KR20080081013A - 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와관련된 방법 및 그 용도 - Google Patents

비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와관련된 방법 및 그 용도 Download PDF

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암브룩스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명에는 비천연 아미노산 및 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 그리고 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 비천연 아미노산은, 그 자체로서 또는 폴리펩티드의 일부로서, 다종 다양한 가능한 작용기들을 포함할 수 있으나, 통상적으로는 하나 이상의 복소환, 알돌계, 디카보닐 및/또는 디아민 기를 가진다. 본 발명에는 또한, 번역 후 추가로 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 이러한 변형을 수행하는 방법, 그리고 이러한 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 통상적으로, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 복소환, 알돌계, 디카보닐 및/또는 디아민 기를 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명에는 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드와 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 방법 예를 들어, 치료용, 진단용 그리고 기타 생물학적 용도로 사용하는 방법에 관하여도 개시되어 있다.

Description

비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와 관련된 방법 및 그 용도{COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES}
관련 출원
본 출원은, 모두 본원에 그 자체로서 참고 문헌으로 인용되어 있는, 2005년 12월 30일 출원된 미국 가 명세서 출원 제60/755,338호; 2005년 12월 30일 출원된 미국 가 명세서 출원 제60/755,711호; 및 2005년 12월 30일 출원된 미국 가 명세서 출원 제60/755,018호의 우선권의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 출원에는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성 규명 및 사용에 관한 기법과 기술, 그리고 이것이 사용되는 화합물 및 조성물에 관하여 개시되어 있다.
유전자에 의해 암호화되지 않는 아미노산(즉, "비천연 아미노산(non-natural amino acid)")을 단백질에 통합하는 능력으로 말미암아, 천연 생성 작용기에 대한 유용한 대안을 제공할 수 있었던 화학 작용기 예를 들어, 리신의 엡실론-NH2, 시스 테인의 설프히드릴-SH, 히스티딘의 이미노기 등을 도입할 수 있다. 임의의 화학 작용기는 20개의 일반적인, 유전자에 의해 암호화되는 아미노산에서 발견되는 작용기에 비활성인 것으로 알려져 있으나, 실제로는 비천연 아미노산에 통합될 수 있는 작용기와 완전하게 반응하여, 효율적으로 안정한 결합을 형성한다.
단백질에서는 발견되지 않으며, 20개의 일반적인, 유전자에 의해 암호화되는 아미노산에서 발견되는 작용기 모두에 대해 화학적으로 비활성이며, 임의의 작용기를 포함하는 시약과 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학 작용기들을 선택적으로 도입하는 방법이 현재 실시되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성 규명 및 사용에 관한 기법과 기술, 그리고 이것이 사용되는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 본 발명은 비천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 방법, 이와 관계된 조성물, 유도체화 기술 및 기법에 관한 것이다. 이러한 방법, 조성물, 기술 및 기법에는, 하나의 구체예에서는, 화학적 유도체화가 관련되어 있으며, 다른 구체예에서는, 생물학적 유도체화가 관련되어 있고, 다른 구체예에서는, 물리적 유도체화가, 그리고 또 다른 구체예에서는 여러 가지 유도체화가 복합적으로 관련되어 있다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 위치 선택적(regioselective)이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 위치 특이적(regiospecific)이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 비천연 아미노산 함유 시약 및 유도체화 시약 둘 다에 있어서 화학량론적이거나 또는 준 화학량론적으로 진행된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 상온에서 신속하게 진행된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 수용액 중에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 2∼약 10에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 3∼약 8에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 2∼약 9에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 4∼약 9에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 4에서 일어난다. 또 다른 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 8에서 일어난다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 유도체화는 비천연 아미노산 함유 시약 및 유도체화 시약 둘 다에 있어서 화학량론적, 준 화학량론적(near stoichiometric) 또는 유사 화학량론적(stoichiometric-like)으로 진행된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서는, 원하는 기를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 화학량론적으로, 준 화학량론적으로 또는 유사 화학량론적으로 통합할 수 있는 방법이 제공된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서는, 원하는 기를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 화학량론적으로, 준 화학량론적으로 또는 유사 화학량론적으로 통합할 수 있는 기법, 반응 혼합물, 합성 조건이 제공된다.
하나의 측면은, 디카보닐기 예를 들어, 하나 이상의 케톤기 및/또는 하나 이상의 알데히드기 및/또는 하나 이상의 에스테르기 및/또는 하나 이상의 카복실산 및/또는 하나 이상의 티오에스테르기를 함유하는 기의 반응성을 바탕으로 하는, 단백질과 펩티드의 화학적 유도체화를 위한 비천연 아미노산에 관한 것인데, 여기서, 상기 디카보닐기는 1,2-디카보닐기, 1,3-디카보닐기, 또는 1,4-디카보닐기일 수 있다. 추가의 또는 부가의 측면은, 디아민기 예를 들어, 히드라진기, 아미딘기, 이민기, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기, 그리고 1,4-디아민기의 반응성을 바탕으로 하는, 단백질과 펩티드의 화학적 유도체화를 위한 비천연 아미노산에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 전술한 비천연 아미노산 중 하나 이상은 폴리펩티드, 즉, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 그것의 측쇄 상에서 작용기화되어, 유도체화 분자와 반응하며, 그 결과, 결합 예를 들어, 복소환계 결합 예를 들어, 질소 함유 복소환 및/또는 알돌계 결합을 형성하게 된다. 추가의 또는 부가의 구체예는, 유도체화 분자와 반응하여 결합 예를 들어, 복소환계 결합 예를 들어, 질소 함유 복소환 및/또는 알돌계 결합을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 디카보닐 및/또는 디아민 측쇄를 가지는 아미노산으로부터 선택된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 마스킹된 측쇄(masked side chain) 예를 들어, 마스킹된 디아민기 및/또는 마스킹된 디카보닐기를 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 하기의 것들로부터 선택되는 기를 포함한다: 케토-아민(즉, 케톤과 아민 둘 다를 함유하는 기); 케토-알킨(즉, 케톤과 알킨 둘 다를 함유하는 기); 그리고 엔-디온(즉, 디카보닐기와 알켄을 함유 하는 기).
추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 디카보닐 측쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 카보닐은 케톤, 알데히드, 카복실산 또는 에스테르 예를 들어, 티오에스테르로부터 선택된다. 다른 구체예는, 적당히 작용기화된 시약으로 처리하였을 때, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성할 수 있는 작용기를 함유하는 비천연 아미노산에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 구조 면에 있어서 천연 아미노산과 유사하지만, 전술한 작용기 중 하나를 함유한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 페닐알라닌 또는 티로신(방향족 아미노산)과 유사한 반면에; 별개의 구체예에서, 비천연 아미노산은 알라닌 및 루신(소수성 아미노산)과 유사하다. 하나의 구체예에서, 비천연 아미노산은 천연 아미노산의 특성과 확연히 구분되는 특성을 가진다. 하나의 구체예에서, 이와 같이 확연히 구분되는 특성으로서는 측쇄의 화학 반응성이 있으며, 추가의 구체예에서, 이와 같이 확연히 구분되는 화학 반응성으로 말미암아, 동일한 폴리펩티드 중에 존재하는 천연 생성 아미노산 단위의 측쇄가 전술한 반응을 수행하지 않을 때조차도, 비천연 아미노산의 측쇄가 폴리펩티드의 단위로서 반응을 수행할 수 있게 된다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 생성 아미노산의 측쇄에 대해 화학적으로 직교 상태(orthogonal)에 있다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 친전자체 함유부를 포함하며; 다른 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 친전자체 함유부는 친핵성 공격을 수행하여, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있다. 본 문단의 전술한 구체예들 중 임의의 구체예에 있어서, 비천연 아미노산은 별도의 분자로서 존재할 수 있거나, 또는 임의의 길이를 가지는 폴리펩티드에 통합될 수 있으며, 후자의 경우, 폴리펩티드는 천연 생성 아미노산 또는 비천연 생성 아미노산을 추가로 통합할 수 있다.
다른 측면은, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 바탕으로 하는, 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생산을 위한 디아민 치환 분자에 관한 것으로서, 여기서, 상기 디아민기는 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민, 1,2-디아민, 1,3-디아민 및 1,4-디아민 기로부터 선택된다. 추가의 구체예는, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 즉, 유도체화 분자와 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 결합을 형성함으로써 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는데 사용되는 디아민 치환 분자에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 전술한 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 디케톤 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산은 측쇄를 포함하는데, 여기서, 상기 카보닐은 케톤, 알데히드, 카복실산 또는 에스테르 예를 들어, 티오에스테르로부터 선택된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 치환 분자는 원하는 작용기로부터 선택되는 기를 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 치환 분자는 디아민 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 생성 아미노산의 측쇄에 대해 화학적으로 직교하여, 비천연 아미노산이 디아민 치환 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 만든다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄 는 디아민 함유 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유부를 포함하며; 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 친전자체 함유부는 친핵성 공격을 수행하여, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있다. 본 문단에 기술된 구체예와 관련된 추가의 측면은, 유도체화 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로부터 생성된 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 구체예는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.
다른 측면은, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 바탕으로 하는, 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위한 디카보닐 치환 분자에 관한 것이다. 추가의 구체예는, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 형성함으로써, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는데 사용되는 디카보닐 치환 분자에 관한 것이다. 추가의 구체예는, pH 약 4∼약 8에서 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 함께, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 형성할 수 있는 디카보닐 치환 분자에 관한 것이다. 추가의 구체예는, 유도체화 분자와 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 사이에서 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성하여, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는데 사용되는 디카보닐 치환 분자에 관한 것이다. 디카보닐 치환 분자는 추가의 구체예에서, 디케톤 치환 분자이고, 다른 측면에서, 케토알데히드 치환 분자이며, 다른 측면에서, 케토산 치환 분자이고, 다른 측면에서, 케토에스테르 치환 분자 예를 들어, 케토티오에스테르 치환 분자이다. 추가의 구체예에서, 디카보닐 치환 분자는 원하는 작용기로부터 선택되는 기를 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 알데히드 치환 분자는 알데히드 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는, 비천연 아미노산이 카보닐 치환 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 만들어주는 천연 생성 아미노산의 측쇄에 대해 화학적으로 직교한다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 디카보닐 함유 분자와 선택적으로 반응하는 부분(예를 들어, 디아민기)을 포함하며; 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산 측쇄의 친핵성 부분은 친전자체를 공격하여, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있다. 본 문단에 기술된 구체예들과 관련된 추가의 측면은, 비천연 아미노산 폴리펩티드와 유도체화 분자의 반응으로부터 생성되는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 구체예는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.
다른 측면은, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 및/또는 알돌 결합을 바탕으로 하는, 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성시키는 1 작용성, 2 작용성 및 다작용성 링커에 관한 것이다. 하나의 구체예는, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 기타 분자들을 연결하는데 사용될 수 있는 분자 링커(2 작용성 및 다작용성 링커)에 관한 것이다. 다른 구체예는, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 기타 분자에 연결하는데 사용될 수 있는 분자 링커(2 작용성 및 다작용성 링커)에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 케톤, 알데히드, 카복실산, 에스테르 또는 티오에스테르 측쇄를 포함 한다. 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 구체예에서, 분자 링커는 그것의 말단부 중 어느 한 쪽에 카보닐기를 함유하며; 추가의 구체예에서, 카보닐기는 알데히드기, 에스테르, 티오에스테르 또는 케톤 기로부터 선택된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 치환 링커 분자는 디아민 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디카보닐 치환 링커 분자는 디카보닐 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 추가의 구체예에서, "기타 분자"란 어구에는 예를 들어, 단백질, 기타 중합체 및 소형 분자가 포함된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 함유 분자 링커는 모든 말단부에 동일하거나 균등한 기를 포함하므로, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 반응시 생성되는 생성물은 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종-다량체화(homo-multimerization) 분자이다. 추가의 구체예에서, 동종-다량체화는 동종-이량체화이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디카보닐 함유 분자 링커는 모든 말단부에 동일하거나 균등한 기를 포함하므로, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 반응시 생성되는 생성물은 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종-다량체화 분자이다. 추가의 구체예에서, 동종-다량체화는 동종-이량체화이다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는, 비천연 아미노산이 디아민 치환 링커 분자와 선택적으로 반응하도록 만들어주는 천연 생성 아미노산의 측쇄에 대해 화학적으로 직교한다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는, 비천연 아미노산이 디카보닐 치환 링커 분자와 선택적으로 반응하도록 만들어주는 천연 생성 아미노산의 측쇄에 대해 화학적으로 직교한다. 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 디아민 함유 링커 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유부를 포함하며; 다른 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 친전자체 함유부는 디아민 함유 링커 분자에 의한 친핵성 공격을 수행하여, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있다. 본 문단에 기술된 구체예와 관련한 추가의 측면은, 링커 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로 인하여 생성된, 결합형(변형) 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 것이다. 추가의 구체예는, 이미 결합된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 추가의 변형을 포함한다.
하나의 측면은, 디카보닐 및 디아민 반응물의 반응을 통하여 단백질을 유도체화함으로써, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 측면에는, 디카보닐 및 디아민 함유 반응물을 축합하여, 복소환 유도체화 단백질 부산물 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질 부산물을 생성시키는 것을 바탕으로 하는, 단백질의 유도체화 방법이 포함된다. 추가의 또는 또 다른 구체예는, 디아민 작용기화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 사용하여, 디케톤 함유 단백질 또는 케토알데히드 함유 단백질 또는 케토산 함유 단백질 또는 케토에스테르 함유 단백질 또는 케토티오에스테르 함유 단백질을 유도체화하는 방법에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 측면에서, 디아민 치환 분자로서는 단백질, 기타 중합체 및 소형 분자를 포함할 수 있다.
또 다른 측면은, 디카보닐 치환 단백질의 유도체화를 위한, 디아민 치환 분자의 화학 합성 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 디아민 치환 분자는 펩티 드, 기타 중합체(비분지형 및 분지형 중합체) 및 소형 분자를 포함할 수 있다. 하나의 구체예는, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및/또는 케토티오에스테르 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 디아민 치환 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 단백질의 생체 내 번역시 위치 특이적으로 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 치환 분자는 각각의 카보닐기를 친핵 공격하여 디카보닐 함유 비천연 아미노산의 위치 특이적 유도체화를 가능하게 만듦으로써, 복소환 유도체화 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 폴리펩티드를 위치 특이적 방식으로 형성할 수 있다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디아민 치환 분자의 제조 방법을 통해서는, 다양한 위치 특이적 유도체화 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 추가의 또는 부가의 구체예는, 디아민 작용기화 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자를 합성하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면은, 디아민 치환 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체화를 위하여 디카보닐 치환 분자를 화학 합성하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 디카보닐 치환 분자로서는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및/또는 케토티오에스테르 치환 분자가 있다. 다른 구체예에서, 디카보닐 치환 분자로서는 단백질, 중합체(비 분지형 및 분지형 중합체) 및 소형 분자를 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이러한 방법은 단백질의 생체 내 번역시 비천연 아미노산을 위치 특이적으로 통합할 수 있는 기술을 보완해준다. 추가의 또는 부가의 구체예는, 위치 특이적으로 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제공하기 위하여, 디아 민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응에 적합한 디카보닐 치환 분자를 제조하는 일반적인 방법에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예는, 디카보닐 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 합성하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면은, 디아민 함유 2 작용성 링커를 사용하여, 디카보닐 치환 비천연 아미노산 폴리펩티드를 화학적으로 유도체화하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예는, 축합 반응을 통하여 디카보닐 치환 단백질에 디아민 치환 링커를 부착시켜, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성하는 방법에 관한 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 디카보닐 치환 비천연 아미노산으로서는, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및/또는 케토티오에스테르 치환 비천연 아미노산이 있다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 디아민 함유 2 작용성 링커를 사용하여, 위치 특이적으로 유도체화되며/되거나 3차원 구조를 정확하게 제어함으로써 유도체화된다. 하나의 구체예에서, 이러한 방법은 분자 링커(1 작용성, 2 작용성 및 다작용성 링커)를 디카보닐 함유(예를 들어, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및/또는 케토티오에스테르 함유) 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부착시키는데 사용되는데, 여기서, 상기 링커의 말단부 중 하나 이상은, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통하여, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 수 있는 디아민기를 함유한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 이와 같은 링커는 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 기타 분자 예를 들어, 단백질, 기타 중합체(분지형 또는 비 분지형 중합체) 및 소형 분자에 연결하는데 사용된다.
몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 2 작용성 중합체이다. 몇몇 구체예에서, 2 작용성 중합체는 제2의 폴리펩티드에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제2의 폴리펩티드는 제1의 폴리펩티드와 동일하며, 다른 구체예에서, 상기 제2의 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드이다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 생산된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 치환, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 단백질 분해 효소 내성, 혈청 반감기, 면역원성 및/또는 발현량을 조정하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 작동제, 부분 작동제, 길항제, 부분 길항제 또는 역 작동제(inverse agonist)이다. 몇몇 구체예에서, 작동제, 부분 작동제, 길항제, 부분 길항제 또는 역 작동제는 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체에 결합되어 있는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 상응하는 수용체의 이량체화를 억제할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체에 결합되어 있는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 결합 파트너, 리간드 또는 수용체에 폴리펩티드가 결합하는 것을 조정한다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조정한다.
몇몇 구체예에서, 셀렉터 코돈(selector codon)은 앰버 코돈(amber codon), 오커 코돈(ochre codon), 오팔 코돈(opal codon), 유니크 코돈(unique codon), 희귀 코돈(rare codon), 비천연 코돈(unnatural codon), 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 수용성 중합체에 결합된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 비천연 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드와, 비천연 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체를 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 통합된 비천연 아미노산은 20개의 일반적 아미노산 중 임의의 것에 대해 비 반응성인 수용성 중합체에 대해 반응성이다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 상기 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 이상일 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da일 수 있 는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 약 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da 및 약 1,000Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 20,000Da이다. 다른 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다.
또한, 본 출원에는 본원에 개시된 비천연 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 관하여 기술되어 있다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 결합되어 있다. 뿐만 아니라, 본원에는 약학적으로 허용 가능한 담체와 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관하여 기술되어 있는데, 여기서, 하나 이상의 아미노산은 비천연 아미노산에 의해 치환된다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산은 당 부분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 당 부분을 통해 폴리펩티드에 결합되어 있다. 본원에는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 전구약물에 관하여도 개시되어 있으며; 또한, 이와 같은 전구약물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물에 관하여도 개시되어 있다. 뿐만 아니라, 본원에는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사산물에 관하여도 개시되어 있는데; 이러한 대사산물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성을 보완하거나 상승시키는 것과 같은 바람직한 활성을 가질 수 있다. 또한, 본원에는 유기체 예를 들어, 상기 대사산물을 필요로 하는 환자에게 원하는 대사산물을 제공하는데 있어서, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리 펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용도에 관하여도 개시되어 있다.
또한, 본원에는 셀렉터 코돈을 포함하는, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 관하여도 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 세포는 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 치환시키기 위한, 직교((orthogonal: 오르소고날) RNA 합성 효소 및/또는 직교 tRNA를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 세포 배양액 중에 존재하는 반면에, 다른 구체예에서는, 다세포 유기체 예를 들어, 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물의 일부를 이루는 세포이다. 세포에 관한 구체예 중 임의의 구체예에서, 추가의 구체예는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함한다. 기타 구체예는, 본원에 개시된 비천연 아미노산을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있는 유기체에 관한 것이다. 다른 구체예는, 본원에 개시된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 유기체에 관한 것이다. 이와 같은 유기체로서는 단세포 및 다세포 유기체 예를 들어, 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 시험관 내에서 생산된다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 용해물 중에서 생산된다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보좀 번역에 의해서 생산된다.
또한, 본원에는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 폴리펩티드를 암호화하는 폴 리뉴클레오티드(들), 직교 RNA 합성 효소 및/또는 직교 tRNA를 포함하는 세포를, 이 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 이 세포 및/또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 비천연 아미노산의 라이브러리 또는 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 본원에 개시된 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리 또는 이의 조합형 라이브러리에 관하여도 개시되어 있다. 또한, 본원에는 하나 이상의 비천연 아미노산, 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형 비천연 아미노산을 함유하는 어레이(array)에 관하여도 개시되어 있다. 또한, 본원에는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 어레이에 관하여도 개시되어 있다. 본원에 개시된 어레이는 (상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사 여부를 검출하거나 또는 상기 폴리펩티드의 번역 여부를 검출함으로써) 유기체 내에서 비천연 아미노산 폴리펩티드가 생산되는지 여부를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 개시된 라이브러리가 원하는 활성을 가지는지 여부를 스크리닝하는 방법, 또는 본원에 개시된 어레이를 사용하여 본원에 개시된 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 또는 화합물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 기타 라이브러리도 원하는 활성을 가지는지 여부를 스크리닝하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 또한, 본원에는 새로운 치료제를 개발 및 발견하기 위해 라이브러리를 스크리닝한 결과와 이 치료제 자체로부터 얻어지는 활성 데이터의 용도 에 관하여도 개시되어 있다.
뿐만 아니라, 본원에는 폴리펩티드의 치료적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 천연 생성 폴리펩티드 중 하나 이상의 임의의 아미노산과 치환하는 단계 및/또는 이 폴리펩티드를 수용성 중합체와 커플링시키는 단계를 포함한다.
또한, 본원에는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 유효량 처리할 필요가 있는 환자를 치료하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 커플링된다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 복소환 함유 비천연 아미노산, 카보닐 함유 비천연 아미노산, 디카보닐 함유 비천연 아미노산, 디아민 함유 비천연 아미노산, 케토알킨 함유 비천연 아미노산, 또는 케토아민 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 기타 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드에 생물 합성에 의해 통합된다. 기타 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드에 합성에 의해 통합된다. 추가의 또는 대안적인 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼LXVII의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 이용률(bioavailability)은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 생체 이용률에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 프로필(safety profile)은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 안전성 프로필에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 수용성에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이 때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 반감기는, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 치료적 반감기에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순환 시간(circulation time)은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 순환 시간에 비하여 연장된다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비하여 조정된다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 질환, 병상 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하고, 이 때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 면역원성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 면역원성에 비하여 조정된다.
뿐만 아니라, 본원에는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관하여도 개시되어 있다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드의 존재 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 복소환 함유 비천연 아미노산, 카보닐 함유 비천연 아미노산, 디카보닐 함유 비천연 아미노산, 디아민 함유 비천연 아미노산, 케토알킨 함유 비천연 아미노산, 또는 케토아민 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 이와 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 폴리펩티드에 생물 합성에 의하여 통합된다. 다른 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 본원에 개시된 폴리펩티드에 합성에 의하여 통합된다. 추가의 또는 대안적 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼LXVII의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 이용률은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 생체 이용률에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적인 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이대, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 프로필은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 안전성 프로필에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 수용성에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 반감기는, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 치료적 반감기에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 증가한다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순환 시간은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 순환 시간에 비하여 연장된다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비하여 조정된다.
추가의 또는 대안적 구체예는, 환자의 체 내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 복소환 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 면역원성은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드의 면역원성에 비하여 조정된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 본원에 개시된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 구조물 및 시약에 국한되지 않고, 다양할 수 있음을 알 것이다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 용어는 오로지 특정 구체예를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것일 뿐, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정될, 본원에 개시된 방법과 조성물의 범위를 한정하고자 하는 것은 아님도 알 것이다.
본원 및 청구의 범위에 사용된 단수를 나타내는 "하나", "하나의" 및 "상기"와 같은 관사는 본원에서 특별히 언급하지 않는 한 복수를 나타내는 용어도 포함하는 것이다.
달리 특정하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본원에 개시된 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 개시된 방법, 장치 및 물질과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본원에 개시된 본 발명을 실시하거나 테스트하는데 사용될 수 있긴 하나, 본원에는 그보다 더욱 바람직한 방법, 장치 및 물질에 관하여 기술되어 있다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 것으로서, 이와 같은 공보에 개시된 구조물과 방법을 기술 및 개시하기 위한 목적으로 사용되었으며, 이와 같은 구조물과 방법은 본원에 기술된 발명과 관련하여서도 사용될 수 있다. 본원에 언급된 공보는 본 출원의 출원일 이전에 공개용으로서만 제공된 것이다. 본 발명의 발명자들이 선행 발명 또는 임의의 기타 이유로 인하여 이와 같은 문헌들이 본 발명보다 앞서 출원되었음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"알돌계 결합" 또는 "혼합 알돌계 결합"이란 용어는, 하나의 카보닐 화합물과, 동일할 수 있거나 또는 동일할 수 없는 다른 카보닐 화합물의 에놀레이트/에놀의, 산 또는 염기에 의하여 촉진되는 축합 반응으로서, β-하이드록시 카보닐 화합물 즉, 알돌을 생성하는 축합 반응을 의미한다
본원에 사용된 "친화성 표지"란 용어는, 다른 분자를 변형 또는 파괴하거나 또는 그것을 포함하는 화합물을 형성하도록, 이 다른 분자에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하는 표지를 의미한다. 예를 들어, 친화성 표지로서는 효소와 그것의 기질, 또는 항체와 그것의 항원을 포함한다.
"알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)란 용어는, 통상적 의미에서 사용되는 것으로서, 각각 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자를 통하여 분자에 결합된 알킬기를 의미한다.
"알킬"이란 용어는, 그 용어 자체로서, 또는 다른 분자의 일부로서 사용될 경우, 달리 언급이 없는 한, 완전히 포화될 수 있거나, 한 군데가 불포화될 수 있거나 여러 부위가 불포화될 수 있으며, 또한 탄소 원자수가 지정된(즉, C1∼C10은 1∼10개의 탄소를 의미함) 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있는, 직쇄 또는 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이의 조합체를 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 상동체 및 이성체와 같은 기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 기이다. 불포화 알킬기의 예로서는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 고급 상동체 및 이성체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "알킬"이 란 용어는, 달리 특정하지 않는한, 본원에 보다 상세하게 정의된 알킬의 유도체 예를 들어, "헤테로알킬", "할로알킬" 및 "호모알킬"을 포함하는 의미이다.
"알킬렌"이란 용어는, 그 용어 자체로서, 또는 다른 분자의 일부로서 사용될 경우, 알칸[(-CH2-)n(식 중, n은 1∼약 24일 수 있음)으로서 예시됨]으로부터 유래하는 2가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 이와 같은 기로서는, 탄소 원자가 10개 이하인 기 예를 들어, 구조식 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은, 일반적으로 탄소 원자가 8개 이하인 단쇄 알킬 또는 알킬렌 기이다. "알킬렌"이란 용어는, 달리 특정하지 않는 한, 본원에 "헤테로알킬렌"이라고 개시된 기를 포함하는 의미이다.
"아미노산"이란 용어는, 천연 생성 아미노산 및 비천연 아미노산, 그리고 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체(mimetic)를 의미한다. 천연 암호화된 아미노산으로서는 20개의 일반적 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)과 피로리신 및 셀레노시스테인이 있다. 아미노산 유사체란, 예를 들어, 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 α-탄소와 같이, 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 의미한다. 이와 같은 유사체는 변형된 R기를 가질 수 있거나(예를 들어, 노르루신), 또는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 여전히 보유하는 변형된 펩티드 주쇄를 가질 수 있다. 아미노산 유사체의 비제한적인 예로서는 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 포함한다.
본원에서 아미노산은 이것의 명칭, 이것의 통상적으로 공지된 3문자 암호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의하여 추천되는 1 문자 암호에 의해 표시될 수 있다.
"아미노 말단 변형기"란, 말단 아민기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 예를 들어, 이러한 말단 아민기는 중합체 분자의 말단에 존재할 수 있는데, 여기서, 이와 같은 중합체 분자로서는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 말단 변형기로서는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 말단 변형기로서는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민을 포함한다. 말단 변형기는 중합체 분자의 치료 특성을 변형시키는데 예를 들어, 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 사용될 수 있다.
"항체 단편"이란, 전장 형태 이외의 임의의 형태를 가지는 항체를 의미한다. 본원의 항체 단편으로서는 전장 항체 내에 존재하는 소형 성분인 항체와, 조작된 항체를 포함한다. 항체 단편으로서는 Fv, Fc, Fab 및 (Fab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), 다이아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 2 작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, 상기 CDR의 조합체, 다양한 부위들, 틀 부위, 불변부, 중쇄, 경쇄 및 가변부와, 대안적인 골격 비 항체 분자(scaffold non- antibody molecule) 및 이중 특이적 항체 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]. 기타 작용성 하위 구조물로서는 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변부가 펩티드 링커에 의하여 공유 결합되어 있는 단일 사슬 Fv(scFv)가 있다[S-z Hu외 다수, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061]. 이와 같은 소형(분자량 = 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 중 항원에 대한 특이성과 친화성을 보유하며, 대형의 항원-특이적 분자에 대해 편리한 구성 블록(building block)을 제공한다. 구체적으로 달리 특정하지 않는 한, "항체" 또는 "항체들"이란 용어를 사용하는 상세한 설명과 청구의 범위에는 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.
본원에 사용된 "방향족" 또는 "아릴"이란 용어는, 파이 전자 시스템(pi electron system)이 접합되어 있는 하나 이상의 고리를 가지며, 카보시클릭 아릴기와 헤테로시클릭 아릴기(또는 "헤테로아릴기" 또는 "헤테로 방향족기") 둘 다를 포함하는, 폐쇄된 고리 구조를 의미한다. 카보시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 5∼20개의 고리 원자를 포함할 수 있다. 상기 용어는 공유 결합된 모노시클릭 고리 또는 융합된 고리 형태의 폴리시클릭(즉, 탄소 원자의 인접 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다. 방향족 기는 비치환 또는 치환될 수 있다. "방향족" 또는 "아릴"기에 관한 비제한적인 예로서는, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 안트라세닐 및 펜안트라세닐을 포함한다. 전술한 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기로서는 본원에 개시된 허용 가능한 치환기 군으로부터 선택된다.
간편함을 위하여, "방향족" 또는 "아릴"이란 용어가 다른 용어와 함께 사용될 때(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시 및 아랄킬), 상기 용어는 상기 정의한 바와 같은 아릴 고리와 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 그러므로, "아랄킬" 또는 "알카릴"이란 용어는, 아릴기가 알킬기(예를 들어, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등) 예를 들어, 탄소 원자(예를 들어, 메틸렌기)가 이종 원자 예를 들어, 산소 원자에 의해 치환된 알킬기에 부착되어 있는 라디칼을 포함하는 의미이다. 이와 같은 아릴기의 예로서는 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된, "아릴렌"이란 용어는, 2가의 아릴 라디칼을 의미한다. "아릴렌"의 비제한적인 예로서는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 및 티오페닐렌을 포함한다. 아릴렌기에 대한 치환기는 본원에 개시된 허용 가능한 치환기의 군으로부터 선택된다.
"2 작용성 중합체"란, "2 작용성 링커"라고도 불리며, 이는 기타 부분과 특이적으로 반응하여, 공유 결합 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 작용기를 포함하는 중합체를 의미한다. 이와 같은 부분들로서는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산, 또는 이와 같은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드 상에 존재하는 측기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 2 작용성 링커는 제1의 펩티드 상에 존재하는 기와 반응성인 작용기와, 제2의 펩티드 상에 존재하는 기와 반응성인 다른 작용기를 보유할 수 있으며, 이로 인하여, 제1의 펩티드, 2 작용성 링커 및 제2의 펩티드를 포함하는 접합체를 형성한다. 다 양한 화합물을 펩티드에 부착시키는 다수의 방법과 링커 분자에 관하여는 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호, 동 제4,659,839호, 동 제4,414,148호, 동 제4,699,784호; 동 제4,680,338호; 및 동 제4,569,789호(이 문헌들은 모두 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용됨)를 참조하시오. "다작용성 중합체"란, "다작용성 링커"라고도 불리며, 이는 기타 부분과 반응할 수 있는 2개 이상의 작용기를 포함하는 중합체를 의미한다. 이와 같은 부분으로서는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산, 또는 이와 같은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드 상에 존재하는 측기(예를 들어, 아미노산 측기)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 2 작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 바람직한 길이 또는 분자량을 가질 수 있으며, 또한 화합물에 결합된 하나 이상의 분자와 그것이 결합되어 있는 분자 또는 화합물 간 특정의 바람직한 공간 또는 형태를 제공하는 것으로서 선택될 수 있다.
본원에 사용된 "생체 이용률"이란 용어는, 어떠한 물질이나 그것의 활성 부분이 약학적 투여형으로부터 전달되어, 작용 위치 또는 전체 혈류 내에서 사용 가능하게 되는 비율 및 그 정도를 의미한다. 생체 이용률이 증가하였다 함은 곧, 어떠한 물질 또는 그것의 활성 부분이 약학적 투여형으로부터 전달되어, 작용 위치 또는 전체 혈류 내에서 사용 가능하게 되는 비율 및 그 정도가 증가하였음을 의미한다. 예를 들어, 생체 이용률이 증가하였음은, 혈중 특정 물질 또는 그것의 활성 부분의 농도가, 기타 물질 또는 활성 부분의 농도에 비하여, 증가하였음을 통하여 알 수 있다. 생체 이용률 증가 여부를 평가하는 방법에 관한 비제한적인 예는 실시 예 21∼25에 개시되어 있다. 이러한 방법은 임의의 폴리펩티드의 생체 이용률을 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적으로 활성인 분자", "생물학적으로 활성인 부분" 또는 "생물학적으로 활성인 제제"란 용어는, 유기체 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간과 관련된 생물 시스템, 경로, 분자 또는 상호 작용의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용된 생물학적으로 활성인 분자로서는, 인간 또는 기타 동물의 질병을 진단, 치료, 완화, 처치 또는 예방하는데 사용되는 임의의 물질, 또는 인간이나 동물의 육체적 또는 정신적 건강을 강화하는 임의의 물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적으로 활성인 분자의 예로서는 펩티드, 단백질, 효소, 소형 분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세 입자 및 미셀을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용하기 적합한 생물학적 활성 제제의 군으로서는, 약물, 전구약물, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항-바이러스 제제, 소염제, 항-종양 제제, 심혈관 제제, 항-불안 제제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드 제제 및 미생물 유래 독소 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"생물학적 활성의 조정"이란, 폴리펩티드의 반응성을 증가 또는 감소시키는 것, 폴리펩티드의 선택성을 변성시키는 것, 폴리펩티드의 기질 선택성을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다. 변형된 생물학적 활성의 분석은 비천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비교함으로써 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "생체 물질(biomaterial)"이란, 생물학적으로 유래된 물질 예를 들어, 생물 반응기로부터 얻어지고/얻어지거나 재조합 방법 및 기술을 통하여 얻어지는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "생체 물리학적 프로브"란, 분자의 구조 변화를 확인 또는 모니터할 수 있는 프로브를 의미한다. 이러한 분자로서는 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, "생체 물리학적 프로브"는 기타 거대 분자와 단백질의 상호 작용을 확인 또는 모니터하는데 사용될 수 있다. 생체 물리학적 프로브의 예로서는 스핀 표지, 형광단 및 광활성 기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "생물 합성에 의해서"란 용어는, (세포성 또는 비세포성) 번역 시스템을 사용하는 임의의 방법에 의하는 경우를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 하기 성분들 중 하나 이상을 사용하는 방법에 의하는 경우를 의미한다: 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보좀. 예를 들어, 비천연 아미노산은 본원에 개시된 방법과 기술을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 "생물 합성에 의해서 통합"될 수 있다["비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생산" 및 비제한적 실시예 20 참조]. 뿐만 아니라, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 "생물 합성에 의해 통합"될 수 있는, 유용한 비천연 아미노산의 선별 방법에 관하여는 비제한적 실시예 20에 개시되어 있다.
"바이오틴 유사체"란 용어는, "바이오틴 모의체"라고도 불리는데, 이는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘과 고도의 친화도로 결합하는 (바이오틴 이외의) 임의의 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "카보닐"이란 용어는, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- 및 -C(S)-로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분에 예를 들어, 하나 이상의 케톤기 및/또는 하나 이상의 알데히드기 및/또는 하나 이상의 에스테르기 및/또는 하나 이상의 카복실산기 및/또는 하나 이상의 티오에스테르기를 함유하는 기를 의미한다. 이와 같은 카보닐기로서는 케톤, 알데히드, 카복실산, 에스테르 및 티오에스테르를 포함한다. 뿐만 아니라 이러한 기는 선형, 분지형 또는 환형 분자의 일부일 수 있다.
"카복실 말단 변형기"란 용어는, 말단 카복시기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 예를 들어, 이와 같은 말단 카복시기는 중합체 분자의 말단에 존재할 수 있는데, 이때, 상기 중합체 분자로서는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 말단 변형기로서는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 말단 변형기로서는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민을 포함한다. 말단 변형기는 중합체 분자의 치료 특성을 변성시키는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 사용될 수 있다.
"화학적으로 절단 가능한 기"란 용어는, "화학적으로 불안정한 기"라고도 불리는데, 이는 산, 염기, 산화제, 환원제, 화학 개시제 또는 라디칼 개시제에 노출 시 분해 또는 절단되는 기를 의미한다.
본원에 사용된 "화학 발광기"란 용어는, 열을 가하지 않고서도 화학 반응에 의하여 빛을 발하는 기를 의미한다. 예를 들어, 루미놀 (5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온)은 염기와 금속 촉매의 존재 하에서, 과산화수소(H2O2)와 같은 산화제와 반응을 하여, 여기 상태의 생성물인 (3-아미노프탈레이트, 3-APA)를 생성한다.
본원에 사용된 "발색단"이란 용어는, 가시 파장, UV 파장 또는 IR 파장의 빛을 흡수하는 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "보조 인자"란 용어는, 대형 분자의 작용에 필수적인 원자 또는 분자를 의미한다. 보조 인자로서는 효소의 활성에 필수적인 무기 이온, 보조 효소, 단백질 또는 몇몇 기타 인자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 예로서는 헤모글로빈 내 헴, 엽록체 내 마그네슘, 그리고 단백질에 대한 금속 이온을 포함한다.
본원에 사용된 "코폴딩(cofolding)"이란 용어는, 서로 상호 작용하여 폴딩되지 않았거나 또는 부적절하게 폴딩된 분자를 적당히 폴딩된 분자로 변형시키는 2개 이상의 분자를 사용하는, 리폴딩(refolding) 과정, 반응 또는 방법을 의미한다. 예를 들어, "코폴딩"에서는 서로 상호 작용하여 폴딩되지 않았거나 또는 부적절하게 폴딩된 폴리펩티드를 적당히 폴딩된 원래의 폴리펩티드로 변형시키는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용한다. 이러한 폴리펩티드는 천연 아미노산 및/또는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "비교 윈도우(comparison window)"란 용어는, 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후, 동일한 수만큼의 인접 위치들로 이루어진 참고 서열과 서열을 비교하는데 사용되는, 인접 위치들 중 임의의 위치로 이루어진 분절을 의미한다. 이와 같은 인접 위치로서는 약 20∼약 600개의 연속 단위로 이루어진 군 예를 들어, 약 50∼약 200개의 연속 단위로 이루어진 군과, 약 100∼약 150개의 연속 단위로 이루어진 군을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이와 같은 서열들은 폴리펩티드와 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서, 연속 단위로서는 천연 및 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 예를 들어, 이와 같은 서열들은 상응하는 연속 단위들인 뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드를 함께 포함한다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬법은 예를 들어, 스미스와 워터맨(Smith and Waterman(1970))에 의한 문헌[Adv. Appl. Math. 2:482c]에 개시된 국소 상동성 알고리즘, 니들맨 및 운치(Needleman and Wunsch(1970))에 의한 문헌[J. Mol. Biol. 48:443]에 개시된 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 립맨(Pearson and Lipman (1988))에 의한 문헌[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]에 개시된 유사성 검색 방법, 알고리즘 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 컴퓨터에 의한 수행, 또는 수동 정렬 및 가시적 검사에 의한 방법[예를 들어, Ausubel외 다수, Current Protocols in Molecular Biology (1995 증보판)]에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 서열 동일성 %와 서열 유사성 %를 측정하는데 사용될 수 있는 알고리즘으로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이것에 관하여는 문헌[Altschul외 다수 (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul외 다수 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터로부터 공개적으로 입수 가능하다. 상기 BLAST 알고리즘 매개 변수인 W, T 및 X는 정렬의 정확도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)에서는 디폴트값으로서 문자 길이(W) = 11, 기대치(E) = 10, M=5, N=-4를 사용하고, 두 사슬을 비교한다. 아미노산 서열용인 BLASTP 프로그램에서는 디폴트값으로서 문자 길이 = 3이고, 기대치(E) = 10이며, BLOSUM62 스코어링 매트릭스[Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]에서는 정렬치(B) = 50, 기대치(E) = 10, M=5, N=-4이며, 두 사슬을 비교한다. BLAST 알고리즘은 통상적으로 "저 복잡도(low complexity)" 필터는 끈 상태에서 실행된다.
상기 BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간 유사성을 통계학적으로 분석한다[예를 들어, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 참조]. 상기 BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성에 관한 하나의 척도는 확률의 최소 합(P(N))으로서, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 매치될 확률을 나타낸다. 예를 들어, 테스트 핵산과 참고 핵산을 비교하였을 때 확률의 최소 합이 약 0.2 미만이거나 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면, 그 핵 산은 참고 서열과 유사한 것으로 간주한다.
"보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant)"란 용어는 천연 및 비천연 아미노산과, 천연 및 비천연 핵산 서열 둘 다와, 이것을 조합한 경우 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하였을 때, "보존적으로 변형된 변이체"란, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 천연 및 비천연 아미노산 서열을 암호화하는 천연 및 비천연 핵산을 의미하거나, 또는 천연 및 비천연 핵산이 천연 및 비천연 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 예를 들어, 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산인 알라닌을 암호화한다. 그러므로, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은, 암호화된 폴리펩티드를 변형하지 않고, 개시된 상응 코돈 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이"라고 부르는데, 이 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종이다. 그러므로, 예를 들어, 천연 및 비천연 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 천연 또는 비천연 핵산 서열에는 또한 천연 또는 비천연 핵산에 발생할 수 있는 모든 침묵 변이가 발생할 수 있다. 당업자는, 천연 또는 비천연 핵산 중 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG와, 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되면, 기능상 동일한 분자가 생성할 수 있음을 알게 될 것이다. 그러므로, 천연 및 비천연 폴리펩티드를 암호화하는 천연 및 비천연 핵산의 각 침묵 변이는 개시된 각각의 서열에 잠재되어 있다.
아미노산 서열에 있어서, 암호화된 서열 내에서 하나의 천연 및 비천연 아미노산, 또는 낮은 비율의 천연 및 비천연 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 각각 치환, 결실 또는 부가가 일어난 경우를 "보존적으로 변형된 변이체"라 하는데, 여기서, 변형이 발생함에 따라서, 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 천연 및 비천연 아미노산과 화학적으로 유사한 아미노산의 치환이 일어나게 된다. 기능상 유사한 천연 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 이와 같이 보존적으로 변형된 변이체는, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립 형질이므로 이것들을 제외하지 않는다.
기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업자에게 공지되어 있다. 이하 8개의 군들 각각은 상호 보존적 치환 관계에 있는 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)] 참조)
"시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"이란 용어는 그 자체로서, 또는 다른 용어와 함께 사용될 때, 달리 언급하지 않는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환형을 의미한다. 그러므로, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화, 부분 불포화 및 완전 불포화 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 이종 원자는 복소환이 분자의 나머지 부분에 부착되어 있는 위치에 존재할 수 있다. 이종 원자는 산소, 질소 또는 황을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시클로알킬의 예로서는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐 및 시클로헵틸 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 헤테로시클로알킬의 예로서는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모폴리닐, 3-모폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐 및 2-피페라지닐 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용어에는 다중 환 구조의 것들 예를 들어, 이중 환 및 삼중 환 고리 구조의 것들도 포함된다. 이와 유사하게, "헤테로시클로알킬렌"이란 용어는 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용될 때, 헤테로시클로알킬로부터 유래하는 2가 라디칼을 의미하고, "시클로알킬렌"이란 용어는 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용될 때, 시클로알킬로부터 유래하는 2가 라디칼을 의미한다.
본원에 사용된 "시클로덱스트린"이란 용어는, 6∼8개의 글루코스 분자가 고 리를 형성하고 있는 환형 탄수화물을 의미한다. 이 고리의 외부는 수용성 기를 함유하며; 이 고리의 중심은 비교적 비극성으로 공동을 이루어 소형 분자들을 수용할 수 있다.
본원에 사용된 "세포 독성"이란 용어는, 세포에 해를 끼치는 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 "변성 제제" 또는 "변성제"란 용어는, 중합체의 가역적인 언폴딩(unfolding)을 일으킬 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들어, "변성 제제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 언폴딩을 유발할 수 있다. 변성 제제 또는 변성제의 세기는 특정 변성 제제 또는 변성제의 농도와 특성에 의하여 결정될 것이다. 예를 들어, 변성 제제 또는 변성제로서는 케이오트로프(chaotrope), 세제, 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질 또는 이러한 제제의 조합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 케이오트로프로서는 우레아, 구아니딘 및 티오시안산나트륨을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비제한적인 세제의 예로서는 강력 세제 예를 들어, 황산 나트륨 도데실 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) 세제), 사코실(Sarkosyl), 순한 비-이온계 세제(예를 들어, 디기토닌), 순한 양이온 세제 예를 들어, N→2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 순한 이온 세제(예를 들어, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 양쪽성 이온 세제 예를 들어, 설포베타인(양쪽성 작용제), 황산3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판(CHAPS) 및 설폰산3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-하이드록시-1-프로판(CHAPSO)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유기의 수혼화성 용매의 비제한적 예로서는, 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C2∼C4 알칸올 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(C2∼C4 알칸디올 예를 들어, 에틸렌-글리콜)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인지질의 비제한적 예로서는 천연 생성 인지질 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체 예를 들어, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "원하는 작용기"란 용어는, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광 가교제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광 친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트화제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당; 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생체 물질; 나노 입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유부; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호 작용하는 기; 광 케이지화된 부분; 악티닌 방사선 여기 부분; 리간드; 광 이성체화 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자 통합 부분; 화학 절단 기; 광 절단 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화 환원-활성화제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소 표지화 부분; 생체 물리학적 프로브; 인광성 기; 화학 발광성 기; 전자 조밀 기; 자성 기; 개입기; 발색 단; 에너지 전이제; 생물학적 활성 제제[이 경우, 생물 학적 활성 제제로서는 치료 활성을 가지는 제제를 포함할 수 있으며, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산은 부착된 치료제와 함께 보조 치료제로서 사용될 수 있거나, 또는 유기체 내 원하는 위치에 치료제를 전달하는 수단으로서 사용될 수 있음]; 검출 가능한 표지; 소형 분자; 억제성 리보 핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴 유도체; 양자 점; 나노 전달체; 방사성 전달체; 항체 효소(abzyme), 활성화된 복합 활성 인자, 바이러스, 애쥬반트, 어글리칸(aglycan), 앨러건(allergan), 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA(guide RNA), 사포닌, 셔틀 벡터(shuttle vector), 거대 분자, 미모토프(mimotope), 수용체, 가역적 미셀 및 이것의 임의의 조합으로부터 선택되는 임의의 기를 의미한다.
본원에 사용된 "디아민"이란 용어는, 2개 이상의 아민 작용기를 포함하는 기/분자를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 히드라진기, 아미딘기, 이민기, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기 및 1,4-디아민기를 포함한다. 뿐만 아니라, 이러한 기들은 선형, 분지형 또는 환형 분자의 일부일 수 있다.
본원에 사용된 "검출 가능한 표지"란 용어는, 분석 기술 예를 들어, 플루오레세인을 사용하는 방법, 화학 발광법, 전자-스핀 공명법, 자외선/가시 광선 흡수 분광 분석법, 질량 분광 분석법, 핵 자기 공명법, 자기 공명법 및 전자 화학적 방법을 이용하여 관찰 가능한 표지를 의미한다.
본원에 사용된 "디카보닐"이란 용어는, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- 및 -C(S)- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 부분을 함유하는 기 예를 들어, 1,2-디카보닐기, 1,3-디카보닐기 및 1,4-디카보닐기, 그리고 하나 이상의 케톤기를 함유하는 기 및/또는 하나 이상의 알데히드기를 함유하는 기 및/또는 하나 이상의 에스테르기를 함유하는 기 및/또는 하나 이상의 카복실산기를 함유하는 기 및/또는 하나 이상의 티오에스테르기를 함유하는 기를 의미한다. 이와 같은 디카보닐기로서는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르를 포함한다. 뿐만 아니라, 이러한 기는 선형, 분지형 또는 환형 분자의 일부일 수 있다. 디카보닐기 중 2개의 부분들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 또한 2개의 부분 중 어느 한 부분에 예를 들어, 에스테르, 케톤, 알데히드, 티오에스테르 또는 아미드를 형성할 치환기를 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "약물"이란 용어는, 질병 또는 병상의 예방, 진단, 경감, 치료 또는 치유에 사용되는 임의의 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "염료"란 용어는, 발색단을 함유하는 가용성의 발색 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "유효량"이란 용어는, 치료될 질병 또는 병상의 증상들 중 하나 이상을 어느 정도 완화시기 위하여, 투여될 제제 또는 화합물의 충분한 양을 의미한다. 유효량을 투여하게 되면, 질병의 징후, 증상 또는 발병률을 감소 및/또는 경감시킬 수 있거나, 생물 시스템에 기타 임의의 원하는 개선 효과를 가져 올 수 있다. 예를 들어, 투여될 제제 또는 화합물로서는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비 아미 노산 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 강화 및/또는 치료적 처치용으로서 투여될 수 있다. 개별적 경우에 있어서 적당한 "유효"량은 투여량의 단계적 확대 연구(dose escalation study)를 통하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "전자 조밀 기"란 용어는, 전자 빔으로 조사하였을 때 전자를 산란하는 기를 의미한다. 이러한 기로서는 몰리브덴산 암모늄, 차 질산 비스무트, 요드화 카드뮴, 99%, 카보하이드라지드, 염화 제2철 6 수화물, 헥사메틸렌 테트라민, 98.5%, 무수 3 염화 인듐, 질산 란탄, 아세트산 납 삼 수화물, 시트르산 납 삼 수화물, 질산 납, 과요드산, 인몰리브덴산, 인텅스텐산, 칼륨 시안화 제2철, 페로시안화칼륨, 루테늄 레드, 질산은, 은 단백질 화합물(Ag 검정: 8.0∼8.5%) "강(Strong)", 은 테트라페닐포르핀(S-TPPS), 염화 금산 나트륨, 텅스텐산 나트륨, 질산 탈륨, 티오세미카바지드(TSC), 아세트산 우라닐, 질산 우라닐 및 황산 바나딜을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "에너지 전이제"란 용어는, 다른 분자로부터 에너지를 받을 수 있거나 줄 수 있는 분자를 의미한다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이(FRET)는, 이중 극자-이중 극자의 커플링 과정으로써, 이를 통하여, 형광 공여 분자의 여기 상태 에너지는 여기되지 않은 수용 분자에 비 방사 방식으로 전이되며, 그 결과 공여된 에너지를 파장이 긴 형광의 형태로 방사한다.
"강화하다" 또는 "강화"란 용어는, 효능 또는 원하는 효과가 지속되는 기간 을 증강 또는 연장하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제의 효능을 "강화"한다는 의미는, 질병, 질환 또는 병상의 치료시 치료제의 효능 또는 이 치료제의 효과 지속 기간을 증강 또는 연장하는 능력을 가짐을 의미한다. 본원에 사용된 "강화 유효량"이란, 질병, 질환 또는 병상의 치료시 치료제의 효과를 강화하는데 충분한 양을 의미한다. 환자에게 적용할 때, 이러한 목적으로서 유효한 양은 질병, 질환 또는 병상의 중증도와 경과, 치료 경력, 환자의 건강 상태와 약물에 대한 반응성, 그리고 치료 전문의의 판단에 따라서 달라질 것이다.
본원에 사용된 "진핵 생물"이란 용어는, 계통 발생 군인 유캐리아(Eucarya)에 속하는 유기체를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충, 파충류 및 조류(bird) 등), 섬모충, 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 및 조류(algae)), 진균, 효모, 편모, 미포자충 및 원생 생물이 있다.
본원에 사용된 "지방산"이란 용어는, 약 C6 이상인 탄화수소 측쇄를 가지는 카복실산을 의미한다.
본원에 사용된 "형광단"이란 용어는, 여기시 광자를 방출하여 형광을 띠게 되는 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응 위치", "화학 반응성 기" 그리고 "화학 반응성 부분"이라는 용어는, 화학 반응이 발생하는 분자의 일부 또는 단위를 의미한다. 상기 용어들은 어느 정도 화학 분야에서 같은 의미로 사용되며, 본원에서는 몇몇 기능 또는 활성을 수행하는 분자의 일부를 의미하고, 또한 이것들은 다른 분자와도 반응한다.
"할로겐"이란 용어는 플루오르, 염소, 요드 및 브롬을 포함한다.
본원에 사용된 "할로아실"이란 용어는, 할로겐 부분을 포함하는 아실기 예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 의미한다.
본원에 사용된 "할로알킬"이란 용어는, 할로겐 부분을 함유하는 알킬기 예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3 등을 의미한다.
본원에 사용된 "헤테로알킬"이란 용어는, 알킬기와, O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 원자로 이루어진, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합체를 의미하는 것으로서, 여기서, 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 이종 원자는 임의로 4차화될 수 있다. 이종 원자(들)인 O, N, S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치, 또는 알킬기가 분자의 나머지에 부착된 위치에 존재할 수 있다. 그 예로서는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 2개 이하의 이종 원자가 연속적으로 존재할 수도 있으며, 그 예로서는 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3이 있다.
"복소환계 결합" 또는 "복소환 결합"이란 용어는, 디아민기와 디카보닐기의 반응으로부터 형성된 부분을 의미한다. 생성된 반응 생성물로서는 복소환 예를 들 어, 헤테로아릴기 또는 헤테로시클로알킬기가 있다. 생성된 복소환기는 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드와 다른 작용기 사이의 화학 결합으로서 사용된다. 하나의 구체예에서, 복소환 결합으로서는 질소 함유 복소환 결합 예를 들어, 피라졸 결합, 피롤 결합, 인돌 결합, 벤조디아제핀 결합 및 피라잘론 결합을 포함한다.
이와 유사하게, "헤테로알킬렌"이란 용어는, 헤테로알킬로부터 유래하는 2가 라디칼을 의미하며, 그 예로서는, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-가 있다. 헤테로알킬렌기에 있어서, 동일하거나 상이한 이종 원자도 사슬의 말단부 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 존재할 수 있다(예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 및 아미노옥시알킬렌 등). 또한, 알킬렌과 헤테로알킬렌 결합기에 있어서, 결합 기의 배향은 결합기에 관한 화학식이 기재된 방향을 암시하는 것이 아니다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'-와 -R'C(O)2- 둘 다를 나타내는 것이다.
본원에 사용된 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"이란 용어는, N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 이종 원자를 함유하는 아릴기를 의미하는 것으로서; 여기서, 상기 질소와 황 원자는 임의로 산화될 수도 있으며, 또한 질소 원자(들)는 임의로 4차화될 수도 있다. 헤테로아릴기는 치환될 수 있거나 또는 치환되지 않을 수 있다. 헤테로아릴기는 이종 원자를 통하여 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 상기 헤테로아릴기의 비제한적인 예로서는 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라 졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤지미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다.
본원에 사용된 "호모알킬"이란 용어는, 탄화수소기인 알킬기를 의미한다.
본원에 사용된 "동일한"이란 용어는, 2개 이상의 서열 또는 부분 서열이 동일한 경우를 의미한다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 2개 이상의 서열을 비교 윈도우, 또는 비교 알고리즘이나 수동으로 정렬하여 가시적으로 관찰함으로써 측정되는 특정 부위에 걸쳐서 비교하고 최대의 상응성을 가지도록 정렬하였을 때, 연속 단위의 비율이 중요한 경우를 의미한다. 예를 들어, 만일 연속 단위가 특정 부위와 비교하였을 때, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일하다면, 2개 이상의 서열은 "실질적으로 동일한" 것일 수 있다. 이와 같은 비율은 2개 이상의 서열의 "동일성 %"를 의미한다. 서열의 동일성은 길이가 약 75∼100개 이상의 연속 단위인 부위, 길이가 약 50 연속 단위인 부위에 걸쳐서 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않았을 경우에는 전체 서열에 걸쳐서 존재할 수 있다. 이 정의는 또한 테스트 서열의 상보체를 의미하는 것이기도 하다. 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 동일할 때 동일한 것인 반면에, 만일 아미노산 잔기가 특정 부위와 비교하였을 때 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일하다면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 동일성은 길이가 약 75∼약 100개 이상의 아미노산인 부위, 길이가 약 50개 이상의 아미노산인 부위에 걸쳐서 존재할 수 있거나, 특정되지 않았을 경우에는 전체 서열에 걸쳐서 존재할 수 있다. 뿐만 아니라, 예를 들어, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 동일할 때 동일한 것인 반면에, 만일 핵산 잔기가 특정 부위와 비교하였을 때 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일하다면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 동일성은 길이가 약 75∼약 100개 이상의 핵산인 부위, 길이가 약 50개 이상의 핵산인 부위에 걸쳐서 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않았을 경우에는 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 서열에 걸쳐서 존재할 수 있다.
서열 비교에 있어서, 통상적으로 하나의 서열은 테스트 서열의 비교 대상인 참고 서열(reference sequence)로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 테스트 서열 및 참고 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라서는 부분 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개 변수가 사용될 수 있거나, 아니면 대안적인 매개 변수가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개 변수를 바탕으로 하는, 참고 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 %를 계산해낸다.
본원에 사용된 "면역원성"이란 용어는, 치료 약물을 투여하였을 경우의 항체 반응을 의미한다. 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성은 생물 유 체 중에 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체가 존재하는지를 검출하기 위한 정량 및 정성 검정법을 통해 파악할 수 있다. 이와 같은 검정법으로서는 방사성 면역 검정법(RIA), 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA), 발광 면역 검정법(LIA) 및 형광 면역 검정법(FIA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성 분석법은, 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하였을 때의 항체 반응성과, 치료용 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하였을 때의 항체 반응성을 비교하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 "개입제"는 "개입기"라고도 불리는 것으로서, 이는 분자 사이의 분자 간 공간 또는 분자의 분자 내 공간에 삽입될 수 있는 화학 물질을 의미한다. 예를 들어, 개입제 또는 개입기는 DNA 이중 나선 구조 내 쌓여있는 염기에 삽입되는 분자일 수 있다.
본원에 사용된 "분리된"이란 용어는, 목적으로 하지 않는 성분들로부터 목적으로 하는 성분을 분리하여 골라낸 상태를 의미한다. 분리된 물질은 건조 또는 반건조 상태일 수 있거나, 아니면 용액 예를 들어, 수용액 중에 존재할 수 있다. 분리된 성분은 균질한 상태일 수 있거나, 또는 분리된 성분은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 부가적으로 포함하는 약학 조성물의 일부일 수 있다. 순도 및 균질도는 분석 화학 기술 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정될 수 있다. 뿐만 아니라, 목적 성분이 분리되어, 제제의 주성분을 이루는 화학 종으로서 존재할 때, 그 성분을 본원에서는 실질적으로 정제되었다고 한다. 본원에 사용된 "정제된"이란 용어는, 목적 성 분이 순도 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상으로 존재하는 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 단백질이 천연의 상태로 있을 때 결합하는 세포 내 성분들 중 적어도 일부가 그 핵산 또는 단백질로부터 제거되었을 때, 또는 핵산 또는 단백질이 생체 내 또는 시험관 내 생산시 농도보다 높은 수준으로 농축되었을 때, 그 핵산 또는 단백질을 "분리되었다"고 말한다. 또한, 예를 들어, 어느 유전자에 측접하여 존재하는 개방 해독 틀로부터 격리되어, 목적 유전자 이외의 유전자에 의해 단백질을 암호화하는 경우, 그 유전자는 분리되었다고 말한다.
본원에 사용된 "표지"라는 용어는, 화합물에 통합되어 용이하게 검출될 수 있고, 이로써 그 화합물의 물리적인 분포 상태를 검출 및/또는 모니터할 수 있도록 만드는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "결합"이라는 용어는, 링커 및 다른 분자의 작용기 사이의 화학 반응으로 형성된 결합 또는 화학적 부분을 의미한다. 이와 같은 결합으로서는 공유 결합 및 비공유 결합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 이러한 화학적 부분들로서는 에스테르, 탄산염, 인산이민에스테르, 히드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 결합 및 올리고뉴클레오티드 결합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가수 분해에 안정한 결합이란, 결합이 수 중에서 실질적으로 안정하여, 긴 시간 동안(심지어는 무한정으로) 유효 pH 수치와 같은 생리적 조건 하에서 물과 반응하지 않는 경우를 의미한다. 가수 분해에 불안정한 결합 또는 분해 가능한 결합이란, 결합이 물 또는 수용액 예를 들어, 혈액 중에서 분 해 가능한 경우를 의미한다. 효소에 불안정한 결합 또는 분해 가능한 결합이란, 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 경우를 의미한다. 예를 들어, PEG와 관련 중합체는, 중합체 분자의 말단 작용기 중 하나 이상과 중합체 주쇄 사이에 존재하는, 링커기 또는 중합체 주쇄 내 분해 가능한 결합을 포함할 수 있다. 이와 같이 분해 가능한 결합으로서는, 생물학적 활성 제제 상 알콜기와 PEG 카복실산 또는 활성화된 PEG 카복실산의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서, 상기 에스테르기는 일반적으로 생리적 조건 하에서 가수 분해되어, 생물학적으로 활성인 제제를 방출한다. 기타 가수 분해에 의해 분해 가능한 결합으로서는 탄산염 결합; 아민과 알데히드의 반응으로부터 형성된 이민 결합; 알콜과 포스페이트기의 반응에 의해 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합; 알데히드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 예를 들어, PEG와 같은 중합체의 말단부에 존재하는 아민기와 펩티드의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 그리고 예를 들어, 중합체의 말단부에 존재하는 포스포라미다이트기와 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "배지" 또는 "배지들"이란 용어는, 세포를 생육하고/하거나 이러한 세포에 의해 발현 및/또는 분비된 생성물을 수집하는데 사용되는 임의의 배양 배지를 의미한다. 이와 같은 "배지" 또는 "배지들"로서는 임의의 숙주 세포 예를 들어, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 생물 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 생물 숙주 세포, 이.콜라이(E.Coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포 그리고 세포 함유물을 지지 또는 함유할 수 있는 단단한 지지체, 반고체, 고체 및 용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 "배지" 또는 "배지들"로서는 숙주 세포가 생육되어 폴리펩티드를 분비하는 배지 또는 배지들 예를 들어, 증식 단계 이전 또는 이후의 배지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 "배지" 또는 "배지들"로서는 숙주 세포 용해물 예를 들어, 세포 내 생산된 폴리펩티드를 함유하는 완충액 또는 시약을 포함하며, 이 경우, 숙주 세포는 용해 또는 파괴되어 폴리펩티드를 방출한다.
본원에 사용된 "대사산물"이란 용어는, 화합물의 유도체 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 의미하며, 이 유도체는 화합물 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성된다. "약학적으로 활성인 대사산물" 또는 "활성 대사산물"이란 용어는, 화합물 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성되는, 화합물의 생물학적으로 활성인 유도체 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 "대사된"이란 용어는, 특정 물질이 유기체에 의하여 변경되는 총체적 과정을 거친 경우를 의미한다. 이러한 과정으로서는 가수 분해 반응과 효소에 의해 촉매되는 반응을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대사에 관한 추가의 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]을 통하여 알 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사산물은, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 숙주에 투여하여, 숙주로부터 얻은 조직 시료를 분석함으로써, 또는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 간 세포와 함께 시험관 내에서 항온 처리하여, 결과로 생성되는 화합물을 분석함으로써 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "금속 킬레이트화제"란 용어는, 금속 이온과 함께 금속 착물을 형성하는 분자를 의미한다. 예를 들어, 이러한 분자는 중심 금속 이온과 함께 2개 이상의 배위 결합을 형성할 수 있으며, 이로써 고리 구조를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 "금속 함유부"란 용어는, 금속 이온, 원자 또는 입자를 함유하는 기를 의미한다. 이러한 부분으로서는 시스플라틴, 킬레이트화 금속 이온(예를 들어, 니켈, 철 및 백금), 그리고 금속 나노입자(예를 들어, 니켈, 철 및 백금)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "중원자 통합부"란 용어는, 일반적으로 탄소보다 무거운 원자 의 이온을 통합하는 기를 의미한다. 이와 같은 이온 또는 원자로서는 실리콘, 텅스텐, 금, 납 및 우라늄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "변형된"이란 용어는, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 변화가 있는 경우를 의미한다. 이와 같은 변이 또는 변형은 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성 후 변형, 또는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형에 의해 유도될 수 있다. "변형된 또는 변형되지 않은"이라는 어구는 논의되고 있는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 임의로 변형된 경우, 즉, 논의중인 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있는 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "조정된 혈청 반감기"란 용어는, 변형되지 않은 생물학적 활성 분자에 비하여, 변형된 생물학적 활성 분자의 순환 반감기에 양으로나 음으로 변화가 생긴 경우를 의미한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자로서는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 혈청 반감기는, 생물학적으로 활성인 분자 또는 변형된 생물학적 활성 분자를 투여한 후 여러 시점에서 혈액 시료를 취하여, 각 시료 중에 존재하는 상기 분자의 농도를 측정함으로써 측 정된다. 혈청 농도와 시간과의 상관 관계를 활용하여 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 예를 들어, 조정된 혈청 반감기는, 혈청 반감기가 증가하여, 투여 방식을 개선하거나 유해 효과를 억제할 수 있는 경우일 수 있다. 이와 같이 혈청 내 반감기는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상 증가할 수 있다. 혈청 반감기의 증가 여부를 측정하는 방법에 관한 비제한적인 예를 실시예 33에 제시하였다. 이 방법은 임의의 폴리펩티드의 혈청 반감기를 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "조정된 치료적 반감기"란 용어는, 변형되지 않은 생물학적 활성 분자에 비하여, 변형된 생물학적 활성 분자의 치료학적 유효량만큼의 반감기에 양으로나 음으로 변화가 생기는 경우를 의미한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자로서는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 치료적 반감기는 투여 후 여러 시점에서 분자의 약물 동태학적 특성 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 치료적 반감기가 증가하면, 투여 방식, 총 투여량을 특히 유효하도록 만들 수 있거나, 또는 원치않는 효과를 없앨 수도 있다. 예를 들어, 효능을 증가시키거나, 변형된 분자와 그것의 표적 간 결합을 증가 또는 감소시키거나, 변형되지 않은 분자의 작용 기작 또는 기타 매개 변수를 증가 또는 감소시키거나, 또는 효소 예를 들어, 단백질 분해 효소에 의한 분자의 분해를 증가시키거나 감소시키면, 치료적 반감기가 증가할 수 있다. 치료적 반감기의 증가 여부를 평가하는 방법에 관한 비제한적 예에 관하여는 실시예 33에 제시되어 있다. 이 방법은 임의의 폴리펩티드의 치료적 반감기를 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "나노입자"란 용어는, 입자 크기가 약 500∼약 1㎚인 입자를 의미한다.
본원에 사용된 "준 화학량론적"이란 용어는, 화학 반응에 참가하는 화합물의 몰비가 약 0.75∼약 1.5인 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "진핵 생물이 아닌 생물(non-eukaryote)"이란 용어는, 진핵 생물이 아닌 유기체를 의미한다. 예를 들어, 진핵 생물이 아닌 유기체는 진정 세균[예를 들어, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 서모스 서모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 등] 계통 발생 도메인에 속하는 것이거나, 또는 고세균[예를 들어, 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 서모오토트로피큠(Methanobacterium thermoautotrophicum), 아키오글로버스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 아에유로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix), 또는 할로박테리움(Halobacterium) 예를 들어, 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리아 종 NRC-1 등] 계통 발생 도메인에 속하는 것일 수 있다.
"비천연 아미노산"이란, 20개의 일반적 아미노산 또는 피로리신 또는 셀레노시스테인 중 어느 것도 아닌 아미노산을 의미한다. "비천연 아미노산"이라는 용어 와 동의어로 사용될 수 있는 기타 용어로서는 "비천연 암호화 아미노산", "인위적 아미노산", "비천연 생성 아미노산"와 이와 유사한 다양한 형태의 용어가 있다. "비천연 아미노산"이란 용어로서는, 천연 암호화 아미노산(예를 들어, 20개의 일반적 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인)의 변형에 의해 자연적으로 생성되나, 그 자체로서는 번역 복합체에 의해 성장하고 있는 폴리펩티드에 통합되지 않는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 천연의 상태에서 암호화되지 않는, 천연 생성 아미노산의 예로서는, N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, "비천연 아미노산"이란 용어는, 천연 생성되지 않지만, 합성에 의해 생성될 수 있거나 비천연 아미노산을 변형시켜 생성될 수 있는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "핵산"이란 용어는, 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태인 중합체를 의미한다. 예를 들어, 이와 같은 핵산 및 핵산 중합체로서는, (i) 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 천연 생성 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체; (ii) 올리고뉴클레오티드 유사체 예를 들어, PNA(펩티도핵산), 안티센스 기술에 사용되는 DNA 유사체(포스포로티오에이트 및 포스포로아미데이트 등); (iii) 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환체) 및 상보성 서열, 그리고 명백히 제시된 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선 택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 이루어질 수 있다[Batzer외 다수, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka외 다수, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini외 다수, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)].
본원에 사용된 "산화제"란 용어는, 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 산화제의 예로서는 산화 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화 디티오트레이톨, 산화 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 산화제가 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되기에 적당하다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"이란 용어는, 물질 예를 들어, 염, 담체 또는 희석제가 화합물의 생물학적 활성이나 생물학적 특성을 해하지 않고, 비교적 무독성인 경우, 즉, 어떤 물질이 그것이 포함되어 있는 조성물의 성분들 중 임의의 성분과, 불리한 방식으로 상호 작용하거나 원치 않는 생물학적 효과를 유발시키지 않고, 개체에 투여될 수 있는 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "광 친화성 표지"란 용어는, 빛에 노출될 때 표지와 친화성인 분자와 결합을 형성하는 기를 포함하는 표지를 의미한다. 예를 들어, 이와 같은 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다.
본원에 사용된 "광 케이징부(photocaged moiety)"란 용어는, 임의의 파장에서 조사되었을 때, 다른 이온 또는 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합하는 기를 의미한다.
본원에 사용된 "광 분해성 기"란 용어는, 빛에 노출되었을 때, 분해되는 기를 의미한다.
본원에 사용된 "광 가교제"란 용어는, 빛에 노출되었을 때, 반응성을 띠게 되어, 2개 이상의 단량체 또는 중합체 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합을 형성하는, 2개 이상의 작용기를 포함하는 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 "광 이성체화 부분"이란 용어는, 빛을 바꾸어 비추었을 때, 하나의 이성체 형에서 다른 이성체 형으로 그 형태를 바꾸는 기를 의미한다.
본원에 사용된 "폴리알킬렌 글리콜"이란 용어는, 선형 또는 분지형 중합체 폴리에틸렌 폴리올을 의미한다. 이와 같은 폴리알킬렌 글리콜로서는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이의 유도체를 포함한다. 기타 대표적인 구체예는, 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그인 "생물 의학 분야의 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)"(2001)에 나열되어 있다. 예를 들어, 이와 같은 중합체 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 0.1∼약 100kDa이다. 예를 들어, 이와 같은 중합체 폴리에테르 폴리올의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da, 예를 들어, 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da3 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 약 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 이 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da 및 약 1,000Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 20,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다.
본원에 사용된 "중합체"란 용어는, 반복 서브유닛으로 이루어진 분자를 의미 한다. 이러한 분자로서는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 다당류 또는 폴리알킬렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본원에서 호환적으로 사용되는 용어로서, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드 및 단백질에 관한 설명에도 똑같이 해당되는 것이고, 그 역으로도 마찬가지이다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 암호화 아미노산인 아미노산 중합체 및 천연 생성 아미노산 중합체에 적용된다. 뿐만 아니라, 상기 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이를 갖는 아미노산 사슬 예를 들어, 전장 단백질을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 결합되어 있다.
"번역 후 변형된"이란 용어는, 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 사슬에 통합된 후 이 아미노산에 발생하는 임의의 변형을 의미한다. 상기 변형으로서는, 생체 내 번역시 변형, 시험관 내 번역시 변형(예를 들어, 무 세포 번역 시스템), 생체 내 번역 후 변형, 그리고 시험관 내 번역 후 변형을 포함한다.
본원에 사용된 "전구약물" 또는 "약학적으로 허용 가능한 전구약물"이란 용어는, 생체 내 또는 시험관 내에서 모 약물로 전환되는 제제를 의미하는 것으로서, 여기서, 상기 전구약물은 약물의 생물학적 활성 또는 특성을 방해하지 않고, 비교적 무독성인 물질, 즉, 상기 물질이 포함되어 있는 조성물의 성분들 중 임의의 성분과 불리한 방식으로 상호 작용하거나 원치 않는 생물학적 효과를 유발시키지 않고, 개체에 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 전구약물은 일반적으로, 개체에 투여 된 후 흡수되어, 몇몇 과정 예를 들어, 대사 경로에 의한 전환 과정을 통해 활성이거나 보다 활성인 화학 종으로 전환되는 약물 전구체이다. 몇몇 전구약물은 그것의 활성을 떨어뜨리고/떨어뜨리거나 약물에 가용성 또는 몇몇 다른 특성을 부여하는, 화학기를 가진다. 일단 화학기가 전구약물로부터 절단되고/절단되거나 이 전구약물로부터 변형되면, 활성 약물이 생성된다. 전구약물은 효소 반응 또는 비효소 반응을 통해 체 내에서 활성 약물로 전환된다. 전구약물은 개선된 물리 화학적 특성 예를 들어, 개선된 가용성, 강화된 전달 특성 예를 들어, 특정 세포, 조직, 기관 또는 리간드에 특이적으로 표적화되는 특성을 제공할 수 있으며, 또한 약물의 치료적 가치도 높일 수 있다. 이와 같은 전구약물의 장점으로서는, (i) 모약물에 비하여 투여가 용이하다는 점; (ii) 전구약물은 경구 투여에 의해 생체 내 이용 가능하지만 모 약물은 그렇지 않다는 점; 그리고 (iii) 전구약물은 모 약물에 비하여, 약학 조성물 중 가용성이 개선될 수 있다는 점을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전구약물로서는, 약리학적으로 비활성이거나 활성이 감소된, 활성 약물의 유도체를 포함한다. 전구약물은 약물의 특성 예를 들어, 물리 화학적 특성, 생물 약제학적 특성 또는 약물 동태학적 특성을 조작함으로써 목적으로 하는 작용 위치에 도달하는, 약물 또는 생물학적 활성 분자의 양을 조정하도록 디자인될 수 있다. 전구약물의 예로서는, 수용성이 이동에 불리한 경우에는, 세포막을 통과하여 이동하는 것을 촉진하는 에스테르("전구약물")로서 투여되지만, 이후 수용성이 유리한 세포 내에서는 대사 작용에 의해 카복실산 즉, 활성 물질로 가수 분해되는, 비천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전구약물은 위치 특이적 조직으 로 약물이 운반되는 것을 촉진하는 변형제로서 사용되도록, 가역적 약물 유도체로 디자인될 수 있다.
본원에 사용된 "예방학적 유효량"이란 용어는, 환자에게 예방적 차원에서 투여되는 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 양으로서, 치료될 질병, 병상 또는 질환의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화할 양을 의미한다. 이와 같은 예방 분야에서, 예방학적 유효량은 환자의 건강 상태 및 체중 등에 따라서 달라질 수 있다. 이와 같은 예방학적 유효량은 통상의 실험 예를 들어, 투여량 증량 임상 실험(dose escalation clinical trial)을 통하여 결정된다는 사실은 당업자에게 널리 알려져 있다.
"보호된"이란 용어는, 임의의 반응 조건 하에서 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 막는 "보호기" 또는 부분이 존재함을 의미한다. 상기 보호기는 보호될 화학 반응기의 종류에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, (i) 만일 화학 반응기가 아민 또는 하이드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)로부터 선택될 수 있고 (ii) 만일 화학 반응기가 티올이면, 보호기는 오르토피리딜디설파이드일 수 있으며; (iii) 만일 화학 반응기가 카복실산 예를 들어, 부타논산 또는 프로피온산, 또는 하이드록실기이면, 보호기는 벤질 또는 알킬 기 예를 들어, 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다.
예를 들어, 차단기/보호기는 하기의 것들로부터 선택될 수 있다:
Figure 112008047567393-PCT00001
뿐만 아니라, 보호기로서는 광 불안정기(photolabile group) 예를 들어, Nvoc 및 MeNvoc 및 기타 당업계에 공지된 보호기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 보호기에 관하여는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "방사성 부분"이란 용어는, 핵이 핵 복사선 예를 들어, 알파, 베타 또는 감마 입자를 자발적으로 방출하는 기를 의미하는데; 여기서, 알파 입자는 헬륨 핵이고, 베타 입자는 전자이며, 감마 입자는 고 에너지 광자이다.
본원에 사용된 "반응성 화합물"이란 용어는, 적당한 조건 하에서 다른 원자, 분자 또는 화합물에 대해 반응성인 화합물을 의미한다.
"재조합 숙주 세포"란 용어는 "숙주 세포"라고도 불리며, 이는 외인성 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 세포를 의미하며, 여기서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 삽입하는데 사용되는 방법으로서는 재조합 숙주 세포를 생산하는 것으로 당업계에 공지된 방법들 즉, 직접 흡수법(direct uptake), 형질 도입, f-교배 또는 기타 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 비 통합형 벡터 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 "산화 환원-활성화제"라는 용어는, 다른 분자를 산화 또는 환원하여, 이 산화 환원 활성화제가 환원 또는 산화된 상태가 되도록 만드는 분자를 의미한다. 산화 환원 활성화제의 예로서는 페로센, 퀴논, Ru2+/3+ 복합체, Co2+/3+ 복합체 및 Os2+/3+ 복합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "환원제"란 용어는, 전자를 환원될 화합물에 부가할 수 있는 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들어, 환원제로서는 디티오트레이톨(DTT), 2-머캡토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄에티올) 및 환원 글루타티온을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 환원제는 예를 들어, 설프히드릴기를 환원된 상태로 유지시키고 분자 내 또는 분자 간 이황화 결합을 환원시키는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "리폴딩(refolding)"이란, 부적당하게 폴딩되었거나 또는 폴딩되지 않은 상태에서, 원래 형태 또는 적당히 폴딩된 형태로 변형시키는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 의미한다. 예를 들어, 리폴딩 과정을 통하여, 이황화 결합 함유 폴리펩티드는, 이황화 결합과 관련하여 부적당하게 폴딩되었거나 또는 폴딩되지 않은 상태에서 이황화 결합과 관련하여 원래 형태 또는 적당히 폴딩된 형태로 변형된다. 이와 같이 이황화 결합 함유 폴리펩티드는 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 "수지"란 용어는, 고 분자량의 불용성 중합체 비드를 의미한다. 예를 들어, 이와 같은 비드는 고상 펩티드 합성법에 대한 지지체, 또는 정제 전 분자를 부착시키는 위치로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "당"이란 용어는, 일군의 탄수화물 예를 들어, 설탕, 단당류, 올리고당 및 다당류를 의미한다.
본원에 사용된 "안전성" 또는 "안전성 프로필(safety profile)"이란 용어는, 약물이 투여되는 횟수에 대한, 약물 투여와 관련될 수 있는 부작용을 의미한다. 예를 들어, 다수 회 투여되었으며, 미약한 정도의 부작용만을 나타내거나, 아니면 아예 부작용을 나타내지 않는 약물의 경우, 안전성 프로필이 우수하다고 일컫는다. 안전성 프로필을 평가하는 방법에 관한 비제한적인 예는 실시예 26에 제시되어 있다. 본 방법은 임의의 폴리펩티드의 안전성 프로필을 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "∼에 선택적으로 혼성화된다" 또는 "∼에 특이적으로 혼성화된다"라는 어구는, 서열이 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포 DNA 또는 RNA, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)에 존재할 때, 엄중한 혼성화 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에 분자가 결합하거나, 이중체를 형성하거나 또는 혼성화하는 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "스핀 표지"라는 용어는, 전자 스핀 공명 분광 분석법에 의하여 검출될 수 있으며, 다른 분자에 부착될 수 있는, 홀 전자 스핀을 나타내는 원자로 이루어진 기(즉, 안정한 상자성 기) 또는 원자를 함유하는 분자를 의미한다. 이와 같은 스핀 표지 분자로서는 니트릴 라디칼 및 질소 산화물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 단일 스판 표지 또는 이중 스핀 표지일 수도 있다.
본원에 사용된 "화학량론적"이라는 용어는, 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비가 약 0.9∼약 1.1인 경우를 의미한다.
본원에 사용된 "유사 화학량론적"이라는 용어는, 화학 반응이, 반응 조건이나 첨가물의 존재 여부에 따라서 화학량론적으로 변하거나 또는 준 화학량론적으로 변하는 경우를 의미한다. 이와 같은 반응 조건의 변화로서는 온도 증가 또는 pH 변화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 첨가물로서는 촉진제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"엄중한 혼성화 조건"이란 어구는, 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건 하에서 DNA, RNA, PNA 서열 또는 기타 핵산 모의체 또는 이들의 조합체와 혼성화되는 조건을 의미한다. 예를 들어, 엄중한 조건 하에서, 프로브는 핵산의 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포 DNA 또는 RNA, 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)에 존재하는 표적 부분 서열에 혼성화 될 것이지만, 복합 혼합체 중에 존재하는 다른 서열과는 혼성화하지 않는다. 엄중한 조건은 서열에 따라서 달라지며, 조건이 상이함에 따라서도 달라질 것이다. 예를 들어, 길이가 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 엄중한 혼성화 조건으로서는, (i) 한정된 이온 세기를 갖는 pH에서 특정 서열에 대 한 열 용융점(Tm)보다 약 5∼10℃ 낮은 경우; (ii) pH가 약 7.0∼약 8.3일 때 염 농도가 약 0.01∼약 1.0 M이고, 온도가 약 30℃ 이상(짧은 프로브(예를 들어, 약 10∼약 50 뉴클레오티드)의 경우) 및 온도가 약 60℃ 이상(긴 프로브(예를 들어, 50 뉴클레오티드 이상)의 경우)인 경우; (iii) 불안정화제 예를 들어 포름아미드를 첨가하는 경우; (iv) 50% 포름아미드, 5×SSC 및 1% SDS, 42℃에서 항온 처리, 또는 5×SSC, 약 1% SDS, 65℃에서 항온 처리, 0.2×SSC로 세척 및 65℃의 약 0.1% SDS에서 약 5∼약 120분. 예를 들어, 선택적 또는 특이적 혼성화 여부는, 예를 들어, 양성 신호가 백그라운드의 2배 이상임을 통하여 확인할 수 있다. 핵산의 혼성화에 관한 상세한 지침은 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다.
본원에 사용된 "개체"란 용어는, 치료, 관찰 또는 실험 대상인 동물을 의미한다. 예를 들어, 개체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다.
"실질적으로 정제된"이란 용어는, 일반적으로 정제 전 목적 성분과 공존하거나 이와 상호 작용하는 성분이 실질적으로 존재하지 않거나 또는 근본적으로 존재하지 않는 경우를 의미한다. 예를 들어, 목적 화합물은, 목적 성분 제제가 오염 성분을 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만(건조 중량)을 함유할 때 "실질적으로 정제된" 상태일 수 있다. 그러므로, "실질적으로 정제된" 목적 성 분은 그 순도가 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 세포, 또는 숙주 세포(천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 재조합에 의해 생산된 경우)로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드 제제가 오염 물질을 건조 중량의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만으로 함유하는 경우, 이 제제는 "실질적으로 정제된" 것일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의하여 재조합 생산될 때, 상기 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합 생산될 때, 상기 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 배양 배지 중에 세포 건조 중량의 약 5g/ℓ, 약 4g/ℓ, 약 3g/ℓ, 약 2g/ℓ, 약 1g/ℓ, 약 750㎎/ℓ, 약 500㎎/ℓ, 약 250㎎/ℓ, 약 100㎎/ℓ, 약 50㎎/ℓ, 약 10㎎/ℓ 또는 약 1㎎/ℓ 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 순도 수준이 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상 또는 그 이상일 수 있다[예를 들어, SDS/PAGE 분석법, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기 영동법에 의해 측정함].
"치환기"라는 용어는 "비-개입 치환기"라고도 불리는데, 이는 곧, 분자 상에서 다른 기를 치환하는데 사용될 수 있는 기를 의미한다. 이와 같은 기로서는 할로, C1∼C10알킬, C2∼C10알케닐, C2∼C10알키닐, C1∼C10알콕시, C5∼C12아랄킬, C3∼C12시클로알킬, C4∼C12시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루올릴, 자일레닐, 비페닐, C2∼C12알콕시알킬, C5∼C12알콕시아릴, C5∼C12아릴옥시알킬, C7∼C12옥시아릴, C1∼C6알킬설피닐, C1∼C10알킬설포닐, -(CH2)m-O-(C1∼C10알킬)[식 중, m은 1∼8임], 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 복소환 라디칼, 치환된 복소환 라디칼, 니트로알킬, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1∼C10알킬), -C(O)-(C1-C10알킬), C2-C10알킬티오알킬, -C(O)O-(C1-C10알킬), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR2, 카보닐, -C(O)-(C1-C10알킬)-CF3, -C(O)-CF3, -C(0)NR2, -(C1-C10아릴)-S-(C6-C10아릴), -C(O)-(C6-C10아릴), -(CH2)m-0-(CH2)m-0-(C1-C10알킬)[식 중, m은 각각 1∼8임], -C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, -NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2 및 이의 염등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 나열한 것들 중 R기는 각각 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 또는 알카릴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치환기가 통상의 화학식에 의해 특정될 경우, 좌→우로 기재되며, 이것은 또한 화학식을 우→좌로 기재한, 화학적으로 동일한 치환기도 포함한다: 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-와 동일하다.
예를 들어, 알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐이라고 칭하여지는 기들 포함)에 대한 치환기로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(0)R, -NRC(0)NR2-, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN 및 -NO2. 상기 나열된 것들 중 R기로서는 각각 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 예를 들어, 1∼3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아랄킬 기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 2개의 R기가 동일한 질소 원자와 결합할 때, 이 2개의 R기는 이 질소 원자와 화합되어 5원, 6원 또는 7원의 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR2란, 예를 들어, 1-피롤리디닐 및 4-모폴리닐을 포함하는 의미이다.
예를 들어, 아릴과 헤테로아릴 기에 대한 치환기로서는 -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, -R, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4) 알킬[0∼방향족 고리 시스템상 개방 원자가(open valence)의 총 갯수일 수 있음]; 상기 나열한 것들 중 R기로서는 각각 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"이란 용어는, 질병, 병상 또는 질환이 이미 발병한 환자에게 투여된 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 양으로서, 치료될 질병, 질환 또는 병상의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 치료하거나 최소한 부분적으로나마 진행을 지연시키거나, 또는 완화하는데 충분한 양을 의미한다. 이와 같은 조성물의 효능은 예를 들어, 질병, 질환 또는 병상의 중증도 및 경과, 치료 경험, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료를 담당하는 의사의 판단에 따라서 달라진다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 통상의 실험(예를 들어, 투여량 증량 임상 실험)을 통하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "티오알콕시"란 용어는, 산소 원자에 의해 분자에 결합된 황 함유 알킬기를 의미한다.
"열 용융점" 또는 Tm이란 용어는, (제한된 이온 세기, pH 및 핵산 농도 하에서) 표적에 상보성인 프로브 중 50%가 표적 서열에 평형인 상태로 혼성화할 때의 온도를 의미한다.
본원에 사용된 "독성 부분"이란 용어는, 해를 입히거나 사멸시킬 수 있는 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료" 또는 "처치"란 용어에는 질병이나 병상의 증상을 경감, 억제 또는 완화하는 것과, 부가 증상을 예방하는 것, 증상을 유발시키는 대사상 잠재된 원인을 경감 또는 예방하는 것, 질병이나 병상을 억제하는 것 예를 들어, 질병이나 병상의 진행을 지연시키는 것, 질병이나 병상을 경감하는 것, 질병이나 병상을 퇴행시키는 것, 질병이나 병상에 의해 유발된 증상을 경감하는 것, 또는 질병이나 병상의 증상을 억제하는 것을 포함한다. 상기 "치료하다", "치료" 또는 "처치"란 용어에는 예방학적 및/또는 치료학적 처치를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "수용성 중합체"란 용어는, 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 의미한다. 이와 같은 수용성 중합체로서는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피오날데히드, 모노 C1∼C10알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본원에 참고용으로 인용된 미국 특허 제5,252,714호에 개시), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리 아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 황산덱스트란을 포함하는 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 산화폴리프로필렌/산화에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당, 글리칸, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스, 혈청 알부민, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜과 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파타미드 등, 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이와 같은 수용성 중합체를 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 폴리펩티드에 커플링시키면, 예를 들어, 수용성의 증가, 혈청 반감기의 증가 또는 조정, 치료적 반감기의 증가 또는 조정(변형되지 않은 형태의 것에 비함), 생체 이용률의 증가, 생물학적 활성의 조정, 순환 시간의 연장, 면역원성의 조정, 물리적 결합 특성 예를 들어, 응집 및 다량체 형성 특성의 조정, 수용체 결합성의 변경, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 결합성의 변경 및 수용체의 이량체화 또는 다량체화의 변경과 같은 여러 가지 변화를 초래할 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 수용성 중합체는 그 자체의 생물학적 활성을 가질 수 있거나, 아니면 그렇지 않을 수도 있다.
달리 특정하지 않는 한, 당업자의 기술 범위 내에 있는 통상의 기술인 질량 분광 분석법, NMR, HPLC, 단백질 화학적 기술, 생화학적 기술, 재조합 DNA 기술 및 약동학적 기술을 사용할 수 있다.
본원에 제시된 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 전술한 화합물들을 생산하기 위한 시약)로서는, 본원에 제시된 다수의 화학식 및 구조식에 나타낸 것과 동일하되, 하나 이상의 원자가 일반적으로 천연에서 발견되는 원자의 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의하여 치환되는, 동위 원소 표지화 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 통합될 수 있는 동위 원소의 예로서는 각각 수소, 탄소, 질소, 산소, 플루오르 및 염소의 동위 원소 예를 들어, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl을 포함한다. 본원에 개시된 임의의 동위 원소 표지화 화합물 예를 들어, 방사성 동위 원소 예를 들어, 3H 및 14C가 통합되어 있는 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 검정법(drug and/or substrate tissue distribution assay)에 유용할 수 있다. 뿐만 아니라, 동위 원소 예를 들어, 중수소 즉, 2H와의 치환을 통하여, 대사 안정성이 증가됨에 따른 치료상의 이점을 얻을 수 있는데, 예를 들어, 생체 내 반감기가 증가하거나 또는 필요 투여량이 감소할 수 있다.
본원에 개시된 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드와, 전술한 화합물을 생산하는 시약) 중 일부는 비대칭 탄소 원자를 가지므로, 거울상 이성체 또는 부분 입체 이성체로서 존재할 수 있다. 부분 입체 이성체 혼합물은 예를 들어, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정과 같이 공지된 방법에 의해 물리 화학적 차이점을 바탕으로 하여 각각의 부분 입체 이성체로 분리될 수 있다. 거울상 이성체는 적당한 광학 활성 화합물(예를 들어, 알콜)과의 반응에 의해 거울상 이성체 혼합물을 부분 입체 이성체 혼합물로 전환하고, 이 부분 입체 이성체를 분리하여, 각각의 부분 입체 이성체를 상응하는 순수한 거울상 이성체로 전환함으로써(예를 들어, 가수 분해함으로써) 분리될 수 있다. 이와 같은 모든 이성체 예를 들어, 부분 입체 이성체, 거울상 이성체 및 이들의 혼합물은 본원에 개시된 조성물의 한 부분을 이루는 것으로 간주한다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 본원에 개시된 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약)은 전구약물의 형태로 사용된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 본원에 개시된 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약)은, 추후 원하는 효과 예를 들어, 원하는 치료 효과를 얻는데 사용되는 대사산물을 생산할 필요가 있는 유기체에 투여시 대사된다. 추가의 또는 부가의 구체예는, 비천연 아미노산 및 "변형 또는 변형되지 않은" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사산물에 관한 것이다.
본원에 개시된 방법 및 제제는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 N-산화물, 결정형(다형체라고도 알려짐) 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하고 또한 이를 포함한다. 임의의 구체예에서, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 호변체로서 존재할 수 있다. 모든 호변체는 본원에 제공된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 범위 내에 포함된다. 또한, 본원에 개시된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 용매화되지 않은 형태로 존재할 수 있을 뿐만 아니라, 약학적으로 허용 가능한 용매 예를 들어, 물이나 에탄올 등으로 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 본원에 제공된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화된 형태도 또한 본 원에 개시되어 있는 것으로 생각된다.
본원의 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약)은 몇 가지 호변체의 형태로서 존재할 수 있다. 이와 같은 모든 호변체 형태의 것은 본원에 개시된 조성물의 한 부분을 이루는 것으로 간주한다. 또한, 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약)의 모든 에놀-케토 형태의 것은 본원에 개시된 조성물의 한 부분을 이루는 것으로 간주한다.
본원의 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약)중 일부는 산성으로서, 약학적으로 허용 가능한 양이온과 염을 형성할 수 있다. 본원에 개시된 화합물(예를 들어, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 그리고 전술한 화합물들을 생산하는데 사용되는 시약) 중 일부는 염기성일 수 있으므로, 약학적으로 허용 가능한 음이온과 염을 형성할 수 있다. 이와 같이 모든 염 예를 들어, 2 염은 본원에 개시된 조성물의 범위 내에 포함되며, 이러한 염은 통상의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 산성 및 염기성 물질을, 수성, 비수성 또는 부분적으로 수성인 배지 중에서 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 염은 다음과 같은 기술들 중 하나 이상의 기술을 사용하여 회수된다: 여과 기술, 비 용매를 사용하여 침전시킨 후 여과하 는 기술, 용매를 증발시키는 기술, 또는 수용액의 경우에는 동결 건조 기술.
모 비천연 아미노산 폴리펩티드에 존재하는 산성 양자가 금속 이온 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나; 또는 유기 염기와 배위 결합을 형성할 때, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용 가능한 염이 형성될 수 있다. 뿐만 아니라, 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 염 형태는 출발 물질 또는 중간체의 염을 이용하여 제조될 수 있다. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 염기 형태와 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 산과 반응시킴으로써, 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염(약학적으로 허용 가능한 염의 한 형태)으로서 제조될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 산 형태와 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 염기와 반응시킴으로써, 약학적으로 허용 가능한 염기 부가 염(약학적으로 허용 가능한 염의 한 형태)으로서 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (1) 무기산 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산 등으로 생성되었거나; 또는 유기산 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸비시클로-[2,2,2]옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3차 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산 및 뮤콘산 등으로 생성된 산 부가 염; (2) 모 화합물 내에 존재하는 산성 양자가 금속 이온 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나; 또는 유기 염기와 배위 결합을 형성할 때 생성되는 염. 허용 가능한 유기 염기로서는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민 및 N-메틸글루카민 등을 포함한다. 허용 가능한 무기 염으로서는 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨 및 수산화나트륨 등을 포함한다.
비천연 아미노산 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 염의 상응하는 반대 이온은 다양한 방법 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 모세관 전기 영동, 유도 결합 플라스마법, 원자 흡수 분광 분석법, 질량 분광 분석법 또는 이 방법의 임의의 병행법을 사용하여 분석 및 동정할 수 있다. 뿐만 아니라, 이와 같은 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 염의 치료 활성은 실시예 87∼91에 기술된 기술과 방법을 사용하여 테스트될 수 있다.
본원에서 염에 관하여 언급할 경우에는 용매 부가형 또는 이의 결정형, 특히, 용매 화합물 또는 다형체를 포함한다는 사실을 이해해야 할 것이다. 용매 화합물은 화학량론적 양 또는 비 화학량론적 양만큼의 용매를 함유하며, 종종 약학적으로 허용 가능한 용매 예를 들어, 물과 에탄올 등을 사용하는 결정화 방법을 통해 형성된다. 상기 용매가 물일 때에는 수화물이 형성되며, 또는 상기 용매가 알콜일 때에는 알콜 화합물이 형성된다. 다형체는 화합물의 동일한 기본 조성물의 상이한 결정 팩킹 배합체(crystal packing arrangement)를 포함한다. 다형체는 일반적으로 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 용융점, 밀도, 경도, 결정형, 광학적 특성 및 전기적 특성, 안정성 및 가용성이 상이하다. 다양한 인자 예를 들어, 재결정 용매, 결정화 속도, 그리고 저장 온도에 따라서 주요한 단일 결정형이 생성될 수 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드, 약학적으로 허용 가능한 염, 다형체 및/또는 용매 화합물을 스크리닝 및 특성 규명하는 방법은, 다양한 기술 예를 들어, 열 분석법, X-선 회절법, 분광 분석법, 증기 흡착법 및 현미경 관찰법을 이용하여 수행될 수 있다. 열 분석 방법이란, 화학적 열 분해 방법 또는 물리적 가열 방법 예를 들어, 다형체 전이법을 말하며, 이러한 방법은 다형체 간 관계를 분석하고, 중량 손실을 측정하여, 유리 전이 온도를 구하는데 사용되거나, 또는 부형제의 호환성을 연구하는데 사용된다. 이러한 방법으로서는 시차 주사 열량 측정법(DSC), 변조 시차 주사 열량 측정법(MDCS), 열 무게 측정 분석법(TGA) 및 열 무게 측정 및 적외선 분석법(TG/IR)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. X-선 회절법으로서는 단일 결정 및 분말 회절계 및 싱크로트론 원을 사용하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 분광 분석 기술 예를 들어, 라만(Raman) 기술, FTIR, UVIS 및 NMR(액상 및 고상)이 사용된다. 현미경을 사용하는 다양한 기술로서는, 편광 광학 현미경, 에너지 분산형 X선 분석기(EDX)를 사용하는 전자 주사 현미경(SEM), 그리고 EDX를 사용하는 환경 주사 전자 현미경(기체 또는 수증기 존재 하), IR 현미경 및 라만 현미경을 사용하는 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 방법, 조성물, 장치 및 장치들의 원리를 이용하는 예시적인 구체예를 제시하는 이하 상세한 설명과 첨부된 도면들을 통하여, 본 발명의 방법과 조성물의 특징 및 장점을 더욱 잘 이해할 수 있다.
도 1은 본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술의 임의의 측면들의 관계를 비제한적으로 도시한 것이다.
도 2는 본원에 개시된 디아민 함유 비천연 아미노산의 종류들에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 3은 본원에 개시된 디카보닐 함유 비천연 아미노산의 종류들에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 4는 본원에 개시된 케토알킨 함유 비천연 아미노산의 종류들에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 5는 본원에 개시된 비천연 아미노산을 생산하는데 사용되는 합성 방법에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 6은 본원에 개시된 비천연 아미노산을 생산하는데 사용되는 합성 방법에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 7은 본원에 개시된 비천연 아미노산을 생산하는데 사용되는 합성 방법에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 8은 본원에 개시된 비천연 아미노산을 생산하는데 사용되는 합성 방법에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 9는 디카보닐 함유 시약을 사용하여 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시켜, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 과정에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 10은 디카보닐 함유 시약을 사용하여 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시켜, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 과정에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 11의 A)는 본원에 개시된 복소환 결합의 형성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 11의 B)는 본원에 개시된 바와 같이, 마스킹된 디카보닐 함유 비천연 아미노산과, 탈 보호시 복소환 결합을 형성하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 12는 디아민 함유 시약을 사용하여 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시켜, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 과정에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 13은 디아민 함유 시약을 사용하여 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시켜, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 과정에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 14는 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 단백질을 변형하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 15는 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 단백질을 변형하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 16은 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 단백질을 변형하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 17은 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 단백질을 PEG화하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 18은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜, PEG 함유 복소환-결합 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는 PEG 함유 시약의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 19는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜, PEG 함유 복소환-결합 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는 PEG 함유 시약의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 20은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜, PEG 함유 복소환-결합 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는, 2 작용성 PEG 함유 시약의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 21은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜, 복소환-결합 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는, 2 작용성 링커의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 22는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜, PEG 함유 복소환-결합비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는, 3 작용성 PEG 함유 시약의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 23은 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG기에 결합시켜 단백질을 PEG화하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 24는 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, PEG 링커를 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키는데 2 작용성 링커기를 사용하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 25는 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 링커를 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키는데 2 작용성 링커기를 사용하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 26은 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, PEG 링커를 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키고, 또한 이 링커를 PEG화하는데 3 작용성 링커기를 사용하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 27은 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 이를 PEG기에 결합시키는데 2 작용성 링커기를 사용하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 28은 피라졸 함유 화합물의 합성에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나타내는 것이다.
도 29는 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG기로 합성하는 것에 관한, 예시적이고 비제한적인 예를 나 타내는 것이다.
I. 도입
최근 들어, 단백질 과학 분야에 전혀 새로운 기술이 보고된 바 있는데, 이 기술은 단백질의 위치 특이적 변형과 관련된 다수의 한계점들을 극복할 것으로 기대된다. 구체적으로 말하면, 새로운 성분들이 원핵 생물인 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli; E.coli)[예를 들어, L. Wang외 다수, (2001), Science 292:498-500] 및 진핵 생물인 사크로마이세스 세레비지아에(Sacchromyces cerevisiae; S. cerevisiae)[예를 들어, J. Chin외 다수, Science 301:964-7 (2003)]의 단백질 생합성 기작에 첨가되는데, 이로써 생체 내에서 단백질에 비천연 아미노산을 통합할 수 있다. 새로운 화학적, 물리학적 또는 생물학적 성질을 갖는 신규 아미노산 대다수 예를 들어, 광 친화성 표지 및 광 이성체화 아미노산, 케토 아미노산, 그리고 글리코실화된 아미노산은, 이 방법을 이용함으로써, 앰버 코돈인 TAG에 따라 이.콜라이 및 효모 내에서 단백질에 효율적이며 고 신뢰도를 가지고 통합된 바 있다. 예를 들어, 문헌[J. W. Chin외 다수, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨); J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨); J. W. Chin외 다수, (2002), PNAS United States of America 99(71):11020-11024(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨); 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-11(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)]을 참조하시오. 이러한 연구 결과를 통하여, 단백질에서는 발견되지 않으며, 20개의 일반적인 아미노산(유전자-암호화 아미노산)에서 발견되는 작용기 모두에 대해 화학적으로 비활성이고, 효율적이며 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결하을 형성하는데 사용될 수 있다는 사실이 입증되었다.
II. 개괄
도 1은 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법의 비제한적인 예를 나타내는 것이다. 제1 단계에는, 디카보닐, 디아민, 케토알킨, 케토아민 또는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기와 함께, 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생산 및 사용하는 도구(방법, 조성물 및 기술)에 관하여 기술되어 있다. 디카보닐기로서는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 디아민기로서는 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기, 그리고 1,4-디아민기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 비천연 아미노산은 작용기 예를 들어, 원하는 작용기를 추가로 포함할 수 있다. 전술한 다양한 작용기들은, 하나의 작용기 일원이 다른 작용기의 일원으로 분류될 수 없다는 사실을 함축하는 의미가 아님에 주의해야 한다. 실제로, 특정 환경에 따라서 중첩될 경우도 있을 것이다. 예를 들어, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 범위가 중첩되지만, 이와 같은 중첩은 완전한 것은 아니므로 두 가지 작용기가 모두 전술되어 있는 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 하나의 측면은 본원에 개시된 방법, 조성물 및 기술을 이용하여 변형될 폴리펩티드를 선별 및 디자인하는 방법에 관한 것이다. 신규의 폴리펩티드는, 예를 들어, 고 처리량 스크리닝 방법(이 경우, 다양한 폴리펩티드가 디자인, 합성, 특성 규명 및/또는 테스트될 수 있음)의 일환으로서, 또는 연구자의 연구 목적을 바탕으로 하여 새로 디자인될 수 있다. 신규의 폴리펩티드는 또한 공지된 폴리펩티드나 부분적으로 특성 규명된 폴리펩티드의 구조를 바탕으로 하여 디자인될 수도 있다. 예를 들어, 성장 호르몬 유전자 상과(도 1 참조)는 과학 학회에 의해 집중적으로 연구되고 있는 대상이며; 신규의 폴리펩티드는 이 유전자 상과의 일원 또는 일원들의 구조를 바탕으로 하여 디자인될 수 있다. 어느 아미노산(들)이 치환 및/또는 변형되었는지 선별하는 원리에 관하여는 본원에 별도로 기술되어 있다. 어느 변형법을 사용할지에 관하여도 본원에 기술되어 있으며, 또한 실험자나 최종 사용자의 필요를 충적시키는데 사용될 수 있다. 이러한 필요 사항으로서는 폴리펩티드의 치료적 효능을 조작하는 것, 이 폴리펩티드의 안전성 프로필을 개선하는 것, 이 폴리펩티드를 약물 동태학, 약리학 및/또는 약력학에 맞추는 것, 예를 들어, 수용성, 생체 이용률, 혈청 반감기 및 치료적 반감기를 증가시키는 것, 면역원성을 조정하는 것, 생물학적 활성을 조정하는 것, 또는 순환 시간을 연장하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 이와 같은 변형법으로서는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 부가 작용기를 제공하는 것, 태그, 표지 또는 검출 가능한 신호를 상기 폴리펩티드에 통합하는 것, 상기 폴리펩티드의 분리 특성을 개선하는 것과, 전술한 변형법을 병행 수행하는 것을 포함한다.
또한, 본원에는 디아민, 디카보닐, 케토알킨, 케토아민 또는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 보유하거나 함유하도록 변형될 수 있는 비천연 아미노산에 관하여 기술되어 있다. 상기 디카보닐로서는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 상기 디아민으로서는 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기 및 1,4-디아민기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 측면에는 이와 같은 비천연 아미노산을 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법도 포함된다. 본원에 개시된 다른 측면은, 이와 같이 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합하는 방법, 기법 및 기술에 관한 것이다. 또한, 본 측면에는 이와 같은 비천연 아미노산을 하나 이상 함유하는 폴리펩티드를 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법도 포함된다. 또한, 본 측면에는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 생산(적어도 부분적으로나마 생산)하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, DNA 및 RNA)를 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법과 이 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물도 포함된다. 또한, 본 측면에는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 생산(적어도 부분적으로나마 생산)하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 세포를 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법과 이 세포를 포함하는 조성물도 포함된다.
그러므로, 디아민, 디카보닐, 케토알킨, 케토아민 또는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 포함하는, 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공되어 있으며, 또한 기술되어 있다. 디카보닐 변형된 비천연 아미노산은 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 디아민 변형 비천연 아미노산은 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기 및 1,4-디아민기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 구체예에서, 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산과, 디아민, 디카보닐, 케토알킨, 케토아민 또는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 포함하는 폴리펩티드는, 폴리펩티드 상 몇몇 위치에, 하나 이상의 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형을 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 디카보닐 변형 비천연 아미노산은 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 디아민 변형 비천연 아미노산은 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기 및 1,4-디아민기를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구체예에서, 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 세포 내 기구(예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미트산염 부가, 인산화 및 당 지질-결합 변형 등)를 통하여 발생하고, 다수의 경우, 이와 같은 세포 내 기구를 바탕으로 한 동시 번역 또는 번역 후 변형은 폴리펩티드 상에 존재하는 천연 생성 아미노산 위치에서 일어나지만, 임의의 구체예에서는, 세포 내 기구를 바탕으로 한 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 폴리펩티드 상에 존재하는 비천연 아미노산 위치(들)에서 일어난다.
다른 구체예에서, 번역 후 변형은 세포 내 기구를 이용하지 않지만, 그 대신 작용기는, 본원에 개시된 화학적 방법 또는 특정 반응기에 적합한 기타 방법을 이용하여, 제2의 반응기를 포함하는 분자(예를 들어, 원하는 작용기)를 제1의 반응기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산(예를 들어, 디카보닐, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르, 케토티오에스테르, 케토알킨, 케토아민, 디아민, 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민, 1,2-디아민, 1,3-디아민, 1,4-디아민, 또는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환, 작용기를 함유하는 비천연 아미노산)에 부착함으로써 제공된다. 임의의 구체예에서, 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 진핵 생물 세포 또는 진핵 생물이 아닌 세포 내에서 생체 내 이루어진다. 임의의 구체예에서, 상기 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 세포 내 기구를 이용하지 않고서도 시험관 내에서 이루어진다. 또한, 본 측면에는 이와 같이 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하는 폴리펩티드를 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법도 포함된다.
또한, 본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술의 범위 내에는, 폴리펩티드의 일부인 비천연 아미노산(디카보닐기, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르, 케토티오에스테르, 케토알킨, 케토아민, 디아민, 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민, 1,2-디아민, 1,3-디아민, 1,4-디아민 또는 이의 보호형을 함유하는 비천연 아미노산)과 반응하여 전술한 번역 후 변형 중 임의의 변형을 일으킬 수 있는 시약도 포함된다. 일반적으로, 생성된 번역 후 변형된 아미노산은 하나 이상의 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환, 또는 알돌계 기를 함유할 것이며, 결과로 변형된 복소환 또는 알돌계 비천연 아미노산은 후속 변형 반응을 수행할 수 있다. 또한, 본 측면에는 이와 같은 비천연 아미노산(들)의 번역 후 변형 중 임의의 변형을 일으킬 수 있는 시약을 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법도 포함된다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나의 숙주 세포에 의해 생체 내 일어나는 한 가지 이상의 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형을 포함하는데, 여기서, 상기 번역 후 변형은 일반적으로 다른 숙주 세포 유형에 의해서는 일어나지 않는다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 진핵 생물 세포에 의해 생체 내 일어나는 한 가지 이상의 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형을 포함하는데, 여기서, 상기 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 일반적으로 진핵 생물이 아닌 세포에 의해서는 일어나지 않는다. 이와 같은 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형에 관한 예로서는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미트산염 부가, 인산화 및 당 지질-결합 변형 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은, (예를 들어, 올리고당이 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우) GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해, 올리고당을 아스파라긴에 부착시키는 과정을 포함한다. 다른 구체예에서, 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 세린이나 트레오닌에 올리고당(예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등)을 결합시키는 과정을 포함한다. 분비 신호 서열의 예로서는 원핵 생물 분비 신호 서열, 진핵 생물 분비 신호 서열, 박테리아 내 발현을 위하여 5'-최적화된 진핵 생물 분비 신호 서열, 신규의 분비 신호 서열, 펙테이트 분해 효소 분비 신호 서열, OmpA 분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분비 신호 서열의 예로서는 STII(원핵 생물), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모) 및 트랜스포존으로부터 유래된 신호 서열 bla를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 구체예에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합체 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 측면에는 이와 같은 동시 번역 변형 또는 번역 후 변형을 하나 이상 포함하는 폴리펩티드를 생산, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법도 포함된다. 다른 구체예에서, 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 글리코실화되지 않은 형태로서 생산된다. 이와 같이 글리코실화된 비천연 아미노산의 글리코실화되지 않은 형태의 것은 분리 또는 실질적으로 정제 또는 정제되지 않은, 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드에서 올리고당 기를, 화학적으로 또는 효소에 의해 제거하는 단계를 포함하는 방법; 상기 비천연 아미노산을 글리코실화하지 않는 숙주(예를 들어, 이와 같은 폴리펩티드를 글리코실화하지 않도록 조작 또는 돌연변이시킨 원핵 생물 또는 진핵 생물과 같은 숙주) 내에서 비천연 아미노산을 생산하는 방법; 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드가 일반적으로 이 폴리펩티드를 글리코실화하는 진핵 생물에 의해 생산되는, 세포 배양 배지에 글리코실화 억제 인자를 도입하는 방법; 또는 이러한 방법들 중 임의의 방법을 병행하여 생산될 수 있다. 또한, 본원에는 일반적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화되지 않은 형태의 것도 포함된다("일반적으로 글리코실화된"이란, 천연 생성 폴리펩티드가 글리코실화되는 조건 하에서 폴리펩티드가 생산될 때 글리코실화되는 경우를 의미함). 물론, 일반적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화되지 않은 형태의 것은 정제되지 않은 형태, 실질적으로 정제된 형태 또는 분리된 형태를 가질 수 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드는 디카보닐기, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르, 케토티오에스테르, 케토알킨, 케토아민, 디아민, 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민, 1,2-디아민, 1,3-디아민, 1,4-디아민, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기, 알돌계 기, 또는 이의 보호형을 함유하는 비천연 아미노산을, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 임의의 구체예에서, 단백질의 천연 생성 형태 내에 존재하는 하나 이상(단, 전부보다는 적은 수)의 특정 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환된다.
본원에 제공 및 개시된 방법 및 조성물은 디카보닐기, 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르, 케토티오에스테르, 케토알킨, 케토아민, 디아민, 히드라진, 아미딘, 이민, 1,1-디아민, 1,2-디아민, 1,3-디아민, 1,4-디아민, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기, 알돌계 기, 또는 이의 보호형 또는 마스킹된 형태의 것을 함유하는, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 도입하면, 특정 화학 반응 예를 들어, 일반적으로 생성되는 20개의 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비천연 아미노산과 반응하는 반응이 관여하는 접합 화학 반응이 일어날 수 있다. 일단 통합되면, 상기 천연 생성되지 않는 아미노산 측쇄는 또한 본원에 개시되었거나 또는 천연 암호화 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적당한 화학적 방법에 의해 변형될 수도 있다.
본원에 개시된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 다양한 작용기, 치환기 또는 부분들을 가지는 물질과, 기타 물질의 접합체를 원하는 작용기에 제공한다.
임의의 구체예에서, 본원에 개시된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 링커 및 시약(예를 들어, 화학식 I∼LXVII의 화합물)은 약산성 조건(예를 들어, pH 약 2∼약 8) 하의 수용액 중에서 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 약산성 조건하에 1개월 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 약산성 조건 하에 약 2주 이상 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 약산성 조건 하에 약 5일 이상 동안 안정하다.
본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법의 다른 측면은, 전술한 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 임의의 것을 연구 또는 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 측면에는 예를 들어, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질이나, 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을, 치료, 진단, 분석, 산업, 화장품, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 소비 제품 관련 분야 및/또는 군용으로 사용하는 것도 포함된다.
III. 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 위치
본원에 개시된 방법 및 조성물은 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합하는 것과 관계되어 있다. 하나 이상의 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 하나 이상의 특정 위치에 통합될 수 있다. 이러한 과정은 "보존적" 치환 예를 들어, 소수성 아미노산과 비천연 또는 천연의 소수성 아미노산의 치환, 벌키한 아미노산과 비천연 또는 천연의 벌키한 아미노산의 치환, 친수성 아미노산과 비천연 또는 천연의 친수성 아미노산의 치환 및/또는 활성과는 무관한 위치에의 비천연 아미노산의 삽입에 의해 이루어질 수 있다.
다양한 생화학적 방법 및 구조적 방법이 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 치환에 바람직한 위치를 선별하는데 사용될 수 있다. 폴리펩티드 사슬의 임의의 위치는 비천연 아미노산을 통합하기 위한 선별에 적당하며, 이러한 선별 과정은 합리적인 디자인을 바탕으로 할 수 있거나, 아니면 특별한 목적을 가지고 또는 특별한 목적을 가지지 않고 무작위로 선별함으로써 수행될 수 있다. 원하는 위치를 선별하는 방법은 임의의 원하는 특성 또는 활성 예를 들어, 작동제, 초-작동제, 부분 작동제, 역 작동제, 길항제, 수용체 결합 조정제, 수용체 활성 조정제, 결합 파트너와의 결합 조정제, 결합 파트너 활성 조정제, 결합 파트너 형태 조정제로서의 활성, 이량체 또는 다량체 형성 활성, 원래 분자에 비하여 활성 또는 특성에 변화가 없다는 특성, 또는 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 특성 예를 들어, 가용성, 응집성 또는 안정성 조정 활성을 가지는 비천연 아미노산 폴리펩티드(추가로 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않은 채 잔류할 수 있는 폴리펩티드)를 생산하는 것을 바탕으로 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 필수적인 폴리펩티드 내 위치는 점 돌연변이 분석법, 알라닌 스캐닝법 또는 상동체 스캐닝법과 같은 방법을 이용하여 동정될 수 있다. 방법 예를 들어, 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 잔기 이외의 잔기들은, 폴리펩티드에 대한 원하는 활성에 따라서, 비천연 아미노산과의 치환에 대해 훌륭한 후보 물질일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 위치들은 또한, 폴리펩티드에 필요한 원하는 활성에 따라서, 비천연 아미노산과의 치환에 대해 훌륭한 후보 물질일 수 있다. 기타 대안으로서는 간단히 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 각각의 위치를 비천연 아미노산으로 연속 치환하고, 이 치환이 폴리펩티드의 활성에 미치는 효과를 관찰하는 방법이 있다. 비천연 아미노산으로 치환되는 위치를 임의의 폴리펩티드 내에서 선별하는 수단, 기술 또는 방법은 본원에 개시된 방법, 기술 및 조성물에 사용하기 적당하다.
결실부를 포함하는 폴리펩티드의 천연 생성 돌연변이체의 구조 및 활성도 관찰하여, 비천연 아미노산과의 치환에 대해 관용할 것 같은 단백질의 영역을 확인할 수도 있다. 일단 비천연 아미노산과의 치환에 대해 관용하지 않을 것 같은 잔기가 제거되면, 제안되었던 치환이 나머지 위치 각각에 미치는 영향력을, 예를 들어, 관련 폴리펩티드와 임의의 관련 리간드 또는 결합 단백질의 3차원 구조를 분석하는 방법에 의해 관찰할 수 있다. 다수의 폴리펩티드에 대한 X-선 결정 분석에 따른 구조 및 NMR 구조는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)(PDB, www.rcsb.org) 즉, 단백질 및 핵산의 거대 분자에 대한 3차원 구조 데이터를 포함하는 중앙 집중 데이터베이스에서 입수 가능하며, 이는 비천연 아미노산과 치환될 수 있는 아미노산 위치를 확인하는데 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 3차원 구조 데이터를 얻을 수 없다면, 폴리펩티드의 2차 구조 및 3차 구조를 연구하기 위한 모델을 제작할 수 있다. 그러므로, 비천연 아미노산과 치환될 수 있는 아미노산 위치의 동일성을 용이하게 얻을 수 있다.
비천연 아미노산의 대표적인 통합 위치로서는 잠재적 수용체 결합부로부터 제외된 위치를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또는 결합 단백질이나 결합 리간드에 결합할 부위는 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있는데, 이 경우, 인접한 잔기와 최소한의 수소 결합 상호 작용을 일으키거나 또는 수소 결합 상호 작용을 일으키지 않을 수 있으며, 또한 인접한 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있으며/있거나, 관련 수용체, 리간드 또는 결합 단백질을 포함하는 특정 폴리펩티드의 3차원 결정 구조에 의해 예측되는 바와 같이 가요성이 큰 부위 내에 존재할 수 있다.
다양한 비천연 아미노산은 폴리펩티드 내 특정 위치에서 치환되거나 또는 이 위치에 통합될 수 있다. 예를 들어, 특정 비천연 아미노산은, 폴리펩티드와 결합된 리간드, 수용체 및/또는 결합 파트너의 3차원 결정 구조를 관찰한 결과를 바탕으로 하는, 통합(바람직하게는 보존적 치환)용으로서 선별될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 개시된 방법은, 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 통합하는 단계[여기서, 비천연 아미노산은 제1 반응기를 포함함]; 및 이 폴리펩티드와 제2의 반응기를 포함하는 분자(예를 들어, 원하는 작용기)를 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 제1의 반응기는 카보닐 또는 디카보닐부가며, 제2의 반응기는 디아민 부분으로서, 이로써 복소환 결합이 형성된다. 임의의 구체예에서, 상기 제1의 반응기는 디아민 부분이고, 제2의 반응기는 카보닐 또는 디카보닐부으로서, 이로써 복소환 결합이 형성된다.
몇몇 경우에 있어서, 비천연 아미노산 치환(들) 또는 통합(들)은 폴리펩티드 내 기타 부가, 치환 또는 결실과 합하여져, 기타 화학적, 물리적, 약리학적 및/또는 생물학적 특징에 영향을 미친다. 몇몇 경우에 있어서, 기타 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(예를 들어, 단백 분해에 대한 내성)을 증가시키거나, 또는 적당한 수용체, 리간드 및/또는 결합 단백질에 대한 폴리펩티드의 친화성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 기타 부가, 치환 또는 결실은 (예를 들어, 폴리펩티드가 이.콜라이 또는 기타 숙주 세포 내에서 발현될 때) 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 구체예에 있어서, 이.콜라이 또는 기타 재조합 숙주 세포 내에서 발현된, 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 목적으로, 비천연 아미노산을 통합하기 위한 다른 위치 이외에, 천연 암호화 아미노산 또는 비천연 아미노산과 치환하기 위한 위치를 선별한다. 몇몇 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 관련 리간드, 결합 단백질 및/또는 수용체에 대한 친화성을 조정하거나, 수용체의 이량체화를 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)하거나, 수용체 이량체를 안정화하거나, 순환 반감기를 조정하거나, 방출 또는 생체 이용률을 조정하거나, 정제를 촉진하거나, 또는 특정 투여 경로를 개선 또는 변경하는, 기타 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 이와 유사하게, 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 검출 특성(예를 들어, GFP), 조직 또는 세포막을 통한 운반 특성, 전구약물 방출 또는 활성화, 크기의 축소, 정제 특성 또는 기타 특성을 개선 시키는, 화학적 또는 효소적 절단 서열, 단백질 분해 효소 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(예를 들어, FLAG 또는 폴리-His) 또는 기타 친화성을 바탕으로 하는 서열(예를 들어, FLAG, 폴리-His 또는 GST 등) 또는 결합 분자(예를 들어, 바이오틴)를 포함할 수 있다.
IV. 대표예로서의 성장 호르몬 초 유전자군
본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 부류 또는 군에 한정되지 않는다. 실제로, 대부분의 임의의 폴리펩티드는 본원에 개시된 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산을 포함하도록 디자인 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질과 상동성일 수 있다: 알파-1 항 트립신, 안지오스타틴, 항 용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포 지방 단백질, 아포 단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-1O, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 시토킨, CC 케모카인, 단핵구 주화성 단백질-1, 단핵구 주화성 단백질-2, 단핵구 주화성 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 집락 형성 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제 인자, 보체 수용체 1, 시토킨, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 상피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소(exfoliating toxin), 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유 아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 묶음 단백질(four-helical bundle protein), G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질(hedgehog protein), 헤모글로빈, 간 세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 임의의 인터페론 유사 분자 또는 IFN 군의 일원, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴튜린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 발암 유전자 생산물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 인자 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 초항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 과산화물 디스뮤타제, 독소 충격 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론(이하, "원하는 폴리펩티드"라고 칭함).
그러므로, 이하에 기술된 성장 호르몬(GH) 초 유전자군에 관한 설명은 예시를 위하여 제공된 것으로서, 예를 든 것일 뿐 본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술의 범위를 제한하는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 본 출원에 개시된 GH 폴리펩티드에 관한 사항은 GH 초 유전자군의 임의의 일원에 대한 예로서, 일반적인 용어를 사용하였다. 그러므로, GH 폴리펩티드 또는 단백질을 참고로 하여 본원에 개시된 변형법 및 화학적 방법은 GH 초 유전자군에 속하는 임의의 일원 예를 들어, 본원에 구체적으로 나열된 일원에 똑같이 적용될 수 있다.
이하의 단백질은 성장 호르몬(GH) 초 유전자군에 속하는 유전자에 의하여 암호화되는 것들이다[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)]: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 적혈구 생성 촉진 인자(EPO), 혈소판 증식 인자 (TPO), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴(oncostatin) M, 섬모 신경 영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 토우 인터페론, 과립구-집락 형성 인자(G-CSF), 과립구-대식 세포 집락 형성 인자(GM-CSF), 대식 세포 집락 형성 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀(cardiotrophin)-1(CT-1)("GH 초 유전자군"). 이 유전자군에 속하는 부가의 일원들은 유전자 클로닝 및 서열 결정을 통하여 앞으로 동정될 것으로 기대된다. GH 초 유전자군에 속하는 일원들은, 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 상동성을 가짐에도 불구 하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유하는 구조적 특징으로 인하여, 유전자군의 새로운 일원들을 용이하게 동정할 수 있고, 본원에 기술된 비천연 아미노산을 사용하는 방법과 이를 포함하는 조성물에도 유사하게 적용될 수 있다.
다수의 시토킨 예를 들어, G-CSF(Zink외 다수, FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink외 다수, Biochemistry 33:8453 (1994); Hill외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5167 (1993)), GM-CSF(Diederichs, K.외 다수, Science 154: 1779-1782 (1991); Walter외 다수, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2(Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992), IL-4(Redfield외 다수, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers외 다수, Science 256:1673-1677 (1992)) 및 IL-5(Milburn외 다수, Nature 363: 172-176 (1993))의 구조는 X-선 회절법과 NMR 연구에 의해 측정될 수 있으며, 측정한 결과 1차적 서열 상동성이 거의 존재하지 않았음에도 불구하고, GH 구조와 상당 부분 동일함을 알 수 있었다. IFN은 모델링 및 기타 연구를 바탕으로 하였을 때, 상기 단백질 군의 일원인 것으로 생각된다[Lee외 다수, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo외 다수, Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan외 다수, Structure 4:1453 (1996); Klaus외 다수, J. Mol. Biol. 274:661 (1997)]. 부가의 시토킨 및 성장 인자 예를 들어, 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 혈소판 증식 인자(TPO), 온코스타틴 M, 대식 세포 집락 형성 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-집락 형성 인자(G-CSF)와, IFN 예를 들어, 알파, 베타, 오메가, 토우, 엡실론 및 감마 인터페론의 다수가 이 군에 속한다[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]. 상기 시토킨 및 성장 인자 모두는 하나의 거대 유전자군을 포함하는 것으로 생각된다.
유사한 2차 구조 및 3차 구조를 공유하는 이외에, 이 군에 속하는 일원들은 세포 표면 수용체를 올리고머로 모아서 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하여야 하는 특성도 공유한다. 몇몇 GH 군의 일원 예를 들어, GH 및 EPO는 한 가지 유형의 수용체에 결합하여, 이 수용체가 동종 이량체를 형성하도록 만든다. 이 군에 속하는 기타 일원들 예를 들어, IL-2, IL-4 및 IL-6은 한 가지 이상의 수용체와 결합하여, 이 수용체들이 이종 이량체 또는 이보다 더욱 많은 수의 수용체로 이루어진 응집체를 형성하도록 만든다[Davis외 다수, (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa외 다수, (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]. 돌연변이 유발 연구 결과, GH와 마찬가지로, 기타 시토킨 및 성장 인자는 다수의(통상적으로 2개) 수용체 결합 위치를 함유하며, 이 시토킨 및 성장 인자의 동계열 수용체에 연속적으로 결합한다는 사실을 알 수 있었다[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews외 다수, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476]. GH와 마찬가지로, 상기 기타 군에 속하는 일원들에 대한 1차적 수용체 결합 위치는 주로 4개의 알파 나선부 및 A-B 루프에 존재한다. 수용체 결합에 관여하는 나선형 묶음 내에 존재하는 특정 아미노산은 군의 일원 들마다 상이하다. GH 초 유전자군의 일원과 상호 작용하는 대부분의 세포 표면 수용체는 구조적으로 관련되어 있으며, 또한 제2의 거대 복수 유전자군을 포함한다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,608,183호를 참조하시오.
GH 초 유전자군에 속하는 여러 가지 일원에 관한 돌연변이 연구를 통하여 일반적으로 도달하게 되는 결론은, 알파 나선부를 연결하는 루프는 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않는다는 사실이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 대부분의(전부는 아닌) 유전자군의 일원에 있어서 수용체 결합에 필수적이지는 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, 상기 B-C 루프는 본원에 기술된 바와 같이 GH 초 유전자군에 속하는 일원들 중의 비천연 암호화 아미노산과 치환될 수 있다. (GH 상위군에 속하는 인터페론/IL-10 유사 일원의) A-B 루프, C-D 루프 (및 D-E 루프)도 또한 비천연 아미노산과 치환될 수 있다. A 나선부와 인접하는 아미노산 및 말단부에 존재하는 나선부로부터 멀리 떨어져 존재하는 아미노산은 또한 수용체 결합에 관여하지 않는 성향이 있으며, 또한 이는 비천연 아미노산을 도입시키는 위치가 될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산은 루프 구조내 임의의 위치 예를 들어, A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산에서 치환된다. 몇몇 구체예에 있어서, 비천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산에서 치환된다.
GH 군에 속하는 임의의 일원 예를 들어, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-1O, IL-12 p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론은 N-결합 당 및/또는 O-결합 당을 포함한다. 단백질 내 글리코실화 위치는 대부분 루프 부위에만 존재하며 알파 나선 묶음에는 존재하지 않는다. 일반적으로 루프 부위는 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유 결합 위치가 되기 때문에, 상기 루프 부위는 단백질에 비천연 아미노산을 치환을 도입시키는데 유용한 위치일 수 있다. 단백질내 N- 및 O-결합 글리코실화 위치를 포함하는 아미노산은 비천연 아미노산 치환을 위한 위치일 수 있는데, 그 이유는 이 아미노산이 표면에 노출되어 있기 때문이다. 그러므로, 천연 단백질은 글리코실화 위치에서 이 단백질과 결합 되어 있는 벌키한 당 기를 묵인(tolerate)할 수 있으며, 이 글리코실화 위치는 수용체 결합 위치로부터 멀리 떨어져서 위치하는 성향이 있다.
상기 GH 유전자군의 부가적인 일원은 앞으로 발견될 것이다. GH 초 유전자군에 속하는 새로운 일원들은 예측 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석과, 특정 표적에 결합하는 분자를 동정하도록 디자인된 선택 기술에 의해 동정될 수 있다. GH 초 유전자군의 일원들은 통상적으로 비-나선형 아미노산(루프 부위)에 의해 연결되어 있는 4개 또는 5개의 양 친매성 나선부를 보유한다. 상기 단백질은 N-말단에 소수성 신호 서열을 함유하여 세포로부터의 분비를 촉진할 수 있다. 이와 같이 나중에 발견된 GH 초 유전자군의 일원도 본원에 개시된 방법 및 조성물에 포함된다.
V. 비천연 아미노산
본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용된 비천연 아미노산은 하기와 4 가지 특성 중 하나 이상의 특성을 나타낸다: (1) 비천연 아미노산의 측쇄에 존재하는 하나 이상의 작용기는 20개의 일반적인, 유전자 암호화 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학 반응성에 직교하거나, 또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 존재하는 천연 생성 아미노산의 화학 반응성에 적어도 직교하는, 하나 이상의 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 가진다는 점; (2) 도입된 비천연 아미노산은 20개의 일반적인, 유전자 암호화 아미노산에 대하여 실질적으로 화학적 비활성이라는 점; (3) 비천연 아미노산은, 바람직하게는 천연 생성 아미노산과 동일한 안정성을 가지고 또는 통상의 생리 조건 하에서 폴리펩티드에 안정적으로 통합될 수 있으며, 또한 바람직하게는 이와 같은 통합은 생체 내 시스템을 통해 이루어질 수 있다는 점; 그리고 (4) 비천연 아미노산은 디카보닐기, 디케톤기, 케토알데히드기, 케토산기, 케토에스테르기, 케토티오에스테르기, 케토알킨기, 케토아민기, 디아민, 알돌계 기, 디아민기, 히드라진기, 아미딘기, 이민기, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기, 1,4-디아민기, 복소환기 예를 들어, 질소 함유 복소환기, 또는 바람직하게는, (물론 생물학적 특성의 파괴가 변형/변환의 목적으로 행하여 지지 않는다면) 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는 조건 하에서, 또는 바람직하게는 이와 같은 변환이 pH 약 4∼약 10, 또는 pH 약 3∼약 8, 또는 약 2∼약 9, 또는 약 4∼약 9의 수성 조건 하에서 일어날 수 있는 경우, 또는 바람직하게는 비천연 아미노산의 반응성 위치가 친전자성 위치인 경우, 시약과 반응하여, 디카보닐기, 디케톤기, 케토알데히드기, 케토산기, 케토에스테르기, 케토티오에스테르기, 케토알킨기, 케토아민기, 디아민, 알돌계 기, 디아민기, 히드라진기, 아미딘기, 이민기, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기, 1,4-디아민기, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기로 변환될 수 있는 작용기를 포함한다는 점. 상기와 같이 본원에 개시된 조성물과 방법에 사용될 수 있는 비천연 아미노산에 대한 4 가지 특성들을 만족시킬 수 있는 아미노산에 대한 예시적이고도 비제한적인 예를 도 2∼도 4에 제시하였다. 임의의 수의 비천연 아미노산이 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 비천연 아미노산은 또한 보호 또는 마스킹된 디카보닐기, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기, 케토알킨, 케토아민, 알돌계 기, 디아민기를 포함할 수 있거나, 상기 보호기가 탈 보호되거나 마스킹된 기가 탈마스크화된 이후, 디카보닐기, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기, 케토알킨, 케토아민, 알돌계 기 또는 디아민기로 전환될 수 있는, 보호 또는 마스킹된 기를 포함할 수도 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 비천연 아미노산으로서는광활성화 가교제, 스핀 표지화 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규의 작용기를 갖는 아미노산, 기타 분자들과 공유 또는 비공유 상호 작용을 하는 아미노산, 광 케이지화 및/또는 광 이성체화 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산 예를 들어, 당 치환 세린, 기타 탄수화물 변형 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 폴리에테르 포함 아미노산, 중원자 치환 아미노산, 화학적으로 분해 가능하고/가능하거나 광 분해 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비하여 측쇄가 연장된 아미노산 예를 들어, 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소 예를 들어, 약 5개 이상 또는 약 10개 이상의 탄소를 갖는 장쇄 탄화수소를 갖는 아미노산, 탄소-결합 당 함유 아미노산, 산화 환원-활성화 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산은 당 부분을 포함한다. 이와 같은 아미노산의 예로서는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로서는 또한 아미노산과 당 사이의 천연 생성 N- 또는 O-결합이 천연에서는 일반적으로 찾아 볼 수 없는 공유 결합(예를 들어, 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 및 디카보닐 등)으로 치환된 아미노산을 포함한다. 뿐만 아니라, 이러한 아미노산의 예로서는 일반적으로 천연 생성 단백질에서 살펴볼 수 없는 당 예를 들어, 2-데옥시-글루코스 및 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.
비천연 아미노산을 이와 같은 폴리펩티드에 통합함으로써 이 폴리펩티드에 통합된 화학적 부분은, 폴리펩티드에 다양한 이점을 제공하도록 이 폴리펩티드를 조작할 수 있다. 예를 들어, 유일한 비천연 아미노산(예를 들어, 벤조페논 및 아릴아지드(예를 들어, 페닐아지드) 측쇄를 갖는 아미노산)은 단백질의 생체 내 및 시험관 내 광가교에 효율적일 수 있다. 광 반응성 비천연 아미노산의 예로서는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이후 광 반응성 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 의도하는 바에 따라서 광 반응기의 여기를 일시적으로 제어함으로써 가교될 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, 비천연 아미노산의 메틸기는 예를 들어, 핵 자기 공명법 및 진동 분광 분석법에 사용되는 국부 구조 및 동력학에 대한 프로브인, 동위 원소 표지화 메틸기로 치환될 수 있다.
A. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 디아민, 디아민 유사, 마스킹된 디아민, 그리고 보호된 디아민 기
친핵성 반응기를 포함하는 아미노산은 친전자성 부가 반응을 통하여 분자들을 결합시키는 다양한 반응을 수행할 수 있다. 이와 같은 친핵성 반응기로서는 디아민기(예를 들어, 히드라진기, 아미딘기, 이민기, 1,1-디아민기, 1,2-디아민기, 1,3-디아민기 및 1,4-디아민기), 디아민 유사기(디아민기와 유사한 반응성을 나타내는 기로서, 디아민기와 구조적으로 유사한 기), 마스킹된 디아민기(디아민기로 용이하게 전환될 수 있는 기), 또는 보호된 디아민기(탈 보호시 디아민기와 유사한 반응성을 나타내는 기)를 포함한다. 이러한 아미노산으로서는 화학식 I의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00002
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
J는
Figure 112008047567393-PCT00003
이고;
R8 및 R9는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되며;
T1은 결합으로서, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이고;
T2는 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이며;
여기서, 각각의 임의의 치환기는 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 치환된 저급 시클로알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 알키닐, 저급 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 저급 헤테로시클로알킬, 치환된 저급 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아릴킬로부터 독립적으로 선택되고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고; 그리고
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-A-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 시클로아릴 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
여기서, -A-B-J-R 상에 존재하는 하나 이상의 아민기는 경우에 따라 보호된 아민임].
하나의 측면은, 다음과 같은 화학식 1 및 화학식 2를 포함하는 화합물 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물에 관한 것이다.
Figure 112008047567393-PCT00004
Figure 112008047567393-PCT00005
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
T1은 결합 또는 CH2이고;
T2는 CH이며;
여기서, 각각의 임의의 치환기는 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 치환된 저급 시클로알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 알키닐, 저급 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 저급 헤테로시클로알킬, 치환된 저급 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아릴킬로부터 독립적으로 선택되고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고; 그리고
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-A-B-디아민 함유부는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-B-디아민 함유부 기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 시클로아릴 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
여기서, -A-B-디아민 함유부 상의 하나 이상의 아민기는 경우에 따라 보호된 아민임].
하나의 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, A는 치환 또는 비치환 저급 알킬렌이거나, 또는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 또는 티오페닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비치환 또는 치환 아릴렌인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)2(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, B는 -O(CH2)-, -NHCH2-, -C(O)-(CH2)-, -CONH-(CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2- 또는 -S(O)2CH2-인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R1은 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA) 또는 벤질옥시카보닐(Cbz)인 화합물에 관한 것이다. 제1항의 화합물은 R1이 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 폴리뉴클레오티드인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 리보핵산(RNA)인 화합물에 관한 것이다. 추가의 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 tRNA인 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, tRNA가 셀렉터 코돈을 특이적으로 인지하는 화합물에 관한 것이다. 다른 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물에 관한 것이다. 추가의 구체예는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물에 관한 것이되, 다만, R2가 서프레서 tRNA인 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 화학식 I의 구조를 갖는 아미노산에 관한 다음과 같은 비제한적인 예들도 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00006
Figure 112008047567393-PCT00007
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며/있거나, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
임의의 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 1개월 이상 동안 안정하다. 임의의 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 2주 이상 동안 약산성 조건하에 안정하다. 임의의 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 5일 이상 동안 약산성 조건하에 안정하다. 임의의 구체예에서, 상기 산성 조건은 pH 약 2∼약 8인 경우이다.
화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, B는 저급 알킬렌, 치환된 저 급 알킬렌, O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, C(R')=NN(R')-, -N(R')CO-, C(O)-, -C(R')=N-, C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CON(R')(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)2(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, B는 -0(CH2)-, -CH=N-, CH=NNH-, -NHCH2-, -NHCO-, C(O)-, C(O)(CH2)-, CONH(CH2)-, -SCH2-, - S(=O)CH2- 또는 -S(O)2CH2-이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R은 C1∼6알킬 또는 시클로알킬이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R은 -CH3, -CH(CH3)2 또는 시클로프로필이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R1은 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA) 또는 벤질옥시카보닐(Cbz)이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 리보핵산(RNA)이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 tRNA이다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인지한다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 화학식 I의 화합물에 관한 임의의 구체예에서, R2는 서프레서 tRNA이다.
뿐만 아니라, 화학식 I의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 II의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00008
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(식 중, k 는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 상기 R'은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임]
추가의 또는 부가의 구체예는 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물에 관한 것이다:
Figure 112008047567393-PCT00009
Figure 112008047567393-PCT00010
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")2, -C(O)N(R")2, -OR" 및 -S(O)kR"(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
화학식 II의 구조를 갖는 아미노산의 다음과 같은 비제한적인 예들도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00011
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며/있거나, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
화학식 I의 구조를 갖는 아미노산은 또한 하기 화학식 III의 구조를 갖는 보호형으로서 존재할 수도 있다:
Figure 112008047567393-PCT00012
[식 중, Prot는 아민 보호기로서 예를 들어, 다음과 같은 기들을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00013
몇몇 구체예에서, J기 중 하나 이상의 아민기가 보호될 수 있으며, 또는 임의의 구체예에서는, 두 개의 아민기가 보호된다.
뿐만 아니라, 화학식 III의 구조를 갖는 보호된 아미노산은 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00014
화학식 IV의 구조를 갖는 보호된 아미노산의 비제한적인 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00015
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며/있거나, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
다른 구체예는, 화학식 1 또는 화학식 2의 구조를 갖는 하나 이상의 화합물이 통합된 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 구체예는, 원하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질과 상동성인 단백질인 폴리펩티드에 관한 것이다.
디아민 함유 비천연 아미노산의 추가의 비제한적 예를 도 2에 나타내었다. 디아민 함유 아미노산의 비제한적인 합성 예에 관하여는 본원에 개시되어 있다(도 7 및 도 8).
B. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 디카보닐, 디카보닐 유사, 마스킹된 디카보닐 및 보호된 디카보닐 기
친전자성 반응기를 가지는 아미노산은 친핵 부가 반응을 통하여 분자를 결합하는 다양한 반응을 진행시킬 수 있다. 이와 같은 친전자성 반응기로서는 디카보닐기(예를 들어, 디케톤기, 케토알데히드기, 케토산기, 케토에스테르기 및 케토티오에스테르기), 디카보닐 유사 기(디카보닐기와 유사한 반응성을 나타내며, 구조적으로도 디카보닐기와 유사한 기), 마스킹된 디카보닐기(디카보닐기로 용이하게 전환될 수 있는 기), 또는 보호된 디카보닐기(탈 보호시 디카보닐기와 유사한 반응성을 나타냄)를 포함한다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00016
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1,2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
K는
Figure 112008047567393-PCT00017
이고,
여기서, T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌으로부터 선택되고;
T2는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3 임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
T3은
Figure 112008047567393-PCT00018
이고,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이고, 여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이거나; 또는
-A-B-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
뿐만 아니라, 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00019
[식 중,
M1은 결합, C(R3)(R4)-, -O-, -S-, -C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-, -C(R3)(R4)-O-, -C(R3)(R4)-S-, -0-C(R3)(R4)-, -S-C(R3)(R4), -C(R3)=C(R3)- 또는 -C(R4)=C(R4)-이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함]
화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00020
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임]
화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 VIII 및 화학식 IX의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00021
Figure 112008047567393-PCT00022
여기서, 화학식 VIII 또는 화학식 IX의 구조를 갖는 다음과 같은 비제한적인 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00023
Figure 112008047567393-PCT00024
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며/있거나, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
부가의 디카보닐 함유 아미노산으로서는 하기 화학식 X의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00025
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이 고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1,2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M2는
Figure 112008047567393-PCT00026
이고,
(식 중, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 각각의 카보닐기와의 결합을 나타냄);
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
화학식 X의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XI 및 화학식 XII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00027
Figure 112008047567393-PCT00028
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임]
또한, 화학식 XI 및 화학식 XII의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XIII 및 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00029
Figure 112008047567393-PCT00030
다음과 같이 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00031
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
추가의 디카보닐 함유 아미노산은 하기 화학식 XV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00032
[식 중,
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -C(O)R"-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R")C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M1은 결합, -C(R3)(R4)-, -O-, -S-, -C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-, -C(R3)(R4)-O-, -C(R3)(R4)-S-, -0-C(R3)(R4)-, -S-C(R3)(R4), -C(R3)=C(R3)- 또는 -C(R4)=C(R4)-이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기, 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2-, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되며, R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치환된 알킬이고; n은 0∼8임]
화학식 XV의 구조를 갖는 다음의 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00033
Figure 112008047567393-PCT00034
이와 같은 비천연 아미노산은 또한 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천 연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
보호된 카보닐기를 가지는 아미노산
하나 이상의 보호된 카보닐기를 가지는, 화학식 XVI의 구조를 갖는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00035
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치 환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M1은 결합, -C(R3)(R4)-, -O-, -S-, -C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-, -C(R3)(R4)-O-, -C(R3)(R4)-S-, -0-C(R3)(R4)-, -S-C(R3)(R4), -C(R3)=C(R3)- 또는 -C(R4)=C(R4)-이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기, 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00036
Figure 112008047567393-PCT00037
이고,
여기서, X1은 각각 독립적으로 O, S, NH, NR', N-Ac 및 N-OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 O-R, O-Ac, SR, S-Ac, N(R')(R'), N(R')(Ac), N(R')(OMe) 또는 N3임].
화학식 XVI의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XVII, 화학식 XVIII 및 화학식 XIX의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00038
Figure 112008047567393-PCT00039
Figure 112008047567393-PCT00040
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)R', -C(O)N(R'),2 -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
뿐만 아니라, 하기 화학식 XX, 화학식 XXI, 화학식 XXII, 화학식 XXIII, 화학식 XXIV 및 화학식 XXV의 구조를 갖는, 보호된 카보닐기를 포함하는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00041
Figure 112008047567393-PCT00042
Figure 112008047567393-PCT00043
Figure 112008047567393-PCT00044
Figure 112008047567393-PCT00045
Figure 112008047567393-PCT00046
[식 중,
X1은 O, S, NH, NR', N-Ac 또는 N-OMe이고;
R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임]
또한, 다음과 같이 보호된 카보닐기를 함유하는 아미노산이 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00047
이와 같은 비천연 아미노산은 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
뿐만 아니라, 다음과 같이 하기 화학식 XXVI의 구조를 가지며, 하나 이상의 보호된 카보닐기를 포함하는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00048
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저 급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Q는
Figure 112008047567393-PCT00049
이고;
M2는
Figure 112008047567393-PCT00050
이며(식 중, (a)는 B기에의 결합을 나타내는 것이며, (b)는 각각의 카보닐기와의 결합을 나타냄);
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기, 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00051
Figure 112008047567393-PCT00052
임
(식 중, X1은 각각 독립적으로, O, S, NH, NR', N-Ac 및 N-OMe로 이루어진 군으로부터 선택되며, X2는 O-R, O-Ac, SR, S-Ac, N(R')(R'), N(R')(Ac), N(R')(OMe) 또는 N3임].
화학식 XXVI의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XXVII, 화학식 XXVIII 및 화학식 XXIX의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00053
Figure 112008047567393-PCT00054
Figure 112008047567393-PCT00055
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
뿐만 아니라, 다음과 같이 하기 화학식 XXX의 구조를 갖는, 보호된 카보닐을 포함하는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00056
[식 중,
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R")C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M1은 결합, -C(R3)(R4)-, -O-, -S-, -C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-, -C(R3)(R4)-O-, -C(R3)(R4)-S-, -0-C(R3)(R4)-, -S-C(R3)(R4), -C(R3)=C(R3)- 또는 -C(R4)=C(R4)-이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기, 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00057
Figure 112008047567393-PCT00058
이고,
여기서, X1은 각각 독립적으로 O, S, NH, NR', N-Ac 및 N-OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 O-R, O-Ac, SR, S-Ac, N(R')(R'), N(R')(Ac), N(R')(OMe) 또는 N3이며;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
n은 0∼8임].
다음과 같이 화학식 XXX에 의한 보호 카보닐기를 가지는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00059
이와 같은 비천연 아미노산은 염의 형태를 가질 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드에 통합될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수도 있다.
카보닐 또는 디카보닐 함유 아미노산의 합성 방법에 관하여는 당업자에게 공지되어 있다. 뿐만 아니라, 카보닐 또는 디카보닐 함유 아미노산의 다양한 합성 방법에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 가 명세서 특허 출원 제60/638,418호에 개시되어 있다. p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 문헌[Zhang, Z.외 다수, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기술되어 있다.
또한, 디카보닐 함유 비천연 아미노산의 비제한적인 예에 관하여는 도 3에 도시하였다. 디카보닐 함유 아미노산의 비제한적 대표 합성 방법에 관하여도 본원에 기술되어 있으며, 또한 도 5 및 도 6에 도시하였다.
몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카보닐 또는 디카보닐 작용기를 생성한다. 예를 들어, 접합 반응에 유용한 알데히드 작용기는 인접 아미노기 및 하이드록실기를 보유하는 작용기로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자가 폴리펩티드일 경우, N-말단 세린 또는 트레오닌(화학 분해 또는 효소 분해를 통하여 노출될 수 있거나 또는 정상적으로 존재할 수 있음)은 온화한 산화 분해 조건 하에서 과요드산염을 이용하여 알데히드 작용기를 생성하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner외 다수, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)]을 참조하시오. 그러나, 당업계에 공지된 방법들은 펩티드 또는 단백질의 N-말단에 존재하는 아미노산에 제한된다.
뿐만 아니라, 예를 들어, 인접 하이드록실기 및 아미노기를 보유하는 비천연 아미노산은 "마스킹된" 알데히드 작용기로서 폴리펩티드에 통합될 수 있다. 예를 들어, 5-하이드록시리신은 엡실론 아민에 인접하여 하이드록실기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건으로서는, 폴리펩티드 내 다른 위치에서 산화 작용이 일어나는 것을 막는 온화한 조건하에서 몰 과량의 메타과요드산 나트륨을 첨가하는 것을 통상적으로 포함한다. 산화 반응의 pH는 통상적으로 약 7.0이다. 통상의 반응은 폴리펩티드 완충 용액에 약 1.5 몰 과량의 메타과요드산 나트륨을 첨가한 후, 암실에서 약 10분 동안 항온 처리하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,423,685호를 참조하시오.
C. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 케토알킨, 케토알킨 유사, 마스킹된 케토알킨 및 보호된 케토알킨 기
디카보닐 유사 반응성을 나타내는 반응기를 함유하는 아미노산은 친핵 부가 반응을 통하여 분자들을 결합할 수 있다. 이와 같은 친전자성 반응기로서는 케토알킨기, 케토알킨 유사 기(케토알킨기와 유사한 반응성을 나타내며, 케토알킨기와 구조적으로 유사함), 마스킹된 케토알킨기(케토알킨기로 용이하게 전환될 수 있음) 또는 보호된 케토알킨기(탈 보호시 케토알킨기와 유사한 반응성을 나타냄)를 포함한다. 이러한 아미노산은 하기 화학식 XXXI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00060
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00061
이고;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00062
Figure 112008047567393-PCT00063
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로, -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 또한 R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치 환된 알킬이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
화학식 XXXI의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XXXII 및 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00064
Figure 112008047567393-PCT00065
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
케토알킨 함유 비천연 아미노산에 관한 추가의 비제한적 예를 도 4에 도시하였다.
D. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 케토아민, 케토아민 유사, 마스킹된 케토아민 및 보호된 케토아민 기
디카보닐 유사 반응성을 나타내는 반응기를 함유하는 아미노산은 친핵 부가 반응을 통하여 분자들을 결합할 수 있다. 이와 같은 반응기로서는 케토아민기, 케토아민 유사 기(케토아민기와 유사한 반응성을 나타내고, 케토아민기와 구조적으로 유사함), 마스킹된 케토아민기(케토아민기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 케토아민기(탈 보호시 케토아민기와 유사한 반응성을 나타냄)를 포함한다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00066
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00067
이고;
T1은 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00068
Figure 112008047567393-PCT00069
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R')-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR', -N(R')2, -N(R')(Ac), -N(R')(OMe) 또는 N3이며, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
화학식 XXXIV의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 XXXV 및 화학식 XXXVI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00070
Figure 112008047567393-PCT00071
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 선 택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
E. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 복소환 함유 아미노산
본원에 개시된 임의의 구체예는 복소환, (복소환기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 복소환기 또는 (복소환기로 용이하게 탈 보호될 수 있는) 보호 복소환기를 포함gksms 측쇄를 가지는 비천연 아미노산에 관한 것이다. 이러한 아미노산은 하기 화학식 XXXVII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00072
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저 급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Q는 임의로 치환된 복소환 또는 임의로 치환된 헤테로아릴로서, 여기서, 각각의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌으로부터 선택되고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이 거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
화학식 XXXVII의 구조를 갖는 이와 같은 비천연 아미노산의 형성 반응으로서는, (i) 디아민 함유 비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응, 또는 디아민 함유 비천연 아미노산과 케토알킨 함유 시약의 반응; (ii) 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응, 또는 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 케토아민 함유 시약의 반응; (iii) 케토알킨 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응; 또는 (iv) 케토아민 함유 비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 비천연 아미노산의 이러한 반응에 의한 변형은 다음과 같은 이점 중 임의의 이점 또는 이들 이점 전부를 갖는다. 첫째, 디아민은 pH 약 5∼약 8(추가의 구체예에서는 pH 약 4∼약 10, 다른 구체예에서는, pH 약 3∼약 8, 다른 구체예에서는 pH 약 4∼약 9, 그리고 추가의 구체예에서는 pH 약 4∼약 9, 다른 구체예에서는 pH 약 4, 그리고 또 다른 구체예에서는 pH 약 8)에서 디카보닐 함유 화 합물과의 축합 반응을 수행하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성한다. 이와 같은 조건 하에서, 천연 생성 아미노산의 측쇄는 미 반응성이다. 둘째, 이와 같은 선택적 화학 반응을 통하여, 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다: 유도체화된 단백질은 제한된 균질의 생성물과 같이 제조될 수 있다. 셋째, 본원에 개시된 디아민과 본원에 개시된 디카보닐 함유 폴리펩티드의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(다만, 이러한 3차 구조를 파괴하는 것이 목적인 반응을 수행하는 경우에는 제외). 넷째, 반응은 실온에서도 쉽게 진행되므로, 고온에서 불안정한 다수의 유형의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다. 다섯째, 반응은 수성 조건 하에서도 쉽게 진행되어, 비수성 용액과 (어느 정도) 비혼화성인 폴리펩티드 및 시약을 사용할 수 있다. 여섯째, 폴리펩티드 또는 아미노산 대 시약의 비율이 화학량론적, 준 화학량론적 또는 유사 화학량론적인 때조차도 반응이 진행되므로, 유용한 양만큼의 반응 생성물을 얻는데 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 가할 필요가 없다. 일곱째, 생성된 복소환은, 반응물의 디아민 및 디카보닐부의 디자인에 따라서, 위치 선택적 및/또는 위치 특이적으로 생산될 수 있다. 마지막으로, 디아민과 디카보닐 함유 분자의 축합 반응을 통하여, 생물학적 조건 하에서 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환, 결합이 형성된다.
(i) 디아민 함유 비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응 또는 디아민 함유 비천연 아미노산과 케토알킨 함유 시약의 반응
디아민기 함유 비천연 아미노산은 다양한 친전자성 기와의 반응을 수행하여, 접합체(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 중합체를 포함하는 접합체)를 형성할 수 있다. 디아민기의 친핵성으로 인하여, 이 디아민기는 카보닐 또는 디카보닐 작용기를 함유하는 다양한 분자들, 또는 유사한 화학 반응성을 나타내는 기타 작용기를 함유하는 다양한 분자들과, 온화한 조건 하에 수용액 중에서, 효율적이고 선택적으로 반응하여, 상응하는 이민 결합을 형성할 수 있다. 뿐만 아니라, 카보닐기 또는 디카보닐기의 독특한 반응성으로 인하여, 기타 아미노산 측쇄의 존재 하에서 선택적으로 변형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cornish, V. W.외 다수, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, L. K.외 다수, Science 276:1125-1128 (1997)]을 참조하시오.
이와 같이 화학식 XXXVII의 구조를 갖는 복소환 측쇄를 포함하는 비천연 아미노산으로서는 하기 화학식 XXXVIII 및 화학식 XXXIX의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00073
Figure 112008047567393-PCT00074
[식 중,
Z1은 결합, CR7R7, O, S, NR', CR7R7-CR7R7, CR7R7-O, 0-CR7R7, CR7R7-S, S-CR7R7, CR7R7-NR', NR'-CR7R7이고;
Z2는 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)- 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R'는 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케 닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R6 및 각각의 R7은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕 시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
인접한 임의의 2개의 R7기는 함께, 임의로 치환된 5∼8원 복소환, 시클로알킬 또는 아릴 고리를 형성하고; 여기서, 상기 임의의 치환기들은 할로겐, OH, C1∼6알킬, C1∼6알콕시, 할로-C1∼6알킬, 할로-C1∼6알콕시, 아릴, 할로아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
단, Z1과 Z2는 복소환 고리 구조에 3개 이하의 고리 원자를 제공한다.
뿐만 아니라, 이하 화학식 XL, 화학식 XLI 및 화학식 XLII의 구조를 갖는 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00075
Figure 112008047567393-PCT00076
Figure 112008047567393-PCT00077
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
뿐만 아니라, 화학식 XL, 화학식 XLI 또는 화학식 XLII의 구조를 갖는 다음과 같은 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00078
(ii) 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약 또는 케토아민 함유 시약의 반응
친전자성 반응기를 가지는 비천연 아미노산은 다양한 반응을 수행하여, 친핵성 부가 반응을 통해 분자를 결합시킬 수 있다. 이와 같은 친전자성 반응기로서는 디카보닐기(예를 들어, 디케톤기, 케토알데히드기, 케토산기, 케토에스테르기 및 케토티오에스테르기), 디카보닐기 유사기(디카보닐기와 유사한 반응성을 나타내며, 카보닐기와 구조적으로 유사함), 마스킹된 디카보닐기(디카보닐기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 디카보닐기(탈 보호시 디카보닐기와 유사한 반응성을 나타냄)를 포함한다. 디카보닐기를 함유하는 비천연 아미노산은 다양한 친핵기와의 반응을 통하여, 접합체(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 중합체를 포함하는 접합체)를 형성할 수 있다. 디카보닐기의 친전자성으로 인하여, 이 디카보닐기는 아민, 디아민, 케토아민 또는 유사한 화학 반응성을 나타내는 기타 작용기를 함유하는 다양한 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다.
그러므로, 본원에 개시된 임의의 구체예는 복소환기, (복소환기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 복소환기 또는 (탈 보호시 기타 화학 반응에 대한 반응성을 나타내는) 보호된 디아민기를 포함하는 측쇄를 가지는 비천연 아미노산에 관 한 것이다. 이때, 디카보닐 함유 비천연 아미노산과, 아민, 디아민, 케토아민 또는 유사한 화학 반응성을 나타내는 기타 작용기를 함유하는 다양한 분자의 반응을 통해 이와 같은 복소환기가 형성되는 것이다.
화학식 XXXVII의 구조를 갖는 아미노산으로서는, 하기 화학식 XLIII, 화학식 XLIV, 화학식 XLV 화학식 XLVI, 화학식 XLVII 및 화학식 XLVIII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00079
Figure 112008047567393-PCT00080
Figure 112008047567393-PCT00081
Figure 112008047567393-PCT00082
Figure 112008047567393-PCT00083
Figure 112008047567393-PCT00084
[식 중,
Z1은 결합, CR5R5, CR5R5-CR5R5, CR5R5-O, O-CR5R5, S-CR5R5, NR5-CR5R5, CR5R5-S 및 CR5R5-NR5이고;
Z2는 임의로 치환된 C1∼C3알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C3알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
M2는
Figure 112008047567393-PCT00085
(여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이고;
M3은
Figure 112008047567393-PCT00086
(여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이며;
M4는
Figure 112008047567393-PCT00087
(여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이고;
단, Z1과 Z2는 복소환 고리 구조에 3개 이하의 고리 원자를 제공하거나, 또는 Z2와 Z3은 복소환 고리 구조에 3개 이하의 고리 원자를 제공하며;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S- S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
뿐만 아니라, 화학식 XLIII, 화학식 XLIV, 화학식 XLV, 화학식 티퍄, 화학식 XLVII 또는 화학식 XLVIII의 구조를 갖는 아미노산으로서는, 하기 화학식 XLIX, 화학식 L, 화학식 LI, 화학식 LII, 화학식 LIII 및 화학식 LIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00088
Figure 112008047567393-PCT00089
Figure 112008047567393-PCT00090
Figure 112008047567393-PCT00091
Figure 112008047567393-PCT00092
Figure 112008047567393-PCT00093
[식 중,
Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨].
뿐만 아니라, 화학식 XXXVII에 의한 다음과 같은 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00094
[식 중,
R6은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 및 치환된 아랄킬임].
디카보닐 함유 아미노산과 케토아민의 반응에 의해 형성되며, 복소환 측쇄기를 가지는 비천연 아미노산도 포함된다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 LV 및 화학식 LVI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00095
Figure 112008047567393-PCT00096
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R" 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키 닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 및 치환된 아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택됨].
뿐만 아니라, 화학식 LV 또는 화학식 LVI에 의한 다음과 같은 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00097
디카보닐 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응을 통하여, 복소환 함유 비천연 아미노산을 합성하는 비제한적인 대표 예를 도 11에 제시하였다.
(iii) 케토알킨 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응
디카보닐 유사 반응성을 나타내는 반응기를 함유하는 비천연 아미노산은 친핵성 부가 반응을 통해 분자를 결합할 수 있다. 이와 같은 친전자성 반응기로서는 케토알킨기, (케토알킨기와 유사한 반응성을 나타내며, 카보닐기와 구조적으로 유 사한) 케토알킨 유사 기, (케토알킨기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 케토알킨기, 또는 (탈 보호시 케토알킨기와 유사한 반응성을 나타내는) 보호된 케토알킨기를 포함한다. 케토알킨기를 함유하는 비천연 아미노산은 다양한 기 예를 들어, 디아민기와 반응을 수행하여, 접합체(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 중합체를 포함하는 접합체)를 형성할 수 있다.
그러므로, 본원에 개시된 임의의 구체예는, 복소환기, (복소환기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 복소환기, 또는 (탈 보호시 기타 화학 반응에 대해 반응성을 나타내는) 보호된 디아민기를 포함하는 측쇄를 가지는 비천연 아미노산에 관한 것이다. 이때, 이러한 복소환기는 케토알킨 함유 비천연 아미노산과, 아민, 디아민 또는 유사한 화학 반응성을 나타내는 기타 작용기를 함유하는 다양한 분자의 반응에 의해 형성된다.
이와 같이 화학식 XXXVII의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 LVII∼화학식 LX의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00098
Figure 112008047567393-PCT00099
Figure 112008047567393-PCT00100
Figure 112008047567393-PCT00101
Figure 112008047567393-PCT00102
[식 중,
Z1은 결합, CR5R5, CR5R5-CR5R5, CR5R5-O, O-CR5R5, S-CR5R5, NR5-CR5R5, CR5R5-S 및 CR5R5-NR5이고;
Z3은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)- 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 및 치환된 아랄킬이고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
케토알킨 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응을 통해, 복소환 함유 비천연 아미노산을 합성시키는 비제한적인 대표 예를 도 13에 제시하였다.
(iv) 케토아민 함유 비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응
디카보닐 유사 반응성을 나타내는 반응기를 함유하는 비천연 아미노산은 친핵성 부가 반응을 통해 분자를 결합할 수 있다. 이와 같은 반응기로서는 케토아민기, (케토아민기와 유사한 반응성을 나타내며, 케토아민기와 구조적으로 유사한) 케토아민 유사 기, (케토아민기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 케토아민기, 또는 (탈 보호시 케토아민기와 유사한 반응성을 나타내는) 보호된 케토아민기를 포함한다. 케토아민기를 함유하는 비천연 아미노산은 다양한 기 예를 들어, 디카보닐기와 반응을 수행하여, 접합체(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 중합체를 포함하는 접합체)를 형성할 수 있다.
그러므로, 본원에 개시된 임의의 구체예는, 복소환기, (복소환기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 복소환기, 또는 (탈 보호시 기타 화학 반응에 대한 반응성을 나타내는) 보호된 복소환기를 포함하는 측쇄를 가지는, 비천연 아미노산에 관한 것이다. 이때, 이러한 복소환기는 케토아민 함유 비천연 아미노산과, 디카보닐, 또는 유사한 화학 반응성을 나타내는 기타 작용기를 함유하는 다양한 분자의 반응에 의해 형성된다.
이와 같이 화학식 XXXVII의 구조를 갖는 아미노산으로서는 하기 화학식 LXII 및 화학식 LXIII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00103
Figure 112008047567393-PCT00104
[식 중,
R6은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으 로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 및 치환된 아랄킬이고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')- (알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임]
F. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 엔- 디온 함유 아미노산
친전자성 반응기를 가지는 비천연 아미노산은, 친핵성 부가 반응을 통하여, 분자들을 결합시키는 다양한 반응을 수행할 수 있다. 이러한 친전자성 반응기로서는 디카보닐기(예를 들어, 디케톤기, 케토알데히드기, 케토산기, 케토에스테르기 및 케토티오에스테르기), (디카보닐기와 유사한 반응성을 나타내며, 카보닐기와 구조적으로 유사한) 디카보닐 유사 기, (디카보닐기로 용이하게 전환될 수 있는) 마스킹된 디카보닐기, 또는 (탈 보호시 디카보닐기와 유사한 반응성을 나타내는) 보호된 디카보닐기를 포함한다. 디카보닐기를 함유하는 비천연 아미노산은, 다양한 친핵성 기와의 반응을 통하여, 접합체(예를 들어, PEG 또는 기타 수용성 중합체를 가지는 접합체)를 형성할 수 있다. 디카보닐기의 친전자성을 통해, 이 디카보닐기가 알돌 반응 또는 알돌형 반응에서 반응을 일으켜, "알돌계 결합" 또는 "혼합 알 돌계 결합"을 형성할 수 있게 된다.
그러므로, 본원에 개시된 임의의 구체예는, 알돌 반응, 혼합 알돌 반응 또는 알돌형 반응에 관여하는 디카보닐에 의해 생성된 기를 포함하는 측쇄를 가지는 비천연 아미노산에 관한 것이다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 LXIV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112008047567393-PCT00105
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치 환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S- S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k- (식중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임].
뿐만 아니라, 하기 화학식 LXV∼화학식 LXVII에 의한 아미노산도 포함된다:
Figure 112008047567393-PCT00106
Figure 112008047567393-PCT00107
Figure 112008047567393-PCT00108
G. 비천연 아미노산의 세포 내 흡수
진핵 생물 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수(uptake)는, 예를 들어, 단백질 에 통합될 비천연 아미노산을 고안 및 선택하는데에 있어서 통상적으로 하나의 문제점으로 인식되고 있다. 예를 들어, α-아미노산의 전하 밀도가 높으면, 그러한 화합물은 세포를 투과하지 못할 것이라고 한다. 천연 아미노산은 단백질계 운반 시스템의 집합체(collection)를 통하여 진핵 생물 세포로 흡수된다. 비천연 아미노산 중 어느 것이 세포에 의해 취하여지는지를 평가하는 스크리닝법이 신속하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 공보 US 2004/198637(발명의 명칭 "Protein Arrays")의 독성 검정법과; 문헌[Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]을 참조하시오. 비록 흡수는 다양한 검정법에 의해 용이하게 분석되지만, 세포 내 흡수 경로에 순응하는 비천연 아미노산을 고안하는 것에 관한 대안은 생체 내에서 아미노산을 합성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
통상적으로, 본원에 개시된 세포 흡수를 통해 생산된 비천연 아미노산은 단백질을 효과적으로 생합성 하는데에 충분한 농도(예를 들어, 천연의 세포 내에 존재하는 양이되, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미친다거나 또는 세포 내 공급원을 고갈시키는 정도는 아닌 농도)로 생산된다. 이러한 방식으로 생산되는 통상의 농도는 약 10∼약 0.05 mM이다.
H. 비천연 아미노산의 생합성
아미노산과 기타 화합물을 생산하는 다수의 생합성 경로는 이미 세포 내에 존재한다. 특정 비천연 아미노산의 생합성 방법은 천연에서(예를 들어, 세포 내에 서) 수행될 수 없지만, 본원에 개시된 방법과 조성물은 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산의 생합성 경로는 신규 효소를 첨가하거나 또는 현존하는 숙주 세포 경로를 변형함으로써 숙주 세포 내에서 진행될 수 있다. 추가의 신규 효소로서는 천연 생성 효소 또는 인공 진화 효소를 포함한다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성[WO 2002/085923 (발명의 명칭; "In vivo incorporation of unnatural amino acids")]은 기타 유기체로부터 유래하는 공지의 효소를 조합하여 첨가함으로써 진행된다. 이러한 효소 유전자는, 진핵 생물 세포를 이 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환 시킴으로써, 진핵 생물 세포에 도입될 수 있다. 상기 유전자가 세포 내에서 발현될 때, 이 유전자는 원하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 임의적으로 첨가되는 효소의 종류에 관하여는 본원에 예시되어 있다. 부가의 효소 서열은 예를 들어, Genebank에서 살펴볼 수 있다. 인공적으로 진화된 효소는 동일한 방식으로 세포에 부가될 수도 있다. 이러한 방식으로, 세포의 세포 내 기구와 공급원은 조작되어 비천연 아미노산을 생산하게 되는 것이다.
생합성 경로에 이용되는 신규 효소를 생산하거나, 현존하는 경로를 진화시키기 위해서는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 맥시겐 인코포레이션(Maxygen, Inc.; www.maxygen.com에서 정보를 얻을 수 있음)에 의해 개발된 반복적 재조합법(recursive recombination)은 신규 효소와 경로를 개발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; 및 Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751]을 참조하시오. 이와 유사하게, 제넨코(Genencor; www.genencor.com으로부터 정보를 얻을 수 있음)에 의해 개발된 디자인패스(DesignPath)™는 대사 경로 조작법 예를 들어, 세포 내에서 비천연 아미노산을 생성하기 위한 경로를 조작하는 방법에 사용되기도 한다. 이 기술은 신규 유전자 예를 들어, 기능 유전체학적 분자 진화 및 디자인에 의해 동정된 신규 유전자를 조합하여 사용함으로써, 숙주 유기체 내에 현존하는 경로를 재구성한다. 다이버사 코포레이션(Diversa Corporation)(www.diversa.com에서 정보를 얻을 수 있음)은 또한 예를 들어, 비천연 아미노산을 생합성에 의해 생산하는 새로운 경로를 개척하기 위해 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하는 기술을 제공한다.
통상적으로, 본 발명의 조작된 생합성 경로를 통해 생산된 비천연 아미노산은 단백질을 효과적으로 생합성 하는데에 충분한 농도(예를 들어, 천연의 세포 내에 존재하는 양이되, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미친다거나 또는 세포 내 공급원을 고갈시키는 정도는 아닌 농도)로 생산된다. 이러한 방식으로 생체 내에서 생산되는 통상의 농도는 약 10∼약 0.05 mM이다. 일단, 세포가 플라스미드(즉, 특정 경로에 바람직한 효소를 생산하는데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드)로 형질 전환되어 비천연 아미노산이 생산되면, 생체 내 선택법은 또한 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장 둘 다를 위한 비천연 아미노산의 생산을 더욱 최적화하는데에 사용되기도 한다.
I. 추가의 합성 방법
본원에 개시된 비천연 아미노산은 당업계에 공지된 방법 또는 본원에 개시된 기술 또는 이들 방법을 병행하여 합성될 수 있다. 보조 수단으로서, 이하 표 1은 서로 합하여져 원하는 작용기를 생성하는 다수의 출발 친전자체 및 친핵체를 제공한다. 제공된 정보는 본원에 개시된 합성 기술에 대해 예시적인 것으로서, 이 합성 기술을 제한하는 것은 아니다.
공유 결합의 예와 이의 전구체
공유 결합 생성물 친전자체 친핵체
카복사미드 활성화 에스테르 아민/아닐린
카복사미드 아지드화아실 아민/아닐린
카복사미드 할로겐화아실 아민/아닐린
에스테르 할로겐화아실 알콜/페놀
에스테르 아실 니트릴 알콜/페놀
카복사미드 아실 니트릴 아민/아닐린
이민 알데히드 아민/아닐린
히드라존 알데히드 또는 케톤 히드라진
옥심 알데히드 또는 케톤 하이드록실아민
알킬 아민 할로겐화알킬 아민/아닐린
에스테르 할로겐화알킬 카복실산
티오에테르 할로겐화알킬 티올
에테르 할로겐화알킬 알콜/페놀
티오에테르 설폰산알킬 티올
에스테르 설폰산알킬 카복실산
에테르 설폰산알킬 알콜/페놀
에스테르 무수물 알콜/페놀
카복사미드 무수물 아민/아닐린
티오페놀 할로겐화아릴 티올
아릴 아민 할로겐화아릴 아민
티오에테르 아진딘 티올
보로네이트 에스테르 보로네이트 글리콜
카복사미드 카복실산 아민/아닐린
에스테르 카복실산 알콜
히드라진 하이드라지드 카복실산
N-아실우레아 또는 무수물 카보디이미드 카복실산
에스테르 디아조알칸 카복실산
티오에테르 에폭시드 티올
티오에테르 할로아세타미드 티올
암모트리아진 할로트리아진 아민/아닐린
트리아지닐 에테르 할로트리아진 알콜/페놀
아미딘 이미도 에스테르 아민/아닐린
우레아 이소시아네이트 아민/아닐린
우레탄 이소시아네이트 알콜/페놀
티오우레아 이소티오시아네이트 아민/아닐린
티오에테르 말레이미드 티올
포스파이트 에스테르 포스포라미다이트 알콜
실릴 에테르 할로겐화실릴 알콜
알킬 아민 설포네이트 에스테르 아민/아닐린
티오에테르 설포네이트 에스테르 티올
에스테르 설포네이트 에스테르 카복실산
에테르 설포네이트 에스테르 알콜
설폰아미드 할로겐화설포닐 아민/아닐린
설포네이트 에스테르 할로겐화설포닐 페놀/알콜
일반적으로, 탄소 친전자체는 상보적인 친핵체 예를 들어, 탄소 친핵체에 의한 공격에 약한데, 여기서, 친핵체가 공격하면, 전자쌍이 탄소 친전자체로 옮겨가서, 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로운 결합이 형성된다.
탄소 친전자체에 대한 비제한적 예로서는 알킬, 알케닐, 아릴 및 알키닐 그리냐르, 오가노리튬, 유기 아연(organozinc), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-주석 시약(오가노스타난), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-보란 시약(오가노보란 및 오가노보로네이트)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며; 이러한 탄소 친핵체는 물과 극성 유기 용매 중에서 역학적으로 안정하다는 이점을 갖는다. 탄소 친핵체에 관한 기타 비제한적인 예로서는 인 함유 일리드, 에놀 및 에놀레이트 시약을 포함하며; 이와 같은 탄소 친핵체는 유기 합성 화학 분야의 당업자에게 널리 공지된 전구체로부터 비교적 쉽게 생성된다는 이점이 있다. 탄소 친핵체가 탄소 친전자체와 함께 사용될 경우, 이 탄소 친핵체는 탄소 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로운 탄소-탄소 결합을 형성한다.
탄소 친전자체에 커플링되기 적당한 비 탄소 친핵체의 비제한적 예로서는 1차 및 2차 아민, 티올, 티올레이트 및 티오에테르, 알콜, 알콕시드, 아지드 및 세미카바지드 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 비 탄소 친핵체가 탄소 친전자체와 함께 사용될 경우, 이 비 탄소 친핵체는 통상적으로, 이종 원자 결합(C-X-C)을 형성하는데, 여기서, X는 이종 원자 예를 들어, 산소, 황 또는 질소이다.
VI. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드
편의상, 본 섹션에 기술된 화합물의 형태, 특성 및 기타 특징들에 관하여는 일반적으로 기술하였으며/기술하였거나, 구체예를 들어 기술하였다. 그러나, 본 섹션에 기술된 형태, 특성 및 기타 특징들은 본 섹션에 제공된 일반적인 설명이나 구체예 만에 한정되는 것은 아니며, 오히려, 본 섹션에 기술된 형태, 특성 및 기타 특징들은, 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위에 속하는 모든 화합물 예를 들어, 본 명세서, 청구의 범위 및 도면에 개시된 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 임의의 부속 화합물 또는 특정 화합물에 균등하게 적용된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합하기 위해 제공된다. 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 임의의 위치 예를 들어, 폴리펩티드의 임의의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치에 존재할 수 있다. 이와 같이, 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하는 것이 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합시키는 목적 중 하나가 아니라면, 비천연 아미노산은, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합함으로써, 활성을 어느 정도 변경할 수 있으며/있거나[예를 들어, 폴리펩티드의 치료 효능의 조작, 폴리펩티드의 안전성 프로필 개선, 폴리펩티드의 약물 동태학, 약리학 및/또는 약력학 특성 조절(예를 들어, 수용성, 생체 이용률, 혈청 반감기 및 치료적 반감기의 증가, 면역원성의 조정, 생물학적 활성의 조정, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에 부가 작용기 제공, 태그, 표지, 또는 검출 가능한 신호의 폴리펩티드에의 통합, 폴리펩티드의 분리 특성 개선 및 전술한 변형을 조합하여 이룰수 있으며/있거나], 이 활성 및/또는 3차 구조를 완전히 파괴하지 않고서, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 3차 구조를 어느 정도 변형시킬 수 있다. 비록 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합하면, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조에 약간의 영향을 미칠 수도 있지만, 이와 같이 활성 및/또는 3차 구조를 변형시키는 것은 종종 통합을 수행하기 위한 목적 중 하나이기도 하다. 그러므로, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드 포함 조성물, 이 폴리펩티드와 폴리펩티드 조성물을 만드는 방법, 이 폴리펩티드와 폴리펩티드 조성물을 정제, 분리 및 특성 규명하는 방법, 그리고, 이 폴리펩티드와 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법은 본원에 개시된 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주한다. 또한, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드(예를 들어, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연 생성 아미노산 폴리펩티드)에 결찰될 수도 있다.
본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의하거나 또는 생합성에 의하지 않고 생산될 수 있다. 생합성에 의한다는 의미는, 다음과 같은 성분들 중 하나 이상의 성분을 이용하는 (세포성 또는 비세포성) 번역 시스템을 이용하는 임의의 방법에 의함을 말한다: 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보좀. 생합성에 의하지 않는다는 의미는, 번역 시스템을 이용하지 않는 임의의 방법에 의함을 말한다: 이 방법은 다시, 고상 펩티드 합성 방법을 이용하는 방법, 고상 펩티드 합성 방법, 하나 이상의 효소를 이용하는 방법, 그리고 하나 이상의 효소를 이용하지 않는 방법으로 나눌 수 있으며; 또한, 상기와 같은 세분화한 영역 중 임의의 것은 중첩될 수 있고, 다수의 방법은 이와 같은 세분화한 영역에 속하는 방법들을 병행할 수 있다.
본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정 유형, 부류 또는 군에 제한되지 않는다. 실제로, 임의의 폴리펩티드는 본원에 개시된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질과 상동성일 수 있다. 관련 구체예 또는 추가의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 초 유전자군에 속하는 임의의 폴리펩티드 일원과 상동성일 수도 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드는 기타 본원에 개시된 바와 같이 변형될 수 있거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 추가의 변형 없이도 사용될 수 있다. 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합하는 것은 다양한 목적 예를 들어, 단백질 구조 및/또는 기능상의 변화를 조작하기 위하거나, 크기, 산성도, 친핵성, 수소 결합능, 소수성, 단백질 분해 효소 표적 위치에의 접근 가능성을 바꾸기 위하거나, 부분(예를 들어, 폴리펩티드 어레이용 부분)을 표적화하기 위하는 등의 목적으로 실시된다. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 강화되었거나 또는 완전 새로운 촉매 특성 또는 생물 물리학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 특성들은 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 포함시킴으로써 변성될 수 있다: 독성, 생물 분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 특성 및/또는 광 화학적 특성, 촉매능, 반감기(예를 들어, 혈청 반감기), 다른 분자와 반응하는 능력(예를 들어, 공유 결합 반응 능력 또는 비공유 결합 반응 능력) 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 예를 들어, 신규의 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(예를 들어, 항체)로서 유용할 뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질 구조 및 기능 연구에도 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]을 참조하시오.
뿐만 아니라, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분(들)의 측쇄는 이 폴리펩티드에 다양한 부가 작용기를 제공할 수 있는데; 예를 들어, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분의 측쇄는 다음과 같은 것 중 임의의 것을 가질 수 있다: 원하는 작용기.
본 발명의 하나의 측면에서, 조성물은 하나 이상, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 뿐만 아니라, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 상이하거나 동일한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드 내에 존재하는 특정 아미노산을 하나 이상(전부보다는 소수) 보유하는 폴리펩티드를 포함하며, 이 특정 아미노산은 비천연 아미노산(들)과 치환된다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있다[예를 들어, 폴리펩티드는 상이한 종류의 비천연 아미노산을 2개 이상 포함할 수 있거나, 또는 동일한 비천연 아미노산을 2개 포함할 수 있음]. 2개 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 소정의 단백질에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 동일한 종류의 비천연 아미노산 다수와 하나 이상의 비천연 아미노산의 조합체일 수 있다.
비록 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 구체예는 고상 펩티드 합성 방법(예를 들어, 고체 수지상에서 행하여지는 방법), 용액 상 펩티드 합성 방법 및/또는 효소의 도움을 받지 않고 화학적으로 합성될 수 있지만, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 기타 구체예는 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 시스템, 또는 생체 내 시스템 예를 들어, 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포의 세포 내 기구를 통하여 합성될 수 있다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 중요 특징 중 하나는, 이 폴리펩티드가 리보좀을 이용하여 합성될 수 있다는 점이다. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 관한 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 다수의 방법들 예를 들어, 효소는 사용하지 않고 고체 수지들을 병용하는 방법, 리보좀의 도움을 받아 합성하는 방법 및/또는 생체 내 시스템을 통해 합성하는 방법들을 병행하여 합성될 수 있다.
리보좀 및/또는 생체 내 시스템을 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드를 합성함에 있어서는, 고체 수지상에서 효소의 도움 없이 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드와는 분명히 구분되는 이점과 특징을 갖는다. 이와 같은 이점 또는 특징으로서는 상이한 불순물 프로필을 포함하며: 리보좀을 이용하는 시스템 및/또는 생체 내 시스템은 이용된 생물 시스템으로부터 유래하는 불순물 예를 들어, 숙주 세포 단백질, 막의 일부 그리고 지질을 가질 것이지만, 고체 수지를 사용하고/사용하거나 효소의 도움을 받지 않는 시스템으로부터 얻어지는 불순물 프로필로서는 합성 방법에 사용된 유기 용매, 보호기, 수지 재료, 커플링 시약 및 기타 화학 물질을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 리보좀 및/또는 생체 내 시스템을 이용하여 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동위 원소 패턴은 세포에 사용된 발효액의 동위 원소 패턴과 대칭을 이룰 수 있으며; 다른 한편으로, 고체 수지를 사용하여/사용하거나, 효소의 도움을 받지 않고 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동위 원소 패턴은 합성에 이용된 아미노산의 동위 원소 패턴과 대칭을 이룰 수 수 있다. 뿐만 아니라, 리보좀 및/또는 생체 내 시스템을 사용하여 합성된 비천연 아미노산에는 아미노산의 D-이성체는 실질적으로 존재하지 않을 수 있으며/있거나, 내부 시스테인 아미노산을 폴리펩티드의 구조에 용이하게 통합할 수 있으며/있거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 드물게나마 제공할 수 있다. 다시 말해서, 고체 수지를 사용하여/사용하거나, 효소를 사용하지 않고서 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 아미노산의 D-이성체 함량이 높을 수 있으며/높을 수 있거나, 내부 시스테인 아미노산의 함량이 낮을 수 있으며/낮을 수 있거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드의 비율이 높을 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 리보좀 및/또는 생체 내 시스템을 이용하여 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를, 고체 수지를 사용하며/사용하거나 효소를 사용하지 않고서 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 구별할 수 있을 것이다.
VII. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법
A. 본원에 사용되는 일반적인 핵산 재조합 방법
본원에 개시된 방법 및 조성물에 관한 다양한 구체예에서, 목적 폴리펩티드(예를 들어, GH 폴리펩티드)를 암호화하는 핵산은, 재조합 방법을 이용하여 분리, 클로닝될 것이며, 또한 종종 변형될 것이기도 하다. 이러한 구체예는 예를 들어, 단백질 발현시, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트 또는 기타 폴리펩티드로부터 유래하는 서열의 생성시에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 이종 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있다.
본원에는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있는 세포에 관하여도 개시되어 있는데, 여기서, 폴리펩티드상에 존재하는 하나 이상의 비천연 아미노산은 기카보닐, 디아민, 복소환 결합 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합 또는 알돌계 결합을 가지는 측쇄를 포함한다. 이러한 세포는 본원에 개시된 방법을 이용하여 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하지만, 생합성에 의해서도 하나 이상의 비천연 아미노산을 생산할 수 있다. 본원에 개시된 기술, 방법, 조성물 및 기법이나 이의 다양한 변법을 이용하여, 하나 이상의 비천연 아미노산을 생합성하는 세포를 생산할 수 있다.
비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 합성된 후, 관련 아미노산 잔기(들)를 도입(즉, 통합 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)하도록 뉴클레오티드 서열을 바꾸어 줌으로써 생산될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 종래 방법에 따라서 위치 지정 돌연변이 유발법에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 대안적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성법 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 방법, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포 내에서 우선적으로 이용되는 코돈을 선택하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드는 PCR, 결찰법 또는 결찰 연쇄 반응에 의하여 합성 및 조립될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Barany외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); 미국 특허 제6,521,427호]을 참조하시오.
본원에 개시된 비천연 아미노산과 관계된 방법 및 조성물은 재조합 유전자학 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 기술을 이용한다. 본원에 개시된 비천연 아미노산의 일반적 사용 방법이 개시되어 있는 기본적인 교과서로서는 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel외 다수, eds., 1994)]을 포함한다.
분자 생물학적 기술에 관하여 개시되어 있는 일반적인 교과서로서는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook외 다수, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel외 다수, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc., 공동 출판(1999년 증보판) ("Ausubel")]을 포함한다. 상기 교과서에는 벡터 및 프로모터를 사용하는 돌연변이 유발법, 그리고 예를 들어, 비천연 아미노산, 직교 tRNA, 직교 tRNA 합성 효소 및 이들의 쌍을 포함하는, 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 생산과 관련된 기타 다수의 주제에 관하여 기술되어 있다.
다수의 목적 예를 들어, 신규의 합성 효소 또는 tRNA를 생산하거나, tRNA 분자를 돌연변이시키거나, 합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시키거나, tRNA 라이브러리를 생산하거나, 합성 효소 라이브러리를 생산하거나, 셀렉터 코돈을 생산하거나, 목적 단백질 또는 폴리펩티드 내에 비천연 아미노산을 암호화하는 셀렉터 코돈을 삽입하기 위하여, 본원에 개시된 비천연 아미노산과 관계된 방법 및 조성물과 관련하여서는 다양한 유형의 돌연변이 유발법이 사용된다. 이러한 돌연변이 유발법으로서는 위치 지정 돌연변이 유발법, 랜덤 점 돌연변이 유발법, 상동성 재조합법, DNA 셔플링 또는 기타 반복 돌연변이 유발법, 키메라 구성법, 우라실 함유 주형을 이용하는 돌연변이 유발법, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 갭이 형성된 이중체 DNA를 이용하는 돌연변이 유발법 등, 또는 이러한 방법의 임의의 조합법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로 적당한 방법으로서는 포인트 미스매치 수선법, 수선 기능 흠결 숙주 변종을 이용하는 돌연변이 유발법, 제한 선택법 및 제한 정제법, 결실 돌연변이 유발법, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 이중 사슬 파괴 수선법 등을 포함한다. 돌연변이 유발법 예를 들어, 키메라 구조물을 이용하는 돌연변이 유발법도 본원에 개시된 비천연 아미노산과 관계된 방법과 조성물 제조 방법에 포함된다. 하나의 구체예에서, 돌연변이 유발법은 천연 생성 분자, 또는 변형 또는 돌연변이된 천연 생성 분자에 관한 공지의 정보 예를 들어, 서열 비교 결과, 물리적 특성 또는 결정 구조 등에 의하여 유도될 수 있다.
본원에 인용되어 있는 교과서 및 실시예에는 이러한 방법과 기타 관련 방법에 관하여 기술되어 있다. 부가 정보는 다음과 같은 문헌 및 이에 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다: Ling외 다수, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997);Dale외 다수, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel외 다수, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass외 다수, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100:468-500(1983); Methods in Enzymol. 154:329-350(1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzvmol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzvmol. 154:329-350 (1987); Taylor외 다수, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor외 다수, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers외 다수, 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers외 다수, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer외 다수, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer외 다수, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz외 다수, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer외 다수, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887(1984); Carter외 다수, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells외 다수, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar외 다수, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells외 다수, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom외 다수, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber외 다수, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); 및 I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). 전술한 방법들 중 다수의 방법에 관한 부연 설명은 문헌[Methods in Enzymology Volume 154; 다양한 돌연변이 유발법으로 인한 문제점들을 해결하기 위한 유용한 방안에 관하여 기술됨]에서 살펴볼 수 있다.
본원에 개시된 방법과 조성물은 또한 직교 tRNA/RS 쌍을 통하여 비천연 아미노산을 생체 내 통합하는데 사용되는 진핵 생물 숙주 세포, 진핵 생물이 아닌 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이기도 하다. 숙주 세포는 본원에 개시된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 개시된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는, 본원에 개시된 폴리펩티드에 상응하는 벡터)을 사용하여 유전적으로 조작(예를 들어, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염)된다. 예를 들어, 직교 tRNA, 직교 tRNA 합성 효소 및 유도체화될 단백질의 암호화 부위는 목적으로 하는 숙주 세포 내에서 작용하는 유전자 발현 제어 요소에 작동 가능하도록 결합된다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 나출 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태를 가질 수 있다. 상기 벡터는 표준적인 방법 예를 들어, 전기 천공법(Fromm외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), 바이러스 벡터에 의한 감염법, 소형 비드 또는 소립자로 이루어진 매트릭스 내 또는 표면상에 존재하는 핵산과 소립자의 고속 충격 관통법(Klein외 다수, Nature 327, 70-73 (1987)) 등에 의해서 세포 및/또는 미생물에 도입된다.
조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터 활성화 또는 형질 전환체 선별과 같은 조작에 적당하도록 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포는 경우에 따라 트랜스제닉 유기체 내에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 세포 분리 및 배양(예를 들어, 후속 핵산 분리)에 관한 기타 유용한 참고 문헌으로서는, 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 여기에 인용된 참고 문헌들; Payne외 다수 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.
표적 핵산을 세포 내에 도입시키는, 널리 공지된 몇몇 방법이 수행될 수 있는데, 이 방법 중 임의의 방법이 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: DNA 함유 박테리아 원형질체와 수용체 세포를 융합하는 방법, 전기 천공법, 추진성 충격법(projectile bombardment) 및 바이러스 벡터를 사용하는 감염법(이하 상세히 설명함) 등. 박테리아 세포는 본원에 개시된 폴리펩티드에 상응하는 DNA 구조물을 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는데에 사용될 수 있다. 상기 박테리아를 대수기까지 생육시키고, 이 박테리아 내에 존재하는 플라스미드는 당업계에 공지된 다수의 방법에 의해 분리될 수 있다[예를 들어, Sambrook 참조]. 뿐만 아니라, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 키트가 시판되고 있다[예를 들어, 이지프렙(EasyPrep)™, 플렉시프렙(FlexiPrep)™, Pharmacia Biotech사 제품; 스트라타클린(StrataClean)™, Stratagene사 제품; 및 키아프렙(QIAprep)™, Qiagen사 제품]. 이후, 분리 및 정제된 플라스미드는 기타 플라스미드를 생산하도록 추가로 조작되며, 이 플라스미드는 세포를 형질 감염하는데 사용되거나, 또는 관련 벡터에 통합되어 유기체를 감염시키는데 사용된다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결 인자, 전사 및 번역 개시 서열, 그리고 특정 표적 핵산의 발현을 조절하는데에 유용한 프로모터를 함유한다. 상기 벡터는 경우에 따라 하나 이상의 독립적인 종결 인자 서열과, 진핵 생물 또는 원핵 생물 내에서 카세트를 복제시킬 수 있는 서열, 또는 이 서열 둘 다를 함유하는 발현 카세트를 함유하는 일반적인 발현 카세트(예를 들어, 셔틀 벡터)와, 원핵 생물 시스템 및 진핵 생물 시스템 둘다에 대한 선별 마커를 포함한다. 벡터는 원핵 생물, 진핵 생물 또는 바람직하게는 둘 다에서 복제 및 통합되기에 적당하다. 문헌[Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts외 다수, Nature, 328:731 (1987); Schneider, E.외 다수, Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger(모두 상동)]을 참조하시오. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지에 관한 카탈로그는 예를 들어, ATCC에 의해 제공되는 "박테리아 및 박테리오파지에 관한 ATCC 카탈로그(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992; Gherna외 다수 (eds), ATCC))"에 제공되어 있다. 서열 결정 및 클로닝하는 기본적인 부가 방법과 분자 생물학적 측면 그리고 이에 깔려있는 이론적 사항에 관하여는 문헌[Watson외 다수 (1992) Recombinant DNA Second Edition, Scientific American Books, NY]에서 살펴볼 수 있다. 뿐만 아니라, 본질적으로 임의의 핵산(및 실질적으로 (표준적이거나 또는 비 표준적으로) 표지화된 임의의 핵산)은 다수의 상업적 공급처 예를 들어, 미들랜드 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(Midland, TX, www.mcrc.com), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(Ramona, CA, www.genco.com), 익스프레스진 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(Chicago, IL, www.expressgen.com), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(Alameda, CA) 등으로부터 주문 제작될 수 있거나 또는 보통으로 구입할 수 있다.
B. 셀렉터 코돈
본원에 개시된 방법 및 조성물에 포함되는 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기작의 유전자 암호 틀을 확장시키는 것이다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 유일 3 염기 코돈, 넌센스 코돈 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA), 비천연 코돈, 4 염기 이상 코돈 또는 희귀 코돈 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 갯 수는, 목적 폴리펩티드의 적어도 일부를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드 내에서 다양할 수 있다(예를 들어, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상).
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 생체 내에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 통합시키기 위한 종결 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, UAG를 인지하는 O-tRNA가 생산되며, 이 O-tRNA는 원하는 비천연 아미노산과 함께 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 상기 O-tRNA는 천연 생성되는 숙주의 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 인지되지 않는다. 통상적인 위치 지정 돌연변이 유발법은 종결 코돈 예를 들어, UAG를, 목적 폴리펩티드 내 목적 위치에 도입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R.외 다수 (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16(3):791-802]을 참조하시오. O-RS, O-tRNA 및 목적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 생체 내에서 화합할 때, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 따라서 통합되며, 그 결과 특정 위치에 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드가 생성된다.
비천연 아미노산은 또한 희귀 코돈으로 암호화될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 단백질 합성 반응에 있어서 아르기닌 농도가 감소하면, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의해 Ala를 삽입하는데에 효율적일 것으로 판단된다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, Biochemistry, 32:7939 (1993)]을 참조하시오. 이 경우, 합성 tRNA는 (에스케리챠 콜라이에 소수 존재하는) 천연 생성 tRNA-Arg과 경쟁한다. 몇몇 유기체는 모든 삼중 코돈을 사용하지 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 내 할당되지 않은 코돈인 AGA는 시험관 내 전사/번역 추출물 중에 존재하는 아미노산을 삽입하는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)]을 참조하시오. 본 발명의 성분들이 생산되면, 이와 같은 희귀 코돈을 생체 내에서 사용할 수 있다.
비천연 아미노산은 진핵 생물 숙주 세포를 거의 동요시키지 않고서도 생체 내 통합될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA 예를 들어, 앰버 서프레서 tRNA와 진핵 생물 방출 인자(예를 들어, eRF)(종결 코돈과 결합하여, 리보좀으로부터 연장되는 펩티드의 방출을 개시하는 인자) 사이의 경쟁에 따라서 달라지며, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 및/또는 서프레서 tRNA의 발현 수준이 증가함에 따라서 조정될 수 있다.
셀렉터 코돈은 또한 확장된 코돈 예를 들어, 4 염기 이상 코돈 예를 들어, 4 염기 코돈, 5 염기 코돈, 6 염기 코돈 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈을 포함한다. 4 염기 코돈의 예로서는, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 5 염기 코돈의 예로서는, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU 및 UAGGC 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 방법 및 조성물의 특징 중 하나는 틀 이동 억제(frameshift suppression)를 바탕으로 하는 확장 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈은 예를 들어, 하나 또는 여러 개의 비천연 아미노산을 동일한 단백질에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 O-tRNA 예를 들어, 특정 틀 이동 서프레서 tRNA(안티 코돈 루프 예를 들어, 8∼10개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 안티 코돈 루프 보유)가 존재하는 경우, 4 염기 이상 코돈은 하나의 아미노산으로 해독된다. 다른 구체예에서, 안티 코돈 루프 예를 들어, 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 5개 이상의 염기로 이루어진 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 이루어진 코돈 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈은 해독될 수 있다. 생성 가능한 4 염기 코돈에는 256가지가 존재하므로, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 이용하여 동일한 세포 내에서 암호화될 수 있다. 문헌[Anderson외 다수, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조하시오.
예를 들어, 4-염기 코돈은 생체 내 생합성 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질에 통합하는 경우에 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, (1993) Biochemistry, 32:7939-7945; 및 Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34-40]을 참조하시오. CGGG 및 AGGU는 2개의 화학적으로 아실화된 틀 이동 서프레서 tRNA와 함께 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 시험관 내에서 스트렙타비딘에 동시에 통합시키는데 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194-12195]을 참조하시오. 생체 내 연구에 있어서, 무어(Moore)외 다수는 NCUA 안티 코돈을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 능력을 관찰하였고, 또한 사중체인 UAGA는 0∼-1 틀을 약간 해독하면서, 13∼26%의 효율로 UCUA 안티 코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있음을 발견하였다. 문헌[Moore외 다수, (2000) J. Mol. Biol., 298:195-205]을 참조하시오. 하나의 구체예에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 바탕으로 한 확장 코돈(기타 원치 않는 위치에서 미스 센스 통독(missense readthrough) 및 틀 이동 억제를 줄일 수 있는 코돈)이 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
소정의 시스템에 있어서, 셀렉터 코돈은 또한 내인성 시스템이 천연 염기 코돈을 이용하지 않는(또는 드물게 이용하는) 경우, 천연의 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이는 천연의 3 염기 코돈을 인지하는 tRNA가 결핍된 시스템 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.
셀렉터 코돈은 인위적 염기 쌍을 포함할 수도 있다. 이러한 인위적 염기 쌍은 추가로 현존하는 유전자 알파벳을 확장시킨다. 하나의 잉여(extra) 염기 쌍은 삼중 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기 쌍의 특성으로서는, 안정하고 선택적인 염기 쌍을 형성하는 것과, 중합 효소에 의하여 고 신뢰도로 DNA에 염기 쌍을 효율적으로 통합시키는 것, 그리고 합성하고자 하는 인위적 염기 쌍을 합성한 이후에 효율적으로 프라이머를 연속 증폭시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 인위적 염기쌍에 관한 설명은 예를 들어, 문헌[Hirao외 다수, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182]에 기술되어 있으며, 또한, 문헌[Wu, Y.외 다수, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630]을 참조하시오. 기타 관련 문헌은 이하에 나열되어 있다.
생체 내 사용에 있어서, 인위적 뉴클레오시드는 막 투과성으로서, 인산화되어 상응하는 삼인산염을 형성한다. 뿐만 아니라, 증가된 유전자 정보는 안정하여 세포 내 효소에 의해 파괴되지 않는다. 예전에, 베너(Benner)외 다수에 의한 연구에서는 정형화된 왓슨-크릭 쌍 형성시와는 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였었는데, 여기서 가장 주목할 만한 사항은 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들어, 문헌[Switzer외 다수, (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322-8322; 및 Piccirilli외 다수, (1990) Nature, 343:33-37; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608]을 참조하시오. 상기 염기들은 일반적으로 천연 염기와 어느 정도 쌍을 잘못 형성하므로, 효소에 의해 복제될 수 없다. 쿨(Kool)과 그의 동료 들은, 염기들 사이의 소수성 팩킹 상호 작용(hydrophobic packing interaction)이 수소 결합을 대신하여 염기 쌍을 형성할 수 있음을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; 및 Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36(24), 2825-2828]을 참조하시오. 전술한 조건을 모두 만족시킬 수 있는 인위적 염기쌍을 개발하기 위한 노력의 일환으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 그의 동료 들은 인위적 소수성 염기 시리즈를 체계적으로 합성하여 이에 관해 연구하였다. PICS:PICS 자가-쌍(self-pair)은 천연 염기 쌍보다 더 안정한 것으로 파악되며, 또한 이는 에스케리챠 콜라이 DNA 중합 효소 I의 Klenow 단편(KF)에 의하여 DNA에 효율적으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McMinn외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-11586; 및 Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274-3278]을 참조하시오. 3MN:3MN 자가-쌍은 생물학적 기능을 발휘하는데에 충분한 효율과 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803-8804]을 참조하시오. 그러나, 상기 양 염기들은 추가의 복제에 대해서는 서열 종결자로서 작용한다. 최근 들어, 돌연변이 DNA 중합 효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는데 사용될 수 있는 것으로 변화하고 있다. 뿐만 아니라, 7AI 자가 쌍은 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tae외 다수, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439-7440]을 참조하시오. 신규의 금속성 염기 쌍인 Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714-10715]을 참조하시오. 확장 코돈 및 비천연 코돈이 본질적으로 천연 코돈에 직교하기 때문에, 본원에 개시된 비천연 아미노산 사용 방법은 이러한 특성을 이용하여 이러한 코돈들을 위한 직교 tRNA를 생산할 수 있다.
번역 우회 시스템(translational bypassing system)은 또한 원하는 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 통합시키는데 사용될 수도 있다. 번역 우회 시스템에서는, 큰 서열이 유전자에 통합되지만, 이는 단백질로 번역되지는 않는다. 이 서열은 리보좀이 서열을 건너뛴 후 삽입부의 하류에서 번역을 재개할 수 있도록 만드는 신호로서 사용되는 구조를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및/또는 조성물에 사용되는 목적 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 일부)는 핵산에 의하여 암호화된다. 통상적으로, 상기 핵산은 하나 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
목적 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 당업자에게 널리 공지되어 있고 본원에 기술된("돌연변이 유발법 및 기타 분자 생물학 기술") 방법들을 이용하여 돌연변이될 수 있으며, 그 결과 예를 들어, 비천연 아미노산을 통합시키기 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하게 될 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질에 대한 핵산은 돌연변이 유발되어 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하게 되며, 그 결과 하나 이상의 비천연 아미노산을 통합할 수 있게 된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 임의의 변이체 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 단백질의 돌연변이체를 포함한다. 이와 유사하게, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 또한 해당 핵산 즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 암호화하거나 생체 내 통합할 수 있는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 임의의 핵산을 포함한다.
목적 폴리펩티드 예를 들어, GH 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 용이하게 돌연변이되어 폴리펩티드 중 임의의 원하는 위치에 시스테인을 도입할 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 다양한 기타 분자를 목적 단백질에 도입하는데에 널리 이용된다. 시스테인을 폴리펩티드 중 원하는 위치에 통합하기에 적당한 방법 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,608,183호에 기술된 방법 및 표준적인 돌연변이 유발 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 같이 시스테인을 도입하여 이용하는 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 도입 및 이용 기술과 연계하여 사용할 수 있다.
VIII. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생산
편의를 위하여, 본 섹션에 기술된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생산에 관하여는 일반적으로 그리고/또는 특정 예를 들어 기술하였다. 그러나, 본 섹션에 개시된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생체 내 생산하는 것은 본 섹션에 제공된 특정 예 또는 일반적인 사항을 한정하고자 하는 것이 아니며, 오히려 본 섹션에 기술된 비천연 아미노산 포함 폴리펩티드의 생체 내 생산법은 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 모든 화합물 예를 들어, 본원의 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면에 개시된 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위에 속하는 특정 화합물 또는 임의의 종속 화합물에 동일하게 적용된다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 천연의 시스템 내에서는 암호화되지 않는 아미노산을 부가하거나 치환하는, 변형 tRNA 및 tRNA 합성 효소를 사용하여, 생체 내에서 생산될 수 있다.
천연의 시스템 내에서는 암호화되지 않는 아미노산을 사용하여, tRNA 및 tRNA 합성 효소를 생산하는 방법에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌 예를 들어, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids") 및 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭:"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 개시되어 있다. 이러한 방법들은 번역 시스템에 원래부터 존재하는 tRNA 또는 합성 효소와는 독립적으로 작용하는 번역 기구를 만드는 단계를 포함한다(이러한 이유로 "직교(orthogonal)"이라 칭함). 하나의 구체예에서, 번역 시스템은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데; 이 폴리뉴클레오티드는 상응하는 DNA로부터 전사된 mRNA일 수 있고, 이 mRNA는 RNA 바이러스 벡터로부터 생성될 수 있을 뿐만 아니라; 이 폴리뉴클레오티드는 비천연 아미노산에 대한 통합 위치로서 미리 정해놓은 위치에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함한다. 번역 시스템은 또한, 이 tRNA가 전술한 셀렉터 코돈을 특이적으로 인지하거나 이에 특이적인 경우, 비천연 아미노산에 대한 tRNA를 추가로 포함하고, 또한 적당한 경우에는, 비천연 아미노산을 포함하기도 하며; 추가의 구체예에서, 상기 비천연 아미노산은 아미노아실화된다. 상기 비천연 아미노산으로서는 본원에 개시된 화학식 I∼화학식 LXVII 중 어느 하나의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 포함한다. 추가의 또는 부가적인 구체예에서, 번역 시스템은 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성 효소를 포함하고, 추가의 또는 부가의 구체예에서, 상기 번역 시스템은 직교 tRNA 및 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소를 포함한다. 추가의 또는 부가적인 구체예에서, 번역 시스템으로서는 다음과 같은 것들 중 하나 이상을 포함한다: 전술한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA의 형태의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 플라스미드, 전술한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA의 형태의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 게놈 DNA, 또는 전술한 폴리뉴클레오티드가 통합된 게놈 DNA(추가의 구체예에서, 통합은 안정한 통합임). 번역 시스템에 관한 추가의 또는 부가적인 구체예에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈 및 4염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 번역 시스템에 관한 추가의 또는 부가적인 구체예에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 추가의 또는 부가적인 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보좀에 의해 합성된다.
추가의 또는 부가적인 구체예에서, 번역 시스템은 직교 tRNA(O-tRNA) 및 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소(O-RS)를 포함한다. 통상적으로, 상기 O-RS는 번역 시스템 내 하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, 이 O-tRNA는 시스템 내 다른 tRNA에 의해서는 인지되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인지한다. 그러므로, 번역 시스템은, 암호화된 셀렉터 코돈에 따라서, 비천연 아미노산을 시스템 내 생산된 폴리펩티드에 삽입하므로, 비천연 아미노산을 암호화된 폴리펩티드 내 임의의 위치에 "치환"시킨다.
다양한 종류의 직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성 효소는 폴리펩티드에 특정 합성 아미노산을 삽입하는 것으로 당업계에 알려져 있으며, 이는 일반적으로 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위한, 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적당하다. 예를 들어, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소에 관하여는 문헌[Wang, L.외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(1):56-61 (2003) 및 Zhang, Z.외 다수, Biochem. 42(22): 6735-6746 (2003)]에 개시되어 있다. 대표적인 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 또한 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids") 및 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭:"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 개시되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 상응하는 O-tRNA 분자(O-RS용)에 관하여도, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids") 및 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭:"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 개시되어 있다. 뿐만 아니라, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Mehl외 다수, J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939 및 Santoro외 다수 Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048]에는, p-아미노페닐알라닌을 폴리펩티드에 통합시키기 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 및 tRNA 분자와, 스크리닝 방법에 관하여 기술되어 있다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 적당한 대표적인 O-tRNA 서열로서는, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭:"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 개시된 뉴클레오티드 서열들(서열 번호 1∼서열 번호 3)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 비천연 아미노산에 특이적인 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소 쌍의 기타 예에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids")에 개시되어 있다. 케토- 및 아지드 함유 아미노산 둘 다를 에스.세레비지아애(S.cerevisiae) 내에 통합하는 O-RS 및 O-tRNA에 관하여는 문헌[Chin, J. W.외 다수, Science 301 :964-967 (2003)]에 개시되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소를 사용함에 있어서는, 비천연 아미노산을 암호화하는 특이 코돈을 선별하는 과정을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있을 때, 일반적으로, O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소가 발현되는 세포 내에서 드물게 사용되거나 절대로 사용되지 않는 코돈을 선별하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 코돈으로서는, 넌센스 코돈 예를 들어, 종결 코돈(앰버, 오커 및 오팔 코돈), 4염기 이상의 염기로 이루어진 코돈, 그리고 기타 천연 생성되는 3 염기 코돈(거의 사용되지 않거나 아예 사용되지 않는 코돈)을 포함한다.
특정 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이 유발법(예를 들어, 위치 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등)을 이용하여 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 적당한 위치에 도입될 수 있다.
비천연 아미노산을 통합하는데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분 예를 들어, O-RS, O-tRNA 및 직교 0-tRNA/O-RS 쌍을 생산하는 방법에 관하여는 문헌[Wang, L.외 다수, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W.외 다수, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z.외 다수, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기술되어 있다. 비천연 아미노산의 생체 내 통합 방법 및 이를 위한 조성물에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids") 에 기술되어 있다. 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 선택하는 방법에 관하여도 또한 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭:"In vivo incorporation of unnatural amino acids") 및 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭:"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 기술되어 있다. 뿐만 아니라, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 04/035743(발명의 명칭 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins")에는, 케토 아미노산의 통합에 사용되는 직교 RS 및 tRNA 쌍에 관하여 기술되어 있다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 PCT 공보 WO 04/094593(발명의 명칭 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")에는, 진핵 생물 숙주 세포 내에서 비천연 암호화 아미노산을 통합하는데 사용되는 직교 RS 및 tRNA 쌍에 관하여 기술되어 있다.
하나 이상의 재조합 직교 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 제1 유기체 예를 들어, 원핵 생물 유기체 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움, 에스케리챠 콜라이, 에이.펄기두스, 피.퓨리오서스, 피.호리코시, 에이.페르닉스, 티.서모필러스 등 또는 진핵 생물 유기체로부터, 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)로부터 유래하는 RS 라이브러리(경우에 따라 돌연변이체)를 생산하는 단계; (b) 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 직교 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 일원에 대해 RS 라이브러리(경우에 따라 돌연변이 RS 라이브러리)를 선택(및/또는 스크리닝)하여, 활성(경우에 따라 돌연변이) RS 풀(pool)을 제공하는 단계; 및/또는 (c) 비천연 아미노산의 부재 하에서 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(예를 들어, 돌연변이 RS)에 대한 풀을 선택(경우에 따라 네거티브 선택)하여, 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계[여기서 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시킴].
하나의 구체예에서, 상기 RS는 불활성 RS이다. 상기 불활성 RS는 활성 RS를 돌연변이시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 불활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상, 또는 약 10개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 예를 들어, 알라닌으로 돌연변이시킴으로써 생산될 수 있다.
돌연변이 RS의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 기술 예를 들어, 단백질 3차원 RS 구조를 바탕으로 한 합리적 고안법이나, 랜덤 또는 합리적 고안 기술에 의한 RS 뉴클레오티드 돌연변이 유발법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 RS는 위치 특이적 돌연변이법, 랜덤 돌연변이법, 다양성 발현 재조합 돌연변이법, 키메라 구조물, 합리적 고안법 및 기타 본원 및 당업계에 공지된 방법에 의하여 생성될 수 있다.
하나의 구체예에서, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 직교 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 일원에 대하여 RS(경우에 따라 돌연변이 RS) 라이브러리를 선택(및/또는 스크리닝)하는 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: 포지티브 선별 마커 또는 스크리닝 마커 예를 들어, 항생제 내성 유전자 등과, RS(경우에 따라 돌연변이 RS) 라이브러리를 다수의 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 포지티브 선별 마커 및/또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈 예를 들어, 앰 버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈을 포함함]; 선별 제제의 존재 하에서 다수의 세포들을 생육시키는 단계; 포지티브 선별 마커 또는 스크리닝 마커 내에 존재하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하여, 선별 제제 및/또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 생존하는(또는 특이 반응을 나타내는) 세포를 동정함으로써, 활성인 RS(경우에 따라 돌연변이 RS) 풀을 함유하는 포지티브 선택 세포의 하위 세트를 제공하는 단계. 임의로, 상기 선별 제제 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양할 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 포지티브 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내에 존재하는 앰버 종결 코돈이다. 부가의 선별 마커로서는 네오마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 또는 당업계에 널리 공지 및 개시된 임의의 기타 사용 가능한 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의적으로, 상기 포지티브 선별 마커는 β-락타마제 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내에 존재하는 앰버 종결 코돈이다. 다른 측면에서, 상기 포지티브 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커(예를 들어, 세포 표면 마커)를 포함한다.
하나의 구체예에서, 비천연 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(경우에 따라 돌연변이 RS)의 풀을 네거티브 선택 또는 스크리닝하는 방법으로서는 다음과 같은 단계들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 포지티브 선택 또는 스크리닝을 통하여 얻어진 활성(경우에 따라 돌연변이) RS 풀과 함께 네거티브 선택 또는 스크리닝 마커를 다수의 제2 유기체에 도입하는 단계[여기서, 상기 네거티브 선택 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예를 들어, 항생제 내성 유전자 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸 전이 효소(CAT) 유전자)을 포함함]; 및 비천연 아미노산과 스크리닝 제제 또는 선별 제제가 보강된 제1 매질 중에서 생존하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내되, 비천연 아미노산과 스크리닝 제제 또는 선별 제제가 보강되지 않은 제2 매질 중에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적인 반응을 나타내지 못하는 세포를 동정하여, 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계. 예를 들어, CAT 동정 프로토콜은 적당한 O-RS 재조합체를 확인함에 있어서 경우에 따라 포지티브 선택 수단 및/또는 네거티브 스크리닝 수단으로서의 역할을 한다. 예를 들어, 클론 풀은 경우에 따라, 하나 이상의 비천연 아미노산이 존재하거나 또는 존재하지 않는, CAT(하나 이상의 셀렉터 코돈 포함) 함유 생육 평판 상에서 복제되기도 한다. 그러므로, 비천연 아미노산을 함유하는 평판 상에서만 생장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로서 간주된다. 하나의 측면에서, 선별(및/또는 스크리닝) 제제의 농도는 다양하다. 몇몇 측면에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 상이하다. 그러므로, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체로서는 임의로 다음과 같은 것들을 포함하기도 한다: 원핵 생물, 진핵 생물, 포유동물, 에스케리챠 콜라이, 진균, 효모, 고세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등. 다른 구체예에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커를 포함한다.
다른 구체예에서, 활성 RS(경우에 따라 돌연변이 RS) 풀을 스크리닝 또는 선택(예를 들어, 네거티브 선택)하는 방법으로서는 다음과 같은 단계들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 포지티브 선택 단계(b)로부터 활성 돌연변이 RS 풀을 분리하는 단계; 네거티브 선별 마커 또는 스크리닝 마커와 활성(경우에 따라 돌연변이) RS 풀을 다수의 제2 유기체 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 네거티브 선별 마커 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예를 들어, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자 예를 들어, 리보뉴클레아제 바나제(ribonuclease barnase) 유전자)을 포함함]; 및 비천연 아미노산이 보강되지 않은 제1 매질 중에서 생존하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내되, 비천연 아미노산이 보강된 제2 매질 중에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지 못하는 세포를 동정하여, 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 비천연 아미노산에 특이적임]. 하나의 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 이러한 구체예에서, 임의적으로, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있고, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다[예를 들어, 이 유기체는 임의로, 원핵 생물, 진핵 생물, 포유동물, 에스케리챠 콜라이, 진균, 효모, 고세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등일 수도 있다]. 뿐만 아니라, 몇몇 측면에서는, 네거티브 선별 마커가 리보뉴클레아제 바나제 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하기도 한다. 기타 측면에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 바탕으로 하는 스크리닝 마커를 포함하기도 한다. 본원의 구체예에서, 스크리닝 방법 및/또는 선택 방법은 스크리닝 및/또는 선택 엄중도를 다양하게 조정할 수도 있다.
다른 구체예에서, 하나 이상의 재조합 직교 아미노 아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 생산하는 방법은 추가로 다음의 단계들을 포함할 수도 있다: (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 분리하는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 O-RS(경우에 따라 돌연변이된 O-RS)의 제2 세트를 생산하는 단계; 및 (f) 돌연변이된 O-RS가 우선적으로 O-tRNA를 아미노아실화시키는 능력을 갖게 될 때까지 상기 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복 수행하는 단계. 임의적으로, 상기 단계 (d)∼(f)는 약 2회 이상 반복 수행된다. 하나의 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유래된 돌연변이 O-RS의 제2 세트는 돌연변이 유발법 예를 들어, 랜덤 돌연변이 유발법, 위치 특이적 돌연변이 유발법, 재조합법 또는 이들 방법의 병행법에 의해 생산될 수 있다.
전술한 방법에 있어서, 선택/스크리닝 단계 예를 들어, 포지티브 선택/스크리닝 단계 (b), 네거티브 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 포지티브 및 네거티브 선택/스크리닝 단계인 (b) 및 (c) 둘 다의 엄중도는 다양한 선택/스크리닝 엄중도를 포함하기도 한다. 다른 구체예에서, 포지티브 선택/스크리닝 단계 (b), 네거티브 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 포지티브 및 네거티브 선택/스크리닝 단계인 (b) 및 (c) 둘 다에서는 리포터를 사용하는데, 여기서 상기 리포터는 형광도-활성화 세포 분류법(FACS)에 의해 검출되거나, 또는 상기 리포터는 발광도에 의해 검출된다. 임의로, 상기 리포터는 세포 표면에 디스플레이되거나, 또는 파지 디스플레이되며, 비천연 아미노산 또는 유사체가 관여하는 친화도 또는 촉매 활성을 바탕으로 하여 선택된다. 하나의 구체예에서, 돌연변이된 합성 효소는 세포 표면 상에 디스플레이되거나, 또는 파지 디스플레이된다.
재조합 직교 tRNA(O-tRNA)를 생산하는 방법은 다음과 같은 단계들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (a) 제1 유기체로부터 하나 이상의 tRNA 예를 들어, 서프레서 tRNA 유래 돌연변이 tRNA 라이브러리를 생산하는 단계; (b) 제1 유기체 유래 RS의 부재 하에서, 제2 유기체로부터 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)로 아미노아실화된 tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA)에 대한 라이브러리를 선택(예를 들어, 네거티브 선택) 또는 스크리닝하여, tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA) 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 직교 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 일원들에 대하여 tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA) 풀을 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인지하고, 제2 유기체로부터 유래된 RS에 의해서는 효과적으로 인지되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨]. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 tRNA는, 서프레서 tRNA이고/이거나, 천연 및/또는 인위적 염기로 이루어진 유일 3 염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌 센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 종결 코돈이다. 하나의 구체예에서, 재조합 O-tRNA는 직교성(orthogonality)이 개선되었다. 몇몇 구체예에서, O-tRNA는 변형되지 않고서도, 제2 유기체로부터 제1 유기체로 이동하기도 함을 알 것이다. 다수의 구체예에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하며, 경우에 따라 예를 들어, 원핵 생물(예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 에스케리챠 콜라이, 할로박테리움 등), 진핵 생물, 포유동물, 진균, 효모, 고세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물 등으로부터 선택된다. 뿐만 아니라, 상기 재조합 tRNA는 임의로 비천연 아미노산에 의해 아미노아실화되기도 하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통하여 생체 내에서 생합성 된다. 비천연 아미노산은 경우에 따라 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체용 성장 배지에 첨가되기도 하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 적당한 세포 내 농도를 이룰 수 있으며, 그 결과, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 통합될 수 있는 것이다.
하나의 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 아미노아실화된 tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA)의 라이브러리를 선택(예를 들어, 네거티브 선택) 또는 스크리닝 하는 단계(단계 (b))는 다음의 단계들을 포함한다: 독성 마커 유전자와 (경우에 따라 돌연변이) tRNA 라이브러리를 제2 유기체로부터 유래하는 다수의 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 독성 마커 유전자는 셀렉터 코돈 중 하나 이상(또는 독성 제제 또는 정균제를 생성시키는 유전자, 또는 유기체에 필수적인 유전자)을 포함하며, 이러한 마커 유전자는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함]; 및 생존하는 세포를 선택하는 단계[여기서, 상기 생존하는 세포는 하나 이상의 직교 tRNA 또는 비 기능성 tRNA를 포함하는 tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA) 풀을 함유함]. 예를 들어, 생존 세포는 비교비세포 밀도 검정법(comparison ratio cell density assay)에 의해 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 관한 다른 구체예에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바나제 유전자이며, 여기서, 상기 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 임의적으로, 상기 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.
도입된 직교 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 일원에 대하여 (경우에 따라 돌연변이) tRNA 풀을 선택 또는 스크리닝하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 포지티브 선택 또는 스크리닝 마커 유전자를, O-RS, 그리고 (경우에 따라 돌연변이) tRNA 풀과 함께, 제2 유기체로부터 유래하는 다수의 세포에 도입하는 단계[여기서, 상기 포지티브 마커 유전자는 약물 내성 유전자(예를 들어, 셀렉터 코돈 중 하나 이상 예를 들어, 하나 이상의 앰버 종결 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자), 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 독성 제제를 해독시키는 유전자를 포함함]; 및 선별 제제 또는 스크리닝 제제 예를 들어, 항생제의 존재 하에서 생육된 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 동정하여, 하나 이상의 재조합 tRNA를 갖는 세포 풀을 제공하는 단계[여기서, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 이 재조합 tRNA는 또한 하나 이상의 셀렉터 코돈에 따라서, 포지티브 마커 유전자에 의해 암호화된 번역 산물에 아미노산을 삽입함]. 다른 구체예에서, 선택 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양하다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 형성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (a) 제1 유기체로부터, 하나 이상의 tRNA로부터 유래하는 돌연변이 tRNA 라이브러리를 생산하는 단계; (b) 제1 유기체로부터 유래하는 RS의 부재 하에서, 제2 유기체로부터 얻은 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)에 의해 아미노아실화된 tRNA(경우에 따라 돌연변이 tRNA)에 대한 라이브러리를 네거티브 선택 또는 스크리닝하여, (경우에 따라 돌연변이) tRNA 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 직교 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 일원들에 대하여 (경우에 따라 돌연변이) tRNA 풀을 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계. 상기 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인지하고, 제2 유기체로부터 유래하는 RS에 의해 효과적으로 인지되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 이 방법은 또한 (d) 제3 유기체로부터, 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)로부터 유래하는 (경우에 따라 돌연변이) RS 라이브러리를 생산하는 단계; (e) 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 일원에 대하여 돌연변이 RS 라이브러리를 선택 또는 스크리닝하여, 활성(경우에 따라 돌연변이) RS 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연 아미노산의 부재 하에서, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성(경우에 따라 돌연변이) RS에 대한 풀을 네거티브 선택 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 제공하는 단계[여기서, 상기 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS와, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함]. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍도 본원의 범위와 본원에 개시된 방법에 포함된다. 예를 들어, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 예를 들어, mutRNATyr-mutTyrRS 쌍 예를 들어, mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 이러한 방법은 상기 제1 유기체 및 제3 유기체가 동일한(예를 들어, 메타노코커스 재너쉬) 방법도 포함한다.
제2 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 선택하는 방법도 본원에 개시된 발명에 포함된다. 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 제1 유기체로부터 분리 또는 유래하는 마커 유전자, tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)를 제2 유기체로부터 유래하는 제1 세포 세트에 도입하는 단계; 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터 얻은 이중체 세포(duplicate cell) 세트에 도입하는 단계; 및 이중체 세포 세트 중에서 생존하지 못하는 제1 세트 내 생존 세포를 선택하거나, 또는 이중체 세포 세트 내에서 이러한 반응을 나타내지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트 및 이중체 세포 세트는 선별 제제 또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 생육되고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체 내 번역 시스템 내에서 사용되는 직교 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍을 포함한다. 하나의 구체예에서, 비교 및 선택 또는 스크리닝하는 방법은 생체 내 상보성 검정법을 포함한다. 선별 제제 또는 스크리닝 제제의 농도는 다양할 수 있다.
본원에 개시된 유기체로서는 다양한 종류의 것들과 이들의 다양한 조합체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 유기체는 경우에 따라 원핵 생물 유기체 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움, 에스케리챠 콜라이, 에이.펄기두스, 피.퓨리오서스, 피.호리코시, 에이.페르닉스, 티.서모필러스 등이다. 대안적으로, 상기 유기체로서는 진핵 생물 유기체 예를 들어, 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 등과 같은 고등 식물), 조류(algae), 원생 생물, 진균(예를 들어, 효모), 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충 및 절지 동물 등) 등이 있다.
A. 진핵 생물이 아닌 생물 및 진핵 생물 내에서의 발현
본 섹션에 개시된 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 진핵 생물이 아닌 생물 및 진핵 생물 내에서의 발현에 적용될 수 있다.
클로닝된 폴리뉴클레오티드를 고 수준으로 발현시키기 위해서는, 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 유도하는 강력한 프로모터, 전사/번역 종결 인자를 함유하는 발현 벡터에 서브 클로닝하며, 만일 단백질을 암호화하는 핵산의 경우에는, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 위치를 함유하는 발현 벡터에 서브 클로닝하는 것이 통상적이다. 적당한 박테리아 프로모터에 관하여는 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수 및 Ausubel외 다수]에 기술되어 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드를 발현하기 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들어, 이.콜라이, 바실러스 속, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애어루기노사, 슈도모나스 퓨티다 및 살모넬라로부터 얻을 수 있다(Palva외 다수, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach외 다수, Nature 302:543-545 (1983)). 이러한 발현 시스템용 키트는 시판중에 있다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵 생물 발현 시스템도 시판되고 있다. (전술한) 직교 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성 효소가 폴리펩티드를 발현시키는데에 사용되는 경우, 발현용 숙주 세포는, 이 숙주 세포가 직교 구성 성분을 사용하는 능력을 바탕으로 하여 선택된다. 대표적인 숙주 세포로서는 그램-양성 박테리아(예를 들어, 비.브레비스(B.brevis), 비.서브틸리스(B.subtilis) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 그램 음성 박테리아(이.콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애어루기노사, 슈도모나스 퓨티다), 그리고 효모 및 기타 진핵 생물 세포를 포함한다. 0-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물이 아닌 숙주 세포는 유용할 정도로 다량으로, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 합성하는 능력을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 조성물은 경우에 따라 약 10㎍ 이상, 약 50㎍ 이상, 약 75㎍ 이상, 약 100㎍ 이상, 약 200㎍ 이상, 약 250㎍ 이상, 약 500㎍ 이상, 약 1㎎ 이상, 약 10㎎ 이상, 약 100㎎ 이상, 약 1g 이상의 비천연 아미노산 포함 폴리펩티드, 또는 생체 내 폴리펩티드 생산 방법을 수행할 수 있는 양만큼의 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[재조합 단백질 생산 방법 및 정제 방법에 관한 상세한 설명은 본원에 제공됨]. 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 경우에 따라 예를 들어, (예를 들어, 부피 약 1nl∼약 100ℓ 이상인) 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액, 또는 기타 액체 현탁액 중에, 이것들 1ℓ당 약 10㎍ 이상, 약 50㎍ 이상, 약 75㎍ 이상, 약 100㎍ 이상, 약 200㎍ 이상, 약 250㎍ 이상, 약 500㎍ 이상, 약 1㎎ 이상 또는 약 10㎎ 이상의 폴리펩티드의 농도로 조성물 중에 존재한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 진핵 생물 세포 중 단백질의 다량 생산 방법(예를 들어, 시험관 내 번역과 같은 기타 방법에서 통상적으로 생산될 수 있는 양보다 다량으로 생산하는 방법)은 본원에 개시된 방법, 기술 및 조성물의 특징을 이룬다.
본원에 개시된 진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물이 아닌 숙주 세포는 다량의 유효량으로 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 및/또는 완충액 중 약 10㎍/ℓ 이상, 약 50㎍/ℓ 이상, 약 75㎍/ℓ 이상, 약 100㎍/ℓ 이상, 약 200㎍/ℓ 이상, 약 250㎍/ℓ 이상, 또는 약 500㎍/ℓ 이상, 약 1㎎/ℓ 이상, 약 2㎎/ℓ 이상, 약 3㎎/ℓ 이상, 약 4㎎/ℓ 이상, 약 5㎎/ℓ 이상, 약 6㎎/ℓ 이상, 약 7㎎/ℓ 이상, 약 8㎎/ℓ 이상, 약 9㎎/ℓ 이상, 약 10㎎/ℓ 이상, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900㎎/ℓ 이상, 약 1g/ℓ, 약 5g/ℓ, 약 10g/ℓ 이상의 단백질 농도로 생산될 수 있다.
1. 발현 시스템, 배양 및 분리
본 섹션에 개시된 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 발현 시스템, 배양 및 분리에 적용될 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의의 수의 적당한 발현 시스템 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아 내에서 발현될 수 있다. 대표적인 발현 시스템에 관한 설명은 본원에 제공되어 있다.
효모
본원에 사용된 "효모"란 용어는, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 다양한 효모 중 임의의 것을 포함한다. 이러한 효모로서는 유포자 효모류(ascosporogenous yeasts)(엔도마이세탈레스; Endomycetales), 담자균 효모 및 불완전 진균(Fungi imperfecti)(블라스토마이세츠; Blastomycetes) 군에 속하는 효모를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유포자 효모류는 2개의 군으로 나뉘는데, 즉, 스페르모프토라세아에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세아에(Saccharomycetaceae)로 나뉜다. 상기 사카로마이세타세아에는 4개의 하위 군인 쉬조사카로마이코이디아에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이디아에(Nadsonioideae), 리포마이코이디아에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이디아에(Saccharomycoideae) (예를 들어, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스 속)으로 이루어져 있다. 상기 담자균 효모로서는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 상기 불완전 진균(블라스토마이세츠) 군에 속하는 효모는 2개의 군으로 나뉘는데, 즉, 스포로볼로마이세타세아에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 크립토코카세아에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida) 속)으로 나뉜다.
임의의 구체예에서, 피치아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세뉼라(Hansenula), 토룰롭시스(Torulopsis), 그리고 칸디다(Candida) 예를 들어, 피.파스토리스(P. pastoris), 피.길레리몬디(P. guillerimondii), 에스.세레비지아에(S. cerevisiae), 에스.칼스버젠시스(S. carlsbergensis), 에스.디아스타티쿠스(S. diastaticus), 에스.더글라시(S. douglasii), 에스.클루이베리(S. kluyveri), 에스.노벤시스(S. norbensis), 에스. 오비포르미스(S. oviformis), 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프래길리스(K. fragilis), 씨.알비칸스(C. albicans), 씨. 말토사(C. maltosa) 및 에이치. 폴리모파(H. polymorpha) 속에 포함되는 종들이 본원에 개시된 방법, 기술 및 조성물에 사용된다.
비천연 아미노산 폴리펩티드를 발현시키는데에 적당한 효모를 선택하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 발현용 효모 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주로서는 예를 들어, 분비능이 뛰어난 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 그리고 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 효모는 일반적으로 다수의 공급체 예를 들어, 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center), 캘리포니아 대학(Berkeley, CA)의 생물 물리학 및 의학 물리학 부 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC") (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다.
"효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고 있는 효모들을 포함한다. 상기 용어는 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA를 수용한 원래의 효모 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, 비천연 아미노산 폴리펩티드 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
다수의 효모 숙주에 형질 전환 시키는데에 사용되는 발현 및 형질 전환 벡터 예를 들어, 잉여 염색체 레플리콘 또는 통합 벡터가 개발되었다. 예를 들어, 에스.세레비지아에(Sikorski외 다수, GENETICS (1989) 122:19; Ito외 다수, J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); 씨.알비칸스(Kurtz외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); 씨.말토사(Kunze외 다수, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); 에이치.폴리모파(Gleeson외 다수, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp외 다수, MOL. GEN. GENET.(1986) 202:302); 케이.프래길리스(Das외 다수, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); 케이.락티스(De Louvencourt외 다수, J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg외 다수, BIOTECHNOLOGY(1990) 8:135); 피.길레리몬디(Kunze외 다수, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); 피.파스토리스(미국 특허 제5,324,639호; 동 제4,929,555호; 및 동 제4,837,148호; Cregg외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Beach외 다수, NATURE (1982) 300:706); 및 와이.리폴리티카(Y. lipolytica); 에이.니듈란스(A. nidulans)(Ballance외 다수, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn외 다수, GENE (1983) 26:205-221; 및 Yelton외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); 에이.나이저(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); 티.리시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 사상 진균 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)[상기 각 문헌은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 사용되는 발현 벡터가 개발되었다.
효모 벡터에 대한 제어 서열로서는 알콜 탈수소효소(ADH)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이성화 효소; 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈 수소 효소(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프락토키나제; 3-포스포글리서레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP 0 329 203)와 같은 효소의 유전자로부터 얻어지는 프로모터 부위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 산성 포스파타제를 암호화하는 효모 PHO5 유전자는 또한 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다[Miyanohara외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1]. 효모 숙주에 사용되는 기타 적당한 프로모터 서열은 3-포스포글리서레이트 키나제용 프로모터[Hitzeman외 다수, J. BIOL. CHEM. (1980) 255(4):12073-12080]; 및 기타 해당 효소 예를 들어, 피루베이트 탈 탄소 효소, 트리오스포스페이트 이성화 효소 및 포스포글루코스 이성화 효소용 프로모터[Holland외 다수, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess외 다수, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149]를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 제어된다는 부가적인 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알콜 탈수소 효소 2; 이소시토크롬 C; 산성 포스파타제; 메탈로티오닌; 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소; 질소 대사와 관련된 분해 효소; 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 부위를 포함할 수 있다. 효모 내 발현시 사용되는 적당한 벡터 및 프로모터에 관하여는 EP 0 073 657에 더욱 상세히 기술되어 있다.
효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서의 기능을 가질 수도 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS)은 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 부위와 결합하여 합성 혼성 프로모터를 형성할 수 있다. 이와 같은 혼성 프로모터의 예로서는 GAP 전사 활성화 부위에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 미국 특허 제4,880,734호 및 동 제4,876,197호를 참조하시오. 혼성 프로모터의 다른 예로서는 ADH2, GAL4, GAL1O 또는 PHO5 유전자의 조절 서열이 해당 효소 유전자인 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 부위와 합체되어 있는 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조하시오. 뿐만 아니라, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합 효소와 결합하여 전사를 개시하는 능력을 가지는 비-효모 기원의 천연 생성 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 기타 조절 요소로서는 종결 인자 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라아제 유전자 유래 종결 인자를 포함한다[Holland외 다수, J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385]. 뿐만 아니라, 2 μ 플라스미드 기원으로부터 유래한 복제 기원은 효모용으로서 적당하다. 효모용으로 사용하기에 적당한 선택 유전자로서는 효모 플라스미드 내에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌[Tschumper외 다수, GENE (1980) 10:157; Kingsman외 다수, GENE (1979) 7:141]을 참조하시오. 상기 trp1 유전자는 트립토판이 존재하는 환경 하에서 생육하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커를 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 보유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
외인성 DNA를 효모 숙주에 도입하는 방법으로서는, 알칼리 양이온으로 처리된 스페로플라스트(spheroplast)의 형질 전환법 또는 원래 상태의 효모 숙주 세포의 형질 전환법을 포함한다. 예를 들어, 효모의 형질 전환법은 문헌[Hsiao외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 및 Van Solingen외 다수, J. BACT. (1977) 130:946]에 기술된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 세포로 도입하는 기타 방법 예를 들어, 핵내 주입법, 전기 천공법 또는 원형질체 융합법도 문헌[SAMBROOK외 다수, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 이후, 효모 숙주 세포는 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 배양될 수 있다.
이종 단백질을 효모 숙주 세포 내에서 발현시키는 또 다른 방법이 문헌[미국 특허 출원 공보 제20020055169호, 미국 특허 제6,361,969호; 동 제6,312,923호; 동 제6,183,985호; 동 제6,083,723호; 동 제6,017,731호; 동 제5,674,706호; 동 제5,629,203호; 동 제5,602,034호; 동 제5,089,398호; 미국 재심사 특허 RE37,343 및 RE35,749; PCT 특허 출원 공보 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556]에 개시되어 있다. 또한 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 문헌[Gellissen외 다수, Antonie Van Leeuwenhoek(1992) 62(1-2):79-93; Romanos외 다수, Yeast (1992) 8(6):423-488; Goeddel, Methods in Enzymology (1990) 185:3-7]을 참조하시오.
효모 숙주 균주는 표준적인 유가식 발효법을 이용하여 증폭시 발효조 내에서 생육될 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 제어 방식의 차이점을 보완하도록 응용될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효에는 단일 글루코스 공급물, 복합적 질소 공급원(예를 들어, 카세인 가수 분해물) 그리고 다수의 비타민 보충물이 필요할 수 있으며, 이와는 반대로, 메탄올자화성 효모인 피.파스토리스는 글리세롤, 메탄올, 그리고 미량의 무기 공급물이 필요할 수 있으나, 최적 생육과 발현을 위해서는 간단히 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수도 있다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 문헌[미국 특허 제5,324,639호; Elliott외 다수, J. Protein Chem.(1990) 9:95; 및 Fieschko외 다수, Biotech. Bioeng. (1987) 29:1113]을 참조하시오.
그러나, 이러한 발효 방법은 사용된 효모 숙주 균주와는 독립적인 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 최대로 생육시키기 위해서는 증식 단계 중에 생육 제한 영양소(통상적으로는 탄소)를 발효기에 가할 수 있다. 뿐만 아니라, 발효 방법에 있어서는, 일반적으로 적당한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인 및 기타 최소 영양소(비타민, 미량 무기물 및 염 등)를 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아(Pichia) 용으로서 사용하기에 적당한 발효 배지의 예는 미국 특허 제5,324,639호 및 동 제5,231,178호(각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 기술되어 있다.
바큘로바이러스-감염 곤충 세포
"곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"란 용어는, 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용되는 곤충을 의미한다. 상기 용어는 형질 감염된 원래 곤충 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, 비천연 아미노산 폴리펩티드 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
원하는 폴리펩티드 발현에 적당한 곤충 세포의 선택 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 몇몇 곤충 세포종 예를 들어, 아에데스 아에집티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)에 관하여는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 곤충 세포종 중 몇몇은 시판되고 있다. 발현용 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주로서는 예를 들어, 분비능이 뛰어난 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 그리고 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 곤충은 일반적으로 다수의 공급체 예를 들어, 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center), 캘리포니아 대학(Berkeley, CA)의 생물 물리학 및 의학 물리학 부; 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC") (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다.
일반적으로, 바큘로바이러스 감염 곤충 발현 시스템의 성분으로서는 운반 벡터, 일반적으로 박테리아 플라스미드(바큘로바이러스 게놈 단편과, 발현될 이종 유전자를 삽입하기 위한 편리한 제한 위치 둘 다를 함유); 운반 벡터 내 바큘로바이러스-특이 단편에 상동성인 서열을 보유하는 야생형 바큘로바이러스(이종 유전자의 상동성 재조합에 의해 바큘로바이러스 게놈 내에 도입 가능); 및 적당한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질 감염시키며, 플라크를 선택하고, 배양액 중에서 세포를 생육시키는 등에 사용되는 재료, 방법 및 기술에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 이에 관한 매뉴얼에는 이러한 기술에 관하여 설명되어 있다.
이종 유전자를 운반 벡터에 삽입한 이후, 상기 벡터 및 야생형 바이러스 게놈은 벡터와 바이러스 게놈이 재조합되는 곤충 숙주 세포 내에 형질 감염된다. 팩킹된 재조합 바이러스는 발현되며, 재조합 플라크는 동정 및 정제된다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 사용되는 재료 및 방법은 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA)으로부터 키트의 형태로 시판되고 있다. 예시적인 기술에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)]에 상세히 설명되어 있다. 뿐만 아니라, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL외 다수, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); 및 O'REILLY외 다수, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]도 참조하시오.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용하여 다양한 이종 단백질을 생산하는 방법에 관하여는 다음과 같은 참고 문헌에 기술되어 있으며, 이와 같은 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하도록 응용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,368,825호; 동 제6,342,216호; 동 제6,338,846호; 동 제6,261,805호; 동 제6,245,528호, 동 제6,225,060호; 동 제6,183,987호; 동 제6,168,932호; 동 제6,126,944호; 동 제6,096,304호; 동 제6,013,433호; 동 제5,965,393호; 동 제5,939,285호; 동 제5,891,676호; 동 제5,871,986호; 동 제5,861,279호; 동 제5,858,368호; 동 제5,843,733호; 동 제5,762,939호; 동 제5,753,220호; 동 제5,605,827호; 동 제5,583,023호; 동 제5,571,709호; 동 제5,516,657호; 동 제5,290,686호; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082를 참조하시오.
바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터로서는 바큘로바이러스 오토그라파캘리포니카(Autographacalifornica) 핵 다면체 바이러스(AcNPV)(헬퍼(helper)-독립성 바이러스 발현 벡터)로부터 유래하는 곤충 발현 벡터 및 운반 벡터를 포함한다. 이 시스템으로부터 유래하는 바이러스 발현 벡터는 일반적으로 강력한 바이러스 다면체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로 문헌[O'Reilly외 다수, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조하시오.
외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입하기 이전에, 프로모터, 리더(원하는 경우), 목적으로 하는 암호화 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 전술한 성분들은 통상적으로 중간 대체 구조물(intermediate transplacement construct)(운반 벡터) 내에서 조립된다. 중간 대체 구조물은 종종 레플리콘 예를 들어, 숙주 예를 들어, 박테리아 내에서 안정하게 유지될 수 있는 잉여 염색체 요소(예를 들어, 플라스미드) 내에 유지된다. 상기 레플리콘은 복제 시스템을 가지므로, 클로닝 및 증폭에 적당한 숙주 내에 유지될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 플라스미드는 다면체 단백질(polyhedrin) 폴리아데닐화 신호[Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177]와 원핵 생물 암피실린-내성(amp) 유전자, 그리고 이.콜라이 내 선택 및 증식용 복제 기원을 포함할 수 있다.
AcNPV 내에 외래 유전자를 도입하는데 일반적으로 사용되는 하나의 운반 벡터로서는 pAc373이 있다. 당업자에게 공지된 다수의 기타 벡터 예를 들어, pVL985(다면체 단백질 개시 코돈을 ATG에서 ATT로 바꾸어 주며, 이 ATT로부터 32 염기쌍 하류에 BamHI 클로닝 위치를 도입함)도 디자인되었다. 문헌[Luckow and Summers, Virology 170:31-39(1989)]을 참조하시오. 기타 시판되고 있는 벡터로서는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 포함한다.
이종 유전자를 삽입한 이후, 운반 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주에 공동 형질 감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 내 원하는 위치에 도입하는 예시적인 방법에 관하여는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31-39]에 기술되어 있다. 예를 들어, 삽입은 상동성 이중 교차 재조합에 의해 유전자 예를 들어, 다면체 단백질 유전자에서 일어날 수 있으며; 삽입은 또한 원하는 바큘로바이러스 유전자 내에 조작되어 도입된 제한 효소 위치에서도 일어날 수 있다. 문헌[Miller외 다수, BIOESSAYS (1989) 11(4):91]을 참조하시오.
형질 감염은 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501]에 개시된 방법을 이용하여, 전기 천공법에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 리포좀은 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스로 곤충 세포를 형질 감염시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Liebman외 다수, BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36; Graves외 다수, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura외 다수, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt외 다수, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert외 다수, NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS외 다수, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai외 다수, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin외 다수, NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost외 다수, GENE (1997) 190:139; Jakobsson외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reverey외 다수, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10; Stanley외 다수, J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk외 다수, J. VIROL. (1994) 68(2):766; 및 Peng외 다수, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274]을 참조하시오. 시판중인 리포좀으로서는 예를 들어, 셀펙틴(Cellfectin)® 및 리포펙틴(Lipofectin)® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)을 포함한다. 뿐만 아니라, 인산칼슘 형질 감염법이 사용될 수도 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; 및 Mann and King, J. GEN. VlROL. (1989) 70:3501]을 참조하시오.
바큘로바이러스 발현 벡터는 일반적으로 바큘로바이러스 프로모터를 함유한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합 효소에 결합하여, 암호화 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5' 말단에 인접하여 존재하는 전사 개시 부위를 가질 것이다. 이 전사 개시 부위는 통상적으로 RNA 중합 효소 결합 위치와 전사 개시 위치를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 또한 제2 도메인("인핸서"라 칭함)을 가질 수 있으며, 이 인핸서가 존재하면 이 프로모터는 구조 유전자와 멀리 떨어져 존재하게 된다. 뿐만 아니라, 발현은 조절되거나 또는 구성적일 수 있다.
감염 주기의 후반부에 다량으로 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로서는 바이러스 다면체 단백질을 암호화하는 유전자[FRIESEN외 다수, The Regulation of Baculovirus Gene Expression, THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 및 0 155 476]과 p10 단백질을 암호화하는 유전자[Vlak외 다수, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765]로부터 유래하는 서열을 포함한다.
새로 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스로 팩킹되고, 이후 생장한 플라크는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어, 문헌[Miller외 다수, BIOESSAYS (1989)4:91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)]에 개시된 기술에 의해 정제될 수 있다.
재조합 바큘로바이러스 발현 벡터가 몇몇 곤충 세포에 감염시키기 위한 목적으로 개발되었다. 예를 들어, 재조합 바큘로바이러스는, 그 중에서도 특히 아에데스 아에집티(ATCC No. CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC No. CRL-8910), 드로소필라 멜라노개스터(ATCC No. 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리코플러시아 니에 사용하기 위한 목적으로서 개발되었다. 문헌[WO 89/046,699; Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell외 다수, J. VIROL. (1985) 56:153; Smith외 다수, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]을 참조하시오. 일반적으로, 문헌[Fraser외 다수, IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]을 참조하시오. 더욱 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템 용으로 사용된 세포주로서는 일반적으로, Sf9(스포도프테라 프루기페르다)(ATCC No. CRL-1711), Sf21(스포도프테라 프루기페르다)(Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (트리코플러시아 니) 및 하이-파이브(High-Five)™ BTI-TN-5B1-4(트리코플러시아 니)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바큘로바이러스내 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현/발현 양자를 위한 세포 및 배양 배지가 시판되고 있다.
이.콜라이, 슈도모나스 및 기타 원핵 생물
박테리아 발현 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 다양한 벡터가 박테리아 숙주 내에서 사용될 수 있다. 벡터는 하나의 복사체이거나, 또는 소수 또는 다수의 복사체로 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현용으로 사용될 수 있다. 벡터에 관한 다수의 문헌, 다수의 벡터의 상업적 이용 가능성, 그리고 벡터와 이 벡터의 제한 맵 그리고 특성에 관하여 기술되어 있는 매뉴얼에 비추어 보았을때, 본원에서는 더 이상 논의할 필요는 없다. 널리 알려져 있는 바와 같이, 벡터는 일반적으로 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하는데, 여기서 상기 마커는 세포 독성 제제 내성, 원 영양성 또는 면역성을 제공할 수 있다. 종종, 상이한 특성을 제공하는 다수의 마커들이 존재한다.
박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합 효소와 결합할 수 있고 암호화 서열(예를 들어, 구조 유전자)→mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5' 말단에 인접하여 위치하는 전사 개시 부위를 가질 것이다. 이러한 전사 개시 부위는 통상적으로 RNA 중합 효소 결합 위치와 전사 개시 위치를 포함한다. 박테리아 프로모터는 또한 작동자(operator)라고 불리는 제2의 도메인 즉, RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합 효소 결합 위치에 중첩되어 존재할 수 있는 도메인을 가질 수 있다. 유전자 억제자 단백질이 작동자에 결합하여 특정 유전자의 전사를 억제할 수 있을 때, 작동자는 네거티브 조절 방식(유도성)으로 전사를 가능하게 한다. 구성적 발현은 네거티브 조절 요소 예를 들어, 작동자가 존재하지 않을 때 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 프지티브 조절은, 일반적으로 유전자 활성자(activator) 단백질 결합 서열이 RNA 중합 효소 결합 서열에 인접하여(5') 존재할 경우, 이 유전자 활성자 단백질 결합 서열에 의하여 일어날 수 있다. 유전자 활성자 단백질의 예로서는, 에스케리챠 콜라이(이.콜라이) 내 lac 오페론의 전사 개시를 도와주는 대사물 활성자 단백질(CAP)이 있다[Raibaud외 다수, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]. 그러므로, 발현은 포지티브 방식이나 네거티브 방식으로 조절될 수 있으며, 또한 이에 따라서 전사가 강화 또는 감소될 수 있는 것이다.
대사 경로 효소를 암호화하는 서열이 프로모터 서열로서 특히 유용하다. 그 예로서는 당(예를 들어, 갈락토스, 락토스(lac)(Chang외 다수, NATURE (1977) 198:1056) 및 말토스) 대사 효소로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다. 부가 예로서는 생합성 효소 예를 들어, 트립토판(trp) 생합성 효소로부터 유래 된 프로모터 서열을 포함한다[Goeddel외 다수, NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton외 다수, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; 미국 특허 제4,738,921호; IFN 공보 036 776 및 121 775; 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]. β-갈락토시다제(bla) 프로모터 시스템[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes.", Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], 박테리오파지 람다 PL[Shimatake외 다수, NATURE (1981) 292:128] 및 T5[미국 특허 제4,689,406호](상기 문헌들은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨) 프로모터 시스템 또한 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강력한 프로모터 예를 들어, T7 프로모터를 이용하여, 폴리펩티드가 높은 수준으로 생산되도록 유도하는 것이다. 이러한 벡터의 예로서는 pET29 시리즈(Novagen)와, pPOP 벡터(WO99/05297; 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 자생력 또는 성장 매개 변수를 악화시키지 않고서도 숙주 내에서 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다. pET19 (Novagen)는 당업계에 공지된 또 다른 벡터이다.
뿐만 아니라, 천연에서 생성되지 않는 합성 프로모터는 또한 박테리아 프로모터로서도 작용한다. 예를 들어, 하나의 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열은 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합하여, 합성 혼성 프로모터를 생성할 수 있다[미국 특허 제4,551,433호]. 예를 들어, tac 프로모터는 trp 프로모터와 lac 오페론 서열 둘 다를 포함하는 혼성 trp-lac 프로모터로서, lac 억제자에 의해 조절된다[Amann외 다수, GENE (1983) 25:167; de Boer외 다수, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. 더욱이, 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 중합 효소와 결합하여 전사를 개시하는 능력을 가지는 비-박테리아 기원의 천연 생성 프로모터를 포함할 수 있다. 비-박테리아 기원의 천연 생성 프로모터는 또한 친화 가능한 RNA 중합 효소와 커플링되어 원핵 생물 내에서 몇몇 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수도 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다[Studier외 다수, J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor외 다수, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074]. 뿐만 아니라, 혼성 프로모터는 또한 박테리오파지 프로모터와 이.콜라이 작동자 부위로 이루어질 수도 있다[EPO 공보 267 851].
프로모터 서열을 작동시키는 것 이외에, 효과적인 리보좀 결합 위치는 또한 원핵 생물 내에서 외래 유전자를 발현시키는데에도 유용하다. 이.콜라이 내에 존재하는 리보좀 결합 위치를 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열이라고 부르며, 이 위치는 개시 코돈(ATG)과 이 개시 코돈의 3∼11 뉴클레오티드 상류에 위치하는, 길이 3∼9 뉴클레오티드인 서열을 포함한다[Shine외 다수, NATURE (1975) 254:34]. 상기 SD 서열은, 이.콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이에 염기쌍을 형성함으로써, mRNA가 리보좀에 결합하는 것을 촉진하는 것으로 생각된다[Steitz외 다수 "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. 약한 리보좀-결합 위치를 갖는 진핵 생물 유전자 및 원핵 생물 유전자의 발현도 촉진하는 것으로 생각된다[Sambrook외 다수 "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].
"박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"라는 용어는, 재조합 벡터 또는 기타 운반 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고 있는 박테리아를 의미한다. 상기 용어는 형질 감염된 원래의 박테리아 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 부모 세포의 자손은 우발적 또는 의도적 돌연변이가 발생하기 때문에, 원래의 부모 세포와 형태, 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요는 없다는 사실을 알 수 있다. 부모와 충분히 유사하여 관련 특성 예를 들어, 원하는 폴리펩티드 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 부모 세포의 자손은 상기 정의에 따른 숙주 세포의 자손에 포함된다.
원하는 폴리펩티드의 발현에 적당한 숙주 박테리아의 선택법은 당업자에게 공지되어 있다. 발현용 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적당한 숙주는 다음과 같은 특징들 중 하나 이상, 바람직하게는, 우수한 봉입체(inclusion body) 형성 능, 낮은 단백 분해 활성, 우수한 분비능, 우수한 가용성 단백질 생산 능, 전체적인 강건함과 같은 특징들 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 박테리아 숙주는 일반적으로 다양한 공급원 예를 들어, 박테리아 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center), 캘리포니아 대학(Berkeley, CA)의 생물 물리학 및 의학 물리학 부; 및 미국 모식균 배양 수집소("ATCC")(Manassas, VA)로부터 입수할 수 있다. 산업적/제약학적 발효에서는 일반적으로 K 균주(예를 들어, W3110)으로부터 유래된 박테리아 또는 B 균주(예를 들어, BL21)로부터 유래된 박테리아를 이용한다. 이들 균주는 성장 매개 변수가 잘 알려져 있으며, 강건하기 때문에 특히 유용하다. 뿐만 아니라, 이들 균주는 비-병원성으로서, 안전 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 본원에 개시 및 포함된 방법에 관한 하나의 구체예에서, 이.콜라이 숙주로서는 BL21, DH10B 균주 또는 이들의 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시 및 포함된 방법에 관한 다른 구체예에서, 상기 이.콜라이 숙주는 단백질 분해 효소 음성 균주 예를 들어, OMP- 및 LON-이다. 다른 구체예에서, 박테리아 숙주는 슈도모나스 속에 속하는 종들 예를 들어, 피. 플루오레센스, 피. 애어루기노사 및 피. 퓨티다이다. 슈도모나스 발현 균주의 예로서는 피. 플루오레센스 바이오바 1(MB101 균주)(Dow Chemical)이 있다.
세포 또는 세포주 발현 시스템
세포 또는 세포주 발현 시스템이란, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 세포, 세포주 및 트랜스제닉 유기체 예를 들어, 양서류, 파충류, 조류, 그리고 포유동물을 의미한다. 뿐만 아니라, 트랜스제닉 유기체 발현에는, 분비형 또는 배출형(예를 들어, 모유 또는 달걀)인 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하는데, 이 폴리펩티드는 수집 가능하며, 필요에 따라서, 발현된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 당업계에 공지되었으며, 본원에 개시된 표준적인 방법을 사용하여 추출 및 추가로 정제될 수 있다.
유용한 숙주 세포 및/또는 세포주의 예로서는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Balb/3T3, RIN, MT2, 마우스 NSO 및 기타 골수종 세포주, 하이브리도마 및 이종 하이브리도마(heterohybridoma) 세포주, 백혈구, 섬유 아세포, Sp2/0 및 MDCK 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 무혈청 배지에 순응한 세포주도 사용할 수 있으며, 이와 같은 세포주는 혈청 단백질을 포함하지 않으므로, 분비된 단백질을 세포 배양 배지로부터 정제하는 것을 촉진한다. 하나의 구체예로서는 무 혈청 EBNA-1 세포주가 있다[Pham외 다수, (2003) Biotechnol Bioeng. 84.332-42]. 뿐만 아니라, 숙주 세포 균주로서는, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 원하는 방식으로 유전자 생산물을 변형 및 가공하는 것으로서 선택될 수 있다. 이러한 단백질 생산물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포, 세포주, 숙주 시스템 또는 유기체는 번역 후 가공 및 단백질 변형을 수행한다는 특징과 이에 특이적인 기구를 갖는다. 적당한 세포, 세포주, 숙주 시스템 또는 유기체로서는, 발현된 외래 단백질을 올바르게 변형 및 가공하는 것으로서 선택될 수 있다.
다수의 선별 시스템 예를 들어, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및/또는 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(tk-, hgprt-, aprt- 또는 dhfr- 세포 내)이 사용될 수 있다. 또한, 항-대사 물질 내성은 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt에 대한 선별의 기초; 아미노글리코시드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo에 대한 선별의 기초; 그리고 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro에 대한 선별의 기초로 사용될 수 있다. 부가의 선별 시스템에 관하여는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 생산과 관련된 다수의 고려 사항 예를 들어, 숙주 세포의 유형, 원하는 번역 후 변형, 벡터의 선택, 생산 규모, 생산 비용, 그리고 정제의 용이성에 따라서 이용될 수 있다.
일단, 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구조물이 숙주 세포 내에 도입되고, 적당한 발현 구조물을 갖는 숙주 세포가 분리되면), 재조합 숙주 세포 균주는 폴리펩티드 생산에 적당한 조건 하에서 배양된다. 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용된 발현 구조물의 성질과 숙주 세포의 본질에 따라서 달라질 것이다. 재조합 숙주 균주는 보통 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 배양된다. 재조합 숙주 세포는 통상적으로 동화 가능한 탄소, 질소 및 무기 염 공급원을 함유하고, 경우에 따라 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 기타 당업계에 공지된 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 숙주 세포 배양을 위한 액체 배지는, 원하지 않는 미생물의 생장을 막기 위한 항생제 또는 항진균제 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 화합물 예를 들어, 항생제를 함유할 수도 있다.
재조합 숙주 세포는, 회분식 또는 연속식으로, 세포를 수집하거나(원하는 폴리펩티드가 세포 내에 축적될 경우) 또는 배양 상청액을 수집하는, 회분식 또는 연속식 배양 방법으로 배양될 수 있다. 원핵 생물 숙주 세포 내에서의 생산에 있어서는, 회분식 배양 및 세포 수집 방식이 바람직하다. 단백질 발현이 세포 또는 세포주 발현 시스템에 의해 이루어지는 경우, 세포는 다양한 형태 예를 들어, 다량의 배양액에 현탁된 상태로 생장하는 비고정 의존형 세포의 형태, 또는 증식을 위해서는 고체 기재에 부착되어야 하는, 고정 의존형 세포의 형태(즉, 세포가 단일 층 형태를 이루며 성장하는 경우)로서, 시험관 내 증식될 수 있다. 연속 확립 세포주로부터 유래하는 비고정 의존형 배양액 또는 현탁 배양액은, 세포 및 세포 생산물을 큰 규모로 생산하는데 가장 널리 사용되는 수단이다. 또한, 세포 유형과 증식 형태는 전술한 바와 같은, 다양한 생산시 고려 사항을 바탕으로 선택될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 재조합 시스템 내 발현 이후에 정제된다. 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 일반적으로, 박테리아 숙주 세포 내 생산된 다수의 폴리펩티드는 거의 용해되지 않거나 불용성(봉입체의 형태일 경우)이다. 하나의 구체예에서, 아미노산 치환은 본원에 개시된 방법과 당업계에 공지된 방법을 이용하여 재조합 생산된 폴리펩티드의 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선택된 폴리펩티드 내에서 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 폴리펩티드일 경우, 폴리펩티드는 숙주 세포 용해물로부터 원심 분리 또는 여과에 의해 수집될 수 있으며, 세포를 추가로 균질화할 수도 있다. 가용성이 거의 없는 폴리펩티드의 경우, 화합물 예를 들어, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 첨가하면 부분적으로 가용성인 폴리펩티드를 침전시킬 수 있다. 침전된 폴리펩티드는 이후 원심 분리나 여과에 의해 편리하게 수집될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 다수의 방법에 의해서, 재조합 숙주 세포는 분쇄 또는 균질화되어, 세포 내에서 봉입체를 방출할 수 있다. 숙주 세포 분쇄 또는 균질화는 널리 공지된 기술 예를 들어, 효소 세포 분쇄, 초음파 처리, 다운스 균질화 또는 고압 방출 분쇄 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 개시 및 포함된 방법에 관한 하나의 구체예에서, 고압 방출 기술은 폴리펩티드의 봉입체를 방출시키기 위해 이.콜라이 숙주 세포를 파괴하는데에 사용된다. 폴리펩티드의 봉입체를 다룰 때, 예를 들어, 용해 특성, 기계적 전단성 또는 단백 분해성과 같은 요소로 인하여 손상되지 않은 채로 봉입체의 수율을 최대화하도록, 균질화 반복 시간을 최소화하는 것이 유리하다.
이후 불용성 또는 침전된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다수의 적당한 용해제 중 임의의 것을 이용하여 용해될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여 용해될 수 있다. 용해된 폴리펩티드의 부피는 최소화되어, 관리가 용이한 회분 크기를 갖는 다량의 회분을 생산할 수 있어야 한다. 이러한 요소는 재조합 숙주가 부피 수천 리터인 회분 내에서 생장할 수 있는, 상업용인 거대 규모로 공정 규모를 맞추는데 중요할 수 있다. 뿐만 아니라, 폴리펩티드를 거대 규모의 상업용으로(특히, 인간의 의약용으로) 생산하는 경우, 기계와 용기, 또는 폴리펩티드 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학 물질은 가능한 한 사용하지 말아야 한다. 본원에 개시 및 포함된 방법에 있어서, 폴리펩티드 봉입체를 용해하기 위해서는 강력한 변성제인 구아니딘 하이드로클로라이드 대신에 보다 약한 변성제인 우레아를 사용할 수도 있는 것으로 파악된다. 우레아를 사용하면 폴리펩티드의 제조 및 정제 공정에 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 손상을 줄 위험성이 상당히 줄어 듦과 동시에, 이 폴리펩티드 봉입체도 효율적으로 용해할 수 있다.
가용성 폴리펩티드의 경우, 펩티드는 세포질 주변 공간이나 배양 배지 속으로 분비될 수 있다. 뿐만 아니라, 가용성 펩티드는 숙주 세포의 세포질에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 이전에 가용성 펩티드를 농축할 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 펩티드를 농축시키기 위해서는 본원에 개시된 표준 기술이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에 개시된 표준 기술은 숙주 세포를 파괴하고 이 숙주 세포의 세포질 또는 세포질 주변 공간으로부터 가용성 펩티드를 방출시키는데에 사용될 수 있다.
폴리펩티드가 융합 단백질로서 생산될 때, 상기 융합 서열은 제거되는 것이 바람직하다. 효소적 절단 또는 화학적 절단과 같은 방법에 의해 융합 서열을 제거할 수 있으며, 이때, 효소에 의한 절단이 바람직하다. 융합 서열을 효소적으로 제거하는 것은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 융합 서열을 제거하기 위한 효소의 선택은 융합체의 본질에 의해 결정될 것이며, 반응 조건은 어떠한 효소를 선택하느냐에 따라서 특정될 것이다. 화학적 절단은 시약 예를 들어, 브롬화시아노겐, TEV 단백질 분해 효소 및 기타 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 절단된 폴리펩티드는 널리 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제될 수도 있다. 그러한 방법은 융합 서열 및 폴리펩티드의 본질과 특성에 따라서 결정될 것이다. 정제 방법으로서는 크기별 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography), 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석이나 상기 방법들의 임의의 병행법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리펩티드는 또한 정제되어, 단백질 용액으로부터 DNA를 제거할 수도 있다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법 예를 들어, 침전법 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 하나의 구체예에서, DNA는 핵산 침전제 예를 들어, 황산프로타민을 사용하는 침전법에 의해서도 제거될 수 있다. 폴리펩티드는 널리 공지된 표준적인 방법 예를 들어, 원심 분리 또는 여과에 의해서도 침전된 DNA로부터 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자를 제거하는 것은 폴리펩티드가 인간을 치료하는데 사용되는 경우에 중요한 요소이며, 본원에 개시된 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용 가능한 수준으로 감소시킨다.
소규모 또는 대규모 발효 방법은 또한 단백질 발현시 실행될 수 있는데, 예를 들어, 발효조, 진탕 플라스크, 유동층 생물 반응기, 중공 섬유 생물 반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물 반응기 시스템에서 실행될 수 있다. 이러한 방법들은 각각 회분식, 유가식 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다.
본원에 개시된 인간 비천연 폴리펩티드는 일반적으로 당업계의 표준적인 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물은 원심 분리 또는 여과되어, 이로부터 세포 파편을 제거할 수 있다. 상청액은 원하는 부피로 농축 또는 희석되거나, 또는 적당한 완충액으로 다이아필터링(diafiltering)된 후, 추가 정제를 위해 컨디셔닝(conditioning)될 수도 있다. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정제는 또한, 상응하는 원래 상태의 폴리펩티드로부터 탈아민화 형 및 절단형 폴리펩티드 변이체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
다음과 같은 대표적인 방법들 중 임의의 방법이 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, DEAE 세파로스 사용); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과법(예를 들어, 세파덱스 G-75 사용); 소수성 상호 작용 크로마토그래피; 크기별 배제 크로마토그래피; 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외 여과/다이아필터링; 에탄올 침전법; 황산 암모늄 침전법; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전 초법), 분별 용해도법(예를 들어, 황산 암모늄 침전법), SDS-PAGE 또는 추출, 또는 상기 방법의 임의의 병행법.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 포함되는 폴리펩티드, 예를 들어, 비천연아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 등은 당업자에게 공지되어 당업자에 의해 사용되고 있는 표준적인 방법에 따라서, 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법 예를 들어, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 또는 염기 추출법, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기 영동법 및 상기 방법의 병행법에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 단백질 리폴딩 단계는 원하는 바에 따라서, 올바르게 폴딩된 성숙한 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 기타 적당한 방법은 고순도이어야 하는 마지막 정제 단계에서 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 비천연 아미노산에 대해 생성된 항체(또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드)는 정제 시약 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드의 친화성을 바탕으로 하는 정제 시약으로 사용된다. 원하는 바에 따라서, 일단 부분적으로 또는 균질하게 정제되면, 폴리펩티드는 다양한 용도 예를 들어, 검정용 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구용 시약 및/또는 항체 생산용 면역원으로서 사용되기도 한다.
본원에 인용된 기타 참고 문헌 이외에, 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계에 널리 알려져 있다[예를 들어, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag외 다수 (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; 및 Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌 참조].
진핵 생물 숙주 세포 또는 진핵 생물이 아닌 숙주 세포 내에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생산함에 있어서 한 가지 이점은, 폴리펩티드가 통상적으로 그것이 원래 가졌던 형태로 폴딩될 것이라는 점이다. 그러나, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 관한 임의의 구체예에서, 합성, 발현 및/또는 정제 이후, 폴리펩티드는 관련 폴리펩티드의 원하는 형태와 상이한 형태를 가질 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 관한 하나의 측면에서, 발현된 단백질은 경우에 따라 변성된 후 재변성된다. 이와 같은 변성 및 재변성 과정은 당업계에 공지된 방법 예를 들어, 샤페로닌(chaperonin)을 목적 폴리펩티드에 첨가하는 방법과, 이 폴리펩티드를 카오트로픽 제제(chaotropic agent) 예를 들어, 구아니딘 HCl 중에 용해시켜 단백질 이 황화물 이성체화 효소를 이용하는 방법에 의해 최적화된다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 이 폴리펩티드를 리폴딩시켜 바람직한 형태를 취하게 만드는 것이 때로는 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌이 목적으로 하는 번역 산물에 가하여질 수 있다. 단백질을 환원, 변성 및 재변성하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다[상기 참고 문헌들 및 Debinski외 다수 (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; 및 Buchner외 다수, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270]. 예를 들어, 데빈스키(Debinski) 외 다수의 문헌에는, 구아니딘-DTE 중 봉입체 단백질의 변성 및 환원에 관하여 기술되어 있다. 단백질은 예를 들어, 산화 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 산화 환원 완충액 중에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 흘러 들어가거나 또는 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 기타 발현 산물과 접촉할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드의 원핵 생물 내 생산의 경우, 생산된 폴리펩티드는 미스 폴딩되어 생물학적 활성이 결여 또는 감소할 수도 있다. 단백질의 생물학적 활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 하나의 구체예에서, 미스 폴딩된 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 카오트로픽 제제(예를 들어, 우레아 및/또는 구아니딘)과, 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캡토에탄올, 2-ME)를 이용하여, 폴리펩티드 사슬을 용해(폴리펩티드가 불용성인 경우), 언폴딩 및 환원시켜 리폴딩될 수 있다. 카오트로프의 농도가 적당할 때, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하면, 이황화 결합이 재형성될 수 있다. 언폴딩 또는 미스폴딩된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준적인 방법 예를 들어, 미국 특허 제4,511,502호, 동 제4,511,503호 및 동 제4,512,922호(각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시된 방법을 이용하여 리폴딩될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 다른 단백질과 코폴딩(cofolding)되어 이종 이량체 또는 이종 다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩 후, 폴리펩티드는 추가로 정제될 수도 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 개시된 다양한 기술 예를 들어, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들 기술 중 임의의 기술을 조합 사용하여 정제할 수 있다. 추가의 정제 과정은 정제된 단백질을 건조 또는 침전시키는 단계를 포함할 수도 있다.
정제 이후, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법 예를 들어, 다이아필터링 및 투석에 의해, 상이한 완충액으로 교환되고/교환되거나, 농축될 수 있다. 단일의 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집 및 침전될 수 있다. 임의의 구체예에서, 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 순도가 90% 이상[역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC, 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, SDS-PAGE로 측정]일 수 있다. 임의의 기타 ㄱc체예에서, 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 순도가 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도에 관한 정확한 수치와는 상관없이, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약품으로서 사용되기에 충분한 순도를 가지거나, 또는 추가의 공정 예를 들어, 수용성 중합체 예를 들어, PEG와의 접합와 같은 공정을 수행하기에 충분히 순수할 수 있다.
임의의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 기타 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 안정화제 및 혈청 알부민 등 이외)의 부재 하에 치료제로서 사용될 수 있으며, 임의의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 복합체를 형성할 수 있다.
2. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정제
일반적인 정제 방법
본 섹션에 개시된 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 일반적인 정제 과정에 적용될 수 있다.
다양한 분리 단계들 중 임의의 단계는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 팽창층 흡착(expanded bed adsorption), 또는 이들 방법의 임의의 병행법 및/또는 이들 방법을 (임의의 적당한 순서로) 반복 수행하여 얻어진, 임의의 폴리펩티드 혼합물을 이용하여 수행될 수 있거나, 또는 원하는 폴리펩티드를 포함하는, 세포 용해물, 추출물, 배양 배지, 봉입체, 숙주 세포의 세포질 주변 공간, 숙주 세포의 세포질 또는 기타 물질을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에 개시된 기술을 수행하는데에 사용되는 장치 및 기타 필요한 물질들은 시판중에 있다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록계 및 전체 시스템은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems; Foster City, CA), 바이오-래드 래보레토리즈 인코포레이션(Bio-Rad Laboratories, Inc.; Hercules, CA) 및 애머샴 바이오사이언시스 인코포레이션(Amersham Biosciences, Inc.; Piscataway, NJ)로부터 구입할 수 있다. 크로마토그래피에 사용되는 재료 예를 들어, 교환 매트릭스 재료, 배지 및 완충액도 상기 회사들로부터 구입할 수 있다.
본원에 기술된 컬럼 크로마토그래피 방법 중 평형 처리 단계 및 기타 단계 예를 들어, 세척 및 용리 단계는 특화된 장치 예를 들어, 펌프를 이용하여 보다 신속하게 진행될 수 있다. 시판중인 펌프로서는 하이로드(HILOAD)® 펌프 P-50, 정량 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901 및 펌프 P-903(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
분획 수집기의 예로서는 레디프랙(RediFrac) 분획 수집기, FRAC-100 및 FRAC-200 분획 수집기와 슈퍼프랙(SUPERFRAC)® 분획 수집기(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함한다. 혼합기는 또한 pH 및 선형 농도 구배를 형성하는데 사용될 수도 있다. 시판중인 혼합기로서는 구배 혼합기(Gradient Mixer) GM-1과 인-라인 혼합기(In-Line Mixers; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함한다.
크로마토그래피 과정은 임의의 시판 모니터로 모니터링될 수 있다. 이러한 모니터는 UV, 형광도, pH 및 전도율과 같은 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로서는 모니터 UV-1, 유비코드(UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 전도율 모니터(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함한다. 실제로, 전체 시스템 예를 들어, 다양한 AKTA® 시스템(Amersham Biosciences; Piscataway, NJ)이 시판중에 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 관한 하나의 구체예에서, 예를 들어, 폴리펩티드는, 우선 우레아 중에서 결과로 정제된 폴리펩티드를 변성시킨 후, 적당한 pH의 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 TRIS 완충액 중으로 희석시킴으로써 환원 및 변성될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 농도 약 2∼약 9 M의 우레아 중에서 변성된 후, pH 약 5.0∼약 8.0인 TRIS 완충액 중에서 희석될 수 있다. 본 구체예의 리폴딩 혼합물은 이후 항온 처리된다. 하나의 구체예에서, 이 리폴딩 혼합물은 실온에서 4∼24 시간 동안 항온 처리된다. 환원 및 변성된 폴리펩티드 혼합물은 이후 추가로 분리 또는 정제될 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, 제1 폴리펩티드 혼합물의 pH는 임의의 후속 분리 단계를 수행하기 이전에 조정할 수 있다. 뿐만 아니라, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 농축될 수 있다. 뿐만 아니라, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충액은 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 그 다음 분리 단계에 사용하기에 적당한 완충액으로 교환될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
본 섹션에 개시된 기술은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 이온-크로마토그래피에 적용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 그리고 임의의 부가 단계에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 제1 폴리펩티드 혼합물에 대해서 수행될 수 있다. 일반적으로, 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)]을 참조하시오. 시판중인 이온 교환 컬럼으로서는 하이트랩(HITRAP)®, 하이프렙(HIPREP)® 및 하이로드(HILOAD)® 컬럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강력한 음이온 교환 수지 예를 들어, Q 세파로스® 패스트 플로우(Q SEPHAROSE® Fast Flow), Q 세파로스® 하이 퍼포먼스(Q SEPHAROSE® High Performance) 및 Q 세파로스® XL(Q SEPHAROSE® XL); 강력한 양이온 교환 수지 예를 들어, SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스® 패스트 플로우 및 SP 세파로스® XL; 약한 음이온 교환 수지 예를 들어, DEAE 세파로스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환 수지 예를 들어, CM 세파로스® 패스트 플로우(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 사용한다. 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 정제 과정 중 임의의 단계에서 폴리펩티드에 대해 수행하여, 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 분리해 낼 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적당한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스로서는 섬유 상, 다공성, 비-다공성, 미소 과립형, 비드 형 또는 가교 양이온 교환 매트릭스 재료를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 재료로서는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르 또는 이들 재료 중 임의의 것의 복합 재료를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 양이온 교환 수지 매트릭스에 폴리펩티드를 흡착한 이후에, 실질적으로 정제된 폴리펩티드가 용리될 수 있는데, 이때에는 매트릭스로부터 폴리펩티드를 치환하기에 충분히 높은 pH 또는 이온 세기를 갖는 완충액과 매트릭스를 접촉시킨다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 고 pH 용리에 사용하기에 적당한 완충액으로서는, 시트르산염, 인산염, 포름산염, 아세트산염, HEPES 및 MES 완충액(농도 = 약 5∼약 100 mM 이상)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
역상 크로마토그래피
본 섹션에 개시된 기술들은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 역상 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
RP-HPLC를 수행하여 당업자에게 공지된 적당한 절차에 따라서 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson외 다수, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier외 다수, J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani외 다수, J. CHROM. (1986) 359:391-402]을 참조하시오. RP-HPLC를 폴리펩티드에 대하여 수행할 수 있으며, 그 결과 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 이러한 관점에서, 다양한 길이를 갖는(예를 들어, 약 C3∼약 C30 이상, 약 C3∼약 C20 이상, 또는 약 C3∼약 C18 이상) 알킬 작용기를 보유하는 실리카 유도체화 수지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 앰버크롬 CG1000sd 수지(TosoHaas Amberchrome CG1OOOsd resin)가 사용될 수 있다. 알킬 사슬 길이가 다양한 시아노 또는 중합체 수지도 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 RP-HPLC 컬럼은 용매 예를 들어, 에탄올로 세척할 수 있다. 이온 쌍 형성 제제(ion pairing agent)와 유기 개질제 예를 들어, 메탄올, 이소프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적당한 용리 완충액을 RP-HPLC 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용리하는데 사용할 수도 있다. 가장 일반적으로 사용되는 이온 쌍 형성 제제로서는 아세트산, 포름산, 과 염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄 및 아세트산트리에틸암모늄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 용리는 하나 이상의 구배 조건 또는 등 조건[분리 시간과 피크 폭을 줄이는데에 바람직한 구배 조건] 하에서 수행될 수 있다. 다른 방법은 상이한 용매 농도를 통하여 2가지 농도 구배를 걸어주어 수행된다. 본원에 사용하기에 적당한 용리 완충액의 예로서는 아세트산 암모늄 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피 정제 기술
본 섹션에 개시된 기술들은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 소수성 상호 작용 크로마토그래피 정제 기술에 적용될 수 있다.
폴리펩티드에 대해서 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)를 수행할 수 있다. 일반적으로, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)]을 참조하시오. 적당한 HIC 매트릭스로서는 알킬- 또는 아릴 치환 매트릭스 예를 들어, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐 치환 매트릭스 예를 들어, 아가로스, 가교 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스 및 혼합된 형태의 수지 예를 들어, 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐 치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시판중인 소수성 상호 작용 컬럼 크로마토그래피로서는 하이트랩®, 하이프렙® 및 하이로드® 컬럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 간단히 요약하면, 로딩하기 이전에, HIC 컬럼을 당업자에게 공지된 표준 완충액 예를 들어, 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄 함유 HEPES로 평형 처리할 수 있다. 황산암모늄은 HIC 컬럼을 로딩시키기 위한 완충액으로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 상기 조건하에서 표준적인 완충액을 사용하여 이 컬럼을 세척함으로써, 원치 않는 물질은 제거하되 HIC 컬럼상에 폴리펩티드는 체류시킬 수 있다. 폴리펩티드는 약 3∼약 10 컬럼 부피의 표준 완충액 예를 들어, EDTA와 평형 처리 완충액보다 낮은 농도의 황산 암모늄을 함유하는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액과 함께 용리될 수 있다. 예를 들어, 인산칼륨 염의 구배를 점차 줄여가면서 폴리펩티드 분자를 용리할 수도 있다. 이후, 용리액을 예를 들어, 여과법 예를 들어, 다이아필터링 또는 한외 여과법에 의해 농축할 수 있다. 다이아필터링을 이용하여 폴리펩티드를 용리시키는데 사용된 염을 제거할 수 있다.
기타 정제 기술
본 섹션에 개시된 기술들은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 기타 정제 기술에 적용될 수 있다.
또 다른 분리 기술 예를 들어, 겔 여과법(GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피[적당한 매트릭스로서는 HA-울트로겔(HA-Ultrogel), 하이 레솔루션(High Resolution; Calbiochem), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT Ceramic Hydroxyapatite; BioRad), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(Bio-Gel HTP Hydroxyapatite; BioRad)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님], HPLC, 팽창 층 흡착법, 한외 여과법, 다이아필터링 및 동결 건조법 등을 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 후속 혼합물에 대해 수행하여 과량의 염을 제거하고, 다음 분리 단계 또는 최종 약품의 제형화에 적당한 완충액을 상기 완충액과 교체할 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 포함하여 폴리펩티드의 수율은 당업자에게 공지된 다양한 기술들을 이용하여 본원에 기술된 각 단계에서 모니터될 수 있다. 이러한 기술은 또한 마지막 분리 단계를 수행한 이후에 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 수율을 평가하는데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 수율은 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼 예를 들어, 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC; 그리고 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 것을 사용하여 모니터될 수 있다.
친화성 정제 기술에서는 비천연 아미노산 폴리펩티드 제제를 정제하거나 또는 이의 순도를 높이기 위해 친화성 정제 기술을 사용할 수도 있다. 친화성 정제법에서는 정제의 특이성을 높이기 위해 항체, 수용체, 렉틴 및/또는 기타 분자를 이용한다. 단백질 제제는 표적 단백질에 특이적인 항체 또는 분자, 또는 이 표적 단백질 상 또는 내부에서 발견되는 에피토프를 함유하는 매트릭스를 통과하고, 이후, 잔류하던 표적 단백질은 용리되어, 고도로 정제된 단백질 제제가 회수된다. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생산용인 발현 구조물은 또한 친화성 태그 예를 들어, myc 에피토프, GST 융합체, 또는 His 태그 및 친화성 정제된 상응 myc 항체, 글루타티온 수지, 또는 Ni-수지를 부가하도록 조작될 수도 있다. 개시된 항체, 리간드 및 친화성 태그를 사용하는 것은 예시적인 것으로서, 비천연 아미노산 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 친화성 정제 방법의 선택을 제한하지 않는다. 다양한 친화성 분자 및 매트릭스(즉, 컬럼, 비드 및 슬러리 등)가 사용될 수 있으며, 이에 관하여는 당업계에 널리 공지되어 있다.
순도는 표준 기술 예를 들어, SDS-PAGE를 사용하거나, 또는 웨스턴 블럿 및 ELISA 검정법을 사용하여 폴리펩티드를 분석함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 네거티브 대조군 효모 발효액 및 양이온 교환 회수물로부터 분리된 단백질에 대하여 생성될 수 있다. 항체는 또한 오염 숙주 세포 단백질의 존부에 대한 프로브로서도 사용될 수 있다.
임의의 구체예에서, 각 정제 단계 이후의 폴리펩티드 수율은, 각 정제 단계에 사용되는 출발 물질 중 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 이상, 약 99.9% 이상, 또는 약 99.99% 이상의 폴리펩티드일 수 있다.
RP-HPLC 물질인 Vydac C4 (Vydac)은 표면에 C4-알킬 사슬을 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질성 불순물로부터 폴리펩티드를 분리하는 방법은 소수성 상호 작용 세기의 차이를 바탕으로 한다. 용리는 희석된 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 걸어주어 수행된다. 예비 HPLC는 스테인리스 스틸 컬럼[약 2.8∼약 3.2 리터의 Vydac C4 실리카겔로 충진]을 이용하여 수행된다. 상기 하이드록시아파타이트 울트로겔 용리물은 이것에 트리플루오로아세트산을 첨가하여 산성화시킨 후에 Vydac C4 컬럼 상에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해서, 희석된 트리플루오로아세트산 중에 아세토니트릴 구배를 걸어준다. 분획을 수집하고, 그 즉시 인산염 완충액으로 중화시킨다. IPC 한계 내에 있는 폴리펩티드 분획을 모은다.
DEAE 세파로스(Pharmacia) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유 결합되어 있는 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. 폴리펩티드를 DEAE 기에 결합시키는 과정은 이온 상호 작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 체류하지 않고 컬럼을 통과한다. 이 물질들이 씻겨져 나간 후, 낮은 pH의 아세테이트 완충액으로 컬럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 이후, 상기 컬럼을 중성의 인산염 완충액으로 세척하고, 폴리펩티드는 이온 세기를 점점 높여가면서 완충액과 함께 용리 시킨다. 이때, 컬럼은 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 충진시킨다. 컬럼 부피는 폴리펩티드 로딩량이 약 3∼약 10㎎ 폴리펩티드/㎖ 겔이 되도록 맞춘다. 컬럼을 물과 평형 완충액(인산 나트륨/인산 칼륨)으로 세척한다. 모아진 HPLC 용리 분획을 로딩하고, 이 컬럼을 평형 완충액으로 세척한다. 이후 상기 컬럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)으로 세척한 후 다시 평형 완충액으로 세척한다. 마지막으로, 폴리펩티드가 용리 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/인산 칼륨)과 함께 이 컬럼으로부터 용리되어 나오면, 주 용리 프로필(master elution profile)에 따라서 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용리액을 비 전도율(specified conductivity)이 되도록 조정한다. 생성된 약물을 테플론 병으로 멸균 여과하고, 이를 -70℃에 보관한다.
다양한 방법 및 절차 예를 들어, SDS-PAGE와 단백질 염색법의 병행법, 면역 블럿팅, 질량 분광 분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광 분석법(matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry; MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석법, 등전 초법, 분석용 음이온 교환법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성(circular dichroism) 분석을 사용하여, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 수율 및 순도를 평가할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 특성 규명하는 방법과 절차로서는, 브래드포드 검정법(Bradford assay), SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마쉬 염색 SDS-PAGE를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가의 방법들은, 예를 들어, 내독소를 제거하는 단계를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 내독소는 그램 음성 숙주 세포 예를 들어, 에스테리챠 콜라이의 외부 막에 존재하는 지질 다당류(LPS)이다. 내독소의 수준을 감소시키는 방법으로서는, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 사용하는 정제 기술과, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 이들 방법의 병행법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형법 또는 부가적 방법은, 오염 물질 예를 들어, 함께 이동한 단백질을, 목적으로 하는 폴리펩티드로부터 제거하는데 필요할 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법에 관하여는 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 리물러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 검정법이 있다.
임의의 구체예에서, 화학식 I∼화학식 LXVII의 아미노산 예를 들어, 이 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 임의의 종속 화합물 또는 특정 화합물은 폴리펩티드에 생합성에 의해 통합될 수 있으며, 이로써, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 다른 구체예에서, 이와 같은 아미노산은 폴리펩티드 내 특정 위치에 통합된다. 다른 구체예에서, 이와 같은 아미노산은 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 통합된다. 기타 구체예에서, 이러한 번역 시스템은, (i) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 아미노산의 예정된 통합 위치에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, (ii) 아미노산을 포함하는 tRNA로서, 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이와 같은 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 이 번역 시스템에서 생산된 mRNA이다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 이 번역 시스템은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 파지를 포함한다. 이와 같은 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 번역 시스템은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA에 안정하게 통합된다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 번역 시스템은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템에 관한 기타 구체예에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 이러한 번역 시스템에 관한 기타 구체예에서, 번역 시스템은 상기와 같이 아미노산으로 아미노아실화되는 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 번역 시스템은 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성 효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 직교 tRNA와 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 리보좀에 의해 합성되며, 추가의 구체예에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진핵 생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 생체 내 번역 시스템이다. 다른 구체예에서, 세포는 에스케리챠 콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종으로부터 유래하는 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 이러한 번역 시스템에 관한 다른 구체예에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 또는 진핵 생물 세포로부터 유래하는 세포 추출물을 포함하는 시험관 내 번역 시스템이다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 에스케리챠 콜라이 세포, 슈도모나스 종으로부터 유래하는 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 적어도 일부는 고상 또는 용액상 펩티드 합성법에 의하거나 이들 방법을 병행하여 합성되지만, 다른 구체예에서는, 합성시 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 결찰하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 화학식 I∼화학식 LXVII의 아미노산 예를 들어, 이 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 임의의 종속 화합물 또는 특정 화합물은 폴리펩티드에 생합성에 의해 통합될 수 있으며, 여기서, 상기 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동성인 단백질이다.
B. 생체 내 번역 후 변형
하나 이상의 비천연 아미노산을 보유하는 목적 폴리펩티드를 진핵 생물 세포 내에서 생산함으로써, 이러한 폴리펩티드는 진핵 생물의 번역 후 변형을 포함할 수도 있다. 임의의 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산과, 진핵 생물 세포에 의하여 생체 내에서 가하여진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 상기 번역 후 변형은 원핵 생물 세포에 의해서는 가하여지지 않는 것이다. 상기 번역 후 변형의 예로서는 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미트산염 부가, 인산화, 당 지질-결합 변형 및 글리코실화 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 아스파라긴에 올리고당[예를 들어, (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc]이 결합하는 것을 포함한다. 진핵 생물 단백질의 N-결합 올리고당의 몇몇 예가 나열되어 있는 표 1을 참조하시오[부가 잔기도 존재할 수 있으나, 별도로 표시하지는 않음]. 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 결합 또는 GalNAc-트레오닌 결합, GlcNAc-세린 결합 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 세린이나 트레오닌에 올리고당[예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등]을 결합시키는 것을 포함한다.
표 1: GlcNAc-결합을 통한 올리고당의 예
Figure 112008047567393-PCT00109
또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(예를 들어, 칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 프리프로 부갑상선 호르몬, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 프리프로-오피오멜라노코르틴 및 프로-오피오멜라노코르틴 등)의 단백 분해 가공, 다중 서브 유닛 단백질로의 조립 또는 거대 분자로의 조립, 세포 내 다른 위치에서의 번역[예를 들어, 기관 예를 들어, 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등에서의 번역, 또는 분비 경로를 통한 번역]을 포함한다. 임의의 구체예에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그 또는 GST 융합체 등을 포함한다.
비천연 아미노산의 한 가지 이점은, 그것이 부가적 분자를 첨가하는데 사용될 수 있는 부가의 화학부를 제공한다는 점이다. 이와 같은 변형은 진핵 생물 세포 또는 진핵 생물이 아닌 세포에서와 같이 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통하여 이루어진다. 예를 들어, 번역 후 변형은 친핵-친전자 반응을 통하여 이루어질 수 있다. 현재 단백질을 선택적으로 변형시키는데 사용되는 대부분의 반응들은, 친핵 반응 파트너와 친전자 반응 파트너 사이에 공유 결합을 형성하는 것[예를 들어, α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응]을 포함한다. 이러한 경우 선택성은 단백질 내에 존재하는 친핵성 잔기의 수와 접근 가능성에 의해 결정된다. 당업계에 개시되었거나 또는 본원에 개시된 방법에 의하여 생산된 폴리펩티드에 있어서, 보다 선택적인 기타 반응 예를 들어, 비천연 디카보닐 아미노산과 디아민의 시험관 내 및 생체 내 반응이 사용될 수 있다. 예시적인 구체예에 관하여는 다음과 같은 문헌에서 살펴볼 수 있다[Cornish외 다수, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal외 다수, (1997) Science, 276:1125-1128; Wang외 다수, (2001) Science 292:498-500; Chin외 다수, (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin외 다수, (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024; Wang외 다수, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100:56-61; Zhang외 다수, (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; 및 Chin외 다수, (2003) Science. 300:964-7]을 참조하시오. 이로써, 임의의 단백질을 일군의 시약 예를 들어, 형광단, 가교제, 당 유도체 및 세포 독성 분자로써 선택적으로 표지화할 수 있다. 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "Glycoprotein Synthesis"; 2003년 1월 16일 출원)도 참조하시오. 예를 들어, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형은 또한 스타우딩거(Staudinger) 결찰법(예를 들어, 트리아릴포스핀 시약 이용)을 통해서도 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kiick외 다수, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99(1):19-24]을 참조하시오.
IX. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위한 대안적 시스템
몇몇 기술을 사용하여 비천연 아미노산을 비-재조합 숙주 세포, 돌연변이 숙주 세포 또는 무 세포 시스템 내에 존재하는 단백질로 도입할 수 있다. 본 섹션에 개시된 대안적 시스템은 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산을 반응성 측쇄 예를 들어, Lys, Cys 및 Tyr로 유도체화하면, 리신이 N2-아세틸-리신으로 전환되었다. 화학적 합성법도 비천연 아미노산을 통합시키는 직접적인 방법을 제공한다. 최근, 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 원래의 화학적 결찰 방법을 개발함에 따라서, 더욱 큰 단백질을 만들 수 있게 되었다. 예를 들어, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000)]을 참조하시오. 화학적 펩티드 결찰법 및 원래의 화학적 결찰법에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용된 미국 특허 제6,184,344호, 미국 특허 공보 2004/0138412, 미국 특허 공보 2003/0208046, WO 02/098902 및 WO 03/042235에 기술되어 있다. 원하는 비천연 아미노산과 화학적으로 아실화된 서프레서 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가하는 일반적인 시험관 내 생합성법은, 실질적으로 여러가지 크기를 갖는 다양한 단백질에 100개 이상의 비천연 아미노산을 위치 특이적으로 통합시키는데에 사용된다. 예를 들어, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 1995, 34:621-633 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); 및 J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989)]을 참조하시오. 광범위한 작용기가 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기작 및 신호 전달에 관한 연구를 위해 도입되었다.
야생형 합성 효소의 혼잡 작용(promiscuity)을 연구하기 위해 생체 내 방법(선택 압 통합법; selective pressure incorporation)이 개발되었다. 예를 들어, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999)]을 참조하시오. 영양 요구성 균주 즉, 세포에게 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 스위치-오프(switch-off)된 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지 중에서 생장하는 반면에, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 생장 단계 중 정상기가 시작되면, 천연 아미노산은 고갈되어 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현을 유도시키면, 비천연 유사체를 함유하는 단백질이 축적된다. 예를 들어, 이러한 기법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌을 단백질에 통합시켰을 때, 쉽게 확인될 수 있는 2개의 특징적인 쇼울더 부(shoulder)가 UV 스펙트럼 대역에 나타나고[예를 들어, C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)]; 트리플루오로메티오닌은 박테리오파지 T4 리소자임 중 메티오닌을 대신해서 사용되며, 그 결과 트리플루오로메티오닌과 키토올리고당 리간드의 상호 작용을 19F NMR에 의해 분석할 수 있으며[예를 들어, H. Duewel, E.Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404-3416 (1997)]; 트리플루오로루신은 루신 대신에 통합되어, 루신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학 안정성이 증가하게 되는 것이다. 예를 들어, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40(8):1494-1496 (2001)]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 셀레노메티오닌과 텔루로메티오닌은 다양한 재조합 단백질에 통합되어, X-선 결정 분석에 있어서 상 분석을 용이하게 만들어 준다. 예를 들어, 문헌[W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9(5):1665-1672 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283-284 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788-796 (1995); 및 N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616-623(1997)]을 참조하시오. 알켄 또는 알킨 작용기를 보유하는 메티오닌 유사체도 효과적으로 통합되어, 화학적 수단에 의해 단백질을 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68-70 (1998); J. C. vanHest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000); 및 K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487-9493 (2000); 미국 특허 제6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)]을 참조하시오.
본 방법의 성공 여부는, 일반적으로 단백질 번역의 신뢰도를 보장하기 위해서는 고도의 선택성을 필요로 하는 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 비천연 아미노산 유사체가 인지되는지 여부에 달려있다. 본 방법의 범위를 확대하기 위한 한 가지 방편은 아미노아실-tRNA 합성 효소의 기질 특이성을 완화시키는 것으로서, 이는 제한된 수의 경우에 이루어지고 있다. 예를 들어, 에스케리챠 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성 효소(PheRS) 내에서 Ala294를 Gly로 치환시키면, 기질 결합 포켓의 크기가 늘어나게 되는데, 그 결과 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe이 아실화된다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107-7112 (1994)]을 참조하시오. 이러한 돌연변이 PheRS를 보유하는 에스케리챠 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 통합할 수 있다. 예를 들어, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272-275 (1995); 및 N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37-40 (2000)]을 참조하시오. 이와 유사하게, 에스케리챠 콜라이의 티로실-tRNA 합성 효소의 아미노산 결합 위치에 인접하여 일어난 점 돌연변이 Phe130Ser은 아자티로신이 티로신보다 더 효율적으로 통합될 수 있도록 만들어 주는 것으로 파악된다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275(51):40324-40328 (2000)]을 참조하시오.
비천연 아미노산을 단백질에 생체 내 통합하는 다른 기법은 교정 기작(proofreading mechanism)을 갖는 합성 효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성 효소는 동계열 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 구별할 수 없으므로 이를 활성화할 수도 없다. 이러한 오류는 별도의 위치에서 교정되는데, 즉, tRNA로부터 잘못 운반된 아미노산을 탈 아실화하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지하게 되는 것이다. 만일, 합성 효소의 교정 작용이 불능하게 되면, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 편집 작용(edit function)을 피해서 통합될 수 있다. 최근, 발릴-tRNA 합성 효소(ValRS)를 이용하여 이러한 연구 결과를 입증한 바 있다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501-504 (2001)]을 참조하시오. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 가지는 tRNAVal을 잘못 아실화할 수 있으며; 이후 이러한 비-동계열 아미노산은 편집 도메인에 의해 가수 분해된다. 에스케리챠 콜라이 염색체의 랜덤한 돌연변이 유발법 수행 후, ValRS의 편집 위치에 돌연변이가 일어난 돌연변이 에스케리챠 콜라이 균주가 선택되었다. 이와 같은 편집 기능-결여 ValRS는 tRNAVal이 Cys을 잘못 운반하게 만든다. Abu는 입체적으로 Cys과 유사하기 때문에[Cys의 -SH기가 -CH3로 치환된 것이 Abu임], 돌연변이 에스케리챠 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에 생육할 때 돌연변이 ValRS는 또한 Abu를 단백질에 통합시킨다. 질량 스펙트럼 분석 결과, 발린의 약 24%가 원래 단백질 내 각각의 발린 위치에서 Abu에 의해 치환됨을 알 수 있다.
고상 합성법 및 반합성법도 또한 신규 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 문헌 및 이에 인용된 참고 문헌을 참조하시오: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192(4809):1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22(2):47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T., Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc. 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256, 221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng. 1(3):151-157 (1987); 및 Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266, 243-247 (1994).
화학적 변형법이 다양한 비천연 측쇄 예를 들어, 보조 인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서 단백질에 도입하는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science. 238 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Ann. Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226:505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc. 88(13):3153-3154 (1966); 및 Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 1(242):1038-1040 (1988)]을 참조하시오.
대안적으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성법은 시험관 내에서 합성된 단백질에 몇몇 생물 물리학적 프로브를 통합시키는데 사용되었다. 다음의 문헌들 및 이에 인용된 참고 문헌들을 참조하시오: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem. 483-514 (1993); 및 Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 8604-8608 (1986).
화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 포함하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써, 비천연 아미노산은 시험관 내에서 단백질에 위치 특이적으로 통합될 수 있다는 사실에 대해서는 이미 규명된 바 있다. 이러한 연구법을 활용하여, 다수의 일반적인 20개의 아미노산과 구조적으로 유사한 상동체 예를 들어, 페닐알라닌과 플루오로페닐알라닌을, 특정 아미노산에 대한 영양 요구 균주를 이용하여 치환할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak외 다수, Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa외 다수, FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site- specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); 및 Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조하시오.
예를 들어, 종결 코돈인 UAG를 인지하는 서프레서 tRNA가 제조되었으며, 이 서프레서 tRNA는 비천연 아미노산으로써 화학적으로 아미노아실화되었다. 통상적인 위치 지정 돌연변이 유발법은 단백질 유전자 내에 존재하는 목적 위치에 종결 코돈인 TAG를 도입시키는데에 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3): 791-802 (1988)]을 참조하시오. 아실화된 서프레서 tRNA와 돌연변이 유전자가 시험관 내 전사/번역 시스템에 통합되었을 때, 비천연 아미노산은 특정 위치에 특정 아미노산을 함유하는 단백질을 형성시키는 UAG 코돈에 따라서 통합되었다. [3H]-Phe을 이용하는 실험 및 α-하이드록시산을 이용하는 실험을 통하여, 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정되는 위치에 통합되며, 이러한 아미노산은 단백질 내 어느 위치에도 통합되지 않는다는 사실이 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Noren외 다수, 상동; Kobayashi외 다수, (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; 및 Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255:197-200 (1992)]을 참조하시오.
미세 주입 기술로도 비천연 아미노산을 단백질에 통합시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N.Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science. 268:439-442 (1995); 및 D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000)]을 참조하시오. 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus) 난모 세포에 시험관 내에서 생산된 2 종류의 RNA를 공동 주입하였다: 즉, 목적 아미노산 위치에 UAG 종결 코돈을 포함하는 표적 단백질 암호화 mRNA와, 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 서프레서 tRNA. 이후 난모 세포의 번역 기작은 UAG로 특정되는 위치에 비천연 아미노산을 삽입한다. 이러한 방법은 일반적으로 시험관 내 발현 시스템에는 맞지 않는 총체적인 막 단백질에 관한 생체 내 구조-기능 연구를 가능하게 하였다. 그 예로서는, 형광 아미노산을 타키키닌 뉴로키닌-2 수용체에 통합시켜 형광 공명 에너지 전이에 의해 거리를 측정하는 방법[예를 들어, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271(33):19991-19998 (1996)]; 바이오틴화된 아미노산을 통합하여 이온 통로 내 표면-노출 잔기를 동정하는 방법[예를 들어, J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4(10):739-749 (1997)]; 케이지화된 티로신 유사체를 사용하여 실시간 이온 통로의 형태 변화를 관찰하는 방법[예를 들어, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619-624 (1998)]; 그리고, 알파 하이드록시 아미노산을 사용하여 이온 통로 골격을 이의 관문 기작(gating mechanisms)을 찾아내기 위한 형태로 바꾸는 방법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89-98 (1999); 및 T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4(3):239-246 (2001)]을 참조하시오.
생체 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 직접 통합시키는 능력은 다양한 이점 예를 들어, 돌연변이 단백질을 고수율로 얻을 수 있는 이점, 기술적 용이함, 세포 또는 살아있는 유기체 내에서도 돌연변이 단백질에 관하여 연구할 수 있는 가능성을 열어주었다는 점과, 이러한 돌연변이 단백질을 치료용 처치 수단으로 사용할 수 있다는 점 등을 제공한다. 다양한 크기, 산성도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성들을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시키는 능력은, 단백질 기능을 프로빙하고 새로운 특성을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생산하기 위해, 단백질의 구조를 합리적이고 체계적으로 조작할 수 있는 가능성을 매우 넓혀줄 수 있다.
파라-F-Phe, 효모 앰버 서프레서 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성 효소 쌍을 위치 특이적으로 통합하고자 하는 시도는, p-F-Phe 내성, Phe 영양 요구성 에스케리챠 콜라이 균주 내에서 행하여지고 있다. 예를 들어, 문헌[R. Furter, Protein Sci., 7:419-426 (1998)]을 참조하시오.
뿐만 아니라, 무 세포(시험관 내) 번역 시스템을 이용하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수도 있다. 번역 시스템은 세포 또는 무 세포 시스템일 수 있으며, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 것일 수도 있다. 세포 번역 시스템로서는 전 세포 제조물 예를 들어, 투과 처리된 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서, 원하는 핵산 서열은 mRNA 또는 번역된 mRNA로 전사될 수 있다. 무 세포 번역 시스템은 시판중에 있으며, 상이한 종류의 다수의 시스템들은 널리 공지되어 있다. 무 세포 시스템의 예로서는 원핵 생물의 용해물 예를 들어, 에스케리챠 콜라이 용해물 및 진핵 생물의 용해물 예를 들어, 맥아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상 적혈구 용해물, 토끼 난모 세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대부분의 변형은 진핵 생물 시스템에서만 일어날 수 있기 때문에, 진핵 생물 추출물 또는 용해물은 결과로 생성되는 단백질이 글리코실화, 인산화 또는 변형될 때 바람직할 수 있다. 이러한 추출물 및 용해물 중 일부는 시판중에 있다[Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, Ill.; GIBCO/BRL; Grand Island, N. Y.]. 분비형 단백질을 번역하는데 유용한 막상 추출물 예를 들어, 마이크로좀 막을 함유하는 개의 췌장 추출물도 입수할 수 있다. 주형으로서 mRNA(시험관 내 번역) 또는 DNA(시험관 내 전사 및 번역의 혼합형)를 포함할 수 있는 이와 같은 시스템에서, 시험관 내 합성법은 리보좀에 의해 유도된다. 무 세포 단백질 발현 시스템의 개발에 상당한 노력이 가하여지고 있다. 예를 들어, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74(4) :309-316 (2001); Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66(3): 180-188, (1999); 및 Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24(5): 862-868, (1998); 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허 공보 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785]을 참조하시오. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 다른 방법으로서는 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel외 다수, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003)]을 참조하시오. 이 연구법에서, 퓨로마이신에 결합된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형되면, 비천연 아미노산은 또한 펩티드에도 통합될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 해독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획하게 된다. 만일 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관 내 검정법에서 흥미로운 특성을 갖는 것으로 파악되면, 이의 본질은 mRNA 서열로부터 용이하게 규명될 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 동정하기 위해 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 보다 최근에는, 정제된 성분을 이용하는 시험관 내 리보좀 번역을 통하여 비천연 아미노산으로 치환된 펩티드를 합성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌[A. Forster외 다수, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100(11):6353-6357 (2003)]을 참조하시오.
재구성된 번역 시스템이 사용될 수도 있다. 또한 정제된 번역 인자 혼합물뿐만 아니라, 용해물의 혼합물 또는 정제된 번역 인자 예를 들어, 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3, 연장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자가 보충된 용해물도 mRNA를 단백질로 성공적으로 번역시키는 데에 사용될 수 있다. 무 세포 시스템은 또한 전사/번역 시스템과 커플링될 수 있는데, 이때 DNA는 이 시스템에 도입되어 mRNA 및 번역된 mRNA로 전사된다[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel외 다수 editors, Wiley Interscience, 1993); 본원에 구체적으로 참고용으로 인용됨]. 진핵 생물 전사 시스템 내에서 전사된 RNA는 이종 핵 내 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리부를 보유하는 성숙한 mRNA의 형태일 수 있는데, 이는 임의의 번역 시스템에서는 이점으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상 적혈구 용해 시스템 내에서 고효율로 번역된다.
tRNA는 임의의 방법 또는 기술 예를 들어, 화학적 아미노아실화 또는 효소적 아미노아실화에 의하여, 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.
아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성 효소 또는 기타 효소 분자 예를 들어, 리보자임에 의해 이루어질 수 있다. "리보자임"이란 용어는 "촉매 RNA"라는 용어와 호환된다. 세크(Cech)와 동료들[Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle외 다수, 1987, Concepts Biochem. 64:221-226]은, 촉매(리보자임) 역할을 할 수 있는 천연 생성 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매는 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에서만 작용하는 것으로 파악되지만, 최근 들어 리보자임을 인공적으로 진화시켜, 촉매 작용 레파토리를 다양한 화학 반응으로 확대시킨 바 있다. 연구 결과, RNA 분자 자체의 (2')3'-말단부에서 아미노아실-RNA 결합을 촉매할 수 있는 RNA 분자[Illangakekare외 다수, 1995 Science 267:643-647)]와, 하나의 RNA 분자에서 다른 RNA 분자로 아미노산을 운반할 수 있는 RNA 분자[Lohse외 다수, 1996, Nature 381:442-444]를 확인하였다.
본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2003/0228593에는, 리보자임을 구성하는 방법과, tRNA를 천연 암호화 및 비천연 암호화 아미노산으로 아미노아실화할 경우 리보자임의 용도에 관하여 기술되어 있다. tRNA를 아미노아실화할 수 있는 효소 분자 예를 들어, 리보자임의 기재-고정형은 아미노아실화된 산물을 효율적으로 친화 정제할 수 있게 만들 수 있다. 적당한 기재의 예로서는 아가로스, 세파로스 및 자성 비드를 포함한다. 아미노아실화용 리보자임의 기재-고정형을 제조하는 방법과 이의 용도에 관하여는, 본원에 참고용으로 인용된 문헌[Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 및 미국 특허 출원 공보 2003/0228593]에 기술되어 있다.
화학적 아미노아실화 방법으로서는 다음과 같은 문헌에서 소개된 방법들(아미노아실화에 합성 효소를 사용하지 않는 방법)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: Hecht와 동료(Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) 및 Schultz, Chamberlin, Dougherty외 다수(Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D.외 다수 Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti외 다수 J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W.외 다수 Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E.외 다수 J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T.외 다수 J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34) (상기 문헌들 모두 본원에 참고용으로 인용됨). 이러한 방법들 또는 기타 화학적 아미노아실화 방법은 tRNA 분자를 아미노아실화하는데에 사용될 수 있다.
촉매성 RNA를 생산하는 방법은, 랜덤화된 리보자임 서열의 별도 풀(pool)을 제조하는 단계, 이 풀에 대해 배향 진화(directed evolution)를 수행하는 단계, 이 풀을 원하는 아미노아실화 활성에 대해 스크리닝하는 단계 및 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임 서열을 선택하는 단계를 포함한다.
리보자임은 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 부위들 예를 들어, GGU 모티프 및 U-풍부 부위(U-rich region)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 U-풍부 부위는 아미노산 기질의 인지를 촉진할 수 있으며, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기 쌍을 형성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 이와 아울러, 상기 GGU 모티프 및 U-풍부 부위는 아미노산과 tRNA를 동시에 인지하는 것을 촉진하며, 또한 그에 따라서 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화도 촉진한다.
리보자임은 부분적으로 랜덤화된 r24미니와 tRNAAsnCCCG를 접합하는 시험관 내 선택법을 수행한 후, 활성 클론에서 살펴볼 수 있는 공통 서열을 체계적으로 조작하여 제조될 수 있다. 이 방법에 의해 얻어지는 대표적인 리보자임을 "Fx3 리보자임"이라 칭하며, 이에 관하여는 미국 특허 출원 공보 2003/0228593(이의 내용은 본원에 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있고, 또한 이 리보자임은 동종 비천연 아미노산을 운반하는 다양한 아미노아실-tRNA 합성용인 다용도 촉매로서 작용한다.
기재상에서 고정화시키면, 아미노아실화된 tRNA를 효율적으로 친화 정제할 수 있다. 적당한 기재의 예로서는 아가로스, 세파로스 및 자성 비드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리보자임은 RNA의 화학 구조를 이용하여 수지상에 고정될 수 있으며, 예를 들어, RNA의 리보스 상에 존재하는 3'-cis-디올은 과요드산염으로 산화되어, 이 수지상에 RNA를 효율적으로 고정시키는 해당 디알데히드를 생성할 수 있다. 저렴한 하이드라지드 수지를 비롯한 다양한 유형의 수지들이 사용될 수 있으며, 여기서, 환원성 아민화를 통하여 수지와 리보자임 간의 상호 작용을 비가역적 결합으로 만들 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 주로 컬럼 상 아미노아실화 기술에 의해 촉진될 수 있다. 문헌[Kourouklis외 다수, Methods 2005; 36:239-4]에는 컬럼계 아미노아실화 시스템에 관하여 기술되어 있다.
아미노아실화된 tRNA의 분리는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 한 가지 적당한 방법은 완충액 예를 들어, 아세트산나트륨 용액(10 mM EDTA포함), 50 mM의 N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA를 함유하는 완충액, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)와 함께, 컬럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리시키는 것이다.
번역 반응에 의하여 생성된 폴리펩티드 내 선택 위치에서 이 tRNA가 아미노아실화된 아미노산을 통합하기 위해, 아미노아실화 tRNA가 번역 반응에 가하여질 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예로서는, 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 용해물은 도입 mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관 내 번역하는데에 필요한 반응 성분을 제공한다. 이러한 반응 성분의 예로서는 리보좀 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 연장 인자 및 번역과 관련된 부가 인자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 번역 시스템은 일군의 번역 시스템이거나 또는 개별적으로 구획화된 번역 시스템일 수 있다. 일군의 번역 시스템은 반응 성분들을 단일의 구획에서 화합시키지만, 구획화된 번역 시스템은 번역의 효율을 줄일 수 있는 반응 생성물로부터 번역 반응 성분들을 구분한다. 이러한 번역 시스템은 시판중에 있다.
뿐만 아니라, 커플링된 전사/번역 시스템이 사용될 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 도입 DNA를 상응하는 mRNA로 전사시킬 수 있는데, 이때 이 mRNA는 반응 성분에 의해 번역될 수 있다. 시판중인 커플링된 전사/번역 시스템의 예로서는 신속 번역 시스템(Rapid Translation System; RTS, Roche Inc.)가 있다. 이 시스템은 번역 성분들 예를 들어, 리보좀과 번역 인자들을 제공하는 이.콜라이 용해물 함유 혼합물을 포함한다. 뿐만 아니라, RNA 중합 효소는 도입 DNA를, 번역에 사용될 mRNA 주형으로 전사시키기 위해 포함된다. RTS는 반응 구획 예를 들어, 공급/소모 구획 및 전사/번역 구획 사이에 존재하는 막을 이용하여 반응 성분들을 구획화하는데 사용될 수 있다.
tRNA의 아미노아실화는 기타 제제 예를 들어, 트랜스퍼라제, 중합 효소, 촉매 항체 및 다작용성 단백질 등에 의해 수행될 수 있다.
문헌[Stephan, Scientist, 2005, Oct 10;pp 30∼33]에는, 비천연 암호화 아미노산을 단백질에 통합하는 부가적인 방법에 관하여 기술되어 있다. 문헌[Lu외 다수, Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]에는, 단백질을, 인위적 아미노산을 함유하는 합성 펩티드에 화학적으로 결찰 시키는 방법에 관하여 기술되어 있다[발현된 단백질 결찰].
X. 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형
편의상, 본원에 개시된 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형에 관하여는 일반적인 사항들을 기술하였으며/기술하였거나, 구체예를 들어 기술하였다. 그러나, 본원에 개시된 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은 본 섹션에 제공된 일반적인 설명이나 구체예 만에 한정되는 것은 아니며, 오히려, 본원에 개시된 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은, 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위에 속하는 모든 화합물 예를 들어, 본 명세서, 천구의 범위 및 도면에 개시된 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 임의의 부속 화합물 또는 특정 화합물에 균등하게 적용된다.
방법, 조성물, 기술 및 기법은 단백질의 생체 내 번역시 비천연 아미노산을 위치 특이적으로 통합시키도록 개발하였다. 천연 생성 아미노산의 측쇄에 직교하는 측쇄 화학기를 비천연 아미노산에 통합함으로써, 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다. 결과적으로, 본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법의 주요 이점은, 유도체화된 단백질이 제한적으로 균질성인 생산물로서 생산된다는 점이다. 그러나, 본원에 개시된 방법, 조성물, 반응 혼합물, 기술 및 기법은 생체 내 단백질 번역 기술에 의해 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 한정되는 것은 아니지만, 임의의 기술 예를 들어, 발현된 단백질만을 결찰하는 기술, 화학적 합성 기술, 리보자임을 바탕으로 하는 기술에 의해 생산된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다[예를 들어, 본원의 "대안적 시스템에서의 발현" 섹션 참조].
비천연 아미노산을 재조합 단백질에 통합하는 능력은, 번역 후 유도체화를 수행할 수 있는 화학 분야에 광범위하게 확대되는데, 여기서, 이러한 유도체화는 생체 내 또는 시험관 내에서 일어난다. 더욱 구체적으로, 디카보닐 및 디아민의 반응을 이용하여, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분에 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성하는 폴리펩티드 유도체화를 통하여, 몇 가지 이점을 얻을 수 있다. 첫째, 천연 생성 아미노산은 (a) 디아민기와 반응하여 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성할 수 있는 디카보닐기와, (b) 디카보닐기와 반응하여 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성할 수 있는 디아민기를 함유하지 않으므로, 이러한 결합을 형성하도록 디자인된 시약이 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분과 위치 특이적으로 반응할 것이고(물론, 비천연 아미노산과 상응하는 시약이 이러한 결합을 형성하도록 디자인되었을 경우), 또한 단백질을 위치 선택적으로 유도체화하는 능력으로 말미암아, 선행 기술을 이용하여 생산된 유도체화 단백질의 혼합물과는 대조적으로, 균질한 단일 생산물을 제공한다는 점이다. 둘째, 이와 같은 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합은 생물학적 조건 하에서 안정하므로, 이러한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합에 의해 유도체화된 단백질이 치료용으로서 유효한 후보 물질이 된다는 점이다. 셋째, 생성된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합의 안정성은 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 형성된 비천연 아미노산의 본질(즉, 작용기 및/또는 구조)을 바탕으로 하여 조작될 수 있다는 점이다. 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합은 분해 반감기(decomposition half-life)가 약 1시간 미만이고, 다른 구체예에서는, 약 1일 미만, 다른 구체예에서는 약 2일 미만, 다른 구체예에서는 약 1주 미만, 그리고 다른 구체예에서는 약 1주 이상이다. 또 다른 구체예에서, 생성된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환은 약산성 조건 하에서 약 2주 이상 안정하고, 다른 구체예에서, 생성된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합은 약산성 조건 하에서 약 5일 이상 안정하다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 pH 약 2∼약 8에서 약 1일 이상 동안 안정하고; 다른 구체예에서는, pH 약 2∼약 6에서; 다른 구체예에서는, pH 약 2∼약 4에서 안정하다. 다른 구체예에서, 당업자는 본원에 개시된 기법, 방법, 조성물 및 기술을 사용하여 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 합성하여, 이를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시켜, 당업자의 필요에 따라서 상기 결합의 분해 반감기를 조정할 수 있다(예를 들어, 치료용, 또는 진단용, 또는 산업용, 또는 군사용으로서는 예를 들어, 지연 방출되도록 조정).
전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 예를 들어, 신규의 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(예를 들어, 항체) 및 항체 단편으로서 유용할 뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질 구조 및 기능 연구에도 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]을 참조하시오. 전술한 바와 같은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 기타 용도로서는 예를 들어, 분석용, 화장품 생산용, 식물 생물학 분야, 환경 분야, 에너지 생산용 및/또는 군사용을 포함한다. 그러나, 전술한 바와 같은 비천연 아미노산 폴리펩티드에서는 추가의 변형이 진행되어, 신규의 변형된 작용기를 통합할 수 있는데, 예를 들어, 폴리펩티드의 치료적 효능을 조정하거나, 폴리펩티드의 안전성 프로필을 개선하거나, 폴리펩티드의 약물 동태학, 약리학 및/또는 약력학적 특성을 맞추거나(예를 들어, 수용성, 생체 이용률, 혈청 반감기 또는 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성 또는 생물학적 활성을 조정하거나, 또는 순환 시간을 연장함), 폴리펩티드에 부가적인 작용기를 제공하거나, 태그, 표지 또는 검출 가능한 신호를 폴리펩티드에 통합하거나, 폴리펩티드의 분리 특성을 개선하거나, 전술한 변형들을 조합하여 제공할 수 있다.
임의의 구체예는 폴리펩티드의 분리 특성을 개선시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 카보닐 함유 비천연 아미노산, 디카보닐 함유 비천연 아미노산, 디아민 함유 비천연 아미노산, 케토아민 함유 비천연 아미노산과 케토알킬 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 이와 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 바와 같이, 폴리펩티드에 생합성에 의하여 통합된다. 추가의 또는 대안적인 구체예에서, 이와 같은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼화학식 LXVII의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 방법, 조성물, 기법 및 기술은 폴리펩티드의 특정 유형, 부류 또는 군에 제한되지 않는다. 사실상 임의의 폴리펩티드는 본원에 개시된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질과 상동성일 수 있다. 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 초 유전자군에 속하는 임의의 폴리펩티드 일원에 상동성일 수도 있다.
이와 같은 변형법으로서는, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 추가의 작용기 예를 들어, 원하는 작용기를 통합시키는 것을 포함한다.
본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 기타 작용기로 전환될 수 있는 부분들을 포함할 수 있는데, 여기서, 이러한 부분으로서는 카보닐, 디카보닐, 디아민, 케토아민 또는 케토알킨을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 개시된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성 규명 및 사용하는 방법, 조성물, 기술 및 기법 중 임의의 것에 사용될 수 있거나 또는 이것에 통합될 수 있다. 이와 같은 부분을 기타 작용기 예를 들어, 복소환부로 화학 전환하는 것은 본원에 개시된 기술 또는 문헌[March, Advanced Organic Chemistry 5th Ed., (Wiley 2001); and Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001); 이 문헌 모두 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)]에 개시된 기술을 이용하여 이루어질 수 있다.
그러므로, 예를 들어, 다음과 같은 아미노산 중 임의의 것을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법과 조성물을 이용하여 추가로 변형될 수 있다:
(a) 화학식 I
Figure 112008047567393-PCT00110
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
J는
Figure 112008047567393-PCT00111
이고;
R8은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되며;
R9는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되고;
T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
T2는 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 치환된 저급 시클로알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 알키닐, 저급 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 저급 헤테로시클로알킬, 치환된 저급 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬로부터 선택되며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-A-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 시클로아릴 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
여기서, -A-B-J-R 상에 존재하는 하나 이상의 아민기는 경우에 따라 보호된 아민임];
(b) 화학식 V
Figure 112008047567393-PCT00112
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
K는
Figure 112008047567393-PCT00113
이고,
여기서, T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌으로부터 선택되고;
T2는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되며;
T3은
Figure 112008047567393-PCT00114
이고,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되며; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이고, 여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이거나; 또는
-A-B-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함];
(c) 화학식 X
Figure 112008047567393-PCT00115
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 식 중, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M2는
Figure 112008047567393-PCT00116
이고,
(식 중, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 각각의 카보닐기와의 결합을 나타냄);
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함]
(d) 화학식 XV
Figure 112008047567393-PCT00117
[식 중,
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R", -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R")C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M1은 결합, -C(R3)(R4)-, -O-, -S-, -C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-, -C(R3)(R4)-O-, -C(R3)(R4)-S-, -0-C(R3)(R4)-, -S-C(R3)(R4), -C(R3)=C(R3)- 또는 -C(R4)=C(R4)-이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기, 또는 2개의 R4기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2-, -C(O)kR' (식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'로 이루어진 군으로부터 선택되며, R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치환된 알킬이고; n은 0∼8임];
(e) 화학식 XXXI
Figure 112008047567393-PCT00118
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00119
이고;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00120
Figure 112008047567393-PCT00121
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로, -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 또한 R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함];
(f) 화학식 XXXIV
Figure 112008047567393-PCT00122
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00123
이고;
T1은 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00124
Figure 112008047567393-PCT00125
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
본원에 개시된 방법 및 조성물에 관한 하나의 구체예는, 하나 이상, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산(번역 후 변형된 아미노산)을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 번역 후 변형된 비천연 아미노산으로 치환된, 폴리펩티드 내 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상 또는 전부보다는 적은 수의 아미노산을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 가지는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다[예를 들어, 폴리펩티드는 번역 후 변형된 비천연 아미노산 중 2개 이상의 상이한 유형을 포함할 수 있거나, 또는 번역 후 변형된 동일한 비천연 아미노산 중 2개를 포함할 수 있다]. 2개 이상의 번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 번역 후 변형된 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 동일한 종류의 번역 후 변형된 비천연 아미노산 다수와 하나 이상의 번역 후 변형된 상이한 비천연 아미노산의 조합체일 수 있다.
번역 후 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 방법
도 14와 도 17은 본원에 개시된 방법과 기술을 이용하여 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 것에 관하여 도시한 것이다. 이와 같이 번역 후 변형 및 기타 번역 후 변형에 관하여는 이하에 기술되어 있다.
A. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형 방법: 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응
천연 생성되는 아미노산의 측쇄에는 고도로 친전자성인 위치가 존재하지 않는다. 그러므로, 친전자체 함유 측쇄를 가지는 인위적 아미노산 예를 들어, 디카보닐기 예를 들어, 디케톤, 케토알데히드, 케토에스테르, 케토산 또는 케토티오에스테르를 함유하는 아미노산의 통합으로 말미암아, 카보닐기 중 하나 이상의 친핵성 공격을 통해 이 측쇄를 위치 특이적으로 유도체화할 수 있는 것이다. 친핵체를 공격하는 것이 디아민인 경우, 복소환 유도체화 단백질 예를 들어, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질이 생성될 것이다. 유도체화 방법 및/또는 추가의 변형 방법은 유도체화 단계 이전 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드로써 유도될 수 있다. 뿐만 아니라, 유도체화 방법 및/또는 추가의 변형 방법은 이와 같은 변형 방법을 수행하기 이전이나 이후에 정제된 합성 중합체, 다당류 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 유도체화 단계는 약산성 조건으로부터 약염기성 조건 예를 들어, pH 약 2∼약 8, pH 약 4∼약 8, pH 약 3∼약 8, 또는 pH 약 2∼약 9, 또는 pH 약 4∼약 9, 또는 pH 약 4∼약 10에 이르기까지 이루어질 수 있다.
디아민 치환 분자와 디카보닐 함유 단백질의 반응을 바탕으로 하는 단백질 유도체화 방법은 분명한 이점을 갖는다. 첫째, 디아민은 pH 약 5∼약 8(추가의 구체예에서는, pH 약 4∼약 10, 추가의 구체예에서는 pH 약 3∼약 8, 또는 또 다른 구체예에서는 pH 약 2∼약 9, 또는 추가의 구체예에서는 pH 약 4∼약 9)에서, 디카보닐 함유 화합물과의 축합 반응을 수행하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성한다는 점이다. 이와 같은 조건 하에서, 천연 생성되는 아미노산의 측쇄는 비 반응성이다. 둘째, 이와 같은 선택적 화학 반응은 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다는 점이다[이때, 유도체화된 단백질은 제한적으로 균질한 생산물로서 제조될 수 있음]. 셋째, 본원에 개시된 바와 같은 디카보닐 함유 폴리펩티드와 본원에 개시된 바와 같은 디아민의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다는 점이다[다만, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것일 경우에는 제외]. 넷째, 반응이 실온에서 신속하게 일어나서, 고온에서 불안정한 다수의 유형의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다는 점이다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나므로, 비수성 용액과 (어느 정도) 비혼화성인 시약과 폴리펩티드를 사용할 수도 있다는 점이다. 여섯째, 이 반응은 폴리펩티드 또는 아미노산 대 시약의 비율이 화학량론적, 준 화학량론적 또는 유사 화학량론적일 때조차도 용이하게 일어나므로, 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가하지 않더라도 유효량만큼의 반응 생성물을 얻을 수 있다는 점이다. 일곱째, 생성된 복소환은 반응물의 디아민 부분 및 디카보닐부의 디자인에 따라서, 위치 선택적 및/또는 위치 특이적으로 생산될 수 있다는 점이다. 마지막으로, 디아민과 디카보닐 함유 분자의 축합 반응을 통하여는, 생물학적 조건 하에서 안정한, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성된다는 점이다.
예를 들어, 다음과 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 디아민 함유 시약과 반응성인, 디카보닐 함유 아미노산류으로서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는데 사용될 수 있는 것이다:
(a) 화학식 V
Figure 112008047567393-PCT00126
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
K는
Figure 112008047567393-PCT00127
이고,
여기서, T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌으로부터 선택되고;
T2는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌. 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
T3은
Figure 112008047567393-PCT00128
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이고, 여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이거나; 또는
-A-B-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-K-R기는 함께, 하나 이상의 카보닐기 예를 들어, 디카보닐기, 보호된 카보닐기 예를 들어, 보호된 디카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기 예를 들어, 마스킹된 디카보닐기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
이와 같은 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 유형은, 디카보닐 함유 비천연 아미노산이 폴리펩티드에 존재하여, 디아민 시약이 디카보닐기와 반응할 수 있고, 또한 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는(물론 반응의 목적이 파괴일 경우에는 제외) 변형된 비천연 아미노산을 생성할 수 없는 한, 실질적으로 비한정적이다.
예를 들어, 다음과 같은 디아민 함유 제제는 본원에 개시된 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응성이고, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는, 디아민 함유 제제류이다.
Figure 112008047567393-PCT00129
[식 중,
X는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로서, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
X는 각각 독립적으로 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 각각 독립적으로, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬 렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L1은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, p는 0, 1 또는 2임)이며;
R'는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬 또는 아미노 보호기이고;
W는
Figure 112008047567393-PCT00130
이며,
Z2 및 Z3은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)- 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
n은 1∼3임].
화학식 LVVIII의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 화학식 LXIX의 구조를 갖는 화합물이 있다.
Figure 112008047567393-PCT00131
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이 있다:
Figure 112008047567393-PCT00132
다른 구체예에서, 이러한 m-PEG 또는 PEG 기의 분자량은 약 5∼약 30kDa이다. 다른 구체예에서, 이러한 m-PEG 또는 PEG 기의 분자량은 약 2∼약 50kDa이다. 다른 구체예에서, 이러한 m-PEG 또는 PEG 기의 분자량은 약 5kDa이다.
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 화학식 LXX의 구조를 갖는 화합물이 있다.
Figure 112008047567393-PCT00133
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 화학식 LXXI의 구조를 갖는 화합물이 있다.
Figure 112008047567393-PCT00134
화학식 XXII의 화합물에 관한 기타 구체예에서, 이러한 m-PEG기의 분자량은 약 5∼약 30kDa이다. 기타 구체예에서, 이러한 m-PEG 또는 PEG 기의 분자량은 약 2∼약 50kDa이다. 기타 구체예에서, 이러한 m-PEG 또는 PEG 기의 분자량은 약 5kDa이다.
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 화학식 LXXII의 구조를 갖는 화합물이 있다:
Figure 112008047567393-PCT00135
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 화학식 LXXIII의 구조를 갖는 화합물이 있다:
Figure 112008047567393-PCT00136
화학식 XXII의 화합물에 관한 기타 구체예에서, 이러한 m-PEG기의 분자량은 5∼30kDa이다.
화학식 LXIX의 화합물에 관한 임의의 구체예로서는, 하기 구조를 갖는 화합물이 있다:
Figure 112008047567393-PCT00137
폴리펩티드에 포함된 디카보닐 함유 비천연 아미노산에 디아민을 커플링하는 방법에 관한 예시적인 구체예를 도 12, 도 15 및 도 16에 제시하였다. 이와 같은 예시적인 구체예에서, 디아민 유도체화 시약이 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 완충 용액(pH 약 2∼약 9)에 첨가된다. 반응은 상온에서 진행되고, 생성된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기별 배제 크로마토그래피로 정제될 수 있다.
다른 구체예에서, 다수의 링커 화학 물질은 디카보닐 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개 시된 링커를 이용하는 방법에서는 하나 이상의 링커 말단부에 존재하는 디아민 작용기를 함유하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 사용한다. 디아민 유도체화 링커와 디카보닐 치환된 단백질의 축합 반응을 통하여, 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성된다. 2 작용성 및/또는 다작용성 링커(이종 작용성 링커라고도 알려짐)(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 디아민)로 말미암아, 상이한 분자들(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)을 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시킬 수 있는 반면에, 1 작용성 링커(동종 작용성 링커라고도 알려짐)(모든 말단부가 디아민 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같이 링커를 이용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계하면, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있게 된다.
B. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 케토아민 함유 시약의 반응
전술한 바와 같은 번역 후 변형 기술과 조성물은 또한 케토아민 함유 시약과 반응하는 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 함께 사용되어, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
예를 들어, 상기 섹션 A에 기술된 디카보닐 함유 비천연 아미노산은 또한, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는데 사용될 수 있는, 본원에 개시된 케토아민 함유 시약과 반응성이다.
예를 들어, 다음과 같은 케토아민 함유 시약은 본원에 개시된 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응성이며, 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는, 케토아민 함유 시약류이다:
화학식 LXVIII
Figure 112008047567393-PCT00138
[식 중,
X는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
X는 각각 독립적으로 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 각각 독립적으로, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
L1은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, p는 0, 1 또는 1임)이며;
W는
Figure 112008047567393-PCT00139
이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00140
이고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시 클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며,
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00141
Figure 112008047567393-PCT00142
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R")-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR", -OAc, -SR", -N(R")2, -N(R")(Ac), -N(R")(OMe) 또는 N3이며, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고, n은 1∼3임].
몇몇 구체예에서, 다수의 링커 화학기는 디카보닐 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개시된 링커를 사용하는 방법에서는 하나 이상의 링커 말단부에 케토아민 작용기를 포함하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 사용한다. 케토아민 유도체화 링커와 디카보닐 치환된 단백질의 반응을 통해서는 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성된다. 2 작용성 및/또는 다작용성 링커(이종 작용성 링커라고도 알려짐)(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 케토아민)는 상이한 분자(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시키는 반면에, 1 작용성 링커(동종 작용성 링커라고도 알려짐)(모든 말단부가 케토아민으로 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같이 링커를 이용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계하면, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있게 된다.
C. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 디아민 함유 비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응
전술한 바와 같은 번역 후 변형 기술과 조성물은 디카보닐 함유 시약과 반응하는 디아민 함유 비천연 아미노산과 함께 사용되어, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
디아민 함유 단백질과 디카보닐 치환된 분자의 반응을 바탕으로 하는 단백질 유도체화 방법은 분명한 이점들을 갖는다. 첫째, 디아민은 pH 약 4∼약 10(추가의 구체예에서는, pH 약 4∼약 10, 추가의 구체예에서는 pH 약 3∼약 8, 또는 또 다른 구체예에서는 pH 약 2∼약 9, 또는 추가의 구체예에서는 pH 약 4∼약 9)에서, 디카보닐 함유 화합물과의 반응을 수행하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성한다는 점이다. 이와 같은 조건 하에서, 천연 생성되는 아미노산의 측쇄는 비 반응성이다. 둘째, 이와 같은 선택적 화학 반응은 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다는 점이다[이때, 유도체화된 단백질은 제한적으로 균질한 생산물로서 제조될 수 있음]. 셋째, 본원에 개시된 바와 같은 디카보닐 함유 시약 과 본원에 개시된 바와 같은 디아민 함유 폴리펩티드의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다는 점이다[다만, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것일 경우에는 제외]. 넷째, 반응이 실온에서 신속하게 일어나므로, 고온에서 불안정한 다수의 유형의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다는 점이다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나므로, 비수성 용액과 (어느 정도) 비혼화성인 시약과 폴리펩티드를 사용할 수도 있다는 점이다. 여섯째, 이 반응은 폴리펩티드 또는 아미노산 대 시약의 비율이 화학량론적, 준 화학량론적 또는 유사 화학량론적일 때조차도 용이하게 일어나므로, 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가하지 않더라도 유효량만큼의 반응 생성물을 얻을 수 있다는 점이다. 일곱째, 생성된 복소환은 반응물의 디아민 부분 및 디카보닐부의 디자인에 따라서, 위치 선택적 및/또는 위치 특이적으로 생산될 수 있다는 점이다. 마지막으로, 디아민 함유 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응을 통하여는, 생물학적 조건 하에서 안정한, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성될 수 있다는 점이다.
예를 들어, 다음과 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 디카보닐 함유 시약과 반응성인, 디아민 함유 아미노산류로서, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는데 사용될 수 있다:
화학식 I
Figure 112008047567393-PCT00143
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
J는
Figure 112008047567393-PCT00144
이고;
R8은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되며;
R9는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되고;
T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
T2는 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 치환된 저급 시클로알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 알키닐, 저급 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 저급 헤테로시클로알킬, 치환된 저급 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬로부터 선택되며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-A-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-B-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 시클로아릴 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
-J-R기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 1환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함]
이와 같이 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 유형은, 디아민 함유 비천연 아미노산이 폴리펩티드에 존재하여, 디카보닐 함유 시약이 디아민기와 반응할 수 있고, 또한 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는(물론 반응의 목적 이 파괴일 경우에는 제외) 변형된 비천연 아미노산을 생성할 수 없는 한, 실질적으로 비 한정적이다.
예를 들어, 다음과 같은 디카보닐 함유 시약은 본원에 개시된 디아민 함유 비천연 아미노산과 반응성이고, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는 디카보닐 함유 시약류이다.
화학식 LXVIII
Figure 112008047567393-PCT00145
[식 중,
X는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
X는 각각 독립적으로 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 각각 독립적으로, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L1은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, p는 0, 1 또는 2임)이며;
R'는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬 또는 아미노 보호기이고;
W는
Figure 112008047567393-PCT00146
(식 중, R'는 각각 독립적으로 H임)이며;
G는 각각 독립적으로
Figure 112008047567393-PCT00147
이고;
Z1은 결합, CR7R7, O, S, NR', CR7R7-CR7R7, CR7R7-O, 0-CR7R7, CR7R7-S, S-CR7R7, CR7R7-NR', NR'-CR7R7이며;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00148
Figure 112008047567393-PCT00149
로서, 여기서, X1은 각각 독립적으로, -O-, -S-, -N(H)-, -N(R")-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR', -N(R")2, -N(R")(Ac), -N(R")(OMe) 또는 N3이며, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
M2는
Figure 112008047567393-PCT00150
이고;
n은 1∼3임].
디카보닐 함유 시약을 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링시키는 방법에 관한 예시적인 구체예를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 이와 같은 예시적인 구체예에서, 디카보닐 유도체화된 시약은 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 완충 용액(pH 약 3∼약 8)에 첨가된다. 본 반응은 상온에서 진행되며, 생성된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다른 구체예에서, 다수의 링커 화학기는 디아민 치환 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개시된 링커를 사용하는 방법에서는, 하나 이상의 링커 말단부에 디카보닐 작용기를 함유하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 사용한다. 디카보닐 유도체화 된 링커와 디아민 치환된 단백질의 축합 반응을 통하여, 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성된다. 2 작용성 및/또는 다작용성 링커(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 디카보닐)를 통하여, 상이한 분자들(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)을 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시킬 수 있는 반면에, 1 작용성 링커(모든 말단부가 디카보닐로 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커를 사용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계함으로써, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있다.
D. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 디아민 함유 비천연 아미노산과 케토알킨 함유 시약의 반응
전술한 번역 후 변형 기술과 조성물은 또한 케토알킨 함유 시약과 반응하는 디아민 함유 비천연 아미노산과 함께 사용되어, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 예를 들어, 상기 섹션 C에 기술된 디아민 함유 비천연 아미노산은 또한 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는, 본원에 개시된 케토알킨 함유 시약과도 반응성이다.
예를 들어, 다음과 같은 케토알킨 함유 시약은 섹션 C에 기술된 디아민 함유 비천연 아미노산과 반응성이고, 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는, 케토알킨 함유 시약류이다:
화학식 LXVIII
Figure 112008047567393-PCT00151
[식 중,
X는 각각 독립적으로, H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 산화 폴리알킬렌, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
X는 각각 독립적으로 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되며;
L은 각각 독립적으로, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬 렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L1은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, p는 0, 1 또는 2임)이며;
R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
W는 -G-C≡C-R'이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00152
이고,
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00153
로서, 여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R")-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR', -N(R")2, -N(R")(Ac), -N(R")(OMe) 또는 N3이며, 또한 R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고, n은 1∼3임].
다른 구체예에서, 다수의 링커 화학기는 디아민 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개시된 링커를 이용하는 방법에서는, 하나 이상의 링커 말단에 케토알킨 작용기를 함유하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 이용한다. 케토알킨 유도체화된 링커와 디아민 치환된 단백질의 반응을 통하여, 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 형성된다. 2 작용성 링커 및/또는 다작용성 링커(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 케토알킨)를 통하여, 상이한 분자들(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시킬 수 있으며, 1 작용성 링커(모든 말단부가 케토알킨으로 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커를 사용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계함으로써, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있다.
E. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 케토알킨 함유 비천연 아미노산과 디아민 함유 시약의 반응
전술한 번역 후 변형 기술과 조성물은 또한 디아민 함유 시약과 반응하는 케토알킨 함유 비천연 아미노산과 함께 사용되어, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
케토알킨 함유 단백질과 디아민 치환된 분자의 반응을 바탕으로 한 단백질 유도체화 방법은 분명한 이점을 갖는다. 첫째, 케토알킨은 pH 약 4∼약 10에서, 디아민 함유 화합물과 반응하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성한다는 점이다. 이와 같은 조건 하에서, 천연 생성되는 아미노산의 측쇄는 비 반응성이다. 둘째, 이와 같은 선택적 화학 반응은 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다는 점이다[이때, 유도체화된 단백질은 제한적으로 균질한 생산물로서 제조될 수 있음]. 셋째, 본원에 개시된 바와 같은 케토알킨 함유 폴리펩티드와 본원에 개시된 바와 같은 디아민 함유 시약의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다는 점이다[다만, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것일 경우에는 제외]. 넷째, 반응이 실온에서 신속하게 일어나서, 고온에서 불안정한 다수의 유형의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다는 점이다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나므로, 비수성 용액과 (어느 정도) 비혼화성인 시약과 폴리펩티드를 사용할 수도 있다는 점이다. 여섯째, 이 반응은 폴리펩티드 또는 아미노산 대 시약의 비율이 화학량론적, 준 화학량론적 또는 유사 화학량론적일 때조차도 용이하게 일어나므로, 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가하지 않더라도 유효량만큼의 반응 생성 물을 얻을 수 있다는 점이다. 일곱째, 생성된 복소환은 반응물의 디아민 부분 및 디카보닐부의 디자인에 따라서, 위치 선택적 및/또는 위치 특이적으로 생산될 수 있다는 점이다. 마지막으로, 디아민 함유 시약과 케토알킨 함유 아미노산의 반응을 통하여는, 생물학적 조건 하에서 안정한, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성된다는 점이다.
예를 들어, 다음과 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 디아민 함유 시약과 반응성이고, 케토알킨 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는, 케토알킨 함유 아미노산류이다:
화학식 XXXI
Figure 112008047567393-PCT00154
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부와 결하된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00155
이고;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00156
Figure 112008047567393-PCT00157
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로, -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, 또한 R'는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 치 환된 알킬이며;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함].
하나의 구체예에서, 다수의 링커 화학기는 케토알킨 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개시된 링커를 이용하는 방법에서는, 하나 이상의 링커 말단에 디아민 작용기를 함유하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 이용한다. 디아민 유도체화된 링커와 케토알킨 치환된 단백질의 반응을 통하여, 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 형성된다. 2 작용성 링커 및/또는 다작용성 링커(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 디아민)를 통하여, 상이한 분자들(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)을 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시킬 수 있으며, 1 작용성 링커(모든 말단부가 디아민으로 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커를 사용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계함으로써, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있다.
F. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 방법: 케토아민 함유비천연 아미노산과 디카보닐 함유 시약의 반응
전술한 번역 후 변형 기술과 조성물을 디카보닐 함유 시약과 반응하는 케토아민 함유 비천연 아미노산과 함께 사용하여, 변형된 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 질소 함유 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수도 있다.
케토아민 함유 단백질과 디카보닐 치환된 분자의 반응을 바탕으로 한 단백질 유도체화 방법은 분명한 이점을 갖는다. 첫째, 케토아민은 pH 약 4∼약 10(추가의 구체예에서는 pH 약 4∼약 10, 추가의 구체예에서는 pH 약 3∼약 8, 또는 또 다른 구체예에서는 pH 약 2∼약 9, 또는 부가적인 구체예에서는 pH 약 4∼약 9)에서, 디카보닐 함유 화합물과 반응하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 형성한다는 점이다. 이와 같은 조건 하에서, 천연 생성되는 아미노산의 측쇄는 비 반응성이다. 둘째, 이와 같은 선택적 화학 반응은 재조합 단백질을 위치 특이적으로 유도체화할 수 있다는 점이다[이때, 유도체화된 단백질은 제한적으로 균질한 생산물로서 제조될 수 있음]. 셋째, 본원에 개시된 바와 같은 케토아민 함유 폴리펩티드와 본원에 개시된 바와 같은 디카보닐 함유 시약의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다는 점이다[다만, 반응의 목적이 이러한 3차 구조를 파괴하는 것일 경우에는 제외]. 넷째, 반응이 실온에서 신속하게 일어나서, 고온에서 불안정한 다수의 유형의 폴리펩티드 또는 시약을 사용할 수 있다는 점이다. 다섯째, 반응이 수성 조건 하에서 용이하게 일어나므로, 비수성 용액과 (어느 정도) 비혼화성인 시약과 폴리펩티드를 사용할 수도 있다는 점이다. 여섯째, 이 반응은 폴리펩티드 또는 아미노산 대 시약의 비율이 약 1:1 또는 약 1:1에 거의 근접할 때조차도 용이하게 일어나므로, 과량의 시약 또는 폴리펩티드를 첨가하지 않더라도 유효량만큼의 반응 생성물을 얻을 수 있다는 점이다. 일곱째, 생성된 복소환은 반응물의 케토아민부 및 디카보닐부의 디자인에 따라서, 위치 선택적 및/또는 위치 특이적으로 생산될 수 있다는 점이다. 마지막으로, 디카보닐 함유 시약과 케토아민 함유 아미노산의 반응을 통하여는, 생물학적 조건 하에서 안정한, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 생성될 수 있다는 점이다.
예를 들어, 다음과 같은 비천연 아미노산은, 본원에 개시된 디카보닐 함유 시약과 반응성이고, 케토아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시키는데 사용될 수 있는 케토아민 함유 아미노산류이다:
화학식 XXXIV
Figure 112008047567393-PCT00158
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
G는
Figure 112008047567393-PCT00159
이고;
T1은 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이며;
T4는 카보닐 보호기 예를 들어,
Figure 112008047567393-PCT00160
Figure 112008047567393-PCT00161
로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe) 또는 N3이며, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 을 형성함].
하나의 구체예에서, 다수의 링커 화학기는 케토아민 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 위치 특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 개시된 링커를 이용하는 방법에서는, 하나 이상의 링커 말단에 디카보닐 작용기를 함유하는 링커(1 작용성, 2 작용성 또는 다작용성 링커)를 이용한다. 디카보닐 유도체화된 링커와 케토아민 치환된 단백질의 반응을 통하여, 안정한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합이 형성된다. 2 작용성 링커 및/또는 다작용성 링커(예를 들어, 하나 이상의 기타 결합 화학기를 가지는 디카보닐)를 통하여, 상이한 분자들(예를 들어, 기타 단백질, 중합체 또는 소형 분자)을 비천연 아미노산 폴리펩티드에 위치 특이적으로 결합시킬 수 있으며, 1 작용성 링커(모든 말단부가 디카보닐로 치환된 링커)는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 위치 특이적 이량체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커를 사용하는 기법과 본원에 개시된 생체 내 번역 기술을 연계함으로써, 화학 조작된 단백질의 3차원 구조를 특정할 수 있다.
G. 작용기의 부가 예: 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대 분자 중합체
본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법을 이용하여, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 다양한 변형을 가할 수 있다. 이와 같은 변형으로서는 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 추가의 작용기 예를 들어, 원하는 작용기를 통합시키는 것을 포함한다. 본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법에 관한 비제한적이고도 예시적인 예로서, 이하에는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대 분자 중합체를 부가하는 것에 초점을 맞추어 기술하고 있으며, 이 경우, 여기에 기술된 조성물, 방법, 기술 및 기법들은 기타 작용기 예를 들어, 상기 나열된 작용기를 부가하기에 적합하다는 사실을 알 것이다[필요에 따라서 적당히 변형할 수 있으며, 당업자는 본원에 개시된 바에 따라서 실시할 수 있음].
다양한 거대 분자 중합체와 기타 분자가 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링되어, 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 특성들을 조정할 수 있으며/있거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 신규한 생물학적 특성들을 제공할 수 있다. 이와 같은 거대 분자 중합체는 비천연 아미노산을 통하여, 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용 치환기를 통하여, 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.
수용성 중합체는 본원에 개시된 폴리펩티드(천연 또는 합성 폴리펩티드), 폴리뉴클레오티드, 다당류 또는 합성 중합체에 통합된 비천연 아미노산과 커플링될 수 있다. 수용성 중합체는 폴리펩티드에 통합된 비천연 아미노산, 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통하여 커플링될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 비천연 아미노산과, 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 천연 생성 아미노산을 포함한다. 생물학적으로 활성인 분자에 친수성 중합체를 공유 결합시키는 방법은, (예를 들어, 생리적 환경에서) 수용성, 생체 이용률, 혈청 내 반감기 및 치료 반감기를 증가시키고, 면역원성 및 생물학적 활성을 조정하거나, 또는 생물학적 활성 분자 예를 들어, 단백질, 펩티드 및 구체적으로 소수성 분자의 순환 시간을 연장하는 수단이 된다. 이와 같은 친수성 중합체의 중요한 부가적 특징으로서는 생체 적합성, 무독성 및 비 면역원성을 포함한다. 바람직하게, 최종 생산 제제를 치료용으로 사용하기 위해서는, 중합체가 약학적으로 허용 가능하여야 할 것이다.
친수성 중합체의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 이의 유사체, 특히, 폴리옥시에틸렌 글리콜(폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG라고도 알려짐); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 다당 및 이의 유도체 예를 들어, 덱스트란 및 덱스트란 유도체 예를 들어, 카복시메틸덱스트란, 황산 덱스트란, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 이의 유도체 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카복시메틸키틴, 카복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알지네이트; 황산콘드로이친; 알부민; 풀루란 및 카복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리 리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르타미드; 말산 무수물 공중합체 예를 들어, 스티렌 말산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 이의 공중합체; 이의 삼량체; 이의 혼합물; 및 상기 중합체의 유도체들. 상기 수용성 중합체는 임의의 구조를 갖는 형태의 것 예를 들어, 선형, 포크형 또는 분지형인 것일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 말단이 약 2∼약 300개인 수용성 중합체 주쇄가 특히 유용하다. 다작용성 중합체 유도체로서는, 각 말단부가 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 결합되어 있는, 2개의 말단부를 가지는 선형 중합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 이 중합체의 분자량은 다양한 범위에 해당할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da 및 약 1,000Da일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 20,000Da이다. 다른 구체예에서, 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 당업자는, 실질적으로 수용성인 주쇄에 대한 상기 나열한 바가 결코 제한적인 것이 아니고 오로지 예시적인 것이며, 또한 전술한 특징을 갖는 모든 중합체 물질은 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용되기에 적당한 것으로 간주함을 알 것이다.
전술한 바와 같이, 친수성 중합체의 일례로서는, 생체 적합성, 무독성 및 비 면역원성이 중요한 의미를 갖는, 약학 분야, 인공 임플란트 및 기타 분야에서 광범위하게 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(약칭 "PEG")을 들 수 있다. 본원에 개시된 중 합체:폴리펩티드에 관한 구체예에서는, 예를 들어, 친수성 중합체로서 PEG를 이용하며, 이때, 다른 친수성 중합체도 상기와 같은 구체예에서 유사하게 이용될 수 있음을 이해해야 할 것이다.
PEG는 시판되고 있으며 널리 공지된 수용성 중합체이거나, 또는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라서 에틸렌 글리콜을 개환 중합 반응시켜 제조될 수 있다[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]. PEG는 통상적으로 투명하고, 무색 및 무취이며, 수용성이고, 열 안정성이며, 다수의 화학 제제에 비활성인 것으로서, 가수 분해 또는 저급화되지 않으며, 일반적으로 무독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체 적합성인 것으로 간주하는데, 즉, PEG는 해를 끼치지 않고서도 살아있는 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비 면역원성으로서, 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향이 있다. PEG가, 체내에서 약간의 원하는 기능을 나타내는 분자 예를 들어, 생물학적으로 활성인 제제에 부착될 때, 이 PEG는 이 제제를 마스킹하여, 임의의 면역 반응을 감소 또는 억제할 수 있으며, 그 결과, 유기체는 제제가 존재함에도 관용할 수 있게 된다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키지 않거나, 또는 응집을 일으키지 않으며 또한 기타 바람직하지 않은 효과도 나타내지 않는 경향이 있다.
"PEG"란 용어는 광범위하게는 크기 또는 PEG 말단부의 변형 여부와는 상관없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 의미로서, 다음과 같은 화학식에 따라서 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 형태로서 나타낼 수 있다:
XO-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2 -Y
[상기 식 중, n은 약 2∼약 10,000이고, X는 H 또는 말단부 변형기 예를 들어, C1∼4알킬, 보호기 또는 말단 작용기임]
상기 PEG라는 용어에는, 임의의 형태의 폴리에틸렌 글리콜 예를 들어, 2 작용성 PEG, 다 분지형(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG(각 사슬의 분자량은 약 1∼약 100kDa, 약 1∼약 50kDa, 또는 약 1∼약 20kDa임), 현수형(pendant) PEG(즉, 중합체 주쇄에 현수하는 하나 이상의 작용기를 보유하는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 분해 가능한 결합을 보유하는 PEG를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, n이 약 20∼약 2000인 PEG는 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용하기 적당하다. 몇몇 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. PEG 중합체의 분자량은 광범위할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 상기 분지쇄인 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da 및 약 1,000Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000∼약 20,000Da이다. 기타 구체예에서, 상기 분지쇄 PEG의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 다양한 PEG 분자에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[쉐어워터 폴리머 인코포레이션(Shearwater Polymers, Inc.) 카탈로그, 넥타 서라퓨틱스(Nektar Therapeutics) 카탈로그]에 개시되어 있다.
기타 문헌에 개시된 말단 작용기의 구체예로서는, 탄산 N-숙신이미딜(예를 들어, 미국 특허 제5,281,698호, 동 제5,468,478호), 아민(예를 들어, Buckmann외 다수, Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky외 다수, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), 하이드라지드(예를 들어, Andresz외 다수, Makromol. Chem. 179:301 (1978)), 프로피온산 숙신이미딜 및 부타논산 숙신이미딜(예를 들어, Olson외 다수, Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; 및 미국 특허 제 5,672,662호), 숙신산 숙신이미딜(예를 들어, Abuchowski외 다수, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) 및 Joppich외 다수, Makromol. Chem. 180:1381 (1979)), 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, 미국 특허 제4,670,417호), 탄산 벤조트리아졸(예를 들어, 미국 특허 제5,650,234호), 글리시딜 에테르(예를 들어, Pitha외 다수, Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling외 다수, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)), 옥시카보닐이미다졸(예를 들어, Beauchamp외 다수, Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli외 다수, J. Controlled Release 1:251 (1985)), 탄산 p-니트로페닐(예를 들어, Veronese외 다수, Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); 및 Sartore외 다수, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), 알데히드(예를 들어, Harris외 다수, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), 미국 특허 제5,824,784호, 미국 특허 제5,252,714호), 말레이미드(예를 들어, Goodson외 다수, Bio/Technology 8:343 (1990), Romani외 다수, Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984) 및 Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), 오르토피리딜-디설파이드(예를 들어, Woghiren외 다수, Bioconj. Chem. 4:314(1993)), 아크릴롤 (예를 들어, Sawhney외 다수, Macromolecules, 26:581 (1993)), 비닐설폰(예를 들어, 미국 특허 제5,900,461호)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 참고 문헌 및 특허는 모두 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 것이다.
몇몇 경우, PEG는 하이드록시 또는 메톡시를 가지는 한쪽 말단부(즉, X가 H 또는 CH3("메톡시 PEG")인 말단부)에서 종결된다. 대안적으로, 상기 PEG는 반응기로 종결될 수 있는데, 이로 인하여, 2 작용성 중합체를 형성할 수 있다. 통상적인 반응기는 20개의 일반적 아미노산에서 살펴볼 수 있는 작용기(예를 들어, 말레이미드기, 활성화된 탄산염(예를 들어, p-니트로페닐 에스테르), 활성화된 에스테르(예를 들어, N-하이드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르) 및 알데히드), 그리고 20개의 일반적 아미노산에 비활성이되, 비천연 아미노산에 존재하는 상보성 작용기(예를 들어, 디아민기 및 디카보닐기)와 특이적으로 반응하는 작용기와의 반응에 일반적으로 사용되는 작용기를 포함할 수 있다.
상기 화학식에서 Y로서 나타낸 PEG의 기타 말단부는 비천연 아미노산을 통하여, 폴리펩티드(합성 또는 천연 폴리펩티드), 폴리뉴클레오티드, 다당류 또는 합성 중합체에 직접적으로나 간접적으로 부착될 것임에 주목해야 할 것이다. Y가 디아민기일 때, 디아민 함유 PEG 시약은 폴리펩티드 내 존재하는 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. Y가 디아민기일 때, 디아민 함유 PEG 시약은 또한 폴리펩티드내에 존재하는 케토알킨 함유 비천연 아미노산과 반응을 하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. Y가 디카보닐기일 때, 디카보닐 함유 PEG 시약은 폴리펩티드내에 존재하는 디아민 함유 비천연 아미노산과 반응하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통하여, 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. Y가 디카보닐기일 때, 디카보닐 함유 PEG 시약은 또한 폴리펩티드내에 존재하는 케토아민 함유 비천연 아미노산과 반응을 하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. Y가 케토알킨기일 때, 케토알킨 함유 PEG 시약은 또한 폴리펩티드내에 존재하는 디아민 함유 비천연 아미노산과 반응을 하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. Y가 케토아민기일 때, 케토아민 함유 PEG 시약은 또한 폴리펩티드내에 존재하는 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응을 하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해 폴리펩티드에 PEG기를 결합시킬 수 있다. 적당한 반응 조건, 정제 방법 및 시약의 예에 관하여는 본원의 명세서 및 첨부 도면에 기술되어 있다. 도 17에는, i) 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 디아민 함유 PEG 시약을 반응시켜, 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG기에 결합시키는 것에 관한 것; ii) 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 디카보닐 함유 PEG 시약을 반응시켜, 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG기에 결합시키는 것에 관한 것; 그리고 iii) 케토알킨 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 디아민 함유 PEG 시약을 반응시켜, 복소환 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG기에 결합시키는 것에 관한 것에 관하여 도시되어 있다. 뿐만 아니라, 도 23에는, 단백질 PEG화의 비 제한적인 예에 관하여 도시되어 있는데, 여기서, 디아민 함유 PEG 시약은 단백질에 통합되어 있는 디카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응을 하여, 복소환 결합을 형성한다.
본원에 개시된 조성물, 방법, 기술 및 기법에 사용될 수 있는 PEG 시약의 유형과 부류에 제한되지 않고 오로지 예만을 들었을 때, 도 18에는, 디아민 함유 PEG 시약, 또는 디아민 함유 PEG 시약의 보호형, 또는 디아민 함유 PEG 시약의 마스킹형을 형성하는 합성 방법에 관한 일례가 도시되어 있다. 뿐만 아니라, 도 19에는, 디카보닐 함유 PEG 시약, 또는 디카보닐 함유 PEG 시약의 보호형, 또는 디카보닐 함유 PEG 시약의 마스킹형을 형성하는 합성 방법에 관한 일례가 도시되어 있다. 또한, 도 20에는, 2 작용성 PEG 시약, 또는 2 작용성 PEG 시약의 보호형, 또는 2 작용성 PEG 시약의 마스킹형을 형성하는 합성 방법에 관한 일례가 도시되어 있으며, 도 21에는 2 작용성 링커, 또는 2 작용성 링커의 보호형, 또는 2 작용성 링커의 마스킹형을 형성하는 합성 방법에 관한 일례가 도시되어 있다. 뿐만 아니라, 도 22에는 3 작용성 PEG 시약, 또는 3 작용성 PEG 시약의 보호형, 또는 3 작용성 PEG 시약의 마스킹형을 형성하는 합성 방법에 관한 일례가 도시되어 있다.
이종 2 작용성 유도체는 또한 그것이 중합체의 각 말단부에 상이한 분자를 결합시키는 것이 바람직할 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자기 예를 들어, 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 탄산염 등을 보유하는 분자를 PEG의 한쪽 말단에 결합시키고, 아세틸렌기를 보유하는 분자는 PEG의 다른 쪽 말단에 결합시킬 수 있다.
몇몇 구체예에서, 친핵체(예를 들어, 디아민)은 비천연 아미노산 내에 존재하는 디카보닐기와 반응하여, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성할 수 있는데, 몇몇 경우에 있어서는 적당한 제제로 처리함으로써 추가의 반응이 진행될 수 있다. 대안적으로, 친핵체는 비천연 아미노산을 통하여 폴리펩티드에 통합되어, 수용성 중합체에 존재하는 디카보닐기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단부는 비천연 아미노산과의 반응에 유용하다.
그러므로, 몇몇 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, 비천연 아미노산의 측쇄를 통하여, 수용성 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된다. 본원에 개시된 비천연 아미노산을 이용하는 방법과 조성물을 통하여, PEG 유도체로 단백질을 선택적으로 변형시키는 고효율의 방법을 제공하는데, 이 방법은 셀렉터 코돈에 따라서 비천연 아미노산 예를 들어, 20개의 천연 상태에서 통합되는 아미노산에서는 살펴볼 수 없는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 단백질에 선택적으로 통합한 후, 적당한 반응성 PEG 유도체로 이 아미노산을 변형시키는 단계를 포함한다. 공지의 다양한 화학적 방법은 본원에 개시된 비천연 아미노산을 이용하는 방법과 조성물을 이용하여 수용성 중합체를 단백질에 통합하는데 적당하다.
중합체 주쇄는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 주쇄는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 분지형 중합체는 중앙 분지 중심부와, 이 중앙 분지 중심부에 결합되어 있는 다수의 선형 중합체 사슬을 갖는다. PEG는 산화 에틸렌을 다양한 폴리올 예를 들어, 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트롤 및 소르비톨에 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지형으로서 사용된다. 중앙 분지부는 또한 몇몇 아미노산 예를 들어, 리신으로부터 유래할 수도 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)m[식 중, R은 중심부 예를 들어, 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유래되고, m은 팔의 갯 수임]으로 나타낼 수 있다. 다 분지형 PEG 분자 예를 들어, 미국 특허 제5,932,462호, 동 제5,643,575호; 동 제5,229,490호; 동 제4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259 (각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시된 것들도 중합체 주쇄로 사용될 수 있다.
분지형 PEG는 또한 PEG(-YCHZ2)n [식 중, Y는 결합기이고, Z는 일정한 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화 말단기임]으로 나타낼 수 있는 포크형 PEG의 형태를 가질 수도 있다. 또 다른 분지형인, 현수형 PEG는 PEG 사슬의 말단부보다는 PEG 주쇄를 따라서, 반응기 예를 들어, 카복실기를 가진다.
이와 같은 형태의 PEG 이외에, 중합체는 또한 주쇄 내 약하거나 분해 가능한 결합을 포함하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수 분해될 수 있는 중합체 주쇄에 에스테르 결합을 포함하도록 제조될 수 있다. 이하에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수 분해 결과, 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단할 수 있다:
-PEG-CO 2 -PEG-+H 2 O → PEG-CO 2 H+HO-PEG-
폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG란 용어는 당업계에 공지된 모든 형태의 것 예를 들어, 본원에 개시된 모든 형태의 것들을 나타내고 또한 이것들을 포함하는 의미라는 사실은 당업자에 의해 이해될 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da일 수 있는데, 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 약 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
PEG의 원하는 특성을 최대화하기 위해, 생물학적으로 활성인 분자에 부착된 PEG 중합체(들)의 총 분자량과 수화 상태는, 모 분자의 생물학적 활성에 악영향을 미치지 않으면서, 통상적으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특징 예를 들어, 강한 수용성을 부여하고 순환 반감기를 연장시키기에 충분히 커야 한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 실질적으로 동종인 중합체:단백질 접합체 제제를 생산하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "실질적으로 동종"이란, 중합 체:단백질 접합체 분자가 전체 단백질의 절반보다 크게 관찰되는 경우를 의미한다. 상기 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본원에 제공된 "실질적으로 동종인" PEG화 폴리펩티드 제제는 동종 제제의 이점 예를 들어, 할당 대 할당(lot to lot) 약물 동력학적 임상 분석에 있어서 예측 가능성을 제공하기 쉽다는 점을 나타내기에 충분히 동종인 제제이다.
또한, 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택함에 있어서 본원에 제공된 이점은, 상기 혼합물에 포함된 단일 중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 점이다. 그러므로, 원하는 경우, 결합된(즉, 이중, 삼중 및 사중으로 결합된) 중합체 부분을 다수 포함하는 다양한 단백질 혼합물을 제조할 수 있으며, 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 상기 접합체와 단일 중합체:단백질 접합체를 화합할 수 있을 뿐만 아니라, 단일 중합체:단백질 접합체를 소정의 비율로 포함하는 혼합물을 얻을 수도 있다.
폴리에틸렌 글리콜 분자 대 단백질 분자의 비율은, 반응 혼합물 중 농도와 마찬가지로, 다양할 것이다. 일반적으로, 최적 비율(반응의 효율 면에 있어서, 최소 과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 존재하는 경우)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량과 사용 가능한 반응기의 수에 의하여 결정될 수 있다. 분자량과 관련하여, 통상적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적어진다. 이와 유사하게, 이와 같은 매개 변수들을 최적화할 경우, 중합체가 분지화된다는 것을 고려하여야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지가 많을수록), 중합체:단백질 비율이 높아진다.
본원에서 사용된 친수성 중합체:폴리펩티드/단백질 접합체를 고려할 때, "치료학적 유효량"이란 용어는 또한, 환자에게 원하는 효과를 증진시키는 양을 의미하기도 한다. 상기 양은 개인차가 있으며, 다수의 인자 예를 들어, 환자의 전체적인 건강 상태와 치료될 질병, 질환 또는 병상의 잠재적 소인에 따라서도 달라질 것이다. 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량은 공중이 입수 가능한 물질과 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)는, 변경된(예를 들어, 증가 또는 감소된) 약리학적, 약물 동태학적 또는 약력학적 특징 예를 들어, 생체 내 반감기를 제공하도록 조정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드의 반감기는 변형되지 않은 폴리펩티드에 비하여, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 50배 이상, 또는 약 100배 이상 증가한다.
하나의 구체예에서, 카보닐 또는 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 주쇄에 직접적으로 결합되어 있는 말단 디아민부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다. 다른 구체예에서, 케토알킨 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 주쇄에 직접 결합되어 있는 말단 디아민부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
몇몇 구체예에서, 상기 디아민-말단 PEG 유도체는 다음과 같은 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) m -CH 2 -NH-NH 2
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, m은 약 2∼약 10이며, n은 약 100∼약 1,000임(즉, 평균 분자량은 약 5∼약 40kDa임)]. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
하나의 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, PEG 주쇄에 직접 결합되어 있는 말단 케토아민부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
몇몇 구체예에서, 상기 케토아민-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO -( CH 2 CH 2 O ) n -O-( CH 2 ) m -C(O)- CH 2 - NH 2
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, m은 약 2∼약 10이며, n은 약 100∼약 1,000임(즉, 평균 분자량은 약 5∼약 40kDa임)]. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 디아민 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 주쇄에 직접 결합되어 있는 말단 디카보닐부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다. 다른 구체예에서, 케토아민 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 주쇄에 직접 결합되어 있는 말단 디카보닐부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
몇몇 구체예에서, 디카보닐-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) 2 -NH-C(O)(CH 2 ) m -C(O)-CH 2 -C(O)-R
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, m은 약 2∼약 10이며, n은 약 100∼약 1,000임(즉, 평균 분자량은 약 5∼약 40kDa임)]. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 디아민 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 주쇄 에 직접 결합되어 있는 말단 케토알킨부를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
몇몇 구체예에서, 케토알킨-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) 2 -NH-C(O)(CH 2 ) m -C(O)-C≡C-R
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, m은 약 2∼약 10이며, n은 약 100∼약 1,000임(즉, 평균 분자량은 약 5∼약 40kDa임)]. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 카보닐 또는 디카보닐 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 디아민부를 함유하는 분지형 PEG(여기서, 분지형 PEG의 각 사슬의 MW는 약 10∼약 40kDa이고, 다른 구체예에서는 약 5∼약 20kDa임)로 변형된다. 분지형 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 디카보닐부를 함유하는 분지형 PEG 유도체로 변형된다. 이 분지형 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 케토아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 디카보닐부를 함유하는 분지형 PEG 유도체로 변형된다. 이 분지형 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 케토알킬 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 디아민부를 함유하는 분지형 PEG 유도체로 변형된다. 이 분지형 중합체의 분자량은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 약 100∼약 100,000Da 또는 그 이상일 수 있다. 이 중합체의 분자량은 약 100∼약 100,000Da 예를 들어, 약 100,000Da, 약 95,000Da, 약 90,000Da, 약 85,000Da, 약 80,000Da, 약 75,000Da, 약 70,000Da, 약 65,000Da, 약 60,000Da, 약 55,000Da, 약 50,000Da, 약 45,000Da, 약 40,000Da, 약 35,000Da, 약 30,000Da, 약 25,000Da, 약 20,000Da, 약 15,000Da, 약 10,000Da, 약 9,000Da, 약 8,000Da, 약 7,000Da, 약 6,000Da, 약 5,000Da, 약 4,000Da, 약 3,000Da, 약 2,000Da, 약 1,000Da, 약 900Da, 약 800Da, 약 700Da, 약 600Da, 약 500Da, 약 400Da, 약 300Da, 약 200Da 및 100Da일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 2,000∼약 50,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000∼약 40,000Da이다. 몇몇 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000∼약 40,000Da이다.
다른 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 디아민기를 함유하는 상기 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) m -CH 2 -NH-NH 2
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
다른 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 케토아민기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) m -C(O)-CH 2 -NH 2
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
다른 구체예에서, 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 디카보닐기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) 2 -NH-C(O)(CH 2 ) m -C(O)-CH 2 -C(O)-R
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
다른 구체에에서, 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분 지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 케토알킨기를 함유하는 상기 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) 2 -NH-C(O)(CH 2 ) m -C(O)-C≡C-R
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
다른 구체예에서, 케토아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 디카보닐기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
R0-(CH 2 CH 2 0) n -O-(CH 2 ) 2 -NH-C(O)(CH 2 ) m -C(0)-CH 2 -C(0)-R
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
다른 구체예에서, 케토알킬 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 디아민기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 가질 것이다:
RO-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) m -CH 2 -NH-NH 2
[식 중, R은 간단한 알킬(메틸, 에틸 및 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 약 2∼약 10이고, n은 약 100∼약 1,000임]
PEG의 작용기화 및 접합에 관한 몇몇 문헌 및 전공 논문을 입수할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong외 다수, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado외 다수, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조하시오.
중합체를 활성화하는 방법에 관하여는 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호 및 WO 93/15189에서 찾아볼 수 있으며, 활성화된 중합체와 효소 예를 들어, 응고 인자 VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 과산화물 디스뮤타제(Veronesedhl 다수, App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985) 사이의 접합에 관하여도 공지되어 있다[상기 인용된 모든 참고 문헌과 특허는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있음].
필요할 경우, 소수성 크로마토그래피를 통하여 얻어지는, 본원에 개시된 PEG화 비천연 아미노산 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 하나 이상의 방법 예를 들어, 친화성 크로마토그래피; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, DEAE 세파로스 사용); 실리카상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과법(예를 들어, 세파덱스 G-75 사용); 소수성 상호 작용 크로마토그래피; 크기별 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외 여과법/다이아필터링; 에탄올 침전법; 황산 암모늄 침전법; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전 초법), 분별 용해도법(예를 들어, 황산 암모늄 침전법) 또는 추 출에 의해 추가로 정제될 수도 있다. 겉보기 분자량은 GPC에 의해서, 구상 단백질 표준과 비교함으로써 측정될 수 있다[Preneta, AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306]. (비천연 아미노산 폴리펩티드):PEG 접합체의 순도는 단백 분해(예를 들어, 트립신 분해) 수행 후, 질량 분광 분석법을 실시함으로써 평가될 수 있다[Pepinsky R.B.외 다수, J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)].
본원에 개시된 폴리펩티드의 비천연 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 제한되지 않고 추가로 유도체화 또는 치환될 수 있다.
G. 혈청 알부민에 대한 친화성의 강화
다양한 분자들이 또한 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 융합되어 혈청 중 반감기를 조정할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분자들은 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합 또는 융합될 수 있으며, 이로써 동물 체내 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성이 강화될 수 있다.
예를 들어, 몇몇 경우에 있어서, 폴리펩티드 및 알부민 결합 서열의 재조합 융합체도 제조된다. 대표적인 알부민 결합 서열로서는 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유래된 알부민 결합 도메인[예를 들어, Makrides외 다수, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) 및 Sjolander외 다수, J Immunol. Methods 201:115-123 (1997) 참조], 또는 문헌[예를 들어, Dennis외 다수, J. Biol. Chem. 277(1):35035-35043 (2002)]에 개시된 바와 같은 알부민-결합 펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 몇몇 경우에 있어서, 지방산은 혈청 알부민과의 결합을 촉진한다. 예를 들어, 문헌[Kurtzhals외 다수, Biochem. J. 312:725-731 (1995)]을 참조하시오.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 직접적으로 융합된다. 당업자들은 기타 다양한 분자들도 본 발명의 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하여 혈청 알부민 또는 기타 혈청 성분과의 결합을 조정할 수 있음을 알게 될 것이다.
H. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화
본원에 개시된 방법 및 조성물은 당 잔기들을 보유하는 하나 이상의 비천연 아미노산이 통합되어 있는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 당 잔기들은 천연의 것(예를 들어, N-아세틸글루코사민) 또는 비천연의 것(예를 들어, 3-플루오로갈락토스)일 수 있다. 상기 당은 N- 또는 O-결합 글리코시드 결합(예를 들어, N-아세틸갈락토스-L-세린), 또는 비천연 결합(예를 들어, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환, 결합, 또는 상응하는 C- 또는 S-결합 글리코시드)에 의해 비천연 아미노산에 결합될 수 있다.
당(예를 들어, 글리코실) 부분은 생체 내 또는 시험관 내에서 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 디카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 디아민기로 유도체화된 당으로 변형되어, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해, 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 다른 구체예에서, 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 디카보닐기로 유도체화된 당으로 변형되어, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 통해, 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 생성한다. 당이 일단 비천연 아미노산에 부착되면, 이 당은 글리코실트랜스퍼라제 및 기타 효소 처리에 의해 추가로 조작되어, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 올리고당으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[H. Liu외 다수 J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조하시오.
I. 결합 기 예를 들어, 폴리펩티드 이량체 및 다량체의 사용 방법 및 사용 분야
작용기를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 직접 부가하는 것 이외에, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분은 우선, 추후 추가로 변형되는 다작용성(예를 들어, 2 작용성, 3 작용성 및 4 작용성) 링커로 변형될 수 있다. 즉, 다작용성 링커 분자의 하나 이상의 말단은 폴리펩티드 내 하나 이상의 비천연 아미노산과 반응하며, 다작용성 링커의 하나 이상의 말단은 추가로 작용기화될 수 있다. 만일, 다작용성 링커의 말단 전부가 동일하면, (화학량론적 조건에 따라서) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종 다량체가 형성될 수 있다. 만일, 다작용성 링커의 말단의 화학 반응성이 분명하면, 다작용성 링커기의 하나 이상의 말단은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합될 것이고, 또한 기타 말단은 상이한 작용기 예를 들어, 원하는 작용기와 추후 반응할 수 있다.
상기 다작용성 링커기는 다음과 같은 화학식을 가진다:
Figure 112008047567393-PCT00162
[식 중,
X는 각각 독립적으로-J-R, -K-R, -G-C≡C-R 또는 -C(O)-CH2-NR2이고;
여기서, 상기 J는
Figure 112008047567393-PCT00163
이며;
여기서, R8은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되고;
R9는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 또는 아민 보호기로부터 독립적으로 선택되며;
T1은 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌 또는 임의로 치환된 헤테로알킬이고;
T2는 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치 환된 헤테로알킬, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이며;
여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌으로부터 선택되고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이며;
K는
Figure 112008047567393-PCT00164
Figure 112008047567393-PCT00165
이고;
G는
Figure 112008047567393-PCT00166
이며;
R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
T1 및 T2는 독립적으로 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이며;
L 및 M은 독립적으로 결합, H, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이거나, 또는 L 및 M은 함께, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;
T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며;
T4는
Figure 112008047567393-PCT00167
으로서,
여기서, X1은 각각 독립적으로 -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)- 및 -N(OMe)-로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 -OR', -OAc, -SR, -N(R')2, -N(R')(Ac), -N(R')(OMe) 또는 N3이며;
L은 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되 고;
L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, p는 0, 1 또는 2임)이며;
W는 -J-R, -K-R, -G-C=C-R 또는 -C(O)-CH2-NR2이고;
n은 1∼3임].
도 20에는 2개의 동일한 말단부(즉, 디아민기)를 가지는, 2 작용성 동종 링커의 예시적인 합성 방법에 관하여 도시되어 있다. 이러한 링커는 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종 이량체를 형성하여, 2개의 복소환 결합을 형성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 만일 이와 같은 링커의 한쪽 말단부가 보호되면, 부분적으로 보호된 링커는, 탈 보호 이후 추가의 결합 반응을 수행할 수 있는 기타 보호 말단부를 이탈하는 복소환 결합을 통하여, 보호되지 않은 디아민 말단부를 디카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 시약의 화학량론적 특성을 잘 조정하면, 원하는 이종 이량체가 일부 동종 이량체와 혼합될 가능성이 있음에도 불구하고, 유사한 결과물(이종 이량체)을 얻을 수 있다.
도 24에는 2 작용성 동종 링커를 통하여 2개의 단백질을 커플링시키는, 예시적인 단백질 이량체화(여기서, 상기 링커는 PEG 링커임)에 관하여 도시되어 있다.
도 21에는 2개의 상이한 말단부(예를 들어, 디아민기와 하이드록실 아민기)를 가지는 이종 2 작용성 링커의 예시적인 합성 방법에 관하여 도시되어 있다. 뿐 만 아니라, 도 25 및 도 27에는 다단계 합성법에서 비천연 아미노산 폴리펩티드에 PEG기를 부착시키는데 이종 2 작용성 링커를 사용하는 것에 관한 일례에 관하여 도시되어 있다. 도면에 도시한 바와 같이, 제1 단계에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하이드록실아민 함유 2 작용성 링커와 반응하여, 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성한다. 그러나, 2 작용성 링커는 제2 단계에서 디카보닐 함유 PEG 시약과 반응하여, 복소환 결합을 통해 PEG화 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는, 디아민 작용기를 여전히 보유한다.
도 22에는 3개의 작용기 예를 들어, 하나의 디아민기와 2개의 하이드록실기를 가지는, 3 작용성 링커의 예시적인 합성 방법에 관하여 도시되어 있다. 뿐만 아니라, 도 26에는 다단계 합성법에 있어서 비천연 아미노산 폴리펩티드 이량체에 PEG기를 부착시키는데 3 작용성 링커를 사용하는 것에 관한 일례에 관하여 도시되어 있다. 도면에 도시한 바와 같이, 제1 단계에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 3 작용성 링커의 하이드록실아민부와 반응을 하여, 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 이량체를 형성한다. 그러나, 3 작용성 링커는 디카보닐 함유 PEG 시약과 2단계로 반응을 하여, 복소환 결합을 가지는 PEG화 비천연 아미노산 폴리펩티드 이량체를 형성하는, 디아민 작용기를 여전히 보유한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 또한 폴리펩티드 조합체 예를 들어, 동종 이량체, 이종 이량체, 동종 다량체 또는 이종 다량체(즉, 삼량체 및 사량체 등)를 제공하기도 한다. 예를 들어, 이하 기술될 사항은 GH 초 유전자군의 일원에 초점을 맞춘 것이지만, 본 섹션에 기술된 방법, 기술 및 조성물은 이량체 및 다량체의 형 태로서 효능을 제공할 수 있는 임의의 기타 폴리펩티드 예를 들어, 원하는 폴리펩티드에 실질적으로 적용될 수 있다.
그러므로, 본원에 개시된 방법, 기술 및 조성물에서는, 하나 이상의 비천연 아미노산이 다른 GH 초 유전자군의 일원 또는 이의 변이체에 결합되어 있는 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드이거나, 또는 GH 초 유전자군의 일원이 아닌 기타 임의의 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 링커를 통하여 폴리펩티드 주쇄에 직접 결합되어 있다. 단량체에 비하여 분자량이 크므로, GH 초 유전자군의 일원으로 이루어진 이량체 또는 다량체 접합체는, 단량체 GH 초 유전자군의 일원에 비하여, 새롭거나 또는 원하는 특성 예를 들어, 상이한 약리학적, 약물 동태학적, 약력학적 특성을 나타낼 수 있거나, 또는 치료 반감기나 혈장 반감기가 조정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 GH 초 유전자군 일원의 이량체는, 수용체의 이량체화를 조정할 것이다. 다른 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GH 초 유전자군 일원의 이량체 또는 다량체는 GH 초 유전자군 일원 수용체의 길항제, 작동제 또는 조정제로서 작용할 것이다.
몇몇 구체예에서, 상기 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드는 직접적으로, 예를 들어, Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 이황화 결합을 통하여 결합 된다. 몇몇 구체예에서, 결합형 GH 초 유전자 군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원은 이량체화를 촉진하는 상이한 비천연 아미노산 예를 들어, 제1 GH 초 유전자군 일원 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군 일원, 즉, 디카보닐 함유 비천연 아미노산이, 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 제2의 GH 초 유전자군 일원 폴리펩티드에 접합된 폴리펩티드의 이량체화를 촉진하는 상이한 비천연 아미노산을 포함할 것이며, 이 폴리펩티드는 상응하는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성함으로써 반응하게 된다.
대안적으로, 상기 2개의 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원은 링커에 의해 결합된다. 임의의 이종- 또는 동종-2 작용성 링커가 상기 2개의 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드를 결합하는데 사용될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 동일하거나 또는 상이한 1차 서열을 가질 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드 및/또는 결합형 비-GH 초 유전자군의 일원인 폴리펩티드를 묶어주는데 사용된 링커는 모두 2 작용성 PEG 시약일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 아령 모양의 구조를 갖는 수용성 2 작용성 링커를 제공하는데, 이 링커는 a) 중합체 주쇄의 적어도 첫 번째 말단부에 아지드, 알킨, 히드라진, 디아민, 하이드라지드, 하이드록실아민 또는 카보닐(예를 들어, 디카보닐) 함유부를 포함하고; b) 중합체 주쇄의 두 번째 말단에는 적어도 제2 작용기를 포함한다. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 비 반응성이다. 몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 분지형 분자 구조 중 하나 이상의 팔을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 다음의 구조를 갖는 수용 성 활성화 중합체와의 반응에 의해 형성되는 하나 이상의 GH 초 유전자군 일원을 포함하는 다량체를 제공한다:
R-(CH 2 CH 2 O) n -O-(CH 2 ) m -X
[식 중, n은 약 5∼약 3,000이고, m은 약 2∼약 10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 디아민, 하이드라지드, 하이드록실아민, 아세틸 또는 카보닐(예를 들어, 디카보닐) 함유부일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑기, 작용기 또는 이탈기임].
R은 예를 들어, 하이드록실, 보호 하이드록실, 알콕실, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 탄산N-하이드록시숙신이미딜, 탄산 1-벤조트리아졸릴, 아세탈, 알데히드, 수화 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호 아민, 하이드라지드, 보호 하이드라지드, 보호 티올, 카복실산, 보호 카복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트 및 트레실레이트, 알켄 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기일 수 있다. 추가의 구체예에서, 링커기는 전사 인자를 결합하는데 사용될 수 있다. 유전자는 암호화된 단백질의 발현을 효과적으로 개시하는데 다수의 전사 인자를 필요로 한다. 비천연 아미노산으로 합성된 전사 인자는 전술한 바와 같은 링커를 통하여 결합될 수 있으며, 또한 표적화된 유전자의 인공 활성화를 강화하는데 사용될 수 있다. 결합된 전사 인자는 표적 DNA에 결합할 수 있으며, 정상적인 활성화 신호 케스케이드가 진행되지 않을 경우 RNA 중합 효소의 보충 과정을 촉진하므로, 필요한 신호 없이도 유전자를 발현할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포 수용체에 대한 리간드는 수용체를 효율적으로 활성화하기 위하여 결합시킬 수 있다. 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)는 이량체를 형성하여, 그것의 수용체와 결합한다. 비천연 아미노산을 함유하는 PDGF는 전술한 바와 같이 링커를 통하여 이량체를 형성하도록 결합될 수 있으며, 또한 PDGF 수용체를 효율적으로 결합시키도록 투여될 수도 있다. 결합된 단백질의 또 다른 구체예로서는 결합된 항체를 포함한다. 2개의 상이한 항체(이 항체는 각각 동일하거나 인접한 표적 상에 존재하는 독특한 에피토프에 특이적임)가 결합하면, 자극, 결합 또는 중화가 강화될 수 있다. 예를 들어, gp120에서 발견되며, HIV의 gp40과 결합하는 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 항체가 결합하면, 표적의 중화를 더욱 효율적으로 만들 수 있다. 이와 유사하게, 결합된 항체는 세포 표면 수용체를 자극하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체의 CD3 및 CD4에 대한 항체는 수용체의 활성화에 필요한 자극을 제공하기 위해 결합될 수 있다. 추가의 구체예로서는 핵산에 결합된 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 세포 표면과 결합하는 세포 수용체 또는 단백질에 대한 리간드는 원하는 표적에 투여되는 치료용 핵산에 결합될 수 있다. 결합된 리간드는 이후에 세포 내에서 발현되는 핵산을 흡수하는 것을 촉진하여, 그것의 치료 효과를 얻을 수 있다. 이와 유사하게, 펩티드는 핵산에 결합되어, 핵산의 팩키징(packaging) 또는 응축을 촉진할 수 있다.
링커 상의 작용기는 동일하여서도 안되고, 디아민기이어서도 안된다. 본 명 세서에 기술된 화학 원리를 이용하여, 당업자는 하나 이상의 작용기가 비천연 아미노산 폴리펩티드와 함께 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환기를 형성할 수 있도록 링커를 디자인할 수 있었으며; 링커 상의 다른 작용기는 공지된 다른 화학 원리 예를 들어, 유기 화학 분야에 널리 공지된 친핵체/친전자체를 바탕으로 하는 화학 원리를 이용할 수 있었다.
J. 작용기 부가 예: 폴리펩티드 분리 특성의 용이화
천연 생성 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 여러 가지 이유[예를 들어, 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특성]로 인하여 시료로부터 분리하는데 어려움을 겪을 수 있다. 예를 들어, 치료용 폴리펩티드를 제조함에 있어서, 이와 같은 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 과다 생산하도록 조작된 재조합체 시스템으로부터 분리될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특성으로 인하여, 원하는 수준의 순도로 얻어내는 것이 종종 어려운 것으로 판단된다. 본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법은 이러한 문제점에 대한 해결책을 제공한다.
본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법을 사용함에 있어서, 당업자는 원하는 폴리펩티드에 상동성인 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 질소 함유 복소환과 같은 복소환을 생산할 수 있는데, 여기서, 상기 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 분리 특성이 개선된 것이다. 하나의 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의해 생산된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 본원에 개시된 비천연 아 미노산중 어느 하나의 구조체에 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 통합되며, 또한 위치 특이적으로 통합되기도 한다.
하나의 구체예에서, 생성된 비천연 아미노산(생합성에 의해 생성된 비천연 아미노산)은 이미 분리 특성이 개선되었다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 분리 특성을 개선하는 기에 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 제공한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 추가로 변형되어, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 변형된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성하는데, 여기서, 상기 변형을 통하여는 분리 특성을 개선하는 기에 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접 결합되고, 다른 구체예에서, 이러한 기는 링커기를 통하여 비천연 아미노산에 결합된다. 임의의 구체예에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비천연 아미노산에 결합되고, 다른 구체예에서, 이러한 기를 비천연 아미노산에 결합시키는데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게, 분리 특성을 개선하는 기는, 적용된 반응 조건 하에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드 내 비천연 아미노산에 위치 특이적으로 결합하지만, 천연 생성 아미노산과는 결합하지 않는다.
추가의 측면은 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하기 화학식 XXXVIII 또는 화학식 XXXIX의 구조를 갖는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 활성 대사산물, 염 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물을 유효량 투여하는 단계를 포함한다:
화학식 XXXVIII
Figure 112008047567393-PCT00168
화학식 XXXIX
Figure 112008047567393-PCT00169
[식 중,
A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단이 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
Z1은 결합, CR7R7, O, S, NR', CR7R7-CR7R7, CR7R7-O, 0-CR7R7, CR7R7-S, S-CR7R7, CR7R7-NR', NR'-CR7R7이고;
Z2는 결합, -C(O)-, -C(S)-, 임의로 치환된 C1∼C3알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C3알케닐렌 및 임의로 치환된 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R6 및 각각의 R7은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케 닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
2개의 인접한 임의의 R7은 함께, 임의로 치환된 5∼8원 복소환, 시클로알킬 또는 아릴 고리를 형성하는데; 여기서, 상기 임의의 치환기들은 할로겐, OH, C1∼6알킬, C1∼6알콕시, 할로-C1∼6알킬, 할로-C1∼6알콕시, 아릴, 할로아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
단, Z1과 Z2는 3개 이하의 고리 원자를 제공하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되 는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 폴리펩티드 내 특정 위치에 통합되어 있다. 다른 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 통합된다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 번역 후 변형 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 통합된다. 다른 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 다음의 것들을 포함한다:
(i) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 비천연 아미노산이 통합될 예정 위치에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
(ii) 비천연 아미노산을 포함하고, 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만 큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 시스템 내에서 생산된 mRNA이다. 추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 DNA 또는 파지 DNA 또는 게놈 DNA를 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA에 안정하게 통합된다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 직교 tRNA와 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소를 포함한다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만 큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드는 리보좀에 의해 합성된다. 또 다른 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 다음과 같은 유기체 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 생체 내 번역 시스템이다: 원핵 생물, 진핵 생물, 포유동물, 에스케리챠 콜라이, 슈도모나스 종, 진균, 효모, 고세균, 진정 세균, 식물, 곤충 및 원생 생물.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 또는 진핵 생물 세포로부터 유래하는 세포 추출물을 포함하는 시험관 내 번역 시스템이다. 추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드의 비천연 아미노산은 pH 약 2∼약 8인 수용액 중에서 약 1개월 동안 안정하다. 추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 약 2주 이상 동안 안정하다. 추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 약 5일 이상 동안 안정하다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드들로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동성인 단백질이다.
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 하기 화학식 XLI 또는 화학식 XLII의 구조를 가진다:
화학식 XLI
Figure 112008047567393-PCT00170
화학식 XLII
Figure 112008047567393-PCT00171
[식 중,
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)N(R')2, -OR', -C(O)R' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
추가의 구체예는 환자의 체내에 폴리펩티드가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 비천연 아미노산은 다음의 구조를 가진다:
Figure 112008047567393-PCT00172
추가의 또는 부가의 구체예에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 초 유전자군의 일원과 상동성이지만, 본 섹션에 기술된 방법, 기술 및 조성물은 실질적으로, 분리 특성이 개선됨으로 말미암아 이익을 얻을 수 있는 임의의 기타 폴리펩티드 예를 들어, 원하는 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 분리 특성을 개선하는 기는 폴리펩티드의 수용성도 개선하며; 다른 구체예에서, 이러한 기는 폴리펩티드의 결합 특성도 개선하고; 다른 구체예에서, 이러한 기는 폴리펩티드에 신규의 결합 특성을 제공한다[예를 들어, 바이오틴기 또는 바이오틴-결합기]. 이러한 기가 폴리펩티드의 수용성을 개선하는 하나의 구체예에서, 상기 기는 본원에 개시된 수용성 중합체 예를 들어, 본원에 개시된 PEG 중합체기 중 임의의 기로부터 선택된다.
K. 작용기 부가 예: 폴리펩티드의 존재 여부의 검출
천연 생성 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 여러 가지 이유[예를 들어, 폴리펩티드에 용이하게 결합하는 시약 또는 표지의 부재]로 인하여, 시료(예를 들어, 생체 내 시료 및 시험관 내 시료)로부터 검출하는데 어려움을 겪을 수 있다. 본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법은 이러한 문제점에 대한 해결책을 제공한다.
본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법을 사용함에 있어서, 당업자는 원하는 폴리펩티드에 상동성인 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 질소 함유 복소환과 같은 복소환을 생산할 수 있는데, 여기서, 상기 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생체 내 시료 및 시험관 내 시료 중 폴리펩티드를 검출할 수 있도록 만든다. 하나의 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의하여 생산된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 본원에 개시된 비천연 아미노산 중 하나의 구조에 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 통합될 뿐만 아니라, 위치 특이적으로도 통합된다.
하나의 구체예에서, 생합성에 의해 생산된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이미 원하는 검출 특징을 갖는 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 카보닐 함유 비천연 아미노산, 디카보닐 함유 비천연 아미노산, 디아민 함유 비천연 아미노산, 케토아민 함유 비천연 아미노산, 케토알킨 함유 비천연 아미노산 및 검출 특성을 개선하는 아미노산을 함유하는 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 이와 같은 비천연 아미노산은 본원에 개시된 바와 같이 폴리펩티드에 생합성에 의해 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼화학식 LXVII의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 검출 특성을 개선하는 기에 대한 복소환 결합을 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 추가로 변형되어, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 변형된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성하는데, 여기서, 상기 변형으로 말미암아, 검출 특성을 개선하는 기에 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접 결합되며, 다른 구체예에서, 이러한 기는 링커기를 통해 비천연 아미노산에 결합된다. 임의의 구체예에서, 이러한 기는 단일의 화학 반응에 의해 비천연 아미노산에 결합되며, 다른 구체예에서는, 이러한 기를 비천연 아미노산에 결합시키는데에는 일련의 화학 반응을 필요로 한다. 바람직하게, 검출 특성을 개선하는 기는, 적용된 반응 조건 하에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드 내에 존재하는 비천연 아미노산에 위치 특이적으로 결합되며, 또한 천연 생성 아미노산에는 결합되지 않는다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 초 유전자군의 일원과 상동성이지만, 본 섹션에 기술된 방법, 기술 및 조성물은 실질적으로, 생체 내 시료 및 시험관 내 시료 중에서 검출되어야 하는 임의의 기타 폴리펩티드 예를 들어, 원하는 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 검출 특성을 개선하는 기는, 표지; 염료; 친화성 표지; 광친화성 표지; 스핀 표지; 형광단; 방사성 부분; 중원자 통합부; 동위 원소 표지화 부분; 생물 물리학적 프로브; 인광기; 화학 발광기; 전자 조밀기; 자성기; 발색단; 에너지 전이제; 검출 표지; 및 이의 임의의 조합체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, 항체는 방사성 표지를 함유하도록 조작되며, 이 항체는 암 세포 상에 존재하는 독특한 항원을 인지한다. 방사성 표지는 항체 내에 위치하는 비천연 아미노산에 부착된다. 비천연 아미노산을 통하여 항체를 방사성 표지로 표지화하고, 이 표지화된 항체를 정제한 후, 표지화된 항체에 의해 인지될 수 있는, 암이 발병한 것으로 의심되는 개체에게 상기 항체를 투여한다. 표지화된 하체를 투여한 후, 환자의 체내에서, 표지화된 항체의 존재 여부와 그 위치를 확인함으로써, 암 조직의 존재 여부를 알아낼 수 있다. 당업자는 이 시스템을 사용하여 검출용으로서 적당한 항원과 암 세포 유형을 확인할 수 있다. 이와 유사하게, 당업자는 비천연 아미노산을 통해 항체에 부착된 방사성 표지의 유형에 따라서, 적당한 검출 기술을 확인할 수 있다. 표지화된 항체의 투여로 말미암아, 환자의 체내 에서, 암 존재 여부와, 개체 내 전이 상태 및/또는 개체 내 암 치료 효능을 확인할 수 있다.
다른 구체예에서, 세포 표면상에 존재하는 항원에 결합하는 펩티드는 개체에 펩티드를 투여하고 나서 이 펩티드를 추적하는데 사용될 수 있는 염료 예를 들어, 형광 염료를 함유하도록 조작된다. 이 염료는 펩티드 내에 존재하는 비천연 아미노 산을 통해 펩티드에 부착되며, 이 펩티드는 개체에 투여된다. 펩티드 대 이것의 리간드의 위치 파악 또는 결합 여부의 확인은 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있는 영상화 기술 또는 검출 기술로써 이루어진다.
또 다른 구체예에서, 금속기 또는 금속 함유부는 단백질 내에 존재하는 비천연 아미노산을 통하여, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 부착된다. 적당히 표지화된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 당업자에게 공지된 기술을 통하여 검출 및 영상화하기 위해, 원하는 개체에 투여된다. 이와 같이 표지화된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 통해서, 다수의 질병, 대사 경로, 생리적 구조 또는 세포 성분들을 영상화할 수 있다. 당업자는 표지화에 적당한 표적과 검출 또는 영상화 방법을 확인할 수 있다. 예를 들어, 자성 공명 이미지화(MRI)는 개체 내 표지화된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 존재 여부를 검출하는데 사용될 수 있다.
L. 작용기의 부가 예: 폴리펩티드의 치료 특성의 개선
천연 생성 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 질환, 질병 또는 병상을 갖고 있는 환자에게 치료상 유익을 제공할 수 있을 것이다. 이와 같은 치료 혜택은 다수의 인자 예를 들어, 폴리펩티드의 안전성 프로필과, 폴리펩티드의 약물 동태학, 약리학 및/또는 약력학적 특성(예를 들어, 수용성, 생체 이용률, 혈청 반감기, 치료적 반감기, 면역원성, 생물학적 활성 또는 순환 시간)에 따라서 달라질 것이다. 뿐만 아니라, 폴리펩티드에 부가의 작용기 예를 들어, 부착된 세포 독성 화합물 또는 약물을 제공하는 것이 유리할 수 있으며, 또는 본원에 개시된 동종 다량체 및 이종 다량체를 형성하도록 부가의 폴리펩티드를 부착시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 변형은 원래 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는 것이 바람직하다. 본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법은 이 문제에 해결책을 제공한다.
본원에 개시된 방법, 조성물, 기술 및 기법을 사용함에 있어서, 당업자는 원하는 폴리펩티드에 상동성인 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 질소 함유 복소환과 같은 복소환을 생산할 수 있는데, 여기서, 상기 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 치료 특성을 개선한다. 하나의 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의하여 생산된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 본원에 개시된 비천연 아미노산 중 하나의 구조에 통합된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 통합될 뿐만 아니라, 위치 특이적으로도 통합된다.
하나의 구체예에서, 생합성에 의해 생성된 비천연 아미노산은 이미 치료 특성이 개선된 것이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 치료 특성을 개선하는 기에 대한 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 포함한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 비천연 아미노산은 추가로 변형되어, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 변형된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 형성하는데, 여기서, 상기 변형은 치료 특성을 개선하는 기에 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환 결합을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접적으로 결합되며, 다른 구체예에서는, 이러한 기는 링커기에 의해 비천연 아미노산에 결합된다. 임의의 구체예에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비천연 아 미노산에 결합되고, 다른 구체예에서, 이러한 기를 비천연 아미노산에 결합시키는데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게, 치료 특성을 개선하는 기는, 적용된 반응 조건 하에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드 내 비천연 아미노산에 위치 특이적으로 결합하지만, 천연 생성 아미노산과는 결합하지 않는다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 초 유전자군의 일원과 상동성이지만, 본 섹션에 기술된 방법, 기술 및 조성물은 실질적으로, 치료 특성이 개선됨으로 말미암아 혜택을 얻을 수 있는 임의의 기타 폴리펩티드 예를 들어, 원하는 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 치료 특성을 개선하는 기는 폴리펩티드의 수용성도 개선하고; 다른 구체예에서, 이러한 기는 폴리펩티드의 결합 특성도 개선하며; 다른 구체예에서, 이러한 기는 폴리펩티드에 새로운 결합 특성을 제공한다(에를 들어, 바이오틴기 또는 바이오틴-결합기). 상기 기가 폴리펩티드의 수용성을 개선하는 구체예에서, 상기 기는 본원에 개시된 수용성 중합체 예를 들어, PEG 중합체 기로부터 선택된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 상기 기는 세포 독성 화합물인 반면에, 다른 구체예에서 상기 기는 약물이다. 추가의 구체예에서, 결합된 약물 또는 세포 독성 화합물은 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 절단되어, 약물 또는 세포 독성 화합물을 목표로 하는 치료 위치에 전달할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 기는 제2의 폴리펩티드 예를 들어, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드로서, 예를 들어, 제1의 비천연 아미노산 폴리펩티드와 동일한 아미노산 구조를 갖는 폴리펩티드이다.
추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 변형된 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 생체 이용률이 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 안전성 프로필이 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 수용성이 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 치료적 반감기가 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 혈청 반감기가 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 순환 시간이 연장된다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 증가한다. 추가의 또는 부가의 구체예에서, 복소환 예를 들어, 질소 함유 복소환을 함유하는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성인 천연 생성 아미노산 폴리펩티드에 비하여, 폴리펩티드의 면역원성이 증가한다.
XI. 변형 폴리펩티드의 치료적 용도
편의상, 본 섹션에 기술되어 있는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 일반적으로 그리고/또는 특정 예를 들어서 기술되어 있다. 그러나, 본 섹션에 기술되어 있는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본 섹션에 제공된 특정 예 또는 일반적인 설명을 한정하는 것은 아니며, 오히려, 본 섹션에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은, 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위에 속하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는, 모든 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 본 명세서, 천구의 범위 및 도면에 개시된 화학식 I∼화학식 LXVII의 범위 내에 속하는 임의의 부속 화합물 또는 특정 화합물에 균등하게 적용된다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, 동종 다량체 및 이종 다량체는 다양한 용도로서 사용될 수 있는데 예를 들어, 치료, 진단, 분석, 산업, 화장품, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 소비 제품 관련 분야 및/또는 군용으로 사용하는 것도 포함된다. 비제한적인 예로서, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다음과 같은 치료적 용도도 제공된다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 광범위한 질환, 병상 또는 질병의 치료에 유용하다. 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 제품을 투여하면, 시판중인 폴리펩티드 제제에 의해 인간의 체 내에서 입증되는 활성 중 임의의 활성을 나타낸다. 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 제품의 평균 사용량은 다양할 수 있으며, 구체적으로는, 자격이 있는 전문의의 추천과 처방에 따라서 달라질 것이다. 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료될 병상의 정확한 유형, 치료될 환자의 상태, 그리고 조성물 중 기타 성분들과 같은 인자들에 따라서 결정되는 것이 바람직하다. 투여될 양은 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 치료법을 바탕으로 하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
A. 약학 조성물과 이의 투여 방법
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드(예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 합성 효소, 단백질 등)은, 예를 들어, 적당한 약학 담체와 함께 치료용으로서 사용되기도 한다. 예를 들어, 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로서는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제형은 투여 방식에 맞추어 제조된다. 일반적으로 단백질 투여 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여 방법에 맞추어질 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 치료 조성물은 당업자에게 널리 공지된 방법에 따라서, 하나 이상의 적당한 시험관 내 및/또는 생체 내 동물 질병 모델 내에서 임의로 시험되어, 효능과 조직 대사를 확인하고 투여량을 측정할 수 있다. 특히, 투여량은 처음에는 관련 검정법에서, 활성, 안정성 또는 기타 적당한 척도 즉, 천연 아미노산 상동체에 대한 인위적 아미노산 상동체의 비교 결과(예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드에 대하여 하나 이상의 인위적 아미노산을 포함하도록 변형된 폴리펩티드의 비교)에 의해 결정될 수 있다.
분자를 혈액이나 조직 세포와 궁극적으로 접촉하도록 도입시키는데 보통 사용되는 경로 중 임의의 경로에 의하여 투여가 이루어진다. 본원에 개시된 바와 같은 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의의 적당한 방식으로 투여되는데, 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여된다. 본원에 개시된 바와 같은 변형 또는 변형되지 않은 아미노산 폴리펩티드를 환자에게 투여하는데 적당한 방법이 행하여 질 수 있고, 한 가지 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 다른 경로보다 더욱 즉효적이고 효과적인 작용 또는 반응을 나타낼 수도 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는, 부분적으로는 투여되는 특정 조성물에 의해 결정되고, 또한 이 조성물을 투여하는데에 사용된 특정 방법에 의해서도 결정된다. 그러므로, 본원에 개시된 약학 조성물의 적당한 제형이 다양하게 존재할 수 있다.
본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드와 이와 같은 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 단백질 또는 펩티드에 적당한 임의의 통상적 경로 예를 들어, 비경구 투여 경로 예를 들어, 주사 예를 들어, 피하 주사 또는 정맥 내 주사, 또는 주사나 주입에 관한 임의의 기타 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. (본원에 개시된 다양한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는) 폴리펩티드 약학 조성물은 다수의 경로 예를 들어, 경구 투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 국소 투여, 설하 투여 또는 직장 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 투여 경로 및 적당한 제형에 관하여는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 기타 적당한 성분 예를 들어, 약학 담체와 함께 투여될 수 있다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 기타 적당한 성분과 함께, 에어로졸 제형으로 제조되어(즉, "분무화"되어), 흡입에 의해 투여될 수 있다. 에어로졸 제형은 허용 가능한 가압 추진제 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 프로판 및 질소 등이 담긴 용기에 넣을 수 있다.
비경구 투여용 예를 들어, 관절 내(관절의 내부), 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복막 내 및 피하 투여용으로서 적당한 제형은, 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액(산화 방지제, 완충액, 정균제 및 제형을 투여받는 개체의 혈액과 등장성이 되 도록 만들어 주는 용질 함유), 그리고 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 팩킹된 핵산의 제형은 단위 투여용 또는 복수 투여용 밀봉 용기 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥 내 투여는 투여 방법으로서 바람직하다. 특히, 천연 아미노산 상동체 치료제로서 이미 사용되고 있는 제제(예를 들어, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 기타 임의의 약학적으로 전달될 단백질의 투여 경로는, 현재 사용되고 있는 제형과 함께, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.
본원에 개시된 방법과 조성물에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은, 경시적으로 환자의 체 내에서 유리한 치료 반응을 나타내는데 충분하다. 투여량은 특정 제형의 효능, 그리고 사용된 비천연 아미노산 폴리펩티드(변형 또는 변형되지 않은 폴리펩티드)의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기와 환자의 상태뿐만 아니라, 치료 받을 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 투여량은 또한 특정 제형 등을 특정 환자에게 투여하였을 때에 동반되는 임의의 부작용 발생 여부, 특징 및 정도에 의해 결정된다.
질병(예를 들어, 암, 유전병, 당뇨병 또는 AIDS 등)의 치료 또는 예방 시 투여될 제형의 유효량을 결정함에 있어서, 전문의는 순환 혈장 내 수준, 제형 독성, 질병의 경과 및/또는 관련이 있는 경우에는, 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산 여부를 고려한다.
예를 들어, 체중 70㎏인 환자의 경우 투여될 투여량은, 통상적으로 관련 조성물의 활성이나 혈청 반감기가 변함에 따라서 맞추어지는, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 같다. 본원에 개시된 약학 제형은 공지된 임의의 통상적 치료법 예를 들어, 항체, 백신, 세포 독성 제제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체 또는 생물 반응 개질제 등의 투여에 의해 치료 조건을 보완할 수 있다.
투여에 있어서, 본원에 개시된 약학 제형은 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50에 의해 결정된 비율 및/또는 다양한 농도(예를 들어, 환자의 체중 및 전체적 건강 상태에 따라 맞추어질 농도)에서의 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 의한 임의의 부작용 관찰 결과에 따라서 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여될 수 있다.
만일, 현재 제형을 주입받고 있는 환자가 발열, 오한 또는 근육통을 겪고 있다면, 이 환자는 적당한 양의 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 또는 기타 진통제/해열제를 복용한다. 주입시 반응 예를 들어, 발열, 근육통 및 오한과 같은 반응을 겪고 있는 환자는 다음번 주입하기 30분 전에 미리 아스피린, 아세타미노펜 또는 예를 들어, 디펜히드라민을 복용한다. 메페리딘은 해열제와 항히스타민제에 대한 반응이 더뎌져서 오한과 근육통이 더욱 심해질 때에 사용한다. 세포 주입은 반응의 중증도에 따라서 천천히 하거나 또는 중단된다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 포유동물 개체에 직접 투여될 수 있다. 투여 경로는 개체에 폴리펩티드를 도입하는데에 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드로서는, 비록 주어진 상황에 가장 적당한 경로는 치료될 병상의 특성과 중증도에 따라 달라지겠지만, 경구 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 흡입(예를 들어, 에어로졸에 의한 흡입), 협측 투여(예를 들어, 설하 투여), 질내 투여, 비경구 투여(예를 들어, 피하, 근육 내, 피 내, 관절 내, 흉막 공간 내, 복막 내, 뇌 내, 동맥 내 또는 정맥 내 투여), 국소 투여(즉, 피부와 점막 표면 예를 들어, 기도 표면) 및 경피 투여용으로 적당한 폴리펩티드를 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 제형은 단위 투여용 또는 복수 투여용 밀봉 용기 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있다. 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 단위 투여용 주사 제형(예를 들어, 용액, 현탁액 또는 유액)으로 혼합물 중에 제조될 수 있다. 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 연속 주입(예를 들어, 미니펌프 예를 들어, 삼투압 펌프 사용), 단일 볼루스(single bolus) 또는 서방형 데포 제형(slow-release depot formulation)으로 투여될 수 있다.
투여에 적당한 제형은 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액(산화 방지제, 완충액, 정균제 및 제형을 등장성이 되도록 만들어 주는 용질 함유), 그리고 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 이미 기술된 유형의 정제로 제조될 수 있다.
동결-건조는, 일반적으로 목적 단백질 제제로부터 물을 제거하는데에 사용되는 단백질 제공 기술이다. 동결-건조 또는 동결 건조법은, 건조될 물질이 처음에 동결되었다가, 이후 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경 하에서 승화되어 제거되는 것을 원리로 하는 방법이다. 부형제는 미리 동결 건조된 제형에 포함되어 동결-건조 과정 동안에 안정성을 증강시키고/증강시키거나, 저장시 동결된 생성물의 안정성을 개선시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) 및 Arakawa외 다수 Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)].
약제의 분무 건조법도 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Broadhead, J.외 다수, "The Spray Drying of Pharmaceuticals,", Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조하시오. 소형 분자 약제에 더하여, 다양한 생물 물질들 예를 들어, 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모가 분무 건조되었다. 분무 건조법은 액상 약학 제제를 미세하고, 먼지가 일지 않거나 또는 응집된 분말로 한번에 전환시킬 수 있기 때문에 유용한 기술이다. 이 기술의 기본 원리는 다음과 같이 4단계로 이루어져 있다: a) 공급 용액을 스프레이에 분무하는 단계 ; b) 스프레이와 공기를 접촉시키는 단계; c) 스프레이를 건조시키는 단계; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 생성물을 분리하는 단계. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,235,710호 및 동 제6,001,800호에는, 분무 건조법에 의해 재조합 적혈구 생성 촉진 인자를 제조하는 방법에 관하여 기술되어 있다.
본원에 개시된 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안 정화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물과, 조성물을 투여하는데에 사용되는 특정 방법에 의해서 결정된다. 그러므로, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물(경우에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함)로 이루어진 적당한 제형이 다수 존재한다[예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N. Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)]. 적당한 담체로서는, 숙신산염, 인산염, 붕산염, HEPES, 시트르산염, 이미다졸, 아세트산염, 중탄산염 및 기타 유기산을 함유하는 완충액; 산화 방지제 예를 들어, 아스코르브산; 저 분자량 폴리펩티드 예를 들어, 약 10개 미만의 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 단백질 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예를 들어, 트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들어, EDTA 및 이덴테이트 디소듐(edentate disodium); 2가 금속 이온 예를 들어, 아연, 코발트 또는 구리의 이온; 당 알콜 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 짝 이온 예를 들어, 나트륨 이온; 및/또는 비이온계 계면 활성제 예를 들어, 트윈(Tween)™(예를 들어, 트윈 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20)), 플루로닉스(Pluronics)™ 및 기타 플루론산 예를 들어, 플루론산 F68(폴록사머 188) 또는 PEG를 포함한다. 적당한 계면 활성제로서는 예를 들어, 폴리(산화에틸렌)-폴리(산화프로필렌)-폴리(산화에틸렌) 즉, (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(산화프로필렌)-폴리(산화에틸렌)-폴리(산화프로필렌) 즉, (PPO-PEO-PPO), 또는 이들의 조합체를 주 성분으로 하는 폴리에테르를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 플루로닉스™, R-플루로닉스™, 테트로닉스(Tetronics)™ 및 R-테트로닉스(R-Tetronics)™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)으로 시판되고 있으며, 또한 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제4,820,352호에 상세히 기술되어 있다. 기타 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 적당한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제들의 조합물은, 하나 이상의 스트레스 예를 들어, 진동으로부터 받는 스트레스에 대하여 PEG화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화하는데에 사용될 수 있다. 전술한 계면활성제 중 일부는 "팽창제(bulking agent)"라고도 칭할 수 있다. 일부는 또한 "강장 개선제(tonicity modifier)"라고도 칭할 수 있다. 항 박테리아 보존제도 또한 제품의 안정성과 항 미생물 효능을 얻기 위해 사용될 수 있는데; 적당한 보존제로서는 벤질 알콜, 염화벤잘코늄, 메타크레솔, 메틸/프로필 파라벤, 크레솔 및 페놀 또는 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 예를 들어, PEG와 같은 수용성 중합체에 결합된 폴리펩티드는 지연 방출형 시스템에 의하여 투여될 수 있거나, 또는 이 시스템의 일부로서 투여될 수 있다. 지연 방출형 조성물은 예를 들어, 성형된 제품 예를 들어, 필름 또는 미세 캡슐의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 지연 방출형 매트릭스는 생체 혼화성 재료 예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)[Langer외 다수, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)], 아세트산 에틸렌 비닐[Langer외 다수, 상동] 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산 [EP 133,988], 폴리락티드(폴리락트산)[미국 특허 제3,773,919호; EP 58,481], 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 다가 무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[U.Sidman외 다수, Biopolymers, 22, 547-556 (1983)], 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 황산콘드로이친, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 이소루신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 지연 방출형 조성물은 또한 리포좀으로 포집된 화합물을 포함한다. 화합물을 함유하는 리포좀은 다음과 같은 문헌에 개시된 방법에 의하여 제조된다: DE 3,218,121; Eppstein외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 143,949; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 동 제4,619,794호, 동 제5,021,234호 및 동 제4,544,545호; 및 EP 102,324.
리포좀으로 포집된 폴리펩티드는 예를 들어, 문헌[DE 3,218,121; Epstein외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 143,949; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 동 제4,619,794호, 동 제5,021,234호 및 동 제4,544,545호; 및 EP 102,324]에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의하여 실험을 통해 용이하게 결정될 수 있다. 리포좀의 몇몇 예에 관하여는 예를 들어, 문헌[Park JW외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC외 다수, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW외 다수, Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB외 다수, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118 (2002); Mamot C외 다수, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 개시되어 있다.
본원에 개시된 조성물, 제형 및 방법에 있어서, 환자에게 투여된 투여량은 시간이 경과함에 따라서 개체에게 유리한 반응을 일으키기에 충분하여야 한다. 비경구 투여될, 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은, 치료적 판단에 따라서 좌우되겠지만, 일반적으로는 약 0.01∼약 100㎍/㎏/일, 또는 환자 체중 1㎏당 약 0.05∼약 1㎎이다. 투여 횟수 또한 치료적 판단에 따라서 다르며, 인간에 대하여 사용 승인을 받은 시판 제품들보 다 더 자주 투여될 수 있거나, 투여 횟수를 줄여 투여될 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 중합체:폴리펩티드 접합체 예를 들어, PEG화된 폴리펩티드는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로에 따라서 투여될 수 있다.
XII. 변형된 폴리펩티드의 구조-기능 간 관계
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드(예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 합성 효소, 단백질 등)는 그것이 존재하는 폴리펩티드에 상이한 물리적 특성 및 화학적 특성을 부여할 것이다. 이와 같은 특성의 유용성은 비천연 아미노산의 구조, 비천연 아미노산에 가하여진 변형의 구조, 또는 이 둘 다에 따라서 달라질 것이며, 또한 테스트 폴리펩티드의 구조-기능 간 관계를 평가하는 실험 모델을 통하여 평가될 수 있다.
소정의 임의 실험 모델에 있어서, 원하는 폴리펩티드 또는 단백질 내 천연 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환된다. 비천연 아미노산 함유 펩티드 또는 단백질을 발현한 후, 상기 단백질은 대안 R기의 라이브러리로 유도체화된다. 이와 같은 R기들은 폴리펩티드 또는 단백질 내에 함유된 비천연 아미노산과 반응한다. R기의 라이브러리는 그것의 구조 또는 치환된 아미노산의 R기와의 화학적 유사성에 의해 선택된다. 단백질 내 비천연 아미노산에 신규의 R기를 부가한 후, 이 단백질을 적당한 테스트 시스템 내에서 기능 또는 활성에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 페닐알라닌은 단백질 내에서 비천연 아미노산과 치환된다. 페닐알라닌의 R기와 유사한 특성을 가지는 대안 R기의 라이브러리는 이후 비천연 아미노산에 부가된다. 하나의 대안적 R기는 비천연 R기에 부가되고, 이 비천연 R기는 고리, 헤테로 고리, 접합된 고리; 또는 예를 들어, 유사한 화학적 특성 및 구조적 특성을 부여하는 기타 화학적 부분을 포함한다. 이후, 유도체화된 단백질은, 당업자에 의하여 용이하게 측정되는 적당한 실험 모델에서 테스트함으로써, 새로이 치환된 비천연 아미노산의 부가와 관련된 기능 또는 기능들에 대해 스크리닝된다. 실험 모델의 예로서는 기본 검정법, 무 세포 검정법, 세포 계 검정법, 조직 배양 모델 및 동물 모델을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 인돌은 약물 탐색 시 약리단 활성을 나타내기 위하거나, 검출시 유용한 형광 중심부로서, 비천연 아미노산에서 치환된다. 이와 같이 부가 과정을 촉진하기 위해서, 실온 및 수성 완충액 중 최적화된 2 단계 반응을 통하여 인돌을 형성함으로써, 인돌 합성에 적당한 인돌계 R기(들)가 비천연 아미노산에 부가된다. 이 반응 후, 유도체화된 단백질은 그것이 원하는 활성을 가지는지 여부에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 산성 알파-글루코시다제 효소(GAA) 중 비천연 아미노산 치환의 효능(즉, 폼페병의 완화)은 폼페병에 대한 마우스 모델에서 평가될 수 있다. 효소 내 선택된 위치에 다양한 아미노산 치환을 포함하는 GAA 분자의 라이브러리는 본원에 개시된 본 발명을 통해서 생산 및 발현될 수 있다. 이후, 비천연 아미노산 함유 효소는 폼페병에 대한 마우스 모델(유전적으로 GAA가 결핍되도록 육종된 마우스(GAA-/-))에서 이 효소(본원에 개시된 바와 같이 변형되지 않은 형태 또는 번역 후 변형된 형태인 효소)의 활성에 대해 평가될 수 있다. 비천연 아미노산 함유 효소는 정맥 내 투여 또는 경구 투여될 수 있거나, 또는 단백질을 효율적으로 운반 및 흡수할 수 있는 기타 임의의 경로에 의하여 투여될 수 있다. 투여 효능, 효소 반감기 및 폼페병 완화 여부는 글리코겐 분해 여부 및/또는 마우스 내 소멸 여부를 측정하거나, GAA의 혈청 내 수준, 심장 비대증, 심장 근육병증 또는 골격 근육병증의 병세 변화 또는 완화 여부, 또는 기타 당업자에 의해 용이하게 확인 및 모니터될 수 있는 징후에 의해 평가될 수 있다.
본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드는 다양한 산업 분야에서 유용하다. 본원에 개시된 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하면, 산업 분야에서 시판되고 있는 폴리펩티드 제제에 의해 나타나는 활성 중 임의의 활성을 나타낸다.
예를 들어, 에탄올 생산용 효소는 비천연 아미노산으로 변형될 수 있으며, 또한 기능상의 변화가 확인될 수 있다. 알콜 탈수소 효소 II 및 피루브산염의 탈탄산 효소 라이브러리(다양한 비천연 아미노산 치환부 함유)는 본원에 개시된 본 발명을 통하여 생산 및 발현될 수 있다. 이후, 비천연 아미노산 변형 효소는 비천연 아미노산 치환에 의하거나 또는 이 치환의 결과로서 이루어지는 에탄올 생산의 효능에 변화가 일어났는지 여부에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 기질 친화성과 전환율의 증가 여부는 당업계에 널리 공지된 기술에 의하여 용이하게 스크리닝될 수 있으며, 또한 에탄올의 산업적 생산에서도 마찬가지이다.
본원에 개시된 본 발명의 산업적 용도의 추가 예로서는 제초제 및 살충제를 없애는 환경 정화용을 포함한다. 일반적으로 사용되고 있는 제초제, 아트라진(오염된 토양으로부터 유래함)은, 이 아트라진을 대사하는 효소에 의해 용이하게 제거되 며, 또한 이로써 상기 아트라진은 무독성이 된다. 비천연 아미노산 치환부를 함유하는 변형된 안트라진 클로로하이드롤라제 효소는 본원에 개시된 발명에 의하여 생산 및 발현될 수 있다. 이후, 비천연 아미노산 변형 아트라진 클로로하이드롤라제 효소의 라이브러리는 환경에서 발견되는 아트라진을 탈염화하는 능력의 변화 여부와, 비천연 아미노산 치환에 의해 부여되었거나 또는 이 치환에 의하여 진행되는 아트라진 대사의 신규 양상에 대해 스크리닝될 수 있다. 전술한 바와 같이, 효소 효능의 변화(예를 들어, 아트라진 또는 중간 산물의 대사량 증가)는 당업계에 널리 공지된 기술을 통하여 평가될 수 있다.
실시예 1
Figure 112008047567393-PCT00173
의 합성
이의 합성에 사용된 합성 방법을 이하 반응식에 나타내었다:
Figure 112008047567393-PCT00174
a)
Figure 112008047567393-PCT00175
의 합성
피리딘(50㎖) 중 1-p-톨릴히드라진(5.0g, 31mmol) 용액에 Ac2O(30㎖, 318 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반한 후, MeOH(100㎖)로 켄칭하였다. 상기 용매를 진공 하에서 제거한 후 잔류물은 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 20∼50% EtOAc/헥산)으로 정제한 결과, 무색의 오일이 생성되었다(6.72 g, 87%): 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.47 (s, 6H), 2.40 (s, 3H), 2.14 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171.8, 169.5, 139.1, 138.8, 130.4, 126.4, 25.4, 22.3, 21.3.
b)
Figure 112008047567393-PCT00176
의 합성
CCl4(300㎖) 중 N',N'-디아세틸-N-p-톨릴아세토하이드라지드(6.4g, 25.8mmol) 용액에 N-브로모 숙신이미드(5.1g, 28.7mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 환류 가열한 후, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 0.2g, 1.2mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 36시간 동안 환류 교반하고, 이를 실온으로 냉각시켰다. 이 혼합물을 H2O와 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과 및 농축한 결과, 브롬화물(8.62g)이 갈색 오일로서 생성되었다. 미정제 생성물을 별도의 정제 과정 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
c)
Figure 112008047567393-PCT00177
의 합성
EtOH(80㎖) 중 EtONa(2.3g, 32.1mmol) 용액에 디에틸 2-아세타미도말로네이트(6.3g, 29.0mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. N',N'-디아세틸-N-(4-(브로모메틸)페닐)아세토하이드라지드(8.62g, 26.4mmol)를 1부 첨가하였다. 이 혼합물을 80℃에서 밤새도록 교반한 다음, 실온으로 냉각하였다. 시트르산(10g, 50mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔류물을 EtOAc(500㎖)로 희석하였다. 이 혼합물을 H2O와 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 15∼80% EtOAc/헥산)으로 정제한 결과, 디에틸 2-(4-(아세타미도)벤질)-2-아세타미도말로네이트(4.17g, 35%, 2 단계)(황색 오일)가 생성되었다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.57 (s, 1H), 4.29-4.20 (m, 4H), 3.65 (m, 2H), 2.41 (s, 6H), 2.08 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.27 (t, J = 3.6 Hz, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171.7, 169.3, 169.2, 167.4, 140.3, 136.4, 131.3, 126.2, 67.2, 63.0, 37.4, 25.3, 23.2, 22.3, 14.2.
d)
Figure 112008047567393-PCT00178
의 합성
디옥산(15㎖) 중 디에틸 2-(4-(아세타미도)벤질)-2-아세타미도말로네이트(572㎎, 1.24mmol) 용액에 HCl(12N, 15㎖)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새도록 환류 가열하고, 이를 진공 하에서 농축하였다. 잔류물에 MeOH(1㎖)를 첨가하였다. 에테르(200㎖)를 침전물에 첨가한 결과, 생성물(231㎎, 81%)이 고체로서 생성되었다: 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 7.28 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.21 (dd,J= 7.4, 5.7 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 9.2, 5.7 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 14.7, 7.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, D2O) δ 171.5, 142.9, 130.3, 129.0, 115.7, 54.1, 34.7.
실시예 2
Figure 112008047567393-PCT00179
의 합성
이의 합성에 사용된 합성 방법을 이하 반응식에 나타내었다:
Figure 112008047567393-PCT00180
a)
Figure 112008047567393-PCT00181
의 합성
0℃에서 NaOH(40㎖, 25% 부피)의 용액에 에테르(60㎖)를 첨가하였다. 블라스트 실드(blast shield)를 반응 플라스크 앞에 놓았다. 생성된 혼합물에 N-니트로소-N-메틸 우레아(6.0g, 57.9mmol)을 3분에 걸쳐서 3부 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 이후, 디에틸 에테르와 수산화나트륨 층이 분리되었다. 5분에 걸쳐 출발 물질이 완전히 사라질 때까지(TLC로 모니터) 유기층을 무수 THF(20㎖) 중 N-Boc-4-하이드록시메틸페닐알라닌(7.5g, 25.4mmol) 용액에 일부씩 첨가하였다(약 6회 첨가). 이후, 빙초산 5방울을 첨가하여, 반응을 켄칭하였다. 유기 용매를 회전 증발법에 의해 제거한 다음, 아세트산에틸을 첨가하였다. 유기층을 포화 NaHCO3 용액, H2O 및 염수로 연속 세척한 다음, 이를 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과 및 농축한 결과, 생성물(5.9g, 75%)(백색 분말)이 생성되었다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.01 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.55 (dt, J= 7.7, 6.2 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.10 (dd, J = 13.8, 5.7 Hz, 1H), 3.02 (dd, J = 13.8, 6.0 Hz, 1H), 2.02 (br s, 1H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ172.5, 155.3, 139.9, 135.5, 129.6, 127.4, 80.1, 65.0, 54.6, 52.4, 38.1, 28.4.
b)
Figure 112008047567393-PCT00182
의 합성
0℃에서 CH2Cl2(400㎖) 중 알콜(6.0g, 19.4mmol) 및 피리딘(12㎖, 150mmol)의 교반된 용액에 데스-마틴 페리오디난(Dess-Martin periodinane)(14.2g, 33.4mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 이후, 여기에 포화 수성 Na2S2O3-NaHCO3 용액(1:1, 300㎖)를 첨가하여 반응을 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합한 다음, 이를 H2O와 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조한 다음, 진공 하에서 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 1:100∼1:1 헥산:EtOAc)로 정제한 결과, 알데히드 생성물이 생성되었 다(5.48 g, 92%)(백색 고체): 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.98 (s, 1H), 7.81 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 5.04 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.62 (dt, J = 7.2, 6.2 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.21 (dd, J= 13.7, 5.7 Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 13.7, 6.4 Hz, 1H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 192.1, 172.1, 155.2, 143.7, 135.5, 130.3, 130.1, 80.4, 54.4, 52.6, 38.9, 28.5.
c)
Figure 112008047567393-PCT00183
의 합성
헥산(150㎖) 중 상기 알데히드(3.07g, 10mmol) 용액에 t-부틸카바제이트를 첨가한다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 환류 가열하고 농축한다. 이 잔류물에 BH3-THF(1M, 10㎖, 10mmol)을 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 포화 NaHCO3 용액을 첨가하여 켄칭한다. 이 혼합물을 EtOAc로 추출한다. 유기층을 H2O와 염수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에서 여과 및 농축한다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 2:1∼1:2 헥산:EtOAc)로 정제한 결과, 생성물(3.1g, 73%)(백색 고체)이 생성되었다.
d)
Figure 112008047567393-PCT00184
의 합성
0℃에서 디옥산(10㎖) 중 상기 메틸 에스테르(1.3g, 3.1mmol) 용액에 LiOH(10㎖, 1N)를 첨가한다. 이 혼합물을 같은 온도에서 1시간 동안 교반한 다음, 여기에 시트르산 용액(5%, 200㎖)을 첨가하여 켄칭한다. 이 혼합물을 EtOAc로 추출한다. 유기층을 H2O와 염수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축한 결과 산이 생성된다(고체)(1.08g, 86%).
e)
Figure 112008047567393-PCT00185
의 합성
0℃에서 CH2Cl2(10㎖) 중 상기 산(1.0g, 2.4mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산(20㎖)을 첨가한다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 진공 하에서 농축한다. 잔류물에 MeOH(1㎖)를 첨가한 다음, HCl(2.0㎖, 4N, 디옥산 중)을 첨가한다. 에테르(200㎖)를 침전물에 첨가한 결과, 생성물(0.4g, 80%)(고체)이 생성된다.
실시예 3
본 실시예는 도 5에 도시된 디카보닐 함유 아미노산의 합성 방법에 관한 것이다. 디카보닐 함유 비천연 아미노산은 도 5에 도시된 바와 같이 생성되었다.
실시예 4
본 실시예는 도 6에 도시된 디카보닐 함유 아미노산의 합성 방법에 관한 것이다. 디카보닐 함유 비천연 아미노산은 도 6에 도시된 바와 같이 생성되었다.
실시예 5
본 실시예는 도 7에 도시된 디아민 함유 아미노산의 합성 방법에 관한 것이 다. 디아민 함유 비천연 아미노산은 도 7에 도시된 바와 같이 생성되었다.
실시예 6
본 실시예는 도 8에 도시된 디아민 함유 아미노산의 합성 방법에 관한 것이다. 디아민 함유 비천연 아미노산은 도 8에 도시된 바와 같이 생성되었다.
실시예 7
디카보닐 함유 아미노산과 디아민 함유 시약으로부터의 피라졸 생성
Figure 112008047567393-PCT00186
트리스 완충액(pH8.5, 10mM) 중 메틸히드라진(0.15㎖) 용액에 디케톤을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 여기에 시트르산 용액(5%)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 10:1∼1:1 헥산:EtOAc)로 정제한 결과, 백색 고체인 생성물(약 3:1 이성체 비율, 117㎎, 81%)이 생성되었다.
실시예 8
본 실시예는 도 9에 도시한 바와 같이 디아민 함유 아미노산과 디카보닐 함유 시약을 사용하는 변형법에 관한 것이다.
실시예 9
본 실시예는 도 10에 도시한 바와 같이 디아민 함유 아미노산과 디카보닐 함유 시약을 사용하는 변형법에 관한 것이다.
실시예 10
본 실시예는 도 12에 도시한 바와 같이 디카보닐 함유 아미노산과 디아민 함유 시약을 사용하는 변형법에 관한 것이다.
실시예 11
본 실시예는 도 18에 도시한 바와 같이 디아민 작용기화된 PEG 링커의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예 12
본 실시예는 도 19에 도시한 바와 같이 디카보닐 작용기화된 PEG 링커의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예 13
본 실시예는 도 20에 도시한 바와 같이 디아민 2 작용기화된 PEG 링커의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예 14
본 실시예는 도 21에 도시한 바와 같이 이종 2 작용기화된 링커의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예 15
본 실시예는 도 22에 도시한 바와 같이 3 작용기화된 링커의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예 16
본 실시예는 도 23에 도시한 바와 같이 hGH를 디아민 함유 PEG 시약으로 PEG화하는 방법에 관한 것이다.
실시예 17
본 실시예는 도 24에 도시한 바와 같이 2개의 hGH 폴리펩티드를 디아민 함유 2 작용성 PEG 링커로 이량체화하는 것에 관한 것이다.
실시예 18
본 실시예는 도 25에 도시한 바와 같이 hGH를 헤테로 2 작용기화된 링커로 PEG화하는 것에 관한 것이다.
실시예 19
본 실시예는 도 26에 도시한 바와 같이 2개의 hGH 폴리펩티드를 하이드록실아민 함유 3작용성 링커로 이량체화한 후, hGH 이량체를 PEG화하는 것에 관한 것이다.
실시예 20
본 실시예는 이.콜라이 내에서 변형된 폴리펩티드를 클로닝 및 발현시키는 것에 관한 것이다. 직교 tRNA(O-tRNA)와 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소(O-RS)를 포함하는 도입 번역 시스템을 사용하여, 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 발현하였다. O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 그 다음, 암호화된 셀렉터 코돈에 따라서, 번역 시스템을 통하여 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하였다. 비천연 아미노산을 통합하는데 유용한 O-tRNA 및 O-RS의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는, 미국 특허 출원 제10/126,927호(발명의 명칭:"In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids") 및 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭:"Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA- Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs")에 개시되어 있다. 다음과 같은 O-RS 및 O-tRNA 서열도 사용될 수 있다:
서열 번호 1 엠.재너쉬 mtRNATyr CUA tRNA
서열 번호 2 HLAD03:최적화된 앰버 서프레서 tRNA tRNA
서열 번호 3 HL325A: 최적화된 AGGA 틀 이동 서프레서 tRNA tRNA
서열 번호 4 p-아지도-L-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(6) RS
서열 번호 5 p-벤조일-L-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-BpaRS(1) RS
서열 번호 6 프로파길-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS RS
서열 번호 7 프로파길-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS RS
서열 번호 8 프로파길-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS RS
서열 번호 9 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(1) RS
서열 번호 10 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(3) RS
서열 번호 11 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(4) RS
서열 번호 12 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(2) RS
서열 번호 13 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 (LW1) RS
서열 번호 14 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 (LW5) RS
서열 번호 15 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 (LW6) RS
서열 번호 16 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 (AzPheRS-5) RS
서열 번호 17 p-아지도-페닐알라닌의 통합을 위한 아미노아실 tRNA 합성 효소 (AzPheRS-6) RS
이.콜라이를, 변형된 유전자 및 직교 아미노아실 tRNA 합성 효소/tRNA 쌍(원 하는 비천연 암호화 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드로 형질 전환 시키면, 비천연 아미노산이 폴리펩티드에 위치 특이적으로 통합된다. 약 0.01∼약 100 mM의 특정 비천연 아미노산을 함유하는 37℃의 배지 중에서 생육한 형질 전환 이.콜라이는 고 신뢰도 및 고 효율로 변형된 폴리펩티드를 발현시킨다. 비천연 아미노산을 함유하는 His-태깅된 폴리펩티드는 이.콜라이 숙주 세포에 의해 봉입체 또는 응집체로서 생산된다. 응집체는 변성 조건하에서(6M 구아니딘 HCl) 용해되어 친화성을 바탕으로 정제된다. 리폴딩은 약 50 mM Tris-HCl, pH 약 8.0, 약 40μM CuSO4 및 약 2%(w/v) 사코실 중 약 4℃에서 밤새도록 투석함으로써 수행된다. 이후 상기 물질들을 약 2OmM TRIS-HCl, pH 약 8.0, 약 10OmM NaCl 및 약 2mM CaCl2에 대해서 투석한 다음, 상기 His-태그를 제거한다. 문헌[Boissel외 다수(1993) 268:15983-93]을 참조하시오. 폴리펩티드의 정제 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 그러한 방법에서는 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 분석법 또는 전기 분무-이온화 이온 포집 질량 분석 분광법 등을 통하여 결과를 확인한다
이하 실시예들은 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관 내 및 생체 내 활성과 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관 내 및 생체 내 활성을 측정 및 비교하는 방법에 관한 것이다.
실시예 21: 세포 결합 검정법
세포(3 x lO6)를 0℃에서 90분 동안, 다양한 농도(부피: 10㎕)의 비표지화 GH, hGH 또는 GM-CSF의 부재 또는 존재하, 그리고 125I-GH(약 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재하에, PBS/1% BSA (100㎕) 중에서, 2가지 경우로 항온 처리하였다(총 부피: 120㎕). 이후 350㎕ 들이 플라스틱 원심 분리 튜브 내에서 세포를 재현탁시키고, 200㎕의 얼음 냉각 FCS에 층을 형성한 다음, 이를 원심 분리시켰다(1000 g; 1 분). 튜브의 끝 부분을 컷 오프(cut off)시켜 펠릿을 수집하고, 이 펠릿과 상청액을 각각 감마 카운터(Packard)에서 계측하였다.
비 결합량(cpm)은, 경쟁 물질 부재하에서의 총 결합량(2가지 경우의 중간치) - 100배 과량의 비표지화 GH의 존재하에서의 결합량(cpm)(비 특이적 결합량)으로써 측정하였다. 비 특이적 결합량은 사용된 세포 유형 각각에 대해서 측정하였다. 각각 다른 날에 동일한 125I-GH 제제를 사용하여 실험을 수행하였으며, 이때에는 내부적으로 일관성을 가져야만 한다. GH 수용체-생산 세포에 125I-GH가 결합하는지 여부를 증명하였다. 결합은 비표지화 천연 GH 또는 hGH에 의하되, GM-CSF 또는 기타 네거티브 대조군에 의하지는 않도록, 투여량 의존 방식으로 억제되었다. 천연 GH와 유사하게, hGH가 천연 125I-GH의 결합에 대해 경쟁하는 능력을 통하여, 수용체가 두 가지 형태를 균등하게 인식한다는 사실을 알 수 있다.
실시예 22: 복소환 결합을 통한 hGH PEG화의 생체 내 연구
PEG-hGH, 비변형 hGH 및 완충 용액을 마우스 또는 래트에 투여하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG화된 hGH는 변형되지 않은 hGH에 비하여 활성이 보다 월등하고 반감기도 늘어날 것임을 알 수 있을 것이다[체중이 상당히 증가하였음을 통해 파악됨].
실시예 23: 접합된 hGH 및 접합되지 않은 hGH 및 이들의 변이체의 생체 내 반감기 측정
모든 동물 실험은 AAALAC 인정 시설과 세인트 루이스 대학의 동물 실험 협의회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 수행되었다. 래트를 방안에 있는 우리에 각각 넣은 후 12 시간 동안 명기/암기에 노출시켰다. 동물에게는 임의로 퓨리나(Purina) 설치류 먹이 5001과 물을 주었다. 뇌하수체를 절개한 래트에게는 5% 글루코스를 함유하는 물을 추가로 마시게 하였다.
실시예 24: 약물 동태학적 연구
동물 실험에 들어가기에 앞서 각각의 PEG화된 돌연변이 hGH의 양을 측정하였다. PEG-hGH의 순도는 비-환원성 조건 하에서 4∼12%의 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔(MES SDS 완충액을 전개함)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 전개시켜 관찰하였다. 이 겔을 쿠마쉬 블루로 염색하였다. PEG-hGH 밴드는 농도 측정 스캔 결과를 근거로 하였을 때 순도가 95% 이상이었다. 각 PEG-hGH 중 내독소 수준을, KTA2 키트(Charles River Laboratories; Wilmington, MA)를 사용하는 역학적 LAL 검정법으로 시험한 결과, 투여 당 5 EU 미만이었다. PEG-hGH의 생물학적 활성은 IM-9 pSTAT5 생물 검정법으로 평가하였으며, EC50 값은 15nM 미만이었다.
수컷 스프라그-돌리(Sparague-Dawley) 래트(261∼425g)(Charles River Laboratories) 내에서, PEG 변형 성장 호르몬 화합물의 약물 동태학적 특성을 각각 비교하였으며, 또한 비 PEG화 성장 호르몬 화합물과도 비교하였다. 채혈을 위해 경동맥에 카테터를 수술로써 꽂았다. 카테터를 성공적으로 삽관한 후, 화합물을 투여하기 이전에 동물들을 처리군으로 나투었다(그룹당 3∼6 마리). 동물에게 1㎎/㎏의 화합물을 피하 투여하였다(투여 부피 = 0.41∼0.55㎖/㎏). 삽관된 카테터를 통하여 여러 시점에서 혈액 시료를 채취하였으며, 이렇게 채취한 시료를 EDTA-코팅된 미량 원심 분리 튜브에 넣어 두었다. 원심 분리 후, 혈장을 수집하고, 분석시까지 이를 -80℃에 보관하였다. 바이오소스 인터내셔날(BioSource International; Camarillo, CA) 또는 다이아그노스틱 시스템즈 래보레토리즈(Diagnostic Systems Laboratories; Webster, TX)에서 시판되는 항체 샌드위치 성장 호르몬 ELISA 키트를 이용하여 화합물의 농도를 측정 하였다. 농도는 투여된 유사체에 해당하는 표준을 이용하여 계산하였다. 약물 동태학적 매개 변수는 윈논린(WinNonlin; Pharsight, 4.1 버젼) 모델링 프로그램으로 평가하였다. 상부 선형(linear-up)/하부 로그형(log-down) 사다리꼴 통합법을 이용하는 비구획화 분석법(noncompartmental analysis)을 수행하였으며, 농도 데이터는 균일하게 가중치를 적용하였다.
래트에 1회 피하 투여한 후 규칙적인 간격을 두고 혈장 농도를 측정하였다. 래트(n = 그룹당 3∼6 마리)에 1㎎/㎏ 단백질을 1회 볼루스 투여하였다. hGH 야생형 단백질(WHO hGH), His-태깅된 hGH 폴리펩티드(his-hGH), 또는 6개의 상이한 위치에서 비천연 아미노산인 p-아세틸-페닐알라닌이 30kDa의 PEG와 공유 결합되어 있는, His-태깅된 hGH 폴리펩티드를, WHO hGH 및 (his)-hGH와 비교하였다. 일정한 시 간 간격을 두고 혈장 시료를 채취하였으며, 이를 기술한 바와 같이 주입한 화합물에 대해 검정하였다. 이하 표에는 다양한 hGH 폴리펩티드를 1회 투여하였을 때의 약물 동태학적 매개 변수 수치를 나타내는 것이다. 비구획화 분석법(Pharsight, 4.1 버젼)을 이용하여 농도 대 시간 곡선에 대하여 평가하였다. 수치는 평균(+/- 표준 편차) 값이다. Cmax = 최대 농도; 최종t1/2 = 최종 반감기; AUC0→inf = 무한대로 외삽한 농도-시간 곡선 아래 표면적; MRT = 평균 체류 시간; C1/f = 겉보기 총 혈장 내 소멸률; Vz/f = 최종 단계시 분포의 겉보기 부피. 30KPEG-pAF92(his)hGH는 대조군 hGH에 비하여 순환 시간, 혈청 반감기 및 생체 이용률이 상당히 증가하였다.
표: 정상 수컷 스프라그-돌리 래트 내에서의 1회 투여(1㎎/㎏ 볼루스 피하 투여)시 약물 동태학적 매개 변수
Figure 112008047567393-PCT00187
실시예 25: 약력학적 연구
뇌하수체를 절개한 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 찰스 리버 래보레토리즈로부터 입수하였다. 3∼4주령 된 래트의 뇌하수체를 수술로 제거하였다. 동물들을 3주 동안(체중 관찰 시기) 환경에 적응시켰다. 연구 시작 전 7일의 기간 동안 체중이 0∼8 g 증가한 동물들을 포함시켜, 이들을 무작위로 처리 군으로 나누었다. 레트에 볼루스를 투여하거나 또는 매일 피하 투여하였다. 연구 내내 매일같이 계속해서 래트의 체중을 측정하였고, 마취하여 채혈하고 (필요에 따라서) 화합물을 투여하였다. 헤파린 처리된 모세관을 이용하여 안와 정맥동으로부터 혈액을 채취하였으며, 이를 EDTA 코팅된 미량 원심 분리 튜브에 넣었다. 혈장을 원심 분리에 의해 분리하고, 분석시까지 -80℃에 보관하여 두었다. 평균(+/- SD.) 혈장 농도를 시간 간격에 대해 그래프로 작성하였다.
펩티드 IGF-1은 소마토메딘 또는 인슐린 유사 성장 인자 군의 일원이다. IGF-1은 성장 호르몬의 성장 촉진 효과의 대다수를 매개한다. 제공된 래트/마우스 IGF-1 표준(Diagnosic Systems Laboratories)에 대한 경쟁적 결합 효소 면역 검정 키트를 사용하여 IGF-1의 농도를 측정하였다. 뇌하수체를 절개한 래트. 래트(n = 그룹 당 5∼7 마리)에 1회 투여하거나 또는 매일같이 피하 투여하였다. 매일같이, 연속해서 동물의 체중을 측정하고, 마취시켜 채혈하였으며, (필요에 따라서) 화합물을 추가로 투여하였다. 위약 처리시, 야생형 hGH(hGH) 처리시, His-태깅된 hGH((his)hGH) 처리시, 그리고 35번 및 92번 위치에 30kDa의 PEG가 공유 결합 되어 있는 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH 폴리펩티드 처리시 체중 변화를 측정하였다. 30KPEG-pAF35(his)hGH 화합물을 처리한 지 9일 되는 때에 체중을 관찰한 결과, 30KPEG-pAF92(his)hGH 화합물을 처리하였을 때와 통계학적으로 상이하였는데(p < 0.0005), 즉, 체중이 훨씬 많이 증가하였다. PEG화된 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 1회 투여한 후, 혈류 내 혈장 IGF-1 수준에 미치는 영향을, 양쪽 꼬리 분포(two-tailed distribution)를 나타내는 비대칭의(unpaired) 동등한 변수를 이용하여 t-검정법으로 분석하였다.
실시예 26: 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH(복소환 결합에 의해 PEG화된 hGH)의 안전성 및/또는 효능의 인간 대상 임상 실험
목적 : 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화된 재조합 인간 hGH를 피하 투여하였을 때의 안전성 및 약물 동태학적 특성을, 시판중인 hGH 제품[예를 들어, 휴머트로프(Humatrope)™(Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin)™(Genentech), 노르디트로핀(Norditropin)™(Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin)™(Pfizer) 및 사이젠(Saizen)/세로스팀(Serostim)™(Serono)] 중 하나 이상과 비교하기 위함.
환자 : 연령이 20∼40세 사이이고 체중이 60∼90㎏인 건강한 자원자 18명을 본 연구에 참여시켰다. 환자들은 혈액학 또는 혈청 화학 및 음성 소변 독성 스크리닝, HIV 스크리닝 및 B형 간염 표면 항원에 대해서 임상학적으로 상당히 비정상인 수치를 나타내지 않을 것이다. 이 환자들은 다음과 같은 소견들 중 임의의 것을 나타내어서는 안된다: 즉, 고혈압; 1차 혈액학적 질병력; 간, 신장, 심혈관, 위장, 비뇨 생식기, 대사, 신경 질병력; 빈혈 또는 발작 질환의 병력; 박테리아 또는 포유 동물 유래 생성물, PEG 또는 인간 혈청 알부민에 대한 알려진 감응 반응; 카페인 함유 음료의 습관성 및 중독성 섭취; 연구 개시 전 30일 이내에 다른 임상 실험에 참여하였거나 수혈 또는 헌혈한 경우; 연구 개시 전 3개월 이내에 hGH에 노출된 경우; 연구 개시 전 7일 이내에 앓았을 경우; 연구 개시 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가에서 상당한 비정상 소견을 보인 경우. 환자 모두는 안전성에 대해 평가받을 수 있으며, 약물 동태학적 분석을 위한 혈액 수집물 모두는 예정대로 수집한다. 모든 연구는 연구 윤리 위원회의 승인과 환자들의 동의를 얻어 수행한다.
연구 계획 : 본 연구는 건강한 남성 지원자에 있어서 제1의 단일 중심, 개방형인 임의의 2기 교차 연구로서 수행될 것이다. 18명의 환자들을 2개의 치료군 중 하나의 군에 무작위로 포함시켰다(9명/군). 2회의 개별 투여 기간에 걸쳐 GH를 투여하였다[비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 및 시판중인 제품 중 임의의 것을 동량으로 이용하여 상부 대퇴부에 일정 용량으로 피하 주사함]. 시판중인 제품을 투여하는 횟수 및 투여량은 포장 라벨에 적혀있는 대로 한다. 환자의 추가 군을 포함시켜 시판중인 제품을 사용할 때와 같이 추가 투여하고, 이때와 동일한 투여 횟수 또는 기타 매개 변수를 본 연구에 적용할 수 있다. 각 투여 기간의 중간 중간에는 14일씩의 워시 아웃(washout) 기간을 둔다. 2회의 각 투여 기간 동안 즉, 투여 전 12일 이상 동안, 그리고 투여 후 72 시간 동안(투여 기간 사이는 제외), 환자들을 연구 센터에 집합시켰다. PEG화된 hGH에 대한 추가 투여량, 투여 횟수 또는 기타 매개 변수가 검정되는 경우에는, 개체 군을 추가로 투입할 수 있다. 인간에게 사용하는 것에 대해 승인 얻은 GH 제형 다수가 본 연구에 사용될 수 있다. 휴머트로프™(Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀™(Genentech), 노르디트로핀™(Novo-Nordisk), 제노트로핀™(Pfizer) 및 사이젠/세로스팀™(Serono)은 인간에 사용하는 것에 대해 승인을 받은 GH 제품이다. hGH를 실험적으로 제형화한 것은 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH이다.
채혈 : hGH를 투여하기 전후로 정맥에 직접 구멍을 내어 혈액을 연속적으로 채취하였다. 투여하기 약 30분, 20분 및 10분 전(3개의 기준 시료)과, 투여후 대략 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 8시간, 12시간, 15시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간에, 혈청 GH 농도를 측정하기 위해 정맥혈 시료(5 ㎖)를 얻었다. 각각의 혈청 시료를 2개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 시료를 -20℃에 보관하였다. 혈청 시료를 드라이아이스 위에 놓아두었다. 실험 첫날 처음 투여하기 직전과, 4일째 경과 한 날 아침, 16일째 되는 날 투여 직전, 그리고 19일째 되는 날 아침에, 속성 임상 실험실 테스트(혈액학적 검사, 혈청 화학적 검사 및 소변 검사)를 수행하였다.
생물 분석 방법 : ELISA 키트를 사용하는 방법(Diagnostic Systems Laboratory[DSL], Webster TX)을 실시하여 혈청 중 GH 농도를 측정하였다.
안전성 측정 : 각 투여 직전(1일 및 16일)에, 그리고 각 투여 후 6, 24, 48 및 72 시간 경과시에 활력 증후를 기록하였다. 안전성 측정은 부작용의 발생 여부및 그 유형과, 임상 실험 테스트 결과의 (기준치로부터 발생한) 변화를 바탕으로 하였다. 뿐만 아니라, 활력 증후 예를 들어, 혈압 및 신체 검사 결과시 예비 연구 결과와의 차이점을 평가하였다.
데이터 분석 : 투여 후 각각의 수치로부터 평균 기준 GH 농도[투여 전 30, 20 및 10 분 경과시 수집한 3개의 시료로부터 GH 수치를 평균하여 측정]를 공제함 으로써, 투여 후 혈청 농도 수치를 투여 전 기준 GH 농도에 대해 보정하였다. 농도가 검정법의 정량 수준 이하일 경우, 투여 전 혈청 GH 농도는 평균 수치의 계산에 포함시키지 않는다. 기준 GH 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 약물 동태학적 매개 변수를 측정하였다. 디지털 이큅먼트 코포레이션(Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템[BIOAVL 소프트웨어 최신판 사용] 상에서 모델에 상관 없이 독립적인 방법으로써 약물 동태학적 매개 변수를 계산하였다. 다음과 같은 약물 동력학적 매개 변수를 측정한다: 피크 혈청 농도(Cmax); 시간 대 피크 혈청 농도(tmax); 선형 사다리꼴 규칙(linear trapezoidal rule)을 이용하여 계산된, 0 시간 → 최후 채혈 시간(AUC0-72)에 걸친 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC); 및 소멸률 상수로부터 계산한 최종 소멸 반감기(t1/2). 상기 소멸률 상수는 로그-선형 농도-시간 그래프의 최종 선형 영역에서의 연속적 데이터 포인트를 선형 회귀법으로 측정한다. 약물 동태학적 매개 변수의 평균, 표준 편차(SD) 및 변동 계수(CV)는 각 처리에 대해서 계산한다. 매개 변수 평균값의 비율(보존적 제형/비-보존적 제형)을 계산하였다.
안전성 결과: 부작용은 치료군 전반에 걸쳐 균등하게 발생하였다. 기준 또는 예비 연구 임상 실험 테스트 결과 또는 혈압은 임상학적으로 상당한 정도로 변하지는 않았으며, 예비 연구시 신체 검사 결과 및 활력 증후 측정치 역시 눈에 띌 정도로 변하지는 않았다. 2개의 치료 군에 대한 안전성 프로필은 유사하게 나타났다.
약물 동태학적 결과: 측정된 각 시점마다, 하나 이상의 시판 hGH 제품[예를 들어, 휴머트로프™(Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀™(Genentech), 노르디트로핀™(Novo-Nordisk), 제노트로핀™(Pfizer) 및 사이젠/세로스팀™(Serono)]이 1회 투여된 18명의 환자 모두에 있어서의 평균 혈청 GH 농도-시간 프로필(기준 GH 수준에 대해 보정하지 않음)을 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH와 비교한다. 모든 환자의 투여 전 기준 GH 농도는 정상적인 생리 범위 내이어야 한다. 투여 전 평균 기준 GH 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 약물 동태학적 매개 변수를 측정하고, Cmax 및 tmax를 측정한다. 선택된 임상학적 비교물[휴머트로프™(Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀™(Genentech), 노르디트로핀™(Novo-Nordisk), 제노트로핀™(Pfizer) 및 사이젠/세로스팀™(Serono)]에 대한 평균 tmax는 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화된 GH에 대한 tmax보다 상당히 짧았다. 테스트된 시판 GH 제품의 최종 반감기 수치는, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH의 최종 반감기 수치에 비하여 상당히 짧았다.
비록 본 연구는 건강한 남성 환자에 대하여 수행되었지만, 다른 환자 집단 예를 들어, 남성 또는 여성 암 환자 또는 만성 신부전 환자, 소아 신부전 환자, 자가 이식 예치 프로그램 수행중인 환자, 또는 수술 스케쥴이 잡혀있는 환자에서도 유사한 흡착 특성 및 안전성 프로필이 기대된다.
결과적으로, 피하 투여된 단일 투여량의 PEG화 hGH(비천연 암호화 아미노산 포함)는 안전하며, 건강한 남성 환자는 이를 잘 견뎌낼 것이다. 부작용 발생, 임상 실험 수치, 활력 증후 및 신체 검사 결과의 비교 결과를 바탕으로 하였을 때, 시판 중인, 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 및 hGH의 안전성 프로필은 균등할 것이다. 비천연 암호화 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH는 환자 및 건강 관리 제공자에게 매우 유익한 임상적 수단을 제공한다.
실시예 27: PEG화된 hGH와 PEG화되지 않은 hGH의 수용성 비교
100㎕의 물에 용해할 수 있는 각각의 폴리펩티드의 양을 측정하여, hGH 야생형 단백질(WHO hGH), His-태깅된 hGH 폴리펩티드(his-hGH), 또는 30kDa PEG가 92번 위치에 공유 결합된 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 His-태깅된 hGH 폴리펩티드의 수용성을 측정한다. PEG화된 hGH의 양은 WHO hGH 및 hGH의 양보다 많은데, 이로써, 비천연 아미노산 폴리펩티드가 PEG화되면 수용성도 증가함을 알 수 있다.
실시예 28: 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 내 연구
전립선 암 종양 이종 이식편을 마우스에 이식한 후 이 마우스를 2개의 군으로 나는다. 하나의 군은 매일같이 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드로 처리하고, 나머지 군은 매일같이 치료학적 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드로 처리한다. 이후 종양의 크기를 매일 측정하여, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료 효능이 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 치료 효능에 비하여 개선되었는지를 관찰한다[개선 여부는 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산으로 처리한 군에 대한 종양 크기가 줄어들었는지 여부로 확인함].
실시예 29: 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 내 연 구
전립선 암 종양 이종 이식편을 마우스에 이식한 후 이 마우스를 2개의 군으로 나는다. 하나의 군은 매일같이 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드로 처리하고, 나머지 군은 매일같이 치료학적 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드로 처리한다. 이후 종양의 크기를 매일 측정하여, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료 효능이 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드의 치료 효능에 비하여 개선되었는지를 관찰한다[개선 여부는 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산으로 처리한 군에 대한 종양 크기가 줄어들었는지 여부로 확인함].
이하 실시예에는 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관 내 및 생체 내 활성을 측정하고, 또한 이 활성을 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관 내 및 생체 내 활성과 비교하는 것에 관하여 기술되어 있다.
실시예 30: 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 및 친화성의 측정
본 실시예에는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 및 비천연 아미노산 폴리펩티드와 이의 수용체, 결합 파트너 또는 리간드의 친화성을 측정하는 것에 관하여 기술되어 있다.
비천연 아미노산 폴리펩티드 수용체, 결합 파트너 또는 리간드에 대한 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 따라서 발현 및 분리된다. 바이어코어(Biocore™) 시스템은 비천연 아미노산 폴리펩티드와 그것의 수용체의 결합을 분석하는데 사용되는 것이다. 이와 유사하게, 결합 파트너 또는 리간드도 본 검정법에 사용될 수 있다.
대략 600∼800 RU의 가용성 수용체를 바이어코어™ CM5 칩상에 고정시킨다(제조자의 권고에 따라서, 표준적인 아민-커플링법 이용). HBS-EP 완충액(Biacore™, Pharmacia) 중 다양한 농도의 야생형 또는 변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유속 40㎕/분으로 4∼5분 동안 표면에 주입한 후, 주입 후 15분 동안 해리 여부를 모니터하였다. 표면을 4.5M MgCl2 펄스(15초)로 재생시킨다. 100회 이상의 재생 주기를 진행시킨 이후에 관찰한 결과, 결합 친화성(1∼5%)은 최소한의 수준으로 상실되었다. 수용체가 고정되지 않은 참고 세포는 임의의 완충액 벌크 효과(bulk effect)와 비 특이적 결합을 유도해내는데 사용한다.
변형 또는 변형되지 않은 비천연 아미노산 폴리펩티드 역가 실험으로부터 얻어진 역학 결합 데이터를 바이어이벨류에이션 4.1 소프트웨어(BiaEvaluation 4.1 software; BIACORE™)로 처리한다. 평형 해리 상수(Kd)를 각각의 비율 상수의 비(koff/kon)로서 계산한다.
안정한 세포주는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 수용체, 결합 파트너 또는 리간드를 발현하도록 확립된다. 세포를 상기 수용체, 결합 파트너 또는 리간드 cDNA를 함유하는 구조물을 이용하여 전기 천공시킨다. 형질 감염된 세포를 클로닝하기 이전에 48시간 동안 회수한다. 형질 감염체를 발현하는 수용체, 결합 파트너 또는 리간드를 수용체에 대한 항체로 표면 염색하여 동정하고, 이를 FACS 어레이(BD Biosciences, San Diego, CA) 상에서 분석한다. 원하는 형질 감염체를 반복 하여 수 회 서브클로닝함으로써 안정하게 형질 감염된 세포 클론을 확립한다. 이러한 세포를 세포 결합 검정법에서 사용한다.
다양한 농도(부피:10㎕)의 비표지화된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 네거티브 대조군 폴리펩티드의 부재 또는 존재 하에, 그리고 125I-(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드(약 100,000 cpm 또는 1ng)의 존재 하에서, 세포(3×106)를 2개의 PBS/1% BSA(100㎕) 중에서 항온 처리한다(0℃, 90분)(총 부피 = 120㎕). 이후, 세포를 재현탁하여, 350㎕들이 플라스틱 원심 분리 튜브 중 200㎕의 얼음 냉각 FCS에 층을 형성하도록 만든 다음, 원심 분리한다(1000g; 1분). 튜브의 말단부를 컷 오프하여 펠릿을 수집하고, 이 펠릿과 상청액을 별도로 계수한다(감마 카운터; Packard).
비 결합량(cpm)은, 경쟁 물질 부재하에서의 총 결합량(2가지 경우의 평균) - (비-비 결합량(cpm)으로써 측정한다. 비-비 결합량은 사용된 세포 유형의 각각에 대해서 측정하였다. 각각 다른 날에 동일한 125I-(변형) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하여 실험을 수행하였으며, 이때에는 내부적으로 일관성을 가져야만 한다. 125I-(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체, 결합 단백질 또는 리간드-생산 세포와 결합한다. 결합은 표지화되지 않은 천연 아미노산 폴리펩티드에 의해서는 투여량 의존적 방식으로 억제되지만, 네거티브 대조군 폴리펩티드에 의해서는 그렇지 않다.
실시예 31: 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 내 연구
변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드, 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드 및 완충 용액을 마우스 또는 래트에 투여한다. 그 결과를 통하여, 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 활성 및 반감기에 비하여, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 및 반감기가 더욱 강하고 길다는 사실을 알게 될 것이다.
실시예 32: 접합 및 비 접합된, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 이의 변이체의 생체 내 반감기의 측정
모든 동물 실험은 AAALAC 인정 시설과 세인트 루이스 대학의 동물 실험 협의회에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 수행한다. 래트를 방안에 있는 우리에 각각 넣은 후 12 시간 동안 명기/암기에 노출시킨다. 동물에게는 임의로 퓨리나 설치류 먹이 5001과 물을 공급한다.
실시예 33: 약물 동태학적 연구
동물 실험에 들어가기에 앞서 각각의 치료학적 활성인 비천연 아미노산 폴의 양을 측정하였다. 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 비-환원성 조건 하에서 4∼12 %의 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔(MES SDS 완충액을 전개함)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 전개시켜 관찰하였다. 이 겔을 쿠마쉬 블루로 염색하였다. 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 밴드는 농도 측정 스캔 결과를 근거로 하였을 때 순도가 95% 이상이었다. 각 변형된 치료학적 활 성 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 내독소 수준을, KTA2 키트(Charles River Laboratories; Wilmington, MA)를 사용하는 역학적 LAL 검정법으로 시험한 결과, 투여 당 5 EU 미만이었다. 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 특성 규명하는 세포 검정법으로 평가한다.
수컷 스프라그-돌리 래트(261∼425 g)(Charles River Laboratories) 내에서, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약물 동태학적 특성을 각각 비교하였으며, 또한 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드와도 비교하였다. 채혈을 위해 경동맥에 카테터를 수술에 의해 꽂았다. 카테터를 성공적으로 삽관한 후, 화합물을 투여하기 이전에 동물들을 처리군으로 나누었다(그룹당 3∼6 마리). 동물에게 약 1㎎/㎏의 화합물을 피하 투여하였다(투여 부피 = 약 0.41∼약 0.55㎖/㎏). 삽관된 카테터를 통하여 여러 시점에서 혈액 시료를 채취하였으며, 이렇게 채취한 시료를 EDTA-코팅된 미량 원심 분리 튜브에 넣어 두었다. 원심 분리 후, 혈장을 수집하고, 분석시까지 이를 -80℃에 보관하였다. 바이오소스 인터내셔날(BioSource International; Camarillo, CA) 또는 다이아그노스틱 시스템즈 래보레토리즈(Diagnostic Systems Laboratories; Webster, TX)에서 시판되는 항체 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 화합물의 농도를 측정하였다. 농도는 투여된 유사체에 해당하는 표준을 이용하여 계산하였다. 약물 동력학적 매개 변수는 윈논린(Pharsight, 4.1 버젼) 모델링 프로그램으로 평가하였다. 상부 선형/하부 로그형 사다리꼴 통합법을 이용하는 비구획화 분석법을 수행하였으며, 농도 데이터는 균일하게 가중치를 적용하였다. 이후, 데이터로써 그래프를 작성하였다: Cmax = 최대 농도; 최종t1/2 = 최종 반감기; AUC0→inf = 무한대로 외삽한 농도-시간 곡선 아래 표면적; MRT = 평균 체류 시간; C1/f = 혈장 내 겉보기 총 소멸률; Vz/f = 최종 단계시 분포의 겉보기부피.
실시예 34: 약력학적 연구
수컷 스프라그-돌리 래트를 찰스 리버 래보레토리즈로부터 입수하였다. 동물들을 3주 동안(천연 아미노산 폴리펩티드와 관련된 생물학적 특징 관찰 시기) 환경에 적응시켰다. 이와 같이 생물학적 특징들에 허용 가능한 수준의 변화가 있는 동물을 처리군으로 무작위로 나누었다. 래트에 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 1회 볼루스 주사하거나 또는 매일 피하 주사하였다. 연구 기간 동안, 매일같이 래트를 연속으로 마취하고, 채혈한 다음 (허용 가능하면) 상기 폴리펩티드를 투여하였으며, 상관성 있는 생물학적 특징들을 측정한다. 헤파린 처리한 모세관을 이용하여 안와 누로부터 채혈하고, 이 혈액을 EDTA 코팅된 미세 원심 분리 튜브에 넣었다. 원심 분리에 의해 혈장을 분리하고, 이를 -80℃에 보관하여 두었다가 분석하였다. 래트에 1회 피하 투여한 후의 혈장 농도를 측정하였다.
실시예 35: 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성 및/또는 효능에 대한 인간 대상 임상 실험
목적 : 피하 투여된, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성과 약물 동태학적 특성을, 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드의 안전성과 약물 동태학적 특성과 비교하기 위함.
환자 : 연령이 20∼40세 사이이고 체중이 60∼90㎏인 건강한 자원자 18명을 본 연구에 참여시켰다. 환자들은 혈액학 또는 혈청 화학 및 음성 소변 독성 스크리닝, HIV 스크리닝 및 B형 간염 표면 항원에 대해서 임상학적으로 상당히 비정상인 수치를 나타내지는 않을 것이다. 이 환자들은 다음과 같은 소견들 중 임의의 것을 나타내어서는 안된다: 즉, 고혈압; 1차 혈액학적 질병력; 간, 신장, 심혈관, 위장, 비뇨 생식기, 대사, 신경 질병력; 빈혈 또는 발작 질환의 병력; 박테리아 또는 포유 동물 유래 생성물, PEG 또는 인간 혈청 알부민에 대한 알려진 감응 반응; 카페인 함유 음료의 습관성 및 중독성 섭취; 연구 개시 전 30일 이내에 다른 임상 실험에 참여하였거나 수혈 또는 헌혈한 경우; 연구 개시 전 3개월 이내에 치료학적 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드에 노출된 경우; 연구 개시 전 7일 이내에 앓았을 경우; 및 연구 개시 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가에서 상당한 비정상 소견을 보인 경우. 환자 모두는 안전성에 대해 평가받을 수 있으며, 약물 동태학적 분석을 위한 혈액 수집물 모두는 예정대로 수집한다. 모든 연구는 연구 윤리 위원회의 승인과 환자들의 동의를 얻어 수행한다.
연구 계획 : 본 연구는 건강한 남성 지원자에 있어서 제1의 단일 중심, 개방형인 임의의 2기 교차 연구로서 수행될 것이다. 18명의 환자들을 2개의 치료군 중 하나의 군에 무작위로 포함시켰다(9명/군). 2회의 개별 투여 기간에 걸쳐 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하였다[변형된 치료학적 활성인 비천 연 암호화 아미노산 폴리펩티드를 동량으로 이용하여 상부 대퇴부에 일정 용량으로 피하 주사함]. 환자의 추가 군을 포함시켜 원하는 만큼 추가 투여하고, 이때의 투여 횟수 또는 기타 매개 변수를 본 연구에 적용할 수 있다. 각 투여 기간의 중간 중간에는 14일씩의 워시 아웃 기간을 둔다. 2회의 각 투여 기간 동안 즉, 투여 전 12일 이상 동안, 그리고 투여 후 72 시간 동안(투여 기간 사이는 제외), 환자들을 연구 센터에 집합시켰다. 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 추가 투여량, 투여 횟수 또는 기타 매개 변수가 분석되는 경우에는, 개체 군을 추가로 투입할 수 있다.
채혈 : 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하기 전후로 정맥에 직접 구멍을 내어 혈액을 연속적으로 채취하였다. 투여하기 약 30분, 20분 및 10분 전(3개의 기준 시료)과, 투여후 대략 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 8시간, 12시간, 15시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간에, 혈청내 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 농도를 측정하기 위해 정맥혈 시료(5 ㎖)를 얻었다. 각각의 혈청 시료를 2개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 시료를 -20℃에 보관하였다. 혈청 시료를 드라이아이스 위에 놓아두었다. 실험 첫날 처음 투여하기 직전과, 4일째 경과 한 날 아침, 16일째 되는 날 투여 직전, 그리고 19일째 되는 날 아침에, 속성 임상 실험실 테스트(혈액학적 검사, 혈청 화학적 검사 및 소변 검사)를 수행하였다.
생물 분석 방법 : ELISA 키트 방법(Diagnostic Systems Laboratory[DSL], Webster TX)을 사용하여 혈청 중 농도를 측정한다.
안전성 측정 : 각 투여 직전(1일 및 16일)에, 그리고 각 투여 후 6, 24, 48 및 72 시간 경과시에 활력 증후를 기록하였다. 안전성 측정은 부작용의 발생 여부및 그 유형과, 임상 실험 테스트 결과의 (기준치로부터 발생한) 변화를 바탕으로 하였다. 뿐만 아니라, 활력 증후 예를 들어, 혈압 및 신체 검사 결과시 예비 연구 결과와의 차이점을 평가하였다.
데이터 분석 : 투여 후 각각의 수치로부터 평균 기준 농도[투여 전 30, 20 및 10 분 경과시 수집한 3개의 시료로부터 얻어진 수치를 평균하여 측정]를 공제함으로써, 투여 후 혈청 농도 수치를 투여 전 기준 농도에 대해 보정하였다. 농도가 검정법의 정량 수준 이하일 경우, 투여 전 혈청 농도는 평균 수치의 계산에 포함시키지 않는다. 기준 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 약물 동태학적 매개 변수를 측정하였다. 디지털 이큅먼트 코포레이션 VAX 8600 컴퓨터 시스템[BIOAVL 소프트웨어 최신판 사용] 상에서 모델에 상관없이 독립적인 방법으로써 약물 동태학적 매개 변수를 계산하였다. 다음과 같은 약물 동태학적 매개 변수를 측정한다: 피크 혈청 농도(Cmax); 시간 대 피크 혈청 농도(tmax); 선형 사다리꼴 규칙을 이용하여 계산된, 0 시간 → 최후 채혈 시간(AUC0-72)에 걸친 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC); 및 소멸률 상수로부터 계산한 최종 소멸 반감기(t1/2). 상기 소멸률 상수는 로그-선형 농도-시간 그래프의 최종 선형 영역에서의 연속적 데이터 포인트를 선형 회귀법으로 측정한다. 약물 동태학적 매개 변수의 평균, 표준 편 차(SD) 및 변동 계수(CV)는 각 처리에 대해서 계산한다. 매개 변수 평균값의 비율(보존적 제형/비-보존적 제형)을 계산하였다.
안전성 결과: 부작용은 치료군 전반에 걸쳐 균등하게 발생하였다. 기준 또는 예비 연구 임상 실험 테스트 결과 또는 혈압은 임상학적으로 상당한 정도로 변하지는 않았으며, 예비 연구시 신체 검사 결과 및 활력 증후 측정치 역시 눈에 띌 정도로 변하지는 않았다. 2개의 치료 군에 대한 안전성 프로필은 유사하게 나타났다.
약물 동태학적 결과: 변형된 치료학적 활성인 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여한 후, 18명 모두에 있어서의 평균 혈청 내 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드 농도-시간 프로필(기준 수준에 대해 보정하지 않음)을 각각의 시점에서 측정된 프로필과 비교한다. 모든 개체에게 투여 전 기준 농도만큼(생리적 정상 범위 이내) 투여한다. 투여 전 기준 농도에 대해 보정한 혈청 내 데이터로부터 약물 동태학적 매개 변수를 측하고, 또한 Cmax 및 tmax도 측정한다. 치료학적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 평균 tmax는 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 tmax보다 상당히 짧다. 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 최종 반감기 값은, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 최종 반감기보다 상당히 짧다.
비록 본 연구는 건강한 남성 환자에 대하여 수행되었지만, 다른 환자 집단 예를 들어, 남성 또는 여성 암 환자 또는 만성 신부전 환자, 소아 신부전 환자, 자 가 이식 예치 프로그램 수행중인 환자, 또는 예정 수술 스케쥴이 잡혀있는 환자에서도 유사한 흡착 특성 및 안전성 프로필이 기대된다.
결과적으로, 피하 투여된 단일 투여량의 변형된 치료학적 활성 비천연 암호화 아미노산은 안전하며, 건강한 남성 환자는 이를 잘 견뎌낼 것이다. 부작용 발생, 임상 실험 수치, 활력 증후 및 신체 검사 결과의 비교 결과를 바탕으로 하였을 때, 변형된 치료학적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 치료학적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 PEG화 hGH 및 hGH의 안전성 프로필은 균등할 것이다. 변형된 치료학적 활성 비천연 암호화 아미노산 폴리펩티드는 환자 및 건강 관리 제공자에게 매우 유익한 임상적 수단을 제공한다.
본원에 개시된 실시예 및 구체예는 오로지 예시를 위한 목적으로 기술된 것이며, 이에 다양한 변형 또는 변화를 가할 수 있다는 사실은 당업자들도 알고 있으며, 또한 이와 같은 다양한 변형 또는 변화는 첨부된 청구항의 범위와 본원의 사상 및 범위 내에 포함된다는 사실을 알 수 있다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 본원에 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.
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Figure 112008047567393-PCT00189
Figure 112008047567393-PCT00190
SEQUENCE LISTING <110> Miao, Zhenwei Liu, Junjie <120> Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-Natural Amino Acids and Polypeptides <130> AMBX-0105.00PCT <140> PCT/US2006/049397 <141> 2006-12-27 <160> 17 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 1 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized amber supressor tRNA <400> 2 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 3 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-L-phenylalanine <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-benzoyl-L-phenylalanine <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ala Ala Ile 20 25 30 Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln Ile 35 40 45 Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile Leu 50 55 60 Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp Glu 65 70 75 80 Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met Gly 85 90 95 Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys Asp 100 105 110 Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro Lys 130 135 140 Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His Met 165 170 175 Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn Pro 180 185 190 Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys Gly 195 200 205 Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ile 210 215 220 Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile Met 225 230 235 240 Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg Pro 245 250 255 Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu Glu 260 265 270 Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn Ala 275 280 285 Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg Leu 290 295 300 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ile Pro Tyr 145 150 155 160 Leu Pro Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 8 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 8 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Lys Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 9 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val 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Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 11 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu 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Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 16 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 16 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305

Claims (41)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2를 포함하는 화합물 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물:
    화학식 1
    Figure 112008047567393-PCT00191
    화학식 2
    Figure 112008047567393-PCT00192
    [식 중,
    A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
    B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저 급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    T1은 결합 또는 CH2이고;
    T2는 CH이며;
    여기서, 임의의 치환기는 각각 독립적으로 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 치환된 저급 시클로알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 알키닐, 저급 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 저급 헤테로시클로알킬, 치환된 저급 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아릴킬로부터 선택되고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
    -A-B-디아민 함유부는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는
    -B-디아민 함유부 기는 함께, 하나 이상의 디아민기, 보호된 디아민기 또는 마스킹된 디아민기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 시클로아릴 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
    여기서, -A-B-디아민 함유부 상의 하나 이상의 아민기는 경우에 따라 보호된 아민임].
  2. 제1항에 있어서, 상기 A는 치환 또는 비치환 저급 알킬렌이거나, 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 또는 티오페닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비치환 또는 치환 아릴렌인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알 킬렌)- 또는 -S(O)2(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 B는 -O(CH2)-, -NHCH2-, -C(O)-(CH2)-, -CONH-(CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2- 또는 -S(O)2CH2-인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 R1은 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA) 또는 벤질옥시카보닐(Cbz)인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 R2는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 R2는 폴리뉴클레오티드인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 R2는 리보핵산(RNA)인 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 R2는 tRNA인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 tRNA는 셀렉터 코돈(selector codon)을 특이적으로 인지하는 것인 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버 코돈(amber codon), 오커 코돈(ochre codon), 오팔 코돈(opal codon), 유니크 코돈(unique codon), 희귀 코돈(rare codon), 비천연 코돈(unnatural codon), 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 R2는 서프레서 tRNA(supressor tRNA)인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 하기 화학식 3 또는 화학식 4에 해당하는 것인 화합물:
    화학식 3
    Figure 112008047567393-PCT00193
    화학식 4
    Figure 112008047567393-PCT00194
    [식 중,
    Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")2, -C(O)N(R")2, -OR" 및 -S(O)kR"(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
  16. 제15항에 있어서,
    Figure 112008047567393-PCT00195
    의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물; 또는 이의 염; 또는 임의의 위치에 상기 화합물 중 임의의 것이 통합된 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 -B-디아민 함유부 상의 하나 이상의 아민기는 보호된 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아민 보호기는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure 112008047567393-PCT00196
  19. 제18항에 있어서,
    Figure 112008047567393-PCT00197
    의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물; 또는 이의 염; 또는 임의의 위치에 상기 화합물 중 임의의 것이 통합된 폴리펩티드.
  20. 제1항의 화합물이 하나 이상 통합된 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료용 단백질과 상동성인 단백질인 폴리펩티드.
  22. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 온화한 조건 하에서 수용액 중 디카보닐 함유 제제와 반응성인 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 화합물과 상기 디카보닐 함유 제제의 반응은 하기 특징들 중 하나 이상을 나타내는 것인 화합물: (i) pH 약 4∼약 10에서 일어남; (ii) 생물학적 조건 하에서 안정한 복소환 결합을 형성함; (iii) 위치 특이적임; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않음; (v) 실온에서 신속하게 진행됨; (vi) 수성 조건에서 용이하게 진행됨; (vii) 화합물 대 디카보닐 함유 제제의 비율이 약 1:1일 때 용이하게 진행됨; 또는 (viii) 위치 선택적(regioselective) 및/또는 위치 특이적(regiospecific)임.
  24. 제22항에 있어서, 상기 화합물과 상기 디카보닐 함유 제제의 반응은 하기 특 징들 중 4 가지 이상을 나타내는 것인 화합물: (i) pH 약 4∼약 10에서 일어남; (ii) 생물학적 조건 하에서 안정한 복소환 결합을 형성함; (iii) 위치 특이적임; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않음; (v) 실온에서 신속하게 진행됨; (vi) 수성 조건에서 용이하게 진행됨; (vii) 화합물 대 디카보닐 함유 제제의 비율이 약 1:1일 때 용이하게 진행됨; 또는 (viii) 위치 선택적 및/또는 위치 특이적임.
  25. 제22항에 있어서, 상기 온화한 조건은 pH 약 2∼약 10인 화합물.
  26. 제22항에 있어서, 상기 온화한 조건은 pH 약 4∼약 9인 화합물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액 중에서 1개월 이상 동안 안정한 것인 화합물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 pH 약 2∼약 10에서 안정한 것인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 화합물은 pH 약 4∼약 9에서 안정한 것인 화합물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 화합물은 2주 이상 동안 안정한 것인 화합물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 화합물은 5일 이상 동안 안정한 것인 화합물.
  32. 하기 화학식 XXXVIII 또는 화학식 XXXIX의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물:
    화학식 XXXVIII
    Figure 112008047567393-PCT00198
    화학식 XXXIX
    Figure 112008047567393-PCT00199
    [식 중,
    A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이 고;
    B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
    Z1은 결합, CR7R7, O, S, NR', CR7R7-CR7R7, CR7R7-O, 0-CR7R7, CR7R7-S, S- CR7R7, CR7R7-NR', NR'-CR7R7이고;
    R'는 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    Z2는 결합, -C(O)-, -C(S)-, 임의로 치환된 C1∼C3알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C3알케닐렌 및 임의로 치환된 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이거나; 또는
    인접한 임의의 2개의 R7기는 함께, 임의로 치환된 5∼8원 복소환, 시클로알킬 또는 아릴 고리를 형성하고; 여기서, 상기 임의의 치환기들은 할로겐, OH, C1∼6알킬, C1∼6알콕시, 할로-C1∼6알킬, 할로-C1∼6알콕시, 아릴, 할로아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
    단, Z1과 Z2는 3개 이하의 고리 원자를 제공하고;
    R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
    R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환 된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
  33. 제32항에 있어서, 하기 화학식 XLI 또는 화학식 XLII의 구조를 갖는 것인 화합물:
    화학식 XLI
    Figure 112008047567393-PCT00200
    화학식 XLII
    Figure 112008047567393-PCT00201
    [식 중,
    Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R', -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택됨].
  34. 제33항에 있어서, 하기 화학식의 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112008047567393-PCT00202
    .
  35. 하기 화학식 XLIII, 화학식 XLIV 및 화학식 XLV로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물:
    화학식 XLIII
    Figure 112008047567393-PCT00203
    화학식 XLIV
    Figure 112008047567393-PCT00204
    화학식 XLV
    Figure 112008047567393-PCT00205
    [식 중,
    A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
    B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치 환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
    Z1은 결합, CR5R5, CR5R5-CR5R5, CR5R5-O, O-CR5R5, S-CR5R5, NR5-CR5R5, CR5R5-S 및 CR5R5-NR5이며;
    Z2는 임의로 치환된 C1∼C3알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C3알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Z3은 독립적으로 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)- 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되며[단, 적어도 하나의 Z3은 결합이 아님];
    T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이고; R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며; 단, T3이 O 또는 S일 때, R은 할로겐일 수 없고;
    R6은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이고;
    단, Z1과 Z2는 3개 이하의 고리 원자를 제공하며;
    R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키 닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
    R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
  36. 제35항에 있어서, 하기 화학식 XLIX, 화학식 L 및 화학식 LI의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    화학식 XLIX
    Figure 112008047567393-PCT00206
    화학식 L
    Figure 112008047567393-PCT00207
    화학식 LI
    Figure 112008047567393-PCT00208
    [식 중,
    Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택됨].
  37. 제36항에 있어서,
    Figure 112008047567393-PCT00209
    의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  38. 하기 화학식 XLVI의 화합물, 화학식 XLVII의 화합물 및 화학식 XLVIII의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물:
    화학식 XLVI
    Figure 112008047567393-PCT00210
    화학식 XLVII
    Figure 112008047567393-PCT00211
    화학식 XLVIII
    Figure 112008047567393-PCT00212
    [식 중,
    A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
    B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
    Z1은 결합, CR5R5, CR5R5-CR5R5, CR5R5-O, O-CR5R5, S-CR5R5, NR5-CR5R5, CR5R5-S 및 CR5R5-NR5이며;
    Z3은 독립적으로 결합, 임의로 치환된 C1∼C4알킬렌, 임의로 치환된 C1∼C4알케닐렌, 임의로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)- 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    M2는
    Figure 112008047567393-PCT00213
    (여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이고;
    M3은
    Figure 112008047567393-PCT00214
    (여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이며;
    M4는
    Figure 112008047567393-PCT00215
    (여기서, (a)는 B기에의 결합을 나타내고, (b)는 복소환기 내 각각의 위치에의 결합을 나타냄)이고;
    T3은 결합, C(R)(R), O 또는 S이며, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
    R6은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬이고;
    R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키 닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
    R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
  39. 제38항에 있어서, 하기 화학식 LII의 화합물, 화학식 LIII의 화합물 및 화학식 LIV의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    화학식 LII
    Figure 112008047567393-PCT00216
    화학식 LIII
    Figure 112008047567393-PCT00217
    화학식 LIV
    Figure 112008047567393-PCT00218
    [식 중,
    Ra는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R'-, -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 선택됨].
  40. 하기 화학식 LV의 화합물, 화학식 LVI의 화합물 및 화학식 LXII의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 활성 대사산물, 염, 또는 약학적으로 허용 가능한 전구약물 또는 용매화물:
    화학식 LV
    Figure 112008047567393-PCT00219
    화학식 LVI
    Figure 112008047567393-PCT00220
    화학식 LXII
    Figure 112008047567393-PCT00221
    [식 중,
    A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고;
    B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우 한쪽 말단부가 디아민 함유부에 결합된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치 환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R3과 R4, 또는 2개의 R3기는 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
    R6은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이고;
    R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2이며, 여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나; 또는
    R5는 L-X로서, 여기서, X는 원하는 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -S(O)k-(식 중, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임].
  41. 제40항에 있어서, 하기 화학식의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure 112008047567393-PCT00222
    [식 중,
    Ra는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(O)R'-, -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(식 중, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨].
KR1020087016090A 2005-12-30 2006-12-27 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와관련된 방법 및 그 용도 KR20080081013A (ko)

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