JP2007519422A - 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用 - Google Patents

修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用 Download PDF

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ウイルソン，トロイ
シム，ビー−チエン
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Abstract

修飾されたヒト四螺旋バンドル（４ＨＢ）ポリペプチド及びその使用が提供される。

Description

（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００４年２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／５４１，５２８号、２００４年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５８１，３１４号、２００４年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５８１，１７５号、２００４年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５８０，８８５号、及び２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３８，６１６号の優先権を主張し、これらの明細書はその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、天然にコードされていない少なくとも一つのアミノ酸で修飾された四螺旋バンドル（４ＨＢ）ポリペプチドに関する。
成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリー（Ｂａｚａｎ， Ｆ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９１）； Ｍｏｔｔ， Ｈ． Ｒ． ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ． Ｄ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｍｌｏｉｎｅｎ，Ｏ．及びＩｈｌｅ， Ｊ． Ｎ．（１９９６） ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ）は、類似の構造的特徴を有する一群のタンパク質である。このタンパク質ファミリーの各メンバーは、四螺旋バンドルを含み、その一般的な構造は図１に示されている。本明細書において、ファミリーメンバーは、「四螺旋バンドルポリペプチド」又は「４ＨＢ」ポリペプチドと称される。今後さらに同定されるべきファミリーのさらなるメンバーが存在するが、本ファミリーの幾つかのメンバーには、以下のものが含まれる。成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０，ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、εインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）。一般に、限られたアミノ酸又はＤＮＡ配列同一性を有するという事実にもかかわらず、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは類似の二次及び三次構造を有する。構造的な特徴を共有しているため、遺伝子ファミリーの新規メンバーは容易に同定することができる。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＮＦα−２及びＧ−ＣＳＦの一般構造は、それぞれ、図２、３、４及び５に示されている。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの一つのメンバーは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ヒト成長ホルモンは、正常なヒトの成長及び発達の制御の多くに関与している。天然に存在するこの一本鎖下垂体ホルモンは、１９１アミノ酸残基からなり、約２２ｋＤａの分子量を有する。ｈＧＨは、とりわけ、線形成長（身体成長（ｓｏｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ））、乳汁分泌、マクロファージの活性化並びにインシュリン様及び糖尿病誘発効果など多様な生物学的効果を示す（Ｃｈａｗｌａ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ３４：５１９−５４７（１９８３）；Ｉｓａｋｓｓｏｎ，Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４７：４８３−４９９（１９８５）； Ｈｕｇｈｅｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｆｒｉｅｓｅ， Ｈ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４７：４６９−４８２（１９８５））。
ｈＧＨの構造は周知であり（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４−５４８（１９７９）、ｈＧＨの三次元構造は、Ｘ線結晶学によって明らかにされている（ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。該タンパク質は、Ａ−Ｄと称されるＮ末端から始まる４つの両親媒性α螺旋バンドルを含み、ループによって連結されたコンパクトな球状構造を有する。ｈＧＨは、２つの分子内ジスルフィド結合（Ｃ５３はＣ１６５と対を形成し、Ｃ１８２はＣ１８９と対を形成している。）に関与する４つのシステイン残基も含有する。ホルモンはグリコシル化されておらず、Ｅ．コリ中では、分泌型として発現される（Ｃｈａｎｇ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５５：１８９−１９６（１９８７））。
天然に存在する多数のｈＧＨの変異体が同定されている。これらには、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｅｒｇ， ＤＮＡ １：２３９（１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、第４，６７０，３９３号及び第４，６６５，１８０号を参照これらは参照により、本明細書に組み込まれる。）及びｈＧＨの残基３２ないし４６の欠失を含有する２０−ｋＤａのｈＧＨが含まれる（Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９２５：３１４（１９８７）； Ｌｅｗｉｓ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５３：２６７９−２６８７（１９７８））。さらに、転写後、翻訳後、分泌、代謝的プロセッシング及び他の生理的プロセスから生じる多数のｈＧＨバリアントが報告されている（Ｂａｕｍａｎｎ， Ｇ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：４２４（１９９１））。
ｈＧＨの生物学的効果は、特異的な細胞受容体とのその相互作用に由来する。本ホルモンは、胎盤性ラクトゲン及びプロラクチンを含む相同タンパク質のファミリーのメンバーである。しかしながら、広い種特異性を示し、クローニングされた体形成（Ｌｅｕｎｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５３７−５４３（１９８７））又はプロラクチン（Ｂｏｕｔｉｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５３ ：６９−７７（１９８８））受容体の何れかに結合するという点で、ｈＧＨは、本ファミリーのメンバーとしては異質である。構造的及び生化学的研究に基づいて、乳腺刺激性及び体形成性結合ドメインに対する機能的な地図が提案されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ． ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：３４０７（１９９１））。ｈＧＨ受容体は、造血／サイトカイン／増殖因子受容体ファミリーのメンバーであり、これには、インターロイキン（ＩＬ）−３−、−４及び−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ受容体並びにＧ−ＣＳＦ受容体などの他の幾つかの増殖因子受容体が含まれる。「Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９３４−６９３８（１９９０）」を参照されたい。サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、保存された４つのシステイン残基及び膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフを含有する。保存された配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関わると考えられている。例えば、「Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １８４：４８５−４９０（１９９２）」を参照されたい。ｈＧＨとその受容体（ｈＧＨｂｐ）の細胞外ドメインとの相互作用は、最も深く理解されているホルモン−受容体相互作用の一つである。高解像度Ｘ線結晶学的データ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：８２１−８２５（１９９１））は、ｈＧＨが２つの受容体結合部位を有し、分子上の異なる部位を使用して順次２つの受容体分子を結合することを示した。２つの受容体の結合部位は、部位Ｉ及び部位ＩＩと称される。部位Ｉは、螺旋Ｄのカルボキシ末端及び螺旋Ａの一部及びＡ−Ｂループを含むのに対して、部位ＩＩは、螺旋Ａのアミノ末端領域及び螺旋Ｃの一部を包含する。その受容体へのＧＨの結合は、順番に起こり、部位Ｉが最初に結合する。次いで、部位ＩＩは第二のＧＨ受容体を係合し、受容体二量体化及びホルモンに対して細胞応答をもたらす細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。Ｇ１２０Ｒ置換が部位ＩＩ中に導入されたｈＧＨミュテインは、単一のｈＧＨ受容体を結合することができるが、２つの受容体を二量体化することはできない。ミュテインは、おそらく、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく受容体部位を占領することにより、インビトロでｈＧＨアンタゴニストとして作用する（Ｆｕｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７−１６８０（１９９２））。
組換えｈＧＨは治療剤として使用され、数多くの適応症の治療に対して承認されている。ｈＧＨ欠乏は小人症を引き起こし、例えば、ホルモンの外来投与によって、１０年超にわたって首尾よく治療されている。ｈＧＨ欠乏のほかに、ｈＧＨは、腎不全（小児の）、ターナー症候群及びＡＩＤＳ患者における悪液質の治療に対しても承認を受けている。最近、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、非ＧＨ依存性の小人症の治療に対してｈＧＨを承認した。ｈＧＨは、老化、高齢者の虚弱、短腸症候群及びうっ血性心不全の治療に関しても現在調査されている。
組換えｈＧＨは、現在、日常注射可能な製品として売られており、５つの代表的な製品、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ＮｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／ＳｅｒｏｓｔｉｍＴＭ（Ｓｅｒｏｎｏ）が現在市場で売られている。しかしながら、成長モルモンを治療薬として使用する場合の著しく困難な課題は、本タンパク質が短いインビボ半減期を有していることであり、従って、最大の有効性を得るために毎日皮下注射によって投与しなければならない（ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８１：１８０６−１８０９（１９９６））。製造コストを低下し、患者にとって投与を容易にし、効力及び安全性プロファイルを改善し、及び競合的な有利さを付与し得る他の特性を作り出すことによって、ｈＧＨアゴニスト及びアンタゴニストの投与を改善するための手段に対して、多大な努力が注力されている。例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈとＡｌｋｅｒｍｅｓは、小児成長ホルモン欠乏症に対して、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（ｈＧＨのデポ製剤）をかつて販売していた。デポ剤は、より少ない頻度での投与（毎日一度ではなく、２ないし３週ごとに一度）を可能とするが、生物学的利用性の減少及び注射部位の痛みなどの望ましくない副作用も伴い、２００４年に、市場から撤去された。別の製品であるＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）も、最近、ＦＤＡによって承認された。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭは、末端肥大症の治療を適応症とする極めて選択的な成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する、遺伝子操作されたｈＧＨの類縁体である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５８：１７５４−１７５９（２００１））。ＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔＴＭ中のアミノ酸側鎖残基の幾つかがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで誘導体化されているが、この製品も毎日一度投与され、薬理学的特性が最適でないことを示唆する。ＰＥＧ化及びデポ製剤の他に、ｈＧＨの吸入剤形及び経口剤形などの他の投与経路が初期段階の前臨床及び臨床開発中であるが、何れもＦＤＡから承認を受けていない。従って、成長ホルモン活性を示すが、さらに長い血清半減期を与え、従って、より最適なｈＧＨの治療レベルと増加した治療的半減期も与えるポリペプチドが必要とされている。
インターフェロンは、ウイルスによって侵入され、又は他のある種の物質に曝露された細胞によって放出される、比較的小さな一本鎖糖タンパク質である。インターフェロンは、現在、１）白血球インターフェロン（インターフェロン−α、α−インターフェロン、ＩＦＮ−α）、２）繊維芽細胞インターフェロン（インターフェロン−β、β−インターフェロン、ＩＦＮ−β）、及び３）免疫インターフェロン（インターフェロン−γ、γ−インターフェロン、ＩＦＮ−γ）という３つの主要なクラスに分類される。ウイルス感染に応答して、リンパ球は、主として（ωインターフェロン、ＩＦＮ−ωとともに）α−インターフェロンを合成するが、繊維芽細胞の感染は、通常、β−インターフェロン産生を誘導する。ＩＦＮα及びＩＦＮβは、約２０ないし３０パーセントのアミノ酸配列相同性を有している。ヒトＩＦＮ−βに対する遺伝子はイントロンを欠き、ヒトＩＦＮ−αと２９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードしており、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β遺伝子が共通の先祖から進化したことを示唆している（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８５ ５４７−５４９（１９８０））。これに対して、ＩＦＮ−γは、分裂促進因子に応答してリンパ球によって合成される。ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮωは、ＭＨＣクラスＩ抗原発現を誘導することが知られており、Ｉ型インターフェロンと称されているのに対して、ＩＦＮγはＭＨＣクラスＩＩ抗原発現を誘導し、ＩＩ型インターフェロンと称されている。
ＩＦＮαの異なる種をコードする数多くの異なる遺伝子が同定されている。αインターフェロンは、２つの主要なクラスＩ及びＩＩに属し、それぞれ、複数の別個のタンパク質を含有する（Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，１７９−１９０（１９９０）； Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４０１−４０８（１９８０）； Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８４，３１６−３２０（１９８０）； Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９，１３４３−１３４７（１９８０）； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ ２９０，２０−２６（１９８１）； Ｌａｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２，１１５９−１１６２（１９８１）； Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５６，４６７−４８６（１９８２）； Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ｂ２９９，７−２８（１９８２）； Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１，２４３５−２４３９（１９８４）； Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５，７６８（１９８５））。様々なＩＦＮ−α種には、ＩＦＮ−αＡ（ＩＦＮ−α２）、ＩＦＮ−αＢ、ＩＦＮ−αＣ、ＩＦＮ−αＣ１、ＩＦＮ−αＤ（ＩＦＮ−α１）、ＩＦＮ−αＥ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＦＮ−αＨ、ＩＦＮ−αＩ、ＩＦＮ−αＪ１、ＩＦＮ−αＪ２、ＩＦＮ−αＫ、ＩＦＮ−αＬ、ＩＦＮ−α４Ｂ、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７４、ＩＦＮ−α７６ ＩＦＮ−α４ａ）、ＩＦＮ−ａ８８及びそれらの対立遺伝子が含まれる。
インターフェロンは、元々、インターフェロン産生を増加するために必要に応じて誘導剤を使用して、軟膜白血球及び繊維芽細胞などの天然源から得られた。インターフェロンは、組換えＤＮＡ技術によっても製造されている。
組換えＩＦＮαＡ（ＩＦＮαＡ、ＩＦＮα２としても知られている。）のクローニングと発現は、「Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２８７，４１１（１９８０）」によって記載された。ＩＦＮαＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ及びＬのアミノ酸配列は、コードするヌクレオチド配列とともに、「Ｐｅｓｔｋａ ｉｎ Ａｒｃｈｉｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２２１， １（１９８３）」によって記載されている。成熟したＩＦＮβのクローニング及び発現は、「Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ． ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８，４０５７（１９８０）」によって記載されている。成熟したＩＦＮ−γのクローニング及び発現は、「Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９５，５０３（１９８２）」によって記載されている。ＩＦＮωは、「Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５，７６８（１９８５）」によって記載されている。ＩＦＮτは、「Ｗｈａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１０８６４−８（１９９４）」によって同定及び開示されている。
インターフェロンは、抗ウイルス、免疫制御及び抗増殖特性を含む様々な生物学的活性を有し、癌及び様々なウイルス性疾患などの疾病の治療のための治療剤として使用されている。クラスとして、インターフェロン−αは、様々な種類の細胞増殖を阻害することが示されており、癌、特に白血病などの血液学的悪性疾患に頻繁に伴う様々な細胞増殖疾患の治療に特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、低度のリンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌腫、膀胱癌及び卵巣癌に対する抗増殖活性を示した（Ｂｏｎｎｅｍ， Ｅ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ３：５８０； Ｏｌｄｈａｍ， Ｒ． Ｋ．（１９８５） Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０：７１）。
市販のＩＦＮ製品の具体例には、ＩＦＮγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ））、ＩＦＮβ−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）、及びＲｅｂｉｆ（Ｒ））、ＩＦＮβ−１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ））、ＩＦＮアルファコン−１（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（Ｒ））、ＩＦＮα−２（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））、ＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ））、Ｐｅｇインターフェロンα−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（Ｒ））及びＰｅｇインターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ））が含まれる。ＩＦＮタンパク質のＰＥＧ化されたバージョンの産生に関する幾つかの問題が、「Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５４：５４７−５７０」及び「Ｐｅｄｄｅｒ， Ｓ． Ｃ． Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ． ２００３； ２３ Ｓｕｐｐｌ １：１９−２２」に記載されている。Ｗａｎｇらは、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）の位置異性体を特定し、Ｐｅｄｄｅｒらは、Ｐｅｇａｓｙｓ（Ｒ）をＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）と比較し、使用されたＰＥＧ化化学反応の不安定さと処方に対する効果について記載している。現在、数多くのＩＦＮ製品が市場で販売されているにもかかわらず、充たされていない必要性がインターフェロン治療に対して存在する。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの別のメンバーは、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。天然に存在するＧ−ＣＳＦは、約２０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する約１７７アミノ酸の糖タンパク質ホルモンである。Ｇ−ＣＳＦの結晶構造が公知であり（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５１６７−７１）、その受容体に結合されたＧ−ＣＳＦの結晶構造も公知である（Ａｒｉｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｎａｔｕｒｅ，４０１：７１３−７１７）。Ｇ−ＣＳＦの三次元構造は、原子レベルで公知である。Ｇ−ＣＳＦの三次元構造から、Ｇ−ＣＳＦ分子のアミノ酸組成の変化がどのように構造的な変化をもたらし得るかを予想することが可能である。これらの構造特性又は変化は、Ｇ−ＣＳＦ類縁体を設計及び製造するために生物学的活性と相関し得る。
Ｇ−ＣＳＦは、好中球顆粒球の増殖、分化及び機能的活性化を制御する薬学的に活性なタンパク質である（Ｍｅｔｃａｌｆ， Ｂｌｏｏｄ ６７：２５７（１９８６）；Ｙａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ８４（３）：７９５−７９９（１９９４）；Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ８１（１１）：３１５８−３１６３（１９９３）； Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｔ’ｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２２：１１５６−１１６３（１９９４）；Ｎｅｂｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ８１（７）：１９６０−１９６７（１９９３）；Ｗｅｌｔｅ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ−ＵＳＡ ８２：１５２６−１５３０（１９８５）； Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５（１９８６） ａｎｄ Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ， Ｊ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２６：２ １−１４（１９８９））。Ｇ−ＣＳＦは、ヒト膀胱癌細胞株５６３７の細胞培養上清から均一になるまで精製された（Ｗｅｌｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ（１９８５）８２：１５２６−３０）。野生型のＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡの配列は、「Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３２：６１−６５」から公知である。第二のイントロン中での選択的スプライシングの結果、最初の３０アミノ酸がシグナルペプチドに相当する２０４又は２０７のアミノ酸を有するＧ−ＣＳＦの２つの天然型が存在する（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｄ． Ｍａｌｅ ａｎｄ Ｃ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）。成熟したタンパク質は約１９ｋＤａの分子量を有し、分子間又は分子内ジスルフィド架橋を形成することができる５つのシステイン残基を有することが示された。結合研究は、Ｇ−ＣＳＦが好中球顆粒球に結合することを示した。赤血球、リンパ性好酸球細胞株及びマクロファージには、殆ど又は全く結合が観察されない。
ヒトでは、内在性Ｇ−ＣＳＦは、血液の血漿中に検出することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２：１ ８３−１１１（１９８９））。Ｇ−ＣＳＦは、繊維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、トロホブラスト、内皮細胞及び上皮細胞によって産生され、第１７染色体上に存在する４つのエキソンと５つのイントロンから構成される単一コピー遺伝子の発現産物である。この遺伝子坐の転写は、異なってプロセッシングされるｍＲＮＡ種を産生し、１つの様式は１７７アミノ酸のタンパク質をコードし、他方の様式は１７４アミノ酸のタンパク質をコードする２つの形態のＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡをもたらし（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ ５：５７５−５８１（１９８６））、１７４アミノ酸から構成される形態は、最も特異的なインビボ生物活性を有することが見出された。Ｇ−ＣＳＦは、ヒトＧ−ＣＳＦがマウス、イヌ又はサルなどの別の哺乳動物に投与されたときに、持続的な好中球増加症が誘発されるように、種間交叉反応性である（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ−ＵＳＡ ８４：７１３４−７１３８（１９８７））。
ヒトＧ−ＣＳＦは、数多くの採取源から取得し、精製することができる。天然のヒトＧ−ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）は、培養されたヒト腫瘍細胞株の上清から単離することが可能である。組換えＤＮＡ技術の発展により（例えば、米国特許第４，８１０，６４３号（Ｓｏｕｚａ）（参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）、商業規模の量のＧ−ＣＳＦを、真核宿主細胞発現の産物としてグリコシル化された形態で、及び原核宿主細胞発現の産物としてグリコシル化されていない形態で産生することが可能となっている。
Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増加が利点を与える適応症の治療において有用であることが見出されている。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄から幹細胞及び前駆細胞を動員することができ、化学療法によって顆粒球が枯渇した患者を治療するために、又は骨髄移植のための前駆的処置として使用される。例えば、がん患者の場合、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法又は放射線療法から生じた造血系の欠損を補償するために好中球産生を選択的に刺激する手段として有益である。他の適応症には、典型的には細菌の代謝物によって引き起こされる敗血症など、様々な感染性疾病及び関連する症状の治療が含まれる。Ｇ−ＣＳＦは、単独で、又は他のサイトカインなどの他の化合物と組み合わせて、例えば骨髄移植のために、培養中の細胞を増殖又は増大させる上でも有用である。
Ｇ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）は、造血／サイトカイン／増殖因子受容体ファミリーのメンバーであり、これには、インターロイキン（ＩＬ）−３−、−４及び−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体並びにプロラクチン及び成長ホルモ受容体などのその他の幾つかの増殖因子受容体が含まれる。「Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９３４−６９３８（１９９０）」を参照されたい。サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、保存された４つのシステイン残基及び膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフを含有する。保存された配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関わると考えられている。例えば、「Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １８４：４８５−４９０（１９９２）」を参照されたい。Ｇ−ＣＳＦ受容体は、約１５０ｋＤａの分子量を有する単一ペプチド鎖からなる（Ｎｉｃｏｌａ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ８（１９８７）， １３４）。
グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦは、ノイラミニダーゼ及びエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いたインビトロ酵素消化によって調製される脱グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦと、ｐＨ及び温度の関数としての安定性に関して比較されている（Ｏｈ−ｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（２０）：１１４３２−３５）。０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する２０ｍＭ リン酸緩衝液中に１μｇ／ｍＬの濃度で溶解された脱グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦは、３７℃で２日間インキュベートされた後、約ｐＨ７から約ｐＨ８までのｐＨ範囲内で急速に不活化された。これに対して、グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦは、同じ条件下で、その活性の８０％超を保持した。さらに、生物学的アッセイ及び熱量測定分析によって測定されたｈＧ−ＣＳＦの両形態の熱的安定性を評価することによって、脱グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦは、ｈＧ−ＣＳＦの野生型に比べて熱的安定性が劣ることが示された。
薬学的に許容される安定なＧ−ＣＳＦ組成物を提供するために、数多くのアプローチが採用されてきた。Ｇ−ＣＳＦの組成物安定性を改善するための一つのアプローチは、該タンパク質の誘導体を合成することを含む。米国特許第５，６６５，８６３号は、アルブミンと結合されたＧ−ＣＳＦを含む組換えキメラタンパク質の形成を開示しており、これは新しい薬物動態特性を有する。米国特許第５，８２４，７８４号及び米国特許第５，３２０，８４０号は、安定性を向上し、タンパク質分解による分解に対する保護を与えるために、水溶性ポリマー、より具体的には、ポリエチレングリコールなどの化学的に付着されたポリマーを有するＮ末端修飾Ｇ−ＣＳＦ分子を化学的にタンパク質に付着することを開示している。
組成物中のＧ−ＣＳＦの安定性を増大するための別のアプローチは、該タンパク質のアミノ酸配列を改変することを含む。米国特許第５，４１６，１９５号は、成熟したポリペプチド鎖の１７位に通常見出されるシステイン残基、２７位に見出されるアスパラギン酸残基、並びに６５及び６６位に見出される少なくとも一つのタンデムプロリン残基が全てセリン残基で置換されている、向上した組成物安定性を有するＧ−ＣＳＦの遺伝子操作された類縁体を開示している。米国特許第５，７７３，５８１号は、水溶性ポリマーに共有結合された、ＧＳＦの遺伝子操作されたＧ−ＣＳＦ類縁体を開示している。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの別のメンバーは、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）である。天然に存在するエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、哺乳動物の腎臓及び肝臓中で産生される、分子量３４キロダルトン（ＫｋＤａ）の糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の増殖及び分化を誘導する赤血球産生における重要な成分である。ＥＰＯ活性は、グロビン及び炭酸脱水酵素を誘導する、多数の赤血球特異的遺伝子の活性化とも関連する。例えば、「Ｂｏｎｄｕｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：６７５−６８３（１９８５）；Ｋｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｃｌ．１２６：２５９−２６５（１９８６）」を参照されたい。
エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）は、造血／サイトカイン／増殖因子受容体ファミリーのメンバーであり、これには、インターロイキン（ＩＬ）−３−、−４及び−６受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体並びにプロラクチン及び成長ホルモ受容体などの幾つかの他の増殖因子受容体が含まれる。「Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９３４−６９３８（１９９０）」を参照されたい。サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、保存された４つのシステイン残基及び膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフを含有する。保存された配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている。例えば、「Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １８４：４８５−４９０（１９９２）」を参照。
米国特許第５，４４１，８６８号；第５，５４７，９３３号；第５，６１８、６９８号及び第５，６２１，０８０号は、ヒトＥＰＯをコードするＤＮＡ配列並びに一次構造の立体構造及び天然に存在するＥＰＯの生物特性の全部又は一部を有する精製及び単離されたポリペプチドを記載している。
ｈＥＰＯの生物学的効果は、特異的な細胞受容体とのその相互作用に由来する。ｈＥＰＯとその受容体（ｈＥＰＯｂｐ）の細胞外ドメイン間の相互作用は、十分に理解されている。高解像度Ｘ線結晶学的データは、ｈＥＰＯが２つの受容体結合部位を有し、分子上の異なる部位を使用して順次２つの受容体分子を結合することを示している。２つの受容体の結合部位は、部位Ｉ及び部位ＩＩと称される。部位Ｉは、ヘリックスＤのカルボキシ末端及びヘリックスＡの一部及びＡ−Ｂループを含むのに対して、部位ＩＩは、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部を包含する。その受容体へのＥＰＯの結合は、順番に起こり、部位Ｉが最初に結合する。次いで、部位ＩＩは第二のＥＰＯ受容体を係合し、受容体二量体化及びホルモンに対して細胞応答をもたらす細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。
組換えｈＥＰＯは、治療薬として使用されてリ、ヒト対象の治療に対して承認を得ている。ｈＥＰＯ欠乏は、例えば貧血を引き起こし、これは、ホルモンの外来投与によって首尾よく治療されている。
親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略記される。）の共有結合は、水溶性、生物学的利用性を増大し、血清半減期を増大し、治療的半減期を増大し、免疫原性を調節し、生物学的活性を調節し、又はタンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子などの多くの生物活性分子の循環時間を延長する方法である。ＰＥＧは、薬剤、人工のインプラント、並びに生体適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の用途で広く使用されている。ＰＥＧの所望の特性を最大化するために、生物活性分子に付着された一又は複数のＰＥＧの総分子量及び水和状態は、親分子の生物活性に悪影響を与えないようにしつつ、水溶性及び循環半減期の増加などの、ＰＥＧポリマー結合に通例付随する有利な特性を付与するのに十分高くなければならない。
ＰＥＧ誘導体は、しばしば、リジン、システイン及びヒスチジン残基、Ｎ末端及び炭水化物部分などの反応性の化学的官能基を通じて、生物活性分子に連結される。タンパク質及びその他の分子は、多くの場合、ポリマー付着に利用できる限られた数の反応部位を有する。しばしば、ポリマー付着を介した修飾に最も適した部位は、受容体結合において重要な役割を果たしており、分子の生物学的活性の保持に必要である。その結果、生物活性分子上のこのような反応性部位へのポリマー鎖の無差別的な付着が、しばしば、ポリマーによって修飾された分子の著しい減少をもたらし、又は完全な喪失さえもたらす。Ｒ． Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７１：２１９６９−２１９７７。標的分子に所望の利点を付与するのに十分なポリマー分子量を有する抱合体を形成するために、従来技術のアプローチでは、通例、多数のポリマーアームを分子に無作為に付着していたが、これにより、親分子の生物活性の減少又は完全な喪失のリスクは増加する。
ＰＥＧ誘導体がタンパク質に付着するための部位を形成する反応性部位は、タンパク質の構造によって決定される。酵素を含むタンパク質は、一般構造Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨを有するα−アミノ酸の様々な配列から構成される。一つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）が、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）に結合して、アミド結合を形成し、これは、−−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−−（下付き文字ｎは、数百または数千に等しいことができる。）として表すことができる。Ｒによって表される断片は、タンパク質の生物活性及びＰＥＧ誘導体の付着に対する反応性部位を含有することが可能である。
例えば、アミノ酸リジンの場合には、α位とε位に−−ＮＨ２部分が存在する。ε−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下で自由に反応できる。ＰＥＧを用いたタンパク質誘導化の分野の多くは、タンパク質中に存在するリジン残基のε−−ＮＨ２部分に付着するためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられてきた。“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”、Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， ｐｐ． １−１７。しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体は全て、タンパク質の表面上にしばしば多数存在するリジン残基を選択的に取り付けることができないという共通の制約を有している。リジン残基が、例えば、酵素活性部位中に存在するタンパク質活性にとって重要である事例において、又は、受容体結合部位の場合のように、他の生物分子とのタンパク質の相互作用を媒介する上でリジン残基が役割を果たしている事例において、これは著しい制約となり得る。
タンパク質をＰＥＧ化するための既存の方法における第二の同等に重要な問題は、ＰＥＧ誘導体が所望の残基以外の残基との所望でない副反応を引き起こし得るということである。ヒスチジンは、−−Ｎ（Ｈ）−−として構造的に表される反応性イミノ部分を含有するが、ε−−ＮＨ２と反応する多くの化学的反応種は、−−Ｎ（Ｈ）−−とも反応することが可能である。同様に、構造的に−ＳＨとして表されるアミノ酸システインの側鎖は遊離のスルフヒドリル基を有している。幾つかの事例では、リジンのε−−ＮＨ２基に誘導されたＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジン又は他の残基とも反応する。これは、ＰＥＧで誘導体化された生物活性分子の複雑な異種混合物を生成し、標的とされている生物分子の活性を破壊するリスクをもたらし得る。化学的官能基をタンパク質内の単一部位に導入することを可能とし、次いで、これにより、生物活性分子のタンパク質表面上に存在する確定され且つ予測可能な特異的部位に一又は複数のＰＥＧポリマーを選択的に結合することを可能とするＰＥＧ誘導体を開発することが望ましい。
リジン残基に加え、本分野における多大な努力は、システイン、ヒスチジン及びＮ末端などの他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化されたＰＥＧ試薬の開発に向けられている。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により本明細書に組み込まれる。）及び“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”， Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ， ２００３， １−１７を参照。システイン残基は、部位特異的突然変異誘発及び本分野で公知の他の技術を用いて、タンパク質の構造中に部位選択的に導入することが可能であり、生じた遊離のスルフヒドリル部分は、チオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応することが可能である。しかしながら、遊離のスルフヒドリル基の導入が、生じたタンパク質の発現、折り畳み及び安定性を悪化させることがあるという点で、このアプローチには問題が多い。このため、スルフヒドリル基及びタンパク質中に典型的に見出される他の化学的官能基との適合性を同時に維持しつつ（すなわち、所望でない副反応に関与せずに）、タンパク質への一又は複数のＰＥＧ重合体の選択的結合を可能とする生物活性分子中に化学的官能基を導入するための手段を有することが望ましいであろう。
本分野の標本から明らかであるように、タンパク質の側鎖、特に、リジンアミノ酸側鎖上の−−ＮＨ２部分及びシステイン側鎖上のーＳＨ部分に付着するために開発されたこれらの誘導体の多くは、それらの合成及び使用において問題があることが明らかとなっている。加水分解に供せられる、タンパク質との不安定な結合を形成するものがあり、従って、血流中などの水性環境中では、崩壊し、分解し、又はその他不安定となる。ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）中での結合の安定性の考察については、「Ｐｅｄｄｅｒ， Ｓ． Ｃ． Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ． ２００３ ； ２３ Ｓｕｐｐｌ １：１９−２２」を参照。より安定な結合を形成するが、結合が形成する前に加水分解に供せられるものもあり、これは、タンパク質が付着できるより前にＰＥＧ誘導体上の反応基が活性化され得ることを意味している。幾分毒性があり、従って、インビボでの使用にあまり適していないものもある。反応が遅すぎて、実用的でないものもある。タンパク質の活性に必要な部位に付着することによって、タンパク質活性の喪失をもたらすものもある。それらが付着する部位において特異的でないものもあり、これも、望ましい活性の喪失と結果の再現性の欠如をもたらし得る。ポリ（エチレングリコール）部分でタンパク質を修飾することに伴う困難な課題を解決するために、さらに安定であるＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（参照により、本明細書に組み込まれる。））又は分子及び表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書に組み込まれる。））が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応するように動員されるまで、生理的な環境中で化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体に対する要求が本分野において明らかに存在する。
最近、タンパク質科学において全く新しい技術が報告されており、本技術は、タンパク質の部位特異的修飾に伴う制約の多くを克服する有望な技術である。具体的には、原核生物エシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）（例えば、Ｌ． Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，（２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００）及び真核生物サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．セレビシアエ）（例えば、Ｊ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成機構に新しい成分が付加され、これによって、遺伝的にコードされていないアミノ酸のタンパク質へのインビボでの取り込みが可能となる。光親和性標識及び光異化性アミノ酸、ケトアミノ酸及びグリコシル化されたアミノ酸など、新規化学的、物理的又は生物学的特性を有する多数の新規アミノ酸が、この方法を用いて、アンバーコドンＴＡＧに応答してＥ．コリ及び酵母中のタンパク質中に、効率的に且つ高い精度で取り込まれている。例えば、「Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７； Ｊ． Ｗ． Ｃｈｉｎ， ＆ Ｐ．Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７ ； Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．，（２００２）， ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４； ａｎｄ， Ｌ． Ｗａｎｇ， ＆ Ｐ． Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）， Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．， １−１０」を参照。これらの研究は、ケトン基、アルキン基及びアジド部分など、タンパク質中に見出されず、遺伝子によってコードされる２０の共通アミノ酸中に見出される全ての官能基に対して化学的に不活性であり、並びに安定な共有結合を形成するために効率的且つ選択的に反応するために使用され得る化学的官能基を選択的且つ定型的に導入することが可能であることを実証している。
遺伝子によってコードされていないアミノ酸をタンパク質中に取り込ませる能力によって、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの天然に存在する官能基に対する価値ある代替物を提供し得る化学的官能基の導入が可能となる。化学的官能基のなかには、遺伝子によってコードされる２０の共通アミノ酸中に見出される官能基に対して不活性であるが、きれいに且つ効果的に反応して安定な結合を形成するものがあることが知られている。例えば、アジド及びアセチレン基は、触媒量の銅の存在下、水性条件中でＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を行うことが本分野において公知である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１：２５９６−２５９９」を参照されたい。例えば、タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、タンパク質中に見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑且つ効率的に反応して、付加環化産物を形成する官能基を取り込ませることが可能である。重要なことは、アセチレン部分の不存在下では、アジドは化学的に不活性で、他のタンパク質側鎖の存在下及び生理的条件下で非反応性状態を保つということである。
本発明は、とりわけ、四螺旋バンドル（４ＨＢ）ポリペプチドの活性及び産生に関連する問題に取り組み、及び改善された治療的半減期など、改善された生物学的又は薬理学的特性を有する４−ＨＢポリペプチドの製造に取り組む。
本発明は、一又は複数の天然にコードされていないアミノ酸を含む、ｈＧＨポリペプチド、ｈＩＦＮポリペプチド、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド及びｈＥＰＯポリペプチドなどのＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーを提供する。
幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチドは、一又は複数の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施形態において、４ポリペプチドは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも一つのさらなる４ＨＢポリペプチドに連結されている。
幾つかの実施形態において、前記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。幾つかの実施形態において、前記二官能性ポリマーは第二のポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、前記第二のポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドである。
幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結されている少なくとも二つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸は天然にコードされていないアミノ酸である。
ｈＧＨの領域は以下のように表すことが可能であり、ここで、ｈＧＨ中でのアミノ酸位置は真ん中の列中に記されている。
Figure 2007519422
幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、以下のように、ｈＧＨ中の二次構造に対応する以下の一以上の領域中の任意の位置に取り込まれる。配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸から得られる、１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。他の実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、ｈＧＨ配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸から得られる残基１−５、３２−４６、９７−１０５、１３２−１４９及び１８４−１９１からなる群から選択される位置において置換される。幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、ｈＧＨ中の以下の位置の一又は複数：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、位置１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）に取り込まれる（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施形態では、以下の位置の一又は複数：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７において（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が置換される。
幾つかの実施形態では、以下の位置の一又は複数：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７において（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が置換される。
幾つかの実施形態では、以下の位置の一又は複数：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５において（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が置換される。
幾つかの実施形態では、以下の位置の一又は複数：３０、７４、１０３において（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が置換される。幾つかの実施形態では、以下の位置の一又は複数：３５、９２、１４３、１４５において（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が置換される。
幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に位置する天然に存在しないアミノ酸は、位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５０、１５１、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）などにおいて、水溶性ポリマー（これらに限定されない。）に連結される。幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に位置する非天然アミノ酸は、水溶性ポリマー：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に連結されている。幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に位置する非天然アミノ酸は、水溶性ポリマー：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）に連結されている。
ヒトＧＨアンタゴニストには、以下の位置：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換を有するもの又は位置１（すなわち、Ｎ末端に）付加を有するもの又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるがこれらに限定されるものではない（配列番号２又は配列番号１、３の対応するアミノ酸、又は他の任意のＧＨ配列）。
幾つかの実施形態では、以下のように、ＩＦＮ中の二次構造に対応する以下の領域の一又は複数の任意の位置に、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が取り込まれる。１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅヘリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置の一又は複数：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）に取り込まれる（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４に（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：４１、４５、４６、４８、４９に（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９に（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２に（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５に（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に存在する非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに、位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端で）、位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、カルボキシル末端）（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）など（これらに限定されない。）で、連結されている。幾つかの実施形態では、非天然アミノ酸は、以下の位置の一又は複数：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２において（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態では、本発明のＩＦＮポリペプチドは、アンタゴニストを与える以下の位置の一又は複数：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５又はこれらの任意の組み合わせに（配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。これらの置換の一つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された部位及び所望の活性に応じて、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして作用し得る。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるがこれらに限定されるものではない（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施形態では、以下のように、Ｇ−ＣＳＦ中の二次構造に対応する以下の領域の一又は複数の任意の位置に、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が取り込まれる。１−１０（Ｎ末端）、１１−３９（Ａヘリックス）、４０−７０（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、７１−９１（Ｂヘリックス）、９２−９９（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、１００−１２３（Ｃヘリックス）、１２４−１４２（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１４３−１７２（Ｄヘリックス）、１７３−１７５（Ｃ末端）（３１０ヘリックス（４４−４７）とαヘリックス（４８−５３）から構成され、ＡヘリックスとＢヘリックスの間に存在する４４−５３に位置する短いヘリックスセグメント、ミニ−Ｅヘリックスを含む。）（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、Ｇ−ＣＳＦ中の以下の位置の一又は複数：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（すなわち、カルボキシル末端）に取り込まれる（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドは、以下の位置の一又は複数：３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０、１７１に（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）、一又は複数の非天然アミノ酸を含む。天然にコードされていないアミノ酸を取り込むための典型的な位置には、５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７及び１７１又はこれらの組み合わせ（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）が含まれる。幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に存在する非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに、位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（すなわち、カルボキシル末端）（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）など（これらに限定されない。）において連結されている。幾つかの実施形態では、これら又は他の位置にある一又は複数の非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに、位置５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７、１７１又はこれらの任意の組み合わせなど（これらに限定されない。）（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）において連結されている。ヒトＧ−ＣＳＦアンタゴニストには、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１４５に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施形態では、以下のように、ＥＰＯ中の二次構造に対応する以下の領域の一又は複数における任意の位置に、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸が取り込まれる。１−７（Ｎ末端）、８−２６（Ａヘリックス）、２７−５４（ＡＢループ、βシート１（３９−４１）及びミニＢ’ヘリックス（４７−５２）を含有する。）、５５−８３（Ｂヘリックス）、８４−８９（ＢＣループ）、９０−１１２（Ｃヘリックス）、１１３−１３７（ＣＤループ、ミニＣ’ヘリックス（１１４−１２１）及びβシート２（１３３−１３５）を含有する。）、１３８−１６１（Ｄヘリックス）、１６２−１６６（Ｃ末端）（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、ＥＰＯ中の以下の一又は複数の位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（すなわち、カルボキシル末端）に取り込まれる（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）。天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸を取り込むための典型的な部位のサブセットには、ＥＰＯ中の１、２、４、９、１７、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４０、５０、５３、５５、５８、６５、６８、７２、７６、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、１５９、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）が含まれるが、これらに限定されるものではない。天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸を取り込むための典型的な位置には、ＥＰＯ中の２１、２４、２８、３０、３１、３６、３７、３８、５５、７２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）が含まれる。
幾つかの実施形態では、これらの位置の一又は複数に存在する非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに、位置：位置１の前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（すなわち、カルボキシル末端）（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）など（これらに限定されない。）において連結されている。幾つかの実施形態では、これら又は他の位置に存在する一又は複数の非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに、位置２１、２４、３８、８３、８５、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８、又はこれらの任意の組み合わせなど（これらに限定されない。）（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）に連結されている。
ヒトＥＰＯアンタゴニストには、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（ｈＥＰＯ；配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）。
幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチド受容体に対する４ＨＢポリペプチドの親和性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドの安定性を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨ配列番号２中のＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドの免疫原性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドの血清半減期又は循環時間を調節する置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドの水への溶解度を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、宿主細胞中で産生される４ＨＢポリペプチドの溶解度を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、４ＨＢポリペプチドは、宿主細胞中又はインビトロで合成された４ＨＢポリペプチドの発現を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｇ１２０Ａを含む。この置換を含むｈＧＨポリペプチドは、アゴニスト活性を保持し、及び宿主細胞中での発現レベルを保持又は向上させる。幾つかの実施形態では、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｔ３８Ａ、Ｈ５２Ａ、Ｌ７１Ａ、Ｔ１０２Ａ、Ｌ１０８Ａ、Ｗ１１８Ａ、Ｓ１５９Ａ（（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９０３４（１９９６）又は配列番号２９の対応するアミノ酸位置）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される（但し、これらに限定されるものではない。）アミノ酸の置換を含む。幾つかの実施形態では、ｈＥＰＯポリペプチドは、配列番号３８中のＮ２４、Ｎ３６、Ｎ３８、Ｑ５８、Ｑ６５、Ｎ８３、Ｑ８６、Ｇ１１３、Ｑ１１５及びＳ１２６又はこれらの組み合わせからなる群から選択される（但し、これらに限定されるものではない。）アミノ酸の置換を含む。幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増加する置換、付加又は欠失を含む。
幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチド中のアミノ酸置換は、天然又は非天然アミノ酸を用いて行うことができるが、但し、少なくとも一つの置換は天然にコードされていないアミノ酸による置換である。
幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジド基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸はヒドラジン基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸残基はセミカルバジド基を含む。
幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、構造：
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
を有する。
幾つかの実施形態では、前記ポリペプチドは、４−ＨＢポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストである。幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチドのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、天然にコードされていないアミノ酸と、一又は複数の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子とを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸は、４ＨＢポリペプチドの部位ＩＩ領域（ＡＣヘリカル−バンドル面、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部を包含するタンパク質の領域）内に存在する。幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドアンタゴニストが第二の４ＨＢポリペプチド受容体分子に結合するのを妨げることによって、４ＨＢポリペプチドの受容体の二量体化を妨げる。幾つかの実施形態では、グリシン以外のアミノ酸が、配列番号２（ｈＧＨ）中のＧ１２０を置換する。幾つかの実施形態では、アルギニンが、配列番号２中のＧ１２０を置換する。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２中のＧ１２０を置換する。幾つかの実施形態では、ロイシン以外のアミノ酸が、配列番号２９（ｈＧ−ＣＳＦ）中のＬ７０を置換する。幾つかの実施形態では、アルギニン又はリジンが、配列番号２９中のＬ７０を置換する。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号２９中のＬ７０を置換する。幾つかの実施形態では、ロイシン以外のアミノ酸が、配列番号３８（ｈＥＰＯ）中のＬ１０８を置換する。幾つかの実施形態では、アルギニン又はリジンが、配列番号３８中のＬ１０８を置換する。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が、配列番号３８中のＬ１０８を置換する。
本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号２１、２２、２６、２７、３１、３２、３３、３４、４０、４１、４２又は４３にハイブリダイズし、少なくとも一つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む単離された核酸も提供する。幾つかの実施形態において、前記セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される。
本発明は、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離された４ＨＢポリペプチドを、前記天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を示す。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸は、２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性を示す。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、前記アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アジド部分を含むポリ（エチレン）グリコール分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、前記アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、前記アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
幾つかの実施形態において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａないし５０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、前記ポリ（エチレングリコール）分子は分岐ポリマーである。幾つかの実施形態において、前記ポリ（エチレングリコール）分岐ポリマーの各分岐は、１ｋＤａないし１００ｋＤａ又は１ｋＤａないし５０ｋＤａの分子量を有する。
幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチドに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸残基はカルボニル部分を含み、前記水溶性ポリマーはアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含む。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸残基はアルキン部分を含み、前記水溶性ポリマーはアジド部分を含む。幾つかの実施形態において、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれた前記天然にコードされていないアミノ酸残基はアジド部分を含み、前記水溶性ポリマーはアルキン部分を含む。
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。幾つかの実施形態において、前記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、セレクターコドンを含む４ＨＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、天然にコードされていないアミノ酸を４ＨＢポリペプチド中に置換するために、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む。
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、４ＨＢポリペプチドの発現を許容する条件下で、４ＨＢポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチド、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を培養することと、細胞及び／又は培地から４ＨＢポリペプチドを精製することを含む。
本発明は、４ＨＢポリペプチドの治療的半減期、血清半減期又は循環時間を増加させる方法も提供する。本発明は、４ＨＢポリペプチドの免疫原性を調節する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然に存在する４ＨＢポリペプチド中の一又は複数の任意のアミノ酸を、天然にコードされていないアミノ酸と置換することと、及び／又は４ＨＢポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結することとを含む。
本発明は、本発明の４ＨＢ分子の有効量を用いて、このような治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物の治療的有効量を前記患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、前記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
本発明は、少なくとも一つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されていることを除き、配列番号１、２、３に示されている配列若しくは他の任意のＧＨポリペプチド配列、配列番号２３、２４、２５若しくは他の任意のｈＩＦＮポリペプチド配列、又は配列番号２８、２９、３０、３５、３６若しくは他の任意のｈＧ−ＣＳＦポリペプチド配列、配列番号３７、３８、３９若しくは他の任意のｈＥＰＯポリペプチド配列を含む４ＨＢポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、前記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号３（ｈＧＨ）から得られる残基１−５、８２−９０、１１７−１３４及び１６９−１７６からなる群から選択される位置において置換される。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号２９（Ｇ−ＣＳＦ）中又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸位置１−１６、３０−１０９、１２５−１７５などの残基（これらに限定されない。）からなる群から選択される位置において置換される。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は、配列番号３８（ＥＰＯ）、又は配列番号３９、又は配列番号３７の対応するアミノ酸位置から得られる１−６、２１−４０、６８−８９、１１６−１３６、１６２−１６６などの残基（これらに限定されない。）からなる群から選択される位置において置換される。
本発明は、薬学的に許容される担体と、配列番号１、２、３に示されている配列若しくは他の任意のＧＨポリペプチド配列、配列番号２３、２４、２５若しくは他の任意のＩＦＮポリペプチド配列、配列番号２８、２９、３０、３５、３６若しくは他の任意のＧ−ＣＳＦポリペプチド配列、配列番号３７．３８、３９、３９若しくは他の任意のＥＰＯ配列を含み、少なくとも一つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されている４ＨＢポリペプチドとを含む薬学的組成物も提供する。幾つかの実施形態では、前記天然にコードされていないアミノ酸は糖質部分を含む。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、糖質部分を介して、ポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカー、ポリマー又は生物活性分子は、糖質部分を介して、４ＨＢポリペプチドに連結されている。
本発明は、共有結合によって、４ＨＢポリペプチドの単一のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを含む４ＨＢポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸は、ポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸である。
本発明は、少なくとも一つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー、又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を通じて前記ポリペプチドに付着されている、ポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、前記第ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されている。本発明は、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸に付着された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記天然にコードされていないアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれた、ポリペプチドも提供する。
定義
本発明は、本発明に記載されている特定の方法、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、従って、変化し得ることを理解しなければならない。また、本明細書で使用されている用語は、具体的な実施形態を記載するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている、「一」及び「該」という単数形には、文脈上複数形を表さないことが明確でない限り、複数表記も含まれる。このため、例えば、「ｈＧＨ」、「ｈＩＦＮ」、「Ｇ−ＣＳＦ」又は「ｈＥＰＯ」という表記は、一又は複数のこのようなタンパク質を表し、当業者に公知のその均等物などを含む。
別段の定義がなされている場合を除き、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者に一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。明細書に記載されているものと類似又は均等な任意の方法、装置及び材料を本発明の実施又は検査において使用することができるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料が記載されている。
本明細書に記載されている全ての文献及び特許は、例えば、文献に記載されている記載されており、本明細書に記載されている発明と組み合わせて使用され得る構築物及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に論述されている文献は、専ら本出願の出願日以前の開示のために提供されている。本明細書の記載は、以前の発明のため、又は他の何らかの理由のため、本発明者らがこのような開示を遡及させる権限を有しないことを認めたものと解釈すべきでない。
「実質的に精製された」という用語は、それが天然に存在する環境中、すなわち、野生型細胞、又は組換え的に産生された４ＨＢポリペプチドの場合には宿主細胞中で通常タンパク質を伴い、又は該タンパク質と相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まないことができる４ＨＢポリペプチドを表す。細胞物質を実質的に含まないことができる４ＨＢポリペプチドには、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量に対して）の莢雑タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。４ＨＢポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％未満で存在し得る。４ＨＢポリペプチド又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約５ｇ／Ｌ、約 ４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ未満で、培地中に存在し得る。このため、本発明の方法によって作製された「実質的に精製された」４ＨＢポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって測定された場合に、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％以上の純度レベル、具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有し得る。
「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、挿入のために使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）又は組換え宿主細胞を作製するための本分野で公知の他の方法にかかわらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を表す。外来ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えば、プラスミドとして維持されることができ、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれることができる。
本明細書において使用される「培地」という用語には、任意の培養培地、溶液、固体、半固体又は任意の宿主細胞（細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞又はＥ．コリを含む。）及び細胞内容物を支持し、若しくは含有し得る強固な支持体が含まれる。このため、本用語は、その中で宿主細胞が増殖される培地、例えば、４ＨＢポリペプチドがその中に分泌される培地（増殖工程前又は後の培地を含む。）を包含し得る。本用語は、４ＨＢポリペプチドが細胞内で産生され、４ＨＢポリペプチドを放出するために宿主細胞が溶解又は破壊される場合など、宿主細胞可溶化液を含有する緩衝液又は試薬も包含し得る。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「還元剤」は、スルフヒドリル基を還元状態に保ち、及び分子内又は分子間ジスルフィド結合を還元する任意の化合物又は物質として定義される。適切な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン、（２−アミノエタンチオール）及び還元されたグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。様々な還元剤が本発明の方法及び組成物における使用に適していることが、当業者に自明である。
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる任意の化合物又は物質として定義される。適切な酸化剤には、酸化されたグルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化されたジチオスレイトール、酸化されたエリスリトール及び酸素が含まれるが、これらに限定されない。様々な酸化剤が本発明の方法における使用に適していることが、当業者に自明である。
本明細書において使用される「変性剤」は、タンパク質の可逆的な折り畳み構造の解除を引き起こし得る任意の化合物又は物質として定義される。変性剤の強度は、具体的な変性剤の特性及び濃度の両方によって決定され得る。適切な変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質又は二以上のこのような薬剤の組み合わせであり得る。適切なカオトロープには、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどの強い界面活性剤、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの穏やかな陽イオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）又はスルホベテイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含む（これらに限定されない。）双性イオン界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノール又はイソプロパノールなどのＣ２−Ｃ４アルカノール）、又は（低級アルカンジオール（特に、エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）などの水混和性有機溶媒は、界面活性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又は合成リン脂質誘導体又はジヘキサノイルホスファチジルコリン又はジヘプタノイルホスファチジルコリンなどのバリアントであり得る。
本明細書に使用される「再折り畳み」は、ジスルフィド結合を含有するポリペプチドを、不適切に折りたたまれ、又は折り畳み解除された状態から、ジスルフィド結合に関して固有の高次構造又は適切に折りたたまれた高次構造へと転換する任意のプロセス、反応又は方法を記載する。
本明細書において使用される「同時折り畳み」とは、互いに相互作用し、及び折り畳み解除されたポリペプチド又は不適切に折り畳まれたポリペプチドを、適切に折り畳まれた固有のポリペプチドへと変換させる少なくとも２つのポリペプチドを使用する再折り畳みプロセス、反応又は方法を具体的に表す。
本明細書において使用される「四螺旋バンドルポリペプチド」、「４ＨＢポリペプチド」及び「４ＨＢ」という用語は、ＧＨスーパー遺伝子の公知の任意のポリペプチド又はタンパク質及び公知になるポリペプチド又はタンパク質を表す。これらの用語には、ｈＧＨポリペプチド、ｈＩＦＮポリペプチド、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド、ｈＥＰＯポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではなく、さらに、一又は複数のアミノ酸置換、付加若しくは欠失を含むもの並びにバリアント、融合体、変異体、断片、アゴニスト、アンタゴニスト、二量体、多量体、ポリマーに共有結合されたポリペプチド、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーに対する９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、及び四螺旋バンドル構造を有するポリペプチドを含む他の任意のＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバーが包含される。本用語には、文脈上明確に反する場合を除いては、複数表記が含まれる。
本明細書において使用される「成長ホルモン」又は「ＧＨ」には、同じ生物活性かどうかにかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法にかかわらず、ヒト成長ホルモンの少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質、並びにそれらのＧＨ類縁体、ＧＨイソフォーム、ＧＨ模倣体、ＧＨ断片、ハイブリッドＧＨタンパク質、融合タンパク質オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、ミュテインが含まれるものとする。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むｈＧＨポリペプチドが包含される。典型的な置換には、例えば、固有のｈＧＨの４１位のリジン又は１７６位のフェニルアラニンの置換が含まれる。幾つかの事例では、前記置換が４１位にあれば、イソロイシン若しくはアルギニン残基とすることができ、又は、位置が１７６であれば、チロシン残基である。位置Ｆ１０は、例えば、Ａ、Ｈ又はＩで置換することができる。位置Ｍ１４は、例えば、Ｗ、Ｑ又はＧで置換され得る。
他の典型的な置換には、
Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｒ１６７Ｅ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｆ１０Ｈ、Ｍ１４Ｇ、Ｈ１８Ｎ、Ｈ２１Ｎ；
Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７５Ｔ、Ｉ１７９Ｔ；又は
Ｆ１０Ｉ、Ｍ１４Ｑ、Ｈ１８Ｅ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｉ１７９Ｔなど（これらに限定されない。）の任意のそれらの置換又は組み合わせが含まれる。例えば、米国特許第６，１４３，５２３号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
アゴニスト活性を増加する置換、プロテアーゼ耐性を増加する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換など、天然のｈＧＨ中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ｈＧＨポリペプチド」という用語によって包含される。
アゴニストｈＧＨ配列には、例えば、以下の修飾Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔを含む天然のｈＧＨ配列が含まれる。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。さらなるアゴニストｈＧＨ配列には、
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；
Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；又は
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａが含まれる。例えば、米国特許第６，０２２，７１１号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａに置換を含むｈＧＨポリペプチドは、部位ＩにおけるｈＧＨ受容体に対する親和性を増強する。例えば、米国特許第５，８５４，０２６号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。プロテアーゼに対して増加した耐性を有するｈＧＨ配列には、Ｃ−Ｄループ内に一又は複数のアミノ酸置換を含むｈＧＨポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、置換には、Ｒ１３４Ｄ、Ｔ１３５Ｐ、Ｋ１４０Ａ及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、「Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ ； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６５：１８３−１９０」を参照。
ヒト成長ホルモンアンタゴニストには、例えば、Ｇ１２０（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）に置換を有し、及び、時には、以下の置換：Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａをさらに含むものが含まれる。例えば、米国特許第６，００４，９３１号（参照によって、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる領域１０６−１０８又は１２７−１２９中に少なくとも一つの置換を含む。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（参照によって、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の部位ＩＩ結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ｈＧＨポリペプチドは、Ｇ１２０での置換に、以下の置換：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔをさらに含む。（例えば、米国特許第５，８４９，５３５号を参照）。
完全な完全長天然ＧＨアミノ酸ＧＨアミノ酸配列並びに成熟天然ＧＨアミノ酸配列及び天然に存在する変異体については、それぞれ、本明細書中の配列番号１、配列番号２及び配列番号３を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のｈＧＨポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３または成長ホルモンポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。天然に存在する多数のｈＧＨの変異体が同定されている。これらには、ｈＧＨ−Ｖ（Ｓｅｅｂｅｒｇ， ＤＮＡ １：２３９（１９８２）；米国特許第４，４４６，２３５号、第４，６７０，３９３号及び第４，６６５，１８０号を参照。これらは参照により、本明細書に組み込まれる。）及びｈＧＨの残基３２ないし４６（配列番号２３）の欠失を含有する２０−ｋＤａのｈＧＨが含まれる（Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ ：Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３：２６７９−２６８７（１９７８））。胎盤成長ホルモンは、「Ｉｇｏｕｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１０）：３９９８（１９８９））」に記載されている。さらに、タンパク分解によって切断されたバリアント又は２鎖バリアントなど、転写後、翻訳後、分泌、代謝プロセッシング及び他の生理的プロセスから生じる多数のｈＧＨバリアントが報告されている（Ｂａｕｍａｎｎ， Ｇ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：４２４（１９９１））。Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を直接介して連結されたｈＧＨ二量体は、「Ｌｅｗｉｓ， Ｕ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：３６９７−３７０２（１９７７）； Ｂｒｏｓｔｅｄｔ， Ｐ． ａｎｄ Ｒｏｏｓ， Ｐ．， Ｐｒｅｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９：２１７−２２９（１９８９））」に記載されている。ｈＧＨ変異体をコードする核酸分子及び変異ｈＧＨポリペプチドは周知であり、米国特許第５，５３４，６１７号；第５，５８０，７２３号；第５，６８８，６６６号；第５，７５０，３７３号；第５，８３４，２５０号；第５，８３４，５９８号；第５，８４９，５３５号；第５，８５４，０２６号；第５，９６２，４１１号；第５，９５５，３４６号；第６，０１３，４７８号；第６，０２２，７１１号；第６，１３６，５６３号；第６，１４３，５２３号；第６，４２８，９５４号；第６，４５１，５６１号；第６，７８０，６１３号及び米国特許出願公開２００３／０１５３００３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。
ｈＧＨの市販の調製物は、ＨｕｍａｔｒｏｐｅＴＭ（ＥｌｉＬｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）、ＮｕｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／ＳｅｒｏｓｔｉｍＴＭ（Ｓｅｒｏｎｏ）の名前で売られている。
「ｈＧＨポリペプチド」という用語には、天然ｈＧＨの薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然ｈＧＨの塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、並びに天然ｈＧＨのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそれらのポリペプチド融合物も含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ｈＧＨポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合物、血清アルブミン結合ペプチドとの融合及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合から得られる、例えば、メチオニンがｈＨＧのＮ末端に連結されたメチオニル成長ホルモンが含まれるが、それらに限定されるものではない。
本明細書において使用される「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」には、その生物活性にかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法にかかわらず、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮε又はＩＦＮτ（米国特許第４，４１４，１５０；４，４５６，７４８号；第４，７２７，１３８；４，７６２，７９１，４，９２９，５５４号；第５，０９６，７０５号；第４，６９５，６２３号；第４，６１４，６５１号；第４，６７８，７５１号；第４，９２５，７９３号；第５，４６０，８１１号；第５，１２０，８３２号；第４，７８０，５３０号；第４，９０８，４３２号；第４，９７０，１６１号；第４，９７３，４７９号；第４，９７５，２７６号；第５，０９８，７０３号；第５，２７８，２８６号；第５，６６１，００９号；第６，３７２，２０６号；第６，４３３，１４４号；第６，４７２，５１２号；第６，５７２，８５３号；第６，７０３，２２５号；第６，２００，７８０号；第６，２９９，８６９号；第６，３００，４７５号；第６，３２３，００６号；第６，３５０，５８９号；第５，７０５，３６３号；第５，７３８，８４５号；第５，７８９，５５１号；第６，１１７，４２３号；第６，１７４，９９６号；第５，５４０，９２３号；第５，５４１，２９３号；第５，５４１，３１２号；第５，５５４，５１３号；第５，５９３，６６７号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなど）、並びにそれらのＩＦＮ類縁体、ＩＦＮイソフォーム、ＩＦＮ模倣体、ＩＦＮ断片、ハイブリッドＩＦＮタンパク質、融合タンパク質オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント及びミュテインなど（これらに限定されない。）、ヒトインターフェロンの少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質が含まれるものとする。ＩＦＮの具体例には、ＩＦＮγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ））、ＩＦＮβ−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（Ｒ）、及びＲｅｂｉｆ（Ｒ））、ＩＦＮβ−１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ））、コンセンサスＩＦＮ、ＩＦＮアルファコン−１（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（Ｒ））、ＩＦＮα−２（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））、ＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（Ｒ））、Ｐｅｇインターフェロンα−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（Ｒ））及びＰｅｇインターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ））、ＩＦＮ類縁体、ＩＦＮ変異体、改変されたグリコシル化ヒトＩＦＮ及びＰＥＧ抱合ＩＦＮ類縁体が含まれるが、これらに限定されない。内在性ヒトＩＦＮの発現に対して修飾された細胞の具体例は、「Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ４１：３０６（１９８７）」；米国特許６，７１６，６０６号；第６，６１０，８３０号；第６，４８２，６１３号；第６，４８９，１４４号；第６，１５９，７１２号；第５，８１４，４８５号；第５，７１０，０２７号；第５，５９５，８８８号；第４，９６６，８４３号；第６，３７９，６６１号；第６，００４，５４８号；第５，８３０，７０５号；第５，５８２，８２３号；第４，８１０，６４３号；及び第６，２４２，２１８号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
「ヒトＩＦＮ（ｈＩＦＮ）」又は「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語は、上述されているインターフェロン又はＩＦＮ、並びに天然のｈＩＦＮの少なくとも一つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。ｈＩＦＮポリペプチドには、天然のヒトＩＦＮの薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然ヒトＩＦＮの塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、及び天然のヒトＩＦＮのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそれらのポリペプチド融合物が含まれる。ｈＩＦＮポリペプチドの例には、米国特許第４，６０４，２８４号；第５，５８２，８２４号；第６，５３１，１２２号；第６，２０４，０２２号；第６，１２０，７６２号；第６，０４６，０３４号；第６，０３６，９５６号；第５，９３９，２８６号；第５，９０８，６２６号；第５，７８０，０２７号；第５，７７０，１９１号；第５，７２３，１２５号；第５，５９４，１０７号；第５，３７８，８２３号；第４，８９８，９３１号；第４，８９２，７４３号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれるが、それらに限定されるものではない。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ｈＩＦＮポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、分泌シグナルペプチド又はその一部を欠如するｈＩＦＮの成熟形態の組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合物、血清アルブミン結合ペプチドとの融合及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合から得られる、例えば、メチオニンがｈＩＦＮのＮ末端に連結されたメチオニルＩＦＮが含まれるが、それらに限定されるものではない。完全長及び成熟形態に対する天然のｈＩＦＮ核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント又はスプライスバリアントなどのバリアントと同様に、公知である。
コンセンサスインターフェロンは、１６６アミノ酸を含有する組換え１型インターフェロンである。コンセンサスＩＦＮは、幾つかの天然αインターフェロンの配列を走査し、各対応する位置において最も頻繁に観察されるアミノ酸を割り当てることによって得られた。コンセンサスＩＦＮは、等質量を基礎として、ＩＦＮα−２ａ及びα−２ｂとインビトロアッセイで比較されたときに、典型的には、５ないし１０倍より高い生物活性を示す（Ｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １９９６；１６：４８９−９９）。
完全な完全長天然ＩＦＮα−２ａアミノ酸配列並びに成熟天然ＩＦＮα−２ａアミノ酸配列については、それぞれ、本明細書中の配列番号２３及び配列番号２４を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のｈＩＦＮポリペプチドは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５またはインターフェロンポリペプチドの任意の他の配列と実質的に同一である。
ｈＩＦＮ変異体をコードする核酸分子及び変異ｈＩＦＮポリペプチドは周知であり、米国特許第６，３３１，５２５号；第６，０６９，１３３号；第５，９５５，３０７号；第５，８６９，２９３号；第５，８３１，０６２号；第５，０８１，０２２号；第５，００４，６８９号；第４，７３８，９３１号；第４，６８６，１９１（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。ｈＩＦＮ変異体の例には、米国特許第６，５１４，７２９号及び第５，５８２，８２４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
インターフェロンは、抗ウイルス、免疫制御及び抗増殖特性を含む様々な生物学的活性を有し、癌及び様々なウイルス病などの疾病の治療のため治療剤として使用されている。インターフェロン−αは、様々な種類の細胞増殖を阻害することが示されており、癌、特に白血病などの血液学的悪性疾患に頻繁に伴う様々な細胞増殖疾患の治療に特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、低度のリンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌腫、膀胱癌及び卵巣癌に対する抗増殖活性を示した。（Ｂｏｎｎｅｍ， Ｅ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ３：５８０；Ｏｌｄｈａｍ， Ｒ． Ｋ．（１９８５） Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０：７１）。
ＩＦＮαは、様々な種類のウイルス感染症に対して有用である（Ｆｉｎｔｅｒ， Ｎ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｄｒｕｇｓ ４２（５）：７４９）。インターフェロン−αは、ヒトパピローマウイルス感染、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染症に対して活性を示した（Ｆｉｎｔｅｒ， Ｎ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． １９９１， ｓｕｐｒａ；Ｋａｓｈｉｍａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ ９８：３３４；Ｄｕｓｈｅｉｋｏ， Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３（Ｓｕｐｐｌｅ． ２）：Ｓ１９９ ；Ｄａｖｉｓ， Ｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎ． Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：１５０１）。ある種の自己免疫疾患及び炎症性疾患の発病におけるインターフェロン及びインターフェロン受容体の役割も研究されている（Ｂｅｎｏｉｔ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０（３）：７０７）。さらに、インターフェロン−αは、ヘアリー細胞白血病、腎細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、尖圭コンジローマ、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性Ｄ型肝炎及び慢性非Ａ、非Ｂ／Ｃ肝炎などの疾病の治療への使用に関して認可を受けている。
インターフェロンは、全身性紅斑性狼瘡、ベーチェット病及びインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病とも称される。）などの様々な自己免疫疾患の発病にも関わっていると推測されている。トランスジェニックマウスモデルにおいて、ＩＦＮ−αのβ細胞発現が膵島炎及びＩＤＤＭを引き起こし得ることが実証されており、ＩＤＤＭの治療のためにＩＦＮ−αアンタゴニスト（抗体を含む。）が提案されている（ＷＯ ９３／０４６９９， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒ． １８，１９９３）。多発性硬化症（ＭＳ）患者では、ＩＦＮγ及びＩＦＮ−αの産生不全が観察されている。ＩＦＮ−αは、多くのＡＩＤＳ患者の血清中に検出されており、分裂促進因子によって刺激されたＡＩＤＳ患者由来の単核細胞の懸濁液中では、ＩＦＮ−γの産生が大幅に抑制されていることが報告されている。総説としては、例えば、「Ｃｈａｐｔｅｒ １６， “Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ｉｎ ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， Ｅｄｗａｒｄ ｄｅ Ｍａｅｙｅｒ（１９８８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）」を参照されたい。α及びβインターフェロンは、急性ウイルス疾患である帯状疱疹（Ｔ．Ｃ． Ｍｅｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２９８，９８１−９８７（１９７８）；Ｅ． Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ７，２１０−２１２（１９８４））、慢性ウイルス感染症、例えば、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎感染症（Ｒ． Ｌ．Ｋｎｏｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４，１２７３０７８（１９８４）；Ｍ． Ａ． Ｆａｅｒｋｋｉｌａｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． ６９，１８４−１８５（１９８５））の治療で使用されている。ｒＩＦＮα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒ）、Ｒｏｃｈｅ）は、ヘアリー細胞白血病及びＡＩＤＳ関連カポジ肉腫の治療への使用を適応症とする注射用製剤である。組換えＩＦＮα−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ ＡＴＭ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）は、ある種の患者において、ヘアリー細胞白血病、尖圭コンジローマの特定の症例、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、慢性Ｃ型肝炎及び慢性Ｂ型肝炎感染症の治療に対して承認を受けている。ＩＦＮαの複数サブタイプの組成物も、様々な疾病を治療するために使用されている（Ｍｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（Ｒ）、Ｖｉｒａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）。ＩＦＮγ１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（Ｒ）、Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）は、慢性肉芽腫症及び悪性大理石骨病の治療のために市販されている。
Ｉ型ＩＦＮの生物活性は、本分野において開示されており、公知であり、例えば、「Ｐｆｅｆｆｅｒ， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．２４（ｓｕｐｐｌ ９），Ｓ９−６３−Ｓ９−６９（１９９７）及び米国特許第６，４３６，３９１号；第６，３７２，２１８号；第６，２７０，７５６号；第６，２０７，１４５号、第６，０８６，８６９号；第６，０３６，９４９号；第６，０１３，２５３号；第６，００７，８０５号；第５，９８０，８８４号；第５，９５８，４０２号；第５，８６３，５３０号；第５，８４９，２８２号；第５，８４６，５２６号；第５，８３０，４５６号；第５，８２４，３００号；第５，８１７，３０７号；第５，７８０，０２１号；第５，６２４，８９５号；第５，４８０，６４０号；第５，２６８，１６９号；第５，２０８，０１９号；第５，１９６，１９１号；第５，１９０，７５１号；第５，１０４，６５３号；第５，０１９，３８２号；第５，９５９，２１０号（これらは、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に見出すことができる。
ＩＦＮαは、サイトカイン遺伝子の多様な螺旋−バンドルスーパーファミリーのメンバーである（Ｓｐｒａｎｇ， Ｓ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。ヒトインターフェロンαは、アミノ酸レベルで８５ないし９８％の配列同一性を有する２０超のタンデムに重複された非対立遺伝子のファミリーによってコードされている（Ｈｅｎｃｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１５：２２７−２６０）。ヒトＩＦＮβは、１６６アミノ酸残基からなる約２２ｋＤａの分子量を有する調節ポリペプチドである。ヒトＩＦＮβは、ウイルス感染又は他の因子への曝露に応答して、体内の多くの細胞、特に繊維芽細胞によって産生され得る。ヒトＩＦＮβは、多量体細胞表面受容体に結合し、生産的な受容体結合が、ＩＦＮβ誘導性遺伝子の発現を引き起こす細胞内現象のカスケードをもたらし、次いで、これは、抗ウイルス、抗増殖及び免疫調節性として分類することが可能な効果を生じる。
ヒトＩＦＮβのアミノ酸配列は公知であり、例えば、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｇｅｎｅ １０：１１−１５，１９８０」、ＥＰ８３０６９号、ＥＰ４１３１３号及び米国特許第４，６８６，１９１号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって報告された。それぞれ、ヒト及びマウスＩＦＮβに対して結晶構造が報告されている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１１８１３−１１８１８，１９９７；Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５３：１８７−２０７，１９９５；米国特許第５，６０２，２３２号；第５，４６０，９５６号；第５，４４１，７３４号；第４，６７２， １０８号；これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。それらは、「Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５４：１２０３−１２０６，１９９８」に概説されている。ＩＦＮβのバリアントが報告されている（ＷＯ９５／２５１７０、ＷＯ９８／４８０１８、米国特許第５，５４５，７２３号、米国特許第４，９１４，０３３号、ＥＰ ２６０３５０号、米国特許第４，５８８，５８５号、米国特許第４，７６９，２３３号、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ， ＤＮＡ Ｖｏｌ． ６ ｎｏ． ２ １９８７ ｐｐ．１１９−１２８， Ｒｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， Ｎｏ． １４， ｐｐ． ８００３−８００８、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。ＣＨＯ細胞中でのＩＦＮβの発現が報告されている（米国特許第４，９６６，８４３号、米国特許第５，３７６，５６７号及び米国特許第５，７９５，７７９号、これらは参照により、本明細書に組み込まれる。）。特定のグリコシル化パターンを有するＩＦＮβ分子及びそれらの調製方法が報告されている（ＥＰ ２８７０７５号及びＥＰ ５２９３００号）。
ＩＦＮβの市販調製物は、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（Ｒ）（インターフェロンβ１ｂとも称され、グリコシル化されておらず、組換え細菌細胞を用いて産生され、Ｎ末端メチオニン残基及びＣ１７Ｓ変異の欠失を有する。）、並びにＡｖｏｎｅｘＴＭ及びＲｅｂｉｆ（Ｒ）（インターフェロンβ１ａとも称される、グリコシル化されており、組換え哺乳動物細胞を用いて産生される。）の名称で、多発性硬化症患者の治療のために売られており、悪化速度を低減する上で有効であることが示されており、より多くの患者が、プラセボ処置された患者に比べて、悪化のない状態を長期間維持する。さらに、身体障害の蓄積速度が軽減される（Ｎｕｅｒｏｌ． ５１：６８２−６８９，１９９８）。
構造及び機能に関するＩＦＮβ１ａ及びβ１ｂの比較は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｒｅｓ． １５：６４１−６４９，１９９８」に記載されている。ＩＦＮβは、再発した後、進行する中枢神経系の炎症性変性疾患である多発性硬化症の進行を遅延させることが示されている。ＩＦＮβは、白血球の増殖及び抗原提示に対して阻害的効果を有し得る。ＩＦＮβは、抗炎症性表現型に対するサイトカイン産生のプロファイルを調節し得る。ＩＦＮβは、Ｔ細胞マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することによって、Ｔ細胞の遊走を低下させることが可能である。これらの活性は共同して作用し、ＭＳにおけるＩＦｎβの機序の原因となるものと思われる（Ｎｅｕｒｏｌ． ５１：６８２−６８９，１９９８）。
ＩＦＮβは、骨肉腫、基底細胞癌、子宮頸部形成異常、神経膠腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、乳癌、黒色腫、並びに、パピローマウイルス、ウイルス性肝炎、陰部ヘルペス、帯状疱疹、ヘルペス性角膜炎、単純ヘルペス、ウイルス性腸炎、サイトメガロウイルス肺炎及びライノウイルスなどのウイルス性感染症の治療のために使用され得る。現行のＩＦＮβ調製物の使用には、注射部位反応、発熱、悪寒、筋肉痛、関節痛及びその他のインフルエンザ様症候など、様々な副作用が伴う（Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９：８８３−８９３，１９９７）
現行のＩＦＮβ製品に伴う数多くの副作用、頻繁な注射を伴うこと、ＩＦＮβの所望の治療効果を妨害する中和抗体を生じるリスク、及び増強された付随的治療効果を有するさらに最適な治療用ＩＦＮβレベルを取得できる可能性に鑑みれば、改善されたＩＦＮβ様分子に対する要求が明確に存在する。
本明細書において使用される「顆粒球コロニー刺激因子」又は「Ｇ−ＣＳＦ」には、その生物活性にかかわらず、及び、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法にかかわらず、ヒトｈＧ−ＣＳＦの少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質（米国特許第６，７１６，６０６号；第６，６８９，３５１号；第６，５６５，８４１号；第６，１６２，４２６号；第５，８１１，３０１号；第５，７７６，８９５号；第５，７１８，８９３号；第５，５８０，７５５号；第５，５３６，４９５号；第５，２０２，１１７号；第５，０４３，１５６号；第４，９９９，２９１号；第４，８１０，６４３号；及び第４，９６８，６１８号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなど）並びにそれらのＧ−ＣＳＦ類縁体、Ｇ−ＣＳＦイソフォーム、Ｇ−ＣＳＦ模倣体、Ｇ−ＣＳＦ断片、ハイブリッドＧ−ＣＳＦタンパク質、融合タンパク質オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント及びミュテインが含まれるものとする。Ｇ−ＣＳＦの具体例には、ＰＥＧフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ｒ））、フィルグラスチム（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ））、Ｇ−ＣＳＦ類縁体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、改変されたグリコシル化ヒトＧ−ＣＳＦ及びＰＥＧ抱合されたＧ−ＣＳＦ類縁体が含まれるが、これらに限定されない。内在性ヒトＧ−ＣＳＦの発現に対して修飾された細胞株の具体例は、「Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ４１：３０６（１９８７）」；米国特許６，７１６，６０６号；第６，３７９，６６１号；第６，００４，５４８号；第５，８３０，７０５号；第５，５８２，８２３号；第４，８１０，６４３号；及び第６，２４２，２１８号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
「ヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）」又は「ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド」という用語は、上述されているような顆粒球コロニー刺激因子又はＧ−ＣＳＦ、並びに天然のｈＧ−ＣＳＦの少なくとも一つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドには、天然のヒトＧ−ＣＳＦの薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然ヒトＧ−ＣＳＦの塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、並びに天然のヒトＧ−ＣＳＦのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそれらのポリペプチド融合物が含まれる。ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド及び模倣体の例には、米国特許第６，７１６，６０６号；第６，６８９，３５１号；第６，５６５，８４１号；第６，１６２，４２６号；第５，８２４，７８４号；第５，８１１，３０１号；第５，７７６，８９５号；第５，７１８，８９３号；第５，２０２，１１７号；第５，０４３，１５６号；第４，９６８，６１８号；第６，６３０，４７０号；第６，３４６，５３１号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、分泌シグナルペプチドを欠如するｈＧ−ＣＳＦの成熟形態の組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合、血清アルブミン結合ペプチドとの融合及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合から得られる、例えば、メチオニンがｈＧ−ＣＳＦ（配列番号２９のポリペプチドなど）のＮ末端に連結されたメチオニルＧ−ＣＳＦが含まれるが、それらに限定されるものではない。配列番号２９の１位のメチオニンは、ｈＧ−ＣＳＦの天然に存在する成熟形態中に見出されるアラニンを置換した。完全長及び成熟形態に対する天然のｈＧ−ＣＳＦ核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント及びスプライスバリアントなどのバリアントと同様に、公知である。完全な完全長天然ｈＧ−ＣＳＦアミノ酸配列並びに成熟メチオニルｈＧ−ＣＳＦアミノ酸配列及びスプライスバリアントについては、それぞれ、本明細書中の配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を参照されたい。天然のｈＧ−ＣＳＦ単一アミノ酸配列バリアントについては、本明細書の配列番号３５及び配列番号３６を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチドは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５又は配列番号３６と実質的に同一である。ｈＧ−ＣＳＦ変異体及び変異体ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸分子も公知である。ｈＧ−ＣＳＦ変異体の例には、米国特許第６，４８９，２９３号；第６，１５３，４０７号；第６，０４８，９７１号；第５，６１４，１８４号；第５，４１６，１９５号；第５，３９９，３４５号；及び第５，４５７，０８９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
顆粒球コロニー刺激因子又はｈＧ−ＣＳＦは、その受容体への結合、その受容体の二量体化の誘導、好中球産生の刺激並びに細胞増殖及び分化の刺激などの（これらに限定されない。）、様々な生物活性を有する。顆粒球コロニー刺激因子及びｈＧ−ＣＳＦの生物活性の幾つかの例が上記されており、米国特許６，６７６，９４７号；第６，５７９，５２５号；第６，５３１，１２１号；第６，５２１，２４５号；第６，４８９，２９３号；第６，３６８，８５４号；第６，３１６，２５４号；第６，２６８，３３６号；第６，２３９，１０９号；第６，１６５，２８３号；第５，９８６，０４７号；第５，８３０，８５１号；第５，０４３，１５６号；第５，７７３，５６９（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
ｈＧ−ＣＳＦの生物学的に活性な断片／バリアントには、その最初の３０アミノ酸が分泌中に切断される（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４１５（１９８６）；Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１（１９８６））、２０７個又は２０４個（Ｖ６６、Ｓ６７及びＥ６８を喪失したスプライスバリアント）のアミノ酸を含有する遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「エリスロポエチン」又は「ＥＰＯ」には、その生物活性にかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから産生されたかどうかを問わない。）、合成（米国特許第６，５５２，１６７号、第６，００１，３６４号、第６，１７４，５３０号，第６，２１７，８７３号、第６，６６３，８６９号、第６，６７３，３４７号；ＷＯ ００／１２５８７号（参照により、本明細書に組み込まれる。））、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）、その合成又は製造の方法にかかわらず、ＥＰＯの少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質、並びにヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）、エリスロポエチン類縁体、エリスロポエチンイソフォーム（米国特許第５，８５６，２９８号に記載されているものなど。参照により、本明細書に組み込まれる。）、エリスロポエチン模倣体（米国特許第６，３１０，０７８号に記載されているものなど。参照により、本明細書に組み込まれる。）、エリスロポエチン断片、ハイブリッドエリスロポエチンタンパク質、融合タンパク質オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント及びミュテインが含まれるものとする。非ヒトＥＰＯの具体例には、ウシ、イヌ（米国特許第６，６９６，４１１号）、ネコ、霊長類（米国特許第６，５５５，３４３号及び第６，８３１，０６０号）、ブタ及びウマＥＰＯが含まれるが、これらに限定されない。ウマ、ブタ、ネコ及びヒツジなど様々な哺乳動物から得られるＥＰＯ配列の分析については、「Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．“Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｈｉｇｈ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｍｏｎｇ ｍａｍｍａｌｓ，”Ｂｌｏｏｄ，（１９９３）８２：１５０７−１５１６」及び「Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｎｋｅｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｅｎｅ：ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｅｎｅ，”Ｇｅｎｅ，（１９８６）４４（２−３）：２０１−９」も参照されたい。全ての引用文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。エリスロポエチンの具体例には、エポエチンα（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６６７，０１６号；第４，７０３，００８号；第５，４４１，８６８号；第５，５４７，９３３号；第５，６１８，６９８号；第５，６２１，０８０号；第５，７５６，３４９号；及び第５，９５５，４２２に記載されているものなど）、ダルベポエチンα（欧州特許出願ＥＰ６４０６１９号に記載されているものなど）、ＤＹＮＥＰＯＴＭ（エポエチンδ）、ヒトエリスロポエチン類縁体（国際特許出願ＷＯ９９／６６０５４号、及び米国特許第６，５４８，６５３号及び第５，８８８，７７２号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているヒト血清アルブミン融合タンパク質など）、エリスロポエチン変異体（参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願ＷＯ９９／３８８９０号、及び米国特許第６，４８９，２９３号；第５，８８８，７７２号；第５，６１４，１８４号；及び第５，４５７，０８９号に記載されているものなど）、エリスロポエチンω（米国特許第５，６８８，６７９号；第６，０９９，８３０号；第６，３１６，２５４号及び第６，６８２，９１０号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているヒトエリスロポエチン遺伝子のＡｐａＩ制限断片から産生され得る。）、改変されたグリコシル化ヒトエリスロポエチン（国際特許出願ＷＯ９９／１１７８１号及びＥＰ１０６４９５１号に記載されているものなど）及びＰＥＧ抱合されたエリスロポエチン類縁体（ＷＯ９８／０５３６３号、及び米国特許第５，６４３，５７５号；第６，５８３，２７２号；第６，３４０，７４２号；及び第６，５８６，３９８号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなど）が含まれるが、これらに限定されない。内在性ヒトエリスロポエチンの発現のために修飾された細胞株の具体例は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願Ｗ０９９／０５２６８号及びＷ０９４／１２６５０号及び米国特許第６，３７６，２１８号に記載されている。
「ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）」又は「ｈＥＰＯポリペプチド」という用語は、上述されているエリスロポエチン又はＥＰＯ、並びに天然のｈＥＰＯの少なくとも一つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。ｈＥＰＯポリペプチドには、天然のヒトエリスロポエチンの薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然ヒトエリスロポエチンの塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、及び天然のヒトエリスロポエチンのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント及びそれらのポリペプチド融合物が含まれる。ｈＥＰＯポリペプチド及び模倣体の例には、米国特許第６，３１０，０７８号；第５，１０６，９５４号；第６，７０３，４８０号；第６，６４２，３５３号；第５，９８６，０４７号；及び第５，７１２，３７０号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ｈＥＰＯポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、例えば、メチオニンがｈＥＰＯのＮ末端に連結されたメチオニルエリスロポエチン、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合、血清アルブミン結合ペプチドとの融合及び血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合から得られる、が含まれるが、それらに限定されるものではない。天然のｈＥＰＯ核酸及びアミノ酸の配列は公知である。完全な天然ｈＥＰＯのアミノ酸配列並びに成熟天然ｈＥＰＯのアミノ酸配列及び成熟ＥＰＯのバリアントについては、それぞれ、本明細書中の配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のｈＥＰＯポリペプチドは、配列番号３７、配列番号３８又は配列番号３９と実質的に同一である。ｈＥＰＯ変異体及び変異体ｈＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子も公知である。ｈＥＰＯ変異体の例には、米国特許第６，４８９，２９３号；第６，１５３，４０７号；第６，０４８，９７１号；第５，６１４，１８４号；及び第５，４５７，０８９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
エリスロポエチン又はｈＥＰＯは、その受容体への結合、その受容体の二量体化の誘導、赤血球産生の刺激及び細胞増殖の刺激などの（これらに限定されない。）、様々な生物活性を有する。エリスロポエチン又はｈＥＰＯの生物活性の幾つかの例は、米国特許第６，６７６，９４７号；第６，５７９，５２５号；第６，５３１，１２１号；第６，５２１，２４５号；第６，４８９，２９３号；第６，３６８，８５４号；第６，３１６，２５４号；第６，２６８，３３６号；第６，２３９，１０９号；第６，１６５，２８３号；第５，９８６，０４７号；第５，８３０，８５１号；及び第５，７７３，５６９号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
様々な参考文献が、ポリマー抱合又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。「４ＨＢポリペプチド」という用語には、ＰＥＧなどのポリマーに抱合されたポリペプチドが含まれ、システイン、リジン又はその他の残基の一又は複数のさらなる誘導化から構成され得る。さらに、４ＨＢポリペプチドは、当該リンカー又はポリマーが抱合されているアミノ酸が本発明に従って非天然アミノ酸であり得、又はリジン若しくはシステインへの結合などの本分野で公知の技術を使用して天然にコードされているアミノ酸へ抱合され得るリンカー又はポリマーを含み得る。
ｈＧＨポリペプチドのポリマー抱合が報告されている。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号、第６，１３６，５６３号及び第６，６０８，１８３号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。野生型ＩＦＮβ又はそのＣ１７Ｓバリアントのポリマー修飾が報告されている（ＥＰ２２９１０８号、米国特許第５，３８２，６５７号、ＥＰ５９３８６８号；米国特許第４，９１７，８８８号及びＷＯ９９／５５３７７号、これらは参照により、本明細書に組み込まれる。）。米国特許第４，９０４，５８４号は、ＰＥＧ化され、リジンが喪失されたポリペプチド（少なくとも一つのリジン残基が、欠失され、又は他の任意のアミノ酸残基と置換されている。）を開示している。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質上の少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失され、該タンパク質への抱合を達成するのに十分な条件下で該タンパク質がＰＥＧと接触される、タンパク質をＰＥＧと抱合するための方法を開示している。ＷＯ９９／０３８８７号は、ポリペプチドの特定された領域中に位置する非必須アミノ酸残基でシステイン残基が置換されている、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化されたバリアントを開示する。ＰＥＧ化されたＩＦＮ分子の例には、米国特許第６，５２４，５７０号；第６，２５０，４６９号；第６，１８０，０９６号；第６，１７７，０７４号；第６，０４２，８２２号；第５，９８１，７０９号；第５，９５１，９７４号；第５，９０８，６２１号；第５，７３８，８４６号；第５，７１１，９４４号；第５，３８２，６５７号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。ＩＦＮβが、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの一例として挙げられる。ＷＯ００／２３１１４号は、グリコシル化されたＩＦＮβ及びＰＥＧ化されたＩＦＮβを開示する。ＷＯ００／２３４７２号は、ＩＦＮβ融合タンパク質を開示する。ＷＯ００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比較して少なくとも一つの追加のグリコシル化部位を含む、軽減されたアレルゲン性を有するグリコシル化されたポリペプチドバリアントを作製する方法を開示する。米国特許第５，２１８，０９２号は、野生型ポリペプチドに比べて少なくとも一つの追加の炭水化物鎖を導入するための、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び他のポリペプチドの修飾を開示する。米国特許第５，２１８，０９２号に記載されている技術に従って修飾することができる多くのポリペプチドの一例として、ＩＦＮβが開示されている。
「４ＨＢポリペプチド」という用語には、該ポリペプチドのＮ結合型又はＯ結合型グリコシル化形態も含まれる。これらの形態には、配列番号２３の１２９位、又は配列番号２４若しくは２５、若しくは他の任意のＩＦＮポリペプチドの均等な位置にＯ結合型グリコシル化部位を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない（Ａｄｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７６：５１１（１９９１））。「ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド」という用語には、配列番号２９の１３４位にＯ結合型グリコシル化部位を有するポリペプチドなど（これに限定されない。）、該ポリペプチドのグリコシル化された形態も含まれる（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ ６３７：５５−６２（１９９３）。「ｈＥＰＯポリペプチド」という用語には、２４、３８及び８３にＮ結合型グリコシル化部位を有し、並びに１２６にＯ結合型グリコシル化部位を有するグリコシル化された形態も含まれる（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＪＢＣ ２６３：３６５７−３６６３；Ｓａｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：８６１８−８６２６）。
単一ヌクレオチドの変化を含有するバリアントも、４ＨＢポリペプチドの生物活性バリアントと考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。「４ＨＢポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された又は融合タンパク質として発現された、一若しくは複数の任意の４ＨＢポリペプチド、又は他の任意のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リガンド若しくは任意の種類の他の活性分子、並びに、例えば生物活性を維持しつつ特異的な欠失又は他の修飾を含有するポリペプチド類縁体の、４ＨＢポリペプチドヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体も含まれる。単一ヌクレオチドの変化（すなわち、Ｌ１２７Ｍ及びＡ１４４Ｔ）を含有するバリアントも、ｈＧ−ＣＳＦの生物活性バリアントと考えられる（配列番号３５及び３６参照）。さらに、配列番号２８のＶ６６、Ｓ６７及びＥ６８を喪失している配列番号３０に示されたバリアントなど（これに限定されない。）のスプライスバリアントも含まれる。「ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された又は融合タンパク質として発現された、一若しくは複数の任意のｈＧ−ＣＳＦ、又は他の任意のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リガンド若しくは任意の種類の他の活性分子（米国特許第６，２６１，５５０号；６，１６６，１８３号；第６，２０４，２４７号；第６，２６１，５５０号；第６，０１７，８７６号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。））、並びに、例えば生物活性を維持しつつ特異的な欠失又は他の修飾を含有するポリペプチド類縁体（米国特許第６，２６１，５５０号；第６，００４，５４８号；第６，６３２，４２６号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。））の、ｈＧ−ＣＳＦヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体も含まれる。ｈＥＰＯの生物活性断片／バリアントには、１９３個のアミノ酸を含有し、最初の２７個のアミノ酸が分泌中に切断される遺伝子産物（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８０６−８１０ ；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） ＰＮＡＳ， ＵＳＡ ８２：７５８０−７５８４）（配列番号３８）及びエリスロポエチンの成熟形態の形成中に最後の４つのアミノ酸の一以上が除去されることが含まれる。単一ヌクレオチドの変化を含有するバリアント（すなわち、Ｓ１０４Ｎ及びＬ１０５Ｆ、Ｐ１２２Ｑ、Ｅ１３Ｑ、Ｑ５８−＞ＱＱ、Ｇ１１３Ｒ）も、ｈＥＰＯの生物活性バリアントと考えられる（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８０６−８１０；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９５：７１７−７２２）。「ｈＥＰＯポリペプチド」という用語には、化学的手段によって連結された又は融合タンパク質として発現された、一若しくは複数の任意のｈＥＰＯ、又は他の任意のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リガンド若しくは任意の種類の他の活性分子（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（３）：１１８４−８；及びＳｙｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（３５）：２４７７３−８、及び米国特許第６，１８７，５６４号；第６，７０３，４８０号；第５，７６７，０７８号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。））、並びに、生物活性を維持しつつ特異的な欠失を含有するポリペプチド類縁体（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＪＢＣ ２６８：１５９８３−１５９９３；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＪＢＣ ２６９：２２８３９−２２８４６；Ｂｉｔｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） ＦＥＢＳ ３３６：１３３−１３６；及び米国特許第６，１５３，４０７号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。））の、ｈＥＰＯへテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体も含まれる。
本明細書に記載されているｈＧＨ中のアミノ酸位置に関する全ての表記は、別段の記載がなければ（すなわち、比較が配列番号１、３又は他のｈＧＨ配列に基づいていると記載されている場合）、配列番号２の位置に基づいている。本明細書に記載されているｈＩＦＮ中のアミノ酸位置に関する全ての表記は、別段の記載がなければ（すなわち、比較が配列番号２３、２５又は他のｈＩＦＮ配列に基づいていると記載されている場合）、配列番号２４の位置に基づいている。本明細書に記載されているｈＧ−ＣＳＦ中のアミノ酸位置に関する全ての表記は、別段の記載がなければ（すなわち、比較が配列番号２８、３０、３５、３６又は他のｈＧ−ＣＳＦ配列に基づいていると記載されている場合）、配列番号２９の位置に基づいている。本明細書に記載されているｈＥＰＯ中のアミノ酸位置に関する全ての表記は、別段の記載がなければ（すなわち、比較が配列番号３７、３９又は他のｈＥＰＯ配列に基づいていると記載されている場合）、配列番号３８の位置に基づいている。当業者であれば、配列番号１、２、３又は他の任意のＧＨ配列中の位置に対応するアミノ酸位置は、ｈＧＨ融合物、バリアント、断片などの他の任意のｈＧＨ分子中に容易に同定可能であることが自明であろう。例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列整列プログラムは、配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列中の位置と対応する、タンパク質中の特定の位置を整列し、同定するために使用することが可能である。配列番号１、２、３又は他のＧＨ配列に関して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失又は付加は、本明細書に記載され又は本分野で公知のｈＧＨ融合物、バリアント、断片などにおける対応する位置の置換、欠失又は付加も表すものとし、本発明によって明示的に包含される。類似の同定及び分析が、配列番号２３、２４、２５又は他の任意のＩＦＮ配列、配列番号２８、２９、３０、３５、３６又は他の任意のｈＧ−ＣＳＦ配列及び配列番号３７、３８、３９又は他の任意のＥＰＯ配列についても当てはまる。
「４ＨＢポリペプチド」という用語には、一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む四螺旋バンドルポリペプチドが包含される。本発明の４ＨＢポリペプチドは、一又は複数の非天然アミノ酸修飾とともに、一又は複数の天然アミノ酸を用いた修飾から構成され得る。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換などの（これらに限定されない。）、４ＨＢポリペプチドの一又は複数の生物活性を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然の４ＨＢポリペプチド中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「４ＨＢポリペプチド」という用語によって包含される。
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７に置換を有するもの又は位置１（すなわち、Ｎ末端に）付加を有するもの又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸、又は他の任意のＧＨ配列）。幾つかの実施形態では、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして作用させる、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中の少なくとも一つの置換を含む。他の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸の典型的な取り込み部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域中及びヘリックスＣの一部の中の残基が含まれる。別の実施形態では、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなど、天然にコードされていないアミノ酸によるＧ１２０の置換。別の実施形態では、上掲されている置換が、ｈＧＨポリペプチドをｈＧＨアンタゴニストに誘導するさらなる置換と組み合わされる。例えば、天然にコードされていないアミノ酸が本明細書に明記されている位置の一つにおいて置換され、且つ同時にＧ１２０に置換が導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）。幾つかの実施形態において、ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。
ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５、又はそれらの任意の組み合わせに置換を有するもの（配列番号２４、又は配列番号２３、２５中の対応するアミノ酸、又は他の任意のＩＦＮ配列）が含まれるが、これらに限定されない。これらの置換の一つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択された部位及び所望の活性に応じて弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして作用し得る可能性がある。ヒトＩＦＮアンタゴニストには、２２、２３、２４、２５、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるがこれらに限定されるものではない（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態では、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ＩＦＮをアンタゴニストとして作用させる、領域１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤおよびＥヘリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅヘリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）中の少なくとも一つの置換を含む。他の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸の典型的な取り込み部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域中及びヘリックスＣの一部の中の残基が含まれる。別の実施形態では、上掲されている置換が、ｈＩＦＮポリペプチドをｈＩＦＮアンタゴニストに誘導するさらなる置換と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ｈＩＦＮアンタゴニストは、ｈＩＦＮ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。
ヒトＧ−ＣＳＦアンタゴニストには、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１４５に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＧ−ＣＳＦアンタゴニストは、Ｇ−ＣＳＦをアンタゴニストとして作用させる領域６−３０、４０−７０又は１０５−１３０中に少なくとも一つの置換を含む。他の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸の典型的な取り込み部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域中及びヘリックスＣの一部の中の残基が含まれる。別の実施形態では、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなど、天然にコードされていないアミノ酸によるＬ７０の置換。別の実施形態では、上掲されている置換が、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドをｈＧ−ＣＳＦアンタゴニストに誘導するさらなる置換と組み合わされる。例えば、天然にコードされていないアミノ酸が本明細書に明記されている位置の一つにおいて置換され、且つ同時にＬ７０に置換が導入される。幾つかの実施形態において、ｈＧ−ＣＳＦアンタゴニストは、ｈＧ−ＣＳＦ分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。
ヒトＥＰＯアンタゴニストには、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９に置換を有するもの、又はこれらの任意の組み合わせを有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（ｈＥＰＯ；配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９の対応するアミノ酸）。幾つかの実施形態において、ｈＥＰＯアンタゴニストは、ＥＰＯをアンタゴニストとして作用させる領域１０−１５又は１００−１０８中に少なくとも一つの置換を含む。「Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：４９３−５０２」及び「Ｃｈｅｅｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：８６１−８６６」を参照されたい。幾つかの実施形態では、低親和性受容体結合部位（部位２）中に見出される以下の置換：Ｖ１１Ｓ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｉ、Ｓ１００Ｅ、Ｒ１０３Ａ、Ｓ１０４Ｉ、Ｌ１０８Ｋを一又複数含有することによって、ｈＥＰＯポリペプチドが修飾される。他の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸の典型的な取り込み部位には、ヘリックスＡのアミノ末端領域中及びヘリックスＣの一部の中の残基が含まれる。別の実施形態では、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン又はＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなど、天然にコードされていないアミノ酸によるＬ１０８の置換。別の実施形態では、上掲されている置換が、ｈＥＰＯポリペプチドをｈＥＰＯアンタゴニストに誘導するさらなる置換と組み合わされる。例えば、天然にコードされていないアミノ酸が本明細書に明記されている位置の一つにおいて置換され、且つ同時にＬ１０８に置換が導入される（Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｒ、Ｌ１０８Ｈ、Ｌ１０８Ｄ又はＬ１０８Ｅを含むが、これらに限定されない。）。幾つかの実施形態において、ｈＥＰＯアンタゴニストは、ｈＥＰＯ分子の部位２結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態では、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換又は欠失をさらに含む。例えば、前記付加、置換又は欠失は、４ＨＢポリペプチド受容体に対する親和性を調節し、受容体の二量体化を調節し（増加又は減少させることを含むが、これらに限定されない。）、受容体の二量体を安定化し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、用量を調節し、放出若しくは生物学的利用可能性を調節し、精製を促進し、又は投与の具体的経路を改善若しくは改変し得る。同様に、４ＨＢポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、該ポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない。）、精製又は他の形質を向上させる、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限定されない。）又はアフィニティーを基礎とした他の配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない。）又は連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない。）を含み得る。
「４ＨＢポリペプチド」という用語には、天然にコードされていないアミノ酸側鎖を介して、同一若しくは異別の天然にコードされていないアミノ酸側鎖に、天然にコードされているアミノ酸側鎖に直接的に連結されたもの又はリンカーを介して間接的に連結されたものなど（これらに限定されない。）、連結されたホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含される。典型的なリンカーには、ポリ（エチレングリコール）又はポリデキストラン又はポリペプチドなど水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
「天然にコードされていないアミノ酸」とは、２０の共通アミノ酸うちの一つ又はパイロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）又はセレノシステインでないアミノ酸を表す。「天然にコードされていないアミノ酸」と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、並びに様々にハイフンが付されたそのバージョン又はハイフンが付されていないそのバージョンである。「天然にコードされていないアミノ酸」という用語には、天然にコードされているアミノ酸（２０の共通アミノ酸又はパイロリジン又はセレノシステインを含むが、これらに限定されない。）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体、成長しているポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって本来取り込まれないアミノ酸が含まれるが、これに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
「アミノ末端修飾基」とは、ポリペプチドのアミノ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどのペプチド若しくはタンパク質、又はペプチドの血清半減期を増加させるその他の部分が含まれるが、これらに限定されない。
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語が、分子の異なる、確定可能な部分又は単位を表すために、本分野及び本明細書において使用されている。前記用語は、化学の分野において若干同義的であり、本明細書では、何らかの機能又は活性を発揮し、他の分子と反応する分子の部分を表すために使用される。
本明細書において、「結合」又は「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を表すために使用され、典型的には、共有結合である。加水分解に対して安定な結合とは、該結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下を含む（これに限定されない。）有用なｐＨ値で、長期にわたって、おそらくは永久に水と反応しない結合を意味する。加水分解に対して不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が、水又は例えば、血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が一又は複数の酵素によって分解可能であることを意味する。本分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の一若しくは複数との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸の、生物活性因子上のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は、一般的には、生理的条件下で加水分解されて、前記因子を放出する。加水分解によって分解可能な他の結合には、炭酸塩結合；アミンとアルデヒドの反応から得られたイミン結合；アルコールとリン酸基との反応によって形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（ＰＥＧなどのポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合；及びホスホルアミダイト基（ポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性因子」という用語は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物及びヒトを含む（これらに限定されない。）生物の任意の物理的又は生化学的特性に影響を与えることが可能な任意の物質を意味する。特に、本明細書において使用される場合、生物活性分子には、ヒト若しくは他の動物の疾病の診断、治癒、緩和、治療若しくは予防用の任意の物質、又はヒト若しくは動物の身体的若しくは精神的な健康をその他の方法で強化する任意の物質が含まれるが、これらに限定されない。生物活性分子の例には、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子及びミセルが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明とともに使用するのに適する生物活性因子のクラスには、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド系薬剤などが含まれるが、これらに限定されない。
「二官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを表す。第一の生物活性成分と、二官能性リンカーと、及び第二の生物活性成分とを含む抱合体を形成するために、ある生物活性成分上の基と反応する１つの官能基と、第二の生物成分上の基と反応する別の基とを有する二官能性リンカーを使用することができる。ペプチドに様々な化合物を付着するための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８４号；第４，６８０，３３８号；第４，５６９，７８９号；及び第４，５８９，０７１号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。「多官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２以上の別個の官能基を含むポリマーを表す。
置換基が、左から右へ書かれた慣用の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左へ構造を書くことによって得られる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と等価である。
「置換基」という用語には、「非妨害性置換基」が含まれるが、これに限定されない。「非妨害性置換基」とは、安定な化合物を生成する基である。適切な非妨害性置換基又は基には、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリール、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ｍは、１から８までである。）、アリール、置換されたアリール、置換されたアルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換された複素環基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（各ｍは、１から８までである。）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用される各Ｒは、Ｈ、アルキル又は置換されたアルキル、アリール又は置換されたアリール、アラルキル又はアルカリールである。
「ハロゲン」という用語には、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素が含まれる。
「アルキル」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、別段の記載がなければ、完全に不飽和とし、一又は多不飽和とすることができ、且つ表記の炭素原子数を有する二価及び多価の基を含むことが可能な直鎖若しくは分枝鎖、又は環状炭化水素基、又はそれらの組み合わせを意味する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は、１ないし１０個の炭素を意味する。）。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体及び異性体などの基が含まれるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基とは、一又は複数の二重結合又は三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例には、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、並びにこれらより高級な相同体及び異性体が含まれるが、これらに限定されるものではない。「アルキル」という用語は、別段の記載がなければ、「ヘテロアルキル」など、以下でさらに詳細に定義されているアルキルの誘導体も含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
「アルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、アルカンから誘導される二価の基を意味し、例として、構造−ＣＨ２ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下に記載されている基が含まれる。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１から２４個までの炭素原子を有し得るが、本発明では、１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」とは、一般的には８個以下の炭素原子を有する、短鎖アルキル又はアルキレン基である。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、それらの慣用的な意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子を介して分子の残部に付着されたアルキル基を表す。
単独又は別の用語と一部として組み合わされた「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記載がなければ、表記の炭素原子数と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも一つの複素原子とからなり、窒素原子及び硫黄原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素複素原子が必要に応じて四級化されていてもよい、安定な直鎖若しくは分枝鎖若しくは環状炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味する。複素原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置又はアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置され得る。例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれるが、これらに限定されるものではない。最大２個の複素原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ−（ＣＨ３）３のように、連続してもよい。同様に、単独又は別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、ヘテロアルキルから得られる二価の基を意味し、例として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及びＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基の場合、同一又は異別の複素原子が、鎖末端の一方又は両方を占めることも可能である（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含むが、これらに限定されない。）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
単独又は別の用語と一部として組み合わされた「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別段の記載がなければ、それぞれ、「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状様式を表す。このため、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルには、飽和及び不飽和環結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、複素原子は、複素環が分子の残部に付着されている位置を占めることが可能である。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが含まれるが、こられに限定されない。さらに、本用語は、二環式及び三環式の環構造を包含する。同様に、単独で又は別の置換基の一部としての「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、ヘテロシクロアルキルから誘導される二価の基を意味し、単独で又は別の置換基の一部としての「シクロアルキレン」という用語は、シクロアルキルから誘導される二価の基を意味する。
本明細書において使用される、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中に溶解可能な任意のポリマーを表す。４ＨＢポリペプチドへの水溶性ポリマーの結合は、非修飾形態に比べて、増加若しくは調節された血清半減期、又は増加若しくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、凝集及び多量体の形成、改変された受容体結合及び改変された受容体二量体化又は多量体化などの調節された物理的会合特性を含む（これらに限定されない。）変化をもたらすことが可能である。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有してもよく、又は有さなくてもよい。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、そのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン硫酸を含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むが、これらに限定されない。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアルキレングリコールの共重合体及びその誘導体、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。このような水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びそれらの誘導体を表す。「ポリアルキレングリコール」という用語は、直鎖及び分岐ポリマーの両方、並びに０．１ｋＤａないし１００ｋＤａの平均分子量を包含する。他の典型的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）」など、供給業者のカタログに列記されている。
「アリール」という用語は、別段の記載がなければ、互いに縮合し、又は共有結合された単一環又は複数環（好ましくは、１から３個までの環）とすることが可能な多不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から４個までの複素原子を含有し、窒素及び硫黄原子が必要に応じて酸化されており、並びに窒素原子が必要に応じて四級化されているアリール基（又は環）を表す。ヘテロアリール基は、複素原子を通じて分子の残部に付着させることが可能である。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル，２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが含まれる。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下に記載されている許容される置換基の群から選択される。
簡略のため、他の用語と組み合わせて使用される場合（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含むが、これらに限定されない。）、「アリール」という用語は、上記定義のアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。このため、「アリールアルキル」という用語は、アリール基が、炭素原子（メチレン基を含むが、これに限定されない。）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどを含むが、これらに限定されない。）を含むアルキル基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが含まれるが、これらに限定されない。）に付着された基を含むものとする。
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」を含むが、これらに限定されない。）は、表記されている基の置換された形態及び置換されていない形態の両方を含むものとする。各種類の基に対する典型的な置換基が、以下に記載されている。
アルキル及びヘテロアルキル基に対する置換基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと称される基を含む。）は、０から（２ｍ’＋１）（ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である。）までの範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される様々な一又は複数の基とすることができるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない。）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できるであろう。
アルキル基に対して記載した置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基に対する置換基は多様であり、ゼロから芳香環系上の開放された原子価の総数までの数の、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、独立に、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから選択される。）から選択されるが、これらに限定されない。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。
本明細書において使用される「調節された血清半減期」という用語は、修飾されていない生物活性分子に比した、修飾された生物活性分子の循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、生物活性分子の投与後の様々な時点に血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度の時間との相関は、血清半減期の計算を可能とする。増加された血清半減期は、望ましくは、少なくとも約２倍を有するが、例えば、満足のいく投薬治療が可能となり、又は毒性効果を回避する場合には、これより小さな増加も有用であり得る。幾つかの実施形態では、前記増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍である。
本明細書において使用される「調節された治療半減期」という用語は、修飾されていない形態に比した、修飾された生物活性分子の治療的有効量の半減期の正又は負の変化を意味する。治療的半減期は、投与後の様々な時点での、分子の薬物動態学的及び／又は薬力学的特性を測定することによって測定される。増加された治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬治療、特定の有益な総投薬量を可能とし、又は所望でない効果を回避する。幾つかの実施形態では、増加された治療的半減期は、増加した効力、修飾された分子のその標的への増加若しくは減少した結合、又は非修飾分子の別のパラメータ若しくは作用機序の増加若しくは減少から生じる。
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用される場合、自然の状態で核酸又はタンパク質とともに付随している他の細胞成分を、該核酸又はタンパク質が実質的に含まないことを表す。それは、均質な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態、又は溶液（水溶液を含むが、これに限定されない。）とすることができる。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析的化学技術を用いて測定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、該遺伝子に隣接し、対象遺伝子とは別のタンパク質をコードする読み取り枠から分離されている。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に一つのバンドを生じることを表す。特に、「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋であることを意味する。
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された一又は複数（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１（１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）； ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書では互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに対する記載は、ペプチドという記載及びタンパク質という記載に対しても等しく適用され、逆も同様である。本用語は、天然のアミノ酸ポリマー及び一又は複数のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において使用される本用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている任意の長さのアミノ酸鎖（完全長のタンパク質（すなわち、抗原）など）を包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然アミノ酸並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにパイロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合されているα炭素を有する化合物を表す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の基礎的化学構造を保持する。
本明細書では、アミノ酸は、一般的に知られている三文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている一文字記号の何れかによって表記され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受容されている一文字コードによって表記され得る。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に対して適用される。ある核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を表し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンによって指定されている全ての位置で、該コドンは、コードされているポリペプチドを変化させずに、任意の対応する記載されているコドンへと変化させることができる。このような核酸の変化は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本発明において、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）は、機能的に同一の分子を生成するために修飾可能であることを理解するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載された配列に含意される。
アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされている配列中の単一アミノ酸又は僅かな割合のアミノ酸を変化し、付加し、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する、各置換、欠失又は付加は、変化が、あるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、本分野において周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、さらに、本発明の多型バリアント、種間相同体及び対立遺伝子であり、これらを除外するものではない。
以下の８つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する。
１） アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２） アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３） アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４） アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５） イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６） フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７） セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８） システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照。）
２以上の核酸又はポリペプチド配列に関する、「同一」又はパーセント「同一性」という用語は、同一である２以上の配列又はサブ配列を表す。以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、又は手で整列し、目で調べることによって測定された場合に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたり、最大の一致度を比較し、整列したときに、当該配列が、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの一定パーセント（すなわち、指定された領域にわたって、約６０％の同一性、必要に応じて約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の同一性）を有すれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補物も表す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は７５ないし１００アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、又は、明記されていない場合には、配列又はポリヌクレオチド又はポリペプチド全体にわたって存在することが可能である。
配列比較の場合、典型的には、一つの配列が、該配列に対して試験配列が比較される基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、サブ配列座標を指定し、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用することが可能であり、又は別のパラメータを指定することが可能である。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」には、２０から６００まで、通常は約５０から約２００まで、より一般的には約１００から１５０までからなる群から選択される連続する位置の数の任意の一つのセグメントへの参照が含まれ、その中で、２つの配列は最適に整列された後に、配列は同数の連続位置の基準配列に対して比較され得る。比較のための配列の整列方法は、本分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、「Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ｃ」の局所相同性アルゴリズム、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０） Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３」の相同性整列アルゴリズム、「Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４」の類似性検索方法、これらのアルゴリズムをコンピュータに実装したもの（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、又は手による整列と目視での調査（例えば、 Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）などによって（これらに限定されない。）、実施することが可能である。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、それぞれ、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２」及び「Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０」に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を通じて公に頒布されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）、１０の予測値（Ｅ；ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）、及び１０の予測値（Ｅ；ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）整列（Ｂ）、１０の予測値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑性」フィルターのスイッチを切って行われる。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一指標は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で一致が偶発的に生じ得る確率の指標を与える。例えば、基準核酸に対して試験核酸を比較した場合に、最少合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似していると考えられる。
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」という用語は、あるヌクレオチド配列が複雑な混合物（全細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該配列にのみ分子が結合し、二重鎖を形成し、又はハイブリダイズすることを表す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本分野で公知であるように、低いイオン強度と高い温度の条件を表す。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複雑な混合物（全細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。）中のその標的サブ配列にハイブリダイズするが、複雑な混合物中の他の配列にはハイブリダイズしないであろう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい手引きは、「Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）」に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５ないし１０℃低いように選択される。Ｔｍとは、（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、５０％のプローブが平衡状態で占有されるので）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、短いプローブ（１０ないし５０ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約３０℃、長いプローブの場合（５０ヌクレオチド超を含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、必要に応じてバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベートする条件、又は５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ中で洗浄し、６５°の０．１％ ＳＤＳ中で洗浄する条件とすることができる。このような洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分以上行うことが可能である。
本明細書において使用される「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含むが、これらに限定されない。）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含むが、これらに限定されない。）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などの系統発生学的ドメインで真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を表す。
本明細書において、「非真核生物（ｎｏｎ−ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）」という用語は、非真核生物（ｎｏｎ−ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を表す。例えば、非真核生物は、真正細菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などを含むが、これらに限定されない。）系統発生学的ドメイン、又は古細菌（メタノコッカス・ジャンナスキー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｎａｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｒｒａ）、ハロフェラックス・ボルカニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム種ＮＲＣ−１（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ＮＲＣ−１）などの好塩菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシー（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエウロピラム・ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）などを含むが、これらに限定されない。）系統発生学的ドメインに属することができる。
本明細書において使用される「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表す。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、治療されている疾病、症状又は疾患の一又は複数の症候を、ある程度緩和し得る、投与されている（修飾された）非天然アミノ酸の量を表す。本明細書に記載されている（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、増強的及び／又は治療的処置のために投与することが可能である。
「増強」又は「増強的」という用語は、所望の効果の効力又は持続時間の何れかを増加又は延長することを意味する。このため、治療剤の効果の増強に関しては、「増強」という用語は、ある系に対する他の治療剤の効果の効力又は持続時間の何れかを増加又は延長する能力を表す。本明細書において使用される「増強的有効量」とは、所望の系において、別の治療剤の効果を増強するのに十分な量を表す。患者に使用される場合、この使用に対して有効な量は、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存するであろう。
本明細書において使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチド上に翻訳後修飾が存在することを表す。「（修飾された）」という形式の用語は、論述されているポリペプチドが必要に応じて修飾されていること、すなわち、論述されているポリペプチドは修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいことを意味する。
「翻訳後修飾された」及び「修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖中に取り込まれた後に、このようなアミノ酸に対して起こる、天然又は非天然アミノ酸の任意の修飾を表す。本用語は、単なる例示として、翻訳同時インビボ修飾、翻訳後インビボ修飾及び翻訳後インビトロ修飾を包含する。
予防的な適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、ある疾病、疾患又は症状が発生しやすく、又はその他該疾病、疾患又は症状に対してリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防的有効量」と定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。このような予防的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「保護された」という用語は、一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を抑制する「保護基」又は部分が存在することを表す。保護基は、保護されている化学的反応基の種類に応じて、変化し得る。例えば、化学的反応基がアミン又はヒドラジドであれば、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択することが可能である。化学的反応基がチオールであれば、保護基は、オルトピリジルジスルフィドとすることが可能である。化学的反応基が、酪酸若しくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基であれば、保護基は、ベンジルとすることができ、又はメチル、エチル若しくはｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基とすることが可能である。本分野で公知の他の保護基は、本明細書に記載されている方法及び組成物中で、又は該組成物とともに使用することもできる。
単なる例示として、ブロッキング／保護基は、
Figure 2007519422
 から選択され得る。
他の保護基は、「Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９９」に記載されている、その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
治療的な適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、疾病、症状又は疾患に既に罹患している患者に、該疾病、疾患又は症状の症候を治癒し、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存するであろう。このような治療的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを表すために使用される。
別段の記載がなければ、当業者の通常の技術知識の範疇に属する、質量分析計、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用法が使用される。
Ｉ．序論
少なくとも一つの非天然アミノ酸を含む四螺旋バンドル分子が、本発明において提供される。本発明のある種の実施形態において、少なくとも一つの非天然アミノ酸を有する４ＨＢポリペプチドは、少なくとも一つの翻訳後修飾を含む。一実施形態において、前記少なくとも一つの翻訳後修飾は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第二のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類縁体、抗体若しくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、阻害的リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新しい官能基、他の分子と共有結合的に若しくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージ（ｐｈｏｔｏ ｃａｇｅ）化された部分、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類縁体、重原子を取り込む部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長された側鎖、炭素結合された糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、電子密度が高い基、磁性基、インターカレート基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能な標識、小分子、又は第二の反応基を含む上記若しくはその他の任意の望ましい化合物若しくは物質の組み合わせなどの分子（これらに限定されない。）を、特定の反応基に対して適切であることが当業者に公知である化学的方法を用いて、第一の反応基を含む少なくとも一つの非天然アミノ酸に付着させることを含む。例えば、第一の反応基はアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、アセチレン部分と称される場合もある。）を含むが、これに限定されない。）であり、前記第二の反応基はアジド部分であり、［３＋２］付加環化化学方法が使用される。別の例では、前記第一の反応基はアジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない。）であり、第二の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾された４ＨＢポリペプチドのある種の実施形態では、少なくとも一つの翻訳後修飾を含む少なくとも一つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない。）が使用され、この場合、少なくとも一つの翻訳後修飾は糖質部分を含む。ある種の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞又は非真核細胞中、インビボで行われる。
ある種の実施形態では、タンパク質は、ある宿主細胞によってインビボで作製される少なくとも一つの翻訳後修飾を含み、該翻訳後修飾は別の宿主細胞の種類によって通常作製されない。ある種の実施形態では、タンパク質は、ある真核細胞によってインビボで作製される少なくとも一つの翻訳後修飾を含み、該翻訳後修飾は非真核細胞によって通常作製されない。翻訳後修飾の例には、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合（オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧＩｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）によって、オリゴ糖をアスパラギンに付着させることを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合にによって、オリゴ糖（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）をセリン又はスレオニンに付着させることを含む。ある種の実施形態において、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合物などを含むことが可能である。
目的のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は１０個以上の非天然アミノ酸を含有することが可能である。非天然アミノ酸は、同一又は異別とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる部位が存在することが可能である。ある種の実施形態では、タンパク質の天然のバージョン中に存在する少なくとも１個、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸と置換される。
本発明は、天然にコードされていない少なくとも一つのアミノ酸を含む、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー、特にｈＧＨ、ｈＩＦＮ，ｈＧ−ＣＳＦ及びｈＥＰＯのメンバーを基礎とする方法及び組成物を提供する。天然にコードされた少なくとも一つのアミノ酸をＧＨスーパー遺伝子ファミリーメンバー中に導入することによって、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸など（これに限定されない。）との特異的化学反応を含むが、一般に存在する２０アミノ酸と反応しない抱合化学の適用が可能となる。幾つかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含むＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結されている。本発明は、ケトン、アジド又はアセチレン部分など（これらに限定されない。）、天然に取り込まれる２０個のアミノ酸中に見出されない官能基又は置換基を含有するアミノ酸など（これらに限定されない。）、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、セレクターコドンに応じてタンパク質中に、選択的に取り込み、適切に反応性を有するＰＥＧ誘導体でそれらのアミノ酸をその後修飾することを含む、ＰＥＧ誘導体によるタンパク質の選択的修飾のための極めて効率的な方法を提供する。一旦取り込まれれば、次いで、このアミノ酸側鎖は、天然にコードされていないアミノ酸中に存在する特定の官能基又は置換基に適していることが当業者に公知の化学方法を使用することによって修飾することができる。多様な公知の化学方法は、水溶性ポリマーをタンパク質中に取り込むために本発明において使用するのに適している。このような方法には、それぞれ、アセチレン又はアジド誘導体など（これらに限定されない。）とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応（例えば、Ｐａｄｗａ， Ａ． ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｖｏｌ． ４，（１９９１） Ｅｄ． Ｔｒｏｓｔ， Ｂ． Ｍ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ． １０６９−１１０９ ； ａｎｄ， Ｈｕｉｓｇｅｎ， Ｒ． ｉｎ １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｖ，（１９８４） Ｅｄ． Ｐａｄｗａ， Ａ．， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ． １−１７６）が含まれるが、これに限定されない。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加方法は、求核置換反応ではなく、環化付加を含むので、タンパク質は、極めて高い選択性で修飾することが可能である。該反応は、Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することによって、優れた立体選択性（１，４＞１，５）を有する水性条件において、室温で実施することが可能である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６７：３０５７−３０６４； ａｎｄ， Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１：２５９６−２５９９」；及びＷＯ ０３／１０１９７２号を参照。［３＋２］環化付加を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子には、アジド又はアセチレン誘導体など（これらに限定されない。）の適切な官能基又は置換基を有する実質的に全ての分子が含まれる。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど（これに限定されない。）アセチレン基を有する非天然アミノ酸、又はｐ−アジド−フェニルアラニンなど（これに限定されない。）アジド基を有する非天然アミノ酸に付加されることが可能である。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化から得られる五員環は、還元環境では、一般に可逆的でなく、水性環境中では長期間、加水分解に対して安定である。従って、様々な物質の物理的及び化学的特性は、本発明の活性なＰＥＧ誘導体を用いて、厳しい水性条件下で修飾することができる。さらに重要なことに、アジドとアセチレン部分は互いに対して特異的であるので（例えば、遺伝子によってコードされた２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない。）、タンパク質は、極めて高い選択性で、一又は複数の特異的な部位において修飾されることが可能である。
本発明は、ＰＥＧ誘導体の水溶性且つ加水分解に対して安定な誘導体及び一又は複数のアセチレン又はアジド部分を有する関連の親水性ポリマーも提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答して、タンパク質中に選択的に導入されるアジド部分との結合に対して高度に選択的である。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答して、タンパク質中に選択的に導入されるアセチレン部分との結合に対して高度に選択的である。
より具体的には、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジド及びこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレン並びにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。
本発明は、様々な官能基、置換基又は部分を有する物質の、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第二のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類縁体；抗体若しくは抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；阻害的リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；フルオロフォア；金属含有部分；放射性部分；新しい官能基；他の分子と共有結合的に若しくは非共有結合的に相互作用する基；光ケージ（ｐｈｏｔｏ ｃａｇｅ）化された部分；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類縁体；重原子を取り込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長された側鎖；炭素結合された糖；酸化還元活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識された部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；電子密度が高い基；磁性基；インターカレート基；発色団；エネルギー移動剤；生物活性剤；検出可能な標識；小分子；又は上記若しくはその他の任意の望ましい化合物若しくは物質の任意の組み合わせなどの（これらに限定されない）他の物質との抱合体を提供する。本発明は、アジド又はアセチレン部分を有する物質の、対応するアセチレン又はアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との抱合体も含む。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能基を有する遺伝子によってコードされていないアミノ酸を含有するタンパク質中の位置において生物活性分子に結合させることが可能である。ＰＥＧ及び生物活性分子が結合される結合には、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物が含まれるが、これに限定されない。
ＰＥＧは、生物材料の表面を修飾するために使用できることが本分野では十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ， Ｒ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｓｃｉ．， ３（１）：１２５−１３６（２０００）参照、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。本発明には、一又は複数の反応性アジド又はアセチレン部分を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅ［３＋２］付加環化結合を介して、該表面に結合された本発明の一又は複数のアジド又はアセチレン含有ポリマーとを含む生物材料も含まれる。生物材料及び他の物質は、その後の反応に利用可能なアジド又はアセチレン部分を残すために、カルボン酸、アミン、アルコール又はチオール部分を含む結合を介してなど、アジド又はアセチレン結合以外の結合を介して、アジド又はアセチレン活性化されたポリマー誘導体に結合することも可能である。
本発明は、本発明のポリマーを含有するアジド及びアセチレンを合成する方法も含まれる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一つの末端にアジド部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、メシラート、トレシラート、トシラート又はハロゲン脱離基など、さらに反応性が高い部分をその上に有する置換されたポリマーを生成する。スルホニル酸（ｓｕｌｆｏｎｙｌ ａｃｉｄ）ハロゲン化物、ハロゲン原子及び他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者に周知である。得られた置換されたポリマーは、次いで、反応を行って、ポリマーの末端をさらに反応性の高い部分であるアジド部分を置換する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアジド部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアジドを有する連結剤と反応を行う。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシラート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどの求核及び求電子部分は、当業者に周知である。
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲン又は他の活性化された脱離基を置換する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアセチレン部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアセチレンを有する連結剤と反応を行う。有機合成におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核及び求電子部分の使用並びにＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者にとって十分に確立されている。
本発明は、ＰＥＧ及びアジド又はアセチレン部分を含有するＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマーを含む（これらに限定されない。）他の物質を修飾されたタンパク質に付加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法も提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解度及び免疫原性の欠如が重要である、一方、同時に、本分野で既に公知であるタンパク質にＰＥＧ誘導体を付加するさらに選択的な手段を与えながら、表面及び分子の特性を修飾するために使用することが可能である。
ＩＩ．成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリー
以下のタンパク質には、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされるもの（Ｂａｚａｎ， Ｆ．， Ｉｍｍｎｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９１）；Ｂａｚａｎ， Ｊ． Ｆ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１１（１９９２）； Ｍｏｔｔ， Ｈ． Ｒ． ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ． Ｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）； Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ， Ｏ． ａｎｄ Ｉｈｌｅ， Ｊ． Ｎ．， ＳＩＧＮＡＬＬＩＮＧ ＢＹ ＴＨＥ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣＣＹＴＯＫＩＮＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ（１９９６））：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０，ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、αインターフェロン、βインターフェロン、εインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）が含まれる。この遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、遺伝子クローニングと配列決定によって将来同定されると予想される。一般に、限られたアミノ酸又はＤＮＡ配列同一性を有するという事実にもかかわらず、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは類似の二次及び三次構造を有する。構造的な特徴を共有しているため、遺伝子ファミリーの新規メンバーは容易に同定することが可能であり、本明細書に記載された非天然アミノ酸方法及び組成物が同様に適用される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバー間の構造的相同性の程度に鑑みれば、天然にコードされていないアミノ酸は、本発明を用いて、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの任意のメンバー中に取りこまれ得る。このタンパク質ファミリーの各メンバーは、四螺旋バンドルを含み、その一般的な構造は図１に示されている。ファミリーメンバーｈＧＨ、ＥＰＯ、ＩＮＦα−２及びＧ−ＣＳＦの一般構造は、それぞれ、図２、３、４及び５に示されている。
Ｇ−ＣＳＦ（Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１４：４３５（１９９２）；Ｚｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：８４５３（１９９４）；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５１６７（１９９３）），ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １５４：１７７９−１７８２（１９９１）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：１０７５−１０８５（１９９２）），ＩＬ−２（Ｂａｚａｎ， Ｊ． Ｆ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１１（１９９２）；ＭｃＫａｙ， Ｄ． Ｂ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１２（１９９２）），ＩＬ−４（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１１０２９−１１０３５（１９９１）； Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７３−１６７７（１９９２））、及びＩＬ−５（Ｍｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：１７２−１７６（１９９３））などの多数のサイトカインの構造は、著しい一次配列相同性の欠如にもかかわらず、Ｘ線回折及びＮＭＲ研究によって決定され、ＧＨ構造と顕著な保存を示す。モデリング及び他の研究に基づいて、ＩＦＮは、このファミリーのメンバーであると考えられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １５：３４１（１９９５）； Ｍｕｒｇｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：６２（１９９３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１４５３（１９９６）； Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７４：６６１（１９９７））。モデリング及び突然変異誘発研究に基づいて、ＥＰＯは、このファミリーのメンバーであると考えられる（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１５９８３−１５９９３（１９９３）；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２２８３９−２２８４６（１９９４））。現在では、上記サイトカインと増殖因子の全てが、一つの巨大な遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
共通の類似の二次及び三次構造に加えて、本ファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために細胞表面受容体をオリゴマー化しなければならないという特性を共有する。ＧＨ及びＥＰＯなど（これらに限定されない。）、ＧＨファミリーメンバーの幾つかは、単一の種類の受容体を結合し、それにホモ二量体を形成させる。ＩＬ−２、Ｉｌ−４及びＩＬ−６など（これらに限定されない。）、他のファミリーのメンバーは、２種以上の受容体を結合し、該受容体にヘテロ二量体又はこれより高次の凝集物を形成させる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８； Ｐａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）， ＥＭＢＯ Ｊ． １４：１９４２−１９５１； Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５））。突然変異誘発研究によって、ＧＨ同様、これら他のサイトカイン及び増殖因子は、複数、典型的には２つの受容体結合部位を含有し、それらのコグネート受容体を順次結合することが示されている（Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：１１４−１２１（１９９５）； Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９４７１−９４７６）。ＧＨ同様、これらの他のファミリーメンバーに対する主要な受容体結合部位は、主に、４つのαヘリックス及びＡ−Ｂループ中を占める。受容体結合に関与するヘリックスバンドル中の具体的なアミノ酸は、ファミリーメンバーごとに異なる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面受容体の多くは構造的に関連しており、第二の大きなマルチ遺伝子ファミリーを構成する。例えば、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの様々なメンバーの変異研究から到達された一般的な結論は、αヘリックスを結合するループは、一般的には、受容体結合に関与する傾向がないということである。特に、短いＢ−Ｃループは、全てではないとしても、殆どのファミリーメンバーにおいて、受容体結合にとって不可欠でないように思える。このため、Ｂ−Ｃループは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーにおいて本明細書に記載されているように、天然にコードされていないアミノ酸で置換され得る。Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（及びＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０様メンバーのＤ−Ｅループ）は、非天然アミノ酸も置換され得る。ヘリックスＡに近く、最後のヘリックスから離れたアミノ酸も、受容体結合に関与する傾向がなく、非天然アミノ酸を導入するための部位であり得る。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７以上のアミノ酸など（これらに限定されない）、ループ構造内の任意の位置で置換される。幾つかの実施形態では、天然にコードされていない一又は複数のアミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７以上のアミノ酸内で置換される。
ＥＰＯ，ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びβインターフェロンなど（これらに限定されない。）の、ＧＨファミリーのある種のメンバーは、Ｎ結合型及び／又はＯ結合型の糖を含有する。タンパク質中のグリコシル化部位は、ほとんど専らループ領域中に生じ、αヘリックスバンドル中には生じない。ループ領域は、一般的に、受容体結合には関与しておらず、且つループ領域は、糖基の共有結合のための部位なので、それらは、タンパク質中に非天然アミノ酸置換を導入するための有用な部位であり得る。タンパク質中でＮ及びＯ結合型グリコシル化部位を占めるアミノ酸は、表面に露出されているので、非天然アミノ酸置換のための部位であり得る。従って、天然のタンパク質は、これらの部位でタンパク質に付着された嵩の大きな糖基を許容することが可能であり、グリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、将来、発見される可能性がある。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの新しいメンバーは、予測されるタンパク質配列の、コンピュータに補助された二次及び三次構造解析を通じて同定することが可能である。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、典型的には、非ヘリックスアミノ酸（ループ領域）によって連結された４又は５つの両親媒性ヘリックスを有する。該タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、それらのＮ末端に疎水性のシグナル配列を含有し得る。このようなＧＨスーパー遺伝子ファミリーの後に発見されたメンバーも、本発明に含まれる。
このように、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーの記述は、例示の目的で、単なる例示として提供されており、本明細書に記載されている方法、組成物、戦略及び技術の範囲を限定するために提供されているのではない。さらに、本願において、ＧＨ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰＯポリペプチドという表記は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの全てのメンバーの例としての包括的用語を使用することが意図されている。このため、ｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ又はＥＰＯポリペプチド又はタンパク質に関して本明細書で記載された修飾及び化学反応は、本明細書に具体的に列記されているものを含むＧＨスーパー遺伝子ファミリーの任意のメンバーに等しく適用することが可能であることが理解される。
ＩＩＩ．本発明とともに使用するための一般的な組換え核酸法
本発明の多数の実施形態において、目的の４ＨＢポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローニングされ、及び組換え法を用いてしばしば改変され得る。このような実施形態は、タンパク質発現のために、又はバリアント、誘導体、発現カセット若しくは４ＨＢポリペプチドに由来する他の配列の生成の間などに（これらに限定されない。）使用される。幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモーターに作用可能に連結される。ｈＧＨの単離及び宿主細胞中でのＧＨの産生は、例えば、米国特許第４，６０１，９８０号、第４，６０４，３５９号、第４，６３４，６７７号、第４，６５８，０２１号、第４，８９８，８３０号、第５，４２４，１９９号、第５，７９５，７４５号、第５，８５４，０２６号、第５，８４９，５３５；第６，００４，９３１号；第６，０２２，７１１号；第６，１４３，５２３号及び第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ｈＩＦＮの単離及び宿主細胞中でのＩＦＮの産生は、例えば、米国特許第６，４８９，１４４号；第６，４１０，６９７号；第６，１５９，７１２号；第５，９５５，３０７号；第５，８１４，４８５号；第５，７１０，０２７号；第５，５９５，８８８号；第５，３９１，７１３号；第５，２４４，６５５号；第５，１９６，３２３号；第５，０６６，７８６号；第４，９６６，８４３号；第４，８９４，３３０号；第４，３６４，８６３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ｈＧ−ＣＳＦの単離及び宿主細胞中でのＧ−ＣＳＦの産生は、例えば、米国特許第４，８１０，６４３号；第４，９９９，２９１号；第５，５８０，７５５号；及び第６，７１６，６０６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ｈＥＰＯの単離は、例えば、米国特許第５，４４１，８６８号；第５，５４７，９３３号；第５，６１８，６９８号；第５，６２１，０８０号；及び第６，５４４，７４８号に記載されており、ヒト細胞でのＥＰＯの産生は、ＷＯ９３／０９２２２に記載されている。
天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、２４（ｈＩＦＮ）、２９（ｈＧ−ＣＳＦ）又は３８（ＥＰＯ）に示されているアミノ酸配列など（これらに限定されない。）を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、次いで、適切なアミノ酸残基の導入（すなわち、取り込み又は置換）又は除去（すなわち、欠失又は置換）を実施するためにヌクレオチド配列を変更することによって合成され得る。該ヌクレオチド配列は、慣用の方法に従って、部位特異的な突然変異誘発によって便利に修飾され得る。あるいは、該ヌクレオチド配列は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドが設計されるオリゴヌクレオチド合成機を使用し、好ましくは、組換えポリペプチドがその中で産生される宿主細胞中で好まれるコドンを選択することなどによって（これらに限定されない。）、化学合成によって調製され得る。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、連結又は連結連鎖反応によって集合させ得る。例えば、Ｂａｒａｎｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
本発明は、組換え遺伝学の分野における定型的な技術を使用する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストには、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ． ２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４））が含まれる。
分子生物学的技術を記載する一般的なテキストには、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，の合弁企業（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ １９９９）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”））が含まれる。これらのテキストは、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、並びに非天然アミノ酸、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルシンテターゼ及びそれらの一部を含むタンパク質を製造するためのセレクターコドンを含む遺伝子の生成など（これらに限定されない。）に関連する他の多くの関連する話題を記載している。
ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、セレクターコドンを作製するため、目的のタンパク質又はポリペプチド中に非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためなど（これらに限定されない。）、様々な目的のために、様々な種類の突然変異誘発が本発明で使用される。それらには、部位特異的な、ランダムポイント突然変異誘発、相同的組換え、ＤＮＡシャフリング若しくは他の再帰的突然変異誘発方法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾されたＤＮＡ突然変異誘発、ギャップが導入された二重鎖ＤＮＡを用いた突然変異導入など又はこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。さらなる適切な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが含まれる。キメラの構築を伴うものなど（これらに限定されない。）の突然変異誘発も、本発明に含まれる。一実施形態において、突然変異誘発は、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造など（これらに限定されない。）、天然に存在する分子又は天然に存在する改変若しくは変異された分子の公知の情報によって手引きされ得る。
本明細書中に見出されるテキスト及び実施例は、これらの手順について記載している。さらなる情報は、引用されている以下の刊行物及び参考文献中に見出される。Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｎａｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ， Ｄ． Ｍ． Ｊ． ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ， Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔａｇｅｔａｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：６９８７−６９９９（１９８８） ；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ， Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｉｍｐｒｏｖｅｄｏｌｉｇｏｔｉｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ， Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ａ ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｉｉｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ， Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ， Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ 「ｓｈｏｔ−ｇｕｎ」 ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｉｉｅｓｉｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ． Ｐ． Ｃ． Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４）；ａｎｄ， Ｉ． Ａ． Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ． Ｐａｓｔａｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，３０６７−８（１９９５）。上記方法の多くに関するさらなる詳細は、様々な突然変異誘発方法によるトラブルシューティング問題にとって有用な管理についても記載している「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４」に見出すことができる。
本発明は、オルソゴナルｔＲＮＡ／ＲＳ対を介して、非天然アミノ酸をインビボで取り込むための真核宿主細胞、非真核宿主細胞及び生物にも関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、又は、例えば、クローニングベクター若しくは発現ベクターであり得る本発明のベクターなど（これに限定されない。）、本発明のポリヌクレオチドを含む構築物を用いて、遺伝子操作（形質転換、形質導入又は形質移入を含むが、これらに限定されない。）される。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は抱合されたポリヌクレオチドの形態とすることが可能である。ベクターは、電気穿孔（Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小ビーズ若しくは粒子のマトリックス内又は表面上の何れかに核酸を有する小粒子（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７））による高速弾道穿通などの、標準的な方法によって、細胞及び／又は微生物中に導入される。
操作された宿主細胞は、例えば、スクリーニング工程、プロモーターの活性化又は形質転換体の選択などの活性に対して、適宜修飾された慣用の栄養素培地中で培養することが可能である。これらの細胞は、必要に応じて、トランスジェニック生物中に培養されることが可能である。細胞の単離及び培養のために（例えば、その後の核酸単離のために）（これらに限定されない。）有用な他の参考文献には、「Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ； Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ．）（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ａｎｄ Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ．） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ」が含まれるが、これらに限定されない。
細胞中に標的核酸を導入する幾つかの周知の方法が利用可能であり、その何れも本発明で使用することが可能である。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとのレシピエント細胞の融合、電気穿孔、噴出性照射（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及びウイルスベクターによる感染（以下でさらに論述されている。）などが含まれる。細菌細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅するために使用することが可能である。細菌は対数期まで増殖され、細菌中のプラスミドは、本分野で公知の様々な方法によって単離することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多数のキットが、市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ（何れもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから得られる。）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得られるＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ、及びＱｉａｇｅｎから得られるＱＩＡｐｒｅｐＴＭを参照。）。単離及び精製されたプラスミドは、次いで、他のプラスミドを作製するためにさらに操作が施され、細胞を形質移入するために使用されるか、又は生物を感染させるために関連するベクター中に取り込まれる。典型的なベクターは、転写及び翻訳終結因子、転写及び翻訳開始配列、及び特定の標的核酸の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、少なくとも一つの独立した終結因子配列、真核生物若しくは原核生物又は両者でカセットの複製を可能とする配列（シャトルベクターを含むが、これに限定されない。）並びに原核及び真核の両系に対する選択マーカーを含有する包括発現カセットを必要に応じて含む。ベクターは、原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び組み込みに適している。「Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）； Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２８：７３１（１９８７）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ６４３５：１０（１９９５）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｂｅｒｇｅｒ（全て上記）」を参照。クローニングに有用な多数の細菌及びバクテリオファージが、例えば、ＡＴＣＣ、例えば、ＡＴＣＣによって出版されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２） Ｇｈｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）によって記載されている。配列決定、クローニング及び分子生物学の他の側面に対するさらなる基礎的な手技及び基礎となる理論的考察は、「Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， ＮＹ」にも見出される。さらに、実質的に全ての核酸（及び、標準又は非標準を問わず、実質的に全ての標識された核酸）は、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ｍｃｒｃ．ｃｏｍ上で入手可能）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ， ＣＡ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ上で入手可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ上で入手可能）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）及びその他多くのような、様々な商業的入手先の何れかから注文された特別仕様又は標準仕様であり得る。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドン骨格を拡張する。例えば、セレクターコドンには、固有の３塩基コドン、アンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）などの（これらに限定されない）停止コドン、非天然コドン、四以上の塩基のコドン、レアコドンなどのようなナンセンスコドンが含まれるが、これらに限定されない。４ＨＢポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチド中に１以上、２以上、３、４、５、６、７、８、９、１０以上など（これらに限定されない。）、所望の遺伝子中に導入可能なセレクターコドンの数は多岐にわたることが当業者に自明である。
一実施形態において、前記方法は、インビボで真核細胞中に非天然アミノ酸を取り込むために、停止コドンであるセレクターコドンを使用することを含む。例えば、ＵＡＧを含む（但し、これに限定されない。）停止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳによって、所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されているＯ−ｔＲＮＡが作製される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシルーｔＲＮＡシンテターゼによって認識されない。ＴＡＧを含む（但し、これに限定されない。）停止コドンを、目的のポリペプチドの中の目的の部位に導入するために、慣用の部位特異的突然変異誘発を使用することが可能である。例えば、「Ｓａｙｅｒｓ， Ｊ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．（１９８８）， ５’，３’ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｆｚｅｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ７９１−８０２」を参照されたい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び目的のポリペプチドをコードする核酸がインビボで組み合わされたときには、指定された位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを与えるために、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が取り込まれる。
インビボでの非天然アミノ酸の取り込みは、真核宿主細胞の著しい擾乱なしに行うことが可能である。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡなどの（但し、これに限定されない）Ｏ−ｔＲＮＡと真核生物の放出因子（ｅＲＦを含むが、これに限定されない。）（停止コドンに結合し、成長しているペプチドのリボソームからの放出を開始させる。）との競合に依存するので、抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを増加させることなどによって（これに限定されない。）、調節することが可能である。
セレクターコドンは、４、５、６以上の塩基のコドンなど、４塩基以上のコドンなど（これに限定されない。）、伸長されたコドンも含む。４塩基コドンの例には、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが含まれるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例には、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明の側面には、フレームシフト抑制を基礎とする伸長されたコドンを使用することが含まれる。４塩基以上のコドンは、同じタンパク質中に一又は複数の非天然アミノ酸などを挿入することが可能であるが、これらに限定するものではない。例えば、アンチコドンループ（例えば、少なくとも８ないし１０ヌクレオチドのアンチコドンループ）を有する変異されたＯ−ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含むが、これに限定されない。）の存在下で、４塩基以上のコドンは、単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態において、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン又は少なくとも６塩基コドン以上など（但し、これらに限定されない。）を解読することが可能である。可能な４塩基コドンは２５６存在するので、４塩基以上のコドンを用いて、同一細胞中で、複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。「Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ９：２３７−２４４； Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ “Ｓｈｉｆｔｙ” Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０７：７５５−７６９」を参照されたい。
例えば、インビトロ生合成方法を用いて、非天然アミノ酸をタンパク質中に取り込むために、４塩基コドンが使用されている。例えば、「Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３２：７９３９； ａｎｄ Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２１：３４」を参照されたい。化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロで、２−ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジン中に同時に取り込むために、ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵが使用された。例えば、「Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２１：１２１９４」を参照されたい。インビボ研究において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＵＣＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）を抑制する能力について調べ、クアドルプレットＵＡＧＡは、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによって、１３ないし２６％の効率で解読されることができ、０又は１フレーム中では、ほとんど解読されないことを見出した。「Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２９８：１９５」を参照。一実施形態において、他の望ましくない部位でのミスセンス読み過ごし及びフレームシフト抑制を低減することができる、レアコドン又はナンセンスコドンを基礎として伸長されたコドンを本発明において使用することが可能である。
あるシステムに対して、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの一つを含むことも可能であり、ここでは、内在性の系は、天然の塩基コドンを使用しない（又はめったに使用しない。）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠如する系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
セレクターコドンは、必要に応じて、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、さらに、既存の遺伝子アルファベットを拡大する。１つの余分な塩基対は、６４から１２５までのトリプレットコドンの数を増加させる。第三の塩基対の特性には、安定且つ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによるＤＮＡ中への効率的な高忠実度での酵素的取り込み、及び新生の非天然塩基対の合成後における効率的な継続的プライマー伸長が含まれる。方法及び組成物に対して適合可能な非天然塩基対の記述は、例えば、「Ｈｉｒａｏ， ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：１７７−１８２」を含む。他の関連する文献が以下に列記されている。
インビボでの使用の場合、非天然のヌクレオシドは膜透過性であり、対応する三リン酸エステルを形成するためにリン酸化される。さらに、増加された遺伝情報は安定であり、細胞の酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる以前の努力では、正準ワトソンクリック対中のものとはことなる水素結合パターンを活用し、そのうち最も注目すべき例は、ｉｓｏ−Ｃ：ｉｓｏ−Ｇ対である。例えば、「Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１１：８３２２； ａｎｄ Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ， ３４３：３３； Ｋｏｏｌ，（２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ４：６０２」を参照されたい。一般に、これらの塩基は、ある程度、天然塩基と誤った対を形成し、酵素的に複製されることができない。Ｋｏｏｌと共同研究者は、塩基間の疎水性充填相互作用は、塩基対の形成を駆動するために水素結合を置換できることを実証した。「Ｋｏｏｌ，（２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ４：６０２； ａｎｄ Ｇｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３６，２８２５」を参照されたい。上記の要件を全て充足する非天然塩基対を開発するために、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を系統的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然の塩基対より安定であることが見出され、エシェリヒア・コリ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＫＦ）によってＤＮＡ中に効率的に取り込まれることが可能である。例えば、「ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １２１：１１５８６； ａｎｄ Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２：３２７４」を参照されたい。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能にとって十分な効率性と選択性で、ＫＦによって合成されることができる。例えば、「Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．． １２２：８８０３」を参照されたい。しかしながら、両塩基は、さらなる複製に対して鎖終結因子として作用する。最近、ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用することが可能な変異ＤＮＡポリメラーゼが発展を遂げている。さらに、７ＡＩ自己対は複製されることも可能である。例えば、「Ｔａｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２３ ：７４３９」を参照されたい。新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されており、これは、Ｃｕ（ＩＩ）を結合すると、安定な対を形成する。「Ｍｅｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １２２：１０７１４」を参照されたい。伸長されたコドン及び非天然コドンは、天然コドンに対して、本質的にオルソゴナルであるので、本発明の方法は、それらに対するオルソゴナルｔＲＮＡを生成するために、本特性を活用することが可能である。
所望のポリペプチド中に非天然アミノ酸を取り込むために、翻訳迂回系（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｂｙｐａｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）も使用することが可能である。翻訳迂回系では、大きな配列が遺伝子中に取り込まれるが、タンパク質へ翻訳されない。該配列は、リボソームが該配列を跳び越し、挿入の下流で翻訳を再開するように誘導する合図として機能する構造を含有する。
ある種の実施形態では、本発明の方法及び／又は組成物における目的タンパク質又はポリペプチド（又はその一部）は、核酸によってコードされる。典型的には、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、１０以上のセレクターコドンを含む。
例えば、非天然アミノ酸を取り込むための一又は複数のセレクターコドンを含ませるために、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に周知の方法及び本明細書に記載されている方法を用いて、突然変異を起こさせることが可能である。例えば、目的のタンパク質に対する核酸は、一又は複数のセレクターを含め、一又は複数の非天然アミノ酸の取り込みを与えるために、突然変異を起こさせることが可能である。本発明は、変異体など（これに限定されない。）の任意のこのようなバリアント、例えば、少なくとも一つの非天然アミノ酸を含む任意のタンパク質の様式が含まれる。同様に、本発明は、対応する核酸、すなわち一又は複数の非天然アミノ酸をコードする一又は複数のセレクターコドンを有する任意の核酸も含む。
４ＨＢポリペプチドなどの目的のタンパク質をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入するために容易に突然変異を起こさせ得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は他の様々な分子を、目的のタンパク質上に導入するために広く使用されている。４ＨＢポリペプチドの所望の位置にシステインを取り込ませるのに適した方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているもの及び標準的な突然変異誘発技術など、本分野において周知である。
ＩＶ．天然にコードされていないアミノ酸
天然にコードされていない極めて様々なアミノ酸が本発明での使用に適している。任意の数の天然にコードされていないアミノ酸を４ＨＢポリペプチド中に導入することが可能である。一般的に、導入される天然にコードされていないアミノ酸は、遺伝子によってコードされる２０の共通アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸には、２０の共通アミノ酸中に見出されない官能基（アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基を含むが、これらに限定されない。）と効率的且つ選択的に反応して、安定な抱合体を形成する側鎖官能基が含まれる。例えば、アジド官能基を含有する天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、ポリマー（ポリ（エチレングリコール）を含むが、これに限定されない。）、あるいは、アルキン部分を含有する第二のポリペプチドと反応して、安定な抱合体を形成し、アジド及びアルキン官能基の選択的反応をもたらし、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成することが可能である。
α−アミノ酸の一般構造は、以下のように表される（式Ｉ）。
Figure 2007519422
天然にコードされていないアミノ酸は、典型的には、上掲の式を有する任意の構造である（Ｒ基は、２０の天然アミノ酸に使用されている置換基とは異なる任意の置換基であり、本発明で使用するのに適切であり得る。）。本発明の天然にコードされていないアミノ酸は、典型的には、側鎖の構造のみが天然アミノ酸と異なっているので、天然にコードされていないアミノ酸は、天然のポリペプチド中で形成されるのと同じ様式で、他のアミノ酸（天然にコードされているもの又は天然にコードされていないものを含むが、これらに限定されない。）とアミド結合を形成する。しかしながら、天然にコードされていないアミノ酸は、天然アミノ酸とそれらを識別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、必要に応じて、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド−、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など又はこれらの任意の組み合わせを含む。本発明での使用に適切であり得る目的の他の非天然アミノ酸には、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識されたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的に又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージ化された及び／又は光異性体化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類縁体を含むアミノ酸、糖置換されたセリンなどのグリコシル化されたアミノ酸、他の炭水化物で修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換されたアミノ酸、化学的に切断可能な及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸に比べて伸長された側鎖を有するアミノ酸（約５より多い、又は約１０より多い炭素を含む（これらに限定されない。）、ポリエーテル又は長鎖炭化水素）、炭素連結された糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸を含有するアミノ酸、及び一又は複数の毒性部分を含むアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
本発明における使用に適切であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である、天然にコードされていない典型的なアミノ酸には、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド及びアルキン反応基を有するものが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は糖質部分を含む。このようなアミノ酸の例には、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが含まれる。このようなアミノ酸の例には、アミノ酸と糖質との天然に存在するＮ又はＯ結合が、自然には一般的に見出されない共有結合（アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどが含まれるが、これらに限定されない。）によって置換されている例も含まれる。このようなアミノ酸の例には、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどの天然に存在するタンパク質中に一般的に見出されない糖質も含まれる。
本明細書に記載されている、天然にコードされるアミノ酸の多くは市販されており、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの一部門， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）から得られる。市販されていないものは、本明細書に記載されているとおりに、又は当業者に公知の標準的な方法を使用して、必要に応じて合成される。有機合成技術に関しては、例えば、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， １９９０， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）」を参照されたい。米国特許出願第２００３／００８２５７５号及び２００３／０１０８８８５（参照によって本明細書に組み込まれる。）も参照されたい。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明における使用に適切であり得る非天然アミノ酸は、式ＩＩ及びＩＩＩ：
Figure 2007519422
（Ｚは、典型的には、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、Ｘ及びＹは、同一又は異別とすることが可能であり、典型的には、Ｓ又はＯを含み、Ｒ及びＲ’は、必要に応じて同一又は異別であり、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸に対して上記されたＲ基に対する成分の同じリスト及び水素から選択される。）の構造によって記されているものなどの（これらに限定されない。）、修飾された骨格構造も必要に応じて含む。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、式ＩＩ及びＩＩＩによって表されているようにアミノ又はカルボキシル基中に必要に応じて置換を含む。この種の非天然アミノ酸には、２０の共通天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然の側鎖などを有する（これらに限定されない。）、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシル酸塩が含まれるが、これらに限定されない。さらに、α−炭素の置換は、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などの、Ｌ、Ｄ又はα−α−二置換されたアミノ酸を必要に応じて含むが、これらに限定されない。他の構造的代替物には、プロリン類縁体及び３、４、６、７、８及び９員環のプロリン類縁体などの環状アミノ酸、並びに置換されたβ−アラニン及びγ−アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が含まれる。
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸を基礎としており、本発明での使用に適している。チロシン類縁体には、パラ置換されたチロシン、オルト置換されたチロシン及びメタ置換されたチロシンが含まれるが、これらに限定されず、前記置換されたチロシンは、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない。）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などを含むが、これらに限定されない。さらに、複数に置換されたアリール環も想定される。本発明における使用に適切であり得るグルタミン類縁体には、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換された誘導体、環状誘導体及びアミド置換されたグルタミン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類縁体の例には、置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない。）、ベンゾイル、アルキニル基など（これらに限定されない。）を含む、パラ置換されたフェニルアラニン、オルト置換されたフェニルアラニン及びメタ置換されたフェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体例には、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドパ、フッ素化されたフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」という表題のＷＯ ２００２／０８５９２３号に記載されている。さらなるメチオニン類縁体については、「Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ， ＰＮＡＳ ９９：１９−２４」も参照されたい。
一実施形態において、（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど）非天然アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドの組成物が提供される。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを含む様々な組成物、及びタンパク質及び／又は細胞など（これらに限定されない。）も提供される。一側面において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、オルソゴナルｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、オルソゴナルｔＲＮＡ（アミノアシル結合を通じてオルソゴナルｔＲＮＡに共有結合されたもの、オルソゴナルｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに共有結合されたものなどを含むが、これらに限定されない。）に結合（共有結合を含むが、これに限定されない。）されることが可能である。
タンパク質中に取り込まれ得る非天然アミノ酸を介した化学部分は、タンパク質の様々な利点及び操作を提供する。例えば、ケト官能基の特異的な反応性は、インビトロ及びインビボでの多数のヒドラジン又はヒドロキシルアミン含有試薬の何れかによるタンパク質の選択的修飾を可能とする。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データを実行するのに有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入は、重原子に対する位置を選択する上で選択性と柔軟性も提供する。光活性非天然アミノ酸（ベンゾフェノン及びアリールアジド（フェニルアジドを含むが、これらに限定されない。）側鎖を有するアミノ酸を含むが、これらに限定されない。）は、例えば、タンパク質の効率的なインビボ及びインビトロ光架橋を可能とする。光反応性非天然アミノ酸の例には、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。次いで、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質は、時間的調節を提供する光活性基の励起によって、自由に、架橋することができる。一つの例では、非天然アミノのメチル基は、核磁気共鳴及び振動分光法など（これらに限定されない。）を使用して、局所構造及び力学のプローブとして、放射性標識されたメチルなど（これに限定されない。）で置換することができる。アルキニル又はアジド官能基は、例えば、［３＋２］付加環化反応を通じて、分子によるタンパク質の選択的修飾を可能とする。
ポリペプチドのアミノ末端に取り込まれた非天然アミノ酸は、２０の天然アミノ酸に使用されているもの以外の任意の置換基であるＲ基及びα−アミノ酸中に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応基から構成されることができる（式Ｉ参照）。同様の非天然アミノ酸は、α−アミノ酸中に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応基を用いて、カルボキシル末端に取り込まれることが可能である。
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書記載されているとおりに、若しくは様々な刊行物に記載されているとおりに、又は当業者に公知の標準的な方法を使用して、必要に応じて合成される。有機合成技術については、例えば、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８５， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， １９９０， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）」を参照。非天然アミノ酸の合成を記載するさらなる刊行物には、例えば、「“Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ”と題されたＷＯ ２００２／０８５９２３；Ｍａｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ， Ｆ．Ｅ． ＆ Ｋｉｄｄ， Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９） Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｏ． Ｍ． ＆ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ， Ｒ．（１９５９） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ， Ｍ．， Ｖｉｌｍｏｎｔ， Ｍ． ＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ， Ｆ．（１９９１） Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６，２０１−５ ；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ， Ａ．Ｍ．Ｐ． ＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｈ．（１９８９） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ， Ｂ． Ｄ． ＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４３：４２９７−４３０８；ａｎｄ， Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３５：４６０２−７」が含まれる。２００３年１２月２２日に出願された“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ”と題された特許出願、出願番号１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日に出願された出願番号６０／４３５，８２１号も参照されたい。
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加又はアルドール縮合反応を介して、分子（ＰＥＧ又は他の水溶性分子を含むが、これらに限定されない。）を連結するための様々な反応を可能とする。
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表されることができる。
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
ｐ−アセチル−（＋／−）フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）フェニルアラニンの合成は、「Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製することが可能である。
幾つかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドは、反応性カルボニル官能基を生成するために化学的に修飾される。例えば、抱合反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から生成することが可能である。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在し得る、又は化学的若しくは酵素的消化を介して露出され得る。）は、過ヨウ素酸を用いた穏やかな酸化的切断条件下でアルデヒド官能基を生成するために使用することが可能である。例えば、「Ｇａｅｒｔｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ３：２６２−２６８（１９９２）； Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ， Ｋ． ＆ Ｓｔｒｏｈ， Ｊ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ３：１３８−１４６（１９９２）； Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：７２２４−７２３０（１９９４）」を参照されたい。しかしながら、本分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端にあるアミノ酸に制限される。
本発明において、隣接するヒドロキシル及びアミノ基を有する天然にコードされていないアミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチド中に取り込ませることが可能である。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的には、ポリペプチド内の別の部位での酸化を回避するために、穏やかな条件下で、モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することを含む。酸化反応のｐＨは、典型的には、約７．０である。典型的な反応では、ポリペプチドの緩衝溶液に約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加した後、約１０分間、暗所でインキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照。
カルボニル官能基は、水溶液中の穏やかな条件下で、ヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−又はセミカルバジド含有試薬と選択的に反応して、生理的条件下で安定な、それぞれ対応するヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾン結合を形成することが可能である。例えば、「Ｊｅｎｃｋｓ， Ｗ． Ｐ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８１，４７５−４８１（１９５９）； Ｓｈａｏ， Ｊ． ａｎｄ Ｔａｍ， Ｊ． Ｐ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７：３８９３−３８９９（１９９５）」を参照。さらに、カルボニル基の特異的な反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾を可能とする。例えば、「Ｃｏｒｎｉｓｈ， Ｖ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ， Ｋ． Ｆ． ＆ Ｓｔｒｏｈ， Ｊ． Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ３：１３８−１４６（１９９２）； Ｍａｈａｌ， Ｌ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）」を参照。
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、様々な求電子基と反応して、抱合体（ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーとの抱合体を含むが、これらに限定されない。）を形成することが可能である。
典型的なヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル若しくは置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ若しくはＳであり、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
幾つかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、及びＸはＮである。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、及びＸは存在しない。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、酸素原子はアリール環上の脂肪族基に対してパラの位置にある。
ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド含有アミノ酸は、市販の入手先から入手可能である。例えば、Ｌ−グルタミン酸−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｍｉｃａｌ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製することが可能である。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド官能基を有する天然にコードされていないアミノ酸を含有するポリペプチドは、類似の化学的反応性を有するアルデヒド又は他の官能基を含有する様々な分子と効率的且つ選択的に反応することができる。例えば、「Ｓｈａｏ， Ｊ． ａｎｄ Ｔａｍ， Ｊ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７：３８９３−３８９９（１９９５）」を参照。ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド官能基の特異的な反応性のために、それらは、２０の共通アミノ酸上に存在する求核基（セリン又はスレオニンのヒドロキシル基又はリジン及びＮ末端のアミノ基を含むが、これらに限定されない。）に比べて、アルデヒド、ケトン及び他の求電子基に対してさらに著しい反応性を示す。
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも称される。）基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、様々な求電子基と反応して、抱合体（ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーとの抱合体を含むが、これらに限定されない。）を形成することが可能である。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドと同様、アミノオキシ基の増大された求核性のため、アルデヒド又は類似の化学的反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的且つ選択的に反応することが可能である。例えば、「Ｓｈａｏ，Ｊ． ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７：３８９３−３８９９（１９９５）； Ｈ． Ｈａｎｇ ａｎｄ Ｃ． Ｂｅｒｔｏｚｚｉ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３４：７２７−７３６（２００１）」を参照。ヒドラジン基との反応の結果は対応するヒドラゾンであるのに対して、オキシムは、一般的には、ケトンなどのカルボニル含有基とのアミノオキシ基の反応から生じる。
アミノオキシを含有する典型的なアミノ酸は、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、若しくは置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であり、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在する。幾つかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びスレオニン）から調製することが可能である。例えば、「Ｍ． Ｃａｒｒａｓｃｏ ａｎｄ Ｒ． Ｂｒｏｗｎ， Ｊ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６８：８８５３−８８５８（２００３）」を参照されたい。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などのある種のアミノオキシ含有アミノ酸が、天然の採取源から単離されている（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６０：１６３５−１６４１（１９９７）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製することが可能である。
Ｄ．アジド及びアルキン反応基
アジド及びアルキン官能基の特異的な反応性のため、それらは、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾のために特に有用である。有機アジド、特に脂肪族アジド及びアルキンは、一般的には、一般的な反応性化学的条件に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基は何れも、天然のポリペプチド中に見出される２０の共通アミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかしながら、接近した状態になると、アジド及びアルキン基の「ばね仕掛けの」性質が現れ、それらは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して、選択的且つ効率的に反応して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、「Ｃｈｉｎ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３）； Ｗａｎｇ， Ｑ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２５，３１９２−３１９３（２００３）； Ｃｈｉｎ， Ｊ． Ｗ． ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２４：９０２６−９０２７（２００２）」を参照されたい。
Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化反応は、求核的置換ではなく、選択的な付加環化反応を含むので（例えば、Ｐａｄｗａ， Ａ． ， ｉｎ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， Ｖｏｌ． ４，（ｅｄ． Ｔｒｏｓｔ， Ｂ． Ｍ．， １９９１）， ｐ． １０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ， Ｒ． ｉｎ １，３−ＤＩＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，（ｅｄ． Ｐａｄｗａ， Ａ．， １９８４），ｐ．１−１７６を参照。）、アジド及びアルキン含有側鎖を有する天然にコードされていないアミノ酸を取り込むと、得られたポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の位置で選択的に修飾することが可能となる。アジド又はアルキン含有４ＨＢポリペプチドを含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、インシチュにて、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態を含むが、これに限定されない。）を添加することによって、水性条件下で室温にて行うことができる。例えば、「Ｗａｎｇ， Ｑ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １２５，３１９２−３１９３（２００３）； Ｔｏｒｎｏｅ， Ｃ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６７：３０５７−３０６４（２００２）； Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４１：２５９６−２５９９（２００２）」を参照。典型的な還元剤には、アスコルビン酸塩、金属銅、キニン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、及び印加される電圧などが含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの事例では、アジドとアルキンとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が望まれる場合、４ＨＢポリペプチドはアルキン部分を含む天然にコードされていないアミノ酸を含み、該アミノ酸に付着されるべき水溶性ポリマーはアジド部分を含む。あるいは、逆の反応（すなわち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分との反応）も実施することが可能である。
アジド官能基は、アリールエステルを含有する水溶性ポリマーとも選択的に反応することができ、アミド結合を生成するためにアリールホスフィン部分で適切に官能化することが可能である。アリールホスフィン基はインシチュでアジドを還元し、次いで、得られたアミンは対応するアミドを生成するために近くのエステル結合と効率的に反応する。例えば、「Ｅ． Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｃ． Ｂｅｒｔｏｚｚｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，２００７−２０１０（２０００）」を参照されたい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸を含むが、これに限定されない。）又はアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアランン）の何れかとすることが可能である。
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓとすることができ、又は存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリール基とすることが可能である。）。典型的なＲ基には、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が含まれるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない。）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できるであろう。
アジド官能基は、チオエステルを含有する水溶性ポリマーとも選択的に反応することができ、アミド結合を生成するためにアリールホスフィン部分で適切に官能化することが可能である。アリールホスフィン基はインシチュでアジドを還元し、次いで、得られたアミンは対応するアミドを生成するためにチオエステル結合と効率的に反応する。チオエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（式中、ｎは、１ないし１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓとすることができ、又は存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。）
典型的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、若しくは置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する（すなわち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。幾つかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０である（すなわち、プロパリルルグリシン（ｐｒｏｐａｒｙｌｇｌｙｃｉｎｅ））。
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製することが可能である。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、「Ｄｅｉｔｅｒｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｃｉｄ． Ｃｌｉｅｍ． Ｓｏｃ． １２５：１１７８２−１１７８３（２００３）」に記載されているとおりに合成することが可能であり、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、「Ｋａｙｓｅｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）」に記載されているとおりに合成することが可能である。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製することが可能である。
典型的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができる。
Figure 2007519422
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。幾つかの実施形態において、ｎは０ないし４であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍ＝０である。幾つかの実施例では、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
アジド含有アミノ酸は、市販の入手先から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ， ＩＬ）から取得することが可能である。市販されていないアジド含有アミノ酸については、アジド基は、適切な脱離基（ハロゲン化物、メシラート、トシラートを含むが、これらに限定されない。）の置換を介する、又は適切に保護されたラクトンの開環を介するなど（これらに限定されない。）、当業者に公知の標準的な方法を用いて比較的容易に調製することが可能である。例えば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８５， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）」を参照。
Ｅ．アミノチオール反応基
β置換されたアミノチオール官能基の特異的な反応性のため、それらは、チアゾリジンの形成を介して、アルデヒド基を含有するポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾のために特に有用である。例えば、「Ｊ． Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｊ． Ｔａｍ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９５，１１７（１４）３８９３−３８９９」を参照。幾つかの実施形態では、β置換されたアミノチオールアミノ酸は、４ＨＢポリペプチド中に取り込まれ、次いで、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応することができる。幾つかの実施形態では、水溶性ポリマー、薬物抱合体又は他の搭載物は、チアゾリジンの形成を介して、β置換されたアミノチオールアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドに結合することが可能である。
非天然アミノ酸の細胞取り込み
真核細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質中に取り込むためなどの（これに限定されない。）非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に、通例、検討される一事項である。例えば、αアミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性でない可能性が高いことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質をベースとした輸送系群を介して、真核細胞中に取り込まれる。存在する場合、どの非天然アミノ酸が細胞によって取り込まれたかを評価する迅速なスクリーニングを行うことが可能である。例えば２００３年１２月２２日に出願された、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ」と題された出願、１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日に出願された６０／４３５，８２１号；及び「Ｌｉｕ， Ｄ． Ｒ． ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ． Ｇ．（１９９９） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ． ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６：４７８０−４７８５」中の毒性アッセイを、例えば参照されたい。取り込みは、様々なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞取り込み経路に対して親和性を有する非天然アミノ酸を設計する別の方法は、インビボでアミノ酸を作製するための生合成経路を提供することである。
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及びその他の化合物を産生するための、多くの生合成経路が既に細胞中に存在する。ある非天然アミノ酸に対する生合成方法が自然に（真核細胞中などに（これに限定されない。））は存在しない場合があり得るが、本発明は、このような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸に対する生合成経路は、新しい酵素を追加し、又は既存の宿主細胞経路を修飾することによって、宿主細胞中で必要に応じて生成される。追加される新しい酵素は、必要に応じて、天然の酵素であり、又は人工的に開発された酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は（「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」と題されたＷＯ２００２／０８５９２３号の実施例に記されているように）、他の生物から得られる公知の酵素の組み合わせを追加することに依拠する。これらの酵素に対する遺伝子は、該遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞を形質転換することによって、真核細胞中に導入することが可能である。細胞中に発現されると、該遺伝子は、所望の化合物を合成するための酵素的経路を与える。必要に応じて追加される酵素の種類の例は、以下の実施例に記載されている。追加される酵素の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに見出される。人工的に開発された酵素も、同様にして、細胞中に必要に応じて追加される。このようにして、非天然アミノ酸を産生するために、細胞の機構及び細胞の資源が操作される。
生合成経路で使用するために又は既存の経路を進化させるために新規酵素を作製するための様々な方法を利用できる。例えば、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって開発されたものなどの（これに限定されない）（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのホームページ上から入手可能）、新規酵素及び経路を開発するために、再帰的組換えが必要に応じて使用される。例えば、「Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）， Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１； ａｎｄ， Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）， ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９１：１０７４７−１０７５１」を参照されたい。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ． ｃｏｍのホームページ上から入手可能）によって開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈＴＭは、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシンを細胞中で作製するための経路を操作するためなど（これに限定されない。）、代謝経路を操作するために必要に応じて使用される。本技術は、機能的ゲノミクスを通じて、並びに分子進化及び設計を通じて同定された（これらに限定されない。）新しい遺伝子の組み合わせを用いて、宿主生物中の既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのホームページから入手可能）も、新しい経路を作製するためなど（これに限定されない。）、遺伝子のライブラリー及び遺伝子経路を迅速にスクリーニングするための技術も提供する。
典型的には、本発明の操作された生合成経路によって産生された非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成にとって十分な濃度（天然の細胞の量など（これに限定されない。））で産生されるが、他のアミノ酸の濃度に影響を与えず、又は細胞資源を枯渇させない程度で産生される。インビボでこのようにして産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭないし約０．０５ｍＭである。特異的な経路に対して望まれる酵素を産生するために使用される遺伝子を含むプラスミドによって細胞が形質転換されると、非天然アミノ酸が生成され、リボソームタンパク質合成及び細胞増殖にとって該非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、インビボでの選択が必要に応じて使用される。
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質構造及び／又は機能中の変化を調整し、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近性を変化させ、ある部分（タンパク質アレイを含むが、これに限定されない。）に誘導するなど（これに限定されない。）、様々な目的のために行うことが可能である。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された又は全く新しい触媒又は生物物理的特性を有することができる。例えば、タンパク質中に非天然アミノ酸を導入することによって、以下の特性が必要に応じて修飾される。毒性、生体分布、構造的特性、分光学的特性、化学的及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（血清半減期を含むが、これらに限定されない。）、（共有的に又は非共有的になど（これらに限定されない。））他の分子と反応する能力。少なくとも一つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、新規治療薬、診断薬、触媒的酵素、産業的酵素、結合タンパク質（抗体を含むが、これに限定されない。）など（これらに限定されない）、及びタンパク質の構造と機能の研究などに（これに限定されない。）有用である。例えば、「Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ． ４：６４５−６５２」を参照。
本発明の一側面において、組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個又はそれ以上など（これらに限定されない。）、少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する少なくとも一つのタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同一又は異別とすることができ、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上などの異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上など（これらに限定されない。）の異なる部位が存在することが可能である。別の側面では、組成物は、タンパク質中に存在するアミノ酸の少なくとも１個、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸と置換されたタンパク質を含む。２以上の非天然アミノ酸を有するタンパク質の場合、非天然アミノ酸は同一又は異別とすることが可能である（タンパク質は２以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含むことが可能であり、又は同一の天然アミノ酸を２個含むことが可能であるが、これらに限定されない。）。３つ以上の非天然アミノ酸を有するタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同一、異別又は少なくとも一つの異なる非天然アミノ酸を有する同種の複数の非天然アミノ酸の組み合わせとすることができる。
少なくとも一つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の側面である。本発明は、本発明の組成物及び方法を用いて作製された少なくとも一つの非天然アミノ酸を有するポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（薬学的に許容される賦形剤を含むが、これらに限定されない。）も、タンパク質とともに存在することが可能である。
真核細胞、タンパク質又はポリペプチド中の少なくとも一つの非天然アミノ酸を用いて目的のタンパク質又はポリペプチドを作製することによって、タンパク質又はポリペプチドは、典型的には、真核生物の翻訳後修飾を含み得る。ある種の実施形態では、タンパク質は、少なくとも一つの非天然アミノ酸と、ある真核細胞によってインビボで行われる少なくとも一つの翻訳後修飾を含み、該翻訳後修飾は原核細胞によっては通常行われない。例えば、翻訳後修飾には、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれるが、これらに限定されない。一側面において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によって、オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）をアスパラギンに付着させることを含む。真核生物タンパク質のＮ結合型オリゴ糖の幾つかの例を列記する表１を参照されたい（さらなる残基も存在することが可能であるが、これらは示されていない。）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、オリゴ糖（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）を、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａＩＮＡｃ−スレオニン結合、又はＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によって、スレオニン又はセリンに付着させることを含む。
Figure 2007519422
さらに別の側面においては、翻訳後修飾は、（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロオピオメラノコルチン、プロオピオメラノコルチンなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない）前駆体のタンパク質分解性プロセシング、多サブユニットタンパク質又は巨大分子アセンブリへのアセンブリ、（小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、空胞などの細胞小器官、分泌性経路経由などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）細胞中の別の部位への移行を含む。ある実施形態においては、タンパク質は、分泌又は局在性配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９６３，４９５号及び同６，４３６，６７４号は、ｈＧＨポリペプチドの分泌を改善するように設計された構築体を詳述する。
アミノ酸のひとつの利点は、さらに別の分子を追加するために使用することができるさらに別の化学的部分を提供することである。これらの修飾は、真核又は非真核細胞中でインビボ又はインビトロで行うことができる。したがって、ある実施形態においては、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核性求電子反応によることができる。タンパク質の選択的改変に現在使用されているほとんどの反応は、α−ハロケトンとヒスチジン又はシステイン側鎖との反応を含めて、ただしこれだけに限定されない求核性反応パートナーと求電子反応パートナーとの共有結合の形成を伴う。これらの例における選択性は、タンパク質中の求核性残基の数及び利用可能性によって決定される。本発明のタンパク質においては、異常ケトアミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボ反応など他のより選択的な反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６及びＣｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，印刷中を参照されたい。これによって、蛍光団、架橋剤、糖誘導体及び細胞傷害性分子を含めて、試薬のホストを用いて実質的にあらゆるタンパク質を選択的に標識することができる。参照により本明細書に組み込まれる２００３年１月１６日に出願された米国特許出願第１０／６８６，９４４号「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」も参照されたい。アジドアミノ酸によるものを含めて、ただしこれだけに限定されない翻訳後修飾は、（トリアリールホスフィン試薬を含めて、ただしこれだけに限定されない）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結によって行うこともできる。例えば、Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ ９９：１９−２４を参照されたい。
本発明は、タンパク質を選択的に修飾する別の効率の高い方法を提供する。この方法は、これらだけに限定されないがアジド又はアルキニル部分を含む非天然アミノ酸の遺伝子を選択コドンに応じてタンパク質中に取り込むものである。次いで、これらのアミノ酸側鎖は、これだけに限定されないがＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１７６を参照されたい。）によって、これらだけに限定されないがそれぞれアルキニル又はアジド誘導体を用いて修飾することができる。この方法は求核置換ではなく環付加を含むので、タンパク質をきわめて高い選択性で修飾することができる。この反応は、水溶液条件下で室温で実施することができ、Ｃｕ（ｉ）塩の触媒作用量を反応混合物に添加することによって優れた位置選択性（１，４＞１，５）を有する。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照されたい。使用することができる別の方法は、二ヒ素化合物上でのテトラシステインモチーフとのリガンド交換である。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２を参照されたい。
［３＋２］環付加によって本発明のタンパク質に添加することができる分子としては、アジド又はアルキニル誘導体を含む実質的にあらゆる分子が挙げられる。分子としては、色素、蛍光団、架橋剤、糖誘導体、（ポリエチレングリコール誘導体を含めて、ただしこれだけに限定されない）ポリマー、光架橋剤、細胞傷害性化合物、親和性標識、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第２のタンパク質又はポリペプチド（又はそれ以上）、（ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない）ポリヌクレオチド、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物などが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含めて、ただしこれらだけに限定されないアルキニル基又はｐ−アジド−フェニルアラニンを含めて、ただしこれらだけに限定されないアジド基を有する非天然アミノ酸に添加することができる。
Ｖ． 非遺伝的にコードされたアミノ酸を含む４螺旋バンドルポリペプチドのインビボ産生
本発明の４ＨＢポリペプチドは、改変ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンセターゼを用いてインビボで産生されて、天然の系ではコードされないアミノ酸に付加することができ、又は天然の系ではコードされないアミノ酸を置換することができる。
天然の系ではコードされないアミノ酸を用いてｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンセターゼを生成する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。これらの方法は、翻訳システムに内在するシンセターゼ及びｔＲＮＡとは無関係に機能する翻訳機構を作製するものである（したがって、「オルソゴナル」と記載することがある。）。一般に、翻訳システムは、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは、翻訳システム中の少なくとも１個の非天然アミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、システム中の他のｔＲＮＡによっては認識されない少なくとも１個の選択コドンを認識する。したがって、翻訳システムは、コードされた選択コドンに応じて、非天然的にコードされたアミノ酸をシステム中で産生されたタンパク質に挿入し、それによって、コードされたポリペプチド中のある位置にアミノ酸を「置換」する。
多種多様なオルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが、特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するために当分野で記述されており、本発明における使用に一般に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。例示的なＯ−ＲＳ又はその一部は、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、各々参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号及び同２００３／０１０８８８５号に開示されたアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳと一緒に使用される対応するＯ−ｔＲＮＡ分子も、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ系の例はＣｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅの例示的なＯ−ＲＳ配列としては、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に開示されたヌクレオチド配列配列番号１４−１６及び２９−３２及びアミノ酸配列配列番号４６−４８及び６１−６４などが挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明における使用に適切な例示的Ｏ−ｔＲＮＡ配列としては、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に開示されたヌクレオチド配列配列番号１−３などが挙げられるが、これらだけに限定されない。特定の非天然的にコードされたアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼペアの他の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）に記載されている。ケト含有アミノ酸とアジド含有アミノ酸の両方をＳ．セレビシエに組み入れるＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの使用は、非天然的にコードされたアミノ酸をコードする特異的コドンの選択を伴う。任意のコドンを使用することができるが、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼが発現される細胞中でめったに又はまったく使用されないコドンを選択することが一般に望ましい。例えば、例示的なコドンとしては、終止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４塩基以上のコドン及びめったに又はまったく使用されない他の天然３塩基コドンが挙げられる。
特異的選択コドンは、（部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、制限選択変異誘発などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）当分野で公知の変異誘発方法によって４ＨＢポリヌクレオチドコード配列中の適切な位置に導入することができる。
非天然的にコードされたアミノ酸を組み込むために使用することができるＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、オルソゴナルＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成する方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。非天然的にコードされたアミノ酸をインビボで組み込む方法及び組成物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）に記載されている。生物のインビボでの翻訳システムに使用されるオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを選択する方法も、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。
少なくとも１個の組換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を産生する方法は、（ａ）メタノコッカス ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ａ．フルギダス（ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、Ｐ．フリオサス（ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．ホリコシイ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ａ．ペルニックス（ｐｅｒｎｉｘ）、Ｔ．サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの原核生物又は真核生物を含めて、ただしこれらだけに限定されない第１の生物から得られる少なくとも１個のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのライブラリを作製すること、（ｂ）非天然的にコードされたアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下でオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーを（場合によっては変異体ＲＳでもよい）ＲＳのライブラリから選択（及び／又はスクリーニング）し、それによって活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのプールを用意すること及び／又は（ｃ）非天然的にコードされたアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する（変異体ＲＳを含めて、ただしこれだけに限定されない）活性なＲＳをそのプールから選択し（場合によってはネガティブ選択でもよい）、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを用意することを含み、少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳは、非天然的にコードされたアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
一実施形態においては、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは、活性ＲＳを変異させることによって産生することができる。例えば、不活性ＲＳは、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個又は少なくとも約１０個以上のアミノ酸を、アラニンを含めて、ただしこれだけに限定されないさまざまなアミノ酸に変異させることによって産生することができる。
変異体ＲＳのライブラリは、タンパク質３次元ＲＳ構造に基づく合理的設計、又は無作為若しくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの変異誘発を含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知のさまざまな技術を用いて作製することができる。例えば、変異体ＲＳは、部位特異的変異、無作為変異、組換え変異をもたらす多様性、キメラ構築体、合理的設計及び本明細書に記載された又は当分野で公知の他の方法によって産生することができる。
一実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下でオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーを含めて、ただしこれらだけに限定されない活性なメンバーを（場合によっては変異体ＲＳでもよい）ＲＳのライブラリから選択（及び／又はスクリーニング）することは、抗生物質耐性遺伝子などを含めて、ただしこれらだけに限定されないポジティブ選択又はスクリーニングマーカー及び（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのライブラリを複数の細胞に導入することと（ポジティブ選択及び／又はスクリーニングマーカーは、アンバー、オーカー又はオパールコドンを含めて、ただしこれらだけに限定されない少なくとも１個の選択コドンを含む。）、選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）の存在下で複数の細胞を増殖させることと、ポジティブ選択によって又はスクリーニングマーカー中の少なくとも１個の選択コドンを抑制することによって、選択剤及び／又はスクリーニング剤の存在下で生存する（又は特異的応答を示す）細胞を特定し、それによって活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのプールを含むポジティブ選択された細胞のサブセットを用意することとを含む。選択剤及び／又はスクリーニング剤濃度は、場合によっては変更することができる。
一側面においては、ポジティブ選択マーカーはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、選択コドンはＣＡＴ遺伝子中のアンバー終止コドンである。場合によっては、ポジティブ選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、選択コドンはβ−ラクタマーゼ遺伝子中のアンバー終止コドンでもよい。別の側面においては、ポジティブスクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は（細胞表面マーカーを含めて、ただしこれだけに限定されない）親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
一実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳをプールからネガティブ選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングから得られた活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのプールと一緒にネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを第２の生物の複数の細胞に導入することと（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含めて、ただしこれだけに限定されない抗生物質耐性遺伝子を含めて、ただしこれらだけに限定されない）少なくとも１個の選択コドンを含む。）、非天然的にコードされたアミノ酸及びスクリーニング剤又は選択剤が補充された第１の培地中で生存する又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然的にコードされたアミノ酸及び選択剤又はスクリーニング剤が補充されていない第２の培地中で生存しない又は特異的応答を示さない細胞を特定し、それによって生存細胞又はスクリーニングされた細胞に少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳが供給されることを含む。例えば、ＣＡＴ特定プロトコルは、適切なＯ−ＲＳ組換えの決定において、場合によってはポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして働くことができる。例えば、クローンのプールは、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を用いても用いなくても、（少なくとも１個の選択コドンを含む）ＣＡＴを含む増殖プレート上で場合によっては複製することができる。したがって、非天然的にコードされたアミノ酸を含むプレート上でもっぱら増殖するコロニーは、組換えＯ−ＲＳを含むと考えられる。一側面においては、選択（及び／又はスクリーニング）剤の濃度は変化する。いくつかの側面においては、第１の生物と第２の生物は異なる。したがって、第１の生物及び／又は第２の生物は、原核生物、真核生物、哺乳動物、エシェリキア コリ、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを場合によっては含んでもよい。他の実施形態においては、スクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
別の実施形態においては、活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳをプールからスクリーニング又は（ネガティブ選択を含めて、ただしこれだけに限定されない）選択することは、ポジティブ選択段階（ｂ）から活性な変異体ＲＳのプールを単離することと、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、（少なくとも１個の選択コドンを含む、リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子を含めて、ただしこれらだけに限定されない毒性標識遺伝子を含めて、ただしこれらだけに限定されない）少なくとも１個の選択コドンを含む。）及び活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのプールを第２の生物の複数の細胞に導入することと、非天然的にコードされたアミノ酸が補充されていない第１の培地中で生存する又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然的にコードされたアミノ酸が補充された第２の培地中で生存しない又は特異的スクリーニング応答を示さない細胞を特定し、それによって生存細胞又はスクリーニングされた細胞に少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを供給すること（少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳは、非天然的にコードされたアミノ酸に特異的である。）を含む。一側面においては、少なくとも１個の選択コドンは約２個以上の選択コドンを含む。かかる実施形態は、場合によっては、少なくとも１個の選択コドンが２個以上の選択コドンを含み、第１の生物と第２の生物が異なってもよい（これだけに限定されないが、各生物は、場合によっては、これらだけに限定されないが原核生物、真核生物、哺乳動物、エシェリキア コリ、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などでもよい。）。また、いくつかの側面では、ネガティブ選択マーカーは（少なくとも１個の選択コドンを含む）リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子を含む。他の側面では、スクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを場合によっては含むことができる。本発明の実施形態においては、スクリーニング及び／又は選択は、スクリーニング及び／又は選択厳密性が場合によっては変化してもよい。
一実施形態においては、少なくとも１個の組換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を産生する方法は、さらに、（ｄ）少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを単離すること、（ｅ）少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳから誘導される（場合によっては変異していてもよい）Ｏ−ＲＳの第２のセットを産生すること及び（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を有する変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）と（ｃ）を繰り返すことを含むことができる。段階（ｄ）−（ｆ）は、これだけに限定されないが少なくとも約２回場合によっては繰り返してもよい。一側面においては、少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳから誘導される変異Ｏ−ＲＳの第２のセットは、無作為変異誘発、部位特異的変異誘発、組換え又はそれらの組み合わせを含めて、ただしこれらだけに限定されない変異誘発を含むことができる。
上述の方法におけるポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）とネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）の両方を含めて、ただしこれらだけに限定されない選択／スクリーニング段階の厳密性は、選択／スクリーニング厳密性が場合によっては変化してもよい。別の実施形態においては、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）とネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）の両方は、レポーターの使用を含む。レポーターは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって検出され、又は発光によって検出される。場合によっては、レポーターは、細胞表面、ファージディスプレイなどに表示され、非天然的にコードされたアミノ酸又はアナログを含む親和性又は触媒活性に基づいて選択されてもよい。一実施形態においては、変異シンセターゼは、細胞表面、ファージディスプレイなどに表示される。
組換えオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生する方法は、（ａ）サプレッサーｔＲＮＡを含めて、ただしこれだけに限定されない、第１の生物から得られる少なくとも１個のｔＲＮＡから誘導される変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製すること、（ｂ）第２の生物から得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化された（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡを第１の生物から得られるＲＳの非存在下でライブラリから（ネガティブ選択を含めて、ただしこれだけに限定されない）選択又はスクリーニングし、それによって（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを用意すること及び（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されたメンバーを（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを含み、少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡは選択コドンを認識し、第２の生物から得られるＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化されている。一部の実施形態においては、少なくとも１個のｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、かつ／又は天然及び／又は異常塩基独特の３塩基コドンを含み、又はナンセンスコドン、レアコドン、異常コドン、少なくとも４個の塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドン若しくはオパール終止コドンである。一実施形態においては、組換えＯ−ｔＲＮＡは、オルソゴナル性が改善されている。一部の実施形態においては、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変する必要なしに、第２の生物から第１の生物に場合によっては移入されてもよいことを理解されたい。さまざまな実施形態においては、第１の生物と第２の生物は同じか又は異なっており、これらだけに限定されないが（メタノコッカス ジャナシー、メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム、エシェリキア コリ、ハロバクテリウムなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない）原核生物、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから場合によっては選択されてもよい。また、組換えｔＲＮＡは、非天然的にコードされたアミノ酸によって場合によってはアミノアシル化されてもよく、非天然的にコードされたアミノ酸はインビボで天然に又は遺伝子操作によって生合成される。非天然的にコードされたアミノ酸は、少なくとも第１の生物又は第２の生物用の増殖培地に場合によっては添加されてもよい。
一側面においては、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化された（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡをライブラリから（ネガティブ選択を含めて、ただしこれだけに限定されない）選択又はスクリーニングすること（段階（ｂ））は、第２の生物から得られる複数の細胞に毒性標識遺伝子（毒性標識遺伝子は、選択コドン（又は毒剤若しくは静的剤（ｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）の産生をもたらす遺伝子又は生物に必須の遺伝子（かかる標識遺伝子は少なくとも１個の選択コドンを含む。））の少なくとも１個を含む。）及び（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのライブラリを導入すること並びに生存細胞を選択することを含み、生存細胞は、少なくとも１個のオルソゴナルｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを含む。例えば、生存細胞は、対照比細胞密度（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒａｔｉｏ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）アッセイによって選択することができる。
別の側面においては、毒性標識遺伝子は２個以上の選択コドンを含むことができる。本方法の別の実施形態においては、毒性標識遺伝子はリボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子は少なくとも１個のアンバーコドンを含む。リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子は、２個以上のアンバーコドンを場合によっては含むことができる。
一実施形態においては、導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されたメンバーを（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングすることは、第２の生物から得られる複数の細胞にポジティブ選択又はスクリーニング標識遺伝子（ポジティブ標識遺伝子は、（少なくとも１個のアンバー終止コドンなどの選択コドンの少なくとも１個を含む、β−ラクタマーゼ遺伝子を含めて、ただしこれらだけに限定されない）薬剤耐性遺伝子又は生物に必須の遺伝子を含む。）又はＯ−ＲＳと一緒に毒剤の解毒をもたらす遺伝子及び（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを導入することと、抗生物質を含めて、ただしこれだけに限定されない選択剤又はスクリーニング剤の存在下で増殖した、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を特定し、それによって少なくとも１個の組換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供することとを含むことができ、少なくとも１個の組換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、少なくとも１個の選択コドンに応じてポジティブ標識遺伝子によってコードされた翻訳産物にアミノ酸を挿入する。別の実施形態においては、選択剤及び／又はスクリーニング剤の濃度は変化する。
特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを産生する方法が提供される。方法は、（ａ）第１の生物から得られる少なくとも１個のｔＲＮＡから誘導される変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製すること、（ｂ）第１の生物から得られるＲＳの非存在下で第２の生物から得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化された（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡをライブラリからネガティブ選択又はスクリーニングし、それによって（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを用意すること及び（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されたメンバーを（場合によっては変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを用意することを含む。少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡは、選択コドンを認識し、第２の生物から得られるＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化されている。この方法は、（ｄ）第３の生物から得られる少なくとも１個のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのライブラリを作製すること、（ｅ）非天然的にコードされたアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーを変異体ＲＳのライブラリから選択又はスクリーニングし、それによって活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳのプールを用意すること並びに（ｆ）非天然的にコードされたアミノ酸の非存在下で少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性な（場合によっては変異体でもよい）ＲＳをプールからネガティブ選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを用意することも含み、少なくとも１個の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、非天然的にコードされたアミノ酸に特異的である少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡとを含む。本方法によって産生される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアとしては、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペアなどのｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。さらに、かかる方法は、第１の生物と第３の生物が（メタノコッカス ジャナシーを含めて、ただしこれだけに限定されない）同じ場合を含む。
第２の生物のインビボでの翻訳システムに使用されるオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを選択する方法も本発明に含まれる。この方法は、第２の生物から得られる細胞の第１のセットに標識遺伝子、ｔＲＮＡ及び第１の生物から単離される又は誘導されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）を導入すること、第２の生物から得られる２つ組の細胞セットに標識遺伝子及びｔＲＮＡを導入すること並びに２つ組の細胞セット中に生存しない第１のセット中の生存細胞を選択すること又は２つ組の細胞セット中のかかる応答を示さない、特異的スクリーニング応答を示す細胞をスクリーニングすることを含み、第１のセット及び２つ組の細胞セットは選択剤又はスクリーニング剤の存在下で増殖され、生存細胞又はスクリーニングされた細胞は、第２の生物のインビボでの翻訳システムに使用されるオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを含む。一実施形態においては、比較及び選択又はスクリーニングすることは、インビボでの相補性アッセイを含む。選択剤又はスクリーニング剤の濃度は変化し得る。
本発明の生物は、さまざまな生物及びさまざまな組み合わせを含む。例えば、本発明の方法の第１の生物及び第２の生物は同じでも異なってもよい。一実施形態においては、生物は、場合によっては、メタノコッカス ジャナシー、メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシイ、Ａ．ペルニックス、Ｔ．サーモフィラスなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない原核生物であってもよい。或いは、これらの生物は、（単子葉植物、双子葉植物などの複雑な植物を含めて、ただしこれらだけに限定されない）植物、藻類、原生生物、（酵母などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）真菌、（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）動物などを含めて、ただしこれらだけに限定されない真核生物を場合によっては含んでもよい。別の実施形態においては、第２の生物は、メタノコッカス ジャナシー、メタノバクテリウム サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、エシェリキア コリ、Ａ．フルギダス、ハロバクテリウム、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシイ、Ａ．ペルニックス、Ｔ．サーモフィラスなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない原核生物である。或いは、第２の生物は、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞などを含めて、ただしこれらだけに限定されない真核生物とすることができる。さまざまな実施形態においては、第１の生物と第２の生物は異なる。
ＶＩ． ４螺旋バンドルポリペプチド中の非天然アミノ酸の位置
本発明は、１個以上の非天然アミノ酸を４ＨＢポリペプチド中に組み込むことを企図する。１個以上の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を乱さない特定の位置に組み込むことができる。これは、疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で、かさ高いアミノ酸をかさ高いアミノ酸で、親水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換することを含めて、ただしこれらだけに限定されない「保存的」置換をすること）及び／又は活性に不要な位置に非天然アミノ酸を挿入することによって実施することができる。
ｈＧＨ領域は以下のように示すことができる。ここで、ｈＧＨ中のアミノ酸位置は中間の行に示されている（配列番号２）。
Figure 2007519422
ｈＩＦＮ領域は以下のように示すことができる。ここで、ｈＩＦＮ中のアミノ酸位置は配列番号２４に従う。
１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域） １３７−１５５（Ｅヘリックス） １５６−１６５（Ｃ末端）
ｈＧ−ＣＳＦ領域は以下のように示すことができる。ここで、ｈＧ−ＣＳＦ中のアミノ酸位置は括弧中に示されている（配列番号２９又は配列番号３０中の対応するアミノ酸位置 しかし、Ｎ末端の３０アミノ酸シグナル配列を欠く）。
３１０ヘリックス（４４−４７）とαヘリックス（４８−５３）で構成される、ＡヘリックスとＢヘリックスの間の４４−５３の短いらせん状セグメント、ミニＥヘリックスを含めて、１−１０（Ｎ末端）、１１−３９（Ａヘリックス）、４０−７０（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、７１−９１（Ｂヘリックス）、９２−９９（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、１００−１２３（Ｃヘリックス）、１２４−１４２（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１４３−１７２（Ｄヘリックス）、１７３−１７５（Ｃ末端）。
ｈＥＰＯ領域は以下のように示すことができる（配列番号３８）。
１−７（Ｎ末端）、８−２６（Ａヘリックス）、２７−５４（ベータシート１（３９−４１）とミニＢ’ヘリックス（４７−５２）を含むＡＢループ）、５５−８３（Ｂヘリックス）、８４−８９（ＢＣループ）、９０−１１２（Ｃヘリックス）、１１３−１３７（ミニＣ’ヘリックス（１１４−１２１）とベータシート２（１３３−１３５）を含むＣＤループ）、１３８−１６１（Ｄヘリックス）、１６２−１６６（Ｃ末端）。
４ＨＢポリペプチド中の非天然的にコードされたアミノ酸による置換に対する所望の部位を選択するためにさまざまな生化学的及び構造的手法を使用することができる。ポリペプチド鎖の任意の位置が、非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れるための選択に適切であり、選択は合理的設計に基づくことができ、又は任意の所望の目的で、若しくは特定の所望の目的なしに無作為選択によることができることは当業者に容易に明らかである。所望の部位は、作用物質、スーパーアゴニスト、逆作用物質、拮抗物質、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、２量体又は多量体形成、未変性分子と比較して活性若しくは特性が不変、又は溶解性、凝集、安定性などのポリペプチドの任意の物理的若しくは化学的性質の操作を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の所望の特性又は活性を有する４螺旋バンドル分子を産生するために選択することができる。例えば、４螺旋バンドルポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチド中の位置は、当分野で公知のアラニンスキャン法又はホモログスキャン法によって特定することができる。例えば、（ｈＧＨ生理活性にきわめて重要である１４種類の残基を特定する）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）及び（ホモログスキャン変異誘発によって抗体及び受容体エピトープを特定する）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）を参照されたい。ＩＦＮについては、例えば、Ｄｉ Ｍａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ２０２：１４４５（１９９４）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１３：１４３（１９９８）；Ｒｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７３：８００３（１９９８）を参照されたい。Ｇ−ＣＳＦアラニンスキャン変異誘発試験は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ＪＦ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｕｌ １６；３５（２８）：９０３４−４１、Ｙｏｕｎｇ ＤＣ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（１９９７）Ｊｕｎ；６（６）：１２２８−３６及びＬａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＪＢＣ ２７２（４７）：２９７３５−２９７４１に記載されている。例えば、（ｈＥＰＯ活性にきわめて重要な残基を特定する）Ｂｉｔｔｏｒｆ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ，３３６：１３３−１３６（１９９３）、Ｗｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ、２６９：２２８３９−２２８４６（１９９４）（ｈＥＰＯの機能的に重要なドメインを特定するのに使用されるアラニンスキャン変異誘発）及び（ｈＥＰＯとヒトＥＰＯ受容体との鍵となる静電相互作用を特定する）Ｅｌｌｉｏｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，８９：４９３−５０２（１９９７）を参照されたい。アラニン又はホモログスキャン変異誘発によって生物活性にきわめて重要であると確認された残基以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、非天然的にコードされたアミノ酸による置換の良好な候補となり得る。或いは、生物活性にきわめて重要であると確認された部位も、やはりポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、非天然的にコードされたアミノ酸による置換の良好な候補となり得る。別の選択肢は、ポリペプチド鎖上の各位置において、非天然的にコードされたアミノ酸で単に連続置換することであり、ポリペプチドの活性に対する効果を観察することである。非天然アミノ酸を任意のポリペプチドに代入するための位置を選択する任意の手段、技術又は方法が本発明における使用に適切であることは当業者に容易に明らかである。
非天然的にコードされたアミノ酸による置換が許容される可能性があるタンパク質の領域を決定するために、欠失を含む４ＨＢポリペプチドの天然変異体の構造及び活性も検討することができる。ｈＧＨについては、例えば、Ｋｏｓｔｙｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９２５：３１４（１９８７）；Ｌｅｗｉｓ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：２６７９−２６８７（１９７８）を参照されたい。ｈＥＰＯについては、例えば、Ｂｉｔｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ，３３６：１３３（１９９３）；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ，２６９：２２８３９（１９９４）を参照されたい。同様に、４ＨＢポリペプチド受容体を結びつける４ＨＢポリペプチドの領域を特定するために、プロテアーゼ消化及びモノクローナル抗体を使用することができる。例えば、（残基１３４−１４９間のアミノ酸が、ｈＧＨに対する活性を失わずに欠失させることができることを示す）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０７：３９１−３９９（１９８０）；Ｌｉ，Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６：３１−４１（１９８２）を参照されたい。Ｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＪＢＣ ２７６（３９）３６７７９−３６７８７は、ｈＧ−ＣＳＦ及びその受容体を用いた抗体試験を記載している。非天然的にコードされたアミノ酸による置換を受け容れない可能性がある残基が除去された後に、残りの位置の各々において提案される置換の影響は、４ＨＢ及びその結合タンパク質の３次元結晶構造から検討することができる。ｈＧＨについてはｄｅ Ｖｏｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６−３１２（１９９２）を参照されたい。（３ＨＨＲ、１ＡＸＩ及び１ＨＷＧを含めて）ｈＧＨのすべての結晶構造は、タンパク質及び核酸の大分子の３次元構造データを含む集中データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ、ｒｃｓｂ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ上で利用可能）において利用可能である。ｈＩＦＮのＸ線結晶構造及びＮＭＲ構造も、タンパク質データバンク（１ＲＨ２及び１ＩＴＦ）並びに参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６０２，２３２号、同５，４６０，９５６号、同５，４４１，７３４号、同４，６７２，１０８号において利用可能である。ｈＧ−ＣＳＦのＸ線結晶構造及びＮＭＲ構造は、ＰＤＢＩＤ：１ＣＤ９、１ＰＧＲ、１ＲＨＧ、１ＧＮＣのタンパク質データバンク並びに参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８１，４７６号及び同５，７９０，４２１号において利用可能である。ｈＥＰＯについては、Ｓｙｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９５：５１１（１９９８）及びＣｈｅｅｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：８６１（１９９８）を参照されたい。ｈＥＰＯのＸ線結晶構造及びＮＭＲ構造は、ＰＤＢＩＤ：１ＣＮ４、１ＥＥＲ及び１ＢＵＹのタンパク質データバンクにおいて利用可能である。したがって、当業者は、非天然的にコードされたアミノ酸で置換することができるアミノ酸位置を容易に特定することができる。
一部の実施形態においては、本発明の４ＨＢポリペプチドは、ポリペプチドのへリックス又はベータシート二次構造を乱さないタンパク質の領域に位置する１個以上の非天然アミノ酸を含む。
非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的な残基は、（サイトＩ及びサイトＩＩを含めて、ただしこれらだけに限定されない）潜在的な受容体結合領域から除外される残基とすることができ、完全に又は部分的に溶媒に曝すことができ、近くの残基と最低限の水素結合相互作用を有し、又は水素結合相互作用を有さず、近くの反応性残基への暴露を最低限に抑えることができ、４螺旋バンドルポリペプチドとその受容体の３次元結晶構造によって予測される（Ｃ−Ｄループを含めて、ただしこれだけに限定されない）きわめて柔軟な領域又は（Ｂヘリックスを含めて、ただしこれだけに限定されない）構造的に堅い領域に存在することができる。
一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ｈＧＨ中の二次構造に対応する以下の領域の１つ以上における任意の位置に組み込まれる：配列番号２の１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。他の実施形態においては、本発明のｈＧＨポリペプチドは、Ｎ末端（１−５）、Ａ−ＢループのＮ末端（３２−４６）；Ｂ−Ｃループ（９７−１０５）、Ｃ−Ｄループ（１３２−１４９）及びＣ末端（１８４−１９１）からなる群から選択されるｈＧＨの少なくとも１個の領域に位置する少なくとも１個のアミノ酸を置換する少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む。一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ｈＧＨの以下の位置の１つ以上に組み込まれる：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわちタンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位としては、配列番号２の２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７若しくはそれらの任意の組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が挙げられる。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、配列番号２の２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７若しくはそれらの任意の組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が挙げられる。ｈＧＨの結晶構造及びｈＧＨ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的又は部分的に溶媒と接触可能であり、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖は、タンパク質表面から離れた方向を向き、溶媒方向を向き得る。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的位置としては、配列番号２の３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５若しくはそれらの任意の組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が挙げられる。ｈＧＨの結晶構造及びｈＧＨ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的に溶媒に曝され、未変性残基の側鎖は溶媒方向を向く。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、配列番号２の３０、７４、１０３若しくはそれらの任意の組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が挙げられる。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位の別のサブセットとしては、配列番号２の３５、９２、１４３、１４５若しくはそれらの任意の組み合わせ又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸が挙げられる。
一部の実施形態においては、以下の位置を含めて、ただしこれらだけに限定されない位置の１つ以上における非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、これらの位置の１つ以上における非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、これらの位置の１つ以上における非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：３５、９２、１４３、１４５（配列番号２又は配列番号１若しくは３の対応するアミノ酸）。
ヒトＧＨ拮抗物質としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３及び１２７における置換、位置１（すなわちＮ末端）における付加又はそれらの任意の組み合わせ（配列番号２又は配列番号１、３若しくは任意の他のＧＨ配列中の対応するアミノ酸）を含むものなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ＩＦＮにおける二次構造に対応する以下の領域の１つ以上において組み込まれ又は置換されており、ｈＩＦＮ中のアミノ酸位置は配列番号２４に従う：１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域） １３７−１５５（Ｅヘリックス）１５６−１６５（Ｃ末端）。
一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ＩＦＮ中の以下の位置の１つ以上に組み込まれる：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸と同様）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：４１、４５、４６、４８、４９（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、以下の位置を含めて、ただしこれらだけに限定されない、これら又は他の位置の非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわちカルボキシ末端）（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーは、１つ以上のアミノ酸位置において結合している：６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２４又は配列番号２３、２５若しくは任意の他のＩＦＮポリペプチド中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、本発明のＩＦＮポリペプチドは、拮抗物質を与える以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５又はそれらの任意の組み合わせ（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸）。これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは、選択部位及び所望の活性に応じて弱い拮抗物質又は弱い作用物質として潜在的に作用し得る。ヒトＩＦＮ拮抗物質としては、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７又はそれらの任意の組み合わせ（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５中の対応するアミノ酸）において置換されたものなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、以下のとおりＧ−ＣＳＦ中の二次構造に対応する以下の領域の１つ以上において組み込まれ又は置換されている：（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５及び３６中の対応するアミノ酸におけるように）３１０ヘリックス（４４−４７）とαヘリックス（４８−５３）で構成される、ＡヘリックスとＢヘリックスの間の４４−５３における短いらせん状セグメント、ミニＥヘリックスを含めて、１−１０（Ｎ末端）、１１−３９（Ａヘリックス）、４０−７０（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、７１−９１（Ｂヘリックス）、９２−９９（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、１００−１２３（Ｃヘリックス）、１２４−１４２（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１４３−１７２（Ｄヘリックス）、１７３−１７５（Ｃ末端）。一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、Ｇ−ＣＳＦ中の以下の位置の１つに組み込まれている：（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（すなわちカルボキシ末端）。一部の実施形態においては、本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドは、以下の位置の１つ以上に１個以上の非天然アミノ酸を含む：（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０及び１７１。一部の実施形態においては、以下の位置を含めて、ただしこれらだけに限定されない位置の１つ以上における非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（すなわちカルボキシ末端）（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、以下の位置を含めて、ただしこれらだけに限定されない、これら又は他の位置の非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７及び１７１。
非天然的にコードされたアミノ酸が組み込まれる例示的部位のサブセットとしては、（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０、１７１などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ｈＧ−ＣＳＦの結晶構造及びｈＧ−ＣＳＦ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的又は部分的に溶媒と接触可能であり、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖は、タンパク質表面から離れた方向を向き、溶媒方向を向き得る。
非天然的にコードされたアミノ酸が組み込まれる例示的な位置としては、（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７及び１７１が挙げられる。ｈＧ−ＣＳＦの結晶構造及びｈＧ−ＣＳＦ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的に溶媒に曝され、未変性残基の側鎖は溶媒方向を向く。
ヒトＧ−ＣＳＦ拮抗物質としては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１４５又はそれらの任意の組み合わせ（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸）における置換を含むものなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
［３４１］
一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ＥＰＯ中の二次構造に対応する以下の領域の１つ以上において組み込まれ又は置換されている：１−７（Ｎ末端）、８−２６（Ａヘリックス）、２７−５４（ベータシート１（３９−４１）とミニＢ’ヘリックス（４７−５２）を含むＡＢループ）、５５−８３（Ｂヘリックス）、８４−８９（ＢＣループ）、９０−１１２（Ｃヘリックス）、１１３−１３７（ミニＣ’ヘリックス（１１４−１２１）とベータシート２（１３３−１３５）を含むＣＤループ）、１３８−１６１（Ｄヘリックス）、１６２−１６６（Ｃ末端）（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は、ＥＰＯ中の以下の位置の１つ以上に組み込まれている：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（すなわちカルボキシ末端）（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、以下の位置を含めて、ただしこれらだけに限定されない位置の１つ以上における非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（すなわちカルボキシ末端）（配列番号３８又は配列番号３７又は３９中の対応するアミノ酸）。一部の実施形態においては、位置２１、２４、３８、８３、８５、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７及び１２８又はそれらの組み合わせ（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）を含めて、ただしこれらだけに限定されない、水溶性ポリマーに連結されたこれら又は他の位置における１個以上の非天然アミノ酸。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、１、２、４、９、１７、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４０、５０、５３、５５、５８、６５、６８、７２、７６、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、１５９、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ｈＥＰＯの結晶構造及びｈＥＰＯ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的又は部分的に溶媒と接触可能であり、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖は、タンパク質表面から離れた方向を向き、溶媒方向を向き得る。
１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的な位置としては、２１、２４、２８、３０、３１、３６、３７、３８、５５、７２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）が挙げられる。ｈＥＰＯの結晶構造及びｈＥＰＯ受容体とのその相互作用の検討によれば、これらのアミノ酸残基の側鎖は全体的に溶媒に曝され、未変性残基の側鎖は溶媒方向を向く。
ヒトＥＰＯ拮抗物質としては、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９（ｈＥＰＯ；配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）における置換を有するものなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。。
多種多様な非天然的にコードされたアミノ酸は、４ＨＢポリペプチド中の所与の位置を置換することができ、又は所与の位置に組み込むことができる。一般に、特定の非天然的にコードされたアミノ酸は、４ＨＢポリペプチドとその受容体の３次元結晶構造、保存的置換（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニン、Ｏ−プロパルギルチロシンなどのアリールを主体とする非天然的にコードされたアミノ酸）の優先度及び４ＨＢポリペプチド中に導入したい特異的共役化学反応（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加を実施したい場合又はホスフィン部分を組み込むアリールエステルを有する水溶性ポリマーとのアミド結合形成を実施したい場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）の検討に基づいて組み込み用に選択される。
一実施形態においては、本方法は、さらに、タンパク質に非天然アミノ酸を組み込むこと（該非天然アミノ酸は第１の反応性基を含む。）と、該タンパク質を（標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ、抗体若しくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、抑制性リボ核酸、医用材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチンアナログ、重原子を組み入れた部分、化学開裂可能な基、光開裂可能な基、長い側鎖、炭素結合糖、レドックス活性薬剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記の任意の組み合わせ又は任意の他の望ましい化合物若しくは物質を含めて、ただしこれらだけに限定されない）第２の反応性基を含む分子と接触させることを含む。第１の反応性基は第２の反応性基と反応して、［３＋２］環付加によって分子を非天然アミノ酸に結合させる。一実施形態においては、第１の反応性基はアルキニル又はアジド部分であり、第２の反応性基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第１の反応性基は（これだけに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン中を含めた）アルキニル部分であり、第２の反応性基はアジド部分である。他の例においては、第１の反応性基は（これだけに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン中を含めた）アジド部分であり、第２の反応性基はアルキニル部分である。
非天然的にコードされたアミノ酸置換は、４ＨＢポリペプチド内の他の付加、置換又は欠失と組み合わされて、４ＨＢポリペプチドの他の生物学的特質に影響を及ぼす場合がある。他の付加、置換又は欠失は、４ＨＢポリペプチドの（耐タンパク質分解性を含めて、ただしこれだけに限定されない）安定性を増大させることができ、又は４ＨＢポリペプチド受容体に対する４ＨＢポリペプチドの親和性を増大させることができる場合がある。一部の実施形態においては、ｈＧＨポリペプチドは、配列番号２中のＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。他の付加、置換又は欠失は、４ＨＢポリペプチドの（Ｅ．コリ又は他の宿主細胞中で発現されるときを含めて、ただしこれだけに限定されない）溶解性を増大させることができる場合がある。一部の実施形態においては、付加、置換又は欠失は、Ｅ．コリ組換え宿主細胞中の発現後のポリペプチド溶解性を増大させることができる。一部の実施形態においては、部位は、Ｅ．コリ組換え宿主細胞中の発現後のポリペプチド溶解性を増大させる非天然アミノ酸を組み込む別の部位に加えて、天然にコードされたアミノ酸又は非天然アミノ酸との置換用に選択される。溶解性を増大させるアミノ酸置換用のｈＥＰＯ中のかかる部位の例は、Ｎ３６、Ｑ８６、Ｇ１１３及び／又はＱ１１５であり、これらはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ又は任意の他の天然にコードされた若しくは非天然的にコードされた荷電アミノ酸（配列番号３８）で置換することができる。一部の実施形態においては、４ＨＢポリペプチドは、４ＨＢポリペプチド受容体に対する親和性を調整する、受容体２量体化の（増加又は減少を含めて、ただしこれらだけに限定されない）調整をする、受容体２量体を安定化する、循環半減期を調整する、放出若しくは生物学的利用能を調整する、精製を促進する、又は特定の投与経路を改善若しくは変更する、別の付加、置換若しくは欠失を含む。例えば、本明細書に記載の１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を導入することに加えて、ｈＧＨ変異体受容体に対するｈＧＨ変異体の親和性を増大させるために、以下の置換の１個以上が導入される：Ｆ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ ｏｒＦ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、又はＭ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ及びＩ１７９Ｔ。例えば、本明細書に記載の１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を導入することに加えて、ｈＥＰＯ変異体受容体に対するｈＥＰＯ変異体の親和性を増大させるために、以下の置換の１個以上が導入される：Ｓ９Ａ、Ｆ４８Ｓ、Ｙ４９Ｓ、Ａ５０Ｓ、Ｑ５９Ａ、Ａ７３Ｇ、Ｇ１０１Ａ、Ｔ１０６Ａ、Ｌ１０８Ａ、Ｔ１３２Ａ、Ｒ１３９Ａ、Ｋ１４０Ａ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１４６Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｒ１５０Ａ、及びＫ１５４Ａ（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＪＢＣ ２６９：２２８３９−２２８４６）。同様に、４ＨＢポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性基、（ＦＬＡＧ又はｐｏｌｙ−Ｈｉｓを含めて、ただしこれらだけに限定されない）抗体−結合ドメイン、（ＦＬＡＧ、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない）他の親和性に基づく配列又はポリペプチドの（ＧＦＰを含めて、ただしこれだけに限定されない）検出、精製若しくは他の形質を改善する（ビオチンを含めて、ただしこれだけに限定されない）連結分子を含むことができる。
一部の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸の置換によってｈＧＨ拮抗物質が産生される。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７又は位置１の前の付加（配列番号２又は配列番号１、３若しくは任意の他のＧＨ配列中の対応するアミノ酸）が挙げられる。一部の実施形態においては、ｈＧＨ拮抗物質は、領域１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）中にＧＨを拮抗物質として作用させる少なくとも１個の置換を含む。他の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位としては、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部のアミノ末端領域内の残基が挙げられる。別の実施形態においては、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの非天然的にコードされたアミノ酸とのＧ１２０の置換。他の実施形態においては、上記置換は、ｈＧＨポリペプチドをｈＧＨ拮抗物質にするさらに別の置換と組み合わせられる。例えば、非天然的にコードされたアミノ酸は、本明細書に特定される位置の１つにおいて置換され、併発する置換はＧ１２０（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ又はＧ１２０Ｅ）に導入される。一部の実施形態においては、ｈＧＨ拮抗物質は、ｈＧＨ分子の受容体結合領域に存在する、水溶性ポリマーに連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。
一部の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸の置換によってｈＩＦＮ拮抗物質が産生される。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、（配列番号２４又は他のＩＦＮ中の対応するアミノ酸におけるように）２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５が挙げられる。非天然的にコードされたアミノ酸が組み込まれる例示的部位の別のサブセットとしては、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５中の対応するアミノ酸）が挙げられる。一部の実施形態においては、ｈＩＦＮ拮抗物質は、領域１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅヘリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）中にＩＦＮを拮抗物質として作用させる少なくとも１個の置換を含む。他の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位としては、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部のアミノ末端領域内の残基が挙げられる。他の実施形態においては、上記置換は、ｈＩＦＮポリペプチドをｈＩＦＮ拮抗物質にするさらに別の置換と組み合わせられる。一部の実施形態においては、ｈＩＦＮ拮抗物質は、ｈＩＦＮ分子の受容体結合領域に存在する、水溶性ポリマーに連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。
一部の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸の置換によってｈＧ−ＣＳＦ拮抗物質が産生される。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位のサブセットとしては、（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５若しくは３６中の対応するアミノ酸におけるように）６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７及び１４５が挙げられる。一部の実施形態においては、ｈＧ−ＣＳＦ拮抗物質は、領域６−３０、４０−７０又は１０５−１３０中にＧ−ＣＳＦを拮抗物質として作用させる少なくとも１個の置換を含む。他の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位としては、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部のアミノ末端領域内の残基が挙げられる。別の実施形態においては、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの非天然的にコードされたアミノ酸とのＬ７０の置換。他の実施形態においては、上記置換は、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドをｈＧ−ＣＳＦ拮抗物質にするさらに別の置換と組み合わせられる。例えば、非天然的にコードされたアミノ酸は、本明細書に特定される位置の１つにおいて置換され、併発する置換はＬ７０に導入される。一部の実施形態においては、ｈＧ−ＣＳＦ拮抗物質は、ｈＧ−ＣＳＦ分子の受容体結合領域に存在する、水溶性ポリマーに連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。
一部の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸の置換によってｈＥＰＯ拮抗物質が産生される。ヒトＥＰＯ拮抗物質としては、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９又はそれらの任意の組み合わせ（ｈＥＰＯ；配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９中の対応するアミノ酸）における置換を有するものなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。一部の実施形態においては、ｈＥＰＯ拮抗物質は、領域１０−１５又は１００−１０８中にＥＰＯを拮抗物質として作用させる少なくとも１個の置換を含む。Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：４９３−５０２及びＣｈｅｅｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：８６１−８６６を参照されたい。一部の実施形態においては、ｈＥＰＯポリペプチドは、低親和性受容体結合部位（サイト２）中に存在する以下の置換、Ｖ１１Ｓ、Ｒ１４Ｑ、Ｙ１５Ｉ、Ｓ１００Ｅ、Ｒ１０３Ａ、Ｓ１０４Ｉ及びＬ１０８Ｋの１個以上を含むことによって改変される。他の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる例示的部位としては、ヘリックスＡのアミノ末端領域及びヘリックスＣの一部のアミノ末端領域内の残基が挙げられる。別の実施形態においては、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなどの非天然的にコードされたアミノ酸とのＬ１０８の置換。他の実施形態においては、上記置換は、ｈＥＰＯポリペプチドをｈＥＰＯ拮抗物質にするさらに別の置換と組み合わせられる。例えば、非天然的にコードされたアミノ酸は、本明細書に特定される位置の１つにおいて置換され、併発する置換は、（Ｌ１０８Ｋ、Ｌ１０８Ｒ、Ｌ１０８Ｈ、Ｌ１０８Ｄ又はＬ１０８Ｅを含めて、ただしこれらだけに限定されない）Ｌ１０８に導入される。一部の実施形態においては、ｈＥＰＯ拮抗物質は、ｈＥＰＯ分子のサイト２結合領域に存在する、水溶性ポリマーに連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸が１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換される場合もある。４ＨＢポリペプチドは、さらに、天然アミノ酸の代わりに１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の置換を含む場合もある。例えば、一部の実施形態においては、ｈＧＨの以下の領域中の少なくとも２個の残基は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている：１−５（Ｎ末端）；３２−４６（Ａ−ＢループのＮ末端）；９７−１０５（Ｂ−Ｃループ）及び１３２−１４９（Ｃ−Ｄループ）及び１８４−１９１（Ｃ末端）。一部の実施形態においては、ｈＧＨの以下の領域中の少なくとも２個の残基は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている：１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａヘリックス）、３４−７４（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂヘリックス）、９７−１０５（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃヘリックス）、１３０−１５３（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄヘリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）。一部の実施形態においては、ｈＩＦＮの以下の領域中の少なくとも２個の残基は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている：１−９（Ｎ末端）、１０−２１（Ａヘリックス）、２２−３９（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、４０−７５（Ｂヘリックス）、７６−７７（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、７８−１００（Ｃヘリックス）、１０１−１１０（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１１１−１３２（Ｄヘリックス）、１３３−１３６（ＤヘリックスとＥヘリックスの間の領域）、１３７−１５５（Ｅヘリックス）、１５６−１６５（Ｃ末端）。一部の実施形態においては、ｈＧ−ＣＳＦの以下の領域中の少なくとも２個の残基は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている：３１０ヘリックス（４４−４７）とαヘリックス（４８−５３）で構成される、ＡヘリックスとＢヘリックスの間の４４−５３の短いらせん状セグメント、ミニＥヘリックスを含めて、１−１０（Ｎ末端）、１１−３９（Ａヘリックス）、４０−７０（ＡヘリックスとＢヘリックスの間の領域）、７１−９１（Ｂヘリックス）、９２−９９（ＢヘリックスとＣヘリックスの間の領域）、１００−１２３（Ｃヘリックス）、１２４−１４２（ＣヘリックスとＤヘリックスの間の領域）、１４３−１７２（Ｄヘリックス）、１７３−１７５（Ｃ末端）。例えば、一部の実施形態においては、ｈＥＰＯの以下の領域中の少なくとも２個の残基は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている：１−７（Ｎ末端）、８−２６（Ａヘリックス）、２７−５４（ベータシート１（３９−４１）とミニＢ’ヘリックス（４７−５２）を含めたＡＢループ）、５５−８３（Ｂヘリックス）、８４−８９（ＢＣループ）、９０−１１２（Ｃヘリックス）、１１３−１３７（ミニＣ’ヘリックス（１１４−１２１）とベータシート２（１３３−１３５）を含むＣＤループ）、１３８−１６１（Ｄヘリックス）、１６２−１６６（Ｃ末端）。２個以上の非天然的にコードされた残基は、１個以上の低分子量線状又は分枝ＰＥＧ（質量約５−２０ｋＤａ以下）と連結され、それによって、単一の高分子量ＰＥＧに結合した種よりも結合親和性又は類似の血清半減期が増大する。
一部の実施形態においては、ｈＧＨの以下の残基の最高２個は、位置：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６及び１８７において、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている。以下の置換ペアのいずれかが作製される場合がある：Ｋ３８Ｘ＊とＫ１４０Ｘ＊；Ｋ４１Ｘ＊とＫ１４５Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊とＥ８８Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊とＦ９２Ｘ＊；Ｙ３５Ｘ＊とＹ１４３Ｘ＊；Ｆ９２Ｘ＊とＹ１４３Ｘ＊。ここで、Ｘ＊は、非天然的にコードされたアミノ酸である。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６及び１８７。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる特に好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５及び１５５。
２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸をｈＧＨ中に組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：配列番号２の位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又はそれらの任意の組み合わせ。
２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸をｈＩＦＮ中に組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（すなわち、タンパク質のカルボキシ末端）又はそれらの任意の組み合わせ。
一部の実施形態においては、ｈＧ−ＣＳＦの以下の残基の最高２個は、位置：３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０及び１７１において、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている。したがって、以下の置換ペアのいずれかが作製される場合がある：Ｗ５９Ｘ＊とＴ１３４Ｘ＊；Ｌ１３１Ｘ＊とＳ６７Ｘ＊；Ｓ６７Ｘ＊とＱ９１Ｘ＊；Ｔ１３４Ｘ＊とＳｅｒ７７Ｘ＊。ここで、Ｘ＊は非天然的にコードされたアミノ酸である。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０及び１７１。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる特に好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７及び１７１。
２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸をｈＧ−ＣＳＦに組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、Ｊ２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（すなわちカルボキシ末端）。
一部の実施形態においては、以下の残基の最高２個は、ｈＥＰＯ中の位置：１、２、４、９、１７、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４０、５０、５３、５５、５８、６５、６８、７２、７６、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、１５９、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６において、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸で置換されている。したがって、以下の置換ペアのいずれかが作製される場合がある：Ｎ２４Ｘ＊とＧ１１３Ｘ＊；Ｎ３８Ｘ＊とＱ１１５Ｘ＊；Ｎ３６Ｘ＊とＳ８５Ｘ＊；Ｎ３６Ｘ＊とＡ１２５Ｘ＊；Ｎ３６Ｘ＊とＡ１２８Ｘ＊；Ｑ８６Ｘ＊とＳ１２６Ｘ＊。ここで、Ｘ＊は非天然的にコードされたアミノ酸である。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：２１、２４、２８、３０、３１、３６、３７、３８、５５、７２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１６２、１６３、１６４、１６５及び１６６。２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み入れる特に好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：２１、２４、３８、８３、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１６２。
２個以上の非天然的にコードされたアミノ酸をｈＥＰＯに組み入れる好ましい部位としては、以下の残基の組み合わせなどが挙げられる：位置１の前（すなわちＮ末端）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（すなわちカルボキシ末端）。
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物における発現
４ＨＢポリヌクレオチドクローンを高レベルで発現させるために、一般に、本発明の４ＨＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、強力なプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングして、転写、転写／翻訳ターミネーターを誘導し、タンパク質をコードする核酸の場合には翻訳開始用リボソーム結合部位を誘導する。適切な細菌プロモーターは、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に記載されている。
本発明の４ＨＢポリペプチドを発現する細菌発現系は、Ｅ．コリ、バチルス種及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（これらだけに限定されない。）において利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３−５４５（１９８３））。かかる発現系のキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞の真核生物発現系は当分野で周知であり、やはり市販されている。オルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（上記）が本発明の４ＨＢポリペプチドの発現に使用される場合には、発現用宿主細胞は、オルソゴナル成分を使用するその能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、（Ｂ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない）グラム陽性菌及びグラム陰性菌（Ｅ．コリ、シュードモナス フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）並びに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞は、本明細書に記載されたとおりに使用することができる。
本発明の真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞は、非天然アミノ酸を含むタンパク質を多量に有用な量で合成する能力を提供する。一側面においては、この組成物は、非天然アミノ酸を含むタンパク質の少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム若しくはそれ以上又はインビボでのタンパク質産生方法によって実施することができる量を含めて、ただしこれらだけに限定されない量を場合によっては含んでもよい（組換えタンパク質産生及び精製の詳細は本明細書に記載されている。）。別の側面においては、タンパク質は、これらだけに限定されないが、（これらだけに限定されないが、約１ｎｌから約１００Ｌの体積を含めて、ただしこれらだけに限定されない）細胞溶解物、緩衝剤、薬剤緩衝剤又は他の液体懸濁液（これらだけに限定されない。）中のタンパク質少なくとも１０マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも５０マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも７５マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも１００マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも２００マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも２５０マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも５００マイクログラム／リットル、タンパク質少なくとも１ミリグラム／リットル又はタンパク質少なくとも１０ミリグラム／リットル以上を含めて、ただしこれらだけに限定されない濃度で組成物中に場合によっては存在してもよい。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞における（インビトロでの翻訳を含めて、ただしこれだけに限定されない他の方法によって一般に可能である量よりも多量を含めて、ただしこれだけに限定されない）多量のタンパク質の産生は、本発明の特徴である。
本発明の真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞は、非天然アミノ酸を含むタンパク質を多量に有用な量で生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含むタンパク質は、細胞抽出物、細胞溶解物、培地、緩衝剤などの中のタンパク質少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル以上を含めて、ただしこれらだけに限定されない濃度で産生することができる。
Ｉ． 発現系、培養及び単離
４ＨＢポリペプチドは、例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含めて、任意の数の適切な発現系において発現させることができる。例示的な発現系を以下に記述する。
酵母 本明細書では「酵母」という用語は、４ＨＢポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能なさまざまな酵母のいずれをも含む。かかる酵母としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目）、有担子胞子（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、不完全菌類（不完全酵母綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））群に属する酵母などが挙げられるが、これらだけに限定されない。有子嚢胞子酵母は、スパーモフソラ科（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）とサッカロミセス科の２つの科に分類される。後者は、シゾサッカロミセス亜科（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、シゾサッカロミセス属）、ナドソニア亜科（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミセス亜科（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミセス亜科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属及びサッカロミセス属）の４つの亜科からなる。有担子胞子酵母は、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属を含む。不完全菌類（不完全酵母綱）群に属する酵母は、スポロボロミケス科（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロボロミケス属及びブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属）とクリプトコッカス科（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属）の２つの科に分類される。
本発明と一緒に使用するのに特に興味深いのは、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．ギレリモンディ（ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ジアスタティカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ダグラシー（ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クリヴェリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、Ｓ．オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）及びＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属及びカンジダ属の種である。
４ＨＢポリペプチドの発現に適切な酵母の選択は、当業者の技能の範囲内である。発現用酵母宿主の選択において、適切な宿主としては、例えば、良好な分泌能力、低タンパク質分解活性、良好な分泌能力、良好な可溶性タンパク質産生及び全体的な堅牢性を有することが判明した宿主などが挙げられる。酵母は、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含めて、ただしこれらだけに限定されないさまざまなソースから一般に利用可能である。
「酵母宿主」又は「酵母宿主細胞」という用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡ用レシピエントとして使用することができる酵母又は使用されている酵母を含む。この用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡを受け取った元の酵母宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は偶発的若しくは意図的変異のために元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが完全に同一である必要はない。４ＨＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性によって特徴付けられるのに親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
染色体外レプリコン又は組込み型ベクターを含めて、発現及び形質転換ベクターが多数の酵母宿主への形質転換用に開発された。例えば、発現ベクターは、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルフェ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｅ）（Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＧＥＮ．ＧＥＮＥＴ．（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．フラギリス（（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンディ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＳＩＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号、同４，９２９，５５５号及び同４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８５）５：３３７６）；シゾサッカロミセス ポンベ（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）３００：７０６）及びＹ．リポリチカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｄａｖｉｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲ．ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲ．ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：４９）；Ａ．ニドゥランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８３）２６：２０５−２２１及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．リーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ０２４４２３４）及び例えばニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌（国際公開第９１／００３５７号）用が開発された。各々を参照により本明細書に組み込まれる。
酵母ベクターの制御配列は、当業者に周知であり、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）（ＥＰ０２８４０４４）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ０３２９２０３）などの遺伝子由来のプロモーター領域などが挙げられるが、これらだけに限定されない。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺伝子も、有用なプロモーター配列を与えることができる（Ｍｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主と一緒に使用される他の適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５：２０７３）及びピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどの他の糖分解酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＤＶ．ＥＮＺＹＭＥ ＲＥＧ．（１９６８）７：１４９）用プロモーターなどが挙げられる。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性酵母プロモーターは、アルコール脱水素酵素２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関連する分解酵素並びにマルトース及びガラクトースの利用をもたらす酵素用のプロモーター領域を含むことができる。酵母発現に使用するのに適切なベクター及びプロモーターは、さらに、ＥＰ００７３６５７に記載されている。
酵母エンハンサーも酵母プロモーターと一緒に使用することができる。また、合成プロモーターも酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と一緒に合成ハイブリッドプロモーターを生成することができる。かかるハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ制御配列が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８８０，７３４号及び第４，８７６，１９７号を参照されたい。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＧＡＰ、ＰｙＫなどの糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わされた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨ０５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ０１６４５５６を参照されたい。また、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結びつけ、転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然のプロモーターなどが挙げられる。
酵母発現ベクターの一部を含むことができる他の調節領域としては、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のターミネーターが挙げられる（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）。また、２μプラスミド起源の複製開始点は、酵母に適切である。酵母に使用するのに適切な選択遺伝子は、酵母プラスミド中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１を参照されたい。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異体系統用の選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母系統（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に周知であり、一般に、スフェロプラストの形質転換又はアルカリ陽イオンで処理された完全な酵母宿主細胞の形質転換などが挙げられるが、これらだけに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＡＣＴ．（１９７７）１３０：９４６に記載の方法に従って実施することができる。しかし、核注入、エレクトロポレーション、原形質体融合などのＤＮＡを細胞中に導入する他の方法も、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（２００１）に概説されたように使用することができる。次いで、酵母宿主細胞は、当業者に公知の標準技術を用いて培養することができる。
酵母宿主細胞中で異種タンパク質を発現させる他の方法は当業者に周知である。一般に、米国特許公報第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号、同６，３１２，９２３号、同６，１８３，９８５号、同６，０８３，７２３号、同６，０１７，７３１号、同５，６７４，７０６号、同５，６２９，２０３号、同５，６０２，０３４号及び同５，０８９，３９８号；米国再審査特許第ＲＥ３７，３４３号及び同ＲＥ３５，７４９号；国際公開第９９／０７８６２１号、同９８／３７２０８号及び同９８／２６０８０号；欧州特許出願ＥＰ０９４６７３６；ＥＰ０７３２４０３；ＥＰ０４８０４８０；ＥＰ０４６００７１；ＥＰ０３４０９８６；ＥＰ０３２９２０３；ＥＰ０３２４２７４及びＥＰ０１６４５５６を参照されたい。Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＯＮＩＥ ＶＡＮ ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＹＥＡＳＴ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９０）１８５：３−７も参照されたい。各々を参照により本明細書に組み込まれる。
酵母宿主系統は、当業者に周知の標準給餌バッチ発酵方法を用いて発酵槽中で増幅ステージ中に増殖させることができる。発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の差を埋め合わせる（ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ）ように改作することができる。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵は、単一グルコース給餌、複雑な窒素源（例えば、カゼイン加水分解物）及び複数のビタミン補充を必要とし得る。これに対して、メチロトローフィック酵母Ｐ．パストリスは、グリセリン、メタノール及び微量のミネラル給餌を必要とし得るが、最適な増殖及び発現には簡単なアンモニウム（窒素）塩のみを必要とし得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＨＥＭ．（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨ．ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３を参照されたい。
しかし、かかる発酵方法は、使用される酵母宿主系統とは無関係にある共通の特徴を有し得る。例えば、増殖制限栄養素、一般に炭素は、成長を最大にするために増幅時期に発酵槽に添加することができる。また、発酵方法は、一般に、炭素、窒素、基礎的な塩、リン及び他の微量栄養素（ビタミン、微量のミネラル、塩など）の適切な量を含むように設計された発酵培地を使用する。ピキアと一緒に使用するのに適切な発酵培地の例は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３２４，６３９号及び同５，２３１，１７８号に記載されている。
バキュロウイルス感染昆虫細胞 「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡ用レシピエントとして使用することができ、又は使用されている昆虫を指す。この用語は、形質移入された元の昆虫宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は偶発的若しくは意図的変異のために元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが完全に同一である必要はない。４ＨＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性によって特徴付けられるのに親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
４ＨＢポリペプチドの発現に適切な昆虫細胞の選択は当業者に周知である。ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）を含めていくつかの昆虫種は当分野で十分に記述されており、市販されている。発現用の昆虫宿主の選択においては、適切な宿主としては、とりわけ、良好な分泌能力、低タンパク質分解活性及び全体の堅牢性を有することが判明した宿主などが挙げられる。昆虫は、Ｉｎｓｅｃｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含めて、ただしこれらだけに限定されないさまざまなソースから一般に利用可能である。
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分としては、導入ベクター、通常は、バキュロウイルスゲノムと発現される異種遺伝子の挿入に好都合な制限酵素切断部位との両方を含む細菌プラスミド、導入ベクター中のバキュロウイルス特異的断片に相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを可能にする。）、適切な昆虫宿主細胞及び増殖培地などが挙げられる。ベクターの構築、細胞の形質移入、プラークの採集、細胞の培養増殖などに使用される材料、方法及び技術は当分野で公知であり、これらの技術を記載したマニュアルが利用可能である。
異種遺伝子を導入ベクターに挿入した後、ベクター及び野生型ウイルスゲノムは昆虫宿主細胞に形質移入され、そこでベクターとウイルスのゲノムが再結合する。パッケージ化された組換えウイルスは発現され、組換えプラークが確認され、精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料及び方法は、キットの形で、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＳＵＭＭＥＲＳ ＡＮＤ ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に十分に記載されている。ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（１９９５）；ＡＵＳＵＢＥＬ ＥＴ ＡＬ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １６．９−１６．１１（１９９４）；ＫＩＮＧ ＡＮＤ ＰＯＳＳＥＥ，ＴＨＥ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＳＹＳＴＥＭ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＧＵＩＤＥ（１９９２）及びＯ’ＲＥＩＬＬＹ ＥＴ ＡＬ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）も参照されたい。
実際、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いたさまざまな異種タンパク質の製造は当分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６８，８２５号、同６，３４２，２１６号、同６，３３８，８４６号、同６，２６１，８０５号、同６，２４５，５２８号、同６，２２５，０６０号、同６，１８３，９８７号、同６，１６８，９３２号、同６，１２６，９４４号、同６，０９６，３０４号、同６，０１３，４３３号、同５，９６５，３９３号、同５，９３９，２８５号、同５，８９１，６７６号、同５，８７１，９８６号、同５，８６１，２７９号、同５，８５８，３６８号、同５，８４３，７３３号、同５，７６２，９３９号、同５，７５３，２２０号、同５，６０５，８２７号、同５，５８３，０２３号、同５，５７１，７０９号、同５，５１６，６５７号、同５，２９０，６８６号、国際公開第０２／０６３０５号、同０１／９０３９０号、同０１／２７３０１号、同０１／０５９５６号、同００／５５３４５号、同００／２００３２号 同９９／５１７２１号、同９９／４５１３０号、同９９／３１２５７号、同９９／１０５１５号、同９９／０９１９３号、同９７／２６３３２号、同９６／２９４００号、同９６／２５４９６号、同９６／０６１６１号、同９５／２０６７２号、同９３／０３１７３号、同９２／１６６１９号、同９２／０３６２８号、同９２／０１８０１号、同９０／１４４２８号、同９０／１００７８号、同９０／０２５６６号、同９０／０２１８６号、同９０／０１５５６号、同８９／０１０３８号、同８９／０１０３７号、同８８／０７０８２号を参照されたい。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用であるベクターは当分野で公知であり、例えば、ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターであるバキュロウイルスオートグラファ カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現及び導入ベクターが挙げられる。この系に由来するウイルス発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現をもたらす強力なウイルス多角体遺伝子プロモーターを使用する。一般に、Ｒｅｉｌｌｙ ＥＴ ＡＬ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）を参照されたい。
外来遺伝子をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、（必要に応じて）リーダー、目的コード配列及び転写終結配列を含む上記成分は、一般に、集められて中間体置換構築体（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（導入ベクター）を構築する。中間体置換構築体は、細菌などの宿主中に安定に維持することができる染色体外要素（例えば、プラスミド）などのレプリコン中に維持されることが多い。レプリコンは、複製システムを有し、したがってクローニング及び増幅に適切な宿主中に維持することができる。より具体的には、プラスミドは、多角体ポリアデニレーションシグナル（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）、原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子並びにＥ．コリ中での選択及び増殖用複製開始点を含むことができる。
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するのに一般に使用される１種類の導入ベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多数の他のベクターは、例えば、ｐＶＬ９８５を含むようにも設計されている。ｐＶＬ９８５は、多角体開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＢａｍＨＩクローニング部位をＡＴＴから３２塩基対下流に導入する。Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１７ ＶＩＲＯＬＯＧＹ ３１（１９８９）を参照されたい。他の市販されているベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。
異種遺伝子の挿入後、導入ベクター及び野生型バキュロウイルスゲノムは、昆虫細胞宿主に同時形質移入される。異種ＤＮＡをバキュロウイルス中の所望の部位に導入する方法は、当分野で公知である。ＳＵＭＭＥＲＳ ＡＮＤ ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７：３１を参照されたい。例えば、挿入は、相同の二重交叉型組換え（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって多角体遺伝子などの遺伝子中にすることができる。挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素切断部位中にすることもできる。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１を参照されたい。
形質移入は、エレクトロポレーションによって実施することができる。ＴＲＯＴＴＥＲ ＡＮＤ ＷＯＯＤ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｉｎｇ，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照されたい。或いは、リポソームは、昆虫細胞に組換え発現ベクター及びバキュロウイルスを形質移入するのに使用することができる。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳ ＥＴ ＡＬ．，ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６及びＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４．２：２７４を参照されたい。市販リポソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。また、リン酸カルシウム形質移入を使用することができる。ＴＲＯＴＴＥＲ ＡＮＤ ＷＯＯＤ，３９ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７及びＭａｎｎ ａｎｄ Ｋｉｎｇ，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照されたい。
バキュロウイルス発現ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結びつけることができ、ｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始させることができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近くに通常は位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始点を含む。バキュロウイルスプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有することもできる。エンハンサーは、存在する場合には、通常、構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現は、調節することができ、又は恒常的とすることができる。
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子（ＦＲＩＥＳＥＮ ＥＴ ＡＬ．，Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（１９８６）；ＥＰ０１２７８３９及び同０１５５４７６）及びｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９：７６５）に由来する配列が挙げられる。
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性組換えバキュロウイルスに入れられ、続いて増殖したプラークは、当業者に公知の技術によって精製することができる。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１；ＳＵＭＭＥＲＳ ＡＮＤ ＳＭＩＴＨ，ＴＥＸＡＳ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＯＮ ＢＵＬＬＥＴＩＮ Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照されたい。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ、ネッタイシマカ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１２５）、カイコ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−８９１０）、キイロショウジョウバエ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１９６３）、ツマジロクサヨトウ及びイラクサギンウワバ用に開発された。国際公開第８９／０４６，６９９号；Ｗｒｉｇｈｔ，ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６を参照されたい。一般には、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＣＥＬＬ．ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５を参照されたい。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターシステムに使用される細胞系としては、通常、Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（ツマジロクサヨトウ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
細胞及び培地は、バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現の両方に対して市販されており、細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。
Ｅ．コリ及び他の原核生物 細菌発現技術は当分野で周知である。多種多様なベクターが細菌宿主に使用するのに利用可能である。ベクターは、単一コピー又は少数回若しくは多数回の多コピーベクターとすることができる。ベクターは、クローニング及び／又は発現に使用することができる。ベクターに関する豊富な文献、多数のベクターの市販入手性、さらにはベクターを記載したマニュアル並びにそれらの制限酵素地図及び諸特性を考慮すると、本明細書では大規模な考察は不要である。周知のとおり、ベクターは、通常、選択を可能にするマーカーを含む。このマーカーは、細胞毒性薬耐性、原栄養性又は免疫をもたらすことができる。異なる特性をもたらす複数のマーカーが存在することが多い。
細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結びつけることができ、ｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始させることができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近くに通常は位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始点を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有することもできる。オペレーターは、ＲＮＡ合成が始まる隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレーターを結びつけることができ、それによって特定の遺伝子の転写を阻害するので、オペレーターによって、ネガティブに調節された（誘導性）転写が可能になる。恒常的な発現は、オペレーターなどの負の調節要素の非存在下で起こり得る。また、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列によって実施することができる。遺伝子活性化タンパク質結合配列は、存在する場合には、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）である。これは、エシェリキア コリ（Ｅ．コリ）中でｌａｃオペロンの転写開始を助ける［Ｒａｉｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３］。したがって、調節発現は、正でも負でもよく、それによって転写を促進又は抑制することができる。
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６］、マルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。追加の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）［参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮｕｃＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ Ｐｕｂ．Ｎｏｓ．０３６７７６及び１２１７７５］などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）”Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．” Ｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｅｄ．Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８］及びＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号、これらを参照により本明細書に組み込まれる。］プロモーター系も有用なプロモーター配列を提供する。本発明の好ましい方法は、４ＨＢポリペプチドを高レベルで誘導するために、Ｔ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。かかるベクターの例は当分野で周知であり、ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ２９シリーズ及び参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０５２９７号に記載のｐＰＯＰベクターである。かかる発現系は、宿主細胞の生存又は増殖パラメータを損なわずに、宿主中で高レベルの４ＨＢポリペプチドを産生する。
また、天然にはない合成プロモーターも細菌プロモーターとして働く。例えば、１種類の細菌プロモーター又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌プロモーター又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結されて、合成ハイブリッドプロモーターを形成することができる［参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃオペロン配列の両方からなるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターであり、ｌａｃリプレッサーによって調節される［Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．（１９８３）８０：２１］。また、細菌プロモーターとしては、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結びつけ、転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然のプロモーターなどが挙げられる。非細菌起源の天然プロモーターは、原核生物において一部の遺伝子を高レベルで発現させるために、適合するＲＮＡポリメラーゼと連結させることもできる。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結プロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４］。また、ハイブリッドプロモーターは、バクテリオファージプロモーターとＥ．コリオペレーター領域からなることもできる（ＥＰ Ｐｕｂ．Ｎｏ．２６７８５１）。
機能性プロモーター配列に加えて、効率的リボソーム結合部位も原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．コリでは、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）及び開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む［Ｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６ＳｒＲＮＡの３’末端の塩基の対形成によってリボソームに対するｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．”Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ”，Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ，１９７９）］。弱いリボソーム結合部位によって真核生物遺伝子及び原核生物遺伝子を発現するために［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９］。
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡ用レシピエントとして使用することができる細菌又は使用されている細菌を含む。この用語は、形質移入された元の細菌宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は偶発的若しくは意図的変異のために元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが完全に同一である必要はない。４ＨＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性によって特徴付けられるのに親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
４ＨＢポリペプチドの発現に適切な宿主細菌の選択は当業者に周知である。発現用の細菌宿主の選択においては、適切な宿主としては、とりわけ、良好な封入体形成能力、低タンパク質分解活性及び全体の堅牢性を有することが判明した宿主などが挙げられる。細菌宿主は、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含めて、ただしこれらだけに限定されないさまざまなソースから一般に利用可能である工業／医薬の発酵は、一般に、Ｋ系統由来の細菌（例えば、Ｗ３１１０）又はＢ系統由来の細菌（例えば、ＢＬ２１）を使用する。これらの系統は、それらの増殖パラメータがきわめてよく知られており堅牢であるので特に有用である。また、これらの系統は、非病原性であり、安全及び環境上の理由のために商業的に重要である。本発明の方法の一実施形態においては、Ｅ．コリ宿主はＢＬ２１系統である。本発明の方法の別の実施形態においては、Ｅ．コリ宿主は、ＯＭＰ−及びＬＯＮ−を含めて、ただしこれらだけに限定されないプロテアーゼマイナス系統である。本発明の方法の別の実施形態においては、宿主細胞系統は、シュードモナス フルオレッセンス、シュードモナス エルジノーサ及びシュードモナス プチダを含めて、ただしこれらだけに限定されないシュードモナス種である。系統ＭＢ１０１と命名されたシュードモナス フルオレッセンス次亜種１は、Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙによる治療用タンパク質製造プロセスに宿主系統として利用可能である（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ ｄｏｗ．ｃｏｍのワールドワイドウェッブ上で利用可能）。本明細書に援用される、米国特許第４，７５５，４６５号及び同４，８５９，６００号には、ｈＧＨ産生用宿主細胞としてシュードモナス系統の使用が記載されている。
組換え宿主細胞系統が樹立された後（すなわち、発現構築体が宿主細胞に導入され、適切な発現構築体を含む宿主細胞が単離される。）、組換え宿主細胞系統は、４ＨＢポリペプチドの産生に適切な条件下で培養される。当業者には明らかなように、組換え宿主細胞系統の培養方法は、利用される発現構築体の性質及び宿主細胞のアイデンティティによって決まる。組換え宿主系統は、通常、当分野で周知の方法を用いて培養される。組換え宿主細胞は、一般に、炭素、窒素及び無機塩の同化可能源を含み、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及び当分野で周知の他のタンパク質培養サプリメントを場合によっては含んでもよい、液体培地中で培養される。宿主細胞の培養用液体培地は、発現ベクターを含む宿主細胞を選択する抗生物質を含めて、ただしこれだけに限定されない、望ましくない微生物及び／又は化合物の増殖を防止する抗生物質又は抗真菌薬を場合によっては含んでもよい。
組換え宿主細胞は、バッチ又は連続形式の（４ＨＢポリペプチドが細胞内に蓄積する場合）細胞収集又は培養上清収集によって、バッチ又は連続形式で培養することができる。原核生物宿主細胞における産生の場合には、バッチ培養と細胞収集が好ましい。
本発明の４ＨＢポリペプチドは、通常、組換えシステムにおける発現後に精製される。４ＨＢポリペプチドは、当分野で公知のさまざまな方法によって宿主細胞から精製することができる。通常、細菌宿主細胞において産生される４ＨＢポリペプチドは、（封入体の形で）難溶性又は不溶性である。本発明の一実施形態においては、組換え産生されたタンパク質の溶解性を高めるために選択されるアミノ酸置換は、本明細書に開示される方法及び当分野で公知の方法を利用して、４ＨＢポリペプチドにおいて容易に実施することができる。不溶性タンパク質の場合には、タンパク質は遠心分離によって宿主細胞溶解物から収集することができ、続いてさらに細胞を均質化することができる。難溶性タンパク質の場合には、部分可溶性タンパク質の沈殿を誘導するために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含めて、ただしこれだけに限定されない化合物を添加することができる。次いで、沈澱したタンパク質は、好都合には、遠心分離によって収集することができる。組換え宿主細胞は、当業者に周知のさまざまな方法を用いて細胞内から封入体を放出させるために分断又は均質化することができる。宿主細胞分断又は均質化は、酵素による細胞分断、超音波処理、ダウンス型均質化又は高圧放出分断（ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない周知技術を用いて実施することができる。本発明による方法の一実施形態においては、高圧放出技術は、Ｅ．コリ宿主細胞を分断して４ＨＢポリペプチドの封入体を放出させるために使用される。封入体の形の不溶性４ＨＢポリペプチドの収率は、Ｅ．コリ宿主細胞をホモジナイザーに１回通過させるだけで増加できることが見出された。４ＨＢポリペプチドの封入体を扱うときには、可溶化、機械的せん断、タンパク質分解などの要因による損失なしに封入体収率を最大にするために、反復均質化時間を最少にすることが有利である。
次いで、不溶性又は沈殿４ＨＢポリペプチドは、当分野で公知であるいくつかの適切な可溶化剤のいずれかを用いて可溶化することができる。４ＨＢポリペプチドは、ウレア又はグアニジン塩酸塩を用いて可溶化されることが好ましい。可溶化４ＨＢポリペプチド−ＢＰの体積は、都合良く操作できるバッチサイズを用いて大きいバッチを製造することができるように、最小限とすべきである。この要因は、組換え宿主を体積が数千リットルのバッチで増殖することができる大規模工業用設定において重要となり得る。また、特にヒトの薬剤用に４ＨＢポリペプチドを大規模工業用設定で製造するときには、機械及び容器又はタンパク質産物自体を損なう恐れがある不快な化学物質を回避することはできるだけ回避すべきである。穏和な変性剤ウレアは、不快な変性剤グアニジン塩酸塩の代わりに４ＨＢポリペプチド封入体を可溶化するのに使用できることが本発明による方法において示された。ウレアを使用すると、４ＨＢポリペプチド封入体を効率的に可溶化しつつ、４ＨＢポリペプチドの製造及び精製プロセスに利用されるステンレススチール装置に損傷を与えるリスクがかなり減少する。
４ＨＢポリペプチドが融合タンパク質として製造されるときには、融合配列は好ましくは除去される。融合配列の除去は、酵素又は化学切断、好ましくは酵素切断によって実施することができる。融合配列の酵素による除去は、当業者に周知の方法を用いて実施することができる。融合配列を除去するための酵素の選択は、融合のアイデンティティによって決定され、反応条件は、当業者に明白な酵素選択によって特定される。切断された４ＨＢポリペプチドは、切断された融合配列から周知の方法によって好ましくは精製される。かかる方法は、当業者に明らかなとおり、融合配列及び４ＨＢポリペプチドのアイデンティティ及び諸特性によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は透析或いはこれらの任意の組み合わせなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
４ＨＢポリペプチドは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するためにも好ましくは精製される。ＤＮＡは、沈殿、イオン交換クロマトグラフィーなどの当分野で周知の任意の適切な方法によって除去することができるが、硫酸プロタミンなど、ただしこれだけに限定されない核酸沈殿剤を用いた沈殿によって好ましくは除去される。４ＨＢポリペプチドは、遠心分離又はろ過を含めて、ただしこれらだけに限定されない周知の標準方法によって沈澱ＤＮＡから分離することができる。４ＨＢポリペプチドがヒトの治療に使用され、本発明の方法によって宿主細胞ＤＮＡが、薬剤として許容されるレベルに減少する設定においては、宿主核酸分子の除去は重要な要因である。
発酵槽、振とうフラスコ、流動層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養システム及び撹拌タンクバイオリアクターシステムを含めて、ただしこれらだけに限定されない小規模又は大規模発酵方法は、タンパク質発現においても使用することができる。これらの方法の各々は、バッチ、流加又は連続方式プロセスで実施することができる。
本発明のヒト４ＨＢポリペプチドは、一般に、当分野で標準の方法を用いて回収することができる。例えば、培地又は細胞溶解物は、細胞片を除去するために遠心分離又はろ過することができる。上清は、所望の体積に濃縮若しくは希釈し、又は適切な緩衝剤で透析ろ過して、さらなる精製用の調製物を用意することができる。本発明の４ＨＢポリペプチドのさらなる精製は、４ＨＢポリペプチド変異体の脱アミド体及び短縮体（ｃｌｉｐｐｅｄ ｆｏｒｍ）を完全体（ｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ）から分離することを含む。
以下の例示的な手順のいずれかを本発明の４ＨＢポリペプチドの精製に使用することができる：アフィニティークロマトグラフィー；（ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥの使用を含めて、ただしこれだけに限定されない）陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー；シリカ上のクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；（ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５の使用を含めて、ただしこれだけに限定されない）ゲルろ過；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属−キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫安塩析；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；（調製用等電点電気泳動を含めて、ただしこれらだけに限定されない）電気泳動手順、（硫安塩析を含めて、ただしこれらだけに限定されない）示差溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。
非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質の結合パートナーなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない本発明のタンパク質は、当業者に公知であり使用されている標準手順によって、部分的又は実質的に精製して均一にすることができる。したがって、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって回収及び精製することができる。タンパク質リフォールディング段階は、正確に折り畳まれた成熟タンパク質を作製するのに所望のとおり使用することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法は、高純度が望まれる最終精製段階に使用することができる。一実施形態においては、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むタンパク質）に対して作製される抗体は、１個以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質の親和性に基づく精製用を含めて、ただしこれだけに限定されない精製試薬として使用される。所望のとおり部分的又は均一に精製後、ポリペプチドは、これらだけに限定されないがアッセイ成分、治療、予防、診断、研究試薬及び／又は抗体産生用免疫原として、多種多様な用途に場合によっては使用することができる。
本明細書に記載の他の参考文献に加えて、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ，（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ，（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ及びＷａｌｋｅｒ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ並びにこれらの中で引用された参考文献に示された方法を含めて、ただしこれらだけに限定されないさまざまな精製／タンパク質折り畳み方法が当分野で周知である。
真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞中で非天然アミノ酸を有する目的タンパク質又はポリペプチドを製造する１つの利点は、一般に、タンパク質又はポリペプチドがそれらの本来の高次構造で折り畳まれることである。しかし、本発明のある実施形態においては、当業者は、タンパク質が、合成、発現及び／又は精製後に、関連するポリペプチドの所望の高次構造とは異なる高次構造を有することができることを認識されたい。本発明の一側面においては、発現タンパク質は、場合によっては変性され、次いで再生されてもよい。これは、目的タンパク質又はポリペプチドにシャペロニンを添加すること、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中にタンパク質を溶解すること、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知の方法を利用して実施される。
一般に、発現ポリペプチドを変性及び還元し、次いでポリペプチドを好ましい高次構造に再び折り畳むことが望ましいことがある。例えば、グアニジン、ウレア、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを目的翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元し、変性し、再生する方法は、当業者に周知である（上記参考文献及びＤｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５及びＢｕｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０を参照されたい。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ等は、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性及び還元を記述している。タンパク質は、これらだけに限定されないが酸化型グルタチオン及びＬ−アルギニンを含むレドックス緩衝剤中で再び折り畳むことができる。リフォールディング試薬は、流し、又は移動させて１個以上のポリペプチド若しくは他の発現産物と接触させることができ、その逆もまた同じである。
４ＨＢポリペプチドの原核生物による製造の場合には、かくして製造された４ＨＢポリペプチドは、誤って折り畳まれることがあり、したがって生物活性が失なわれ、又は減少する。タンパク質の生理活性は、「リフォールディング」によって回復することができる。一般に、誤って折り畳まれた４ＨＢポリペプチドは、（４ＨＢポリペプチドが不溶性である場合も）溶解し、１個以上のカオトロピック剤（例えば、ウレア及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を例えば用いて、ポリペプチド鎖をほどき、還元することによって、再び折り畳まれる。次いで、カオトロープの中程度の濃度において、酸化剤が添加され（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）、それによってジスルフィド結合が再形成される。４ＨＢポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５１１，５０２号、同４，５１１，５０３号及び同４，５１２，９２２号に記載の方法など当分野で公知の標準方法によって再び折り畳むことができる。４ＨＢポリペプチドを他のタンパク質と同時に折り畳んで（ｃｏｆｏｌｄ）ヘテロ２量体又はヘテロ多量体を形成することもできる。リフォールディング又は同時折り畳み後、４ＨＢポリペプチドは好ましくはさらに精製される。
一般的精製方法 さまざまな単離段階のいずれか１つを、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層型吸着（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、それらの任意の組み合わせ及び／又は反復並びに任意の適切な順序を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の単離段階から生成した４ＨＢポリペプチドを含む細胞溶解物又は任意の４ＨＢポリペプチド混合物に対して実施することができる。
本明細書に記載の技術を実施するのに使用される装置及び他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及び全体のシステムは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。交換マトリックス材料、媒体及び緩衝剤を含めて、ただしこれらだけに限定されないクロマトグラフィー材料もかかる会社から利用可能である。
洗浄、溶出などの本明細書に記載されたカラムクロマトグラフィープロセスにおける平衡及び他の段階は、ポンプなどの特化された装置を用いてより迅速に実施することができる。市販されているポンプとしては、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）Ｐｕｍｐ Ｐ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ Ｐ−１、Ｐｕｍｐ Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、ＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（登録商標）Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが挙げられる。撹拌機もｐＨ及び線状濃度勾配を形成するために利用可能である。市販されている撹拌機としては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｉｘｅｒ ＧＭ−１、Ｉｎ−Ｌｉｎｅ Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが挙げられる。
クロマトグラフィープロセスは、任意の市販モニターを用いてモニターすることができる。かかるモニターは、ＵＶ、ｐＨ及び伝導率のような情報を収集するために使用することができる。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（登録商標）Ｓ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−Ｍ ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ ｐＨ／Ｃ−９００、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが挙げられる。実際、システム全体が、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのさまざまなＡＫＴＡ（登録商標）システムを含めて、市販されている。
本発明の一実施形態においては、例えば、４ＨＢポリペプチドは、得られた精製４ＨＢポリペプチドをウレア中でまず変性し、続いて適切なｐＨにおいて（ＤＴＴなどの）還元剤を含むＴＲＩＳ緩衝剤に希釈することによって還元し、変性することができる。別の実施形態においては、４ＨＢポリペプチドは、約２Ｍから約９Ｍの濃度範囲のウレア中で変性され、続いて約５．０から約８．０の範囲のｐＨにおいてＴＲＩＳ緩衝剤に希釈される。次いで、この実施形態のリフォールディング混合物はインキュベートすることができる。一実施形態においては、リフォールディング混合物は室温で４から２４時間インキュベートされる。次いで、還元及び変性４ＨＢポリペプチド混合物は、さらに単離し、又は精製することができる。
本明細書に記載されるように、第１の４ＨＢポリペプチド混合物のｐＨは、任意の後続の単離段階の前に調節することができる。また、第１の４ＨＢポリペプチド混合物又はそれに続く任意のそれらの混合物は、当分野で公知の技術によって濃縮することができる。さらに、第１の４ＨＢポリペプチド混合物又はそれに続く任意のそれらの混合物を含む溶出緩衝剤は、当業者に周知の技術を用いて次の単離段階に適切な緩衝剤と交換することができる。
イオン交換クロマトグラフィー 一実施形態及び任意に選択される追加の段階においては、イオン交換クロマトグラフィーは、第１の４ＨＢポリペプチド混合物に対して実施することができる。一般には、ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照されたい。市販イオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などが挙げられる。かかるカラムは、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体及びＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、精製４ＨＢポリペプチドを実質的に単離するために、精製プロセスの任意のステージにおいて４ＨＢポリペプチドに対して実施することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー段階は、任意の適切な陽イオン交換マトリックスを用いて実施することができる。有用な陽イオン交換マトリックスとしては、繊維状、多孔質、非多孔質、微顆粒状、ビーズ状又は架橋陽イオン交換マトリックス材料などが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる陽イオン交換マトリックス材料としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、上述のいずれかの複合体などが挙げられるが、これらだけに限定されない。陽イオン交換マトリックスへの４ＨＢポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製された４ＨＢポリペプチドは、十分に高いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝剤とマトリックスを接触させて４ＨＢポリペプチドをマトリックスから移動させることによって溶出させることができる。実質的に精製された４ＨＢポリペプチドの高ｐＨ溶出に使用するのに適切な緩衝剤としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度のクエン酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ緩衝剤などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
逆相クロマトグラフィー ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコルに従って精製タンパク質に対して実施することができる。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照されたい。ＲＰ−ＨＰＬＣは、精製４ＨＢポリペプチドを実質的に単離するために４ＨＢポリペプチドに対して実施することができる。この点で、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８を含めて、ただしこれらだけに限定されない多種多様な長さのアルキル官能基を有するシリカ変性樹脂、樹脂を使用することができる。或いは、重合体樹脂を使用することができる。例えば、スチレンポリマー樹脂であるＴｏｓｏＨａａｓ Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用することができる。多種多様なアルキル鎖長を有するシアノ又は重合体樹脂も使用することができる。また、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、エタノールなどの溶媒で洗浄することができる。イオン対形成剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノールなどの有機改質剤を含む適切な溶出緩衝剤は、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから４ＨＢポリペプチドを溶出させるために使用することができる。最も一般に使用されるイオン対形成剤としては、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。溶出は、１つ以上の勾配又は無勾配条件を用いて実施することができる。分離時間を短縮し、ピーク幅を減少させるために勾配条件が好ましい。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２つの勾配の使用を含む。本発明に使用するのに適切な溶出緩衝剤の例としては、酢酸アンモニウム、アセトニトリル溶液などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を４ＨＢポリペプチドに対して実施することができる。一般には、参照により本明細書に援用されるＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照されたい。適切なＨＩＣマトリックスとしては、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリラート）マトリックスを含めてブチル、ヘキシル、オクチル、フェニル置換マトリックスなどのアルキル又はアリール置換マトリックス、ポリエチレンアミン樹脂又はブチル若しくはフェニル置換ポリ（メタクリラート）マトリックスを含めて、ただしこれらだけに限定されない混合型樹脂などが挙げられるが、これらだけに限定されない。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーの市販源としては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。手短に述べると、ＨＩＣカラムは、装填前に、酢酸／塩化ナトリウム溶液、ＨＥＰＥＳ含有硫酸アンモニウムなどの当業者に公知の標準緩衝剤を用いて平衡にすることができる。次いで、４ＨＢポリペプチドを充填後、カラムを標準緩衝剤及び条件によって洗浄して、４ＨＢポリペプチドをＨＩＣカラム上に保持しながら望ましくない材料を除去することができる。４ＨＢポリペプチドは、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡緩衝剤よりも低硫酸アンモニウム濃度とを含むＨＥＰＥＳ緩衝剤、酢酸／塩化ナトリウム緩衝剤などの標準緩衝剤の約３から約１０カラム体積で溶出させることができる。４ＨＢ分子を溶出させるために、例えばリン酸カリウム勾配を用いた漸減線状塩勾配も使用することができる。次いで、溶離剤は、例えば透析ろ過、限外ろ過などのろ過によって、濃縮することができる。透析ろ過は、４ＨＢポリペプチドの溶出に使用される塩を除去するのに利用することができる。
他の精製技術 あらゆる過剰の塩を除去し、緩衝剤を次の単離段階、さらには最終薬物生成物の処方に適切な緩衝剤で置換するために、例えば、参照により本明細書に組み込まれるゲルろ過（ＧＥＬ ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＨＰＬＣ、膨張層型吸着、限外ろ過、透析ろ過、凍結乾燥などを用いたさらに別の単離段階を第１の４ＨＢポリペプチド混合物又はそれに続く任意のそれらの混合物に対して実施することができる。実質的に精製された４ＨＢポリペプチドを含めた４ＨＢポリペプチドの収率は、本明細書に記載された各段階において当業者に公知の技術を用いてモニターすることができる。かかる技術は、最終単離段階に続いて実質的に精製された４ＨＢポリペプチドの収率を評価するのに使用することもできる。例えば、４ＨＢポリペプチドの収率は、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣなどのさまざまなアルキル鎖長を有するいくつかの逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム並びに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣのいずれかを用いてモニターすることができる。
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準技術によって、又はウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いて４ＨＢポリペプチドを測定することによって、決定することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、負の対照酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離されるタンパク質に対して産生され得る。抗体は、汚染宿主細胞タンパク質の存在を探るために使用することもできる。
追加の精製手順としては、米国特許第４，６１２，３６７号に記載されたものなどが挙げられ、また、（１）ｈＥＰＯポリペプチドを含む混合物をｐＨ約７から約９で逆相マクロ孔質アクリラートエステルコポリマー樹脂担体に塗布すること並びに（２）アセトン、アセトニトリル及びアセトンとアセトニトリルの組み合わせからなる群から選択される有機希釈剤約２０％から約８０体積％を含むｐＨ約７から約９の水系溶離剤を用いてｈＥＰＯポリペプチドを前記担体から溶出させることなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
ＥＰＯタンパク質の典型的な精製プロセスは、国際公開第９６／３５７１８号（Ｂｕｒｇ、１９９６年１１月１４日公開）に開示され、以下に説明される。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、その表面にシバクロンブルー色素が共有結合されたＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズからなる。ＥＰＯはほとんどの非タンパク質汚染物質よりも強力にＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを結びつけるので、一部のタンパク質不純物及びＰＶＡ、ＥＰＯをこの段階で濃縮することができる。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出は、塩濃度及びｐＨを増加させることによって実施することができる。このカラムは、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ８０−１００ｌで満たされ、ＮａＯＨを用いて再生され、平衡緩衝剤（塩化ナトリウム／カルシウム及び酢酸ナトリウム）を用いて平衡化される。酸性化されろ過された発酵槽上清が充填される。充填完了後、カラムは、高塩化ナトリウム濃度を含む平衡緩衝剤と類似の緩衝剤でまず洗浄され、続いてＴＲＩＳ塩基緩衝剤で洗浄される。生成物は、ＴＲＩＳ塩基緩衝剤で溶出され、基本溶出プロファイルに従って単一画分として収集される。
Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）は、脂肪族ブチル残基が共有結合されたポリスチレン系マトリックスである。ＥＰＯは、不純物及びＰＶＡの大部分よりもこのゲルにより強力に結合するので、イソプロパノールを含む緩衝剤で溶出させなければならない。このカラムは、Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ Ｃ ３０−４０ｌが充填され、ＮａＯＨで再生され、ＴＲＩＳ塩基緩衝剤で洗浄され、イソプロパノールを含むＴＲＩＳ塩基緩衝剤で平衡化される。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出物は、カラム平衡緩衝剤でイソプロパノール濃度に調節され、カラムに充填される。次いで、このカラムは、高イソプロパノール濃度の平衡緩衝剤で洗浄される。生成物は、溶出緩衝剤（高イソプロパノール含量のＴＲＩＳ塩基緩衝剤）で溶出され、基本溶出プロファイルに従って単一画分として収集される。
Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）は、機械的性質を改善するためにアガロースマトリックスに組み込まれたヒドロキシアパタイトからなる。ＥＰＯは、ヒドロキシアパタイトに対して低親和性であり、したがってタンパク質不純物よりも低いリン酸塩濃度で溶出させることができる。このカラムは、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ３０−４０ｌで満たされ、リン酸カリウム／塩化カルシウム緩衝剤及びＮａＯＨ、続いてＴＲＩＳ塩基緩衝剤で再生される。次いで、少量のイソプロパノールと塩化ナトリウムを含むＴＲＩＳ塩基緩衝剤で平衡化される。Ｂｕｔｙｌ ＴｏｙｏｐｅａｒｌクロマトグラフィーのＥＰＯ含有溶出物をカラムに充填する。続いて、カラムは、平衡緩衝剤及びイソプロパノールと塩化ナトリウムを含まないＴＲＩＳ塩基緩衝剤で洗浄される。生成物は、低濃度のリン酸カリウムを含むＴＲＩＳ塩基緩衝剤で溶出され、基本溶出プロファイルに従って単一画分として収集される。
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料Ｖｙｄａｃ Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、表面にＣ４−アルキル鎖を有するシリカゲル粒子からなる。タンパク質不純物からの４ＨＢポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度差に基づく。溶出は、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて実施される。分取用ＨＰＬＣは、（Ｖｙｄａｃ Ｃ４シリカゲル２．８から３．２リットルで満たされた）ステンレススチールカラムを用いて実施される。Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出物は、トリフルオロ酢酸を添加することによって酸性化され、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラム上に充填される。洗浄及び溶出には、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配が使用される。画分は、収集され、すぐにリン酸緩衝液で中和される。ＩＰＣ限界内の４ＨＢポリペプチド画分がプールされる。
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）材料は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ表面に共有結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなるＤＥＡＥ基への４ＨＢポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸は、保持されずにカラムを通過する。これらの物質が洗浄除去された後、微量の不純物は、カラムを低ｐＨの酢酸塩緩衝剤で洗浄することによって除去される。次いで、カラムは、中性リン酸緩衝液で洗浄され、４ＨＢポリペプチドは高イオン強度の緩衝剤で溶出される。このカラムは、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗが充填されている。カラム体積は、４ＨＢポリペプチド充填量が４ＨＢポリペプチド ３−１０ｍｇ／ｍｌゲルの範囲に確実になるように調節される。カラムは水及び平衡緩衝剤（リン酸ナトリウム／カリウム）で洗浄される。ＨＰＬＣ溶出物のプールされた画分が充填され、カラムは平衡緩衝剤で洗浄される。次いで、カラムは、洗浄緩衝剤（酢酸ナトリウム緩衝剤）で洗浄され、続いて平衡緩衝剤で洗浄される。続いて、４ＨＢポリペプチドは、溶出緩衝剤（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出され、基本溶出プロファイルに従って単一画分として収集される。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出物は、指定の伝導率に調節される。生成した薬物は、テフロンビン中に無菌ろ過され、−７０℃で保存される。
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含めて、ただしこれだけに限定されない）質量分析法及び当業者に公知の他のタンパク質分析方法を含めて、ただしこれらだけに限定されない多種多様な方法及び手順は、４ＨＢタンパク質１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸の収率及び純度を評価するのに使用することができる。
ＶＩＩＩ． 代替システムにおける発現
非組換え宿主細胞、変異誘発宿主細胞又は無細胞系中のタンパク質に非天然アミノ酸を導入するためにいくつかの戦略が使用された。これらのシステムは、本発明の４ＨＢポリペプチドの調製に使用するのにも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒなどの反応性側鎖を有するアミノ酸を誘導体化すると、リジンはＮ２−アセチル−リジンに転化される。化学合成も、非天然アミノ酸を組み込む直接の方法である。ペプチド断片の酵素的連結及び固有の化学的連結の最近の発展につれ、より大きなタンパク質を調製することが可能になった。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）を参照されたい。所望の非天然アミノ酸を用いて化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質生合成を支援することができるインビトロ抽出物に添加される一般のインビトロ生合成方法は、実質的にあらゆるサイズのさまざまなタンパク質に１００個を超える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８８（１９８９）及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照されたい。タンパク質安定性、タンパク質折り畳み、酵素機序及びシグナル伝達の研究のために、広範囲の官能基がタンパク質に導入された。
選択圧組込み（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれるインビボでの方法は、野生型シンセターゼの無差別な混合を利用するために開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ，Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照されたい。特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路が切断された栄養要求性系統は、限られた濃度の天然アミノ酸を含む最少培地中で、標的遺伝子の転写が抑制される一方で、増殖される。定常増殖相の開始時には、天然アミノ酸は使い果たされ、非天然アミノ酸アナログで置換される。組換えタンパク質の発現が誘導されると、異常アナログを含むタンパク質が蓄積される。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質に組み込まれ、ＵＶスペクトルにおいて容易に確認することができる２個の特徴的なショルダーを示す。例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照されたい。トリフルオロメチオニンは、キトオリゴ糖リガンドとのその相互作用を１９Ｆ ＮＭＲによって研究するために、バクテリオファージＴ４リゾチーム中のメチオニンを置換するのに使用された。例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）を参照されたい。トリフルオロロイシンはロイシンの代わりに組み込まれ、ロイシン−ジッパータンパク質の熱及び化学安定性が増大した。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ，Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ，Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照されたい。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニン（ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）は、Ｘ線結晶学において各相の溶解を促進するためにさまざまな組換えタンパク質に組み込まれる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｋｕｎｋｌｅ，Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ，Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ，Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ ａｎｄ Ｍ．Ｈａｔａｄａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ，Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ，Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ，Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ，Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｈｕｍｍ，Ｌ．Ｐｒａｄｅ，Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照されたい。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニンアナログも効率的に組み込まれ、化学的手段によってタンパク質をさらに修飾することができた。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎＨｅｓｔ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｓｔ，Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公報第２００２／００４２０９７号を参照されたい。
この方法の成否は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって非天然アミノ酸アナログが認識されるかどうかにかかっており、一般に、タンパク質翻訳の忠実度を保証するために高い選択性を必要とする。この方法の範囲を拡大する１つの方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの基質特異性を緩和することであり、これは限られた数の例においてしか達成されていない。例えば、エシェリキア コリフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＰｈｅＲＳ）中のＡｌａ２９４をＧｌｙで置換すると、基質結合ポケットのサイズが増大し、ｔＲＮＡＰｈｅがｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によってアシル化される。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３：７１０７（１９９４）を参照されたい。この変異体ＰｈｅＲＳを含むエシェリキア コリ系統は、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンを組み込むことができる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）及びＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．Ｋａｓｔ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照されたい。同様に、エシェリキア コリ チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合部位近くの点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒによって、アザチロシンをチロシンよりも効率的に組み込むことができることが判明した。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．Ｓｏｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照されたい。
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで組み入れる別の戦略は、校正機序を有するシンセターゼを改変することである。これらのシンセターゼは識別することができず、したがって同族天然アミノ酸に構造的に類似したアミノ酸を活性化する。このエラーは離れた部位において修正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、誤って充填されたアミノ酸をｔＲＮＡから脱アシル化する。シンセターゼの校正活性が働かない場合には、誤って活性化された構造アナログは編集機能を逃れ、組み込まれることがある。この手法は、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近実証された。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ，Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ，Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｖ．ｄｅ Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ａｎｄ Ｐ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）を参照されたい。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノ酪酸塩（Ａｂｕ）で誤ってアミノアシル化し得る。これらの非同族アミノ酸は、続いて編集ドメインによって加水分解される。エシェリキア コリ染色体の無作為変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位中に変異を有する変異体エシェリキア コリ系統が選択された。この編集に欠陥のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓを不正確に充填する。ＡｂｕはＣｙｓに立体的に類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基は、Ａｂｕでは−ＣＨ３で置換される。）、変異体ＶａｌＲＳは、この変異体エシェリキア コリ系統がＡｂｕの存在下で増殖されるときには、Ａｂｕもタンパク質に組み入れる。質量分析によれば、バリンの約２４％は、未変性タンパク質中の各バリン位置においてＡｂｕで置換されている。
固相合成及び半合成方法によっても、新規アミノ酸を含むいくつかのタンパク質の合成が可能になる。例えば、以下の刊行物及びその中の引用文献を参照されたい：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｙｒａｚｏｌｅ− ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ，８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｙｚｍｅｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ Ｂ Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
化学修飾は、補因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドを含めてさまざまな異常側鎖をタンパク質にインビトロで導入するのに使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｙｚｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，３１５３−３１５４（１９６６）及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照されたい。
或いは、化学修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成方法は、インビトロで合成されたタンパク質にいくつかの生物物理学的プローブを組み入れるのに使用されてきた。以下の刊行物及びその中の引用文献を参照されたい：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｓｃｅｎｔ ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
所望のアンバーナンセンス変異を含む遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応に、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを追加することによって、非天然アミノ酸をタンパク質にインビトロで部位特異的に組み入れることができることが以前に判明している。これらの手法を用いると、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である系統を用いて、いくつかの一般的な２０種類のアミノ酸を構造的に近い相同体で、例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ，Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５−６２（１９９５）を参照されたい。
例えば、終止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが調製された。従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質遺伝子中の目的部位に終止コドンＴＡＧを導入するのに使用された。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｎｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照されたい。アシル化サプレッサーｔＲＮＡと変異体遺伝子がインビトロでの転写／翻訳システムにおいて組み合わされるときには、指定位置にそのアミノ酸を含むタンパク質を与えるＵＡＧコドンに応じて非天然アミノ酸が組み込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験によって、所望のアミノ酸のみが、ＵＡＧコドンによって指定された位置に組み込まれ、タンパク質中の任意の他の部位に組み込まれないことが示された。例えば、Ｎｏｒｅｎ，ｅｔ ａｌ，同上；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（６）：４２５−４３２及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照されたい。
非天然アミノ酸をタンパク質に組み入れる微量注入技術も使用された。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ，Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照されたい。アフリカツメガエル卵母細胞に、インビトロで調製された２個のＲＮＡ種、すなわち、目的アミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンを有し、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡと所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡとを同時注射した。次いで、卵母細胞の翻訳機構によって、ＵＡＧによって指定された位置に非天然アミノ酸が挿入される。この方法によって、インビトロでの発現系には一般に適していない内在性膜タンパク質のインビボでの構造−機能研究が可能になった。例としては、蛍光共鳴エネルギー移動によって距離を測定するための、タキキニンニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ，Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ，Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ，Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ，Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｈ．Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ａ．Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照されたい。）、イオンチャネル中の表面露出残基を特定するためのビオチン化アミノ酸の組み込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照されたい。）、イオンチャネル中の高次構造変化を実時間でモニターするためのケージ化チロシンアナログの使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）を参照されたい。）、及びそのゲート開閉機序を探索するためのイオンチャネル骨格を変化させるアルファヒドロキシアミノ酸の使用（例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）及びＴ．Ｌｕ，Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ，Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照されたい。）が挙げられる。
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで直接組み入れる能力は、変異体タンパク質の高収率、技術的容易さ、細胞中又はことによると生物中の変異体タンパク質を研究する潜在的可能性及び治療処置におけるこれらの変異体タンパク質の使用の利点をもたらす。さまざまなサイズ、酸性度、求核性、疎水性及び他の諸特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含ませる能力によって、タンパク質機能の探索と新規特性を有する新しいタンパク質又は生物の創造との両方のために、タンパク質構造を合理的かつ系統的に操作する本発明者らの能力を大いに拡張することができる。しかし、タンパク質翻訳において高い忠実度を得るのに必要なｔＲＮＡ−シンセターゼ相互作用の性質が複雑であるので、このプロセスは困難である。
ｐａｒａ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み入れようとする際には、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼペアが、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ抵抗性、Ｐｈｅ栄養要求性エシェリキア コリ系統において使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：４１９（１９９８）を参照されたい。
無細胞（インビトロ）翻訳システムを用いて本発明の４ＨＢポリヌクレオチドの発現を得ることもできる。これらのシステムにおいては、テンプレートとしてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてＤＮＡ（インビトロ転写と翻訳の組み合わせ）を含むことができ、インビトロでの合成はリボソームによって誘導される。無細胞タンパク質発現系の開発にはかなりの努力が払われてきた。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１５３７−１５４２，（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０，（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６６，１８０−１８８，（１９９９）及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４，８６２−８６８，（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１；米国特許公報第２００２／００８１６６０号；国際公開第００／５５３５３号；同９０／０５７８５号を参照されたい。非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドの発現に適用することができる別の手法としては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術などが挙げられる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｊ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照されたい。この手法では、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１個以上のｔＲＮＡ分子が改変された場合には、非天然アミノ酸も同様にそのペプチドに組み込むことができる。最終ｍＲＮＡコドンが読まれた後に、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端を捕捉する。生成したｍＲＮＡ−ペプチド複合体がインビトロアッセイにおいて興味深い諸特性を有することが見出された場合には、そのアイデンティティは、ｍＲＮＡ配列から容易に明らかにすることができる。このようにして、所望の特性を有するポリペプチドを特定するために、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドのライブラリをスクリーニングすることができる。より最近では、非天然的にコードされたアミノ酸で置換されたペプチドの合成を可能にする精製成分を用いたインビトロでのリボソーム翻訳が報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照されたい。
ＩＸ ４ＨＢポリペプチドに結合された巨大分子ポリマー
本明細書に記載された非天然アミノ酸ポリペプチドに対するさまざまな改変は、本明細書に記載された組成物 方法、技術及び戦略を用いて実施することができる。これらの改変は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ、抗体若しくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、抑制性リボ核酸、医用材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチンアナログ、重原子を組み入れた部分、化学開裂可能な基、光開裂可能な基、長い側鎖、炭素結合糖、レドックス活性薬剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記の任意の組み合わせ又は任意の他の望ましい化合物若しくは物質を含めて、ただしこれらだけに限定されないさらなる官能基をポリペプチドの非天然アミノ酸成分上へ組み入れることを含む。本明細書に記載された組成物、方法、技術及び戦略の説明のための非限定的な例として、以下の記述は、巨大分子ポリマーを非天然アミノ酸ポリペプチドに付加することに焦点を合わせる。本明細書に記載される組成物、方法、技術及び戦略は、上記の官能基を含めて、ただしこれらだけに限定されない他の官能基を付加するためにも（必要に応じ、かつ当業者が本明細書の開示によって成し得る適切な改変によって）適用できることを理解されたい。
多種多様な巨大分子ポリマー及び他の分子は、４ＨＢポリペプチドの生物学的諸特性の調整及び／又は４ＨＢ分子への新しい生物学的諸特性の付与のために、本発明の４ＨＢポリペプチドに連結することができる。これらの巨大分子ポリマーは、天然にコードされたアミノ酸、非天然的にコードされたアミノ酸、天然若しくは非天然アミノ酸の任意の機能的置換基又は天然若しくは非天然アミノ酸に付加された任意の置換基若しくは官能基を介して、４ＨＢポリペプチドに連結することができる。
本発明は、実質的に同質であるポリマー：タンパク質複合体調製物を提供する。本明細書では「実質的に同質」とは、ポリマー：タンパク質複合体分子が総タンパク質の半分よりも多いと認められることを意味する。ポリマー：タンパク質複合体は生物活性を有し、本明細書に記載の「実質的に同質」であるＰＥＧ化４ＨＢポリペプチド調製物は、同質調製物の利点、例えば、ロットごとの薬物動態学の予測性における臨床応用の容易性を示すのに十分同質である調製物である。
ポリマー：タンパク質複合体分子の混合物を調製するようにしてもよい。本明細書において提供される利点は、モノポリマー：タンパク質複合体の比率を、混合物に含むように選択できることである。したがって、必要に応じて、さまざまなタンパク質とさまざまな数の結合ポリマー部分（すなわち、ジ、トリ、テトラなど）との混合物を調製することができ、前記複合体を、本発明の方法によって調製されたモノポリマー：タンパク質複合体と組み合わせることができ、所定の比率のモノポリマー：タンパク質複合体を含む混合物を有することができる。
選択されたポリマーは、それが結合したタンパク質が生理学的環境などの水系環境において沈殿しないように、水溶性とすることができる。ポリマーは、分枝状でも非分枝状でもよい。最終生成調製物を治療に使用するために、ポリマーは薬剤として許容されるものであることが好ましい。
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子の比率は変動し、反応混合物中のそれらの濃度も変動する。一般に、（過剰の未反応タンパク質又はポリマーが最少となる反応効率の点での）最適比は、選択されたポリエチレングリコールの分子量及び利用可能な反応性基の数によって決定することができる。分子量に関しては、一般に、ポリマー分子量が高いほど、タンパク質に結合することができるポリマー分子数は少ない。同様に、これらのパラメータを最適化するときには、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）ポリマー：タンパク質比は高くなる。
本明細書では、ＰＥＧ：４ＨＢポリペプチド複合体を企図するときには、「治療有効量」という用語は、患者に利するヘマトクリットの増加をもたらす量を指す。この量は、個体ごとに変動し、患者の全体的体調及び貧血の根本的原因を含めていくつかの要因に左右される。例えば、慢性腎不全患者の４ＨＢポリペプチドの治療有効量は、週３回５０から１５０単位／ｋｇである。治療に使用される４ＨＢポリペプチド量は、許容されるヘマトクリット増加率を与え、ヘマトクリットを有益なレベル（通常は少なくとも約３０％、一般には３０％から３６％の範囲）に維持する。本組成物の治療有効量は、公的に利用可能な材料及び手順を用いて当業者が容易に確認することができる。
水溶性ポリマーは、線状、叉状又は分枝状を含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の構造的形状とすることができる。一般に、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーを使用することもできる。例として、ＰＥＧは、本発明のある実施形態の記述に使用される。
ＰＥＧは、市販されている、又は当分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる、周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８−１６１）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズ又はＰＥＧ末端の改変にかかわらず広義に使用されてあらゆるポリエチレングリコール分子を包含し、次式によって４ＨＢポリペプチドに連結されて表すことができる。
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
式中、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨ又はＣ１−４アルキルを含めて、ただしこれだけに限定されない末端改変である。
本発明に使用されるＰＥＧは、一端がヒドロキシ又はメトキシで終結している。すなわち、ＸはＨ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。或いは、ＰＥＧは反応性基で終結し、それによって二官能性ポリマーを形成することができる。典型的な反応性基としては、（マレイミド基、（ｐ−ニトロフェニルエステルを含めて、ただしこれだけに限定されない）活性カルボナート、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含めて、ただしこれらだけに限定されない）活性エステル及びアルデヒドを含めて、ただしこれらだけに限定されない）２０種類の一般的アミノ酸中に存在する官能基、（アジド基、アルキン基を含めて、ただしこれらだけに限定されない）２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが、非天然的にコードされたアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基との反応に一般に使用される反応性基などが挙げられる。上式でＹで示されるＰＥＧの他の末端は、天然又は非天然的にコードされたアミノ酸を介して４ＨＢポリペプチドに直接的又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドの（リジンのイプシロンアミン又はＮ末端を含めて、ただしこれらだけに限定されない）アミン基に対するアミド、カルバメート又はウレア結合とすることができる。或いは、Ｙは、（システインのチオール基を含めて、ただしこれだけに限定されない）チオール基に対するマレイミド結合とすることができる。或いは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸によって一般には利用できない残基との結合とすることができる。例えば、ＰＥＧ上のアジド基は、４ＨＢポリペプチド上のアルキン基と反応してＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加生成物を形成することができる。或いは、ＰＥＧ上のアルキン基は、非天然的にコードされたアミノ酸中に存在するアジド基と反応して類似の生成物を形成することができる。一部の実施形態においては、（ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含めて、ただしこれらだけに限定されない）強力な求核試薬は、非天然的にコードされたアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応して、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成することができる。該当する場合には、適切な還元剤で処理することによってさらに還元できる場合がある。或いは、強力な求核試薬は、非天然的にコードされたアミノ酸を介して４ＨＢポリペプチドに組み入れることができ、水溶性ポリマー中に存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させるために使用することができる。
（時折の０．１−５０ｋＤａ又は１０−４０ｋＤａを含めて、ただしこれらだけに限定されない）所望のとおりの約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ以上を含めて、ただしこれらだけに限定されないあらゆる分子量のＰＥＧを実際の所望のとおりに使用することができる。各鎖が（１−５０ｋＤａ又は５−２０ｋＤａを含めて、ただしこれらだけに限定されない）１−１００ｋＤａのＭＷを有するＰＥＧ分子を含めて、ただしこれらだけに限定されない分枝鎖ＰＥＧも使用することができる。広範囲のＰＥＧ分子が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログを含めて、ただしこれらだけに限定されないカタログに記載されている。
一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも１個の末端は、非天然的にコードされたアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応用にアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体は、本明細書に記載された非天然的にコードされたアミノ酸にＰＥＧを結合させるのに使用することができる。非天然的にコードされたアミノ酸がアジドを含む場合には、ＰＥＧは、一般に、［３＋２］環付加生成物の形成をもたらすアルキン部分又はアミド結合の形成をもたらすホスフィン基を含む活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カルボナート）を含む。或いは、非天然的にコードされたアミノ酸がアルキンを含む場合には、ＰＥＧは、一般に、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ環付加生成物の形成をもたらすアジド部分を含む。非天然的にコードされたアミノ酸がカルボニル基を含む場合には、ＰＥＧは、一般に、（ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基を含めて、ただしこれらだけに限定されない）強力な求核試薬を、それぞれ対応するヒドラゾン、オキシム及びセミカルバゾン結合の形成をもたらすために含む。別の選択肢においては、上記反応性基の方向の逆を使用することができる。すなわち、非天然的にコードされたアミノ酸中のアジド部分は、アルキンを含むＰＥＧ誘導体と反応させることができる。
一部の実施形態においては、ＰＥＧ誘導体を含む４ＨＢポリペプチド変異体は、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応しやすい化学官能基を含む。
本発明は、一部の実施形態においては、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含む、アジド含有ポリマー誘導体及びアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）とすることができる。しかし、ポリ（エチレン）グリコールを含めて、ただしこれだけに限定されない多種多様な水溶性ポリマー並びにポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）を含めた他の関係するポリマーも、本発明の実施において使用するのに適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語はかかる分子すべてを包含し、含むものであることを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、二官能性ＰＥＧ、複数の手を有する（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ）ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、叉状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（すなわちポリマー骨格に懸垂した１個以上の官能基を有するＰＥＧ又は関係するポリマー）又は分子中に分解性結合を有するＰＥＧを含めて、その形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）を含むが、これらだけに限定されない。
ＰＥＧは、一般に、透明、無色、無臭、水溶性で、熱に対して安定であり、多数の化学薬品に対して不活性であり、加水分解されず、又は劣化せず、一般に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性であると考えられる。すなわち、ＰＥＧは、害を及ぼさずに生組織又は生物と共存することができる。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性である。すなわち、ＰＥＧは、体内で免疫応答を生じる傾向にはない。ＰＥＧは、生物活性剤など体内である望ましい機能を有する分子に結合すると、その剤をマスクする傾向にあり、あらゆる免疫応答を軽減又は排除することができ、その結果、生物は、その剤の存在に寛容になり得る。ＰＥＧ複合体は、実質的な免疫応答を生じる傾向にはなく、又は凝固若しくは他の望ましくない効果を起こす傾向にはない。式−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（式中、ｎは約３から約４０００であり、一般に約２０から約２０００である。）を有するＰＥＧは、本発明における使用に適切である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明の一部の実施形態においてはポリマー骨格として特に有用である。
ポリマー骨格は線状でも分枝状でもよい。分枝ポリマー骨格は、一般に当分野で公知である。一般に、分枝ポリマーは、中心の枝の核部分と、中心の枝の核部分に連結された複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、一般に、グリセリン、グリセリンオリゴマー、ペンタエリスリトール、ソルビトールなどのさまざまなポリオールにエチレンオキシドを付加することによって調製することができる分枝形態で使用される。中心の枝部分は、リジンなどのいくつかのアミノ酸から誘導することもできる。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセリン、グリセリンオリゴマー、ペンタエリスリトールなどの核部分から誘導され、ｍは腕の数である。）の一般的形態で表すことができる。その各々を参照によりその全体を本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号 同５，６４３，５７５号、同５，２２９，４９０号、同４，２８９，８７２号、米国特許出願第２００３／０１４３５９６号、国際公開第９６／２１４６９号及び国際公開第９３／２１２５９号に記載のものなど複数の手を有するＰＥＧ分子もポリマー骨格として使用することができる。
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは連結基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨに連結された活性末端基である。）で表される叉状ＰＥＧの形とすることもできる。
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応性基を有する。
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中に弱い結合又は分解性結合を有するポリマーも調製することができる。例えば、ポリマー骨格中に加水分解されやすいエステル結合を有するＰＥＧを調製することができる。以下に示すように、この加水分解によって、ポリマーは低分子量の断片に切断される。
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ− ＋ Ｈ２Ｏ → ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ ＋ ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語は、本明細書に開示するものを含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知のすべての形態を表し、又は含むことを当業者は理解されたい。
多数の他のポリマーも本発明における使用に適切である。一部の実施形態においては、２から約３００個の末端を有し、水溶性であるポリマー骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、（エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含めて、ただしこれだけに限定されない）そのコポリマー、そのターポリマー、その混合物などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変動し得るが、一般に、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲であり、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲であることが多い。
当業者は、実質的に水溶性である骨格の上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に説明のためのものであって、上記性質を有するすべての高分子材料が本発明における使用に適切であると企図されることを認識されたい。
本発明の一部の実施形態においては、ポリマー誘導体は「多官能」であり、ポリマー骨格は、少なくとも２個の末端を有し、ことによると約３００個もの末端を有し、官能基で官能化又は活性化されていることを意味する。多官能ポリマー誘導体としては、同じでも異なっていてもよい官能基に各末端が結合した２個の末端を有する線状ポリマーなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
一実施形態においては、ポリマー誘導体は以下の構造を有する。
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり、
Ｂは連結部分であり、存在してもしなくてもよく、
ＰＯＬＹは水溶性非抗原性ポリマーであり、
Ａは連結部分であり、存在してもしなくてもよく、Ｂと同じでも異なっていてもよく、
Ｘは第２の官能基である。
Ａ及びＢの連結部分の例としては、最高１８個、より好ましくは１−１０個の炭素原子を含む多官能アルキル基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖と一緒に含むことができる。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分岐していてもよい。Ａ及びＢの連結部分の他の例としては、最高１０個、より好ましくは５−６個の炭素原子を含む多官能アリール基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。アリール基は、もう１個の炭素原子、窒素、酸素又は硫黄原子で置換されていてもよい。適切な連結基の他の例としては、その各々を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号、同５，６４３，５７５号及び米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号に記載の連結基が挙げられる。当業者は、連結部分の上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に説明のためのものであって、上記性質を有するすべての連結部分が本発明における使用に適切であると企図されることを認識されたい。
Ｘとして使用するのに適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステルなどの活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、１−ベンゾトリアゾリルカルボナートなどの活性カルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルケン、ケトン、アジドなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。当業者には理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないようにアジド基と共存できるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性（第２の官能基（すなわちＸ）もアジド部分であることを意味する。）でもヘテロ二官能性（第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。）でもよい。
「保護された」という用語は、ある反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応性基のタイプに応じて変わる。例えば、化学反応性基がアミン又はヒドラジドである場合には、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択することができる。化学反応性基がチオールである場合には、保護基は、オルトピリジルジスルフィドとすることができる。化学反応性基が、ブタン酸、プロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合には、保護基は、ベンジル又はメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基とすることができる。本発明においては、当分野で公知の他の保護基も使用することができる。
文献中の末端官能基の具体例としては、Ｎ−スクシンイミジルカルボナート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同５，４６８，４７８号を参照されたい。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）を参照されたい。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚ ｅｔ ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照されたい。）、スクシンイミジルプロピオナート及びスクシンイミジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １７０−１８１，Ｈａｒｒｉｓ ＆ Ｚａｐｌｉｐｓｋｙ Ｅｄｓ．，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９７を参照されたい。米国特許第５，６７２，６６２号も参照されたい。）、スクシンイミジルスクシナート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照されたい。、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号を参照されたい。）、ベンゾトリアゾールカルボナート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照されたい。、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１（１９８５）を参照されたい。）、ｐ−ニトロフェニルカルボナート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）及びＳａｒｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照されたい。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、同５，２５２，７１４号を参照されたい。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２：２９（１９８４））及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照されたい。）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照されたい。）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照されたい。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照されたい。）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。上記参考文献及び特許のすべてを参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のある実施形態においては、本発明のポリマー誘導体は以下の構造を有するポリマー骨格を含む。
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中、
Ｘは上述の官能基であり、
ｎは約２０から約４０００である。
別の実施形態においては、本発明のポリマー誘導体は、以下の構造を有するポリマー骨格を含む。
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中、
Ｗは、１−１０個の炭素原子を含む脂肪族又は芳香族リンカー部分であり、
ｎは約２０から約４０００であり、
Ｘは上述の官能基である。ｍは１から１０である。
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当分野で公知のさまざまな方法及び／又は本明細書に開示されるさまざまな方法によって調製することができる。以下に示す１つの方法においては、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、第１の官能基に結合した第１の末端と適切な脱離基に結合した第２の末端とを有する水溶性ポリマー骨格は、（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどを含めて、いくつかの適切なカウンターイオンのいずれかと対にすることができる）アジドアニオンと反応する。脱離基は求核置換を起こし、アジド部分で置換され、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーを与える。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ ＋ Ｎ３ −− → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示したように、本発明に使用するのに適切なポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有する。ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ケトンなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。適切な脱離基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート、トシラートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体を調製する別の方法においては、アジド官能基を有する連結剤は、平均分子量約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの水溶性ポリマー骨格と接触する。ここで、連結剤は、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応してアジド含有ポリマー誘導体生成物を形成する化学官能基を有する。ここで、アジドは、連結基によってポリマー骨格から分離されている。
例示的な反応スキームを以下に示す。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ ＋ Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ → ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアルコキシなどのキャッピング基又は上述の官能基であり、
Ｍは、アジド官能基と反応しないがＮ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。
適切な官能基の例としては、Ｎがアミンである場合にはＭがカルボン酸、カルボナート又は活性エステルであり、Ｎがヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合にはＭはケトンであり、Ｎが求核試薬である場合にはＭは脱離基である例などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
粗生成物の精製は、生成物の沈殿と必要に応じてそれに続くクロマトグラフィーを含めて、ただしこれらだけに限定されない公知の方法によって実施することができる。
ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を以下に示す。この場合には、アミンの一方がｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分で保護され、生成した、一方が保護されたＰＥＧジアミンは、アジド官能基を有する連結部分と反応する。
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２ ＋ ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この場合には、アミン基は、塩化チオニル又はカルボジイミド試薬及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのさまざまな活性化剤を用いてカルボン酸基と結合して、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を形成することができる。アミド結合が正常に形成された後に、生成したＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護アジド含有誘導体は、生理活性分子を改変するのに直接使用することができ、又は他の有用である官能基を設けるためにさらに手を加えることができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は強酸で処理することによって加水分解してオメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成することができる。生成したアミンは、貴重なヘテロ二官能性試薬を生成するために、マレイミド基、活性ジスルフィド、活性エステルなどの他の有用な官能基を設ける合成ハンドルとして使用することができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたいときに特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、アルデヒド、ケトン、活性エステル、活性カルボナートなどの活性求電子基を有する分子をＰＥＧの一端に結合させ、アセチレン基を有する分子をＰＥＧのもう一端に結合させることができる。
本発明の別の実施形態においては、ポリマー誘導体は以下の構造を有する。
Ｘ−−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
式中、
Ｒは、Ｈ又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリール若しくは置換アリール基とすることができ、
Ｂは連結部分であり、存在しても存在しなくてもよく、
ＰＯＬＹは水溶性非抗原性ポリマーであり、
Ａは連結部分であり、存在してもしなくてもよく、Ｂと同じでも異なっていてもよく、
Ｘは第２の官能基である。
Ａ及びＢの連結部分の例としては、最高１８個、より好ましくは１−１０個の炭素原子を含む多官能アルキル基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子をアルキル鎖と一緒に含むことができる。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分岐していてもよい。Ａ及びＢの連結部分の他の例としては、最高１０個、より好ましくは５−６個の炭素原子を含む多官能アリール基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。アリール基は、もう１個の炭素原子、窒素、酸素又は硫黄原子で置換されていてもよい。適切な連結基の他の例としては、その各々を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号及び同５，６４３，５７５号並びに米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号に記載の連結基が挙げられる。当業者は、連結部分の上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に説明のためのものであって、上記性質を有する多種多様な連結部分が本発明において有用であると企図されることを認識されたい。
Ｘとして使用するのに適切な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステルなどの活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、１−ベンゾトリアゾリルカルボナートなどの活性カルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルケン、ケトン、アセチレンが挙げられる。選択されたＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないようにアセチレン基と共存できるべきであることを理解されたい。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性（第２の官能基（すなわちＸ）もアセチレン部分であることを意味する。）でもヘテロ二官能性（第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。）でもよい。
本発明の別の実施形態においては、ポリマー誘導体は、以下の構造を有するポリマー骨格を含む。
Ｘ−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
式中、
Ｘは上述の官能基であり、
ｎは約２０から約４０００であり、
ｍは１から１０である。
ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーの各々の具体例を以下に示す。
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知の方法及び／又は本明細書に開示する方法によって調製することができる１つの方法においては、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、第１の官能基に結合した第１の末端と適切な求核性基に結合した第２の末端とを有する水溶性ポリマー骨格は、アセチレン官能基と、ＰＥＧ上の求核性基との反応に適切である脱離基との両方を有する化合物と反応する。求核性部分を有するＰＥＧポリマーと脱離基を有する分子とが混合されると、脱離基は求核置換を起こし、求核性部分で置換され、所望のアセチレン含有ポリマーを与える。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ ＋ Ｌ−Ａ−Ｃ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示したように、この反応に使用するのに好ましいポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕを有する。ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核性部分であり、ＸはＮｕ、Ｌ又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。
Ｎｕの例としては、主としてＳＮ２型機構によって反応する、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシラート、ヒドラジド、アミノキシ基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。Ｎｕ基の別の例としては、主として求核付加反応によって反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシラート、トシラート及び求核置換を起こすと考えられる他の基並びにケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カルボナート及び求核試薬による付加を起こすと考えられる他の求電子基が挙げられる。
本発明の別の実施形態においては、Ａは、１−１０個の炭素原子の脂肪族リンカー又は６−１４個の炭素原子の置換アリール環である。Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体を調製する別の方法においては、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、一端に保護された官能基又はキャッピング剤、もう一端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーをアセチレンアニオンと接触させる。
例示的な反応スキームを以下に示す。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ ＋ −Ｃ≡ＣＲ’ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡−ＣＲ’
式中、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアルコキシなどのキャッピング基又は上述の官能基であり、
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリール若しくはアリールオキシ基又は置換アルキル、アルコキシル、アリール若しくはアリールオキシ基である。
上記例においては、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレンアニオンと接触したときにＳＮ２型置換を起こすのに十分な反応性を有するべきである。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換を実施するのに必要な反応条件は当分野で周知である。
粗生成物の精製は、通常、生成物の沈殿と必要に応じてそれに続くクロマトグラフィーを含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知の方法によって実施することができる。
水溶性ポリマーは、本発明の４ＨＢポリペプチドに連結することができる。水溶性ポリマーは、４ＨＢポリペプチド中に組み込まれた非天然的にコードされたアミノ酸、又は非天然的にコードされたアミノ酸若しくは天然にコードされたアミノ酸の任意の官能基若しくは置換基、又は非天然的にコードされたアミノ酸若しくは天然にコードされたアミノ酸に付加された任意の官能基若しくは置換基を介して連結することができる。或いは、水溶性ポリマーは、（システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基を含めて、ただしこれらだけに限定されない）天然アミノ酸を介して、非天然的にコードされたアミノ酸を組み込んだ４ＨＢポリペプチドと連結される。本発明の４ＨＢポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の非天然アミノ酸を含む場合もある。ここで、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸は（ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖を含めて、ただしこれらだけに限定されない）水溶性ポリマーに連結されている。本発明の４ＨＢポリペプチドは、さらに、水溶性ポリマーに連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の天然にコードされたアミノ酸を含む場合もある。本発明の４ＨＢポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸と水溶性ポリマーに連結された１個以上の天然のアミノ酸とを含む場合もある。一部の実施形態においては、本発明において使用される水溶性ポリマーは、非複合形態よりも４ＨＢポリペプチドの血清半減期が長くなる。
本発明の４ＨＢポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）は、インビボでの半減期などの薬理的、薬物動態学的又は薬力学的特性を変更（増加又は減少を含めて、ただしこれらだけに限定されない。）するために調節することができる一部の実施形態においては、４ＨＢの半減期は、未改変ポリペプチドの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍増加する。
強力な求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含むＰＥＧ誘導体
本発明の一実施形態においては、カルボニルを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に直接連結された末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。
一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。
一部の実施形態においては、ヒドラジン又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造式を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在してもしなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）でもよい。
一部の実施形態においては、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。
本発明の別の実施形態においては、カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に連結された末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。
一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。
一部の実施形態においては、ヒドラジン又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造式を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在してもしなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）でもよい。
一部の実施形態においては、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。
本発明の別の実施形態においては、カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて改変され、分枝ＰＥＧの各鎖は、１０−４０ｋＤａ、より好ましくは５−２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。
本発明の別の実施形態においては、非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体を用いて改変される。例えば、一部の実施形態においては、ヒドラジン又はヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在してもしなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）でもよい。
一部の実施形態においては、セミカルバジド基を含むＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、場合によっては、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）でも存在しなくてもよく、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。
一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン基を含むＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、場合によっては、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）でも存在しなくてもよく、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。
水溶性ポリマーが４ＨＢポリペプチドに連結される程度及び部位によって、サイト１における４ＨＢポリペプチド受容体への４ＨＢポリペプチドの結合を調整することができる。一部の実施形態においては、結合は、４ＨＢポリペプチドがサイト１における４ＨＢポリペプチド受容体を、ｈＧＨの場合にはＳｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：７８６２−７８６７（１９８８）に記載のものなどの平衡結合アッセイで測定して約４００ｎＭ以下のＫｄ、１５０ｎＭ以下のＫｄ及びある場合には１００ｎＭ以下のＫｄで結びつけるように配列している。
ポリマーの活性化及びペプチドの連結の方法及び化学反応は、文献に記載されており、当分野で公知である。ポリマーを活性化するために一般に使用される方法としては、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンを用いた官能基の活性化などが挙げられるが、これらだけに限定されない（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１），ＰＲＯＴＥＩＮ ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＡＴＩＯＮ．ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２），ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＬＩＧＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照されたい。）。
ＰＥＧの官能化及び連結についてのいくつかの総説及びモノグラフが利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照されたい。
ポリマーを活性化する方法は、国際公開第９４／１７０３９号、米国特許第５，３２４，８４４号、国際公開第９４／１８２４７号、国際公開第９４／０４１９３号、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、国際公開第９０／１３５４０号、米国特許第５，２８１，６９８号及び国際公開第９３／１５１８９号にも記載されている。活性化ポリマーと凝固第ＶＩＩＩ因子（国際公開第９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ａｔ ａｌ．，Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５））を含めて、ただしこれらだけに限定されない酵素とを連結する方法も記載されている。引用したすべての参考文献及び特許を参照により本明細書に組み込まれる。
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、任意の好都合な方法によって実施することができる。例えば、４ＨＢポリペプチドは、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体を用いてＰＥＧ化される。手短に述べると、過剰の固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨを、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ含有４ＨＢポリペプチド水溶液に撹拌しながら室温で添加する。一般に、この水溶液は、反応が実施されるｐＨ（一般に約ｐＨ４−１０）近くのｐＫａを有する緩衝剤で緩衝される。ｐＨ７．５におけるＰＥＧ化に適切な緩衝剤の例としては、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられるが、これらだけに限定されない。ｐＨは連続してモニターされ、必要に応じて調節される。この反応は、一般に約１−４８時間継続される。
続いて、反応生成物は、ＰＥＧ化４ＨＢポリペプチド変異体を、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及びＰＥＧ化４ＨＢポリペプチドの任意の高分子量複合体から分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供される。ＰＥＧ化４ＨＢポリペプチドの任意の高分子量複合体は、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端において活性化され、それによって４ＨＢポリペプチド変異体分子を架橋したときに形成され得る。疎水性相互作用クロマトグラフィー中の条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨはカラムを通過するが、任意の架橋ＰＥＧ化４ＨＢポリペプチド変異体複合体は、１個以上のＰＥＧ基に連結された１個の４ＨＢポリペプチド変異体分子を含む所望の形態の後に溶出するものである。適切な条件は、所望の複合体に対する架橋複合体の相対サイズに応じて変動し、当業者によって容易に決定される。所望の複合体を含む溶離剤は、限外ろ過によって濃縮され、透析ろ過によって脱塩される。
必要に応じて、疎水性クロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化４ＨＢポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー；（ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥの使用を含めて、ただしこれだけに限定されない）陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー；シリカ上のクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；（ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５の使用を含めて、ただしこれだけに限定されない）ゲルろ過；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属−キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫安塩析；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；（調製用等電点電気泳動を含めて、ただしこれだけに限定されない）電気泳動手順、（硫安塩析を含めて、ただしこれだけに限定されない）示差溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）又は抽出を含めて、ただしこれらだけに限定されない当業者に公知の１つ以上の手順によってさらに精製することができる。見掛け分子量は、ＧＰＣによって球状タンパク質標準と比較して推定することができる（ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ ＆ Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９，２９３−３０６）。４ＨＢ−ＰＥＧ複合体の純度は、（トリプシン切断を含めて、ただしこれだけに限定されない）タンパク質分解とそれに続く質量分析法によって評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
本発明の４ＨＢポリペプチドのアミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、制限なくさらに誘導体化又は置換することができる。
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態においては、４ＨＢポリペプチドは、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａの平均分子量を有し、一部の実施形態においては１０−４０ｋＤａの平均分子量を有する。
一部の実施形態においては、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。
別の実施形態においては、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。
本発明の別の実施形態においては、アルキン含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、末端アジド部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて改変され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０−４０ｋＤａ、より好ましくは５−２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。例えば、一部の実施形態においては、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、Ｘは、場合によっては、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）でもよく、各場合において存在してもしなくてもよい。
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態においては、４ＨＢポリペプチドは、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。
一部の実施形態においては、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。
本発明の別の実施形態においては、アルキンを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に連結された末端アジド又は末端アルキン部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。
一部の実施形態においては、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。
本発明の別の実施形態においては、アジド含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、末端アルキン部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて改変され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０−４０ｋＤａ、より好ましくは５−２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する。例えば、一部の実施形態においては、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、Ｘは、場合によっては、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）でもよく、存在しなくてもよい。
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態においては、４ＨＢポリペプチドは、非天然的にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む、（エステル、カルボナートを含めて、ただしこれらだけに限定されない）活性官能基を含むＰＥＧ誘導体を用いて改変される。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａの平均分子量を有し、一部の実施形態においては１０−４０ｋＤａの平均分子量を有する。
一部の実施形態においては、ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
Figure 2007519422
式中、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、Ｎ、Ｓでも存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。
一部の実施形態においては、ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
Figure 2007519422
式中、ＸはＯ、Ｎ、Ｓでも存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリール基とすることができる。例示的なＲ基としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮ、−ＮＯ２などが挙げられるが、これらだけに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””は、各々独立に、水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、１−３個のハロゲンで置換されたアリールを含めて、ただしこれらだけに限定されない置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が１個を超えるＲ基を含むときには、例えば、Ｒ基の各々は、各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””基がこれらの基の１個を超える基が存在するときに選択されるように、独立に選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に結合しているときには、それらは窒素原子と組み合わせて５、６又は７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、これらだけに限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、当業者は、「アルキル」という用語は、（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含めて、ただしこれらだけに限定されない）ハロアルキル、（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）アシルなどの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むものであることを理解されたい。
他のＰＥＧ誘導体及び一般的ＰＥＧ化技術
４ＨＢポリペプチドに連結することができる他の例示的なＰＥＧ分子及びＰＥＧ化方法としては、例えば、米国特許公報第２００４／０００１８３８号、同２００２／００５２００９号、同２００３／０１６２９４９号、同２００４／００１３６３７号、同２００３／０２２８２７４号、同２００３／０２２０４４７号、同２００３／０１５８３３３号、同２００３／０１４３５９６号、同２００３／０１１４６４７号、同２００３／０１０５２７５号、同２００３／０１０５２２４号、同２００３／００２３０２３号、同２００２／０１５６０４７号、同２００２／００９９１３３号、同２００２／００８６９３９号、同２００２／００８２３４５号、同２００２／００７２５７３号、同２００２／００５２４３０号、同２００２／００４００７６号、同２００２／００３７９４９号、同２００２／０００２２５０号、同２００１／００５６１７１号、同２００１／００４４５２６号、同２００１／００２７２１７号、同２００１／００２１７６３号、米国特許第６，６４６，１１０号、同５，８２４，７７８号、同５，４７６，６５３号、同５，２１９，５６４号、同５，６２９，３８４号、同５，７３６，６２５号、同４，９０２，５０２号、同５，２８１，６９８号、同５，１２２，６１４号、同５，４７３，０３４号、同５，５１６，６７３号、同５，３８２，６５７号、同６，５５２，１６７号、同６，６１０，２８１号、同６，５１５，１００号、同６，４６１，６０３号、同６，４３６，３８６号、同６，２１４，９６６号、同５，９９０，２３７号、同５，９００，４６１号、同５，７３９，２０８号、同５，６７２，６６２号、同５，４４６，０９０号、同５，８０８，０９６号、同５，６１２，４６０号、同５，３２４，８４４号、同５，２５２，７１４号、同６，４２０，３３９号、同６，２０１，０７２号、同６，４５１，３４６号、同６，３０６，８２１号、同５，５５９，２１３号、同５，６１２，４６０号、同５，７４７，６４６号、同５，８３４，５９４号、同５，８４９，８６０号、同５，９８０，９４８号、同６，００４，５７３号、同６，１２９，９１２号、国際公開第９７／３２６０７号、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、国際公開第９２／１６５５５号、同９４／０４１９３号、同９４／１４７５８号、同９４／１７０３９号、同９４／１８２４７号、同９４／２８０２４号、同９５／００１６２号、同９５／１１９２４号、同９５／１３０９０号、同９５／３３４９０号、同９６／０００８０号、同９７／１８８３２号、同９８／４１５６２号、同９８／４８８３７号、同９９／３２１３４号、同９９／３２１３９号、同９９／３２１４０号、同９６／４０７９１号、同９８／３２４６６号、同９５／０６０５８号、ＥＰ４３９５０８号、国際公開第９７／０３１０６号、同９６／２１４６９号、同９５／１３３１２号、ＥＰ９２１１３１、国際公開第９８／０５３６３号、ＥＰ８０９９９６、国際公開第９６／４１８１３号、国際公開第９６／０７６７０号、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６に記載のものなどが挙げられる。本明細書に記載されたＰＥＧ分子のいずれも、単鎖、分枝鎖、複数の手を有する鎖、単官能、二官能、多官能又はこれらの任意の組み合わせを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の形態で使用することができる。
血清アルブミンに対する親和性の増大
４ＨＢポリペプチドの血清中の半減期を調整するために、さまざまな分子を本発明の４ＨＢポリペプチドと融合させることもできる。一部の実施形態においては、動物中の内因性血清アルブミンに対する親和性を向上させるために、本発明の４ＨＢポリペプチドに分子を連結又は融合させる。
例えば、４ＨＢポリペプチドとアルブミン結合配列の組換え融合がなされる。例示的なアルブミン結合配列としては、連鎖球菌Ｇタンパク質から得られるアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）ａｎｄ Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：１１５−１２３（１９９７）を参照されたい。）又は例えばＤｅｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。
他の実施形態においては、本発明の４ＨＢポリペプチドは脂肪酸を用いてアシル化される。脂肪酸は、血清アルブミンとの結合を促進する場合がある。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照されたい。
他の実施形態においては、本発明の４ＨＢポリペプチドは、（人血清アルブミンを含めて、ただしこれだけに限定されない）血清アルブミンと直接融合される。例えば、ＥＰＯアナログの血清アルブミン融合については、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５４８，６５３号を参照されたい。当業者は、多種多様な他の分子も、血清アルブミン又は他の血清成分との結合を調整するために、本発明において４ＨＢと連結することができることを認識されたい。
Ｘ． ４ＨＢポリペプチドのグリコシル化
本発明は、糖残基を有する１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を組み込む４ＨＢポリペプチドを含む。糖残基は、（Ｎ−アセチルグルコサミンを含めて、ただしこれだけに限定されない）天然でも（３−フルオロガラクトースを含めて、ただしこれだけに限定されない）非天然でもよい。糖は、（Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンを含めて、ただしこれだけに限定されない）Ｎ若しくはＯ連結グリコシド結合又は（オキシム又は対応するＣ若しくはＳ連結グリコシドを含めて、ただしこれらだけに限定されない）非天然結合によって、非天然的にコードされたアミノ酸に連結することができる。
（グリコールを含めて、ただしこれだけに限定されない）糖部分は、インビボでもインビトロでも４ＨＢポリペプチドに付加させることができる。本発明の一部の実施形態においては、カルボニルを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成するために、アミノオキシ基を用いて誘導体化された糖を用いて改変される。糖は、非天然的にコードされたアミノ酸と結合した後、４ＨＢポリペプチドと結合したオリゴ糖を生成するために、糖転移酵素及び他の酵素で処理することによってさらに手を加えることができる。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照されたい。
本発明の一部の実施形態においては、カルボニルを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製される明確な構造を有するグリカンを用いて直接改変される。当業者は、アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジドを含めて他の官能基を、非天然的にコードされたアミノ酸に糖を連結させるために使用できることを認識されたい。
次いで、本発明の一部の実施形態においては、アジド又はアルキニルを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、これらだけに限定されないがそれぞれアルキニル又はアジド誘導体との、これだけに限定されないがＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加反応によって改変することができる。この方法によって、タンパク質をきわめて高い選択性で改変することができる。
ＸＩ． ＧＨスーパーファミリーメンバー２量体及び多量体
本発明は、１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯなどのＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドが別のＧＨスーパーファミリーメンバー若しくはその変異体又は非ＧＨスーパーファミリーメンバー若しくはその変異体である任意の他のポリペプチドに、ポリペプチド骨格に直接又はリンカーを介して結合した（ｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ又はｈＥＰＯを含めて、ただしこれらだけに限定されない）ＧＨスーパーファミリーメンバーの組み合わせ ホモ２量体、ヘテロ２量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体（すなわち、３量体、４量体など）も提供する。ｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯなどのＧＨスーパーファミリーメンバー、２量体又は多量体複合体は、多量体よりも分子量が増加しているので、単量体のＧＨスーパーファミリーメンバーと比較して、異なる薬理学的、薬物動態学的、薬力学的、調整された治療半減期（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）又は調整された血しょう半減期を含めて、ただしこれらだけに限定されない新しい諸特性又は望ましい諸特性を示し得る。一部の実施形態においては、本発明のｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯ、２量体などのＧＨスーパーファミリーメンバーは、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体の２量体化を調整する。他の実施形態においては、本発明のＧＨスーパーファミリーメンバー２量体又は多量体は、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体拮抗物質、作用物質又は調節物質として働く。
一部の実施形態においては、２量体又は多量体を含む４ＨＢ中に存在する４ＨＢ分子の１個以上は、サイトＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーと連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。したがって、２量体又は多量体の４ＨＢ分子の各々は、サイトＩ界面を介して４ＨＢポリペプチド受容体に結合しやすいが、サイトＩＩ界面を介して第２の４ＨＢポリペプチド受容体に結合することはない。したがって、４ＨＢポリペプチド２量体又は多量体は、２個の異なる４ＨＢポリペプチド受容体の各々のサイトＩ結合部位に係合することはできるが、４ＨＢ分子は、サイトＩＩ領域内に存在する非遺伝的にコードされたアミノ酸に結合した水溶性ポリマーを有するので、４ＨＢポリペプチド受容体は、４ＨＢポリペプチドリガンドのサイトＩＩ領域に係合することができず、２量体又は多量体は４ＨＢポリペプチド拮抗物質として働く。一部の実施形態においては、２量体又は多量体を含む４ＨＢポリペプチド中に存在する４ＨＢ分子の１個以上は、サイトＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーと連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含み、サイトＩＩ領域に結合することができる。或いは、一部の実施形態においては、２量体又は多量体を含む４ＨＢポリペプチド中に存在する４ＨＢ分子の１個以上は、サイトＩ結合領域内にもサイトＩＩ結合領域内にもない部位に存在する水溶性ポリマーと連結された非天然的にコードされたアミノ酸を含む。その結果、両方とも結合に利用することができる。一部の実施形態においては、結合に利用可能なサイトＩ、サイトＩＩ又は両方を有する４ＨＢ分子の組み合わせが使用される。結合に利用可能なサイトＩを少なくとも１個が有し、結合に利用可能なサイトＩＩを少なくとも１個が有する、４ＨＢ分子の組み合わせによって、所望の活性又は特性を有する分子を提供することができる。また、結合に利用可能なサイトＩとサイトＩＩの両方を有する４ＨＢ分子の組み合わせによって、スーパーアゴニスト４ＨＢ分子を生成することができる。
一部の実施形態においては、ＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドは、これらだけに限定されないがＡｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介して直接連結される。一部の実施形態においては、連結されたＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、第１の４ＨＢポリペプチドの１個の非天然的にコードされたアミノ酸中のアルキンと第２のＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドの第２の非天然的にコードされたアミノ酸中のアジドとがＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加によって連結されることを含めて、ただしこれらだけに限定されない、２量体化を促進する異なる非天然的にコードされたアミノ酸を含む。或いは、ケトンを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む、第１のＧＨスーパーファミリーメンバー及び／又は連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバー、ポリペプチドは、ヒドロキシルアミンを含有する非天然的にコードされたアミノ酸を含む第２のＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドと連結することができ、これらのポリペプチドは対応するオキシムを形成することによって反応する。
或いは、２個のＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーはリンカーによって連結される。任意のヘテロ又はホモ二官能性リンカーは、一次配列が同じでも異なっていてもよい、２個のＧＨスーパーファミリーメンバー及び／又は連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバー、ポリペプチドを連結するのに使用することができる。ＧＨスーパーファミリーメンバー及び／又は連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバー、ポリペプチドを一緒につなぐのに使用されるリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬とすることができる場合もある。
一部の実施形態においては、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端上のアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分及びｂ）ポリマー骨格の第２の末端上の少なくとも第２の官能基を含む亜鈴構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供する。第２の官能基は第１の官能基と同じでも異なっていてもよい。一部の実施形態においては、第２の官能基は第１の官能基と反応しない。本発明は、一部の実施形態においては、分枝分子構造の少なくとも１本の腕を含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝分子構造は樹状とすることができる。
一部の実施形態においては、本発明は、以下の構造を有する水溶性活性ポリマーとの反応によって形成されるｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯなどの１個以上のＧＨスーパーファミリーメンバーを含む多量体を提供する。
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２−１０であり、Ｘはアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分とすることができ、Ｒは、Ｘと同じでも異なっていてもよい、キャッピング基、官能基又は脱離基である。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、１−ベンゾトリアゾリルカルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート及びトレシラート、アルケン並びにケトンからなる群から選択される官能基とすることができる。
ＸＩＩ． ４ＨＢポリペプチド活性及び４ＨＢポリペプチド受容体に対する４ＨＢポリペプチドの親和性の測定
ｈＧＨ受容体は、ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：４９４−４９９（１９８９）及びＬｅｕｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５３７−５４３（１９８７）に記載のとおり調製することができる。ｈＧＨポリペプチド活性は、標準インビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。例えば、ｈＧＨの存在下で増殖する細胞系（例えば、ｈＧＨ受容体又はラクトゲン受容体を発現する細胞系）は、ｈＧＨ受容体結合をモニターするのに使用することができる。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３６）：２１９６９（１９９６）；Ｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１４６−１５６（１９９８）；Ｇｏｕｔ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０，２４３３−２４３６（１９８０）；国際公開第９９／０３８８７号を参照されたい。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドの場合、ホルモン受容体に対するそのホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７８６２−７８６７（１９８８）を参照されたい。ｈＧＨ活性を試験するためのインビボの動物モデルとしては、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３６）：２１９６９−２１９７７（１９９６）に記載のものなどが挙げられる。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの２量体化能のアッセイは、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：８２１−８２５（１９９１）及びＦｕｈ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１６７７−１６８０（１９９２）に記載のとおり実施することができる。引用したすべての参考文献及び特許を参照により本明細書に組み込まれる。
ｈＩＦＮ受容体は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５６６，１３２号、同５，８８９，１５１号、同５，８６１，２５８号、同５，７３１，１６９号、同５，５７８，７０７号に記載のとおり調製することができる。ｈＩＦＮポリペプチド活性は、標準又は公知のインビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。例えば、ｈＩＦＮに応じて増殖又はＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ抗原産生を調整する、又はｈＩＦＮを結びつける、（ヒトリンパ芽球状Ｄａｕｄｉ細胞などの活性ＩＦＮ受容体を含む細胞又は組換えＩＦＮ受容体産生細胞を含めて、ただしこれらだけに限定されない）細胞又は細胞系は、ｈＩＦＮ受容体結合をモニターするのに使用することができる。非天然アミノ酸を含む、非ＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチド又はＰＥＧ化ｈＩＦＮポリペプチドの場合、ホルモン受容体に対するそのホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの当分野で公知の技術を用いて測定することができる。ｈＩＦＮ活性を試験するためのインビボの動物モデル及びヒト臨床試験としては、参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｋｏｎｔｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．４３：６３（１９９９）；Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｄｅｓｉｇｎ ８：２１３９（２００２）；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ １５：４１９（２００１）；米国特許第６，１８０，０９６号、同６，１７７，０７４号、同６，０４２，８２２号、同５，９８１，７０９号、同５，９５１，９７４号、同５，９０８，６２１号、同５，７１１，９４４号、同５，７３８，８４６号に記載のものなどが挙げられる。
本ｈＩＦＮアナログを産生するためにどの方法が使用されるかにかかわらず、アナログは生物活性アッセイに供される。トリチウム化チミジンアッセイは、細胞分裂度を確認するのに実施することができる。しかし、他のバイオアッセイも所望の活性を確認するのに使用することができる。ウイルス複製阻害能力のアッセイなどのバイオアッセイもＩＦＮ活性の指標を提供する。参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：１９５（２００１）；Ｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９：５３３（１９８６）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１３：１４３（１９９８）；ＤｉＭａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２０２：１４４５（１９９４）及び米国特許第４，６７５，２８２号、同４，２４１，１７４号、同４，５１４，５０７号、同４，６２２，２９２号、同５，７６６，８６４号を参照されたい。
他のインビトロアッセイを使用して生物活性を確認することもできる。一般に、生物活性試験は、（不変のＩＦＮと比較した）生物活性の増加又は減少、（不変のＩＦＮと比較して）異なる生物活性、受容体親和性分析、血清半減期分析などの所望の結果に対する分析を提供すべきである。
Ｄａｕｄｉ細胞は、１２５Ｉ−標識ネズミＩＦＮを結びつけ、この結合は、非標識ＩＦＮの添加によって競合され得ることが以前に報告された（例えば、米国特許第５，５１６，５１４号、同５，６３２，９８８号を参照されたい。）。ヒト及びネズミ白血病細胞に対する１２５Ｉ−ＩＦＮの結合を天然ＩＦＮとｈＩＦＮが競合するかどうかが試験される。高度に精製された天然ＩＦＮ（純度＞９５％；１μｇ）がヨウ素化され［Ｔｅｊｅｄｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７，１４３（１９８２）］、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーによって反応物から分離される。天然１２５Ｉ−ＩＦＮの比活性は、おそらく約１００μＣｉ／μｇタンパク質である。
ｈＧ−ＣＳＦ受容体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５７４，１３６号に記載のとおり調製することができる。ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド活性は、標準又は公知のインビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。例えば、ｈＧ−ＣＳＦの存在下で増殖する、又はｈＧ−ＣＳＦを結びつける、（マウス骨髄細胞などの活性Ｇ−ＣＳＦ受容体を含む細胞、ＷＥＨＩ−３Ｂ（Ｄ＋）、ＡＭＬ−１９３（ＡＴＣＣ）又は組換えＧ−ＣＳＦ受容体産生細胞を含めて、ただしこれらだけに限定されない）細胞又は細胞系は、ｈＧ−ＣＳＦ受容体結合をモニターするのに使用することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：２２３（１９９２）；米国特許第６，３８５，５０５号を参照されたい。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化又はＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの場合、ホルモン受容体に対するそのホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。ｈＧ−ＣＳＦ活性を試験するためのインビボの動物モデル及びヒト臨床試験としては、参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第６，１６６，１８３号、同６，５６５，８４１号、同６，１６２，４２６号、同５，７１８，８９３号に記載のものなどが挙げられる。
本ｈＧ−ＣＳＦアナログを産生するためにどの方法が使用されるかにかかわらず、アナログは生物活性アッセイに供される。トリチウム化チミジンアッセイは、細胞分裂度を確認するのに実施することができる。しかし、他のバイオアッセイも所望の活性を確認するのに使用することができる。マウスＷＥＨＩ−３Ｂ（Ｄ＋）白血病細胞系における末端分化誘発能力のアッセイなどのバイオアッセイも、Ｇ−ＣＳＦ活性の指標を提供する。Ｎｉｃｏｌａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ５４：６１４−２７（１９７９）を参照されたい。他のインビトロアッセイを使用して生物活性を確認することもできる。Ｎｉｃｏｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４５−７７（１９８９）を参照されたい。一般に、生物活性試験は、（不変のＧ−ＣＳＦと比較した）生物活性の増加又は減少、（不変のＧ−ＣＳＦと比較して）異なる生物活性、受容体親和性分析、血清半減期分析などの所望の結果に対する分析を提供すべきである。
新規に診断された白血病から得られた、ＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞及びヒト白血病細胞は、１２５Ｉ−標識ネズミＧ−ＣＳＦを結びつけ、この結合は、非標識Ｇ−ＣＳＦ又はヒトＣＳＦ−βの添加によって競合され得ることが以前に報告された。ヒト及びネズミ白血病細胞に対する１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの結合を天然Ｇ−ＣＳＦとｈＧ−ＣＳＦが競合するかどうかが試験される。高度に精製された天然Ｇ−ＣＳＦ（純度＞９５％；１μｇ）がヨウ素化され［Ｔｅｊｅｄｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７，１４３（１９８２）］、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーによって反応物から分離される。天然１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの比活性は、約１００μＣｉ／μｇタンパク質である。
ｈＥＰＯ受容体は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８７，８０８号、同５，２９２，６５４号、同５，２７８，０６５号に記載のとおり調製することができる。ｈＥＰＯポリペプチド活性は、標準インビトロ又はインビボアッセイによって測定することができる。例えば、（ＵＴ−７細胞、ＴＦ−１細胞、ＦＤＣＰ−１／ｍＥＰＯＲ又はひ臓細胞を含めて、ただしこれらだけに限定されない）ｈＥＰＯの存在下で増殖する細胞系は、ｈＥＰＯ受容体結合をモニターするのに使用することができる。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１２６１−１２６５；米国特許第５，７７３，５６９号及び同５，８３０，８５１号を参照されたい。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化又はＰＥＧ化ｈＥＰＯポリペプチドの場合、ホルモン受容体に対するそのホルモンの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。ｈＥＰＯ活性を試験するためのインビボの動物モデル及びヒト臨床試験としては、参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第６，６９６，０５６号；Ｃｏｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９６１）Ｎａｔｕｒｅ １９１：１０６５−１０６７；米国特許出願公開第２００３／０１９８６９１号及びＰｈａｒｍ Ｅｕｒｏｐａ Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ＢＲＰ Ｂｉｏ １９９７（２）に記載のものなどが挙げられる。１個以上の非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＥＰＯポリペプチドの２量体化能のアッセイは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２１，６０８号に記載のとおり実施することができる。
アッセイ方法の参考文献の上記収集は網羅的なものではなく、当業者は、所望の最終結果の試験に有用である他のアッセイも承知している。
ＸＩＩＩ． 効力、機能的なインビボでの半減期及び薬物動態学的パラメータの測定
本発明の重要な側面は、ポリペプチドと水溶性ポリマー部分の連結を含む、又は含まない、４ＨＢポリペプチドの構築によって得られる生物学的半減期の延長である。４ＨＢポリペプチドの血清中濃度が急激に減少すると、複合及び非複合４ＨＢポリペプチド並びにその変異体を用いた治療に対する生物学的応答を評価することが重要になる。好ましくは、本発明の複合及び非複合４ＨＢポリペプチド並びにその変異体は、ｉ．ｖ．投与後も長い血清中半減期を有し、例えば、ＥＬＩＳＡ法又は第１次スクリーニングアッセイによって測定することが可能である。ＢｉｏＳｏｕｒｃｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）のＥＬＩＳＡ又はＲＩＡキットを使用することができる。ＩＦＮ又はその変異体のインビボでの半減期を測定するアッセイの他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、ｋｏｚｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ １５：４１９（２００１）；Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１２：１９５（２００１）；Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ ８：２１３９（２００２）；米国特許第６，５２４，５７０号、同６，２５０，４６９号、同６，１８０，０９６号、同６，１７７，０７４号、同６，０４２，８２２号、同５，９８１，７０９号、同５，９８１，７０９号、同５，５９１，９７４号、同５，９０８，６２１号、同５，７３８，８４６号に記載されている。Ｇ−ＣＳＦ又はその変異体のインビボでの半減期を測定するアッセイの他の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２４，７７８号に記載されている。インビボでの生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されたとおりに実施される。
非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの効力及び機能的なインビボでの半減期は、Ｃｌａｒｋ，Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３６，２１９６９−２１９７７（１９９６）に記載のプロトコルに従って求めることができる。非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドの効力及び機能的なインビボでの半減期は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１１，９４４号、同５，３８２，６５７号に記載のプロトコルに従って求めることができる。非天然的にドされたアミノ酸を含むｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの効力及び機能的なインビボでの半減期は、参照により本明細書に組込まれる、米国特許第６，６４６，１１０号、同６，５５５，６６０号、同６，１６６，１８３号、同５，９８５，２６５号、同５，８２４，７７８号、同５，７７３，５８１号に記載のプロトコルに従って求めることができる。非天然的にコードされたアミノ酸を含むｈＥＰＯポリペプチドの効力及び機能的なインビボでの半減期は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，３９８号、同５，５８３，２７２号及び米国特許出願公開第２００３／０１９８６９１Ａ１号に記載のプロトコルに従って求めることができる。
非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドの薬物動態学的パラメータは、正常なスプレーグドーリーオスラット（Ｎ＝５動物／投与群）において評価することができる。動物は、２５ｕｇ／ラットｉｖ又は５０ｕｇ／ラットｓｃの単回投与を受け、既定の時間経過に従って、すなわち、一般に水溶性ポリマーに連結されていない非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドでは約６時間にわたり、また、非天然的にコードされたアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに連結された４ＨＢポリペプチドでは約４日にわたり、約５−７個の血液試料が採取される。４ＨＢポリペプチドの薬物動態学的データは、いくつかの種で十分に研究されており、非天然的にコードされたアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドに対して得られたデータと直接比較することができる。ｈＧＨに関係する研究については、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（１１）：１３５１−５９（１９９１）を参照されたい。
本発明による４ＨＢポリペプチドの比活性は、当分野で公知のさまざまなアッセイによって求めることができる。本発明の精製ｈＧ−ＣＳＦタンパク質の生物活性は非常に高いので、ヒト患者へのこのｈＧ−ＣＳＦタンパク質の注射投与によって、対象の非注射群、すなわち対照群と比較して、骨髄細胞の白血球産生が増加する。本発明の精製ｈＥＰＯタンパク質の生物活性は非常に高いので、ヒト患者へのこのｈＥＰＯタンパク質の注射投与によって、対象の非注射群、すなわち対照群と比較して、骨髄細胞の網状赤血球及び赤血球産生が増加する。本発明によって得られ、精製されるｈＥＰＯ突然変異タンパク質又はその断片の生物活性は、Ｐｈａｒｍ．Ｅｕｒｏｐａ Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ＢＲＰ Ｂｉｏ １９９７（２）による方法によって試験することができる。ｈＥＰＯの活性を求める別のバイオアッセイは、正赤血球症（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウスアッセイである（Ｐｈａｒｍ．Ｅｕｒｏｐａ Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ＢＲＰ Ｂｉｏ １９９７（２））。本発明によって得られ、精製される４ＨＢポリペプチド又はその断片の生物活性は、本明細書に記載の方法、本明細書で参照される方法又は当業者に公知の方法によって試験することができる。
ｈＧ−ＣＳＦ又はその変異体のインビボでの生物活性を測定するアッセイのさらなる例は、その各々を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６８１，７２０号、同５，７９５，９６８号、同５，８２４，７７８号、同５，９８５，２６５号及びＢｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２７：４２５−４３２（１９９９）に記載されている。
ＸＩＶ． 投与及び薬剤組成物
（１個以上の非天然アミノ酸を含む、ｈＧＨ、ｈＩＦＮ、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯ、シンセターゼ、タンパク質などを含めて、ただしこれらだけに限定されない）本発明のポリペプチド又はタンパク質は、適切な薬剤担体との組み合わせを含めて、ただしこれらだけに限定されない治療用途に場合によっては使用してもよい。かかる組成物は、例えば、該化合物の治療有効量及び薬剤として許容される担体又は賦形剤を含む。かかる担体又は賦形剤としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセリン、エタノール及び／又はそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。処方は投与方法に合わせてなされる。一般に、タンパク質を投与する方法は当分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
１個以上の本発明のポリペプチドを含む治療用組成物は、当分野で周知の方法によって効力、組織代謝を確認し、投与量を推定するために、１つ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボの疾患動物モデルにおいて場合によっては試験してもよい。特に、投与量は、（１個以上の非天然アミノ酸を含むように改変された４ＨＢポリペプチドと天然アミノ酸４ＨＢポリペプチドとの比較を含めて、ただしこれらだけに限定されない）天然アミノ酸相同体に対する本明細書の異常の活性、安定性又は他の適切な尺度によって、すなわち、関連アッセイにおいて最初に決定することができる。
投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるのに通常使用される経路のいずれかによる。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬剤として許容される１個以上の担体と場合によっては一緒に、任意の適切な方法で投与される。本発明においてかかるポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能である。特定の組成物を投与するのに１つを超える経路を使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりも迅速で有効な作用又は反応をもたらすことが多い。
薬剤として許容される担体は、投与される特定の組成物及び組成物を投与するのに使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、本発明の薬剤組成物の適切な処方は多種多様である。
ポリペプチド組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段を含めて、ただしこれらだけに限定されないいくつかの経路によって投与することができる。非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、改変されていてもいなくても、リポソームによって投与することもできる。かかる投与経路及び適切な処方は、一般に当業者に公知である。
非天然アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドは、単体でも他の適切な成分との組み合わせでも、エアゾール剤（すなわち、それらは「噴霧する」ことができる。）にして吸入投与することもできる。エアゾール剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴霧剤に入れることができる。
例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下経路などによる非経口投与に適切な製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を対象レシピエントの血液と等張性にする溶質を含むことができる水系及び非水系等張性無菌注射液並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含むことができる水系及び非水系無菌懸濁液が挙げられる。パッケージ化された核酸の製剤は、アンプル、バイアルなどの１回量又は複数回量密封容器中に存在することができる。
非経口投与及び静脈内投与は、好ましい投与方法である。特に、（ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は任意の他の薬剤的に産生されるタンパク質に一般に使用されるものを含めて、ただしこれらだけに限定されない）天然アミノ酸相同体治療にすでに使用されている投与経路は、現在使用されている処方と一緒に、本発明のポリペプチドの好ましい投与経路及び処方をもたらす。
本発明において患者に投与される用量は、適用例に応じて、患者において経時的に有益な治療応答を得るのに、又はこれらだけに限定されないが、病原体による感染を阻害するのに、又は他の適切な活性に十分である。用量は、特定のベクターの効力又は処方及び使用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性若しくは血清半減期及び患者の状態並びに治療を受ける患者の体重若しくは表面積によって決定される。用量サイズは、特定の患者において特定のベクターの投与、処方などに付随するあらゆる有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。
（癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない）疾患の治療又は予防において投与されるベクター又は製剤の有効量を決定する際には、医師は、循環血しょう中濃度、処方の毒性、疾患の進行及び／又は関連する場合には抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、一般に、現在使用されている治療タンパク質の投与量と等しい範囲であり、関連する組成物の変化した活性又は血清半減期に対して調節される。本発明のベクターは、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、生物学的応答調節物質などの投与を含めて、任意の公知の従来療法による治療条件を補足することができる。
投与する場合、本発明の製剤は、関連製剤のＬＤ−５０若しくはＥＤ−５０及び／又はこれらだけに限定されないが、患者の質量及び全体的健康状態に適用されるさまざまな濃度における非天然アミノ酸のあらゆる副作用の観察によって決定される速度で投与される。投与は単一又は分割用量で実施することができる。
製剤を注入された患者が、発熱、悪寒又は筋痛を生じた場合には、彼／彼女は、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の鎮痛薬／解熱薬の適切な用量を服用する。発熱、筋痛、悪寒など注入に対する反応を経験した患者は、アスピリン、アセトアミノフェン又はこれだけに限定されないがジフェンヒドラミンをさらに注入する３０分前に前投薬を受ける。メペリジンは、解熱薬及び抗ヒスタミン薬に素早く応答しないより重度の悪寒及び筋痛に対して使用される。細胞注入は、反応の重症度に応じて、減速され、又は中止される。
本発明のヒト４ＨＢポリペプチドは、哺乳動物対象に直接投与することができる。投与は、４ＨＢポリペプチドを対象に導入するのに通常使用される経路のいずれかによる。本発明の実施形態による４ＨＢポリペプチド組成物としては、経口、直腸、局所、（エアゾール剤を含めて、ただしこれだけに限定されない）吸入、（舌下を含めて、ただしこれだけに限定されない）頬、膣、（皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内を含めて、ただしこれらだけに限定されない）非経口、局所（すなわち、気道表面を含めて皮膚表面と粘膜表面の両方）及び経皮投与に適切な組成物などが挙げられる。ただし、任意の所与の症例において最も適切な経路は、治療される症状の性質及び重症度によって決まる。投与は、局所的でも全身的でもよい。化合物の製剤は、アンプル、バイアルなどの１回量又は複数回量密封容器中に存在することができる。本発明の４ＨＢポリペプチドは、薬剤として許容される担体と一緒に、（溶液、懸濁液又は乳濁液を含めて、ただしこれらだけに限定されない）注射用単位剤形の混合物として調製することができる。本発明の４ＨＢポリペプチドは、（浸透圧ポンプなどのミニポンプの使用を含めて、ただしこれらだけに限定されない）連続注入、単一ボーラス又は徐放性デポー製剤によって投与することもできる。
投与に適切な製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を等張性にする溶質を含むことができる水系及び非水系等張性無菌溶液並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含むことができる水系及び非水系無菌懸濁液が挙げられる。溶液及び懸濁液は、先に記載された種類の無菌粉体、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
本発明の薬剤組成物は、薬剤として許容される担体を含むことができる。薬剤として許容される担体は、投与される特定の組成物及び組成物を投与するのに使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、本発明の（任意に選択される、薬剤として許容される担体、賦形剤又は安定剤を含む）薬剤組成物の適切な処方は多種多様である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄ．１９８５を参照されたい。））。
適切な担体としては、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩及び他の有機酸を含む緩衝剤；アスコルビン酸を含めた酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含めた単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；亜鉛、コバルト、銅などの二価金属イオン；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン及び／又はＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、ＰＥＧなどの非イオン界面活性剤などが挙げられる。
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されたものを含めて、本発明の４ＨＢポリペプチドは、徐放性システムによって、又は徐放性システムの一部として、投与することもできる。徐放性組成物としては、フィルム又はマイクロカプセルを含めて、ただしこれらだけに限定されない成形品の形の半透性ポリマーマトリックスを含むが、これらだけに限定されない。徐放性マトリックスとしては、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，同上）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリ乳酸コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、シリコーンなどの生体適合性材料などが挙げられる。徐放性組成物としては、リポソームに閉じ込められた化合物も挙げられる。化合物を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号及びＥＰ１０２，３２４。引用したすべての参考文献及び特許は参照により本明細書に組み込まれる。
リポソームに閉じこめられた４ＨＢポリペプチドは、例えば、ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法によって調製することができる。リポソームの組成及びサイズは周知であり、又は当業者が経験的に容易に決定することができる。例えば、Ｐａｒｋ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ Ｄ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ（ｅｄｓ）：ＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＤＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｔｅｉｃｈｅｒ Ｂ（ｅｄ）：ＣＡＮＣＥＲ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＵＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載のリポソームのいくつかの例。引用したすべての参考文献及び特許は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明において患者に投与される用量は、対象において経時的に有益な応答を引き起こすのに十分なものとすべきである。一般に、非経口的に投与される本発明の４ＨＢポリペプチドの１回当たりの全薬剤有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ患者体重／日から約１００μｇ／ｋｇ患者体重又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ患者体重から約１ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ただし、これは治療上の自由裁量によって決まる。投薬頻度も治療上の自由裁量によって決まり、ヒトにおける使用に承認されている市販４ＨＢポリペプチド製品よりも多くても少なくてもよい。一般に、本発明のＰＥＧ化４ＨＢポリペプチドは、上記投与経路のいずれかによって投与することができる。
ＸＶ． 本発明の４ＨＢポリペプチドの治療上の使用
本発明の４ＨＢポリペプチドは、広範囲の障害を治療するのに有用である。
本発明のｈＧＨ作用物質ポリペプチドは、例えば、発育不全、免疫不全を治療し、心臓機能を刺激するのに有用であり得る。発育不全の個体としては、例えば、ターナー症候群の個体、（子供を含めた）ＧＨ欠乏個体、（「小さな正常児（ｓｈｏｒｔ ｎｏｒｍａｌ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」としても知られる）成長板が閉じる約２−３年前に正常な成長曲線の減速又は遅延を経験した子供及びＧＨに対するインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）応答が化学的に（すなわち、グルココルチコイド治療によって）遮断された、又はＧＨに対するＩＧＦ−Ｉ応答が生来小さい成体患者などの生来の症状によって遮断された、個体などが挙げられる。
作用物質ｈＧＨ変異体は、その免疫機能を増大させることによって、増大が抗体媒介でも細胞媒介でも、また、免疫系がｈＧＨポリペプチドを用いて治療されたホストに内因性であっても、（骨髄移植におけるように）ｈＧＨポリペプチドを投与されたホストレシピエントにドナーから移植されても、哺乳動物の免疫系を刺激するように作用することができる。「免疫不全」としては、薬物（例えば、化学療法的）治療のために免疫が低下した、小さなひ臓を有する個体を含めて、個体の免疫系が抗原に対して通常よりも小さな抗体又は細胞応答を示すあらゆる症状などが挙げられる。免疫不全個体の例としては、例えば、高齢患者、化学療法又は放射線療法を受けた個体、主要な疾病から回復中の個体、又は手術を受けようとしている個体、ＡＩＤＳ個体、低ガンマグロブリン症、一般的なさまざまな無ガンマグロブリン血症、選択的免疫グロブリン欠損症（例えば、ＩｇＡ欠損症などの先天性及び後天性Ｂ細胞欠損症患者、患者の免疫応答よりも短い潜伏時間で狂犬病などのウイルスに感染した患者並びにディジョージ症候群などの遺伝性疾患個体が挙げられる。
本発明のｈＧＨ拮抗物質ポリペプチドは、巨人症及び末端肥大症、糖尿病及び糖尿病に起因する合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害）、（例えば、増殖性新血管新生を含めた）血管性眼疾患、腎症並びにＧＨ応答性悪性腫ようの治療に有用であり得る。
血管性眼疾患としては、例えば、（例えば、未熟又は鎌状赤血球貧血に起因する）網膜症及び黄斑変性症が挙げられる。
ＧＨ応答性悪性腫ようとしては、例えば、ウィルムス腫よう、肉腫（例えば、骨原性肉腫）、乳癌、結腸癌、前立腺癌及び甲状腺癌並びにＧＨ受容体ｍＲＮＡを発現する組織の癌（すなわち、胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、リンパ節及びバーキットリンパ腫、結腸直腸癌腫、肺癌、リンパ芽球性白血病及び黒色腫から）が挙げられる。
ｈＧＨの平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。ｈＧＨの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。
本発明のｈＩＦＮ生成物の投与は、ヒトにおいて市販ＩＦＮ調製物によって実証された働きのいずれかをもたらす。ｈＩＦＮ糖タンパク質生成物を含む薬剤組成物は、増殖抑制薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬などが使用される、ただしこれらだけに限定されないＩＦＮ作用物質又は拮抗物質によって影響を受け得る障害を単独で又は症状若しくは疾患の一部として経験したヒト患者にさまざまな手段によって投与するのに有効な強度で処方することができる。ｈＩＦＮ糖タンパク質生成物の平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。ｈＩＦＮの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。したがって、本発明のｈＩＦＮは、ウイルス複製サイクルを中断又は調整するために、炎症を調整するために、又は増殖抑制薬として使用することができる。本発明によって治療可能な症状としては、ＨＣＶ、ＨＢＶ及び他のウイルス感染症、腫よう細胞増殖又は生存、多発性硬化症などが挙げられる。本発明は、抗癌化学療法剤などの別の活性薬剤の治療有効量を投与することもできる。投与量は、ｈＩＦＮ療法に基づいて当業者が容易に決定することができる。
本発明のｈＧ−ＣＳＦ生成物を投与すると、ヒトにおいては白血球が形成される。ｈＧ−ＣＳＦ糖タンパク質生成物を含む薬剤組成物は、低い又は不完全な白血球産生を特徴とする障害を単独で又は症状若しくは疾患の一部として経験したヒト患者にさまざまな手段によって投与するのに有効な強度で処方することができる。ｈＧ−ＣＳＦ糖タンパク質生成物の平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。ｈＧ−ＣＳＦの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。したがって、本発明のｈＧ−ＣＳＦは、白血球産生を刺激し、低下した赤血球レベルを修正するために使用することができる。最も一般的には、白血球レベルは、癌、感染又は化学療法のために減少する。本発明によって治療可能な症状としては、細菌感染に付随する好中球減少、化学療法薬、（ＡＺＴなどの）抗ウイルス薬などの骨髄抑制性療法に付随する好中球減少、非骨髄球性癌の進行に付随する好中球減少、（ＨＩＶなどの）ウイルス感染に付随する貧血などが挙げられる。抗癌剤を用いた予測治療など、その他の点では健康な個体における好中球減少をもたらし得る症状も治療可能である。一般に、ｈＧ−ＣＳＦを用いて治療可能な症状は、本発明のＰＥＧ：ｈＧ−ＣＳＦ複合体でも治療することができる。本発明は、抗癌化学療法剤などの別の活性薬剤の治療有効量を投与することもできる。投与量は、ｈＧ−ＣＳＦ療法に基づいて当業者が容易に決定することができる。
本発明のｈＥＰＯポリペプチドは、広範囲の障害を治療するのに有用である。本発明のｈＥＰＯ生成物を投与すると、ヒトにおいては赤血球が形成される。ｈＥＰＯ糖タンパク質生成物を含む薬剤組成物は、低い又は不完全な赤血球産生を特徴とする血液疾患を単独で又は症状若しくは疾患の一部として経験したヒト患者にさまざまな手段によって投与するのに有効な強度で処方することができる。ｈＥＰＯ糖タンパク質生成物の平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。ｈＥＰＯの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。したがって、本発明のｈＥＰＯは、赤血球産生を刺激し、低下した赤血球レベルを修正するために使用することができる。最も一般的には、赤血球レベルは貧血のために減少する。本発明によって治療可能な症状としては、腎機能の低下又は喪失（慢性腎不全）に付随する貧血、化学療法薬、（ＡＺＴなどの）抗ウイルス薬などの骨髄抑制性療法に付随する貧血、非骨髄球性癌の進行に付随する貧血、（ＨＩＶなどの）ウイルス感染に付随する貧血などが挙げられる。手術中の血液の見込み損失など、その他の点では健康な個体における貧血をもたらし得る症状も治療可能である。一般に、ｈＥＰＯを用いて治療可能な症状は、本発明のＰＥＧ：ｈＥＰＯ複合体でも治療することができる。本発明は、治療中の赤血球形成の増加を維持するために、鉄の治療有効量を投与することもできる。投与量は、ｈＥＰＯ療法に基づいて当業者が容易に決定することができる。
（実施例）
以下の実施例は説明のために提唱されるが、請求される本発明に限定を加えるものではない。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸のｈＧＨへの組み込みの好ましい部位の選択のための基準の多くの可能性のあるセットのうちの１つを記述する。
本実施例は、ｈＧＨポリペプチド内の好ましい部位が天然にコードされていないアミノ酸の導入のために如何に選択されたかを示す。受容体の細胞外ドメインの２つの分子と複合体形成したｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）からなる結晶構造３ＨＨＲを使用して、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が導入できる好ましい位置を決定した。他のｈＧＨ構造（例、１ＡＸＩ）を利用して、結晶構造データセット間の一次構造要素及び二次構造要素の可能性のあるバリエーションを検討した。これらの構造についての配位は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｓｔｅｉｎほか、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９７， １１２， ｐｐ５３５）から、又はｒｃｓｂ．ｏｒｇでのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上で入手可能なＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ ＰＤＢのためのＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙを介して入手可能である。構造モデル３ＨＨＲは、前記結晶における乱れのため排除された残基１４８ないし１５３及びＣ末端のＦ１９１残基を除く、ｈＧＨの全成熟型２２ｋＤａ配列を含有する。Ｃ５３及びＣ１６５、並びにＣ１８２及びＣ１８５によって形成される２つのジスルフィド結合が存在する。本実施例で使用される配列番号の割り振りは、配列番号２において示される成熟型ｈＧＨ（２２ｋＤａ変異体）のアミノ酸配列にしたがっている。
以下の基準を使用して、天然にコードされていないアミノ酸の導入のためのｈＧＨの各位置を評価した。すなわち前記残基は、（ａ）３ＨＨＲ、１ＡＸＩ、及び１ＨＷＧ（ｈＧＨｂｐ単量体又は二量体と抱合されたｈＧＨの結晶学的構造）の構造分析に基づいたいずれかのｈＧＨｂｐの結合を干渉すべきではなく、（ｂ）アラニン又はホモログ走査変異誘発によって影響を受けるべきではなく（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９）２４４：１０８１−１０８５及びＣｕｍｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． ＜Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９）２４３：１３３０−１３３６）、（ｃ）表面露出されるべきであり、取り囲んでいる残基との最小のファンデルワールス結合相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＧＨ変異体において欠失されているべきか又は可変性であるべきのいずれかであり（例、Ｔｙｒ３５、Ｌｙｓ３８、Ｐｈｅ９２、Ｌｙｓ１４０）、（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸との置換に関する保存された変化を生じるであろうし、及び（ｆ）高度に柔軟性のある領域（ＣＤループを含むがそれに限定されない）又は構造的に強固な領域（螺旋Ｂを含むがそれには限定されない）のいずれかにおいて見出されうる。加えて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １８， ｐｐ９８０）を利用して各タンパク質原子についての突出の程度を評価するさらなる計算をｈＧＨ分子に関して実施した。結果として、いくつかの実施態様では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が、それに制限を加えるものではないが、ｈＧＨの以下の位置の１つ以上で組み込まれる。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（つまり前記タンパク質のカルボキシル末端で）である（配列番号２又は配列番号１若しくは３における前記対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は以下の位置の１つ以上において置換される。すなわち、２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、及び１８７である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は以下の位置の１つ以上において置換される。すなわち、２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、及び１８７である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は以下の位置の１つ以上において置換される。すなわち、３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、及び１５５である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は以下の位置の１つ以上において置換される。すなわち、３０、７４、１０３である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸
いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は以下の位置の１つ以上において置換される。すなわち、３５、９２、１４３、１４５である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、それに限定を加えるものではないが、以下の位置を含むこれらの位置の１つ以上において非自生的に生じるアミノ酸は水溶性ポリマーへ連結される。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（つまり前記タンパク質のカルボキシル末端で）である（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。いくつかの実施態様において、これらの位置の１つ以上において非自生的に生じるアミノ酸は水溶性ポリマーへ連結される。すなわち、３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５においてである（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。いくつかの実施態様において、これらの位置の１つ以上において非自生的に生じるアミノ酸は水溶性ポリマーへ連結される。すなわち、３５、９２、１４３、１４５においてである（配列番号２又は配列番号１若しくは３の前記対応するアミノ酸）。
ｈＧＨアンタゴニストの生成のためのいくつかの部位には以下のものが含まれる。すなわち、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、又は位置１前の付加、又はそのいずれか組み合わせである（配列番号２又は配列番号１若しくは３における前記対応するアミノ酸、又はいずれかの他のＧＨ配列）。これらの部位はアゴニストデザインの基準（ｃ）ないし基準（ｅ）を利用して選択された。アンタゴニストデザインにはｈＧＨｂｐに対する結合親和性を増大するためのＩ部位残基の部位特異的修飾も含むことが可能である。
本実施例は、大腸菌における天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。本実施例は、修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物学的活性を査定するためのある方法も記述する。
ｈＧＨ及びその断片をクローニングするための方法は、米国特許第４，６０１，９８０号、第４，６０４，３５９号、第４，６３４，６７７号、第４，６５８，０２１号、第４，８９８，８３０号、第５，４２４，１９９号、及び第５，７９５，７４５号に記載され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。全長のｈＧＨ又はＮ末端シグナル配列を欠失するｈＧＨの成熟な形態をコード化するｃＤＮＡは配列番号２１及び配列番号２２にそれぞれ示されている。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入される翻訳システムを使用して、天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＧＨを発現する。前記Ｏ−ＲＳは天然にコードされていないアミノ酸を使用して前記Ｏ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。順に、前記翻訳システムは天然にコードされていないアミノ酸をｈＧＨへと、コード化されるセレクターコドンに応じて挿入する。
Figure 2007519422
前記修飾されたｈＧＨ遺伝子及び（望ましい天然にコードされていないアミノ酸に特異的な）オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を含有するプラスミドによる大腸菌の形質変換により、ｈＧＨポリペプチドへの天然にコードされていないアミノ酸の部位特異的組み込みが可能になる。特定の天然にコードされていないアミノ酸の０．０１ないし１００ｍＭを含有する培地において３７℃で成育される前記形質変換された大腸菌は、修飾されたｈＧＨを高い忠実度及び効率性で発現する。天然にコードされていないアミノ酸を含有するＨｉｓタグのついたｈＧＨは封入体又は凝集体として大腸菌宿主細胞により生成される。前記凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌにおける変性条件下でアフィニティ精製する。４℃で一晩、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭＣｕＳＯ４、及び２％（ｗ／ｖ）サルコシル中で透析することにより再折りたたみを実施する。前記材料を次に、２０ｍＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ２に対して透析し、その後、Ｈｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９３）２６８：１５９８３−９３を参照。ｈＧＨの精製のための方法は本分野で公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、又はエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析等により確認される。
図６は、精製されたｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使用して、製造者により提供される標準的なＨｉｓタグのついたタンパク質の精製手段を介し、その後、陰イオン交換カラム後にゲルへ負荷することによって、Ｈｉｓタグのついた変異体ｈＧＨタンパク質を精製した。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２は非天然アミノ酸を組み込んでいないＮ−Ｈｉｓ ｈＧＨを表す。レーン３ないし１０は、Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３、及びＫ１４５の各位置でそれぞれ、非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むＮ−Ｈｉｓ ｈＧＨ変異体を含有する。
修飾されたｈＧＨポリペプチドの生物活性をさらに査定するため、ｈＧＨのその受容体との相互作用に関する下流マーカーを測定するアッセイを使用した。ｈＧＨのその内因的に生じる受容体との相互作用により、ヒトＩＭ−９リンパ球細胞系における転写因子ファミリーメンバーであるＳＴＡＴ５のシグナル伝達因子と活性化因子のチロシンリン酸化が生じる。ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂのうちの２つの形態をＩＭ−９ｃＤＮＡライブラリから同定した。例えば、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． （１９９６） １０（５）：５０８−５１８を参照。ラット成長ホルモンもヒトプロラクチンも検出可能なＳＴＡＴ５のリン酸化を生じなかったため、ＩＭ−９細胞に関するヒト成長ホルモン受容体はヒト成長ホルモンに対して選択的である。重要なことに、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞外ドメイン及び、ｈＧＨを有するＧ１２０Ｒは、ｈＧＨにより刺激されるｐＳＴＡＴ５リン酸化に対して効果的に競合する。
ＩＭ−９細胞を本発明のｈＧＨポリペプチドで刺激した。ヒトＩＭ−９リンパ球をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入し、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）で補強されたＲＰＭＩ１６４０中で成育させた。前記ＩＭ−９細胞をアッセイ培地（フェノール赤を含まないＲＰＭＩ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１％熱不活性化木炭／デキストランで処理したＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイシン）中で一晩飢餓状態にした後、３７℃で１０分間ｈＧＨポリペプチドの１２地点投与範囲で刺激した。刺激した細胞を１％ホルムアルデヒドで固定した後、９０％氷冷メタノールを使用して氷上で１時間透過処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化のレベルを室温で３０分間、一次ホスホ−ＳＴＡＴ５抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を使用した後、ＰＥ抱合型二次抗体を使用して細胞内染色により検出した。試料の獲得をＦＡＣＳ Ａｒｒａｙで実施し、獲得したデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）で分析した。ＥＣ５０値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔを利用するタンパク質濃度に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）でプロットした投与量反応曲線から生じた。
以下の表３は、変異体ｈＧＨポリペプチドで生じたＩＭ−９データを要約する。異なる位置での非天然アミノ酸置換を有するさまざまなｈＧＨポリペプチドを、記載されるようにヒトＩＭ−９細胞を使用して検査した。特に、図７、パネルＡはＨｉｓタグのついたｈＧＨポリペプチドについてのＩＭ−９データを示し、図７、パネルＢはＹ１４３についての非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓタグのついたｈＧＨについてのＩＭ−９データを示す。同一アッセイを使用して、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの生物活性を査定した。
Figure 2007519422
Figure 2007519422
本実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入及びアミノオキシ含有ＰＥＧとのその後の反応を詳述する。
本実施例は、後に分子量約５，０００のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応するケトン含有の天然にコードされていないアミノ酸を組み込む４ＨＢポリペプチドの生成のための方法を示す。実施例１（ｈＧＨ）の基準に従って同定される残基３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１２０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、及び１５５の各々、実施例３２（ｈＩＦＮ）の基準に従って同定される残基、実施例３６（ｈＧ−ＣＳＦ）の基準に従って同定される残基５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７、及び１７１の各々、又は実施例４０（ｈＥＰＯ）の基準に従って同定される残基２１、２４、３８、８３、８５、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、及び１２８の各々は、以下の構造を有する天然にコードされていないアミノ酸と個別に置換される。
Figure 2007519422
ｈＧＨへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ミトコンドリアＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び上述の実施例に記載される１６，１７又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、又は６）である。ｈＩＦＮへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的組み込みのために利用される配列は、配列番号２４（ｈＩＦＮ）及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ）、及び上述の実施例２に記載される１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、又は６）である。ｈＧ−ＣＳＦへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号２９（ｈＧ−ＣＳＦ）、及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ）、及び上述の実施例２に記載される１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、又は６）である。ｈＥＰＯへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号３８（ｈＥＰＯ）、及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ）、及び上述の実施例２に記載される１６、１７、又は１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、又は６）である。
一度修飾されると、カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体は以下の形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と反応する。すなわち、
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
であり、式中Ｒはメチル、ｎは３、Ｎは分子量約５，０００である。２５ｍＭＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｇｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ７．０、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ４．５に１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製された４ＨＢを、１０ないし１００倍の過剰量のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応させ、次に室温で１０ないし１６時間撹拌した（Ｊｅｎｃｋｓ， Ｗ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５９， ８１， ｐｐ４７５）。前記ＰＥＧ−４ＨＢを次に適切な緩衝液へ希釈して即時精製及び分析に供する。
アミド結合を介してＰＥＧへ結合される、ヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの包合体。
以下の構造を有するＰＥＧ試薬を、実施例３に記載される手段を使用する、ケトンを含有する天然にコードされていないアミノ酸へ結合する。すなわち、
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４及びＮは分子量約２０，０００である。前記反応条件、精製条件、及び分析条件は実施例３に記載されるとおりである。
本実施例は、４ＨＢポリペプチドへの２つの異なる天然にコードされていないアミノ酸の導入を詳述する。
本実施例は、以下の残基のうちの２つの位置でケトン官能性を含む天然にコードされていないアミノ酸を組み込むｈＧＨポリペプチドの生成のための方法を示す。すなわち、Ｅ３０、Ｅ７４、Ｙ１０３、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｋ１４０、及びＫ１４５である。ｈＧＨポリペプチドを実施例１及び２において記載されるとおり調製するが、例外は抑制因子コドンが前記核酸内の２つの異なる部位で導入されることである。
本実施例は、実施例３２に従って同定される残基のうちの２つの位置でケトン官能性を含む天然にコードされていないアミノ酸を組み込むｈＩＦＮポリペプチドの生成のための方法を示し、Ｘ＊は天然にコードされていないアミノ酸を表す。ｈＩＦＮポリペプチドを実施例３２及び３３に記載されているとおりに調製するが、例外は抑制因子コドンを前記核酸内の２つの異なる部位で導入することである。
本実施例は、以下の残基のうちの２つの位置でケトン官能性を含む天然にコードされていないアミノ酸を組み込むｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの生成のための方法を示す。すなわち、（配列番号２９、又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸などにある）Ｗ５９Ｘ＊及びＴ１３４Ｘ＊、Ｌ１３１Ｘ＊及びＳ６７Ｘ＊、Ｓ６７Ｘ＊及びＱ９１Ｘ＊、Ｔ１３４Ｘ＊及びＳｅｒ７７Ｘ＊であり、式中Ｘ＊は天然にコードされていないアミノ酸を表す。ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドを実施例３６及び３７に記載されるとおりに調製するが、例外は抑制因子コドンを前記核酸内の２つの異なる部位で導入することである。
本実施例は、以下の残基のうちの２つの位置でケトン官能性を含む天然にコードされていないアミノ酸を組み込むｈＥＰＯポリペプチドの生成のための方法を示す。すなわち、Ｎ２４Ｘ＊及びＧ１１３Ｘ＊、Ｎ３８Ｘ＊及びＱ１１５Ｘ＊、Ｎ３６Ｘ＊及びＳ８５Ｘ＊、Ｎ３６Ｘ＊及びＡ１２５Ｘ＊、Ｎ３６Ｘ＊及びＡ１２８Ｘ＊、Ｑ８６Ｘ＊及びＳ１２６Ｘ＊であり、式中Ｘ＊は天然にコードされていないアミノ酸を呈する。ｈＥＰＯポリペプチドを実施例４０及び４１において記載されるとおり調製するが、例外は抑制因子コドンを前記核酸内の２つの異なる部位で導入することである。
本実施例はヒドラジド含有ＰＥＧへの４ＨＢポリペプチドの抱合及びその後のｉｎ ｓｉｔｕ還元を詳述する。
カルボニル含有アミノ酸を組み込む４ＨＢポリペプチドを実施例２及び３、実施例３３及び３、実施例３７及び３、並びに実施例４１及び３に記載される手段に従って調製する。一度修飾されると、以下の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧを４ＨＢポリペプチドへ抱合する。すなわち、
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
であり、式中Ｒ＝メチル、ｎ＝２及びＮ＝分子量１０，０００及びＸはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製された４ＨＢを、２５ｍＭＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ７．０、又は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ｐＨ４．５において０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬで溶解し、１ないし１００倍の過剰量のヒドラジン含有ＰＥＧと反応させ、前記対応するヒドラジンを原位置でストックの１ＭのＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の添加により還元し、終濃度１０ないし５０ｍＭになるよう水に溶解する。反応を暗室中で４℃ないし室温で１８ないし２４時間実施する。ｐＨ約７．６の１Ｍトリス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加してトリスの終濃度を５０ｍＭにすることによって、又は適切な緩衝液へ希釈することによって反応を停止させ、即時精製に供する。
本実施例は、４ＨＢポリペプチドへのアルキン含有アミノ酸の導入及びアジ化ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ａｚｉｄｅ）による誘導体化を詳述する。
以下の残基、３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１４０、１４３、１４５、及び１５５を各々以下の天然にコードされていないアミノ酸（ｈＧＨ；配列番号２）と置換する。
Figure 2007519422
ｐ−プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−チロシンのｈＧＨへの部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号２（ｈＧＨ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ミトコンドリアＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び上述の実施例２に記載される９、１０又は１１である。実施例３２に従って同定されるｈＩＦＮの残基のいずれかを、この天然にコードされていないアミノ酸と置換する。ｈＩＦＮへのｐ−プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−チロシンの部位特異的組み込みのために利用される配列は、配列番号２４（ｈＩＦＮ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ミトコンドリアＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び上述の実施例２に記載される９、１０又は１１である。ｈＧ−ＣＳＦの以下の残基５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７、及び１７１を各々、この天然にコードされていないアミノ酸と置換する。ｈＧ−ＣＳＦへのｐ−プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−チロシンの部位特異的組み込みのために利用される配列は、配列番号２９（ｈＧ−ＣＳＦ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ミトコンドリアＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、上述の実施例２に記載の９、１０又は１１である。ｈＥＰＯの以下の残基、２１、２４、３８、８３、８５、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、及び１２８を各々、この天然にコードされていないアミノ酸と置換する。ｈＥＰＯへのｐ−プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−チロシンの部位特異的組み込みに利用される配列は、配列番号３８（ｈＥＰＯ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナスキー（ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ミトコンドリアＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、及び上述の実施例２に記載の９、１０又は１１である。プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）チロシンを含有する４ＨＢポリペプチドを大腸菌で発現させ、実施例３に記載される条件を使用して精製する。
ＰＢ緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ＝８）において０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬで溶解したプロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−チロシンを含有する精製された４ＨＢ、及び１０ないし１０００倍の過剰量のアジ化物含有ＰＥＧを前記反応混合物へ添加する。ＣｕＳＯ４及びＣｕワイヤの触媒量を次に前記反応混合物へ添加する。前記混合物をインキュベートした後（室温又は３７℃で約４時間、又は４℃で一晩を含むがこれには限定されない）、水を添加し、透析膜を通じて前記混合物をろ過する。実施例３に記載される同様の手段によって前記試料を添加のために分析できるが、それには限定されない。
本実施例において、前記ＰＥＧは以下の構造を有するであろう。すなわち、
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
であり、式中Ｒはメチル、ｎは４、Ｎは分子量１０，０００である。
本実施例は４ＨＢポリペプチドにおける大きな疎水性アミノ酸のプロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）チロシンとの置換を詳述する。
ｈＧＨの以下の領域すなわち、１ないし５（Ｎ末端）、６ないし３３、（Ａ螺旋）、３４ないし７４（Ａ螺旋ないしＢ螺旋の領域、Ａ−Ｂループ）、７５ないし９６（Ｂ螺旋）、９７ないし１０５（Ｂ螺旋ないしＣ螺旋の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６ないし１２９（Ｃ螺旋）、１３０ないし１５３（Ｃ螺旋ないしＤ螺旋の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４ないし１８３（Ｄ螺旋）、１８４ないし１９１（Ｃ末端）（配列番号２）の１つの中に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を、実施例７に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。同様に、ｈＩＦＮの以下の領域、すなわち（配列番号２４又は他のＩＦＮポリペプチドの対応するアミノ酸などにある）１ないし９（Ｎ末端）、１０ないし２１（Ａ螺旋）、２２ないし３９（Ａ螺旋ないしＢ螺旋の領域）、４０ないし７５（Ｂ螺旋）、７６ないし７７（Ｂ螺旋ないしＣ螺旋の領域）、７８ないし１００（Ｃ螺旋）、１０１ないし１１０（Ｃ螺旋ないしＤ螺旋の領域）、１１１ないし１３２（Ｄ螺旋）、１３３ないし１３６（Ｄ螺旋ないしＥ螺旋の領域）、１３７ないし１５５（Ｅ螺旋）、１５６ないし１６５（Ｃ末端）を、実施例７に記載されるその後の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。あるいは、ｈＧ−ＣＳＦの以下の領域、すなわち（分泌シグナル配列３５又は３６であるＮ末端の３０個のアミノ酸を持たない配列番号２９、及び配列番号２８又は３０の対応するアミノ酸にある）３１０螺旋（４４ないし４７）及びα螺旋（４８ないし５３）からなるＡ螺旋ないしＢ螺旋の４４ないし５３にある短い螺旋状セグメント、ミニＥ螺旋を含む、１ないし１０（Ｎ末）、１１ないし３９（Ａ螺旋）、４０ないし７０（Ａ螺旋ないしＢ螺旋の領域）、７１ないし９１（Ｂ螺旋）、９２ないし９９（Ｂ螺旋ないしＣ螺旋の領域）、１００ないし１２３（Ｃ螺旋）、１２４ないし１４２（Ｃ螺旋ないしＤ螺旋の領域）、１４３ないし１７２（Ｄ螺旋）、１７３ないし１７５（Ｃ末）のうちの１つの中に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を、実施例７に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。ｈＥＰＯの以下の領域、すなわち１ないし７（Ｎ末端）、８ないし２６（Ａ螺旋）、２７ないし５４（βシート１（３９ないし４１）及びミニＢ’螺旋（４７ないし５２）を含有するＡＢループ）、５５ないし８３（Ｂ螺旋）、８４ないし８９（ＢＣループ）、９０ないし１１２（Ｃ螺旋）、１１３ないし１３７（ミニＣ’螺旋（１１４ないし１２１）及びβシート２（１３３ないし１３５）を含有するＣＤループ）、１３８ないし１６１（Ｄ螺旋）、１６２ないし１６６（Ｃ末端）のうちの１つの中に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を実施例７に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2007519422
一度修飾されると、ＰＥＧは、アルキン含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体へ結合される。ＰＥＧは以下の構造を有するであろう。すなわち、
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
及び結合手段は実施例７に記載されているものに従うであろう。このことは自生する大きな疎水性アミノ酸のうちの１つとほぼ等比体積であり、４ＨＢポリペプチド内の異なる部位でＰＥＧ誘導体により修飾される天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体を生じるであろう。
本実施例は、１つ以上のＰＥＧリンカーにより分離される４ＨＢポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモマルチマー、又はヘテロマルチマーの生成を詳述する。
実施例７で生成される、アルキンを含有する４ＨＢポリペプチド変異体は以下の形態、すなわち、
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（式中ｎは４であり、ＰＥＧは平均分子量約５，０００を有する）の二機能性ＰＥＧ誘導体と反応し、２つの４ＨＢ分子がＰＥＧによって物理的に分離される、対応する４ＨＢポリペプチドホモ二量体を生じる。類似した様式で、４ＨＢポリペプチドは１つ以上の他のポリペプチドへ結合して、ヘテロ二量体、ホモマルチマー、又はへテロマルチマーを形成することが可能である。結合、精製、及び分析は、実施例７及び３にあるとおり実施されるであろう。
本実施例は、糖類部分の４ＨＢポリペプチドへの結合を詳述する。
次の残基すなわち、２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、及び１８７（ｈＧＨ、配列番号２）のうちの１つの残基を実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。同様に、次の残基すなわち、（配列番号２４、又は他のＩＦＮポリペプチドの対応するアミノ酸にある）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６，１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５のうちの１つの残基を以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。次の残基すなわち、（配列番号２９、又は配列番号２８、３０、３５、３６、又は他のＧ−ＣＳＦポリペプチドにおける対応するアミノ酸にある）３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０、及び１７１のうちの１つの残基を、実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。次の残基すなわち、（配列番号３８、又は他のＥＰＯポリペプチドの対応するアミノ酸にある）２１、２４、２８、３０、３１、３６、３７、３８、５５、７２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６のうちの１つの残基を実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2007519422
一度修飾されると、前記カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体をＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合したアミノオキシアナログと反応させる。前記４ＨＢポリペプチド変異体（１０ｍｇ／ｍＬ）及び前記アミノオキシ糖類（２１ｍＭ）を水性の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に混合し、３７℃で７ないし２６時間インキュベートする。糖類の抱合された４ＨＢポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）をＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）及びβ−１，４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４単位／ｍＬ）とともに１５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）において大気温で４８時間インキュベートすることによって、第二糖類を第一糖類へ酵素的に結合する（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９７０， ２４５， ５０５７−５０６１）。
本実施例は、ＰＥＧ化した４ＨＢポリペプチドアンタゴニストの生成を詳述する。
次の残基のうちの１つ、すなわち、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、又は１２７（ｈＧＨ、配列番号２又は、配列番号１若しくは３における対応するアミノ酸）を実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。次の残基のうちの１つ、すなわち、２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５（ｈＩＦＮ；配列番号２４、又は配列番号２３若しくは２５における対応するアミノ酸）を実施例３において記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換し、これらの置換のうちの１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは選択される部位並びに望ましい活性によって弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして場合によっては作用できる。次の残基のうちの１つ、すなわち、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５における対応するアミノ酸）を、実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。次の残基のうちの１つ、すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１４５、（ｈＧ−ＣＳＦ；配列番号２９、又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸）を、実施例３において記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。次の残基のうちの１つ、すなわち、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９（ｈＥＰＯ；配列番号３８、又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）を、実施例３に記載されるとおり、以下の天然にコードされていないアミノ酸と置換する。
Figure 2007519422
一度修飾されると、カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体は、次の形態のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（式中Ｒはメチル、ｎは４、Ｎは分子量２０，０００である）と反応して、４ＨＢポリペプチド内の単一部位においてＰＥＧ誘導体で修飾される天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドアンタゴニストを生じるであろう。結合、精製、及び分析を実施例３にあるとおり実施する。
４ＨＢ分子が直接結合される４ＨＢポリペプチドホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモマルチマー、又はヘテロマルチマーの生成。
アルキン含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチド変異体は、アジド含有アミノ酸を含む別の４ＨＢポリペプチド変異体へ直接結合でき、その各々は、それに限定を加えるものではないが、実施例１０に記載される部位における天然にコードされていないアミノ酸置換を含む。このことは前記２つの４ＨＢポリペプチド変異体がＩＩ部位結合インターフェイスで物理的に接合する、対応する４ＨＢポリペプチドホモ二量体を生じるであろう。類似した様式で、４ＨＢポリペプチドを１つ以上の他のポリペプチドへ結合して、ヘテロ二量体、ホモマルチマー、又はへテロマルチマーを形成することが可能である。結合、精製、及び分析は実施例３、６、及び７にあるとおり実施される。
ＰＥＧ−ＯＨ ＋ Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’ → ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
（式中、Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’はＡ、ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’はＢ）
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキル（Ａ）と反応させ、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物において、ｎは１ないし９の整数であり、Ｒ’は直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和Ｃ１ないしＣ２０アルキル基又はヘテロアルキル基でありうる。Ｒ’はＣ３ないしＣ７の飽和又は不飽和環状アルキル又は環状へテロアルキル、置換された又は未置換のアリール基又はへテロアリール基、又は置換された若しくは未置換のアルカリール基（前記アルキルはＣ１ないしＣ２０の飽和又は不飽和アルキル）又はへテロアルカリール基でもありうる。典型的には、ＰＥＧ−ＯＨは分子量８００ないし４０，０００ダルトン（Ｄａ）を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ＋ Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ → ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
分子量２０，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ； ２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ， Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）に混合したＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に８０重量％溶液としてキシレン（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した臭化プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）の溶液、及びＫＩの触媒量を前記溶液へ添加し、結果として生じる混合物を２時間加熱還流した。次に水（１ｍＬ）を添加し、前記溶媒を真空下で除去した。残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、前記有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、前記容積を約２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。結果として生じる沈殿を回収し、冷ジエチルエーテルで何回も洗浄し、乾燥させると、プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−Ｏ−ＰＥＧを生じた。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ＋ Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ → ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
分子量２０，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ； ２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）を、ＴＨＦ（３５ｍＬ）に混合したＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に５−ブロモ−１−ペンチン１５当量（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫＩの触媒量を前記混合物へ添加した。結果として生じる混合物を１６時間加熱還流した。次に水（１ｍＬ）を添加し、前記溶媒を真空除去した。前記残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、前記有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、前記容積を約２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。結果として生じる沈殿を回収し、冷ジエチルエーテルで何回も洗浄し、乾燥させると、対応するアルキンを生じた。５−クロロ−１−ペンチンを同様の反応において使用してもよい。
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ ＋ ＮａＯＨ ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ → ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ ＋ ＭｓＣｌ ＋Ｎ（Ｅｔ）３ → ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ ＋ ＬｉＢｒ → ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ ＋ ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ → ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び水（２．５ｍＬ）に溶解した３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液へ、まず、粉末状になった水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでキシレン（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）に８０重量％溶液として溶解した臭化プロパギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ）の溶液を添加した。前記反応混合物を還流下で６時間加熱した。前記混合物へ１０％クエン酸（２．５ｍｌ）を添加し、前記溶媒を真空下で除去した。前記残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、３−プロパギルオキシベンジル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）アルコールを生じた。
塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加し、前記反応物を冷蔵庫で１６時間放置した。通常の処理で前記メシレートを青白い黄色の油として得た。この油（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。前記反応混合物を還流下で１時間加熱し、その後室温へ冷却した。前記混合物へ水（２．５ｍＬ）を添加し、前記溶媒を真空下で除去した。前記残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、望ましい臭化物を生じた。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、前記溶液を氷槽中で冷却した。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を数分間の一定時間に激しく撹拌しながら添加した後、上述から得られた臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）及びＫＩの触媒量を添加した。冷却槽を除去し、結果として生じる混合物を１２時間還流加熱した。水（１．０ｍＬ）を前記混合物へ添加し、前記溶媒を真空下で除去した。前記残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、前記有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、前記容積を約２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下による添加によって白色沈殿が生じ、それを回収してＰＥＧ誘導体を産じた。
ｍＰＥＧ−ＮＨ２ ＋ Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’ → ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
最終的なアルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーは、末端機能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーを、上述のようにアルキン官能性を含有する反応性分子へ結合することによっても得られうる。ｎは１ないし１０である。Ｒ’はＨ又はＣ１ないしＣ４の小アルキル基でありうる。
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ ＋ ＮＨＳ ＋ ＤＣＣ → ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２ ＋ ＮＨＳＯ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ → ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、前記溶液を室温で一晩撹拌した。結果として生じる粗ＮＨＳエステル７をさらに精製することなく以下の反応で使用した。
分子量５，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、前記混合物を４℃へ冷却した。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら少量ずつ添加した。前記混合物を室温へと加温しながら３時間撹拌したままにした。次に水（２ｍＬ）を添加し、前記溶媒を真空下で除去した。前記残渣へＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を添加し、前記有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、前記容積を約２ｍＬへ減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）へ滴下して添加した。結果として生じる沈殿を回収して真空乾燥した。
本実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホン酸塩又はメシレートとも呼ばれうるポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステルの調製を表す。前記対応するトシレート及びハロゲン化物は同様の手法により調製できる。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ＋ ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ ＋ Ｎ（Ｅｔ）３ → ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３ → ｍＰＥＧ−Ｎ３
１５０ｍＬのトルエンに混合したｍＰＥＧ−ＯＨ（分子量＝３，４００、２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間共沸蒸留し、前記溶液を室温へ冷却した。４０ｍＬの乾ＣＨ２Ｃｌ２及び２．１ｍＬの乾トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）を前記溶液へ添加した。前記溶液を氷槽中で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）１．２ｍＬを滴下して添加した。前記溶液を窒素下において一晩室温で撹拌し、無水エタノール２ｍＬを添加することによって前記反応物を急冷した。前記混合物を真空下で蒸発させて主としてトルエン以外の溶媒を除去し、ろ過し、真空下で再度濃縮し、その後ジエチルエーテル１００ｍＬへと沈殿させた。前記ろ液を冷ジエチルエーテルで何度も洗浄し、真空乾燥すると、メシレートを生じた。
前記メシレート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ７５ｍｌに溶解し、前記溶液を４℃へ冷却した。前記冷却した溶液へアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。前記反応物を窒素下で２時間加熱還流した。次に前記溶媒を蒸発させ、前記残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。前記容積を２０ｍｌまで減少させ、前記生成物を冷乾エーテル１５０ｍｌへ添加することによって沈殿させた。
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ → Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ → Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ ＋ Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３ → ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９８，５９５に記載される方法を使用して、４−アジドベンジルアルコールを生成できる。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ｍｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加し、前記反応物を冷蔵庫で１６時間放置した。通常の処理によりメシレートを青白い黄色の油として得た。この油（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。前記反応混合物を１時間加熱還流した後、室温へ冷却した。前記混合物へ水（２．５ｍＬ）を添加し、前記溶媒を真空下で除去した。前記残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮すると、望ましい臭化物を得た。
ｍＰＥＧ−ＯＨ ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）に溶かしたＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を前記混合物へ、ＫＩの触媒量とともに添加した。結果として生じる混合物を１２時間加熱還流した。水（１．０ｍＬ）を前記混合物へ添加し、前記溶媒を真空除去した。前記残渣へＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、前記有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、前記容積を約２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）への滴下による添加で沈殿が生じ、それを回収してｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を産じた。
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ ＋ Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ → Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（分子量３，４００Ｄａ、２．０ｇ）を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、前記溶液を０℃へ冷却した。激しく撹拌しながら３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）プロピオン酸（５当量）を添加した。３時間後、Ｈ２Ｏ２０ｍＬを添加し、前記混合物を室温でさらに４５分間撹拌した。前記ｐＨを３へ０．５ＮのＨ２ＳＯ４で調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度になるよう添加した。前記反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルによる沈殿の後、前記生成物をろ過により回収し、真空乾燥させると、オメガ−カルボキシ−アザイドＰＥＧ誘導体を産じた。
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ ＋ ＨＣ≡ＣＬｉ → ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
当分野で公知のように調製され、ＴＨＦに溶解して−７８℃へ冷却したリチウムアセチリド（４当量）の溶液へ、ＴＨＦに溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を激しく撹拌しながら滴下して添加する。３時間後、前記反応を室温へ加温させ、ブタノール１ｍＬの添加で急冷する。次にＨ２Ｏ２０ｍＬを添加し、前記混合物を室温でさらに４５分間撹拌した。ｐＨを３へ０．５ＮのＨ２ＳＯ４で調整し、約１５重量％の濃度になるようＮａＣｌを添加した。前記反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿させた後、前記生成物をろ過により回収し、真空乾燥させると、１−（ブト−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を産じた。
Ｌ． Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， （２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００、Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−７（２００３）、Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７； Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ， ＆ Ｐ．Ｃ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ １１：１１３５−１１３７； Ｊ．Ｗ． Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， （２００２）， ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４：及びＬ． Ｗａｎｇ， ＆ Ｐ．Ｇ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， （２００２）， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．， １−１０に記載されている方法を使用して、アジ化物含有及びアセチレン含有アミノ酸をタンパク質へ部位選択的に組み込んだ。一度アミノ酸を組み込むと、２ｍＭＰＥＧ誘導体、１ｍＭＣｕＳＯ４、及び〜１ｍｇＣｕワイヤの存在下で、リン酸緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ８に混合した０．０１ｍＭタンパク質を使用して環化付加反応を３７℃で４時間実施した。
本実施例は、ｐ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）誘導体及びｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体の合成を記述する。
Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｂ．Ａ．Ｃ．， Ｗａｎｇ， Ｌ．， Ｂｒｏｃｋ， Ａ．， Ｃｈｏ， Ｃ． ＆ Ｓｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （２００３） ４２， ６７３５−６７４６においてすでに記載されている手法を使用してラセミｐＡＦを合成した。
ｍ−ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン誘導体を合成するため、以下の手法を完了した。（Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（０．３８２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ、７０ｍＬ）に溶解した溶液を室温（ＲＴ）で１時間撹拌し、そこへメトキシ−ポリエチレングリコールアミン（ｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２、７．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、Ｍｔ． ３０Ｋ， ＢｉｏＶｅｃｔｒａ社製）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。前記反応物をＲＴで４８時間撹拌した後、約１００ｍＬへ濃縮した。前記混合物を冷エーテル（８００ｍＬ）へ滴下して添加した。ｔ−Ｂｏｃ保護された生成物を沈殿させ、ろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬで洗浄した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に再溶解し、エーテル（８００ｍＬ）中で２回沈殿させることによってさらに精製した。前記生成物を真空乾燥させると、７．２ｇ（９６％）を産じ、そのことはＮＭＲ及びニンヒドリン検査により確認された。
上述のように得られた保護された生成物（７．０ｇ）の脱Ｂｏｃを５０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ）中において０℃で１時間実施した後、ＲＴで１．５時間実施した。真空でＴＦＡのほとんどを除去した後、ジオキサン（１ｍＬ）に溶解した４ＮのＨＣｌを前記残渣へ添加することによって、前記ヒドロキシルアミン誘導体のＴＦＡ塩をＨＣｌ塩へ変換した。前記沈殿をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、エーテル（８００ｍＬ）に再沈殿させた。最終生成物（６．８ｇ、９７％）をろ過により回収し、エーテル３×１００ｍＬで洗浄し、真空乾燥し、窒素下で保存した。同じ手法を使用して、他のＰＥＧ（５Ｋ、２０Ｋ）ヒドロキシルアミン誘導体を合成した。
本実施例は非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに使用される発現方法及び精製方法を記述する。宿主細胞はオルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びｈＧＨコンストラクトで形質変換されている。
形質変換したＤＨ１０Ｂ（ｆｉｓ３）細胞の凍結したグリセロールストックからのわずかなスタブをまず、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有の２ｍｌの定義された培地（ロイシン、イソロイシン、微量金属、及びビタミンで補強されたグルコース最小培地）において３７℃で成育させた。ＯＤ６００が２ないし５に達すると、６０μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有の６０ｍｌの新鮮な定義された培地へ転移し、ＯＤ６００が２ないし５になるまで３７℃で再度成育させた。培養物５０ｍｌを、５ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＢＩ）に搭載した１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の定義された培地２ｌへ転移した。発酵槽のｐＨをｐＨ６．９に炭酸カリウムで調節し、温度を３７℃にし、気流速度を５ｌｐｍにし、ポリアルキレン脱気器ＫＦＯ Ｆ１１９（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）で発砲させた。撹拌器の速度は溶解した酸素レベルを３０％以上に維持するよう自動調整され、純粋な酸素を使用して、撹拌器の速度がそれらの最大値に達する場合、空気散布を補強した。３７℃で８時間後、前記培養物に、指数関数的に増大する速度で、定義された培地の５０倍濃縮物を供給し、０．１５／時の特定成育速度を維持した。ＯＤ６００が約１００に達すると、パラ−アセチル−フェニルアラニンのラセミ混合物を終濃度が３．３ｍＭになるよう添加し、前記温度を２８℃へ低下させた。０．７５時間後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを終濃度０．２５ｍＭになるよう添加した。細胞を２８℃でさらに８時間成育し、ペレットにし、更なる処理まで−８０℃で凍結した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの取扱説明書マニュアルによって提供されるＨｉｓタグのついたタンパク質の標準的な精製手法を介して、ＰｒｏＢｏｎｄニッケルキレート樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してＨｉｓタグのついた変異体ｈＧＨタンパク質を精製した後、陰イオン交換カラムにかけた。
前記精製されたｈＧＨを８ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、緩衝液を反応緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）へ交換した。ＭＰＥＧ−オキシアミン粉末をｈＧＨ溶液へ、ＰＥＧ：ｈＧＨの２０：１モル比で添加した。前記反応を２８℃で２日間やさしく振とうしながら実施した。前記ＰＥＧ−ｈＧＨを未反応のＰＥＧ及びｈＧＨから、陰イオン交換カラムを介して精製した。
各ＰＥＧ化した変異体ｈＧＨの性質を３つのアッセイにより評価した後、動物実験に入った。ＰＥＧ−ｈＧＨの純度を、非還元条件下でＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液を使用する４ないし１２％のアクリルアミドＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲルを実施することによって検討した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。前記ゲルをクーマシーブルーで染色した。前記ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは密度計走査に基づいて９５％純度を超越していた。各ＰＥＧ−ｈＧＨにおける菌体内毒素レベルを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）社製のＫＴＡ２キットを使用する動態学的ＬＡＬアッセイにより検査すると、投与量あたり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２に記載されている）ＩＭ−９ ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイで査定すると、ＥＣ５０値は１５ｎＭ未満であった。
本実施例は非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの精製及び均一性を査定するための方法を記述する。
図８は、位置９２で非天然アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ゲルのレーン３、４、及び５は、位置９２で５ｋＤａ、２０ｋＤａ、又は３０ｋＤａのいずれかのＰＥＧ分子へ共有結合されるｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨを示す。ＰＥＧ化された非天然アミノ酸を含むさらなるｈＧＨポリペプチドが図１１に示されている。各ＰＥＧ−ｈＧＨタンパク質の５μｇを各ＳＤＳ−ＰＡＧＥへ負荷した。図１１、パネルＡ：レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＷＨＯ ｒｈＧＨ 基準標準物質（２μｇ）；レーン３及び７、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン４、３０ＫＰＥＧ−Ｙ３５ｐＡＦ；レーン５、３０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン６、２０ＫＰＥＧ−Ｒ１３４ｐＡＦ；レーン８、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２０μｇ）である。図１１、パネルＢ：レーン９、分子量マーカー、レーン１０、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２μｇ）；レーン１１、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ；レーン１２、３０ＫＰＥＧ−Ｋ１４５ｐＡＦ；レーン１３、３０ＫＰＥＧ−Ｙ１４３ｐＡＦ；レーン１４、３０ＫＰＥＧ−Ｇ１３１ｐＡＦ；レーン１５、３０ＫＰＥＧ−Ｆ９２ｐＡＦ／Ｇ１２０Ｒ、レーン１６、ＷＨＯ ｒｈＧＨ基準標準物質（２０μｇ）である。図９は、ＩＭ−９細胞においてＰＥＧ化されたｈＧＨポリペプチド（５ｋＤａ、２０ｋＤａ、又は３０ｋＤａのＰＥＧ）の生物活性を示し、方法を実施例２に記載されているとおり実施した。
ｈＧＨ−ＰＥＧ包合体の純度は（限定されるものではないがトリプシン開裂を含む）タンパク質分解後の質量分析により査定できる（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ＆ Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。トリプシン分解を実施するための方法は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ （２００２） 第４版、ｐｐ．１９３８にも記載されている。記載される方法への修正を実施した。試料を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で一晩透析する。ｒｈＧＨポリペプチドをトリプシン（ＴＰＣＫ処理されたトリプシン、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）とともに、質量比６６：１で３７℃の水槽で４時間インキュベートした。前記試料を氷上で数分間インキュベートし、消化反応を停止し、その後、ＨＰＬＣ分析の間４℃で維持した。消化した試料（〜２００μｇ）を０．１％トリフルオロ酢酸中の２５×０．４６ｃｍＶｙｄａｃ Ｃ−８カラム（ビーズの大きさ５μｍ、孔の大きさ１００Å）へ負荷し、０ないし８０％のアセトニトリルの勾配で、７０分かけて流速１ｍｌ／分で３０℃において溶出した。トリプシン処理したペプチドの溶出を２１４ｎｍでの吸光によりモニターした。
図１０、パネルＡは、記載されるトリプシン開裂部位及び、矢印で指定される非天然アミノ酸置換Ｆ９２ｐＡＦを有するｈＧＨの一次構造を示す（図はＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８８） １０（４）：３２６−３３７から修正されている）。パネルＢはＰＥＧ化された天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じるペプチド（３０Ｋ ＰＥＧ Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦｒｈＧＨ、Ａと標識）、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生じるペプチド（Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨ、Ｂと標識）、及び野生型ｈＧＨから生じるペプチド（ＷＨＯ ｒｈＧＨ、Ｃと標識）の上書きされたトリプシン処理マップを示す。ＷＨＯ ｒｈＧＨ及びＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのトリプシン処理マップの比較によってペプチドピーク１及びペプチドピーク９の２つのみのピーク移行が明らかになり、残りのピークは同一である。これらの差異は、発現されるＨｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのＮ末端でのＨｉｓ６の添加により生じ、結果としてピーク１の移行を生じるのに対し、ピーク９における移行は、残基９２でのフェニルアラニンのｐ−アセチル−フェニルアラニンとの置換により生じる。パネルＣでは、パネルＢからのピーク９の拡大図が示されている。Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ及び３０Ｋ ＰＥＧ Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのトリプシン処理マップの比較により、Ｈｉｓ６−Ｆ９２ｐＡＦ ｒｈＧＨのＰＥＧ化に関するピーク９の消失が明らかになり、したがって修飾がペプチド９に対して特異的であることを確立する。
本実施例は非天然アミノ酸を各々含む２つのｈＧＨポリペプチドから形成されるホモ二量体を記述する。
図１２は、ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５に記載されている機能基及び反応性を有する二機能性のリンカーと接合したこの修飾されたポリペプチドのホモ二量体との位置９２におけるｐ−アセチル−フェニルアラニン置換を含むＨｉｓタグのついたｈＧＨポリペプチドからのＩＭ−９アッセイ結果を比較する。
本実施例はｈＧＨアンタゴニストとして作用する単量体及び二量体のｈＧＨポリペプチドを記述する。
Ｇ１２０Ｒ置換がＩＩ部位へと導入されたｈＧＨ変異タンパク質は単一のｈＧＨ受容体を結合することが可能であるが、２つの受容体を二量体化することは不可能である。前記変異タンパク質は細胞内シグナル伝達経路を活性化せずに受容体部位を占有することによって試験管内でおそらくｈＧＨアンタゴニストとして作用する（Ｆｕｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７−１６８０（１９９２））。図１３、パネルＡは、Ｇ１２０Ｒ置換を伴うｈＧＨによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータを示す。同一位置（Ｇ１２０）で組み込まれる非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドは、図１３、パネルＢに示されるｈＧＨアンタゴニストとしても作用する分子を生じた。図１３、パネルＢに示されるｈＧＨアンタゴニストの二量体を、ｈＧＨのＰＥＧ化について実施例２５に記載される機能基及び反応性を有する二機能性のリンカーと結合して構築した。図１４は、この二量体がＩＭ−９アッセイにおいて生物活性も欠失することを示す。
Ｇ１２０ｐＡＦ置換を含むｈＧＨポリペプチドを、ＰＥＧリンカーの結合するＧ１２０ｐＡＦ修飾されたｈＧＨポリペプチドの二量体と比較する更なるアッセイを実施した。ＳＴＡＴ５のＷＨＯ ｈＧＨ誘導性リン酸化をＰＥＧリンカーの結合する単量体及び二量体の投与反応範囲と競合させた。ＩＭ−９細胞及びラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）／ＢＡＦ３細胞に関する細胞表面受容体結合について前記単量体及び二量体がＧＨと競合することを示す表面受容体競合研究を実施した。前記二量体は前記単量体よりも可能性のあるアンタゴニストとして作用した。表４はこれらの研究からのデータを示す。
Figure 2007519422
本実施例は、ｈＧＨ受容体についてのｈＧＨポリペプチドのｈＧＨ活性及び親和性の測定を詳述する。
ラットＧＨ受容体のクローニング及び精製
ラットＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ＧＨＲ ＥＣＤ、アミノ酸Ｓ２９ないしＴ２３８）を、Ｃ末端の６Ｈｉｓタグを有するフレームのＮｄｅＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間のｐＥＴ２０ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローニングした。Ｌ４３のＲへの変異を導入して、ヒトＧＨ受容体結合部位をさらに近似した（Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （１９９５） ９２（４）：９５９−６３）。３０℃で４ないし５時間、０．４ｍＭＩＰＴＧを使用して誘導することによって、組み換えタンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において生成した。細胞を溶解した後、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００の３０ｍＬで加圧型細胞破砕装置において再懸濁することによって前記ペレットを４回洗浄し、トリトンＸ−１００を含まない同一緩衝液で２回洗浄した。この時点で、封入体は９５％を超えるＧＨＲ ＥＣＤからなり、０．１Ｍトリス、ｐＨ１１．５、２Ｍ尿素中で可溶化した。５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、１ＭＬ−アルギニン、３．７ｍＭシスタミン、６．５ｍＭシステアミンで平衡化したＳ１００（Ｓｉｇｍａ）ゲルろ過カラムに封入体溶液の一定分量を通過させることによって再折りたたみを達成した。可溶性タンパク質を含有する画分を組み合わせ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、２００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールに対して透析した。前記試料を簡潔には遠心分離していかなる沈殿も除去し、製造者の使用説明書にしたがって、タロン樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の一定分量とともにインキュベートした。前記樹脂を、５ｍＭイミダゾールで補強した透析緩衝液の２０容積で洗浄した後、タンパク質を透析緩衝液中の１２０ｍＭイミダゾールで溶出した。最後に、前記試料を５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、３０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロールに対して一晩透析し、手短に遠心分離し、いかなる沈殿も除去し、グリセロールの終濃度を２０％へ調整し、一定分量に小分けし、−８０℃で保存した。タンパク質の濃度を、ε＝６５，７００Ｍ−１＊ｃｍ−１の算出された吸光係数を使用してＯＤ（２８０）により測定した。
ＧＨＲに対するＧＨの結合に関するビアコア（Ｒ）分析
製造者により推奨されるように標準的なアミン結合手法を使用して、可溶性ＧＨＲ ＥＣＤの約６００ないし８００ＲＵをビアコア（Ｒ）ＣＭ５チップ上に固定した。前記受容体の有意な部分がこの技術によって不活性化されはしたが、結合動態に顕著な変化なく、約１００ないし１５０ＲＵの最大の特異的ＧＨ結合反応を生じるのにこのレベルの固定が十分であることが実験上見出された。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９９３） ２３４（３）：５５４−６３及びＷｅｌｌｓ ＪＡ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （１９９６） ９３（１）： １−６を参照してほしい。
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ビアコア（Ｒ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）における野生型ＧＨ又は変異体ＧＨ（０．１ないし３００ｎＭ）のさまざまな濃度を前記ＧＨＲ表面へ、流速４０μｌ／分で４ないし５分間注入し、解離を注入後１５分間モニターした。前記表面を４．５ＭＭｇＣｌ２の１５秒パルスにより再生した。少なくとも１００回の再生周期後に結合親和性の最小の損失（１ないし５％）のみをモニターした。受容体の固定されていない基準細胞を使用して、いずれかの緩衝液バルク効果及び非特異的結合を差し引いた。
ＧＨ力価実験から得られた動態学的結合データをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア（ビアコア（Ｒ））で処理した。「二価分析物」会合モデルは満足のいく適合（一般に３未満のχ２値）を提供し、提唱される連続的な１：２（ＧＨ：ＧＨＲ）二量体化（Ｗｅｌｌｓ ＪＡ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （１９９６） ９３（１）： １−６）と一致した。平衡解離定数（Ｋｄ）を個々の速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出した。
表５は、ＣＭ５チップ上に固定されるラットＧＨＲ ＥＣＤ（Ｌ４３Ｒ）を使用するビアコア（Ｒ）からの結合因子を示す。
Figure 2007519422
ＧＨＲ安定細胞系
ＩＬ−３依存性マウス細胞系ＢＡＦ３を、ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％熱失活ウシ胎児血清、５０μＭ２−メルカプトエタノール、及びＩＬ−３源としての１０％ＷＥＨＩ−３細胞系調整培地中で通例どおり継代した。細胞培養物をすべて３７℃で５％ＣＯ２の湿度の高い大気中で維持した。
ＢＡＦ３細胞系を使用して、ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）安定細胞クローン２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を確立した。簡潔には、１×１０７個の中間コンフルエントのＢＡＦ３細胞を、全長のラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）ｃＤＮＡを含有する一本鎖になったｐｃＤＮＡ３．１プラスミド１５μｇで電気穿孔した。形質移入した細胞は８００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び５ｎＭのＷＨＯ ｈＧＨを含有する培地において希釈を制限することによってクローニング前４８時間で回収できた。ＧＨＲ発現形質移入体を、ヒトＧＨＲに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）で表面染色することによって同定し、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）上で分析した。次に、ＧＨＲの良好なレベルを発現する形質移入体を（後述のとおりの）ＢｒｄＵ増殖アッセイにおけるＷＨＯ ｈＧＨに対する増殖活性についてスクリーニングした。表面受容体発現及び増殖能について一定の特徴を有する１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び５ｎＭのｈＧＨの存在下で、望ましい形質移入体の繰り返されるサブクローニングの２回の更なるラウンドに関して安定して形質移入されるラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）細胞クローンを確立した。確立される細胞クローン２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ１４はしたがって、ｈＧＨの不在下でＢＡＦ３培地＋１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で通例どおり維持される。
ＢｒｄＵ標識による増殖
ＢＡＦ３細胞系２Ｅ２−２Ｂ１２−Ｆ４を発現する血清飢餓ラットＧＨＲ（Ｌ４３Ｒ）を９６穴プレートにおいて５×１０４個の細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をｈＧＨタンパク質の１２地点投与量範囲で活性化し、同時に５０μＭＢｒｄＵで標識した（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。培養４８時間後、ＢＤ細胞固定／細胞透過溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌを使用して室温で３０分間細胞を固定／透過化した。ＢｒｄＵエピトープを暴露するため、ＤＮＡ分解酵素（Ｓｉｇｍａ）３０μｇ／ウェルを使用して、固定／透過化された細胞を３７℃で１時間処理した。ＡＰＣ抱合型抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による免疫蛍光染色により、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙでの試料分析が可能になった。
表６は、ｐＳＴＡＴ５（ＩＭ−９）増殖アッセイ及びＢｒｄＵ増殖アッセイに関して特徴付けられたＰＥＧ ｈＧＨ変異体の生物活性を示す。ＷＨＯ ｈＧＨはアッセイ間の比較について統一して表現される。
Figure 2007519422
本実施例はＰＥＧ化されたｈＧＨの試験管内活性及び生体内活性を測定するための方法を記述する。
細胞結合アッセイ
標識していないＧＨ、ｈＧＨ又はＧＭ−ＣＳＦのさまざまな濃度（容積：１０μｌ）の有無の下で及び１２５Ｉ−ＧＨ（約１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下で細胞（３×１０６個）をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中で二重にして０℃で９０分間インキュベートする（総容積１２０μｌ）。次に細胞を再懸濁し、３５０μｌプラスチック遠心チューブに入れた氷冷したＦＣＳ２００μｌの上に層状にして入れ、遠心分離する（１０００ｇ；１分間）。前記チューブの端を切除することによって前記ペレットを回収し、ペレット及び上清をガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）において個別に計数する。
競合因子の不在下での結合の総計（二重試料の平均）から標識されていないＧＨの１００倍過剰量の存在下での結合（ｃｐｍ）（非特異的結合）を差し引いたものとして特異的結合（ｃｐｍ）を決定する。非特異的結合は使用される各細胞タイプについて測定される。実験は１２５Ｉ−ＧＨの同一調製物を使用して個別の日に実施し、内部一致性を示すべきである。１２５Ｉ−ＧＨはＧＨ受容体生成細胞に対する結合を示す。前記結合は、標識されていない天然ＧＨ又はｈＧＨによって投与量依存的な様式で阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦ又は他のネガティブコントロールによっては阻害されない。天然ＧＨと同様の天然１２５Ｉ−ＧＨの結合と競合するｈＧＨの能力は、前記受容体が両者の形態を等しく十分に認識することを示唆する。
ＰＥＧ化されたｈＧＨの生体内研究
ＰＥＧ−ｈＧＨ、修飾されていないｈＧＨ及び緩衝液をマウス又はラットへ投与する。本結果は、有意な体重増加によって示される修飾されていないｈＧＨと比較して、本発明のＰＥＧ化されたｈＧＨの優れた活性及び長期の半減期を示すであろう。
抱合型及び非抱合型ｈＧＨ及びその変異体の生体内半減期の測定
すべての動物実験をＡＡＡＬＡＣ公認施設において及びＳｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物取り扱い及び使用委員会によって承認されるプロトコールの下で実施した。ラットを１２時間の明暗周期を備えた室内のケージに個別に収容した。動物に対し、認定されたＰｕｒｉｎａげっ歯類固形飼料５００１及び水への自由なアクセスを提供した。下垂体切除されたラットについては、飲料水はさらに５％グルコースを含有した。
薬物動態学的研究
各ＰＥＧ化された変異体ｈＧＨの品質を３つのアッセイにより評価した後、動物実験に入った。前記ＰＥＧ−ｈＧＨの純度を、非還元条件下でＭＥＭ ＳＤＳ泳動緩衝液を使用する、４ないし１２％のアクリルアミドＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲルで泳動することによって検討した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）。前記ゲルをクーマシーブルーで染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは濃度測定走査に基づいて９５％を超える純度であった。各ＰＥＧ−ｈＧＨにおける菌体内毒素レベルを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）社製ＫＴＡ２キットを使用する動態学的ＬＡＬアッセイにより検査し、１回の投与量につき５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性を（実施例２に記載されている）ＩＭ−９ ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイを使用して査定し、ＥＣ５０値は１５ｎＭ未満であると確認された。
ＰＥＧにより修飾される成長ホルモン化合物の薬物動態学的特性を互いに及び、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるオスのスプラーグドーリーラットにおけるＰＥＧ化されていない成長ホルモンと比較した。血液回収のため、カテーテルを頸動脈へ手術で設置した。カテーテル設置の成功後、投与前に動物を処置群（１群につき３ないし６匹）へ割り当てた、動物に０．４１ないし０．５５ｍｌ／ｋｇの投与容積において１ｍｇ／ｋｇの化合物を皮下投与した。留置しているカテーテルを介して血液試料をさまざまな時点でＥＤＴＡコーティングした微量遠心チューブへと回収した。遠心分離後、血漿を回収し、分析時まで−８０℃で保存した。化合物の濃度は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）のいずれかからの抗体サンドイッチ成長ホルモンＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。投与されるアナログに対応する標準物質を使用して濃度を算出した。モデリングプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ （Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、４．１版）を使用して薬物動態学的因子を概算した。直線的に上昇し／対数的に下降する台形の積分による非区画（ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）分析を使用して、濃度データを均一に測定した。
図１５はラットにおける単回皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群につきｎ＝３ないし４）に１ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ ｈＧＨ）、ＨｉｓタグのついたｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、又は位置９２で３０ｋＤａ ＰＥＧへ共有結合される非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むＨｉｓタグのついたｈＧＨポリペプチド（３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ）の単回の大量瞬時投与を供与した。血漿試料を示される時間間隔にわたって採取し、記載されるような注入された化合物についてアッセイした。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨは、対照のｈＧＨと比較して劇的に循環が上昇した。
図１６はラットにおける単回皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群につきｎ＝３ないし６）に１ｍｇ／ｋｇタンパク質の単回の大量瞬時投与を供与した。６箇所の異なる位置の各々での３０ｋＤａ ＰＥＧへ共有結合される非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドを、ＷＨＯ ｈＧＨ及び（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較した。血漿試料を示される時間間隔にわたって採取し、記載されるような注入される化合物についてアッセイした。表７は図１６に示されるｈＧＨポリペプチドの単回投与量投与についての薬物動態学的因子の値を示す。濃度対時間曲線を非区画（ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）分析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、４．１版）によって評価した。示される値は平均（±標準偏差）である。Ｃｍａｘは最大濃度、終末ｔ１／２は終末の半減期、ＡＵＣ０−＞ｉｎｆは無限大にまで外挿される濃度−時間曲線の下の面積；ＭＲＴは平均残余時間、Ｃ１／ｆは見かけの総血漿クリアランス、Ｖｚ／ｆは終末期における分布の見かけの容積を示す。
Figure 2007519422
薬力学的研究
下垂体切除したオスのスプラーグドーリーラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。下垂体を３ないし４週齢時に外科的に切除した。動物を３週間気候順化させ、その間体重をモニターした。本研究開始前７日間にわたって体重が０ないし８ｇ増加した動物が含まれ、処置群へ無作為に分類された。ラットに大量瞬時投与又は毎日の投与のいずれかで皮下投与した。本研究を通じて、ラットに毎日及び連続して体重測定、麻酔、採血、及び（適用可能な場合に）投与を行った。血液を眼窩洞（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）からヘパリン処理した毛細管を使用して採取し、ＥＤＴＡコーティングした遠心チューブへ移した。血漿を遠心分離により単離し、分析時まで−８０℃まで保存した。
図１７は、下垂体切除したラットにおける単回皮下投与後の平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。ラット（１群につきｎ＝５ないし７）に２．１ｍｇ／ｋｇタンパク質の単回大量瞬時投与を供与した。２つの異なる位置（位置３５、９２）の各々で３０ｋＤａ ＰＥＧへ共有結合した非天然アミノ酸ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドからの結果が示されている。血漿試料を示される時間間隔にわたって採取し、記載された注入される化合物についてアッセイした。
ぺプチドＩＧＦ−１はソマトメジン又はインスリン様成長因子のファミリーの一員である。ＩＧＦ−１は成長ホルモンの成長促進効果の多くを仲介する。提供されるラット／マウスＩＧＦ−１標準物質（Ｄｉａｇｎｏｓｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対し競合的に結合する酵素免疫アッセイを使用して、ＩＧＦ−１濃度を測定した。両側分布の、対になっていない、等分散を使用するｔ検定により有意差を決定した。図１８、パネルＡは下垂体切除したラットにおける化合物の評価を示す。ラット（１群あたりｎ＝５ないし７）に単回投与量又は毎日の投与量のいずれかを皮下投与した。動物には連続して体重測定、麻酔、採血、及び（適用可能な場合に）投与を毎日行った。体重の結果は、偽薬処置、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、ＨｉｓタグのついたｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）、及び位置３５及び９２で３０ｋＤａ ＰＥＧへ共有結合したｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについて示される。図１８、パネルＢは、ＰＥＧ化された天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与量の投与の後の血漿ＩＧＦ−１循環レベルに及ぼす効果に関する図が示されている。棒は標準偏差を表す。図１８、パネルＡにおいて、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ３５（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物についての９日目における体重増加は、より大きな体重増加が観察された３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物と統計的に異なる（ｐ＜０．０００５）。
図１８、パネルＣは、下垂体切除されたラットにおける化合物の評価を示す。ラット（１群につきｎ＝１１）に単回投与量又は毎日の投与量のいずれかを皮下投与した。動物を連続して毎日、体重測定、麻酔、採血、及び（適用可能な場合に）投与に供した。体重の結果は、偽薬処置、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、及び位置９２、１３４、１４５、１３１、及び１４３で３０ｋＤａ ＰＥＧへ共有結合したｐ−アセチル−フェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについて示される。図１８、パネルＤでは、偽薬処置及び野生型ｈＧＨと比較したときの、（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３で）ＰＥＧ化された天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与量の投与のあとの血漿ＩＧＦ−１の循環レベルに及ぼす効果に関する図が示されている。図１８、パネルＥは、（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３で）ＰＥＧ化された天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドに対応する平均（±標準偏差）血漿濃度を示す。血漿試料を示される時間間隔にわたって採取し、記載された注入される化合物についてアッセイした。棒は標準偏差を表す。
天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性及び／又は有効性に関するヒト臨床治験
目的 天然にコードされていないアミノ酸を含む皮下投与されるＰＥＧ化した組み換えヒトｈＧＨの安全性及び薬物動態学的特徴を（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（Ｒ）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含むがそれには限定されない）商業上入手可能なｈＧＨ生成物のうちの１つ以上と比較すること。
患者 年齢２０ないし４０歳及び体重６０ないし９０ｋｇの１８名の健常なボランティアを本研究に登録する。被験者は血液学又は血清化学について臨床的に有意な異常な実験値を有しておらず、負の尿中毒物学スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有していない。被験者は以下のいずれかの証拠を有するべきではない。すなわち、高血圧、いずれかの一次的な血液学的疾病の病歴、肝臓、腎臓、心臓循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、代謝系、神経学的な有意な疾病の病歴、貧血又は発作性疾患の病歴、細菌由来又は哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する既知の感度を有し、カフェイン含有飲料に対する習慣的及び多飲性の消費者であり、いずれかの他の臨床治験への参加又は研究に入る３０日以内に輸血又は献血をし、研究に入る３ヶ月以内にｈＧＨに対して暴露され、研究に入る７日以内に罹患し、研究前身体検査で又は研究に入る１４日以内の臨床的実験結果で有意な異常性を有する。すべての被験者は安全性について評価可能であり、薬物動態学的分析用のすべての採血はスケジュールどおりに回収される。すべての研究は施設内倫理委員会の承認並びに患者の同意を得て実施される。
研究デザイン これは、健常な男性ボランティアにおけるフェーズＩの、単一センターでの、非盲検の、無作為の、２期クロスオーバー研究である。１８名の被験者を２つの処置シーケンス群（１群につき９名の被験者）のうちの１つへ無作為に割り当てる。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨ及び商業的に入手可能な選択された生成物の等価の投与量を使用して、大腿上部に大量瞬時皮下注射として２つの個別の投与期間にわたってＧＨを投与する。商業的に入手可能な生成物の投与の量及び頻度は包装ラベルに説明してあるとおりである。商業的に入手可能な生成物を使用する場合に望まれる付加的な投与、投与頻度、又は他の因子は、被験者のさらなる群を含むことによって本研究へ付加されてもよい。各投与期間は１４日間の休薬期間により分離される。被験者は２回の投与期間の各々についての投与前少なくとも１２時間及び投与後の７２時間は研究センターに拘束されるが、投与期間と次の投与期間の間は拘束されない。ＰＥＧ化されたｈＧＨについて同様に検査されるべき追加の投与量、頻度、又は他の因子があるべきである場合、被験者の追加の群を付加してもよい。ヒトの使用について認可されるＧＨの複数の処方が本研究で使用されてもよい。Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（Ｒ）（Ｓｅｒｏｎｏ）はヒトの使用について認可される商業的に入手可能なＧＨ製剤である。ｈＧＨの実験的な処方は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨである。
採血 連続血をｈＧＨの投与の前後に静脈を直接穿孔することによって採取する。血清ＧＨ濃度の決定のための静脈血試料（５ｍＬ）を投与の約３０、２０、及び１０分前（３個のベースライン試料）に、及び投与後のほぼ以下の時間に得る。すなわち、３０分並びに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後である。各血清試料を２つの一定分量へと分割する。すべての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で維持して移動させる。迅速な臨床検査（血液学、血清化学、及び尿検査）を第１日の初期投与の直前、第４日の午前中、第１６日の投与の直前、及び第１９日の午前中に実施する。
生物学的分析方法 ＥＬＩＳＡキット手段（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ＤＳＬ］、Ｗｅｂｓｔｅｒ ＴＸ）を使用して、血清ＧＨ濃度を決定する。
安全性の決定 バイタルサインを各投与直前（第１日目及び第１６日目）、及び各投与の６、２４，４８、及び７２時間後に記録する。安全性の決定は有害事象の発生頻度及びタイプ並びに臨床検査におけるベースラインからの変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定及び身体検査結果における研究前の値からの変化を評価する。
データ分析 投与後の血清濃度値を投与前のベースラインＧＨ濃度について、投与前３０、２０、及び１０分で回収される３つの試料からＧＨレベルを平均することから決定される平均ベースラインＧＨ濃度を投与後の各値から差し引くことによって補正する。投与前血清ＧＨ濃度はそれらがアッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の計算には含まれない。薬物動態学的因子を、ベースラインＧＨ濃度について補正される血清濃度データから決定する。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムに関するモデル独自の方法により薬物動態学的因子を算出する。以下の薬物動態学的因子を決定する。すなわち、ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）、線形台形公式の使用で算出される時刻０から最後の採血時刻までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積（ＡＵＣ０−７２）、及び排出速度定数から計算される最終排出半減期（ｔ１／２）である。排出速度定数は、対数−直線濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ地点の直線回帰によって概算される。薬物動態学的因子の平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を各処置について算出する。因子の平均の比（保存された処方／保存されていない処方）を算出する。
安全性の結果 有害事象の発生率を処置群にわたって等しく分配する。ベースライン又は研究前臨床検査又は血圧からの臨床的に有意な変化はなく、身体検査結果及びバイタルサイン測定結果における研究前からの顕著な変化はない。２つの処置群についての安全性特性は同様に出現すべきである。
薬物動態学的結果 （それらには限定されないが、Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（Ｒ）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含む）商業上入手可能なｈＧＨ製剤の１つ以上の単回投与を受容した後のすべての１８名の被験者における（ベースラインＧＨレベルについて補正されていない）平均血清ＧＨ濃度−時間特性を、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨと測定される各時点で比較する。すべての被験者は正常な生理学的範囲内の投与前のベースラインＧＨ濃度を有するべきである。薬物動態学的因子を、投与前平均ベースラインＧＨ濃度について補正された血清データから決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。選択される臨床比較因子（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（Ｒ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（Ｒ）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（Ｒ）（Ｓｅｒｏｎｏ））についての平均ｔｍａｘは、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨについてのｔｍａｘよりも有意に短い。終末半減期値は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨについての終末半減期と比較して、検査された商業的に入手可能なｈＧＨ製剤について有意に短い。
本研究は健常な男性被験者において実施されるが、同様の吸収特性及び安全性特性は、癌又は慢性腎疾患を有する男性患者又は女性患者、小児腎疾患患者、貯血式自己血プログラムにある患者、又は待機手術の予定に入れられている患者などの他の患者集団において見込まれるであろう。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの皮下投与される単回投与は安全であり、健常な男性被験者によって十分耐容性を示されるであろう。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づいて、ｈＧＨの商業的に入手可能な形態の安全性特性及び天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性特性は等価であろう。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨは患者及び健康管理提供者に対して大きな臨床的有用性を潜在的に提供する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸のｈＩＦＮＪへの組み込みの好ましい部位の選択のための基準の多くの見込みのあるセットのうちの１つを記述する。
本実施例は、ｈＩＦＮポリペプチド内の好ましい部位が天然にコードされていないアミノ酸の導入のためにいかに選択されるかを示す。ＰＤＢ ＩＤ １ＲＨ２を有する結晶構造及び１ＩＴＦのＮＭＲ構造（２４個の異なるＮＭＲ構造）を使用して、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が導入できる好ましい位置を決定した。これらの構造についての配位はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から又はｒｃｓｂ．ｏｒｇでのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能なＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＰＤＢを介して入手可能である。
本実施例において使用される配列番号割り振りは、配列番号２４に示される成熟型ｈＩＦＮのアミノ酸配列にしたがっている。
以下の基準が天然にコードされていないアミノ酸の導入のためのｈＩＦＮの各位置を評価するのに使用された。すなわち、残基は、（ａ）ｈＩＦＮｂｐと抱合したｈＩＦＮの結晶学的構造の構造上の分析に基づいたいずれかのｈＩＦＮｂｐの結合に干渉すべきではなく、（ｂ）アラニン走査変異原性により影響されるべきではなく、（ｃ）表面露出され、取り込んでいる残基との最小のファンデルワールス結合相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＩＦＮ変異体において欠失しているか又は可変性であるかのいずれかであるべきであり、（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸との置換の際の保存された変化を生じるであろうし、及び（ｆ）（それには限定されないがＣＤループを含む）高度に柔軟性のある領域又は（それには限定されないが螺旋Ｂを含む）構造上硬い領域のいずれかにおいて見出されうる。部位評価において使用される刊行物は以下のものを含む。すなわち、Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ （１２） １９５−２０２； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ２００２ （８） ２１３９−２１５７； Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００１ （１２）， ８５７−８５９； ＢＢＲＣ １９９４ （２０２） １４４５−１４５１； Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＋ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １９９８ （１３巻） １４３−１５３； Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９６ （１４） １４５３−１４６３； ＪＭＢ １９９７ （２７４） ６６１−６７５である。加えて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １８， ｐｐ ９８０）を利用して、更なる計算をｈＩＦＮ分子に関して実施し、各タンパク質原子についての突出の程度を評価した。結果として、いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、それに限定されるものではないが、（配列番号２４又は他のＩＦＮにおける対応するアミノ酸にあるような）ｈＩＦＮの以下の位置の１つ以上で置換される。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、又は１６６（つまりカルボキシル末端で）である。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドは以下の位置、すなわち１００、１０６、１０７、１０８、１１１、１１３、１１４のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドは以下の位置、すなわち４１、４５、４６、４８、４９のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドは以下の位置、すなわち６１、６４、６５、１０１、１０３、１１０、１１７、１２０、１２１、１４９のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドは以下の位置、すなわち６、９、１２、１３、１６、９６、１５６、１６０、１６１、１６２のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドは、以下の位置、すなわち２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、これらの位置又は他の位置にある天然に存在しないアミノ酸は水溶性ポリマーへ結合されており、それは以下の位置に限定されるものではないがそれらを含む。すなわち、位置１前（つまりＮ末端）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５８、６１、６４、６５、６８、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１７、１１８、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４８、１４９、１５２、１５３、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６（つまりカルボキシル末で）である。いくつかの実施態様において、前記水溶性ポリマーは１つ以上のアミノ酸の位置でＩＦＮポリペプチドへ結合し、その位置はすなわち、６、９、１２、１３、１６、４１、４５、４６、４８、４９、６１、６４、６５、９６、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１２０、１２１、１４９、１５６、１５９、１６０、１６１及び１６２（配列番号２４又は配列番号２３、２５における対応するアミノ酸、又はその他のＩＦＮポリペプチド）である。いくつかの実施態様において、本発明のＩＦＮポリペプチドはアンタゴニストを提供する以下の位置、すなわち２、３、４、５、７、８、１６、１９、２０、４０、４２、５０、５１、５８、６８、６９、７０、７１、７３、９７、１０５、１０９、１１２、１１８、１４８、１４９、１５２、１５３、１５８、１６３、１６４、１６５のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含み、これらの置換の１つを含むｈＩＦＮポリペプチドは選択される企図された部位及び望まれる活性により、弱いアンタゴニスト又は弱いアゴニストとして潜在的に作用することができる。ヒトＩＦＮアンタゴニストは、それには限定されるものではないが、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３５、７４、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８９、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、又はそのいずれかの組み合わせ（ｈＩＦＮ；配列番号２４又は配列番号２３若しくは２５における対応するアミノ酸）での置換を有するものを含む。
本実施例は、大腸菌における修飾されたｈＩＦＮポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。
本実施例は天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＦＮポリペプチドが大腸菌においていかに発現できるかを示す。Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ．２８４， ３１６−３２０（１９８０）及び米国特許第４，３６４，８６３号を参照してほしい。全長のｈＩＦＮ及びＮ末端シグナル配列を欠失するｈＩＦＮの成熟型をコード化するｃＤＮＡが配列番号２６及び配列番号２７にそれぞれ示されている。アミノ酸配列を変化させずにクローニング及び発現のために配列を最適化した後、全長及び成熟型のｈＩＦＮをコード化するｃＤＮＡをｐＢＡＤ ＨＩＳｃ、ｐＥＴ２０ｂ、及びｐＥＴ１９ｂ発現ベクターへと挿入する。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入される翻訳系を使用して、ｈＧＨ発現について実施例２に記載されるような天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＩＦＮを発現する。
本実施例はＰＥＧ化されたＩＦＮの試験管内及び生体内活性を測定するための方法を記述する。
細胞結合アッセイ
細胞（３×１０６個）をさまざまな濃度（容積：１０μｌ）の標識されていないＩＦＮ、ｈＩＦＮ又はＧＭ−ＣＳＦの有無のもとで及び１２５Ｉ−ＩＦＮ（約１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下において０℃で９０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中で二重にしてインキュベートする（総容積：１２０μｌ）。細胞を次に再懸濁し、３５０μｌのプラスチック製遠心チューブにある２００μｌの氷冷ＦＣＳ上に重層し、遠心分離する（１０００ｇ；１分間）。前記ペレットを、チューブの端を切断することによって回収し、ペレット及び上清をガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）において個別に計数する。
特異的結合（ｃｐｍ）を、競合剤の不在下での総結合（重複の平均）から、標識されていないＩＦＮの１００倍過剰量の存在下での結合（ｃｐｍ）（非特異的結合）を差し引いたものとして決定する。非特異的結合は使用される各細胞タイプについて測定される。実験は１２５Ｉ−ＩＦＮの同一調製物を使用して個別の日に実施し、内部一致を示すべきである。１２５Ｉ−ＩＦＮはダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞への結合を示す。前記結合は標識されていない天然のＩＦＮ又はｈＩＦＮにより投与量依存的な様式で阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦ又は他のネガティブコントロールによっては阻害されない。天然ＩＦＮと同様、天然１２５Ｉ−ＩＦＮの結合に競合するｈＩＦＮの能力は、前記受容体が両者の形態を等しく十分に認識することを示唆する。
ＰＥＧ化されたＩＦＮからの生体内研究
ＰＥＧ−ｈＩＦＮ、修飾されていないｈＩＦＮ及び緩衝液をマウス又はラットへ投与する。前記結果は、マウス１匹につき同一の投与量を使用するウイルス複製の阻害の有意な上昇によって示される修飾されていないｈＩＦＮと比較して、本発明のＰＥＧ化されたｈＩＦＮの優れた活性及び長時間の半減期を示すであろう。
抱合型及び非抱合型のｈＩＦＮ及びその変異体の生体内半減期の測定
オスのスプラーグドーリーラット（約７週齢）を使用する。投与の当日に、各動物の体重を測定する。体重１ｋｇあたり１００μｇの非抱合型及び抱合型ｈＩＦＮ試料を各々、３匹のラットの尾静脈へ静脈内注射する。注射の１分後、３０分後、１、２、４、６、及び２４時間後に、血液５００μｌをＣＯ２麻酔のもとで各ラットから採取する。前記血液試料を室温で１．５時間保存した後、遠心分離（４℃、１８０００×ｇ、５分間）によって血清を単離する。前記血清試料を分析当日まで−８０℃で保存する。前記血清試料中の活性のあるＩＦＮの量を、氷上で前記試料を解凍した後にＩＦＮ試験管内活性アッセイにより定量する。
抗ウイルス活性
ウイルスに対する細胞の抵抗の程度を測定する多くのアッセイが当業者によって知られている（ＭｃＮｅｉｌｌ ＴＡ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （１９８１） ４６（２）：１２１−７）。これらのアッセイは一般に３つのタイプへと分類できる。すなわち、細胞変性効果の阻害、ウイルスプラーク形成、及びウイルス産生量の低下である。細胞変性効果アッセイは、ＩＦＮで前処理されその後ウイルスで感染された細胞培養物において誘導される保護の程度を測定する。例えば、水疱性口内炎ウイルスはこのようなアッセイにおいて使用するための適切なウイルスである。このタイプのアッセイは、９６穴プレートにおいて実施できるため、数多くの異なるＩＦＮをスクリーニングするのが簡便である。プラーク低下アッセイはプラーク形成ウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に対するＩＦＮ処理した細胞培養物の抵抗性を測定する。このアッセイに対する１つの利点は、プラーク形成における５０％低下の精確な測定が可能であることである。最後に、ウイルス産生量アッセイは、例えば単一成育周期の間に細胞から放出されるウイルスの量を測定する。このようなアッセイは細胞変性効果を生じないウイルス、又は標的細胞培養物においてプラークを作らないウイルスに対するＩＦＮの抗ウイルス活性を検査するのに有用である。感染効率（ｍｏｉ）はプラーク低下アッセイ又はウイルス産生量アッセイのいずれかを使用するときに考慮される重要な因子である。
他の臨床的に重要なインターフェロンの特徴も実験室環境において簡単にアッセイされる。このような特徴の１つは特異的細胞表面受容体へ結合するインターフェロンポリペプチドの能力である。例えば、いくつかのＩＦＮα−２ｂｓは、臨床治験において最も広く使用されているＩＦＮであるＩＦＮα−２ｂと比較して異なる細胞表面特性を呈する。ＩＦＮα−２ｂが効果的な抗ウイルス剤である一方、ＩＦＮα−２ｂは有意な有害な副作用を生じる。ＩＦＮα−２ｂと異なる結合特性を呈するインターフェロンは同一の有害な作用を生じないかもしれない。それゆえ、細胞上の結合部位に対してＩＦＮα−２ｂとほとんど競合しないインターフェロンが臨床的な興味の対象である。競合的インターフェロン結合アッセイは当分野で公知である（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９３） Ｊｕｎ １５；２６８（１７）：１２５９１−５； Ｄｉ Ｍａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２０２： １４４５−１４５１）。一般に、このようなアッセイは１２５Ｉ標識したＩＦＮα−２ｂと標識していない興味の対象のインターフェロンとの混合物とともに培養細胞をインキュベートすることを含む。結合していないインターフェロンをその後除去し、結合した標識の量（及び拡大解釈すれば、結合した１２５Ｉ標識済みＩＦＮα−２ｂ）を測定する。競合するインターフェロンの有無のもとで細胞へ結合する標識の量を比較することによって、相対的な結合親和性を計算できる。
ＩＦＮαの別の顕著な効果は、細胞成長を阻害するその能力であり、それは抗腫瘍作用を決定する上で主に重要である。成長阻害アッセイは十分に確立されており、トリチウム標識したチミジン（［３Ｈ］チミジン）若しくは別の放射線標識の細胞計数又は取り込みに通常依存する。ヒトリンパ芽球腫であるダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞系はＩＦＮαに対して特に感度が高いことが証明されており、多くのＩＦＮαにおける抗増殖性活性を測定するのに使用され、ハイブリッドポリペプチドを惹起してきた（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． （１９８６） Ａｕｇ； ６７ （Ｐｔ ８）：１６３３−４３）。この細胞系の使用は懸濁培養物中で成育されるその能力によって容易である（Ｅｖｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ， （１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｚｙｍｏｌ． ７９：３６２−３６８）。ＩＦＮαは多くの免疫変調活性も呈する（Ｚｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｉｎ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｃａｎｔｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｎｋｅｎｓ， Ｅｄｓ．， Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｙｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
ＩＦＮはウイルス学者によって最初発見されたが、（１９７９年における）それらの最初の臨床的な使用は骨髄腫に対する治療剤としてであった（Ｊｏｓｈｕａ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． １１（４）：１９１−２００）。ＩＦＮαはそれ以来、ウイルス性、悪性、血管新生性、アレルギー性、炎症性、及び線維性の開始点の無数の疾病に対して効果的であることが示されてきた（Ｔｉｌｇ， （１９９７） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． １１２（３）： １０１７−１０２１）。ＩＦＮαは、転移性腎臓癌及び慢性骨髄性白血病の治療において効果的であることも証明してきた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｃｈ， （１９９７） Ｂｒ． Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｍｅｄ． ５７（９）：４３６−４３９）。ＩＦＮの臨床使用はＧｒｅｓｓｅｒ （１９９７） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６１（５）： ５６７−５７４及びＰｆｅｆｆｅｒ （１９９７） Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２４（３ Ｓｕｐｐｌ．９）：Ｓ９−Ｓ６３Ｓ９６９において概説されている。
天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの安全性及び／又は有効性に関するヒトでの臨床治験。
目的 天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化された皮下投与される組み換えヒトｈＩＦＮの安全性及び薬物動態学を、商業的に入手可能なｈＩＦＮ製剤であるＲｏｆｅｒｏｎ Ａ（Ｒ）又はＩｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ）と比較すること。
患者 年齢２０ないし４０歳及び体重６０ないし９０ｋｇの１８名の健常なボランティアを本研究に登録する。被験者は血液学又は血清化学について臨床的に有意な異常な実験値を有しておらず、負の尿中毒物学スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有していない。被験者は以下のいずれかの証拠を有するべきではない。すなわち、高血圧、いずれかの一次的な血液学的疾病の病歴、肝臓、腎臓、心臓循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、代謝系、神経学的な有意な疾病の病歴、貧血又は発作性疾患の病歴、細菌由来又は哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する既知の感度を有し、カフェイン含有飲料に対する習慣的及び多飲性の消費者であり、いずれかの他の臨床治験への参加又は研究に入る３０日以内に輸血又は献血をし、研究に入る３ヶ月以内にｈＧＨに対して暴露され、研究に入る７日以内に罹患し、研究前身体検査で又は研究に入る１４日以内の臨床的実験結果に有意な異常性を有している。すべての被験者は安全性について評価可能であり、薬物動態学的分析用のすべての採血はスケジュールどおりに回収される。すべての研究は施設内倫理委員会の承認並びに患者の同意を得て実施される。
研究デザイン これは、健常な男性ボランティアにおけるフェーズＩの、単一センターでの、非盲検の、無作為の２期クロスオーバー研究である。１８名の被験者を２つの処置シーケンス群（１群につき９名の被験者）のうちの１つへ無作為に割り当てる。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧＨ及び商業的に入手可能な選択された生成物の等価の投与量を使用して、大腿上部に大量瞬時皮下注射として２つの個別の投与時期にわたってＩＦＮを投与する。商業的に入手可能な生成物の投与の量及び頻度は包装ラベルに説明してあるとおりである。商業的に入手可能な生成物を使用する場合に望まれる付加的な投与、投与頻度、又は他の因子は、被験者のさらなる群を含むことによって本研究へ付加されてもよい。各投与期間は１４日間の休薬期間により分離される。被験者は２回の投与期間の各々についての投与前少なくとも１２時間及び投与後の７２時間は研究センターに拘束されるが、投与期間と次の投与期間との間は拘束されない。ＰＥＧ化されたｈＧＨについて同様に検査されるべき追加の投与量、頻度、又は他の因子があるべきである場合、被験者の追加の群を付加してもよい。ヒトの使用について認可されるＩＦＮの複数の処方が本研究で使用されてもよい。Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ（Ｒ）及び／又はＩｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ）はヒトの使用について認可される商業的に入手可能なＩＦＮ製剤である。ｈＩＦＮの実験的な処方は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮである。
採血 連続血をｈＩＦＮの投与の前後に静脈を直接穿孔することによって採取する。血清ＩＦＮ濃度の決定のための静脈血試料（５ｍＬ）を投与の約３０、２０、及び１０分前（３個のベースライン試料）に、及び投与後のほぼ以下の時間に得る。すなわち、３０分並びに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後である。各血清試料を２つの一定分量へと分割する。すべての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で維持して移動させる。迅速な臨床検査（血液学、血清化学、及び尿検査）を第１日の初期投与の直前、第４日の午前中、第１６日の投与の直前、及び第１９日の午前中に実施する。
生物学的分析方法 ＥＬＩＳＡキット手段（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ））を使用して、血清ＩＦＮ濃度を決定する。
安全性の決定 バイタルサインを各投与直前（第１日目及び第１６日目）、及び各投与の６、２４，４８、及び７２時間後に記録する。安全性の決定は有害事象の発生頻度及びタイプ並びに臨床検査におけるベースラインからの変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定及び身体検査結果における研究前の値からの変化を評価する。
データ分析 投与後の血清濃度値を投与前のベースラインＩＦＮ濃度について、投与前３０、２０、及び１０分で回収される３つの試料からＩＦＮレベルを平均することから決定される平均ベースラインＩＦＮ濃度を投与後の各値から差し引くことによって補正する。投与前血清ＩＦＮ濃度はそれらがアッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の計算には含まれない。薬物動態学的因子を、ベースラインＩＦＮ濃度について補正される血清濃度データから決定する。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムに関するモデル独自の方法により薬物動態学的因子を算出する。以下の薬物動態学的因子を決定する。すなわち、ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）、線形台形公式の使用で算出される時刻０から最後の採血時刻までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積（ＡＵＣ０−７２）、及び排出速度定数から計算される最終排出半減期（ｔ１／２）である。排出速度定数は、対数−直線濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ地点の直線回帰によって概算される。薬物動態学的因子の平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を各処置について算出する。因子の平均の比（保存された処方／保存されていない処方）を算出する。
安全性の結果 有害事象の発生率を処置群にわたって等しく分配する。ベースライン又は研究前臨床検査又は血圧からの臨床的に有意な変化はなく、身体検査結果及びバイタルサイン測定結果における研究前からの顕著な変化はない。２つの処置群についての安全性特性は同様に出現すべきである。
薬物動態学的結果 商業上入手可能なｈＩＦＮ製剤（例、Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒ）又はＩｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））の単回投与を受容した後のすべての１８名の被験者における（ベースラインＧＨレベルについて補正されていない）平均血清ＩＦＮ濃度−時間特性を、測定される各時点での天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮと比較する。すべての被験者は正常な生理学的範囲内の投与前のベースラインＩＦＮ濃度を有するべきである。薬物動態学的因子を、投与前平均ベースラインＩＦＮ濃度について補正された血清データから決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。ｈＩＦＮ（例、Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒ））についての平均ｔｍａｘは、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮについてのｔｍａｘよりも有意に短い。終末半減期値は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮについての終末半減期と比較して、検査された商業的に入手可能なｈＩＦＮ製剤（例、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（Ｒ））について有意に短い。
本研究は健常な男性被験者において実施されるが、同様の吸収特性及び安全性特性は、癌又は慢性腎疾患を有する男性患者又は女性患者、小児腎疾患患者、貯血式自己血プログラムにある患者、又は待機手術の予定に入れられている患者などの他の患者集団において見込まれるであろう。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの皮下投与される単回投与は安全であり、健常な男性被験者によって十分耐容性を示されるであろう。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づいて、ｈＩＦＮ（例、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ（Ｒ））の安全性特性及び天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮの安全性特性は等価であろう。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＩＦＮは患者及び健康管理提供者に対して大きな臨床的有用性を潜在的に提供する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸のｈＧ−ＣＳＦへの組み込みの好ましい部位の選択のための基準の多くの見込みのあるセットのうちの１つを記述する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸の導入のために、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド内の好ましい部位が以下に選択されたかを示す。受容体（ｈＧ−ＣＳＦ）の細胞外ドメインの２つの分子と複合体形成したｈＧ−ＣＳＦの２つの分子から構成される結晶構造１ＣＤ９を使用して、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が導入できる好ましい位置を決定した。（それらに限定を加えるものではないが、１ＰＧＲ、１ＲＨＧ、及び１ＧＮＣを含む）他のｈＧ−ＣＳＦ構造を利用して結晶構造データセット間の一次、二次、又は三次構造要素の見込みのあるバリエーションを検討した。これらの構造のための配位は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９７， １１２， ｐｐ ５３５）から又はｒｃｓｂ．ｏｒｇでのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能なＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＰＤＢを介して入手可能である。構造モデル１ＣＤ９はＮ末端残基１ないし４及び残基１２９ないし１３６の例外のあるｈＧ−ＣＳＦの完全な成熟型１９ｋＤａ配列を含有する。２つのジスルフィド結合が存在し、Ｃ３７及びＣ４３並びにＣ６５及びＣ７５によって形成される。
本実施例において使用される配列番号割り振りは、配列番号２９に示される成熟型ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列にしたがっている。
以下の基準が天然にコードされていないアミノ酸の導入のためのｈＧ−ＣＳＦの各位置を評価するのに使用された。すなわち、残基は、（ａ）１ＣＤ９及び１ＲＨＧの構造分析（ｈＧ−ＣＳＦｂｐと抱合したｈＧ−ＣＳＦの結晶学的構造）に基づいたいずれかのｈＧ−ＣＳＦｂｐの結合に干渉すべきではなく、（ｂ）アラニン走査変異原性により影響されるべきではなく（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｅｎ ＪＲ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９６） Ｊｕｌ １６； ３５（２８）：９０３４−４１； Ｙｏｕｎｇ ＤＣ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． （１９９７） Ｊｕｎ；６（６）：１２２８−３６； Ｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＪＢＣ ２７２（４７）：２９７３５−２９７４１）、（ｃ）表面露出され、取り込んでいる残基との最小のファンデルワールス結合相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＧ−ＣＳＦ変異体において欠失しているか又は可変性であるかのいずれかであるべきであり、（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸との置換の際の保存された変化を生じるであろうし、及び（ｆ）（それには限定されないがＣＤループを含む）高度に柔軟性のある領域又は（それには限定されないが螺旋Ｂを含む）構造上硬い領域のいずれかにおいて見出されうる。加えて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １８， ｐｐ ９８０）を利用して、更な９９、る算出をｈＧ−ＣＳＦ分子に関して実施し、各タンパク質原子についての突出の程度を評価した。結果として、いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、それに限定されるものではないが、（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸にあるような）ｈＧ−ＣＳＦの以下の位置の１つ以上で置換される。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（つまりカルボキシル末端で）である。
いくつかの実施態様において、本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドは以下の位置、すなわち３０、３１、３３、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、７７、７８、８１、８７、８８、９１、９５、１０１、１０２、１０３、１３０、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６７、１７０、１７１（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドは以下の位置、すなわち５９、６３、６７、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１６０、１６３、１６７、及び１７１（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸）のうちの１つ以上で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、これらの位置のうちの１つ以上にある天然に存在しないアミノ酸は水溶性ポリマーへ結合されており、以下の位置に限定されるものではないがそれらを含む。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７７、７８、８１、８４、８７、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５６、１５７、１５９、１６０、１６３、１６４、１６６、１６７、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６（つまりカルボキシル末端で）である（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸）。
ｈＧ−ＣＳＦアンタゴニストの生成のためのいくつかの部位には、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２４、２８、３０、４１、４７、４９、５０、７０、７１、１０５、１０６、１０９、１１０、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２７、１４５、又はそれらのいずれかの組み合わせが含まれる（配列番号２９又は配列番号２８、３０、３５、又は３６における対応するアミノ酸）。これらの部位は前記アゴニストデザインの基準（ｃ）ないし（ｅ）を利用して選択された。前記アンタゴニストデザインは、ｈＧ−ＣＳＦｂｐに対する結合親和性を増大させるための受容体結合領域の部位特異的修飾も含むことができる。
本実施例は、大腸菌における修飾されたｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧ−ＣＳＦポリペプチドが大腸菌においていかに発現できるかを示す。大腸菌などの宿主細胞におけるｈＧ−ＣＳＦの単離及びＧ−ＣＳＦの生成は、例えば参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，８１０，６４３号、第４，９９９，２９１号、第５，５８０，７５５号、及び第６，７１６，６０６号に記載されている。全長のｈＧ−ＣＳＦ、ｈＧ−ＣＳＦの成熟型（メチオニルｈＧ−ＣＳＦ）、及びｈＧ−ＣＳＦの成熟型の変異体をコード化するｃＤＮＡはそれぞれ、配列番号３１、３２及び３３に示されている。アミノ酸配列（配列番号３４）を変化させずにクローニング及び発現のために配列を最適化した後、全長及び成熟型のｈＧ−ＣＳＦをコード化するｃＤＮＡをｐＢＡＤ ＨＩＳｃ、ｐＥＴ２０ｂ、及びｐＥＴ１９ｂ発現ベクターへと挿入する。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入される翻訳系を使用して、ｈＧＨ発現について実施例２に記載されるような天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＧ−ＣＳＦを発現する。
ＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦの試験管内活性及び生体内活性
ＰＥＧ−ｈＧ−ＣＳＦ、修飾されていないｈＧ−ＣＳＦ及び緩衝液をマウス又はラットへ投与する。本結果は、マウス１匹当たり同一投与量を使用して、好中球の量の有意な増加及び白血球細胞計数最大値の移行により示される修飾されていないｈＧ−ＣＳＦと比較したときの、本発明のＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦの優れた活性及び長時間の半減期を示すであろう。
３ Ｈ−チミジンアッセイ 標準的な方法を使用して３Ｈ−チミジンアッセイを実施する。屠殺したメスのＢａｌｂ Ｃマウスから骨髄を得る。骨髄細胞を成長培地中で簡潔に言えば懸濁し、遠心分離し、及び再懸濁する。約１０，０００個の細胞を含有する１６０μｌの一定分量を９６穴微量力価プレートの各ウェルへ播種する。（上述のように調製された）精製されたＧ−ＣＳＦアナログの試料を各ウェルへ添加し、６８時間インキュベートする。トリチウム標識したチミジンをウェルへ添加し、さらに５時間インキュベートする。５時間のインキュベーション時間の後、細胞を回収し、ろ過し、完全にすすぐ。シンチレーション液を含有するバイアルへフィルターを添加する。β発光を計数する（ＬＫＢ Ｂｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンタ）。標準物質及びアナログを三重に分析し、標準曲線を実質的に上回るか又は下回る試料を適切な希釈で再アッセイする。本結果は変化していない組み換えヒトＧ−ＣＳＦ標準結果に対する三重のアナログデータの平均として報告される。
ヒト骨髄細胞の増殖誘導を３Ｈ−チミジンの組み込みの増加に基づいてアッセイする。健常なドナーからのヒト骨髄をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅによる密度切断（１．０７７ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ供し、１０％ウシ胎児血清及びグルタミンペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を含有するイスコブ培地（Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ）に低密度細胞を懸濁する。その後、２×１０４個のヒト骨髄細胞を調節培地又は実施例３７の組み換え型大腸菌由来ｈＧ−ＣＳＦ材料のいずれかとともに９６穴平底プレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートする。前記試料を重複してアッセイし、濃度は１０，０００倍の範囲にわたって変動する。培養物を次に、３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓ．）の０．５μＣｉ／ウェルで４時間パルスする。３Ｈ−チミジンの取り込みをＶｅｎｕｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ６１， ７８１ （１９８３）において記載されるように測定する。このアッセイにおいて、ヒトＧ−ＣＳＦ単離物は、対照上清よりも高い約４ないし１０倍のレベルでヒト骨髄細胞への３Ｈ−チミジンの組み込みを誘導できる。本発明の大腸菌由来のｈＧ−ＣＳＦ材料は同様の特性を有する。
ＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ＋分化誘導
ネズミ骨髄性単球白血球細胞系であるＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ＋の分化を誘導する本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの能力を、Ｍｅｔｃａｌｆ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ２５， ２２５ （１９８０）において記載されるように半固体のアガー培地においてアッセイする。組み換えｈＧ−ＣＳＦ製剤及び培地対照をウェル１個につき約６０個のＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ＋細胞とともに、３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートする。前記試料を２４穴平底プレートにおいてインキュベートし、濃度は２０００倍の範囲にわたって変動する。コロニーを未分化のもの、部分的に分化したもの、全体的に分化したものに分類し、コロニー細胞の計数を顕微鏡下で計数する。大腸菌由来のｈＧ−ＣＳＦ材料は分化を誘導することがわかる。
ＣＦＵ−ＧＭアッセイ、ＢＦＵ−Ｅアッセイ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭアッセイ
ヒトＧ−ＣＳＦ及びｈＧ−ＣＳＦの天然単離物はヒト骨髄細胞を増殖及び分化させることがわかっている。これらの活性は、健常者ボランティアからの低密度の接着していない骨髄細胞を使用する、ＣＦＵ−ＧＭアッセイ［Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ５， ８７， （１９７１）］、ＢＦＵ−Ｅアッセイ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭアッセイ［Ｌｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ６１， ２５０ （１９８３）］において測定される。Ｇ−ＣＳＦ又はｈＧ−ＣＳＦのいずれかの５００単位を使用するＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭの生物活性の比較を実施する。
低密度の接着していない骨髄細胞を使用してコロニーアッセイを実施する。ヒト骨髄細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅで密度切断することに供する（密度、１．０７７ｇ／ｃｍ３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。低密度細胞を次にウシ胎児血清を含有するイスコブの修正した（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ダルベッコ培地に再懸濁し、ファルコン組織培養皿（３００３番、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．）上へ接着させるために播種し、３７℃で１．５時間放置する。
培地対照は、イスコブの修正した（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ダルベッコ培地＋１０％ＦＣＳ、０．２ｍＭヘミン及び１単位の組み換えエリスロピエチンからなる。ＣＦＵ−ＧＭアッセイのため、補強されたマッコイの５Ａ培地及び１０％熱失活ウシ胎児血清を含有する０．３％アガー培地１ｍｌに標的細胞を１×１０５個で播種する。培養物をコロニー（凝集体１個につき４０個超の細胞）について記録し、形態を培養の第７日に査定する。コロニーの数を四重プレートから決定される平均±標準誤差として示す。
ＢＦＵ−Ｅアッセイ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭアッセイについて、イスコブの修正した（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃｏ）、０．８％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清、０．０５ｎＭ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭヘミン及び１単位の組み換えエリスロポエチンの１ｍｌ混合物へ細胞（１×１０５個）を添加する。培養皿を５％ＣＯ２及び５％Ｏ２の湿度の高い大気中でインキュベートする。Ｒｅｍｉｎｇ Ｂｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓｙｒａｃｕｓｅ， Ｎ．Ｙ．）社製の酸素低下装置（ｏｘｙｒｅｄｕｃｅｒ）を使用して低酸素分圧を得る。コロニーを１４日間のインキュベーション後に記録する。コロニーの数を二重プレートから決定される平均±標準誤差として決定する。
ＣＦＵ−ＧＭアッセイにおいて形成されるコロニーはすべて、前記コロニーが顆粒球タイプであることと一致して、クロル酢酸エステラーゼ（ｃｈｌｏｒａｃｅｔａｔｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ）陽性及び非特異的エステラーゼ（α−ナフチル酢酸エステラーゼ）陰性であると予測される。天然Ｇ−ＣＳＦ及びｈＧ−ＣＳＦの両者は、ＣＦＵ−ＧＭアッセイにおける連続希釈によってアッセイされるとき、純粋なタンパク質１ｍｇあたり約１×１０８Ｕの比活性を有すると予測される。ｈＧ−ＣＳＦが極めて純粋であり、大腸菌におけるその生成によって他の潜在的な哺乳類成長因子がないことを留意することは重要である。したがって、ｈＧ−ＣＳＦは、組み換えエリスロポエチンの存在下で添加されるとき、混合されたコロニー形成（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びＢＦＵ−Ｅを支持できる。
細胞結合アッセイ ネズミＷＥＨＩ−３ＢＤ＋及びヒト末梢血骨髄性白血病細胞調製物（ＡＮＬＬ）の１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦを結合する能力について検査する。ネズミ及び新鮮に得られたヒト末梢血骨髄性白血病細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄する。ＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞（５×１０６個）又は新鮮な白血病細胞（３×１０６個）をさまざまな濃度（容積：１０μｌ）の標識されていないＧ−ＣＳＦ、ｈＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦの有無のもとで、及び１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ（約１００，０００又は１ｎｇ）の存在下で、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）において０℃で９０分間二重にインキュベートする（総容積：１２０μｌ）。次に細胞を再懸濁し、３５０μｌのプラスチック製遠心チューブに入れた氷冷したＦＣＳ２００μｌの上に層状にし、遠心分離する（１０００ｇ；１分間）。チューブの端を切断することによって前記ペレットを回収し、ペレット及び上清をガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で個別に計数する。
競合剤の不在下での総結合（二重測定の平均）から標識されていないＧ−ＣＳＦの１００倍過剰量の存在下での結合（ｃｐｍ）（非特異的結合）を差し引いたものとして特異的結合（ｃｐｍ）を決定する。非特異的結合を、使用される各細胞タイプについて測定する。実験は１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの同一調製物を使用して個別の日に実施し、内部一致性を示すべきである。１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦはＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ＋白血病細胞に対する結合を示す。前記結合は、標識されていない天然Ｇ−ＣＳＦ又はｈＧ−ＣＳＦによって投与量依存的な様式で阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦによっては阻害されない。天然Ｇ−ＣＳＦと同様、天然１２５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの結合に対して競合するｈＧ−ＣＳＦの能力は、前記受容体が両者の形態を等しく十分に認識することを示唆する。
Ｇ−ＣＳＦは、白血球患者から得られた低密度骨髄細胞の顆粒球分化及び単球分化を誘導する 患者由来の細胞を培地単独で又はｈＧ−ＣＳＦの１×１０５単位の存在下で４日間培養する。培地単独でインキュベートされる対照培養物由来の細胞のタイプは前骨髄球であるのに対し、ｈＧ−ＣＳＦの存在下で培養される細胞は、後骨髄球、巨大帯状形態（ｇｉａｎｔ ｂａｎｄ ｆｏｒｍ）及び分節化された好中球及び単球を含む骨髄型の成熟細胞を示すであろう。少なくとも１００個の細胞の実際の分化を形態学的に評価する。ｈＧ−ＣＳＦ処理された細胞は、芽細胞、骨髄球、後骨髄球、帯状形態に加え、分節化された好中球、前単球及び単球からなる。対照細胞は芽細胞であると予測される。
抱合型及び非抱合型ｈＧ−ＣＳＦ及びその変異体の生体内半減期の測定
オスのスプラーグドーリーラット（約７週齢）を使用する。投与の当日に、各動物の体重を測定する。体重１ｋｇあたり１００μｇの非抱合型及び抱合型ｈＩＦＮ試料を各々、３匹のラットの尾静脈へ静脈内注射する。注射の１分後、３０分後、１、２、４、６、及び２４時間後に、血液５００μｌをＣＯ２麻酔のもとで各ラットから採取した。前記血液試料を室温で１．５時間保存した後、遠心分離によって血清を単離する（４℃、１８０００×ｇ、５分間）。前記血清試料を分析当日まで−８０℃で保存する。前記血清試料中の活性のあるＩＦＮの量を、氷上で前記試料を解凍した後にＧ−ＣＳＦ試験管内活性アッセイにより定量する。
抱合型及び非抱合型ｈＧ−ＣＳＦ及びその変異体の健常ラットにおける生体内生物活性の測定
特定病原体除去のスプラーグドーリーラットにおけるｈＧ−ＣＳＦの生体内での生物学的効果の測定が、抱合型及び非抱合型Ｇ−ＣＳＦ及びその変異体の生物学的有効性を評価するために使用される。到着当日、前記ラットを６群へと無作為に割り当てる。前記動物を７日間安静にし、代謝不良条件にあるか又は体重の極めて大きな個体を除去する。前記ラットの体重の範囲は安静期開始時で２５０ないし２７０ｇである。
投与当日、前記ラットを１６時間絶食させた後、ｈＧ−ＣＳＦ若しくはその変異体を体重１ｋｇあたり１００μｇ皮下注射する。各ｈＧ−ＣＳＦ試料を６匹の無作為に分けられたラット群へ注射する。３００μｇＥＤＴＡにより安定化された血液の血液試料をラットの尾静脈から、投与前及び投与６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間後に採取する。前記血液試料を以下の血液学的因子について分析する。すなわち、ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球分画（好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球）である。これらの測定結果に基づいて、抱合型及び非抱合型ｈＧ−ＣＳＦ並びにそれらの変異体の生物学的有効性を評価する。
化学療法により誘導される好中球減少症を有するラットにおける抱合型及び非抱合型ｈＧ−ＣＳＦ及びその変異体の生体内生物活性の測定
特定病原体除去のスプラーグドーリーラットをこの分析に利用する。到着当日、前記ラットを６群へと無作為に割り当てる。前記動物を７日間安静にし、代謝不良条件にあるか又は体重の極めて大きな個体を除去する。前記ラットの体重の範囲は安静期開始時で２５０ないし２７０ｇである。
ｈＧ−ＣＳＦ試料の投与２４時間前、前記ラットに抗癌性化学療法から生じる好中球減少症を模擬する好中球減少症を誘発するシクロホスファミド（ＣＰＡ）を体重１ｋｇあたり５０ｍｇ腹腔内注射する。第０日で、ｈＧ−ＣＳＦ若しくはその変異体を体重１ｋｇあたり１００μｇ皮下注射する。各ｈＧ−ＣＳＦ試料を６匹の無作為に分けられたラット群へ注射する。３００μｇＥＤＴＡにより安定化された血液の血液試料をラットの尾静脈から、投与前及び投与６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０，１４４及び１６８時間後に採取する。前記血液試料を以下の血液学的因子について分析する。すなわち、ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球分画（好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球）である。これらの測定結果に基づいて、抱合型及び非抱合型ｈＧ−ＣＳＦ並びにそれらの変異体の生物学的有効性を評価する。
天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦの安全性及び／又は有効性に関するヒトでの臨床治験。
目的 天然にコードされていないアミノ酸を含む皮下投与されるＰＥＧ化した組み換えヒトｈＧ−ＣＳＦの安全性及び薬物動態学的特徴を、商業上入手可能なｈＧ−ＣＳＦ製剤であるＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ｒ）又はＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ）と比較すること。
患者 年齢２０ないし４０歳及び体重６０ないし９０ｋｇの１８名の健常なボランティアを本研究に登録する。被験者は血液学又は血清化学について臨床的に有意な異常な実験値を有しておらず、負の尿中毒物学スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有していない。被験者は以下のいずれかの証拠を有するべきではない。すなわち、高血圧、いずれかの一次的な血液学的疾病の病歴、肝臓、腎臓、心臓循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、代謝系、神経学的な有意な疾病の病歴、貧血又は発作性疾患の病歴、細菌由来又は哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する既知の感度を有し、カフェイン含有飲料に対する習慣的及び多飲性の消費者であり、いずれかの他の臨床治験への参加又は研究に入る３０日以内に輸血又は献血をし、研究に入る３ヶ月以内にｈＧＨに対して暴露され、研究に入る７日以内に罹患し、研究前身体検査で又は研究に入る１４日以内の臨床的実験結果に有意な異常性を有している。すべての被験者は安全性について評価可能であり、薬物動態学的分析用のすべての採血はスケジュールどおりに回収される。すべての研究は施設内倫理委員会の承認並びに患者の同意を得て実施される。
研究デザイン これは、健常な男性ボランティアにおけるフェーズＩの、単一センターでの、非盲検の、無作為の、２期クロスオーバー研究である。１８名の被験者を２つの処置シーケンス群（１群につき９名の被験者）のうちの１つへ無作為に割り当てる。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦ及び商業的に入手可能な選択された生成物の等価の投与量を使用して、大腿上部に大量瞬時皮下注射として２つの個別の投与時期にわたってＧ−ＣＳＦを投与する。商業的に入手可能な生成物の投与の量及び頻度は包装ラベルに説明してあるとおりである。商業的に入手可能な生成物を使用する場合に望まれる付加的な投与、投与頻度、又は他の因子は、被験者のさらなる群を含むことによって本研究へ付加されてもよい。各投与期間は１４日間の休薬期間により分離される。被験者は２回の投与期間の各々についての投与前少なくとも１２時間及び投与後の７２時間は研究センターに拘束されるが、投与期間と次の投与期間との間は拘束されない。ＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦについて同様に検査されるべき追加の投与量、頻度、又は他の因子があるべきである場合、被験者の追加の群を付加してもよい。ヒトの使用について認可されるＧ−ＣＳＦの複数の処方が本研究で使用されてもよい。ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ）として市場に出回っているフィルグラスチム及び／又はＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ｒ）として市場に出回っているＰＥＧフィルグラスチムはヒトの使用について認可される商業的に入手可能なＧ−ＣＳＦ製剤である。ｈＧ−ＣＳＦの実験的な処方は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦである。
採血 連続血をｈＧ−ＣＳＦの投与の前後に静脈を直接穿孔することによって採取する。血清Ｇ−ＣＳＦ濃度の決定のための静脈血試料（５ｍＬ）を投与の約３０、２０、及び１０分前（３個のベースライン試料）に、及び投与後のほぼ以下の時間に得る。すなわち、３０分並びに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後である。各血清試料を２つの一定分量へと分割する。すべての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で維持して移動させる。迅速な臨床検査（血液学、血清化学、及び尿検査）を第１日の初期投与の直前、第４日の午前中、第１６日の投与の直前、及び第１９日の午前中に実施する。
生物学的分析方法 ＥＬＩＳＡキット手段（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ））を使用して、血清Ｇ−ＣＳＦ濃度を決定する。
安全性の決定 バイタルサインを各投与直前（第１日目及び第１６日目）、及び各投与の６、２４，４８、及び７２時間後に記録する。安全性の決定は有害事象の発生頻度及びタイプ並びに臨床検査におけるベースラインからの変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定及び身体検査結果における研究前の値からの変化を評価する。
データ分析 投与後の血清濃度値を投与前のベースラインＧ−ＣＳＦ濃度について、投与前３０、２０、及び１０分で回収される３つの試料からＧ−ＣＳＦレベルを平均することから決定される平均ベースラインＧ−ＣＳＦ濃度を投与後の各値から差し引くことによって補正する。投与前血清Ｇ−ＣＳＦ濃度はそれらがアッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の計算には含まれない。薬物動態学的因子を、ベースラインＧ−ＣＳＦ濃度について補正される血清濃度データから決定する。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムに関するモデル独自の方法により薬物動態学的因子を算出する。以下の薬物動態学的因子を決定する。すなわち、ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）、線形台形公式の使用で算出される時刻０から最後の採血時刻までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積（ＡＵＣ０−７２）、及び排出速度定数から計算される最終排出半減期（ｔ１／２）である。排出速度定数は、対数−直線濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ地点の直線回帰によって概算される。薬物動態学的因子の平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を各処置について算出する。因子の平均の比（保存された処方／保存されていない処方）を算出する。
安全性の結果 有害事象の発生率を処置群にわたって等しく分配する。ベースライン又は研究前臨床検査又は血圧からの臨床的に有意な変化はなく、身体検査結果及びバイタルサイン測定結果における研究前からの顕著な変化はない。２つの処置群についての安全性特性は同様に出現すべきである。
薬物動態学的結果 商業上入手可能なｈＧ−ＣＳＦ製剤（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ）又はＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ｒ））の単回投与を受容した後のすべての１８名の被験者における（ベースラインＧＨレベルについて補正されていない）平均血清Ｇ−ＣＳＦ濃度−時間特性を、測定される各時点での天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦと比較する。すべての被験者は正常な生理学的範囲内の投与前のベースラインＧ−ＣＳＦ濃度を有するべきである。薬物動態学的因子を、投与前平均ベースラインＧ−ＣＳＦ濃度について補正された血清データから決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。
ｈＧ−ＣＳＦ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ））についての平均ｔｍａｘは、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦについてのｔｍａｘよりも有意に短い。終末半減期値は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦについての終末半減期と比較して、ｈＧ−ＣＳＦ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ））について有意に短い。
本研究は健常な男性被験者において実施されるが、同様の吸収特性及び安全性特性は、癌又は慢性腎疾患を有する男性患者又は女性患者、小児腎疾患患者、貯血式自己血プログラムにある患者、又は待機手術の予定に入れられている患者などの他の患者集団において見込まれるであろう。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦの皮下投与される単回投与は安全であり、健常な男性被験者によって十分耐容性を示されるであろう。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づいて、ｈＧ−ＣＳＦ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ））の安全性特性及び天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦの安全性特性は等価であろう。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＧ−ＣＳＦは患者及び健康管理提供者に対して大きな臨床的有用性を潜在的に提供する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸のｈＥＰＯへの組み込みの好ましい部位の選択のための基準の多くの見込みのあるセットのうちの１つを記述する。
本実施例は、ｈＥＰＯポリペプチド内の好ましい部位が天然にコードされていないアミノ酸の導入のためにいかに選択されるかを示す。受容体（ｂＥＰＯｂｐ）の細胞外ドメインの２つの分子と複合体形成した（２４、３８、８３を含む部位変異を有する）ｈＥＰＯからなる結晶構造１ＣＮ４を使用して、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が導入できる好ましい位置を決定した。（それに限定されるものではないが１ＥＥＲ（２４、２８、８３、１２１、１２２での変異）及び１ＢＵＹを含む）他のｈＥＰＯ構造を利用して、結晶構造データセット間の一次、二次、又は三次構造要素の見込みのあるバリエーションを検討した。これらの構造のための配位は、これらの構造についての配位はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９７， １１２， ｐｐ ５３５）から又はｒｃｓｂ．ｏｒｇでのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能なＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＰＤＢを介して入手可能である。前記構造モデル１ＣＮ４は、残基１２４ないし１３０、Ｎ末端Ａ１、及び前記結晶における崩壊により省略されたＣ末端Ｔ１６３、Ｇ１６４、Ｄ１６５、及びＲ１６６残基の例外を有するｈＥＰＯの完全な成熟型１８ｋＤａ配列を含有する。Ｃ７及びＣ１６１並びにＣ２９及びＣ３３によって形成される２つのジスルフィド結合が存在する。
本実施例において使用される配列番号割り振りは、配列番号３８に示される成熟型ｈＥＰＯ（１８ｋＤａ変異体）のアミノ酸配列にしたがっている。
以下の基準を使用して、天然にコードされていないアミノ酸の導入のためのｈＥＰＯの各位置を評価した。すなわち、残基は、（ａ）１ＣＮ４、１ＥＥＲ、及び１ＢＵＹ（ｈＥＰＯｂｐと抱合したｈＥＰＯの結晶学的構造）の構造分析に基づいたいずれかのｈＥＰＯｂｐの結合に干渉すべきではなく、（ｂ）アラニン走査変異原性により影響されるべきではなく（Ｂｉｔｔｏｒｆ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ， ３３６：１３３−１３６ （１９９３）， Ｗｅｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ， ２６９：２２８３９−２２８４６ （１９９４）、及びＥｌｌｉｏｔｔ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．
Ｂｌｏｏｄ， ８９： ４９３−５０２ （１９９７））、（ｃ）表面露出され、取り込んでいる残基との最小のファンデルワールス結合相互作用又は水素結合相互作用を呈するべきであり、（ｄ）ｈＥＰＯ変異体において欠失しているか又は可変性であるかのいずれかであるべきであり（Ｂｉｔｔｏｒｆ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ， ３３６：１３３−１３６ （１９９３）， Ｗｅｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ， ２６９：２２８３９−２２８４６ （１９９４））、（ｅ）天然にコードされていないアミノ酸との置換の際の保存された変化を生じるであろうし、及び（ｆ）（それには限定されないがＣＤループを含む）高度に柔軟性のある領域又は（それには限定されないが螺旋Ｂを含む）構造上硬い領域のいずれかにおいて見出されうる。加えて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １８， ｐｐ ９８０）を利用して、更なる算出をｈＥＰＯ分子に関して実施し、各タンパク質原子についての突出の程度を評価した。結果として、いくつかの実施態様において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、それに限定されるものではないが、ｈＥＰＯの以下の位置の１つ以上で組み込まれる。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（つまりカルボキシル末端で）又はそれらの組み合わせである（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。
１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の組み込みのための典型的な部位のサブセットには、それに限定を加えるものではないが、ＥＰＯにおける１、２、４、９、１７、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４０、５０、５３、５５、５８、６５、６８、７２、７６、７９、８０、８２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、１５９、１６２，１６３、１６４、１６５、及び１６６が含まれる（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の組み込みのための典型的な位置には、ＥＰＯにおける２１、２４、２８、３０、３１、３６、３７、３８、５５、７２、８３、８５、８６、８７、８９、１１３、１１６、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１６２、１６３、１６４、１６５、及び１６６が含まれる（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。
いくつかの実施態様において、これらの位置の１つ以上で天然に存在しないアミノ酸は可溶性ポリマーへ結合され、限定を加えるものではないが以下の位置が含まれる。すなわち、位置１前（つまりＮ末端で）、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６５、６８、７２、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６，８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７（つまりカルボキシル末端で）である（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。いくつかの実施態様において、これらの位置又は他の位置にある１つ以上の天然に存在しないアミノ酸は水溶性ポリマーへ結合され、それに限定を加えるものではないが位置２１、２４、３８、８３、８５、８６、８９、１１６、１１９、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、及び１２８、又はこれらの組み合わせが含まれる（配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。
ｈＥＰＯアンタゴニストの生成のためのいくつかの部位には、２、３、５、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、７５、７８、９３、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、１１０、１３１、１３２、１３３、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５４、１５５、１５９、又はそれらのいずれかの組み合わせが含まれる（ｈＥＰＯ；配列番号３８又は配列番号３７若しくは３９における対応するアミノ酸）。これらの部位は前記アゴニストデザインの基準（ｃ）ないし（ｅ）を利用して選択された。前記アンタゴニストデザインは、ｈＥＰＯｂｐに対する結合親和性を増大させるための部位１残基の部位特異的修飾も含むことができる。
本実施例は、大腸菌において修飾されるｈＥＰＯポリペプチドのクローニング及び発現を詳述する。
本実施例は、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＥＰＯポリペプチドが大腸菌において以下に発現できるかを示す。ｈＥＰＯをコード化するヌクレオチド配列を、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） ＰＮＡＳ ９３：９４７１−７６において記載されるとおり、一般的に生成した。胎児肝臓、成体肝臓、胎児腎臓及び成体腎臓のｃＤＮＡライブラリを、全長及び成熟型ｈＥＰＯをコード化するｃＤＮＡをクローニングするためのテンプレートとして使用し、胎児肝臓が最良の結果を与えた。全長及び成熟型ｈＥＰＯをクローニングするのに使用されるプライマーはそれぞれ、
５’ｃａｇｔｔａｃａｔａｔｇｇｇａｇｔｔｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇｇ３’配列番号４４；及び
５’ｃａｇｔｔａｃａｔａｔｇｃｔｃｃａｃｃａａｇａｔｔａａｔｃｔｇｔｇ３’配列番号４５
であった。３’プライマー配列は５’ｃｔｇｃａａｃｔｃｇａｇｔｃａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇ３’配列番号４６であった。クローニングのための反応条件は９４℃で２分間、９４℃で３０秒間を３０周期、５０℃で１分間、７２℃で２分間、及び７２℃で７分間の後、４℃の反応停止であった。全長ｈＥＰＯ、Ｎ末端シグナル配列を欠失するｈＥＰＯの成熟型、及びｈＥＰＯの成熟型の変異体をコード化するものとして３個の分子を同定し、各々配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２にそれぞれ示した。アミノ酸配列（配列番号４３）を変化させずに実施されるクローニング及び発現のための配列の最適化後に、全長及び成熟型ｈＥＰＯをコード化するｃＤＮＡをｐＢＡＤ ＨＩＳｃ発現ベクター及びｐＥＴ２０ｂ発現ベクターの両者へ挿入した。
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入される翻訳系は、ｈＧＨ発現のための実施例２に記載される天然にコードされていないアミノ酸を含有するｈＧ−ＣＳＦを発現するために使用される。
正常赤血球血性（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウスアッセイにより決定されるＰＥＧ化されたｈＥＰＯの試験管内及び生体内活性
ＰＥＧ−ｈＥＰＯ、修飾されていないｈＥＰＯ及び緩衝液をマウスへ投与する。本結果は、マウス１匹あたり同一投与量を使用する網状赤血球量の有意な増加及び網状赤血球計数最大値の移行によって示される修飾されていないｈＥＰＯと比較するときの、本発明のＰＥＧ化されたｈＥＰＯの優れた活性及び長時間の半減期を示すであろう。
正常赤血球血性（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウスバイオアッセイは当分野で公知である（Ｐｈａｒｍ． Ｅｕｒｏｐａ Ｓｐｅｃ． Ｉｓｓｕｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ＢＲＰ Ｂｉｏ １９９７（２））。前記試料をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈する。７ないし１５週齢の正常な健常マウスに本発明のＰＥＧ化されたｈＥＰＯを０．２ｍｌ皮下投与する。投与７２時間後で開始する４日間にわたり、血液を尾静脈の穿刺により採取し、血液１μｌが０．１５μｍｏｌアクリジンオレンジ染色液の１ｍｌ中に存在したように希釈する。染色時間は３ないし１０分間である。（分析される３０，０００血球細胞あたりの）網状赤血球計数を、赤色蛍光ヒストグラムの分析によりフローサイトメーターにおいて微量蛍光定量的に実施する。研究された各群は１日あたり５匹のマウスからなり、前記マウスを１回だけ出血する。
バイオアッセイ さらに、ｈＥＰＯ受容体結合アッセイ及び、生物活性がＢａ／Ｆ３−ｈｕｈＥＰＯＲ細胞増殖によって決定される細胞増殖アッセイを使用する試験管内生物活性に関して本発明のｈＥＰＯポリペプチドを評価する。各アッセイについてのプロトコールはＷｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１２６１−１２６５、及び米国特許第５，７７３，５６９号及び第５，８３０，８５１号に記載されている。本発明にしたがって調製されるｈＥＰＯポリペプチドについてのＥＣ５０値は、組み換えエリスロポエチンを使用して得られる最大活性の５０％を生じるのに必要な化合物の濃度である。
天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯの安全性及び／又は有効性に関するヒトでの臨床治験。
目的 天然にコードされていないアミノ酸を含む皮下投与されるＰＥＧ化した組み換えヒトｈＥＰＯの安全性及び薬物動態学的特徴を、商業上入手可能なｈＥＰＯ製剤であるＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）又はＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ）と比較すること。
患者 年齢２０ないし４０歳及び体重６０ないし９０ｋｇの１８名の健常なボランティアを本研究に登録する。被験者は血液学又は血清化学について臨床的に有意な異常な実験値を有しておらず、負の尿中毒物学スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング、及びＢ型肝炎表面抗原を有していない。被験者は以下のいずれかの証拠を有するべきではない。すなわち、高血圧、いずれかの一次的な血液学的疾病の病歴、肝臓、腎臓、心臓循環器系、消化器系、泌尿生殖器系、代謝系、神経学的な有意な疾病の病歴、貧血又は発作性疾患の病歴、細菌由来又は哺乳類由来の生成物、ＰＥＧ、又はヒト血清アルブミンに対する既知の感度を有し、カフェイン含有飲料に対する習慣的及び多飲性の消費者であり、いずれかの他の臨床治験への参加又は研究に入る３０日以内に輸血又は献血をし、研究に入る３ヶ月以内にｈＧＨに対して暴露され、研究に入る７日以内に罹患し、研究前身体検査で又は研究に入る１４日以内の臨床的実験結果に有意な異常性を有している。すべての被験者は安全性について評価可能であり、薬物動態学的分析用のすべての採血はスケジュールどおりに回収される。すべての研究は施設内倫理委員会の承認並びに患者の同意を得て実施される。
研究デザイン これは、健常な男性ボランティアにおけるフェーズＩの、単一センターでの、非盲検の、無作為の、２期クロスオーバー研究である。１８名の被験者を２つの処置シーケンス群（１群につき９名の被験者）のうちの１つへ無作為に割り当てる。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯ及び商業的に入手可能な選択された生成物の等価の投与量を使用して、大腿上部に大量瞬時皮下注射として２つの個別の投与時期にわたってＥＰＯを投与する。商業的に入手可能な生成物の投与の量及び頻度は包装ラベルに説明してあるとおりである。商業的に入手可能な生成物を使用する場合に望まれる付加的な投与、投与頻度、又は他の因子は、被験者のさらなる群を含むことによって本研究へ付加されてもよい。各投与期間は１４日間の休薬期間により分離される。被験者は２回の投与期間の各々についての投与前少なくとも１２時間及び投与後の７２時間は研究センターに拘束されるが、投与期間と次の投与期間との間は拘束されない。ＰＥＧ化されたｈＥＰＯについて同様に検査されるべき追加の投与量、頻度、又は他の因子があるべきである場合、被験者の追加の群を付加してもよい。ヒトの使用について認可されるＥＰＯの複数の処方が本研究で使用されてもよい。ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）として市場に出回っているエポエチンアルファ及び／又はＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ）として市場に出回っているダルベポイテイン（ｄａｒｂｅｐｏｉｔｅｉｎ）はヒトの使用について認可される商業的に入手可能なＥＰＯ製剤である。ｈＥＰＯの実験的な処方は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯである。
採血 連続血をＥＰＯの投与の前後に静脈を直接穿孔することによって採取する。血清エリスロポエチン濃度の決定のための静脈血試料（５ｍＬ）を投与の約３０、２０、及び１０分前（３個のベースライン試料）に、及び投与後のほぼ以下の時間に得る。すなわち、３０分並びに１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後である。各血清試料を２つの一定分量へと分割する。すべての血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で維持して移動させる。迅速な臨床検査（血液学、血清化学、及び尿検査）を第１日の初期投与の直前、第４日の午前中、第１６日の投与の直前、及び第１９日の午前中に実施する。
生物学的分析方法 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット手段（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ＤＳＬ］、Ｗｅｂｓｔｅｒ ＴＸ）を使用して、血清エリスロポエチン濃度を決定する。商業上入手可能なＲＩＡは二重抗体の競合方法であり、ヒト尿エリスロポエチンに対するウサギポリクローナル抗血清を一次抗体として、及び１２５Ｉ標識したヒト尿エリスロポエチンをトレーサーとして使用する。エポエチンアルファ又はダルベポイテイン（ｄａｒｂｅｐｏｉｔｅｉｎ）はＤＳＬキット、標準物質及び品質対照資料において提供される尿エリスロポエチンに対して置換される。本アッセイで使用される標準濃度は、７．８、１５．６、３１．３、５０、６２．５、１００、及び１２５ｍＩＵ／ｍＬである。受理できる精確性を与える最低標準物質に対する平均適合値として定義される感度は８．６ｍＩＵ／ｍＬであり、本アッセイの範囲は品質対照希釈を通じて２，０００ｍＩＵ／ｍＬへ拡大される。
安全性の決定 バイタルサインを各投与直前（第１日目及び第１６日目）、及び各投与の６、２４，４８、及び７２時間後に記録する。安全性の決定は有害事象の発生頻度及びタイプ並びに臨床検査におけるベースラインからの変化に基づいている。さらに、血圧を含むバイタルサイン測定及び身体検査における研究前の値からの変化を評価する。
データ分析 投与後の血清濃度値を投与前のベースラインエリスロポエチン濃度について、投与前３０、２０、及び１０分で回収される３つの試料からエリスロポエチンレベルを平均することから決定される平均ベースラインエリスロポエチン濃度を投与後の各値から差し引くことによって補正する。投与前血清エリスロポエチン濃度はそれらがアッセイの定量レベルを下回る場合、平均値の計算には含まれない。薬物動態学的因子を、ベースラインのエリスロポエチン濃度について補正される血清濃度データから決定する。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を使用するＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステムに関するモデル独自の方法により薬物動態学的因子を算出する。以下の薬物動態学的因子を決定する。すなわち、ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）、線形台形公式の使用で算出される時刻０から最後の採血時刻までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）の下の面積（ＡＵＣ０−７２）、及び排出速度定数から計算される最終排出半減期（ｔ１／２）である。排出速度定数は、対数−直線濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ地点の直線回帰によって概算される。薬物動態学的因子の平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）を各処置について算出する。因子の平均の比（保存された処方／保存されていない処方）を算出する。
安全性の結果 有害事象の発生率を処置群にわたって等しく分配する。ベースライン又は研究前臨床検査又は血圧からの臨床的に有意な変化はなく、身体検査結果及びバイタルサイン測定結果における研究前からの顕著な変化はない。２つの処置群についての安全性特性は同様に出現すべきである。
薬物動態学的結果 商業上入手可能なｈＥＰＯ（ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ）又はＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ））の単回投与を受容した後のすべての１８名の被験者における（ベースラインエリスロポエチンレベルについて補正されていない）平均血清エリスロポエチン濃度−時間特性を、測定される各時点での天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯと比較する。すべての被験者は正常な生理学的範囲内の投与前のベースラインエリスロポエチン濃度を有するべきである。薬物動態学的因子を、投与前平均ベースラインエリスロポエチン濃度について補正された血清データから決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。ｈＥＰＯ（ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））についての平均ｔｍａｘは、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯについてのｔｍａｘよりも有意に短い。終末半減期値は、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯについての終末半減期と比較すると、ｈＥＰＯ（ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））について有意に短い。
本研究は健常な男性被験者において実施されるが、同様の吸収特性及び安全性特性は、癌又は慢性腎疾患を有する男性患者又は女性患者、小児腎疾患患者、貯血式自己血プログラムにある患者、又は待機手術の予定に入れられている患者などの他の患者集団において見込まれるであろう。
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯの皮下投与される単回投与は安全であり、健常な男性被験者によって十分耐容性を示されるであろう。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン、及び身体検査結果に基づいて、ｈＥＰＯ（ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））の安全性特性及び天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯの安全性特性は等価である。天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ化されたｈＥＰＯは患者及び健康管理提供者に対して大きな臨床的有用性を潜在的に提供する。
本明細書に記載される実施例及び実施態様は説明目的のためのみであり、その点におけるさまざまな修正又は変化は当業者に対して示唆されるものであり、本出願の精神及び範囲並びに添付される請求項の範囲内に含まれるべきであることは理解される。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願はすべての目的のためにそれらの全部において参照により本明細書にこれにより組み込まれる。
Figure 2007519422
四螺旋バンドル（４ＨＢ）タンパク質に対する一般的構造の模式図が示されている 四螺旋バンドルタンパク質である成長ホルモン（ＧＨ）に対する一般的構造の模式図が示されている。 四螺旋バンドルタンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）に対する一般的構造の模式図が示されている。 四螺旋バンドルタンパク質であるインターフェロンα−２（ＩＦＮα−２）に対する一般的構造の模式図が示されている。 四螺旋バンドルタンパク質である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対する一般的構造の模式図が示されている。 クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されており、以下の各位置：Ｙ３５、Ｆ９２、Ｙ１１１、Ｇ１３１、Ｒ１３４、Ｋ１４０、Ｙ１４３又はＫ１４５に、天然にコードされていないアミノ酸であるｐ−アセチルフェニルアラニンを含むｈＧＨの発現を実証している。 パネルＡ及びＢ−天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨ（パネルＢ）及び野生型ｈＧＨ（パネルＡ）のＩＭ９細胞に対する生物活性の模式図が示されている。 パネルＡ及びＢ−天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨ（パネルＢ）及び野生型ｈＧＨ（パネルＡ）のＩＭ９細胞に対する生物活性の模式図が示されている。 クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されており、天然にコードされていないアミノ酸へのＰＥＧ（５、２０及び３０ｋＤａ）の共有結合によってＰＥＧ化された、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨの産生を実証している。 天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨの様々なＰＥＧ化された形態の、ＩＭ９細胞に対する生物活性を実証する模式図が示されている。 パネルＡ−本図は、トリプシン切断部位が記され、非天然アミノ酸置換Ｆ９２ｐＡＦが矢印で明記されているｈＧＨの一次構造を図示している（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１０（４）：３２６−３３７）から改変された図）。 図１０、パネルＢ−天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生成されたペプチド（Ａと標示されている。）、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドから生成されたペプチド（Ｂと標示されている。）及びＷＨＯ ｒｈＧＨから生成されたペプチド（Ｃと標示されている。）の重ね合わされたトリプシンマップが示されている。図１０、パネルＣ−パネルＢから得られるピーク９の拡大図が示されている。 パネルＡ及びパネルＢは、精製されたＰＥＧ−ｈＧＨポリペプチドのクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。 ＩＭ９細胞に対するｈＧＨ二量体分子の生物活性の模式図が示されている。 パネルＡ−Ｇ１２０Ｒ置換を有するｈＧＨアンタゴニストによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータの模式図が示されている。 パネルＢ−同じ位置（Ｇ１２０）に取り込まれた非天然アミノ酸を有するｈＧＨポリペプチドによるｐＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するＩＭ−９アッセイデータの模式図が示されている。 図１３、パネルＢに示されているｈＧＨアンタゴニストの二量体がＩＭ−９アッセイにおいても生物活性を欠如していることを示す模式図が示されている。 天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの、ラットにおける血清半減期を、ＰＥＧ化されていないｈＧＨポリペプチドと比較する模式図が示されている。 天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドの、ラットにおける血清半減期を比較する模式図が示されている。 天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸を含むｈＧＨの、ラットにおける血清半減期を比較する模式図が示されている。ラットは、２．１ｍｇ／ｋｇを一度投薬された。 パネルＡ、天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸（位置３５、９２）を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与後における、ラットの体重増加に対する影響の模式図が示されている。図１８、パネルＢ−天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸（位置３５、９２）を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与後における、循環血漿ＩＧＦ−１レベルに対する影響の模式図が示されている。 図１８、パネルＣ−天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与後における、ラットの体重増加に対する影響の模式図が示されている。図１８、パネルＤ−天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸（位置９２、１３４、１４５、１３１、１４３）を含むｈＧＨポリペプチドの単回投与後における、循環血漿ＩＧＦ−１レベルに対する影響の模式図が示されている。 図１８、パネルＥ−天然にコードされていないＰＥＧ化されたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのラットにおける血清半減期を比較する模式図が示されている。

Claims (83)

  1. 一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む、四螺旋バンドル（４ＨＢ）ポリペプチド。
  2. ４ＨＢポリペプチドが一つ以上の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  3. ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  4. ポリペプチドが水溶性ポリマーに連結されている、請求項３に記載の４ＨＢポリペプチド。
  5. ポリペプチドが、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも一つのさらなる４ＨＢポリペプチドに連結されている、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  6. 二官能性リンカー又は二官能性ポリマーが第二のポリペプチドに連結されている、請求項５に記載の４ＨＢポリペプチド。
  7. 第二のポリペプチドが４ＨＢポリペプチドである、請求項６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  8. 水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  9. 前記水溶性ポリマーが、４ＨＢポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸に連結されている、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  10. Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、インターフェロン及び成長ホルモンからなる群から選択される、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  11. ４ＨＢポリペプチドが、４ＨＢ受容体に対する該４ＨＢポリペプチドの親和性を調節する一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  12. ４ＨＢポリペプチドが、該４ＨＢポリペプチドの安定性又は溶解度を増加させる一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  13. ４ＨＢポリペプチドが、組換え細胞中又はインビトロで合成される該４ＨＢポリペプチドの発現を増加させる一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  14. ４ＨＢポリペプチドが、該４ＨＢポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増加させる一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  15. 天然にコードされていないアミノ酸が、ポリペプチド中の２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性である、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  16. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  17. 天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  18. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2007519422
     （ここでｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項１７に記載の４ＨＢポリペプチド。
  19. 天然にコードされていないアミノ酸がアミノオキシ基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  20. 天然にコードされていないアミノ酸がヒドラジド基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  21. 天然にコードされていないアミノ酸がヒドラジン基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  22. 天然にコードされていないアミノ酸残基がセミカルバジド基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  23. 天然にコードされていないアミノ酸残基がアジド基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  24. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2007519422
     （ここでｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項２３に記載の４ＨＢポリペプチド。
  25. 天然にコードされていないアミノ酸がアルキン基を含む、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  26. 天然にコードされていないアミノ酸が、構造：
    Figure 2007519422
     （ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
    を有する、請求項２５に記載の４ＨＢポリペプチド。
  27. 水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  28. 水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａないし約５０ｋＤａの分子量を有する、請求項２７に記載の４ＨＢポリペプチド。
  29. カルボニル含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  30. アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を通じて、水溶性ポリマーに連結されている、請求項２９に記載の４ＨＢポリペプチド。
  31. カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  32. アルキン含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アジド部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  33. アジド含有アミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを、アルキン部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  34. アジド又はアルキン基が、アミド結合を通じて、水溶性ポリマーに連結されている、請求項１６に記載の４ＨＢポリペプチド。
  35. 水溶性ポリマーが分岐された又はマルチアームのポリマーである、請求項４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  36. 分岐されたポリマーの各分岐が約１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項３５に記載の４ＨＢポリペプチド。
  37. ポリペプチドが４ＨＢアンタゴニストである、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  38. ポリペプチドが、一つ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含む、請求項３７に記載の４ＨＢポリペプチド。
  39. ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項３８に記載の４ＨＢポリペプチド。
  40. 天然にコードされていないアミノ酸が４ＨＢポリペプチドの部位ＩＩ領域内に存在する、請求項３７に記載の４ＨＢポリペプチド。
  41. ポリペプチドが４ＨＢ受容体の二量体化を抑制する、請求項３７に記載の４ＨＢポリペプチド。
  42. 天然にコードされていないアミノ酸が糖質部分を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  43. リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、糖質部分を介してポリペプチドに連結されている、請求項３に記載の４ＨＢポリペプチド。
  44. ４ＨＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、前記ポリヌクレオチドが少なくとも一つのセレクターコドンを含む核酸。
  45. セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される、請求項４４に記載の単離された核酸。
  46. 天然にコードされていないアミノ酸を含む単離された４ＨＢポリペプチドを、該天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む、請求項３に記載の４ＨＢポリペプチドを製造する方法。
  47. ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含む、請求項４６に記載の方法。
  50. アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分が、アミド結合を通じて、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項４９に記載の方法。
  51. 天然にコードされていないアミノ酸残基がアルキン部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアジド部分を含む、請求項４６に記載の方法。
  52. 天然にコードされていないアミノ酸残基がアジド部分を含み、及びリンカー、ポリマー又は生物活性分子がアルキン部分を含む、請求項４６に記載の方法。
  53. アジド又はアルキン部分が、アミド結合を通じて、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項４８に記載の方法。
  54. ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項４７に記載の方法。
  55. ポリ（エチレングリコール）部分が分岐された又はマルチアームのポリマーである、請求項４７に記載の方法。
  56. 請求項１に記載の４ＨＢポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  57. 天然にコードされていないアミノ酸が水溶性ポリマーに連結されている、請求項５６に記載の組成物。
  58. 請求項５６に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、４ＨＢによって調節される疾患を有する患者を治療する方法。
  59. 請求項４４に記載の核酸を含む細胞。
  60. 細胞がオルソゴナルｔＲＮＡシンテターゼ又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む、請求項５９に記載の細胞。
  61. ４ＨＢポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含み、並びにセレクターコドン、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及びオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養することと；及び該４ＨＢポリペプチドを精製することとを含む、天然にコードされていないアミノ酸を含む４ＨＢポリペプチドを作製する方法。
  62. ４ＨＢポリペプチド中の天然に存在するアミノ酸の何れか一つ以上を、天然にコードされていない一つ以上のアミノ酸に置換することを含む、４ＨＢポリペプチドの血清半減期又は循環時間を増加させる方法。
  63. ポリヌクレオチドによってコードされる４ＨＢポリペプチド（ここで前記ポリヌクレオチドはセレクターコドンを含み、及び前記ポリペプチドは天然にコードされていない少なくとも一つのアミノ酸を含む）。
  64. 天然にコードされていないアミノ酸が、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項６３に記載の４ＨＢポリペプチド。
  65. 水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項６４に記載の４ＨＢポリペプチド。
  66. 天然にコードされていないアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項６３に記載の４ＨＢポリペプチド。
  67. ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項６５に記載の４ＨＢポリペプチド。
  68. ポリ（エチレングリコール）部分が分岐された又はマルチアームのポリマーである、請求項６５に記載の４ＨＢポリペプチド。
  69. ポリ（エチレングリコール）部分が、約１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項６８に記載の４ＨＢポリペプチド。
  70. 請求項６３に記載の４ＨＢポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  71. 組換え宿主細胞中での４ＨＢポリペプチドの発現を増加させる一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む４ＨＢポリペプチド。
  72. ４ＨＢポリペプチドの単一のアミノ酸に、共有結合によって連結された水溶性ポリマーを含む４ＨＢポリペプチド。
  73. 水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項７２に記載の４ＨＢポリペプチド。
  74. 水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸である、請求項７２に記載の４ＨＢポリペプチド。
  75. 前記天然にコードされていないアミノ酸がポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項１０に記載の４ＨＢポリペプチド。
  76. 少なくとも一つのリンカー、ポリマー、又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー、又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を通じてポリペプチドに付着されている、ポリペプチド。
  77. 前記ポリペプチドがモノＰＥＧ化されている、請求項７６に記載のポリペプチド。
  78. 前記ポリペプチドが４ＨＢポリペプチドである、請求項７６に記載のポリペプチド。
  79. 天然にコードされていない一つ以上のアミノ酸に付着された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記天然にコードされていないアミノ酸が、ポリペプチドの予め選択された部位中にリボソームによって取り込まれる、ポリペプチド。
  80. 前記ポリペプチドが４ＨＢポリペプチドである、請求項７９に記載のポリペプチド。
  81. ４ＨＢポリペプチドが、４ＨＢポリペプチドの免疫原性を調節する一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  82. ４ＨＢポリペプチドが、４ＨＢポリペプチドの血清半減期又は循環時間を調節する一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の４ＨＢポリペプチド。
  83. ４ＨＢポリペプチド中の天然に存在する何れかの一つ以上のアミノ酸を天然にコードされていない一つ以上のアミノ酸に置換することを含む、４ＨＢポリペプチドの免疫原性を調節する方法。
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