团与非天然氨基酸多肽连接的说明性实例。在第一步骤中，如此说明性图式中所述，含羰基非天然氨基酸多肽与含羟胺双官能连接基反应以形成含肟非天然氨基酸多肽。然而，双官能连接基仍保留二胺官能团，其在第二步骤中可与含二羰基的PEG试剂反应以经由杂环键形成聚乙二醇化的非天然氨基酸多肽。
图22提供合成三官能连接基的说明性实例，其中所述连接基具有三个不同的官能团，仅举例来说，二胺基和两个羟胺基。此外，图26提供在多步骤合成中使用三官能连接基将PEG基团与非天然氨基酸多肽二聚体连接的说明性实例。在第一步骤中，如此说明性图式中所述，含羰基非天然氨基酸多肽与三官能连接基的羟胺部分反应以形成含肟非天然氨基酸多肽二聚体。然而，三官能连接基仍保留二胺官能团，其在第二步骤中可与含二羰基的PEG试剂反应以经由杂环键形成聚乙二醇化的非天然氨基酸多肽二聚体。
本文所述的方法和组合物还提供多肽组合，诸如同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体(即，三聚体、四聚体等)。仅举例来说，以下描述集中在GH超基因家族成员，然而，本节中所述的方法、技术和组合物可应用于可提供二聚体和多聚体形式的益处的几乎任何其它多肽，仅举例来说，包括所需多肽。
因此，本文所述的方法、技术和组合物内涵盖含有一个或一个以上非天然氨基酸的GH超基因家族成员，其与另一GH超基因家族成员或其变体或者为非GH超基因家族成员或其变体的任何其它多肽的多肽主链直接结合或经由连接基结合。由于与单体相比，GH超基因家族成员二聚体或多聚体连结物的分子量有所增加，故其可展现新颖或所需的特性，包括但不限于相对于单体GH超基因家族成员不同的药理学、药物动力学、药效学；经调节的治疗半衰期；或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本文所述的GH超基因家族成员将调节GH超基因家族成员受体的二聚化。在其它实施里种，本文所述的GH超基因家族成员二聚体或多聚体将充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽是直接连接，包括但不限于经由Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键。在一些实施例中，连接的GH超基因家族成员多肽和/或连接的非GH超基因家族成员将包含不同的非天然氨基酸以促进二聚化，包括但不限于包含含二羰基非天然氨基酸的第一GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽与包含含二胺非天然氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽连结，且所述多肽经由相应杂环(包括含氮杂环)的形成来反应。
或者，两个GH超基因家族成员多肽和/或连接的非GH超基因家族成员是经由连接基连接。可使用任何异双官能连接基或同双官能连接基来连接两个GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽，其可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将GH超基因家族成员和/或连接的非GH超基因家族成员多肽连接在一起的连接基可为双官能PEG试剂。
在一些实施例中，本文所述的方法和组合物提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接基，其包括：a)聚合物主链至少第一末端上的含叠氮基、炔、肼、二胺、酰肼、羟胺或羰基(包括二羰基)部分；和b)聚合物主链第二末端上的至少第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不可与第一官能团反应。在一些实施例中，本文所述的方法和组合物提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树突状。
在一些实施例中，本文所述的方法和组合物提供包含一个或一个以上GH超基因家族成员的多聚体，其是由与水溶性活性聚合物的反应而形成，其具有以下结构：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，
其中n为约5到约3,000，m为约2到约10，X可为含叠氮基、炔、肼、二胺、酰肼、羟胺、乙酰基或羰基(包括二羰基)部分，且R为可与X相同或不同的封端基、官能团或离去基团。R可为例如选自由以下各基团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃和酮。在另一实施例中，可使用连接基来连接转录因子。基因需要多种转录因子来有效启动编码蛋白的表达。可经由如上文所述的连接基连接利用非天然氨基酸合成的转录因子并且用于增强靶基因的人工活化。经连接的转录因子可在不存在正常活化信号级联的情况下结合靶DNA并促进RNA聚合酶的募集，从而在无所需信号的情况下表达基因。在另一实施例中，可连接细胞受体的配体以有效活化受体。血小板来源的生长因子(PDGF)形成二聚体以便结合其受体。可在二聚体形成中经由如上文所述的连接基连接含有非天然氨基酸的PDGF并投药以提供PDGF受体的有效结合。连接的蛋白质的其它实施例包括连接的抗体。可连接两种不同的抗体(各自对相同或相邻靶上的独特表位具特异性)以用于增强的刺激、结合或中和。举例来说，可连接对HIV的gp120和所缔合的gp40上所发现的两种不同表位具特异性的抗体以提供对靶更为有效的中和。类似地，连接的抗体可用于刺激细胞表面受体。举例来说，可连接针对T细胞受体的CD3以及CD4的抗体以提供受体活化的必要刺激物。另一实施例包括与核酸连接的肽。举例来说，可将结合细胞表面的细胞受体或蛋白质的配体与投与所需靶的治疗性核酸连接。所述连接的配体促进核酸的摄取，随后所述核酸在细胞内表达从而发挥其治疗作用。类似地，可将肽与核酸连接以促进核酸的包装或缩合。
连接基上的官能团不必相同，也不必为二胺基。使用本说明书通篇详述的化学，所属领域技术人员可设计一种连接基，其中至少一个官能团可与非天然氨基酸多肽形成杂环(包括含氮杂环基)；连接基上的另一官能团可利用其它已知的化学，包括有机化学领域众所周知的基于亲核/亲电试剂的化学。
J.添加官能团的实例：便利多肽的分离特性
天然存在或非天然氨基酸多肽可能出于多种原因(包括但不限于多肽的溶解性或结合特征)而难以从样本中分离。举例来说，在制备供治疗用的多肽中，所述多肽可从已经工程改造以过度产生多肽的重组系统中分离。然而，由于多肽的溶解性或结合特征，故达到所需纯度水平通常证实很难。本文所述的方法、组合物、技术和策略提供有关此情况的解决方法。
使用本文所述的方法、组合物、技术和策略，所属领域技术人员可制造与所需多肽同源的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽具有未经证明的分离特征。在一个实施例中，通过生物合成方法产生同源的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，已将非天然氨基酸并入本文所述的非天然氨基酸之一的结构中。在其它或额外实施例中，将非天然氨基酸并入末端或内部位置处且进一步经位点特异性地并入。
在一个实施例中，如通过生物合成方法产生的所得非天然氨基酸已具有所需的经改进分离特征。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含与提供改进的分离特征的基团的杂环(包括含氮杂环)键。在其它或额外实施例中，对非天然氨基酸进一步修饰以形成经修饰的含杂环(包括含氮杂环)非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改进的分离特征的基团的杂环(包括含氮杂环)键。在一些实施例中，所述基团与非天然氨基酸直接连接，且在其它实施例中，所述基团经由连接基与非天然氨基酸连接。在某些实施例中，通过单一化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接。优选将赋予改进的分离特征的基团与非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸位点特异性地连接，且在所利用的反应条件下并不与天然存在的氨基酸连接。
另一方面为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的具有式(XXXVIII)或(XXXIX)结构的同源非天然氨基酸多肽：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，且其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
Z1为键结、CR7R7、O、S、NR'、CR7R7-CR7R7、CR7R7-O、O-CR7R7、CR7R7-S、S-CR7R7、CR7R7-NR'、NR'-CR7R7；
Z2选自由以下各基团组成的群组：键结、-C(O)-、-C(S)-、视情况经取代的C1-C3亚烷基、视情况经取代的C1-C3亚烯基和视情况经取代的杂烷基；
R6和各R7独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或任何两个相邻的R7基团一起形成视情况经取代的5元到8元杂环、环烷基或芳环；其中所述可选取代基选自卤素、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤基-C1-6烷基、卤基-C1-6烷氧基、芳基、卤芳基和杂芳基；
条件是Z1加Z2提供不超过3个环原子；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸是并入多肽内的特定位点处。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸是使用翻译系统并入多肽中。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸是使用翻译后修饰系统并入多肽中。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统包含：
(i)编码多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含与非天然氨基酸的预先设计的并入位点对应的选择密码子；和
(ii)包含非天然氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对所述选择密码子具特异性。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述聚核苷酸为翻译系统中所产生的mRNA。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统包含包括所述聚核苷酸的质粒DNA或噬菌体DNA或基因组DNA。其它或额外实施例为检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述聚核苷酸稳定整合到基因组DNA中。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统包含对选自由以下密码子组成的群组的选择密码子具特异性的tRNA：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统包含正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述聚核苷酸是由核糖体合成。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统为包含选自以下有机体群组的细胞的活体内翻译系统：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、假单胞菌属、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫和原生生物。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述翻译系统为包含来自细菌细胞、古细菌细胞或真核细胞的细胞提取物的活体外翻译系统。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述多肽的非天然氨基酸在介于约2的pH值与约8的pH值之间在水溶液中可稳定约1个月。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸可稳定约至少2周。另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸可稳定约至少5天。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述多肽为与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源的蛋白质。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸具有式(XLI)或(XLII)结构：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)N(R')2、-OR'、C(O)R'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3，且其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基。
另一实施例为一种检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸具有以下结构：
在其它或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，本节中所述的方法、技术和组合物可应用于可从改进的分离特征获益的几乎任何其它多肽，仅举例来说，其包括所需多肽。
在其它或额外实施例中，赋予改进的分离特征的基团改进多肽的水溶性；在其它实施例中，所述基团改进多肽的结合特性；在其它实施例中，所述基团为多肽提供新的结合特性(仅举例来说，包括生物素基团或生物素结合基团)。在所述基团改进多肽的水溶性的实施例中，所述基团选自本文所述的水溶性聚合物，仅举例来说，包括本文所述的任何PEG聚合物基团。
K.添加官能团的实例：检测多肽的存在
天然存在或非天然氨基酸多肽可能出于多种原因(包括但不限于缺乏易于与多肽结合的试剂或标记)而难以在样本(包括活体内样本和活体外样本)中检测。本文所述的方法、组合物、技术和策略提供对于此情况的解决方法。
使用本文所述的方法、组合物、技术和策略，所属领域技术人员可制造与所需多肽同源的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽允许检测活体内样本和活体外样本中的多肽。在一个实施例中，通过生物合成方法产生同源的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，已将非天然氨基酸并入本文所述的非天然氨基酸之一的结构中。在其它或额外实施例中，将非天然氨基酸并入末端或内部位置处且进一步经位点特异性地并入。
在一个实施例中，如通过生物合成方法产生的所得非天然氨基酸多肽已具有所需的检测特征。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一个选自由以下各物组成的群组的非天然氨基酸以提供改进的检测特征：含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸、含二胺非天然氨基酸、含酮胺非天然氨基酸、含酮炔非天然氨基酸和含杂环(包括含氮杂环)氨基酸。在其它实施例中，已通过生物合成方法将所述非天然氨基酸并入如本文所述的多肽中。在其它或替代性实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-LXVII的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含与提供改进的检测特征的基团的杂环键。在其它或额外实施例中，对非天然氨基酸进一步修饰以形成经修饰的含杂环(包括含氮杂环)非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改进的检测特征的基团的杂环(包括含氮杂环)键。在一些实施例中，所述基团与非天然氨基酸直接连接，且在其它实施例中，所述基团经由连接基与非天然氨基酸连接。在某些实施例中，通过单一化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接。优选将赋予改进的检测特征的基团与非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸位点特异性地连接，且在所利用的反应条件下并不与天然存在的氨基酸连接。
在其它或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，本节中所述的方法、技术和组合物可应用于需要在活体内样本和活体外样本中检测的几乎任何其它多肽，仅举例来说，其包括所需多肽。
在其它或额外实施例中，赋予改进的检测特征的基团选自由以下各基团组成的群组：标记、染料、亲和标记、光亲和标记、自旋标记、荧光团、放射性部分、并有重原子的部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、发色团、能量转移剂、可检测标记和其任何组合。
在一个实施例中，对抗体进行工程改造以使其含有放射性标记并且抗体识别癌细胞上的独特抗原。将放射性标记与位于抗体内的非天然氨基酸连接。在利用放射性标记经由非天然氨基酸标记抗体并纯化经标记抗体之后，将其投与怀疑患有可由经标记抗体识别的癌症的个体。在投与经标记抗体之后，患者体内经标记抗体的存在和位置可确定癌组织的存在。所属领域技术人员可利用此系统确定适当的抗原和癌细胞类型以供检测。类似地，所属领域技术人员可根据经由非天然氨基酸与抗体连接的放射性标记的类型来确定适当的检测技术。投与经标记抗体允许检测患者体内的癌症、个体体内的转移和/或对个体体内癌症的治疗的功效。
在另一实施例中，对与细胞表面上的抗原结合的肽进行工程改造以使其含有可用于在对个体投与肽后追踪所述肽的染料，包括但不限于荧光染料。所述染料经由位于肽内的非天然氨基酸与肽连接，并且将所述肽投与个体。利用所属领域技术人员易于鉴别的成像或检测技术实现肽与其配体的定位或结合。
在另一实施例中，经由位于肽、多肽或蛋白质内的非天然氨基酸将金属基团或含金属部分与肽、多肽或蛋白质连接。将适当标记的肽、多肽或蛋白质投与所需个体以经由所属领域技术人员已知的技术检测和成像。通过这些经标记肽、多肽或蛋白质，可使各种疾病、代谢路径、生理结构或细胞组分成像。所属领域技术人员可确定用于标记的适当靶以及检测或成像方法。举例来说，可使用磁共振成像(MRI)来检测个体体内经标记肽、多肽或蛋白质的存在。
L.添加官能团的实例：改进多肽的治疗特性
天然存在或非天然氨基酸多肽将能够对患有特定病症、疾病或病状的患者提供特定治疗益处。所述治疗益处将视多种因素而定，仅举例来说包括：多肽的安全性特征和多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、治疗半衰期、免疫原性、生物活性或循环时间)。此外，可能有利的是对多肽提供其它官能团，诸如连接的细胞毒性化合物或药物；或可能需要连接其它多肽以形成本文所述的同多聚体和异多聚体。所述修饰优选不会破坏原始多肽的活性和/或三级结构。本文所述的方法、组合物、技术和策略提供针对这些问题的解决方法。
使用本文所述的方法、组合物、技术和策略，所属领域技术人员可制造与所需多肽同源的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽具有改进的治疗特征。在一个实施例中，通过生物合成方法产生同源的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，已将非天然氨基酸并入本文所述的非天然氨基酸之一的结构中。在其它或额外实施例中，将非天然氨基酸并入末端或内部位置处且进一步经位点特异性地并入。
在一个实施例中，如通过生物合成方法产生的所得非天然氨基酸已具有所需的经改进治疗特征。在其它或额外实施例中，非天然氨基酸包含与提供改进的治疗特征的基团的杂环(包括含氮杂环)键。在其它或额外实施例中，对非天然氨基酸进一步修饰以形成经修饰的含杂环(包括含氮杂环)非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改进的治疗特征的基团的杂环(包括含氮杂环)键。在一些实施例中，所述基团与非天然氨基酸直接连接，且在其它实施例中，所述基团经由连接基与非天然氨基酸连接。在某些实施例中，通过单一化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团与非天然氨基酸连接。优选将赋予改进的治疗特征的基团与非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸位点特异性地连接，且在所利用的反应条件下并不与天然存在的氨基酸连接。
在其它或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，本节中所述的方法、技术和组合物可应用于可从改进的治疗特征获益的几乎任何其它多肽，仅举例来说，其包括所需多肽。
在其它或额外实施例中，赋予改进的治疗特征的基团改进多肽的水溶性；在其它实施例中，所述基团改进多肽的结合特性；在其它实施例中，所述基团为多肽提供新的结合特性(仅举例来说，包括生物素基团或生物素结合基团)。在所述基团改进多肽的水溶性的实施例中，所述基团选自本文所述的水溶性聚合物，仅举例来说，包括PEG聚合物基团。在其它或额外实施例中，所述基团为细胞毒性化合物，而在其它实施例中，所述基团为药物。在其它实施例中，可从非天然氨基酸多肽裂解连接的药物或细胞毒性化合物以便将药物或细胞毒性化合物传递到所需治疗位置。在其它实施例中，所述基团为第二多肽，例如包括含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，另外包括例如具有与第一非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构的多肽。
在其它或额外实施例中，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽为经修饰的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的生物可用性增加。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的安全性特征增加。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的水溶性增加。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的治疗半衰期增加。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的血清半衰期增加。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽使多肽的循环时间延长。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽调节多肽的生物活性。在其它或额外实施例中，相对于同源的天然存在的氨基酸多肽，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
XI.经修饰多肽的治疗用途
为方便起见，已一般性地和/或利用特定实例描述本节中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽。然而，本节中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽不应仅限于本节中所提供的通用描述或特定实例，而是本节中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽同样适用于包含至少一个在式I-LXVII范围内的非天然氨基酸的所有经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽，包括本说明书、权利要求书和图式中所述的在式I-LXVII范围内的任何子式或特定化合物。
本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括其同多聚体和异多聚体)具有多种用途，包括但不限于：治疗、诊断、基于检定、工业、化妆品、植物学、环境、能量产生、消费品和/或军事用途。作为非限制性说明，提供经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可用于治疗多种病症、病状或疾病。投与本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品会在人体内引起市售多肽制剂所展现的活性中的任一种。经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品的平均量可变化且尤其应建立在执业医师的推荐和处方的基础之上。经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的确切量是个见仁见智的问题，其是以诸如所治疗病状的确切类型、所治疗患者的情况以及组合物中其它成分的因素为依据。所属领域技术人员根据利用经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的疗法可容易地确定欲给予的量。
A.投药和医药组合物
如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括但不限于合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况(包括但不限于)与适当的医药载剂组合用于治疗用途。举例来说，所述组合物包含治疗有效量的如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。调配物经制备成与投药模式相适应。一般来说，所属领域众所周知投与蛋白质的方法并且其可应用于投与如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽。
根据所属领域众所周知的方法，视情况在一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物疾病模型中测试包含一个或一个以上如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的治疗性组合物，以确定功效、组织代谢并评估剂量。具体来说，最初可通过非天然与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它适当量度(包括但不限于比较经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽)(即在相关检定中)来确定剂量。
投药可通过通常用于将分子引入以使其与血液或组织细胞紧密接触的任何途径进行。如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽是以任何适当的方式视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投与。对患者投与如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的适当方法都可用，且尽管可使用一种以上途径投与特定组合物，但特定途径通常能够提供比另一途径更快捷且更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在多种本文所述的医药组合物的适当调配物。
可通过任何适用于蛋白质或肽的常规途径来投与本文所述的非天然氨基酸多肽和包含所述多肽的组合物，所述途径包括但不限于不经肠途径，例如包括但不限于皮下或静脉内注射的注射或者任何其它注射或输注形式。多肽医药组合物(包括本文所述的各种非天然氨基酸多肽)可通过多种途径投与，包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经由脂质体投与包含如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所属领域技术人员通常已知所述投药途径和适当的调配物。本文所述的非天然氨基酸多肽可单独使用或与其它适当组分(包括但不限于医药载剂)组合使用。
单独或与其它适当组分组合的如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽也可制成气雾剂调配物(即，其可“成雾状”)以经由吸入投与。可将气雾剂调配物放入加压可接受推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
适于不经肠投药(诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性等张无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定受体的血液等张的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供经包装核酸的调配物。
不经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体来说，已经用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括但不限于通常用于EPO、IFN、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学上传递蛋白质的途径)以及当前使用的调配物提供如本文所述的经修饰或未经修饰非天然氨基酸多肽的优选投药途径以及调配物。
在本文所述的组合物和方法的情况中，投与患者的剂量足以在患者体内随时间引起有益的治疗反应。通过特定调配物的功效、所使用的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也通过在特定患者体内伴随特定组合物的投药的任何不利副作用的存在、性质和程度等来确定。
在确定疾病(包括但不限于癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)的治疗或预防中欲投与的调配物的有效量时，医师评价循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如投与70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而调整。本文所述的医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，包括抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。
对于投药，本文所述的医药调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50确定的速率投与，和/或包括但不限于当应用于患者的质量和总体健康状况时，观察各种浓度的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的任何副作用。投药可以单次剂量或分剂量实现。
如果经历调配物输注的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。在将进行输注之前30分钟，对经历输注反应(诸如发烧、肌肉疼痛和寒战)的患者预先给予阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。将哌替啶(Meperidine)用于不能对解热剂和抗组织胺快速反应的更为严重的寒战和肌肉疼痛。视反应的严重程度减缓或中断细胞输注。
如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可直接投与哺乳动物个体。投药可通过通常用于将多肽引入个体的任何途径。如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽包括适于经口、经直肠、局部、吸入(包括但不限于经由气雾剂)、口腔(包括但不限于舌下)、经阴道、不经肠(包括但不限于皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，包括气道表面)和透皮投药，但在任何指定情况下最适合的途径将视所治疗病状的性质和严重程度而定。投药可为局部的或全身的。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供调配物。如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可与医药学上可接受的载剂制备成单位剂量可注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)的混合物。如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽还可通过连续输注(包括但不限于使用微型泵，诸如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物投与。
适于投药的调配物包括水性和非水性溶液、等张无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。溶液和悬浮液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备而来。
冷冻干燥是用于将水从所关注的蛋白质制剂中去除的提供蛋白质的常用技术。冷冻干燥或冻干是首先将欲干燥的材料冷冻且随后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的过程。预先冻干的调配物中可包括赋形剂以在冷冻干燥过程中增强稳定性和/或改进储存时冻干产物的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
所属领域技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说，参看DrugDev.Ind.Pharm,18(11&12),1169-1206(1992)中Broadhead,J.等人,"TheSprayDryingofPharmaceuticals"。除小分子药物外，也已将多种生物材料喷雾干燥并且这些材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。由于喷雾干燥可将液态医药制剂以单步骤工艺转化成无粉尘或团聚细粉，所以喷雾干燥为有用技术。基本技术包含以下四个步骤：a)使进料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；c)干燥喷雾；和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其以全文引用的方式并入本文中)中描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
本文所述的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在本文所述的经修饰或未经修饰非天然氨基酸多肽的医药组合物的多种适当调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(例如参看Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版(Easton,Pa.:MackPublishingCompany,1995)；Hoover,JohnE.,Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.andLachman,L.编,PharmaceuticalDosageForms,MarcelDecker,NewYork,N.Y.,1980；和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,第7版(LippincottWilliams&Wilkins,1999))。适当载剂包括缓冲液，其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量多肽，包括但不限于小于约10个残基的多肽；蛋白质，包括但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括但不限于EDTA和依地酸二钠(edentatedisodium)；二价金属离子，包括但不限于锌、钴或铜；糖醇，包括但不限于甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，包括但不限于钠；和/或非离子表面活性剂，包括但不限于TweenTM(包括但不限于Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普流尼克酸(pluronicacid)(包括但不限于普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188))或PEG。适当的表面活性剂例如包括但不限于以聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)(即，(PPO-PEO-PPO))或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich.)销售并进一步描述于美国专利第4,820,352号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适当的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于使聚乙二醇化非天然氨基酸多肽对一种或一种以上应力(包括但不限于由搅动产生的应力)稳定。上述一些物质可称为“增积剂(bulkingagent)”。一些也可称为“张力改变剂(tonicitymodifier)”。抗菌防腐剂还可应用于产物稳定性和抗菌功效；适当防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和酚或其组合。
如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括与诸如PEG的水溶性聚合物连接的多肽)还可以通过持续释放系统或作为持续释放系统的部分投与。持续释放组合物包括(包括但不限于)成形物件形式的半渗透性聚合物基质，包括但不限于薄膜或微囊。持续释放基质包括生物可相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:267-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人,Biopolymers,22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。可通过以下本身已知的方法制备含有化合物的脂质体：DE3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP143,949；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号、第4,619,794号、第5,021,234号和第4,544,545号；以及EP102,324。
可通过例如DE3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci..U.S.A.,11:4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP143,949；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号、第4,619,794号、第5,021,234号和第4,544,545号；以及EP102,324中所述的方法来制备脂质体包埋的多肽。脂质体的组成和尺寸已为人们所熟知或者能够凭所属领域技术人员的经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于例如ParkJW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1327-1331(1995)；LasicD和PapahadjopoulosD(编):MEDICALAPPLICATIONSOFLIPOSOMES(1998)；DrummondDC等人,Liposomaldrugdeliverysystemsforcancertherapy,TeicherB(编):CANCERDRUGDISCOVERYANDDEVELOPMENT(2002)；ParkJW等人,Clin.CancerRes.8:1172-1181(2002)；NielsenUB等人,Biochim.Biophys.Acta1591(1-3):109-118(2002)；MamotC等人,CancerRes.63:3154-3161(2003)中。
在本文所述的组合物、调配物和方法的情况中，投与患者的剂量应足以随时间在个体体内引起有益的反应。一般来说，每剂不经肠投与的如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤体重约0.05毫克到每公斤患者体重约1毫克的范围内，但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据，并且可以比批准用于人类的市售产品频率更高或更低。一般来说，如本文所述的聚合物:多肽连结物(仅举例来说包括聚乙二醇化多肽)可通过上述投药途径中的任一种投与。
XII.经修饰多肽的结构-功能关系
如本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括但不限于合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)将赋予其所处的多肽不同的物理和化学特征。所述特征的有效性将视非天然氨基酸的结构、非天然氨基酸上修饰的结构或二者而定，且可经由评定测试多肽的结构-功能关系的实验模型加以评估。
在任何指定的实验模型中，用非天然氨基酸取代所需多肽或蛋白质中的天然氨基酸。在表达含有非天然氨基酸的肽或蛋白质后，利用替代R基团文库使蛋白质衍生化。这些R基团可与多肽或蛋白质内所含的非天然氨基酸反应。通过与经置换氨基酸的R基团的结构或化学相似性来选择R基团文库。在将新颖R基团添加到蛋白质内的非天然氨基酸中之后，接着针对适当测试系统内的功能或活性来筛选蛋白质。举例来说，在蛋白质内用非天然氨基酸置换苯丙氨酸。随后将与苯丙氨酸的R基团具有相似特征的替代性R基团文库添加到非天然氨基酸中。将单一替代性R基团添加到非天然R基团中，所添加的R基团包括赋予(但不限于)相似化学和结构特征的环、杂环、共轭环或其它化学部分。随后通过在所属领域技术人员容易确定的适当实验模型中测试来筛选衍生化蛋白质的与新近取代的非天然氨基酸的添加有关的功能。实验模型的实例包括但不限于基础检定(basedassay)、无细胞检定、基于细胞的检定、组织培养物模型和动物模型。
在另一实施例中，将吲哚取代于非天然氨基酸上以用于药物发现中的药效团活性或在检测中作为有用的荧光核。为促进所述添加，利用优化的两步骤反应通过在室温下在水性缓冲液中进行吲哚形成来将基于吲哚的R基团或适用于吲哚合成的R基团添加到非天然氨基酸中。在此反应后，筛选衍生化蛋白质的所需活性。
举例来说，可在庞贝氏病(Pompedisease)小鼠模型中评估酸α葡糖苷酶(GAA)中非天然氨基酸取代对减轻庞贝氏病的作用。可经由本文所揭示的本发明产生并表达在酶内所选位点处含有各种氨基酸取代的GAA分子文库。随后可在庞贝氏病的小鼠模型(经繁殖成GAA遗传缺陷(GAA-/-)的小鼠)中评估如本文所揭示的未经修饰或经翻译后修饰形式的含非天然氨基酸的酶的活性。可经静脉内、经口或允许有效蛋白质输送和吸收的任何其它投药途径投与含有非天然氨基酸的酶。可通过小鼠体内的糖原降解和/或清除率的测量；GAA的血清含量的评定；心脏肥大、心肌病、骨骼肌病或其它所属领域技术人员易于鉴别和监测的标志的改变或降低来评估投药功效、酶半衰期和庞贝氏病的减轻。
本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可用于多种工业应用中。使用本文所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品会引起市售多肽制剂在工业应用中所展现的活性中的任一种。
举例来说，可用非天然氨基酸修饰用于产生乙醇的酶并且检定其功能的改变。可经由本文所揭示的本发明产生和表达含有各种非天然氨基酸取代的醇脱氢酶II和丙酮酸脱羧酶文库。随后可针对非天然氨基酸取代所赋予或引起的醇产生效率的改变来筛选经非天然氨基酸修饰的酶。可通过所属领域内众所周知的技术容易地筛选(但不限于)对底物的亲和力和转化率的增加且将所述增加应用于乙醇的工业制造中。
本文所揭示的本发明的工业应用的其它实例包括除草剂和杀虫剂的环境清除。用使常用除草剂莠去津(atrazine)代谢的酶来促进从受污染的土壤中去除莠去津，从而使土壤无毒。可经由本文所揭示的本发明产生和表达含有非天然氨基酸取代的经修饰莠去津氯水解酶文库。随后可针对使环境中所发现的莠去津脱氯的能力的改变以及非天然氨基酸取代所赋予或引起的莠去津代谢的任何新模式来筛选经非天然氨基酸修饰的莠去津氯水解酶的文库。如前文所述，可经由所属领域内众所周知的技术评定酶效率的改变，包括但不限于莠去津或中间物代谢的增加。
实例
实例1 的合成
所使用的合成描述于以下反应方案中：
a)的合成
0℃下向1-对甲苯肼(5.0g，31mmol)于吡啶(50mL)中的溶液中加入Ac2O(30mL，318mmol)。在室温下将混合物搅拌整夜并且用MeOH(100mL)中止反应。在真空中去除溶剂后，通过快速色谱法(二氧化硅，20-50％EtOAc/己烷)纯化残余物以得到无色油状物(6.72g，87％)：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.28(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝8.4Hz,2H),2.47(s,6H),2.40(s,3H),2.14(s,3H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ171.8,169.5,139.1,138.8,130.4,126.4,25.4,22.3,21.3。
b)的合成
向N',N'-二乙酰基-N-对甲苯基乙酰肼(6.4g，25.8mmol)于CCl4(300mL)中的溶液中加入N-溴代琥珀酰亚胺(5.1g，28.7mmol)。在回流下加热混合物。加入2,2'-偶氮双异丁腈(AIBN，0.2g，1.2mmol)。在回流下将所得混合物搅拌36小时并冷却到室温。将混合物用H2O和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到呈褐色油状物的溴化物(8.62g)。不经纯化即将粗产物直接用于下一步骤中。
c)的合成
向EtONa(2.3g，32.1mmol)于EtOH(80mL)中的溶液中加入2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(6.3g，29.0mmol)。在0℃下将所得混合物搅拌20分钟。一次性加入N',N'-二乙酰基-N-(4-(溴甲基)苯基)乙酰肼(8.62g，26.4mmol)。在80℃下将混合物加热整夜并冷却到室温。将柠檬酸(10g，50mmol)加到反应混合物中。去除大部分溶剂后，用EtOAc(500mL)稀释残余物。将混合物用H2O和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱法(二氧化硅，15-80％EtOAc/己烷)纯化残余物以得到呈黄色油状物的2-(4-(乙酰胺基)苯甲基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(4.17g，两步骤35％)：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.23(d,J＝8.0Hz,2H),7.03(d,J＝8.0Hz,2H),6.57(s,1H),4.29-4.20(m,4H),3.65(m,2H),2.41(s,6H),2.08(s,3H),2.01(s,3H),1.27(t,J＝3.6Hz,6H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ171.7,169.3,169.2,167.4,140.3,136.4,131.3,126.2,67.2,63.0,37.4,25.3,23.2,22.3,14.2。
d)的合成
向2-(4-(乙酰胺基)苯甲基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(572mg，1.24mmol)于二噁烷(15mL)中的溶液中加入HCl(12N，15mL)。在回流下将所得混合物加热整夜并于真空中浓缩。向残余物中加入MeOH(1mL)。加入乙醚(200mL)以沉淀呈固体状的产物(231mg，81％)：1HNMR(500MHz,D2O)δ7.28(d,J＝8.5Hz,2H),7.00(d,J＝8.5Hz,2H),4.21(dd,J＝7.4,5.7Hz,1H),3.26(dd,J＝9.2,5.7Hz,1H),3.15(dd,J＝14.7,7.4Hz,1H)；13CNMR(125MHz,D2O)δ171.5,142.9,130.3,129.0,115.7,54.1,34.7。
实例2 的合成
所使用的合成描述于以下反应方案中：
a)的合成
0℃下向NaOH溶液(40mL，25体积％)中加入乙醚(60mL)。将防暴屏蔽放在反应瓶前面。经3分钟分3份向所得混合物中加入N-亚硝基-N-甲基脲(6.0g，57.9mmol)。在0℃下将反应搅拌10分钟。随后使乙醚与氢氧化钠层分离。经5分钟将有机层逐份(约6次添加)加入N-Boc-4-羟甲基苯丙氨酸(7.5g，25.4mmol)于无水THF(20mL)中的溶液中，直到原材料已完全消失(通过TLC监测)。随后加入5滴冰乙酸以中止反应。通过旋转蒸发去除有机溶剂后，加入乙酸乙酯。将有机层用饱和NaHCO3溶液、H2O和盐水连续洗涤，随后用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩以得到呈白色粉末状的产物(5.9g，75％)：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.27(d,J＝8.0Hz,2H),7.09(d,J＝8.0Hz,2H),5.01(d,J＝7.9Hz,1H),4.63(s,2H),4.55(dt,J＝7.7,6.2Hz,1H),3.69(s,3H),3.10(dd,J＝13.8,5.7Hz,1H),3.02(dd,J＝13.8,6.0Hz,1H),2.02(brs,1H),1.40(s,9H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ172.5,155.3,139.9,135.5,129.6,127.4,80.1,65.0,54.6,52.4,38.1,28.4。
b)的合成
0℃下向醇(6.0g，19.4mmol)和吡啶(12mL，150mmol)于CH2Cl2(400mL)中的经搅拌溶液中加入戴斯-马丁高碘烷(14.2g，33.4mmol)。室温下将混合物搅拌整夜。随后通过加入饱和Na2S2O3-NaHCO3水溶液(1:1，300mL)中止反应且用CH2Cl2萃取。将有机层合并并用H2O和盐水洗涤，随后用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速色谱法(二氧化硅，1:100-1:1己烷:EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的醛产物(5.48g，92％)：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ9.98(s,1H),7.81(d,J＝7.8Hz,2H),7.30(d,J＝7.8Hz,2H),5.04(d,J＝7.8Hz,1H),4.62(dt,J＝7.2,6.2Hz,1H),3.71(s,3H),3.21(dd,J＝13.7,5.7Hz,1H),3.10(dd,J＝13.7,6.4Hz,1H),1.40(s,9H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ192.1,172.1,155.2,143.7,135.5,130.3,130.1,80.4,54.4,52.6,38.9,28.5。
c)的合成
向上述醛(3.07g，10mmol)于己烷(150mL)中的溶液中加入肼基甲酸叔丁酯。在回流下将所得混合物加热1小时且浓缩。向残余物中加入BH3·THF(1M，10mL，10mmol)。在室温下将混合物搅拌15分钟且通过加入饱和NaHCO3溶液中止反应。用EtOAc萃取混合物。将有机层用H2O和盐水洗涤，随后用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速色谱法(二氧化硅，2:1-1:2己烷:EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的产物(3.1g，73％)。
d)的合成
0℃下向上述甲酯(1.3g，3.1mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中加入LiOH(10mL，1N)。在相同温度下将混合物搅拌1小时且通过加入柠檬酸溶液(5％，200mL)中止反应。用EtOAc萃取混合物。将有机层用H2O和盐水洗涤，随后用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到呈固体状的酸(1.08g，86％)。
e)的合成
0℃下向上述酸(1.0g，2.4mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中加入三氟乙酸(20mL)。在0℃下将反应混合物搅拌2小时且在真空中浓缩。向残余物中加入MeOH(1mL)，随后加入HCl(2.0mL，4N于二噁烷中)。加入乙醚(200mL)以沉淀呈固体状的产物(0.4g，80％)。
实例3
本实例详细说明图5中所提供的含二羰基氨基酸的合成。如图5中所述制备含二羰基的非天然氨基酸。
实例4
本实例详细说明图6中所提供的含二羰基氨基酸的合成。如图6中所述制备含二羰基的非天然氨基酸。
实例5
本实例详细说明图7中所提供的含二胺氨基酸的合成。如图7中所述制备含二胺的非天然氨基酸。
实例6
本实例详细说明图8中所提供的含二胺氨基酸的合成。如图8中所述制备含二胺的非天然氨基酸。
实例7自含二羰基氨基酸和含二胺试剂形成吡唑。
向甲基肼(0.15mL)于tris缓冲液(pH8.5，10mM)中的溶液中加入二酮。在室温下将混合物搅拌3小时且通过加入柠檬酸溶液(5％)中止反应。用EtOAc萃取所得混合物。将有机层用H2O和盐水洗涤，随后用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱法(二氧化硅，10:1-1:1己烷:EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的产物(约3:1的异构体比率，117mg，81％)。
实例8
本实例详细说明如图9中所提供用含二羰基试剂修饰含二胺氨基酸。
实例9
本实例详细说明如图10中所提供用含二羰基试剂修饰含二胺氨基酸。
实例10
本实例详细说明如图12中所提供用含二胺试剂修饰含二羰基氨基酸。
实例11
本实例详细说明如图18中所提供的二胺官能化PEG连接基的合成。
实例12
本实例详细说明如图19中所提供的二羰基官能化PEG连接基的合成。
实例13
本实例详细说明如图20中所提供的二胺双官能化PEG连接基的合成。
实例14
本实例详细说明如图21中所提供的异双官能化连接基的合成。
实例15
本实例详细说明如图22中所述的三官能化连接基的合成。
实例16
本实例详细说明如图23中所提供用含二胺PEG试剂使hGH聚乙二醇化。
实例17
本实例详细说明如图24中所提供用含二胺双官能PEG连接基使两个hGH多肽二聚化。
实例18
本实例详细说明如图25中所提供用异双官能化连接基使hGH聚乙二醇化。
实例19
本实例详细说明如图26中所提供用含羟胺三官能连接基使两个hGH多肽二聚化，随后使hGH二聚体聚乙二醇化。
实例20
本实例详细说明经修饰多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。使用引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然氨基酸的多肽。O-RS优先利用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接着，翻译系统响应编码的选择密码子将非天然氨基酸插入多肽中。可用于并入非天然氨基酸的O-tRNA和O-RS的氨基酸和聚核苷酸序列描述于名为“InVivoIncorporationofUnnaturalAminoAcids”的美国专利申请案第10/126,927号和名为“MethodsandCompositionsfortheProductionofOrthogonaltRNA-AminoacyltRNASynthetasePairs”的美国专利第申请案第10/126,931号中，所述专利以引用的方式并入本文中。还可使用以下O-RS和O-tRNA序列：
用含有经修饰基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌，从而将非天然氨基酸位点特异性地并入多肽中。37℃下在含有介于约0.01到约100mM之间的特定非天然氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌以高保真度和效率表达经修饰多肽。大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体的形式产生His标记的含有非天然氨基酸的多肽。将聚集体在变性条件下于6M盐酸胍中溶解并亲和纯化。通过在约4℃下于约50mMTRIS-HCl(约pH8.0)和约40μMCuSO4以及约2％(w/v)月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)中透析整夜来进行再折叠。随后对约20mMTRIS-HCl(约pH8.0)和约100mMNaCl以及约2mMCaCl2透析材料，随后去除His标签。参看Boissel等人,(1993)268:15983-93。纯化多肽的方法在所属领域中众所周知并且通过SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾电离离子阱质谱等加以证实。
以下实例描述测量和比较经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性与治疗活性天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性的方法。
实例21：细胞结合检定
0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)未经标记的GH、hGH或GM-CSF的情况下以及在存在125I-GH(约100,000cpm或1ng)的情况下，一式两份将细胞(3×106个)培育于PBS/1％BSA(100μl)中达90分钟(总体积：120μl)。随后将细胞再悬浮并平铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上并离心(1000g；1分钟)。通过截去管末端来收集离心块并在γ计数器(Packard)中对离心块和上清液单独计数。
以在不存在竞争剂的情况下的总结合(一式两份的平均值)减去在存在100倍过量的未经标记的GH的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)来确定特异性结合(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。使用同一种125I-GH制剂在不同的日子执行实验并且其应显现内在一致性。125I-GH展现与GH受体产生细胞的结合。未经标记的天然GH或hGH以剂量依赖性方式抑制结合，而GM-CSF或其它阴性对照则不然。与天然GH类似，hGH竞争与天然125I-GH的结合的能力表明所述受体同样识别两种形式。
实例22：经由杂环键使hGH聚乙二醇化的活体内研究
对小鼠或大鼠投与PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液。结果将表明，与未经修饰的hGH相比，本发明的聚乙二醇化hGH具有更高的活性和延长的半衰期，这是通过显著增加的体重所表明。
实例23：连结和非连结的hGH和其变体的活体内半衰期的测量
所有动物实验都是在AAALAC授权的设施中并且根据St.LouisUniversity的实验动物管理及使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)所批准的方案进行。将大鼠个别圈养在具有12小时白天/黑夜循环的房间里的笼子中。向动物提供经过检验的Purina啮齿动物食品5001并且任其自由饮用水。对于去垂体大鼠，饮用水中另外含有5％葡萄糖。
实例24：药物动力学研究
在进入动物实验之前，通过三个检定来评估各聚乙二醇化突变体hGH的质量。通过在非还原条件下用MESSDS跑胶缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)将4-12％丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝胶跑胶来检验PEG-hGH(经由杂环键聚乙二醇化)的纯度。用考马斯蓝(Coomassieblue)将凝胶染色。根据密度测定扫描，PEG-hGH的谱带大于95％纯。通过使用来自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)的KTA2试剂盒的动力学LAL检定来测试各PEG-hGH中的内毒素含量，并且所述含量每剂小于5EU。利用IM-9pSTAT5生物检定评定PEG-hGH的生物活性，且经确认EC50值小于15nM。
在从CharlesRiverLaboratories获得的雄性Sprague-Dawley大鼠(261-425g)中将PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学特性彼此相比较以及与未经聚乙二醇化的生长激素相比较。经手术将导管安装到颈动脉中以供血液收集。在成功安装导管后，在给药前将动物分到治疗组(每组三到六只)中。对动物经皮下给予0.41-0.55ml/kg剂量体积的1mg/kg化合物。在各个时间点时，经由内置导管收集血液样本并且将其放入涂布有EDTA的微量离心管中。离心后收集血浆并在-80℃下储存直到分析。使用来自BioSourceInternational(Camarillo,CA)或DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,TX)的抗体夹心生长激素ELISA试剂盒测量化合物浓度。使用与所给予的类似物对应的标准物计算浓度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版本)估算药物动力学参数。使用利用linear-up/log-down梯形积分的非房室模型分析并且对浓度数据均匀加权。
在对大鼠单次皮下给药后，在规律间隔下获得血浆浓度。给予大鼠(每组n＝3-6只)1mg/kg蛋白质的单次剂量。将hGH野生型蛋白(WHOhGH)、His标记的hGH多肽(his-hGH)或在6个不同位置的每一个处包含与30kDaPEG共价连接的非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的经His标记的hGH多肽与WHOhGH和(his)-hGH相比较。在规律时间间隔下取得血浆样本并且如所述评定所注射的化合物。下表展示单剂量投与各种hGH多肽的药物动力学参数值。通过非房室模型分析(Pharsight，4.1版本)评估浓度-时间曲线。所展示的值为平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；终末t1/2：终末半衰期；AUC0->inf：外推到无穷大的浓度-时间曲线下面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；和Vz/f：末期期间的表观分布体积。据观察，与对照hGH相比，30KPEG-pAF92(his)hGH使循环明显延长、增加血清半衰期并且增加生物可用性。
表：对正常雄性Sprague-Dawley大鼠单次皮下投与单次剂量1mg/kg的药物动力学参数值
实例25：药效研究
从CharlesRiverLaboratories获得去垂体雄性Sprague-Dawley大鼠。在3-4周龄时手术去除垂体。使动物适应新环境三周的时间，在此期间监测体重。包括在治疗开始前在7天时间内体重增量为0-8g的动物并将其随机分到治疗组中。对大鼠经皮下投与单次剂量或每日剂量。在整个研究过程中，每日且连续地对大鼠称重，麻醉，抽血并给药(当适用时)。使用肝素化毛细管从眼窝窦收集血液并将其放入涂布有EDTA的微量离心管中。通过离心分离血浆并在-80℃下储存直到分析。绘制平均(+/-S.D.)血浆浓度对时间间隔的图。
肽IGF-1为生长调节素或类胰岛素生长因子家族的成员。IGF-1介导生长激素的许多生长促进作用。使用竞争性结合酶免疫检定试剂盒针对所提供的大鼠/小鼠IGF-1标准物(DiagnosicSystemsLaboratories)测量IGF-1浓度。使大鼠去垂体。经皮下给予大鼠(每组n＝5-7只)单次剂量或每日剂量。每日连续地对大鼠称重，麻醉，抽血并给药(当适用时)。取得安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)、His标记的hGH((his)hGH)和在第35位和第92位包含与30kDaPEG共价连接的对乙酰基苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。据观察第9天时30KPEG-pAF35(his)hGH化合物引起的体重增加在统计学上不同于30KPEG-pAF92(his)hGH化合物(p<0.0005)，因为观察到较高的体重增加。使用双尾分布、不成对、相等方差，通过t检验来测定在投与单剂量包含经聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽后具有显著差异的循环血浆IGF-1含量的影响。
实例26：包含非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化hGH(经由杂环键聚乙二醇化) 的安全性和/或功效的人类临床试验
目的比较皮下投与的包含非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化重组人hGH的安全性和药物动力学与一种或一种以上市售hGH产品(包括但不限于HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))的安全性和药物动力学。
患者本研究中登记18名年龄在20-40岁范围内并且体重介于60-90kg的健康志愿者。个体将无临床上显著异常的血液学或血清化学实验室值，以及具有阴性尿液毒理学筛选、HIV筛选和乙型肝炎表面抗原。他们不应具有以下迹象中的任一者：高血压；任何原发性血液病病史；显著的肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖器、代谢、神经疾病的病史；贫血或癫痫病症的病史；对细菌或哺乳动物来源的产物、PEG或人类血清白蛋白的已知敏感性；习惯并且频繁消费含有咖啡因(caffeine)的饮料；参与任何其它临床试验或在研究开始的30天内输过血或献过血；在研究开始的3个月内暴露于hGH；在研究开始的7天内生病；以及在研究前身体检查时或在研究开始的14天内的临床实验室评估时具有显著异常。可针对安全性评估所有个体，并且如期收集所有血液收集物以供药物动力学分析。所有研究都是在伦理委员会(institutionalethicscommittee)批准和患者同意的情况下进行。
研究设计这将为健康男性志愿者中的阶段I、单中心、开放标记、随机、两个周期轮换的研究。将18名个体随机分到两个治疗序列组的一个中(每组9名个体)。经两个单独给药期使用相等剂量的包含非天然编码的氨基酸的聚乙二醇化hGH和所选市售产品在大腿上部通过单次皮下注射来投与GH。市售产品的投药剂量和频率遵循包装标签中的指示。需要时可通过包括其它个体组而将使用市售产品的其它给药、给药频率或其它参数加到研究中。每一给药期间隔14天的缓冲期(washoutperiod)。在两个给药期中的每一个中给药之前至少12小时和之后72小时而不是在给药期之间，将个体局限在研究中心。如果同时欲测试聚乙二醇化hGH的其它给药、频率或其它参数，那么可添加其它个体组。批准供人类使用的多种GH调配物可用于这项研究中。HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)为批准供人类使用的市售GH产品。hGH的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH。
血液取样在投与hGH之前和之后通过直接静脉穿刺抽取一系列血液。在给药前约30分钟、20分钟和10分钟时(3个基线样本)和给药后大致以下时间时获得静脉血液样本(5mL)以用于测定血清GH浓度：30分钟和1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时。将各血清样本分成两个等分试样。所有血清样本都是在-20℃下储存。血清样本在干冰上运送。在第1天起始剂量之前立即、第4天早晨、第16天给药之前立即以及第19天早晨进行禁食临床实验室试验(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法使用ELISA试剂盒程序(DiagnosticSystemsLaboratory[DSL],WebsterTX)测定血清GH浓度。
安全性测定在每次给药(第1天和第16天)前和每次给药后6、24、48和72小时时立即记录生命指征。安全性测定是建立在不利事件的发生率和类型以及临床实验室试验相比基线的改变的基础上。此外，评估生命指征测量(包括血压)和身体检查结果相比研究前的改变。
数据分析通过从各给药后值减去经由对来自给药前30、20和10分钟时收集的三个样本的GH含量取平均值而测定的平均基线GH浓度，来针对给药前基线GH浓度校正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检定的定量水平，那么所述给药前血清GH浓度不包括在平均值的计算中。由针对基线GH浓度校正的血清浓度数据确定药物动力学参数。在DigitalEquipmentCorporationVAX8600计算机系统上使用最新版本的BIOAVL软件通过模型独立方法计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(tmax)；使用线性梯形法则计算的从时间零点到最后一次血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及自消除率常数计算的终末消除半衰期(t1/2)。消除率常数是通过线性浓度对数-时间曲线图的终末线性区域中邻近数据点的线性回归来估算。针对每一次治疗计算药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保存的调配物/非保存的调配物)。
安全性结果不利事件的发生率在治疗组之间均等分布。与基线或研究前临床实验室试验或血压相比不存在临床上显著的改变，并且身体检查结果和生命指征测量值与研究前相比不存在明显改变。两个治疗组的安全性特征应看起来相似。
药物动力学结果在所测量的每一时间点时，将在接收单次剂量的一种或一种以上市售hGH产品(包括但不限于HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))之后所有18名个体的平均血清GH浓度-时间曲线(未针对基线GH含量校正)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH相比较。所有个体的给药前基线GH浓度应在正常生理范围内。由针对给药前平均基线GH浓度校正的血清数据确定药物动力学参数，并且确定Cmax和tmax。所选临床对照试剂(HumatropeTM(EliLilly&Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)、Saizen/SerostimTM(Serono))的平均tmax显著小于包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的tmax。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的终末半衰期相比，所测试的市售hGH产品的终末半衰期值显著较小。
尽管本研究是在健康男性个体中进行，但预期在其他患者群体中将存在类似的吸收特征和安全性特征，所述群体诸如：患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、处于自体预存程序(autologouspredepositprogram)中的患者或预定可选手术的患者。
总之，皮下投与单次剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH将是安全的并且为健康男性个体良好耐受。基于相当的不利事件发生率、临床实验室值、生命指征和身体检查结果，市售形式的hGH和包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的安全性特征将是相等的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH潜在地为患者以及健康护理提供者提供重大临床效用。
实例27：聚乙二醇化hGH与非聚乙二醇化hGH的水溶性的比较
通过测定可溶解于100μL水中的hGH野生型蛋白(WHOhGH)、His标记的hGH多肽(his-hGH)或在第92位包含与30kDaPEG共价连接的非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的His标记的hGH多肽的量来获得个别多肽的水溶性。聚乙二醇化hGH的量大于WHOhGH和hGH的量，这表明非天然氨基酸多肽的聚乙二醇化会增加水溶性。
实例28：经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠体内，随后将其分为两组。将一组每日用经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽治疗并且另一组每日用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每日测量肿瘤尺寸，且如用经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤尺寸减小所表明，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽具有改进的治疗功效。
实例29：经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠体内，随后将其分为两组。将一组每日用经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽治疗并且另一组每日用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每日测量肿瘤尺寸，且如用经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤尺寸减小所表明，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽具有改进的治疗功效。
以下实例描述测量和比较经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性与治疗活性天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性的方法。
实例30：非天然氨基酸多肽活性和亲和力的测量
本实例详细说明非天然氨基酸多肽活性以及非天然氨基酸多肽对其受体、结合搭配物或配体的亲和力的测量。
根据所属领域技术人员已知的方法表达并分离针对非天然氨基酸多肽受体、结合搭配物或配体的蛋白质。使用BiocoreTM系统分析非天然氨基酸多肽与其受体的结合。类似地，可将结合搭配物或配体用于本检定中。
如制造商所推荐，使用标准胺偶合程序将约600-800RU的可溶性受体固定于BiacoreTMCM5芯片上。在表面上以40μl/min的流率注射HBS-EP缓冲液(BiacoreTM,Pharmacia)中的各种浓度的野生型或者经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽达4-5分钟，并且在注射后监测解离达15分钟。通过4.5MMgCl2的15秒脉冲使表面再生。在至少100个再生循环后，观测到结合亲和力仅损失极少(1-5％)。使用无固定受体的参考细胞以减去任何缓冲液体积效应和非特异性结合。
利用BiaEvaluation4.1软件(BIACORETM)处理从经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽滴定实验获得的动力学结合数据。以个别速率常数的比率(koff/kon)计算平衡解离常数(Kd)。
建立表达非天然氨基酸多肽的受体、结合搭配物或配体的稳定细胞系。利用含有受体、结合搭配物或配体cDNA的构筑体电穿孔细胞。在克隆前，使转染细胞恢复48小时。通过用针对受体的抗体表面染色来鉴别表达受体、结合搭配物或配体的转染体，并且在FACS阵列(BDBiosciences,SanDiego,CA)上加以分析。在进一步进行数轮所需转染体的重复亚克隆后，建立稳定转染的细胞克隆。将所述细胞用于细胞结合检定中。
0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)未经标记的天然氨基酸多肽或阴性对照多肽的情况下以及在存在125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽(约100,000cpm或1ng)的情况下，一式两份将细胞(3×106个)培育于PBS/1％BSA(100μl)中达90分钟(总体积：120μl)。随后将细胞再悬浮并平铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上并离心(1000g；1分钟)。通过截去管末端来收集离心块并在γ计数器(Packard)中对离心块和上清液单独计数。
以在不存在竞争剂的情况下的总结合(一式两份的平均值)减去非特异性结合来确定特异性结合(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。使用同一种125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽制剂在不同的日子执行实验并且其应显现内在一致性。125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽展现与受体、结合蛋白或配体产生细胞的结合。未经标记的天然氨基酸多肽以剂量依赖性方式抑制结合，而阴性对照多肽则不然。
实例31：经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
对小鼠或大鼠投与经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽、治疗活性天然氨基酸多肽和缓冲溶液。结果将表明，与治疗活性天然氨基酸多肽相比较，经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽具有更高的活性以及延长的半衰期。
实例32：连结和非连结的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽和其变体的活体内半衰 期的测量
所有动物实验都是在AAALAC授权的设施中并且根据St.LouisUniversity的实验动物管理及使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)所批准的方案进行。将大鼠个别圈养在具有12小时白天/黑夜循环的房间里的笼子中。向动物提供经过检验的Purina啮齿动物食品5001并且任其自由饮用水。
实例33：药物动力学研究
在进入动物实验之前，通过三个检定评估各经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的质量。通过在非还原条件下用MESSDS跑胶缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)将4-12％丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝胶跑胶来检验经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的纯度。用考马斯蓝将凝胶染色。根据密度测定扫描，经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的谱带大于95％纯。通过使用来自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)的KTA2试剂盒的动力学LAL检定来测试各经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽中的内毒素含量，并且所述含量每剂小于5EU。利用表征经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的生物活性的细胞检定来评定所述多肽的生物活性。
在从CharlesRiverLaboratories获得的雄性Sprague-Dawley大鼠(261-425g)中将经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽化合物的药物动力学特性彼此相比较以及与治疗活性天然氨基酸多肽相比较。经手术将导管安装到颈动脉中以供血液收集。在成功安装导管后，在给药前将动物分到治疗组(每组三到六只)中。对动物经皮下给予约0.41到约0.55ml/kg剂量体积的约1mg/kg化合物。在各时间点时，经由内置导管收集血液样本并且将其放入涂布有EDTA的微量离心管中。在离心后收集血浆并在-80℃下储存直到分析。使用来自BioSourceInternational(Camarillo,CA)或DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,TX)的抗体夹心ELISA试剂盒测量化合物浓度。使用与所给予的类似物对应的标准物计算浓度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版本)评估药物动力学参数。使用利用linear-up/log-down梯形积分的非房室模型分析并且对浓度数据均匀加权。随后绘制数据图以获得Cmax：最大浓度；终末t1/2：终末半衰期；AUC0->inf：外推到无穷大的浓度-时间曲线下面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；和Vz/f：末期期间的表观分布体积。
实例34：药效研究
从CharlesRiverLaboratories获得雄性Sprague-Dawley大鼠。使动物适应新环境三周的时间，在此期间监测与天然氨基酸多肽相关的生物特征。将这些生物特征具有可接受水平的改变的动物随机分到治疗组中。对大鼠皮下投与单次剂量或每日剂量的经修饰非天然氨基酸多肽。在整个研究中，将大鼠每日且依次麻醉，抽血并给药(当适用时)并且测量相关生物特征。使用肝素化毛细管从眼窝窦收集血液并将其放入涂布有EDTA的微量离心管中。通过离心分离血浆并在-80℃下储存直到分析。获得单次皮下给药后在大鼠体内的血浆浓度。
实例35：经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的安全性和/或功效的人类临床试验
目的比较皮下投与的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的安全性和药物动力学与治疗活性天然氨基酸多肽的安全性和药物动力学。
患者本研究中登记18名年龄在20-40岁范围内并且体重介于60-90kg的健康志愿者。个体将无临床上显著异常的血液学或血清化学实验室值，以及具有阴性尿液毒理学筛选、HIV筛选和乙型肝炎表面抗原。他们不应具有以下迹象中的任一者：高血压；任何原发性血液病病史；显著的肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖器、代谢、神经疾病的病史；贫血或癫痫病症的病史；对细菌或哺乳动物来源的产物、PEG或人类血清白蛋白的已知敏感性；习惯并且频繁消费含有咖啡因(caffeine)的饮料；参与任何其它临床试验或在研究开始的30天内输过血或献过血；在研究开始的3个月内暴露于治疗活性天然氨基酸多肽；在研究开始的7天内生病；以及在研究前身体检查时或在研究开始的14天内的临床实验室评估时具有显著异常。可针对安全性评估所有个体，并且如期收集所有血液收集物以供药物动力学分析。所有研究都是在伦理委员会(institutionalethicscommittee)批准和患者同意的情况下进行。
研究设计这将为健康男性志愿者中的阶段I、单中心、开放标记、随机、两个周期轮换的研究。将18名个体随机分到两个治疗序列组的一个中(每组9名个体)。经两个单独给药期使用相等剂量的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽在大腿上部通过单次皮下注射来投与治疗活性天然氨基酸多肽。需要时可通过包括其它个体组来将其它给药、给药频率或其它参数加到研究中。每一给药期间隔14天的缓冲期。在两个给药期中的每一个中给药之前至少12小时和之后72小时而不是在给药期之间，将个体局限在研究中心。如果同时欲测试经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的其它给药、频率或其它参数，那么可添加其它个体组。
血液取样在投与经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽或治疗活性天然氨基酸多肽之前和之后通过直接静脉穿刺抽取一系列血液。在给药前约30分钟、20分钟和10分钟时(3个基线样本)和给药后大致以下时间时获得静脉血液样本(5mL)以用于测定经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽或治疗活性天然氨基酸多肽的血清浓度：30分钟和1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时。将各血清样本分成两个等分试样。所有血清样本都是在-20℃下储存。血清样本在干冰上运送。在第1天起始剂量之前立即、第4天早晨、第16天给药之前立即以及第19天早晨进行禁食临床实验室试验(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法使用ELISA试剂盒程序(DiagnosticSystemsLaboratory[DSL],WebsterTX)测定血清浓度。
安全性测定在每次给药(第1天和第16天)前和每次给药后6、24、48和72小时时立即记录生命指征。安全性测定是建立在不利事件的发生率和类型以及临床实验室试验相比基线的改变的基础上。此外，评估生命指征测量(包括血压)和身体检查结果相比研究前的改变。
数据分析通过从各给药后值减去经由对来自给药前30、20和10分钟时收集的三个样本的水平取平均值而测定的平均基线浓度，来针对给药前基线浓度校正给药后血清浓度。如果给药前血清浓度低于检定的定量水平，那么所述给药前血清浓度不包括在平均值的计算中。由针对基线浓度校正的血清浓度数据确定药物动力学参数。在DigitalEquipmentCorporationVAX8600计算机系统上使用最新版本的BIOAVL软件通过模型独立方法计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(tmax)；使用线性梯形法则计算的从时间零点到最后一次血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及自消除率常数计算的终末消除半衰期(t1/2)。消除率常数是通过线性浓度对数-时间曲线图的终末线性区域中邻近数据点的线性回归来估算。针对每一次治疗计算药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保存的调配物/非保存的调配物)。
安全性结果不利事件的发生率在治疗组之间均等分布。与基线或研究前临床实验室试验或血压相比不存在临床上显著的改变，并且身体检查结果和生命指征测量值与研究前相比不存在明显改变。两个治疗组的安全性特征应看起来相似。
药物动力学结果在所测量的每一时间点时，比较在接收单次剂量的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽或治疗活性天然氨基酸多肽之后所有18名个体的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽或治疗活性天然氨基酸多肽的平均血清浓度-时间曲线(未针对基线水平校正)。所有个体的给药前基线浓度应在正常生理范围内。由针对给药前平均基线浓度校正的血清数据确定药物动力学参数，并且确定Cmax和tmax。治疗活性天然氨基酸多肽的平均tmax明显比经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的tmax短。与经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽的终末半衰期相比较，治疗活性天然氨基酸多肽的终末半衰期值明显要短。
尽管本研究是在健康男性个体中进行，但预期在其他患者群体中将存在类似的吸收特征和安全性特征，所述群体诸如：患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿科肾衰竭患者、处于自体预存程序中的患者或预定可选手术的患者。
总之，皮下投与单次剂量的经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽将是安全的并且为健康男性个体良好耐受。基于相当的不利事件发生率、临床实验室值、生命指征和身体检查结果，经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽和治疗活性天然氨基酸多肽的安全性特征将是相等的。经修饰治疗活性非天然氨基酸多肽对患者和健康护理提供者潜在地提供重大临床效用。
应了解，本文所述的实例和实施例仅出于说明性目的，并且将对所属领域技术人员提出根据所述实例和实施例的各种修改或改变，且所述修改和改变都将包括在本申请案的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。本文所引用的所有公开案、专利和专利申请案都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
序列表

Claims (41)

1.一种化合物，其包含结构1或2：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
T1为键结或CH2；且T2为CH；
其中各可选取代基独立地选自低碳烷基、经取代低碳烷基、低碳环烷基、经取代低碳环烷基、低碳烯基、经取代低碳烯基、炔基、低碳杂烷基、经取代杂烷基、低碳杂环烷基、经取代低碳杂环烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-含二胺部分一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环环烷基或杂环烷基；
或-B-含二胺部分基团一起形成包含至少一个二胺基、经保护二胺基或经遮蔽二胺基的双环或三环环烷基或环芳基或杂环烷基；
其中-A-B-含二胺部分上至少一个胺基视情况为经保护胺；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A为经取代或未经取代的低碳亚烷基，或未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中B为-O(CH2)-、-NHCH2-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苯甲氧羰基(Cbz)。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中R2为聚核苷酸。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中R2为核糖核酸(RNA)。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中R2为tRNA。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述tRNA特异性识别选择密码子。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述选择密码子选自由以下各物组成的群组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中R2为抑制tRNA。
15.根据权利要求1所述的化合物，其与结构3或4对应：
其中各Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R")2、-C(O)N(R")2、-OR"和-S(O)kR"，其中k为1、2或3，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基。
16.根据权利要求15所述的化合物，其选自由以下各物组成的群组：
或其盐；或在任何位置并入任何所述化合物的多肽。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述-B-含二胺部分上至少一个胺基经保护。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述胺保护基选自由以下各基团组成的群组：
19.根据权利要求18所述的化合物，其选自由以下各物组成的群组：
或其盐；或在任何位置并入任何所述化合物的多肽。
20.一种多肽，其并有至少一种根据权利要求1所述的化合物。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述多肽为与选自由所需多肽组成的群组的治疗性蛋白质同源的蛋白质。
22.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物可在温和条件下与含二羰基试剂在水溶液中反应。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中所述化合物与所述含二羰基试剂的反应具有以下特征中的至少一种：(i)在约4到约10的pH值范围内发生；(ii)产生在生物条件下稳定的杂环键；(iii)具有位点特异性；(iv)不会不可逆地破坏多肽的三级结构；(v)在室温下迅速发生；(vi)易于在水性条件下发生；(vii)当所述化合物与所述含二羰基试剂的比率为约1比1时易于发生；或(viii)具有区域选择性和/或区域特异性。
24.根据权利要求22所述的化合物，其中所述化合物与所述含二羰基试剂的反应具有以下特征中的至少四种：(i)在约4到约10的pH值范围内发生；(ii)产生在生物条件下稳定的杂环键；(iii)具有位点特异性；(iv)不会不可逆地破坏多肽的三级结构；(v)在室温下迅速发生；(vi)易于在水性条件下发生；(vii)当所述化合物与所述含二羰基试剂的比率为约1比1时易于发生；或(viii)具有区域选择性和/或区域特异性。
25.根据权利要求22所述的化合物，其中所述温和条件为约2到约10的pH值。
26.根据权利要求22所述的化合物，其中所述温和条件为约4到约9的pH值。
27.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物在水溶液中可稳定至少1个月。
28.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物可在约2到约10的pH值下稳定。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中所述化合物可在约4到约9的pH值下稳定。
30.根据权利要求27所述的化合物，其中所述化合物可稳定至少2周。
31.根据权利要求30所述的化合物，其中所述化合物可稳定至少5天。
32.一种化合物，其具有式(XXXVIII)或(XXXIX)的结构：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
Z1为键结、CR7R7、O、S、NR'、CR7R7-CR7R7、CR7R7-O、O-CR7R7、CR7R7-S、S-CR7R7、CR7R7-NR'、NR'-CR7R7；
R'为H、烷基或经取代烷基；
Z2选自由以下各基团组成的群组：键结、-C(O)-、-C(S)-、视情况经取代的C1-C3亚烷基、视情况经取代的C1-C3亚烯基和视情况经取代的杂烷基；
各R6和R7独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或任何两个相邻R7基团一起形成视情况经取代的5元到8元杂环、环烷基或芳环；其中所述可选取代基选自卤素、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤基-C1-6烷基、卤基-C1-6烷氧基、芳基、卤芳基和杂芳基；
条件是Z1加Z2提供不超过3个环原子；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
33.根据权利要求32所述的化合物，其具有式(XLI)或(XLII)的结构：
其中Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'-、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3。
34.根据权利要求33所述的化合物，其具有以下结构：
35.一种化合物，其具有选自由以下各结构组成的群组的结构：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
Z1为键结、CR5R5、CR5R5-CR5R5、CR5R5-O、O-CR5R5、S-CR5R5、NR5-CR5R5、CR5R5-S、CR5R5-NR5；
Z2选自由以下各基团组成的群组：视情况经取代的C1-C3亚烷基、视情况经取代的C1-C3亚烯基、视情况经取代的杂烷基和N；
Z3独立地选自由以下各基团组成的群组：键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、-O-、-S-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R')-；条件是至少一个Z3不为键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；条件是当T3为O或S时，R不可为卤素；
R6独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
条件是Z1加Z2提供不超过3个环原子；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
36.根据权利要求35所述的化合物，其选自由以下各物组成的群组：
其中Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3。
37.根据权利要求36所述的化合物，其选自由以下各物组成的群组：
38.一种化合物，其选自由以下各物组成的群组：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
Z1为键结、CR5R5、CR5R5-CR5R5、CR5R5-O、O-CR5R5、S-CR5R5、NR5-CR5R5、CR5R5-S、CR5R5-NR5；
Z3独立地选自由以下各基团组成的群组：键结、视情况经取代的C1-C4亚烷基、视情况经取代的C1-C4亚烯基、视情况经取代的杂烷基、-O-、-S-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R')-；
M2为
其中(a)表示与所述B基团的键结，且(b)表示与所述杂环基内的个别位置的键结；
M3为
其中(a)表示与所述B基团的键结，且(b)表示与所述杂环基内个别位置的键结；
M4为其中(a)表示与所述B基团的键结，且(b)表示与所述杂环基内个别位置的键结；
T3为键结、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R6独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
39.根据权利要求38所述的化合物，其选自由以下各物组成的群组：
其中Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'-、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3。
40.一种化合物，其选自由以下各物组成的群组：
其中：
A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，并且当存在时，其为在一端与含二胺部分连接的连接基，所述连接基选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)R"-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR"-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R")-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R")CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中各R"独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚环氧烷、经取代聚环氧烷、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R")2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR"、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R"、-C(O)2R"或-C(O)N(R")2，其中各R"独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X选自由所需官能团组成的群组；且L为可选的，且当存在时，其为选自由以下各基团组成的群组的连接基：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR'-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基；
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其中Ra独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)R'-、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'，其中k为1、2或3。
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