KR20050083677A - 변형 아시알로 인터페론 및 그의 용도 - Google Patents

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니콜라스 피이. 바커
다니엘 케이. 포돌스키
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더 제너럴 하스피탈 코포레이션
더 지아이 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 간 질병의 치료를 위한 변형 아시알로 인터페론의 제조 및 사용 방법을 특징으로 한다. 아시알로 인터페론은 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP); 폴리(비닐 알코올)(PVA); 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG)과 같은 폴리(알킬렌 옥사이드); 및 폴리(옥시에틸화 소르비톨), 폴리(옥시에틸화 글리세롤) 및 폴리(옥실에틸화 글루코오스)와 같은 폴리(옥시올화 폴리올)을 포함하는 수용성 고분자를 첨가함으로써 변형된다. 상기 간 질환의 치료를 위해 변형되고 사용될 수도 있는 아시알로 인터페론은 예를 들면, 아시알로 인터페론-α, 아시알로 인터페론-β, 및 아시알로 인터페론-γ를 포함한다.

Description

변형 아시알로 인터페론 및 그의 용도{MODIFIED ASIALO-INTERFERONS AND USES THEREOF}
본 발명은 인터페론을 이용한 간 질환(hepatic disorders) 치료에 관한 것이다.
인터페론은 바이러스 복제를 방지할 수 있는 최초로 발견된 자연-발생 단백질 군이다. 인터페론이 항-증식 효과를 갖고, 일부 형태의 암 세포를 공격하는데 유용하다는 것이 추가적인 연구에 의해 밝혀져 있다. 특히, 인터페론-α, -β, 및 -γ군(family)의 멤버(member)를 포함하는 인터페론은 간염, 탈세포 백혈병(hairy cell leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 흑색종(melanoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 및 만성 육아종 질환(chronic granulomatous disease)을 포함하는 수많은 바이러스 및 종양학적 징후(oncological indications)에 임상적으로 효과적인 것으로 나타났다.
B형 간염(HBV) C형 간염(HCV) 바이러스 감염은 세계적인 건강 문제이다. 3억 5천만명 이상의 사람들이 HBV에 의해 감염되었으며, 이는 전 세계적으로 가장 보편적이고 심각한 만성 바이러스 감염이다. 또한, HBV는 전세계 간암의 주된 요인이다. 게다가, 미국내 적어도 3백9십만명의 사람들을 포함하여 전세계 약 1억 7천만명의 사람들이 만성적으로 HCV에 감염되어 있다. HCV는 말기(end-stage) 간 질환 및 간암의 30%를 차지하고 있으며, 환자로 하여금 간 이식을 필요로 하게 하는 주요 질환이다. 그러나, HBV 및 HCV 양자에 대한 치료 옵션(treatment options)은 제한된 효과를 가지고, 그 효과가 빨리 사라질 수 있으며, 또한 종종 환자들에게 심한 고통을 겪게 한다.
미국에서 주요 간암 발생은 1975년에서 1995년 사이에 71%로 증가하였고, 매년 간암으로 판명된 환자의 수가 꾸준히 증가하고 있다. 2002년, 미국 간암 학회(American Cancer Society)는 16,600개의 새로운 형태의 주요 간암을 산정하였고, 미국 내에서 쓸개관 암(bile duct cancer)이 진단되었으며, 14,100명의 미국인들이 그 질병으로 사망할 것이라고 규명하였다.
인터페론이 강력한 치료 화합물임에도 불구하고, 이는 환자로부터 빠르게 소진(clear)되고, 치료학적으로 유효한 화합물 수준을 유지하기 위하여 자주 투약할 것이 요구된다. 또한, 인터페론은 특정 조직에 표적화 되지 않기 때문에 표적 부위에서 치료학적으로 유효한 농도를 얻기 위해서 매우 높은 수준의 농도를 요구한다. 인터페론의 이러한 특성은 치료의 결과로 발생되는 해로운 부작용(side-effects)의 가능성을 증가시킨다. 따라서, 효율성을 최대화하고, 부작용을 최소화하기 위해 인터페론을 질환 부위에 오랜 기간 동안 표적화해야 할 필요가 있었다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 양상은 약 1,000 내지 60,000 돌턴, 1,000 내지 5,000, 5,001 내지 10,000, 10,001 내지 20,000, 20,001 내지 35,000, 또는 35,001 내지 60,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체(water soluble polymer)에 콘쥬게이트된 실질적으로 순수하게 변형된 포유류(즉, 인간) 아시알로 인터페론에 관한 것이다. 수용성 중합체는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 내부적으로 가교될 수 있다. 바람직하게는, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG)과 같은 폴리(알킬렌 옥시드), 및 폴리(옥시에틸화 소르비톨), 폴리(옥시에틸화 글리세롤, 및 폴리(옥시에틸화 글루코스)와 같은 폴리(옥시에틸화 폴리올)이다. 본 발명의 아시알로 인터페론은 1, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 잔기에서 변형될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변형된 아시알로 인터페론에 있어서, 동일 또는 다른 수용성 중합체를 사용하여 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 아시알로 인터페론은 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 또는 글루타민산 잔기; C-말단 카르복실; 또는 N-말단 아민에서 변형될 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 아시알로 인터페론은 시스테인 또는 리신에서 변형된다. 변형에 적합한 아시알로 인터페론은 예를 들어 인간 아시알로 인터페론-α, 아시알로 인터페론-β, 및 아시알로 인터페론-γ를 포함한다. 또한, 본 발명은 변형된 포유류 아시알로 인터페론 및 약제학적으로 허용가능한 첨가제(excipient)를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 변형된 포유류(예를 들어, 인간) 아시알로 인터페론을 함유하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여함으로써 간 질환이 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 이용하여 치료할 수 있는 간 질환은 예를 들어, 바이러스 간염(viral hepatitis)(예를 들어, B형 간염 및/또는 C형 간염 바이러스로 감염), 간의 섬유증(fibrosis), 및 확산형(diffuse-type) 간세포 암(hepatocellular carcinoma), 발열형(febrile-type) 간세포 암, 및 담즙정체성(cholestatic) 간세포 암, 간모세포종(hepatoblastoma), 헤파토이드 선암(hepatoid adenocarcinoma), 및 병소 결정성 과형성(focal nodular hyperplasia)과 같은 간암(hepatic cancers)을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 대한 바람직한 구현예에서, 변형 아시알로 인터페론은 상기에서 기술된 것 중 임의의 것이다. 치료학적 유효량의 변형 아시알로 인터페론은, 예를 들어 약 0.025㎍/kg 내지 10.0㎍/kg 체중(예를 들어, 약 0.025, 0.035, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 또는 3.5㎍/kg 체중)의 범위일 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 예를 들어, 1일 1회, 2일 1회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1달 1회 투여되는 양이다.
"인터페론"은 바이러스 복제(viral replication) 및 세포 증식(cellular proliferation)을 억제하고, 면역 반응을 조절하며, 인터페론-α, -β 또는 -γ, 또는 그의 생물학적 활성 단편(biologically active fragments)과 실질적으로 동일한 인터페론으로 알려진 매우 균질한(homologous) 종-특이성 단백질의 군(family)이다. 인터페론의 생물학적 활성을 평가하는 방법은 널리 알려져 있다(예를 들어, Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247: 434-440, 1997; Grace et al., J. Interferon Cytokine Res. 21: 1103-1115, 2001; Bailon et al., Bioconj. Chem. 12: 195-202, 2001; Pepinsky et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 297: 1059-66, 2001). 인간 인터페론은 그의 세포 기원(cellular origin) 및 분자 구조를 기초로 세 가지 부류로 대별된다: 인터페론-α(백혈구), 인터페론-β(섬유아세포), 및 인터페론-γ(림프구).
"인터페론-α"는 인터페론 -α2 성숙 폴리펩티드(Accession No :P01563의 아미노산 24-188; SEQ ID NO : 1), 또는 그의 생물학적 활성 단편과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질이다. 따라서, 인터페론-α는 인터페론-α2 전구체 폴리펩티드(Accession No :P01563 ; SEQ ID NO : 1) 및 성숙 인터페론-α의 생물학적 활성(예를 들어, 항-증식 활성)을 유지하는 단편을 포함한다. 또한, 이러한 정의에는 예를 들어, 인터페론-α2b (SEQ ID NO : 1의 R46K 돌연변이) 및 인터페론-α2c(SEQ ID NO : 1의 R57H의 돌연변이)을 포함하는 인터페론-α2의 변이형태(variant forms)가 포함된다. 인터페론-α2b는 0-결합된 글리코프로틴이다. 인터페론-αl4c는 Asn-72에서 글리코실화된(glycosylated) N-결합된 글리코프로틴이다. 자연적인 인터페론은 Wellferon(Glaxo-Smith Kline), Alferon(Interferon), Sumiferon(Sumitomo) 및 Multiferon(Viragen)이라는 상품명으로 상업적으로 구입가능하다. 또한, 비-글리코실화된 인터페론-α는 예를 들어, 상품명 Roferon®-A(Roghe)의 재조합 인터페론-α2a, Intron®-A(Schering Plough)의 재조합 인터페론-α-2b; 및 Berofor alpha 2(Boehringer Ingelheim)의 재조합인터페론-α2c으로 상업적으로 구입가능하다. 재조합 교감(consensus) 인터페론-con 1은 상품명 Infergen(Amgen)으로 상업적으로 구입가능하다. 물론, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 전에, 임의의 비-글리코실화된 인터페론은 말단 갈락토스 잔기를 갖는 올리고당류로 글리코실화되어야 한다.
"인터페론-β"는 성숙 인터페론-β폴리펩티드(Accession No :P01574의 아미노산 22-187; SEQ ID NO : 2) 또는 그의 생물학적 활성 단편과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질이다. 따라서, 인터페론-β는 시그널 펩티드를 함유하지 않는 성숙 인터페론-β 단백질 이외에, 시그널 펩티드를 함유하는 인터페론-β 전구체 폴리펩티드(Accession No :P01574 ; SEQ ID NO : 2) 및 인터페론-β의 생물학적 활성(예를 들어, 항-증식 활성)을 갖는 그의 단편을 포함한다. 인터페론-β는 성숙 인터페론-β 단백질의 Asn 80에서 글리코실화된 글리코프로틴이다. 인터페론-β의 재조합 형태는 개발되어 왔으며, 상업적으로 구입가능하다. 인터페론-β1a는 상품명, Avonex® (Biogen) 및 Rebif® (Serono)으로 구입가능하다. 인터페론-βlb는 상품명, Betaseron(Berlex)으로 구입가능하다.
"인터페론-γ"는 성숙 인터페론-γ 폴리펩티드(Accession number P01579의 아미노산 21-166 ; SEQ ID NO : 3)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그의 생물학적 단편을 함유하는 단백질이다. 따라서, 인터페론-γ 단백질은 시그널 펩티드를 함유하지 않는 성숙 인터페론-γ 폴리펩티드 이외에, 시그널 펩티드를 함유하는 인터페론-γ 전구체 단백질((Accession number P01579 ; SEQ ID NO : 3) 및, 인터페론-γ의 생물학적 활성(예를 들어, 항증식 활성)을 갖는 그의 단편을 포함한다. 인터페론-γ는 Asn 48 및 다이머(dimer) 내 Asnl20에서 글리코실화된다. 인터페론-γ는 상품명, Actimmune(InterMune)으로 상업적으로 구입가능하다.
상술한 인터페론에 있어서, 인터페론 폴리펩티드 서열 중 하나의 아미노산이 생물학적 활성을 잃지 않은 채 다른 것으로 교체된 변이 형태도 이들 정의에 포함된다. 하나의 예로는 세린 또는 트레오닌 잔기가 시스테인 잔기로 교체되어, 그 시스테인 잔기가 후에 다른 모이어티(예를 들어, PEG 모이어티)를 인터페론에 콘쥬게이트 하는데 사용되는 인터페론-α, -β, 또는 -γ이다. 그러한 예에서, 시스테인은 인터페론 분자 내 위치에서 치환되어 폴딩(folding)에 간섭하지 않으며, 또한 적어도 분자 표면에 부분적으로 노출된다.
"아시알로 인터페론"은 자연적인 글리코실화된 인터페론 내에 존재하는 말단 시알기(sialic group)를 결여한 글리코실화된 인터페론이다. 말단 시알산(sialic acid) 잔기를 제거하면, 하부에 존재하는 갈락토스 모이어티가 노출된다. 아시알로 글리코프로틴 수용체(asialo glycoprotein receptor)에 의해 인식되는 것은 말단 갈락토스이다. 바람직하게는, 아시알로 인터페론은 자연적인 인터페론에 존재하는 카보하이드레이트 모이어티의 50%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 함유한다. 가장 바람직하게는, 아시알로 인터페론은 말단 시알산 잔기만 결여한다. 아시알로 인터페론은 인터페론-α, -β 또는 -γ와 같은 글리코실화된 인터페론으로부터 하나 이상의 시알산기를 제거함으로써 제조될 수 있다. 이러한 제거는 예를 들어, 약산 가수분해 또는 인터페론-α, -β 또는 -γ와 같은 자연적인 글리코실화된 인터페론을 정제된 뉴라민데이즈(neuroaminidase)로 처리함으로써 수행될 수 있다. 하나 이상의 당쇄(sugar chain)를 함유하는 인터페론에 있어서, 선택적인 시알기제거(selective desialylation)는 특이적 뉴라민데이즈(시알리다제, sialidase) 효소를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 정의에서 원핵 세포(prokaryotic cells)에 의해 전형적으로 생산된 인터페론, 진핵 세포(eukaryotic cells)에 의해 생산된 인터페론 및 효소적으로 또는 화학적으로 디글리코실화된 인터페론을 포함한 완전히 디글리코실화된(deglycosylated) 인터페론은 특별히 제외된다. 물론, 시알산 잔기를 제거하는 목적은 올리고당 쇄에 적어도 하나의 말단 갈락토스 잔기를 갖는 글리코실화된 인터페론을 생산하는 것이고, 말단 갈락토스 잔기는 예를 들어, 올리고당을 디글리코실화된(deglycosylated) 인터페론에 공유결합시키는 것을 포함하는 다른 적당한 수단에 의해 엔지니어링될 수 있다.
"변형 아시알로 인터페론"은 적어도 하나의 수용성 중합체에 콘쥬게이트되고, 자연적인 인터페론의 생물학적 활성(예를 들어, 항 증식 또는 항 바이러스 활성)의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지하는 아시알로 인터페론이다. 아시알로 인터페론에 콘쥬게이트 될 수 있는 수용성 중합체의 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(비닐 알코올)(PVA)과 같은 폴리알킬 글리콜, 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG)과 같은 폴리(알킬렌 옥시드), 및 폴리(옥시에틸화 소르비톨), 폴리(옥시에틸화 글리세롤), 및 폴리(옥시에틸화 글루코스)와 같은 폴리(옥시에틸화 폴리올)을 들 수 있다. 바람직하게는, 수용성 중합체가 약 100 돌턴 내지 200,000 돌턴, 예를 들어, 100 내지 999,1,000 내지 5,000, 5,001 내지 10,000, 10,001 내지 20,000, 20,001 내지 35,000, 35,001 내지 60,000, 60,001 내지 100,000, 또는 100,001 내지 200,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 수용성 중합체는 약 1,000 내지 5,000, 5,001 내지 10,000, 10,001 내지 20,000, 20,001 내지 35,000, 35,001 내지 60,000, 또는 60,001 내지 100,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는다. 또한, 이러한 정의에는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 수득되는 중합체의 형태가 포함된다.
상기 변형 아시알로 인터페론은 예를 들어, 인터페론의 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 또는 글루타민산 잔기; C-말단 카르복실; 또는 N-말단 아민에서 중합체와 공유결합됨으로써 변형될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 변형 아시알로 인터페론은 하나 이상의 아미노산 잔기에 수용성 중합체가 콘쥬게이트 됨으로써 변형된다. 당업자는 예를 들어, 변형 아시알로 인터페론 각각의 위치 이성체의 상대적인 항-바이러스 활성, 항-증식 활성 또는 생분배(biodistribution)/약물동력학(pharmacokinetics)을 측정 및 비교함으로써 아시알로 인터페론에 수용성 중합체를 콘쥬게이트하기 위한 가장 바람직한 잔기 및 그 중합체의 평균 분자량을 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 몇 가지 이성체의 조합이 복합적인 약제학적 프로필을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 활성은 본 명세서에 기술된 항-바이러스 또는 항-증식 분석에 의해 결정될 수 있다.
"페길레이티드(pegylated) 아시알로 인터페론"은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체에 콘쥬게이트되고, 자연적인 인터페론의 생물학적 활성(예를 들어, 항-증식 또는 항-바이러스 활성)의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지하는 아시알로 인터페론이다. 예를 들어, PEG는 모노메톡시 PEG(mPEG)일 수 있고, 그것은 아시알로 인터페론에 공유결합될 수 있다. 바람직하게는, PEG는 예를 들어 약 1,000 내지 5,000, 5,001 내지 10,000, 10,001 내지 20,000, 20,001 내지 35,000, 또는 35,001 내지 60,000 돌턴(예를 들어, 1,000, 1,450, 3,350, 5,000, 6,000, 8,000, 10,000, 12,000, 20,000, 30,000, 35,000, 40,000, 또는 60,000 돌턴)의 평균 분자량을 갖는 mPEG 중합체이다. 더욱 바람직한 구현예에서, mPEG 중합체는 예를 들어, 약 5,000, 12,000, 20,000, 또는 40,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는다. 페길레이티드 아시알로 인터페론은 예를 들어, 인터페론의 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 또는 글루타민산 잔기; C-말단 카르복실; 또는 N-말단 아민에서 페길화될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 페길레이티드 아시알로 인터페론은 하나 이상의 아미노산 잔기에서 페길레이티드다. 당업자는 예를 들어, 페길레이티드 아시알로 인터페론 각각의 위치 이성체의 상대적인 항-바이러스 활성, 항-증식 활성 또는 생분배(biodistribution)/약물동력학(pharmacokinetics)을 측정 및 비교함으로써 아시알로 인터페론에서 페길화 하기 위한 가장 바람직한 잔기 및 PEG의 평균 분자량을 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 몇 가지 이성체의 조합이 복합적인 약제학적 프로필을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 활성은 본 명세서에 기술된 항-바이러스 또는 항-증식 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
"피브이필레이트(pvpylated) 아시알로 인터페론"은 적어도 하나의 폴리비닐피롤리돈(PVB) 중합체에 콘쥬게이트되고, 자연적인 인터페론의 생물학적 활성(예를 들어, 항-증식 또는 항-바이러스 활성)의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지하는 아시알로 인터페론이다. 피브이필레이트 아시알로 인터페론은 예를 들어, 인터페론의 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 또는 글루타민산 잔기; C-말단 카르복실; 또는 N-말단 아민에서 피브필화될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, PVP 중합체는 예를 들어, 약 17,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는다.
당업자는 예를 들어, 피브이필레이트 아시알로 인터페론 각각의 위치 이성체의 상대적인 항-바이러스 활성, 항-증식 활성 또는 생분배(biodistribution)/약물동력학(pharmacokinetics)을 측정 및 비교함으로써 아시알로 인터페론에서 피브필화하기 위한 가장 바람직한 잔기 및 얼마나 많은 PVP 분자를 이용할 것인지를 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 몇 가지 이성체의 조합이 복합적인 약제학적 프로필을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 활성은 본 명세서에 기술된 항-바이러스 또는 항-증식 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
"간 질환"은 간 조직 또는 간 세포에 영향을 미치는 임의의 질환이다. "간 질환"의 예로는 바이러스 간염(viral hepatitis), 간 암(hepatic cancer), 및 간의 섬유증(fibrosis)을 포함한다. 간염은 예를 들어, B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의해 간이 감염됨으로써 발생될 수 있다. B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 감염은 당업자라면 표준 방법, 예를 들어 환자가 간염 바이러스에 대항하는 항체를 가지는지 평가하거나 또는 바이러스 RNA가 존재하는지를 평가하는 방법을 사용하여 진단할 수 있다.
"간 암"은 간의 조직 또는 세포가 비정상적으로 증식하는 임의의 질환이다. 간 암을 유발시키는 간 세포는 쓸개관(bile ducts) 세포, 간 문맥(portal vein)과 같은 혈관 세포, 가지 세포(dendritic cells), 또는 헤파토사이트(hepatocytes)를 포함한다. 간 암은 확산형(diffuse-type) 간세포 암(hepatocellular carcinoma), 발열형(febrile-type) 간세포 암, 및 담즙정체성(cholestatic) 간세포 암, 간모세포종(hepatoblastoma), 헤파토이드 선암(hepatoid adenocarcinoma), 및 병소 결정성 과형성(focal nodular hyperplasia)과 같은 간암(hepatic cancers)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 간 암은 간염 바이러스에 의한 만성 감염의 결과일 수 있다.
아시알로글리코프로틴 수용체를 발현하는 간암 환자는 변형 아시알로 인터페론으로 치료할 수 있다; 이러한 환자는 당해 기술분야에서 표준 진단 방법(예를 들어, Burgess et al., Hepatology 15: 702-706, 1992 ; Hirose et al., Biochem. and Biophys. Research Comm. 287: 675-681, 2001 ; Hyodo et al., Liver 13 : 80-5, 1993 ; Trere et al., Br.J. Cancer 81: 404-8, 1999)을 사용하여 확인될 수 있다.
"항네오플라스틱 치료(antineoplastic therapy)"는 네오플라즘(neoplasm)의 증식을 부분적으로, 또는 완전하게 억제하기 위해 사용되는 임의의 의학적 절차 또는 치료이다. 전형적으로, 항네오플라스틱 치료는 환자로부터 네오플라스틱 세포의 일부 또는 전부를 제거하는 외과적 수술(예를 들어, 간절제(hepatectomy)), 방사 치료(radiation therapy), 및 화학요법(chemotherapy)을 포함한다. 본 발명에 따른 아시알로 인터페론과 조합되어 투여될 수 있는 항네오플라스틱 화학요법약(chemotherapeutics)의 특히 유용한 군(class)은 예를 들어, 알킬화제(alkylating agents), 항대사제(antimetabolites), 니트로우레아(nitrosoureas), 및 플랜트 알칼로이드(plant alkaloids)를 포함한다. 바람직하게는, "항네오플라스틱 치료"는 예를 들어 네오플라즘 증식을 25%, 50%, 또는 75%의 감소시킨다. 더욱 바람직한 구현예에서, "항네오플라스틱 치료"는 예를 들어, 네오플라즘 증식을 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소시킨다. 변형 아시알로 인터페론과 조합될 수 있는 항네오플라스틱제(antineoplastic agents)의 예는 예를 들어, Wadler and Schwartz(Cancer Res. 50: 3473-3486, 1990)에 개시되어 있다.
"항바이러스제"는 바이러스를 파괴하거나 또는 생체 내에서 복제 또는 파종하는 바이러스의 활성을 감소시키는 화합물이다. 항바이러스제의 예는 인터페론-α, -β, -γ, 리바비린(lβ-리보퓨라노실-lH-1,2,4 트리아졸 3-카복사미드) 및 그의 유도체, 및 합성 뉴클레오티드 유사체 라미부딘((cis-1-[2'-히드록시메틸l-5'-(1,3-옥사티올라닐)]시토신), 및 그의 유사체를 포함한다. 또한, 당업자는 표준 방법(예를 들어, Monkarsh et al., Analytical Biochemistry 247: 434-440,1997 ; Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202,2001 ; and Grace et al., J. of Interferon and Cytokine Research 21: 1103-1115, 2001에 기술된 방법) 및 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 항바이러스제의 활성을 분석할 수 있다. 바람직하게는, "항바이러스제"는 예를 들어, 바이러스 복제 또는 파종을 적어도 10%, 20%, 30%, 또는 50% 감소시킨다. 더욱 바람직한 구현예에서, 항바이러스제는 예를 들어, 바이러스 복제 또는 파종을 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 감소시킨다.
"아시알로글리코프로틴 수용체-발현 간 질환(asialoglycoprotein receptor-expressing hepatic disorder)"은 검출 가능한 수준의 아시알로글리코프로틴 수용체 단백질(Accession No.:NP001662 또는 P07307) 또는 아시알로 글리코프로틴 수용체 또는 핵산과 실질적으로 동일한 단백질을 발현하는 세포를 함유한 간 질환이다. 상기 세포는 생체 내, 생체 외, 시험관 내 등의 적당한 기술을 사용하여 아시알로글리코프로틴 수용체 발현에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 생검(biopsy) 또는 외과적 절제(surgical resection)가 수행되는 동안 환자로부터 추출된 세포가 표준 면역조직화학(immunohistochemistry), 노던(Northern) 또는 웨스턴(Western) 블롯팅 기술, 또는 ELISA를 이용하여 아시알로글리코프로틴 수용체 발현에 대해 평가될 수 있다. 또한, 아시알로글리코프로틴 수용체는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Spiess et al.(Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82: 6465-6469, 1985 참조) 및 Spiess et al.(J. Biol. Chem. 260: 1979-1982, 1985 참조)에 개시되어 있다.
"실질적으로 동일한"이란 참고가 되는 아미노산 또는 핵산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 또는 핵산이다. 폴리펩티드에서, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 20 아미노산, 바람직하게는 적어도 30 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 40 아미노산, 및 가장 바람직하게는 50 아미노산이다. 핵산에 있어서, 비교 서열의 길이는 적어도 60 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 90 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게는 적어도 120 뉴클레오티드이다.
서열 아이덴티티(identity)는 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 지네틱 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)을 이용하여 측정된다. 그러한 소프트웨어는 다양한 치환(substitutions), 결실(deletions), 및/또는 기타 변형(modifications)에 상동성의 정도를 할당함으로써 동일 또는 유사한 서열에 상응한다. 보존성 치환(Conservative substitutions)은 전형적으로 하기의 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 아이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루타민산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 알기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
"유효량"이란 네오플라즘의 성장을 억제하거나 또는 생체 내 바이러스 복제 또는 파종(dissemination)을 방지하기 위해 필요한, 단독 또는 본 발명에 따른 조합 내에서의 화합물의 양이다. 네오플라즘(neoplasms)(즉, 암) 및 바이러스 감염의 치료를 위해 본 발명의 프랙티스에 사용될 수 있는 활성 화합물의 치료학적 유효량은 투여 방식, 연령, 체중, 및 주체의 일반적인 건강 상태에 따라 변화된다. 극단적으로, 주치의는 적당량 및 도스 요법(dosage regimen)을 결정할 것이다. 그러한 양을 "치료 유효량"으로 칭한다.
변형 아시알로 인터페론의 "유효량"은 예를 들어 약 0.0035㎍ 내지 20㎍/kg 체중/일 또는 0.010㎍ 내지 140㎍/kg 체중/주일 수 있다. 바람직하게는, "치료학적 유효량"은 1일 1회, 2일 1회, 1주 2회, 1주 1회 투여되는 약 0.025㎍ 내지 10.0㎍/kg, 예를 들어, 약 0.025, 0.035, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 또는 9.0㎍/kg 체중의 범위이다. 또한, 변형 아시알로 인터페론의 "치료 유효량"은 예를 들어, 1일 1회, 2일 1회, 1주 2회, 1주 1회 또는 1달 1회 투여되는 약 100㎍/m2 내지 100,000㎍/m2의 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 1일 1회, 2일 1회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회 또는 1달 1회 투여되는 변형 아시알로 인터페론의 치료 유효량은 약 1,000㎍/m2 내지 20,000㎍/m2, 예를 들어, 약 1,000, 1,500, 4,000, 또는 14,000㎍/m2의 범위이다.
"단편"은 참고가 되는 단백질 또는 핵산과 실질적으로 동일하고, 또한 참고가 되는 단백질 또는 핵산의 생물학적 활성(예를 들어, 항-네오플라스틱 또는 항-바이러스 활성)의 적어도 50% 또는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 90%, 또는 95%, 또는 99%을 유지하는 단백질 또는 핵산의 부분이며, 이는 본 명세서에 기술되어 있는 항-바이러스 또는 항-네오플라스틱 분석을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 변형 아시알로 인터페론은 질환 치료에 있어서, 자연적으로 발생되는 형태의 인터페론을 뛰어 넘는 수많은 장점을 제공한다. 변형(예를 들어, 페길화(pegylation) 및 피브필화(pvpylation))의 장점은 하기를 포함한다: 증가된 용해도, 감소된 콩팥 및 면역 제거(immunoclearance), 감소된 단백질 가수분해 감수성(proteolytic susceptibility), 및 감소된 면역 발생력(immunogenicity). 본 명세서에 개시된 바와 같이, 아시알로 인터페론의 변형은 신체에서 제거되는 화합물의 제거 속도를 감소시킴으로써 화합물의 치료학적 유효성을 증가시키는 것을 돕는다. 변형 화합물은 비변형 화합물 보다 장기간 동안 신체 내에 존재하기 때문에 더 적은양의 변현 화합물이 환자에게 투여되는 반면, 동일한 치료적 결과를 얻을 수 있다. 또한, 변형 아시알로 인터페론은 간을 표적화함으로써 비변형 인터페론의 투여와 관련된 부작용의 발생을 감소시키고, 또한 치료에 있어서 유해한 것들도 감소시키는 결과를 가져온다.
또한, 인터페론으로부터 시알산기를 제거하면 그의 말단 갈락토스 잔기 및 아시알로 인터페론을 노출시켜 아시알로글리코프로틴 수용체를 발현하는 임의의 세포에 표적화된다. 간 내 수용체 부위의 총 수가 보통의 간에서 세포 당 부위로140,000(+/-65,000)인 것에 반해, 섬유증(fibrosis), 적증(chirrhosis), 또는 간암종(hepatocarcinoma)으로 감염된 간에서 세포 당 부위로 300,000(+/-125,000)까지 증가되는 것으로 알려져 있다(Eisenberg etal., J. Hepatol. 13: 305-309,1991). 이러한 발견에 의해, 변형 아시알로 인터페론은 간에 우선적으로 표적화된다. 그러한 표적화는 치료 부위에서 치료 화합물의 국소 농도를 증가시키고, 또한 질환을 효과적으로 치료하기 위해 필요한 도스를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 치료 화합물의 증가된 잔류 및 특정 조직의 표적화로 인해 증가된 치료적 유효성을 갖는다.
도면의 간단한 설명
도 1은 자연적인 인간 인터페론-α의 구조를 나타내는 개략도이다. 또한, 뉴라미니다제(neuraminidase)에 의해 자연적인 인간 인터페론-α의 전형적인 비안테나리(biantennary) 복합형(complex-type) 당쇄의 분열 부위(cleavage sites)가 도시되어 있다. 약자: Fuc, 프럭토스; GIcNAc, N-아세틸글루코사민; Man, 만노스; Gal, 갈락토스; NeuAc, N-아세틸뉴라민산(시알산).
도 2A는 시그널 펩티드(아미노산 1-23; 볼드체)를 포함하는 인간 인터페론-α-2 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열(Accession No.:P01563) (SEQ ID NO : 1)이다. 성숙 인터페론-α-2 폴리펩티드(보통체)는 아미노산 24-188로부터 확장된다. 아미노산 129에서 밑줄 그어진 트레오닌은 O-결합 글리코실화 부위이다.
도 2B는 인간 인터페론-α2 전구체 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA의 핵산 서열(Accession No.: NM000605) (SEQ ID NO : 4)이다. 상기 코딩 서열은 핵산 69에서 핵산 635로 확장된다. 개시 및 종결 코돈은 밑줄 그어져 있다. 이러한 핵산 서열의 몇 가지 변이형태(variant forms)가 존재하는데, 이는 하기 핵산 변형을 포함한다: 핵산 위치 205에서 A가 G로; 핵산 위치 667에서 A가 G로, 핵산 위치 909에서 C가 T로; 및/또는 핵산 위치 949에서 A가 G로.
도 3A는 시그널 펩티드(아미노산 1-21; 볼드체)를 포함하는 인간 인터페론-β 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열(Accession No. :P01574) (SEQ ID NO : 2)이다. 상기 성숙 인간 인터페론-β 폴리펩티드(보통체)는 아미노산 22-187로부터 확장된다. 아미노산 위치 101에서 밑줄 그어진 아스파라긴은 N-결합된 글리코실실화 부위이다. 인간 인터페론-β 변이 폴리펩티드는 아미노산 위치 162(C 내지 Y)에서 티로신을 함유한다.
도 3B는 인간 인터페론-β 전구체 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA의 핵산 서열(Accession No:NM002176) (SEQ ID NO :5)이다. 상기 코딩 서열은 핵산 1-564로부터 확장된다. 개시 및 종결 코돈은 밑줄 그어져 있다. 이러한 핵산 서열의 몇 가지 변이형태(variant forms)가 존재하는데, 이는 하기 핵산 변형을 포함한다: 핵산 위치 153에서 C가 T로; 및 핵산 위치 228에서 C가 T로.
도 4A는 시그널 펩티드(아미노산 1-20; 볼드체)를 포함하는 인간 인터페론-γ 전구체 단백질의 아미노산 서열(Accession No.:P01579) (SEQ ID NO : 3)이다. 상기 성숙 인간 인터페론-γ 폴리펩티드(보통체)는 아미노산 21-166에서 확장된다. 인터페론-γ 전구체 단백질의 아미노산 위치 48 및 120에서 밑줄그어진 아스파라긴은 N-결합된 글리코실화(비록 Asn 120이 단지 다이머에서 글리코실화 될지라도) 부위이다.
도 4B는 인간 인터페론-γ 전구체 단백질을 코드화하는 mRNA의 핵산 서열(NM~000619) (SEQ ID NO : 6)이다. 상기 코딩 서열은 핵산 109-609로부터 확장된다. 개시 및 종결 코돈은 밑줄 그어져 있다. 이러한 핵산 서열의 몇 가지 변이형태(variant forms)가 존재하는데, 이는 하기 핵산 변형을 포함한다: 핵산 위치 624에서 A가 G로; 핵산 위치 705에서 A가 G로; 핵산 위치 732에서 A가 T로; 핵산 위치 789에서 C가 T로; 핵산 위치 986에서 C가 T로; 및 핵산 위치 1148에서 A가 G로.
발명의 상세한 설명
본 발명은 변형 아시알로 인터페론, 예를 들어 페길레이티드(pegylated) 아시알로 인터페론 및 피브이필레이트 아시알로 인터페론 및, 네오플라스틱(neoplastic) 질환 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 그러한 화합물의 이용방법에 관한 것이다. 변형 아시알로 인터페론은 아시알로 글리코프로틴 수용체(glycoprotein receptor) 및 인터페론 수용체를 발현하는 세포에 표적화된다. 따라서, 그러한 화합물은 이러한 수용체 중 하나를 발현하는 세포의 네오플라즘(neoplasms) 또는 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 최적의 활성이 2개의 수용체 모두를 발현하는 세포에 사용된다.
인터페론으로부터 시알산기를 제거하면, 그의 말단 갈락토스 잔기가 노출되고, 따라서 상기 아시알로 인터페론은 아시알로글리코프로틴 수용체를 발현하는 임의이 세포에 표적화된다. 간에서 수용체 부위의 총 수가 보통의 간에서 세포 당 부위로 140,000(+/-65,000)인데, 섬유증(fibrosis), 적증(chirrhosis), 또는 간암종(hepatocarcinoma)에 의해 감염된 간에서 세포 당 부위로 300,000(+/-125,000)까지 증가한 것으로 알려져 있다(Eisenberg 등의 J. Hepatol. 13: 305-309, 1991 참조). 이러한 발견을 기초로, 변형 아시알로 인터페론은 우선적으로 간에 표적화된다. 그러한 표적화는 치료 부위에서 치료 화합물의 국소 농도를 증가시키고, 또한 질환을 효과적으로 치료하기 위해 필요한 도스를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 치료 화합물의 잔류(retention)를 증가시키고, 특정 조직에 대한 표적화(targeting)로 인해 치료적 유효성을 증가시킨다.
본 발명의 변형 아시알로 인터페론은 질병을 치료하기 위하여 자연적으로 발생되는 형태의 인터페론을 뛰어 넘는 많은 장점을 제공한다. 변형(예를 들어, 페길화 및 피브필화)의 장점은 하기를 포함한다: 증가된 용해도, 감소된 콩팥 및 면역 제거(immunoclearance), 감소된 단백질 가수분해 감수성(proteolytic susceptibility), 및 감소된 면역 발생력(immunogenicity). 본 명세서에 기술된 바와 같이, 아시알로 인터페론의 변형은 화합물이 신체로부터 제거되는 속도를 감소시키는 것을 도와주며, 그에 따라 화합물의 치료적 유효성을 증가시킨다. 변형된 화합물이 비-변형된 형태 보다 더 오랜 기간 신체 내에 존재하기 때문에 더 적은 양의 변형 화합물이 환자에게 투여될 수 있다. 도스를 감소시킴에 따라, 화합물의 투여와 관련되거나, 치료에 해로운 부작용의 잠재적 발생이 감소된다.
변형 아시알로 인터페론 치료(Modified Asialo-Interferon Therapy)
선천성 인터페론과 같은 변형 아시알로 인터페론은 간염 및 일부 암을 포함하는 간 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법을 이용한 치료 유효량의 변형 아시알로 인터페론(예들 들면, 변형 아시알로 인터페론-α, 변형 아시알로 인터페론-β 또는 변형 아시알로 인터페론-γ)을 포함한 조제 조성물을 포유류에게 투약함으로써, 포유류 내(예들 들면, 인간)에서 B형 및 C형 간염, 및 아시알로당단백질-발현에 의한 간암이 치료될 수 있다.
또한, 변형 아시알로 인터페론은 화학요법, 방사요법, 외과시술 및 추가적인 항바이러스 화합물의 투약과 같은 다른 치료적 접근과 조합하여 이용될 수 있다(그러한 조합은 업계의 표준이며, 예들 들면, Wadler 등의 「Cancer Res. 50: 3473-86,1990」에 기술되어 있다). 예들 들면, 변형 아시알로 인터페론은 바이러스 감염에 치료하기 위하여 치료 유효량의 리바비린(ribavirin)(1β-D 리보퓨라노실-lH-1,2,4 트리아졸 3-카르복스아미드) 또는 그 유도체와 함께 투약될 수도 있다. 변형 아시알로 인터페론은 바이러스 감염을 치료하기 위하여 치료 유효량의 라미뷰딘(시스-1-[2'-하이드록시메틸-5'-(1,3-옥사티올아닐)]시토신; cis-1-[2'-Hydroxymethyl-5'-(1,3-oxathiolanyl)]cytosine), 또는 라미뷰딘 유사체와 함께 선택적으로 투약될 수도 있다.
아시알로당단백질 수용체(Asialoglycoprotein Receptor)
아시알로당단백질 수용체는 간세포의 고농도에서(50,000~500,000site/cell) 존재하는 막횡단 단백질이며, 노출된 말단 갈락토오스 잔기를 갖는 세포 외(外) 당단백질의 결합 및 내재화(internalization)를 중재한다. 아시알로당단백질 수용체는 친화성이 낮은 수용체이며, 리간드에 대한 친화성은 리간드에 존재하는 갈락토오스 클러스터(cluster)의 수에 따라 다양하다(Lee et al., J. Biol. Chem. 258:199-202, 1983). 상기 수용체는 세 개의 갈락토오스 잔기, 즉 트리안테나리(triantennary; KD~10-8-10-9)를 갖는 리간드 보다 두 개의 갈락토오스 잔기, 즉 비안테나리(biantennary; KD~10-6)을 갖는 리간드에 대하여 보다 낮은 친화도를 가진다.
인터페론의 운반(Delivery of Interferons)
천연 인터페론으로부터의 시알산기 제거는 말단 갈락토오스 잔기를 노출시켜서 아시알로당단백질 수용체에 대한 인식 부위를 생성시킨다. 이러한 변형은 아시알로 인터페론이 간과 같은 아시알로당단백질 수용체를 발현시키는 조직에 선택적으로 표적화하는 장점을 부여한다. 또한, 아시알로당단백질 수용체에 대한 결합 및 수용체 복합 내재화(receptor complex internalization)로 인하여 세포간 인터페론-α/β 수용체풀을 활성화시키는 인터페론의 능력을 향상시킬 수 있다. 더욱이, 아시알로당단백질 수용체에 대한 아시알로 인터페론의 표적화는 세포 표면에서 아시알로 인터페론의 국소 농도를 증가시킴으로써 아시알로 인터페론이 간세포에서 저농도(100~5,000site/cell)로 존재하는 고 친화 인터페론-α/β 수용체에 결합하는 가능성을 증가시킨다.
세포표면 인터페론 수용체 결합(Cell Surface Interferon Receptor Binding)
추가적으로, 아시알로당단백질 수용체에 대한 결합을 통한 간세포 표면의 아시알로 인터페론의 국소 농도 증가는 아시알로 인터페론-α, -β 또는 -γ가 인터페론-α/β 수용체 또는 인터페론-γ 수용체와 보다 더 상호작용을 잘하도록 한다. 아시알로당단백질 수용체로부터 인터페론-α/β 수용체 또는 인터페론-γ 수용체로의 아시알로 인터페론의 전이는 아시알로당단백질 수용체에 대한 감소된 친화도를 갖는 아시알로 인터페론 조성물에서 보다 잘 발생할 수 있다. 리간드에 대한 아시알로당단백질 수용체의 친화도는 리간드에 존재하는 갈락토오스 클러스터 수에 따라 변한다(Lee et al., J. Biol. Chem. 258:199-202, 1983). 아시알로당단백질 수용체는 트리안테나리 리간드(KD~10-8-10-9)에 대해서 보다 비안테나리 리간드(KD~10-6)에 대해서 낮은 친화도를 갖는다.
다른 비율의 비안테나리 복합체를 갖는 인터페론을 만들기 위한 다양한 방법들이 업계에 알려져 있다. 예들 들면, 섬유모세포에 의해 생산된 인터페론은 CHO 세포에 의해 생성된 인터페론 보다 높은 비율의 비안테나리 복합체를 갖는다. 특히, 인간 섬유모세포에서 생성된 인간 아시알로 인터페론-β는 약 82%의 비안테나리 갈락토오스 말단 올리고당 및 약 18%의 트리안테나리 갈락토오스 말단 올리고당을 함유한다.
인터페론-β의 탄수화물 사슬의 연장된 형태가 주어진 바(Karpusas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 11813-11818, 1997), 인터페론-β는 아시알로당단백질 수용체 및 인터페론-α/β 수용체와 동시에 상호작용하기 쉽다. 따라서, 풍부한 아시알로당단백질 수용체는 보다 적은 인터페론-α/β 수용체와 동시에 상호작용할 수 있는 세포 표면에서 아시알로 인터페론-β에 집중할 수 있다.
세포간 인터페론 수용체 결합(Intracellular Interferon Receptor Binding)
세포간 인터페론 수용체에 대한 인터페론-α, -β 또는 -γ의 결합은 인터페론 신호를 유발할 수 있다. 리포솜으로 삽입된 인터페론-α는 유리 인터페론-α보다 상당히 큰 활성도를 일으키는 바, 이는 인터페론이 활성을 발휘하는 세포표면에 도달할 필요가 없다는 가설을 지지해 준다. 나아가, 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드 결합은 수용체-리간드 복합체의 내재화를 촉진시키며, 이는 아시알로 인터페론이 세포간 인터페론 수용체에 접근할 수 있도록 한다.
인터페론 생산(Interferon Production)
일반적으로, 인터페론-α(도 2A), -β(도 3A) 또는 -γ(도 4A)에서와 같은 본 발명에 따른 폴리펩티는는 적당한 숙주 세포의 변형에 의하여 생성될 수 있는 바, 상기 숙주 세포는 예를 들면, 도 2B에 도시된 핵산을 인코딩하는 인터페론-α, 도 3B에 도시된 핵산을 인코딩하는 인터페론-β, 도 4B에 도시된 핵산을 인코딩하는 인터페론-γ 또는 적당한 발현 운반수단 내에서 그에 관한 단편과 같은 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자의 전부 또는 부분을 갖는 진핵세포를 들 수 있다.
분자 생물학 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 다양한 발현 시스템이 재조합 단백질을 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 인터페론 펩티드 유전자 서열이 플라스미드 또는 다른 벡터 속으로의 도입으로 인해, 진핵세포 인터페론 펩티드 발현 시스템이 야기될 수 있는 바, 이는 그 후 생체 세포의 변형에 이용된다. 인터페론 펩티드 cDNA가 올바른 배향으로 삽입된 발현 플라스미드로의 전체 개방 해독틀를 포함하는 구조체는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 진핵세포 발현시스템은, 인터페론 펩티드가 동정화 및/또는 정제를 촉진시키는 표지 분자(tag molecule)에 공유결합된 인터페론 펩티드 융합단백질의 발현 및 회복을 허용한다. 효소적 분할 또는 화학적 분할은 인터페론 펩티드와 표지분자 사이에서 처리되어 표지는 뒤따르는 정제로 제거될 수 있다.
전형적인 발현백터들은 플라스미드-부하(plasmid-bearing) 세포 내에 삽입된 인터페론 펩티드 핵산에 대응되는 많은 양의 mRNA의 합성을 명령하는 프로모터들을 포함한다. 이들은 숙주 조직 내에서 자발적 복제를 허용하는 복제 서열의 진핵 또는 원핵생물의 기원(origin), 벡터-함유 세포가 다른 독성 인터페론의 존재하에서 선택되도록 허용하는 유전적 특성을 암호화하는 서열, 및 합성된 mRNA가 해독되는 효율성을 증진시키는 서열을 포함할 수 있다. 안정된 장기 벡터(long-term vector)는 예들 들며, 바이러스(이를테면, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus genome)으로부터 OriP 서열)의 조절 요소를 사용함으로써 자유롭게 복제하는 단위(entity)로서 유지될 수 있다. 또한 세포주는 벡터가 게놈DNA로 삽입되도록 생산될 수 있는데, 이러한 방법으로 유전자 산은 연속적인 체제로 생성된다.
사용되는 정확한 숙주세포가 본 발명에서 특징적인 것은 아니다. 본 발명의 폴리펩티드는 진핵 숙주세포 내에서 생성될 수 있다(예를 들면, Saccharomyces cerevisiae, 곤충세포, 예들 들면, Sf21 세포, 또는 포유류 세포, 예들 들면, NIH 3T3, HeLa, CHO, COS 세포, 또는 바람직하게는 섬유모세포). 그러한 세포들은 폭넓은 범위의 기원으로부터 사용 가능하다(예들 들면, 미국 표준 균주수록 Manassas, VA; 또는, 예들 들면, Ausubel 등의 「Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001」 참조). 형질전환 또는 형질도입의 방법 및 발현 비히클의 선정은 선택된 숙주 시스템에 의존할 것이다. 형질전환 및 형질도입 방법들은 예들 들면, Ausubel 등(Supra)에 기재되어 있으며; 발현 비히클은 예들 들면, 클로닝 벡터(Cloning Vectors : A Laboratory Manual(P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987))에 제공된 것으로부터 선택될 수 있다.
다양한 발현 시스템이 본 발명에 따른 폴리펩티드가 생산을 위해 존재한다. 예들 들면, 포유류 세포가 인터페론 폴리펩티드 발현에 이용될 수 있다. 안정한 또는 일과성(transient) 세포주 클론이, 가용성(절두 및 표식) 형태의 인터페론 폴리펩티드를 생성하기 위해 인터페론 펩티드 발현벡터를 이용하여 만들어 질 수 있다. 적절한 세포주는 예들 들어, COS, HEK293T, CHO 또는 NIH 3T3 세포주를 포함한다. 적절한 벡터는 염색체 벡터, 에피솜 벡터 및 바이러스 유도벡터, 예들 들면 박테리아 플라스미드로부터, 박테리오파지로부터, 트랜스포존으로부터, 효모 에피좀으로부터, 삽입 요소로부터, 효모 염색체 요소로부터 유도된 벡터, 바큘로바이러스(baculoviruses), SV40와 같은 파포바바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 수두 바이러스, 슈도레이비스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터, 및 이들의 결합으로부터 유도된 벡터를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일단 적절한 발현 벡터가 구성되면, 이들은 인산염 칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 트랜스펙션, 천기천공, 현미주사, 프로토플라스트 융합 또는 리포솜-중재 트랜스펙션과 같은 변형기술에 의하여 적절한 숙주 세포 속으로 도입되는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 벡터에 세포 감염되는 숙주 세포로는 효모, 진균, 곤충 세포(예들 들면, SF9 곤충 세포에서 발현을 위한 바큘로바이러스 벡터를 이용한), 또는 쥐, 인간 또는 다른 동물들로부터 유도된 세포가 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 시험관 내에서, 인터페론 폴리펩티드의 발현, 융합 또는 클론된 DNA에 의해 인코드된 폴리펩티드 조각이 또한 이용될 수 있다. 매우 다양한 발현 시스템 및 정제 시스템이 재조합 인터페론 폴리펩티드 및 그에 관한 조각을 생성하는데 이용될 수 있다는 것을 분자 생물학의 당업계에서 통상의 지식을 가진 자는 이해할 수 있을 것이다. 이러한 몇몇 시스템들은 예들 들면, Ausubel 등의 「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY(2000)」에 기재되어 있다.
천연 글리코실화 인터페론은 그것을 선천적으로 생성하는 인간세포, 또는 재조합 인터페론 유전자를 발현시키도록 가공되어 온 트랜스제닉 진핵세포로부터 분리될 수 있다. 천연 또는 재조합형의 인터페론 생산 방법은 일반적으로 미국 특허: 제 4,124,702, 4,130,641, 4,680,261, 4,758,510, 5,376,567, 5,795,779 및 5,827,694호에 기재되어 있다. 선택적으로, 분리 및 정제된 인간 인터페론은 상업적으로 유용하다(예들 들면, Sigma Chemical Co. Catalog Nos.I 2396, I 2271, I 1640, 및 I 6507).
일단 본 발명에 따른 재조합 재조합 폴리펩티드가 발현되면, 그것은 예들 들면, 친화력 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 분리된다. 하나의 예에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대항하여 생산된 항체(예들 들면, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 알려진 표준기술에 의해 생성)는 칼럼에 부착될 수 있으며, 재조합 폴리펩티드를 분리하는데 이용될 수 있다. 친화력 크로마토그래피에 선행하여 폴리펩티드-번식 세포의 용균(lysis) 및 분획은 표준 방법들에 의해 수행될 수 있다(예들 들면, Ausubel et al., supra).
일단 분리되면, 재조합 단백질이, 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 다른 크로마토그래피들에 의해 더욱 정제될 수 있다(예들 들면, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980 참조).
본 발명에 따른 폴리펩티드는 특히, 짧은 펩티드 단편들은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다(예들 들면, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., The Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984 에 기재된 방법들에 의함).
폴리펩티드 발현 및 정제에 관한 이러한 일반적인 기술들은 여기에 기재된 인터페론의 생물학적 활성도를 갖는 유용한 펩티드 단편 또는 유사체를 생성 및 분리하는데 또한 이용될 수 있다.
아시알로 인터페론의 생성(Asialo-Interferon Production)
다른 비율의 비안테나리 복합체를 갖는 인터페론 생성에 관한 여러 가지 방법들이 알려져 있다. 섬유모세포에 의해 생성된 인터페론은, 예들 들면, 중국 비단털쥐 난소 세포에 의해 생성된 인터페론 보다 더 높은 비율의 비안테나리 복합체를 갖는다. 특히, 인간 섬유모세포에서 생성된 인간 아시알로 인터페론-β는 약 82%의 비안테나리 갈락토오스 말단 올리고당과 약 18%의 트리안테나리 갈락토오스 말단 올리고당을 함유한다.
글리코실화되고 진핵세포에서 생성된 선천적 특성으로 인해 통상 시알 잔기를 갖는 인터페론으로부터 말단 시알 잔기(sialic residue)를 제거함으로써, 아시알로 인터페론은 생산될 수 있다(예들 들면, 미국 특허번호 제 4,184기7호 및 여기에 인용된 참조문헌, 및, Kasama et al., J. Interfer. Cyto. Res. 15:407-415, 1995를 보라). 말단 시알 잔기는 예들 들면, Drzenieck et al.(Microbiol. Immunol. 59: 35,1972)에 기재된 분리 및 정제된 박테리아 또는 바이러스 뉴라미니다제로 천연 글리코실화 인터페론을 약산 가수분해하거나 처리함으로써 제거될 수 있다.
Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium, Arthrobacter ureafaciens, 및 Vibrio cholera로부터 얻어진 뉴라미니다제를 포함한 정제 뉴라미니다제는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 쉽게 이용할 수 있다(카탈로그 번호 N 3642, N 5146, N 7771, N 5271, N 6514, N 7885, N 2876, N 2904, N3001,N5631, N 2133, N6021, N 5254, 및 N 4883).
예들 들면, 인간 아시알로 인터페론-β를 생성하기 위하여, 구슬모양의 한천(약 0.22 units)에 부착된 20mg의 불용성 뉴라미니다제를 마이크로원심분리기 튜브 내의 1㎖의 증류수에 서스펜젼되도록 하여 간단히 수화한다. 한천이 원심분리기에 의해 펠렛화되도록 하고 154 mM NaCl 및 9 mM 염화칼슘이 함유된 1㎖의 아세트산염나트륨 완충액(pH 5.5)에 3회 세척하고 겔이 15㎕의 아세트산염나트륨 완충액 내에 재서스펜젼되도록 한다. 예들 들면, 글리코실화된 인간 인터페론-β(3×106IU/vial, 약 0.15mg)가 150㎕의 아세트산염 나트륨 완충액 내에 부유되도록 한다. 그리고 나서 겔 및 인터페론-β를 37℃의 회전형 플랫폼 위에 3시간 동안 혼합 및 배양시켜서 혼합물이 0.2㎛의 필터를 통과하도록 원심분리 여과에 의해 뉴라미니다제로부터 분리될 수 있다. 아시알로 인터페론은 장기간에 걸친 기간 동안 -80℃에서 저장된다.
아시알로 인터페론를 제조하는 추가적인 예시 방법은 1㎖의 5mM 포름산(pH 3.5)에서 한 단위의 Arthrobacter ureafaciens-유도 뉴라미니다제로 자연적인 인간 인터페론-β를 37℃에서 3시간 동안 소화시키는 것을 포함한다.
가수분해에 따르는, 디시알릴레이트(desialylated) 인터페론-β는 0.1%의 트리플루오로아세트산에서 아세토니트릴의 선형 구배를 갖는 C18 역상 칼럼(예들 들면, Zorbax® PR-10) 위에서 분리될 수 있다. 아시알로 인터페론을 생성하는 다른 방법들이 미국 특허번호 제 6,296, 844호(여기에 언급이 통합되어 있다)에 개괄적으로 기재되어 있다.
페길레이트 아시알로 인터페론의 제조(Preparation of Pegylated Asialo-Interferon)
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 중성이며, 수용성이며, 비독성의 폴리머이다(다양한 평균 분자량을 가진 PEG는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 상업적으로 유용하며, 단백질 콘쥬게이션에 따라 변형되는 PEG는 Shearwater Corporation(Huntsville, AL) 또는 Valentis, Inc.(Burlingame, CA.)로부터 상업적으로 구입이능하다. 독성이 없음은 PEG가 FDA사 의해 내복용으로 승인된 얼마 안되는 합성 폴리머 중의 하나이며, 음식 간주물, 화장품, 개인적 보호 제품 및 제약이라는 사실에서 반영된다. 수성 매질에서, 긴 사슬같은 PEG 분자는 수산화가 많이 되며, 그것은 급격한 움직임 상태에 있다. 이러한 급격한 움직임으로 인하여 PEG가 큰 부피를 일소하게 하며("배제부피"(exclusion volume)), 다른 분자의 접근을 막아준다. 아주 실질적인 지각에 있어서, PEG는 생물학적인 계에서 거의 나타나지 아니하며, 결합수 분자의 움직임을 통해서만이 나타난다. 이러한 특성에 따른 하나의 결과는 PEG는 비면역원성이라는 것이다.
폴리펩티드에 대한 폴리머 분자의 공유 결합을 일으키도록 하기 위하여, 폴리머 분자의 하이드록실 말단기는 활성화된 형태로, 이를테면 반응성의 작용기로(예들 들면, 1차 아미노기, 히드라지드(HZ), 티올, 숙신산염(SUC), 숙신산 숙신이미딜(SS), 숙신이미딜 숙신아미드(SSA), 프로피온산 숙신이미딜(SPA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트(SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트(BTC), N-하이드록시숙신이미드(NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트(NPC) 및 트레실레이트(TRES)와 함께) 제공되어야만 한다. 적절한 활성화 폴리머 분자는 예들 들면, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Ala. USA로부터 상업적으로 구입이능하다. 선택적으로, 폴리머 분자는 업계에 알려진 종래의 방법에 의하여 예들 들면, WO 90/13540에 기재된 바에 의하여, 활성화될 수 있다.
본 발명에 사용되는 활성화된 선형 또는 가지형 폴리머 분자의 특별한 예는 the Shearwater Polymers, Inc.의 1997년 및 2000년 카탈로그에 기재되어 있다(Functionalized Biocompatible Polymers for Research 및 pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, 여기에 언급이 통합되어 있다). 활성화된 PEG 폴리머의 특별한 예는 아래의 선형 PEGs를 포함한다: NHS-PEG(예를 들면, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, 및 SCM-PEG) 및 NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG,CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS- PEG, IODO-PEG 및 MAL-PEG, 및 PEG2-NHS와 같은 가지형 PEGs 및 미국 특허번호 제 5,932,462 및 5,643,575호, 여기에 언급이 통합된 양자 모두에 기재된 것들.
아시알로 인터페론에 콘쥬게이트될 수 있는 PEG 유도체의 예들은 아래에 제시된 것들을 포함한다.
(mPEG-프로피온알데히드(mPEG-ALD))
(mPEG-숙신이미딜 프로피오네이드(mPEG-SPA))
(mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA))
(mPEG-말레이미드(mPEG-MAL))
(mPEG-비닐 술폰)
(mPEG-오르소-피리딜-디설피드)
(mPEG2-N-히드록시숙신이미드(mPEG2-NHS))
(mPEG2-말레이미드(mPEG2-MAL))
더욱이, 여기에 언급이 통합된 아래의 공보들은 유용한 폴리머 분자 및/또는 페길레이션(PEGylation) 화학적 작용들이 기재되어 있다: 미국특허번호 제 5,824,778, 5,476,653호, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, 미국특허번호 제 4,902,502, 5,281,698, 5,122,614, 5,219,564호, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, 미국특허 제 5,736, 625, WO 98/05363호, EP 809 996, 미국특허 제 5,629,384호, WO 96/41813, WO 96/07670, 미국특허번호 제 5,473,034, 5,516,673호, EP 605 963, 미국특허번호 제 5,382,657호, EP 510 356, EP 400472, EP 183 503 및 EP 154 316.
폴리펩티드와 활성 폴리머 분자의 콘쥬게이션은 종래의 방법을 이용하여 예들 들면, 아래의 참조문헌(폴리머 분자의 활성화에 대한 적합한 방법이 또한 기재된)에 기재된 바와 같이, 수행된다: Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong,(1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al.,(1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). 이용된 활성화 방법 및/또는 콘쥬게이션 화학은 폴리머의 작용기(예들 들면, 설피드릴에 대한 아미노, 히드록실, 카르복실, 알데히드) 뿐만 아니라 인터페론 폴리펩티드의 부착기에도 의존한다는 것을 통상의 지식을 가진 자는 알 것이다. 페길레이션(PEGylation)는 폴리펩티드 상의 모든 유용한 부착기에 대하여 콘쥬게이션으로 배향될 수 있거나(이를테면, 폴리펩티드의 표면상에 노출된 그러한 부착기), 특수한 부착기 예들 들면, N-말단 아미노기(미국특허번호 제 5,985,265호)에 대하여 배향될 수 있다. 더구나, 콘쥬게이션은 하나의 단계로 또는 한 단계씩 순차적으로 달성될 수 있다(예들 들면, WO 99/55377에 기재된 바와 같이).
아시알로 인터페론과 콘쥬게이트되는 PEGs는 평균분자량 1,000 ~ 5,000, 5,001 ~ 10,000, 10,001 ~ 20,000, 20,001 ~ 35,000, 또는 35,001 ~ 60,000 달톤(예들 들면, 3,350, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000, 20,000, 30,000, 35,000, 40,000, 또는 60,000 달톤)을 갖는 것을 포함한다. 저분자량의 PEGs(예들 들면, 평균분자량 5000달톤을 갖는 것)는 표적 위치 선택에 있어서 상대적으로 비선택적인 바, 이는 상대적으로 적은 PEG는 단백질 표면상에 다른 빈약한 접근가능 지역으로 스며들기 때문이다. 선택적으로, 고분자량의 PEGs가 이길될 수 있다. 그런 고분자량의 PEGs는 60,000달톤 이상의 분자량을 갖는다. 고분자량의 PEGs는 증가된 화학결합 안정성을 제공하며 자리특이성 페길레이션(pegylation)가 요구될 때 유익할 수 있다. 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체는 상대적으로 큰 분자 부피를 갖는다. 따라서, 분지형 PEG 유도체를 사용할 때, PEG 부착에 길한 몇몇 장점들이 많은 지점의 부착없이도 얻어질 수 있다.
시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 포함한 아미노산 서열 내의 많은 다른 잔기에서 아시알로 인터페론은 페길레이션 될 수 있다; C-말단 카르복실; 또는 인터페론의 N-말단 아민에서. 예들 들면, 제거된 N-말단 선도(아미노산 1-23)를 갖는 아시알로 인터페론-α-2b는 아래의 위치 중 하나에서 페길레이션 될 수 있다: 도 2A에 도시된 선이 굵게 표시된 서열인 Cysteine 1, Lysine 23, Lysine31, Lysine 49, Lysine 70, Lysine 83, Lysine 112, Lysine 121, Tyrosine 129, Lysine 131, Lysine 133, Lysine 134, 및 Lysine 164. 본 발명에 따른 아시알로 인터페론은 하나 또는 복수의 위치에서 PEG 폴리머와 콘쥬게이트될 수 있다.
페길레이션 반응은 pH 6.5, 100 mM의 인산나트륨하에서 친전자성 PEG 유도체(SC-PEG) 또는 다른 활성 형태의 PEG로 정제된 아시알로 인터페론을 배양함으로써 수행될 수 있는 바, 그 후 이온교환 크로마토그래피에 의하여 반응생성물을 분리한다. 그러한 이온교환 칼럼은 SP-5PW 강한 양이온 교환 칼럼이다(i.d. 21.5mm, 길이 15cm, 입자크기 13um, Toso Haas, Montgomeryville, PA). 칼럼은 pH 5.8, 10mM의 인산나트륨 완충액에서 평형이 유지될 수 있으며, 페길레이션 생성물은 증가된 비율의 pH 5.8, 80mM의 인산나트륨 완충액을 이용하여 용리될 수 있으며 214nm 파장의 UV 광선을 이용하여 검출될 수 있다. 분리된 생성물을 농축하기 위하여, 10 kDa의 분자 매스 컷오프(molecular mass cutoff)를 갖는 CENTRIPLUS-10 마이크로-농축 칼럼(Amicon, Beverly, MA)이 사용될 수 있다.
선택적으로, pH 9.0의 50mM의 붕산나트륨하에서 아시알로 인터페론과 PEG의 혼합물을 1:3의 몰비로 배양함으로써 아시알로 인터페론은 페길레이션 될 수 있다. 이 혼합물의 최종 단백질 농도는 약 5mg/㎖이다. 그리고 나서 반응혼합물은 4℃에서 2시간 동안 교반되고, 혼합물의 pH를 빙초산으로 4.5로 조절함으로써 반응은 중단된다. 바람직한 반응 생성물을 분리하기 위하여, 혼합물은 10배의 물로 희석되고 혼합물은 Fractogel® EMD CM 650(M) 메타크릴레이트-기저 중합 친수성 크로마토그래피 수지로 충진된 칼럼 위에 사용된다. 상기 수지는 1.3cm/min의 선속도에서 20mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 미리 평형조절된 것이다. 단백질은 2mg/㎖ 농도의 칼럼상에 채워질 수 있다. 칼럼은 과다한 PEG 시약 및 반응 부산물을 제거하기 위하여 평형 완충액으로 세척될 수 있다. 바람직한 페길레이션 아시알로 인터페론은 평형 완충액하에서 200mM 염화나트륨을 갖는 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 정제된 페길레이션 생성물은 더욱 농축되어 4℃의 20mM 아세트산 나트륨(pH 5.0) 및 150mM 염화나트륨을 함유하는 살균 완충액 내에 저장된다.
더욱이, 칼럼의 적절한 흐름 속도에서(예들 들면, 21.5mm i.d. 칼럼에 대한 6mL/min 및 7.5mm i.d. 칼럼에 대한 1mL/min), SP-5PW 강한 양이온 교환수지(예들 들면, Toso Haas, 21.5mm i.d., 길이 15cm, 입자크기 13㎛, 또는 7.5mm i.d., 길이 75mm, 입자크기 10㎛)가 설치된 Waters Delta Prep 3000 preparative HPLC system(Analytical Sales and Service, Mahwah, NJ)을 이용하여 위치 이성질체는 구별될 수 있다.
이들 칼럼은 0~100%의 인산칼륨, 이염기(pH 6.4)로부터 증가된 인산나트륨 농도(pH 5.8)의 선 기울기 또는 선 오름 pH 기울기(a linear ascending pH gradient)(4.3~6.4)로 움직일 수 있다. 위치 이성질체는 214nm 또는 280nm 파장의 UV 광선을 이용하여 검출될 수 있다.
다른 변형된 아시알로 인터페론의 제조(Preparation of Other Modified Asialo-Interferons)
상기 언급한 페길레이션된 아시알로 인터페론에 더하여, 다른 수용성 폴리머도 아시알로 인터페론에 또한 콘쥬게이트될 수 있다. 더욱이, 단일 인터페론은 한 가지 형태 이상의 수용성 폴리머에 의하여 변형될 수 있다. 예들 들면, 인터페론은 PEG 및 PVP 폴리머와 콘쥬게이트될 수 있다. 적합한 수용성 폴리머의 예는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG)와 같은 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG), 및 폴리(옥시에틸레이티드 소비톨), 폴리(옥시에틸레이티드 글리세롤) 및 폴리(옥시에틸레이티드 글루코스)와 같은 폴리(옥시에틸레이티드 폴리올)을 포함한다. 그러한 폴리머는 예들 들면, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 상업적으로 구입 가능하다. 더구나, 수용성 폴리머는 아시알로 인터페론과 콘쥬게이트되기 전에 활성화될 수 있다.
단백질 콘쥬게이트 이전에 폴리머를 활성화시키는 기술이 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 언급된 mPEG 유도체는 PEG의 형태로 활성화된다. 히드록실기의 활성화는 트리클로로-s-트리아진(TsT; 시아누르산)을 이용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 히드록실기는 아민 반응성 N-히드록실 숙신이미딜- 또는 p-니트로페닐 카르보네이트 활성 에스테르의 형성을 통하여 활성화될 수 있다(예들 들면, Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 15:100-114, 1992). 또한, 히드록실-함유 폴리머가 고리형 무수물(예들 들면, 숙신 무수물 또는 글루타르 무수물)과 첫번째 반응하고, 뒤이어 이 반응의 카르복실 변형 생성물이 카르보디이미드의 존재하의 N-히드록실 숙신이미드와 커플링이 일어날 때, 활성화가 수행될 수 있다. 이 반응으로 인하여 숙신이미딜 숙신산염 또는 글루타르산염-타입 활성 에스테르가 야기된다(Abuchowski et al., CancerBiochem. Biophys. 7:175-186, 1984). 폴리머와 N,N'-카르보닐디이미다졸(CDI)의 반응으로 인한 아미다졸릴 카르바메이트 중간체의 형성을 통하여 활성화가 또한 수행될 수 있다. CDI-활성 폴리머는 단백질의 아민기와 반응하여 숙신이미딜 카르보네이트 화학작용을 이용하여 형성된 것과 동일한 안정된 N-알킬 카르바메이트 결합을 형성한다(Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131:25-33, 1983).
여기에 기재된 어떤 폴리머도 아시알로 인터페론과 콘쥬게이트될 수 있다. 일반적으로 선행 활성화를 가지든 가지지 않든, 아시알로 인터페론에 존재하는 펜던트 기(pendant groups) 또는 화학적 변형 또는 다른 표준 방법들을 이용하여 아시알로 인터페론에 부가되는 펜던트 기를 통하여, 폴리머는 단백질에 공유적으로 결합될 수 있다. 그러한 펜던트 기의 예는 1차 아미노기, 카르복실기, 방향족 고리, 및 티올기를 포함한다. 폴리머와 아시알로 인터페론의 결합에 관한 바람직한 기는 예들 들면, 단백질에 존재하는 리신 잔기 속의 유리 아미노기(free amino groups) 및 N-말단 아미노산의 α-아미노기를 포함한다.
콘쥬게이트 반응을 수행함에 있어 사용되는 단백질에 대한 폴리머의 비율은 폴리머가 결합되는 소단위의 특성 뿐만 아니라 폴리머의 특징(예를 들면, 구조, 크기, 하전량(charge) 및 반응성)에도 의존한다. 이 비율을 결정하는 것은 반복적인 실험에 관한 문제이며, 예를 들면, 비율의 다양화 및 생물학적 활성도(예를 들면, 다음 섹션에 기재된 바와 같은 항증식 또는 항바이러스 활성도) 및 반응 생성물의 콘쥬게이트 안정성의 측정을 들 수 있다.
변형된 아시알로-인터페론의 생물학적 활성 분석
페길레이트된 아시알로-인터페론과 같이, 변형 아시알로-인터페론의 항바이러스성 및 항증식 활성을 분석하기 위하여 본 기술 분야의 다수의 표준 방법들이 사용될 수도 있다(예를 들면, Monkarsh 등의 「Analytical Biochemistry 247: 434-440,1997」 및 Bailon 등의 「Bioconjugate Chem. 12: 195- 202,2001」에 개시된 방법들). 예를 들면, 다양한 변형 아시알로-인터페론 이소머의 항바이러스 활성이 Grace 등의 「J.of Interferon and Cytokine Research 21: 1103-1115,2001)」에 개시된 마이크로타이터 플레이트 분석에서 결정될 수도 있다. 그러한 분석에서, Mardin-Darby 우(牛) 신장 세포 또는 인간 포피(包皮) 섬유모세포와 같이 바이러스에 감염되기 쉬운 포유동물 세포는 예를 들면, 물집입안염 바이러스 또는 뇌심장근육염 바이러스와 같은 바이러스에 감염된다. 그 뒤 변형 아시알로-인터페론의 상대적인 효능이 대조군 인터페론으로 감염된 세포 (예를 들면, 인터페론-a2a, 아시알로-인터페론, 또는 참고 페길레이트된 아시알로-인터페론)에 대한 세포병변효과에서 50% 보호를 나타내는 시험 변형 아시알로-인터페론의 도스를 비교함으로써 결정될 수 있다..
뿐만 아니라, 변형 아시알로-인터페론의 항종양 활성 분석을 위하여 항-동물 모델이 사용될 수도 있다. 예를 들면, 누드마우스(가슴샘없는쥐: athymic nude mice)가 인간 콩팥 A498 또는 인간 콩팥 ACHN 세포와 같은 암세포주로 이식될 수도 있다. 구체적으로, 2×106 세포들이 마우스의 옆구리 아래쪽에서 피하로 이식될 수도 있다. 그 뒤 약 0.05 내지 0.05 입방 센티미터 크기의 종양을 구축하기 위해 3 내지 6주 동안 세포를 방치한다. 마우스는 적어도 주 1회 변형 아시알로-인터페론의 시험 도스로 처리될 수 있다. 처리가 4 내지 5주 지속될 수도 있다.
처리 후에, 처리군과 예를 들면, 인터페론-α2a를 받은 군 또는 인터페론-β1a를 받은 군과 같은 대조군 사이의 종양 크기를 비교하고, 동일한 방법으로 변혀아시알로 인터페론의 상대적인 항-종양 활성을 평가한다.
한편, 변형 아시알로 인터페론의 항-증식 활성은 세포 배양 분석을 이용하여 측정될 수도 있다. 예를 들면, 15% 우태아 혈청 및 2mM의 글루타민(Grand Island Biologicals, Grand Island, NY으로부터 모두 입수 가능.)으로 보충된 RMPI 1640 내의 정지된 현탁액에서 보관된 배지 인간 Daudi 세포가 이러한 분석에 사용될 수도 있다. 2×104 세포들은 100㎕의 배지 내에서 마이크로타이터 플레이트(Costar, MA)의 각 웰에 첨가될 수도 있다. 그 뒤 플레이트는 72시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양될 수도 있다. 수확 16시간 이전에, 세포들에 대하여 웰당 0.25 mCi의 [3H] 티미딘으로 펄스를 가할 수도 있다(New England Nuclear, Boston, MA). 상기 세포들은 유리 필터 상에 수집되어 액상 섬광계수기에 의해 계수될 수도 있다. 변형 아시알로-인터페론 및 대조군 인터페론으로 처리된 세포들로부터 수득된 결과는 상대적인 항증식, 따라서 특정 변형 아시알로 인터페론의 항종양 활성을 결정하기 위하여 비교될 수 있다. Grace 등의 「J. Interferon Cytokine Res.21: 1103-1115, 2001」 및 Bailon 등의 「Bioconjugate Chem. 12: 195-202,2001」에 개시된 NK(natural killer) 세포 및 림포카인 활성 세포독성 세포 분석뿐만 아니라, 2'-5' 올리고데닐레이트 합성효소 활성, 혈청 네오프테린(neopterin) 농도, β2-소글로불린 발현과 같은 다른 생물학적 활성이 시험군 및 대조군 세포들 사이에서 비교될 수도 있다.
변형 아시알로 인터페론의 약물동력학 및 생물학적분포
변형 아시알로 인터페론은 본 기술 분야에 알려진 방법에 의해 그 약물동력학 및 약역학 특성들로 특징될 수도 있다. Cmax, Tmax, t1/2, AUC(0~∞), 및 제거 속도(clearance rate)와 같은 약물동력학 파라미터들이 분석될 수도 있다. 뿐만 아니라, 바이러스 세포독성 효과의 약역학 결정은 혈청의 변형 아시알로 인터페론 농도와 관련이 있을 수도 있다. 그러한 방법들의 예들은, 예를 들면 Pepinsky 등의 「J. Pharmacol. Exp. Ther. 297: 1059-1066, 2001」 및 Bailon 등의 「Bioconjugate Chem. 12: 195-202,2001」의 문헌에 개시되어 있다. 더욱이, 간에 대한 표적화를 확인하기 위해 방사성 표지된 아시알로 인터페론의 조직 분포가 평가될 수도 있다.
투약량(Dosage)
본 발명의 치료 방법과 관련하여, 환자에 대한 변형 아시알로 인터페론의 투여가 특정 형태의 투여 방식, 투약량 또는 투약 빈도에 제한되는 것은 아니며, 근육내, 정맥내, 복강내, 폐포내, 관절내, 병변내, 피하내 또는 바이러스의 복제 또는 전염을 예방하기 위한 종양 세포의 수를 감소시키기 위한 적합한 도스를 제공하기에 충분한 임의의 경로들이 고려될 수도 있다. 화합물은 환자에게 단일 도스 또는 다수의 도스로 투여될 수도 있다. 다수의 도스로 투여되는 경우에, 예를 들어, 도스는 서로 1일, 2일, 1주, 2주, 또는 1개월 간격으로 분리되어 투여될 수도 있다. 예를 들면, 페길레이트된 아시알로 인터페론은 예를 들면 1주, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20주 또는 그 이상에 한번씩 투여될 수도 있다. 임의의 특정 대상에 대한 특이적인 투략 요법은 개별적인 필요 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 전문적인 판단에 따라 조정되어야 함이 이해된다. 만일 보다 낮은 투약량이 충분한 항종양 또는 항바이러스 활성을 제공하지 못한다면, 예를 들어 변형 아시알로 인터페론의 투약량은 증가될 수 있다. 역으로, 종양 또는 바이러스 감염이 환자로부터 완전히 제거된다면 변형 아시알로 인터페론의 투약량은 감소될 수 있다.
주치의가 최종적으로 적절한 양 및 투약 요법을 결정할 때, 페길레이트된 또는 피브이필레이트 아시알로 인터페론과 같은 변형 아시알로 인터페론의 치료 유효량은 예를 들면, 약 0.0035㎍ 내지 20㎍/kg 체중/일의 범위 또는 0.010㎍ 내지 140㎍/kg 체중/주의 범위일 수 있다. 바람직하게, 치료 유효량은 예를 들면 0.025㎍ 내지 10㎍/kg의 범위, 예를 들면 매일, 이틀에 한번, 또는 일주에 두번씩 0.025, 0.035, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 또는 9.0㎍/kg 체중의 양이다. 뿐만 아니라, 치료 유효량은 약 0.05, 0.7, 0.15, 0.2, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 또는 18.0㎍/kg으로 매주, 2주에 한번, 또는 한달에 한번 투여될 수도 있다. 나아가, 치료 유효량의 변형 아시알로 인터페론은 예를 들면 매일, 매주 1회, 또는 2주당 1회씩 약 100㎍/m2 내지 100,000㎍/m2의 범위일 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 치료 유효량은 약 1000㎍/m2 내지 20,000㎍/m2의 범위, 예를 들면 1000, 1500, 4000, 또는 14,000㎍/m2의 변형 아시알로 인터페론을 매일, 이틀에 한 번, 주 2회, 주 1회, 또는 2주에 1회 투여할 수도 있다.
제약학적 조성물의 조성
변형 아시알로 인터페론 화합물(예를 들면, 페길레이트 또는 피브필화 아시알로 인터페론)의 투여는, 다른 성분들과 함께 변형 아시알로 인터페론의 농도가 표적 부위에 도달했을 때 항바이러스 또는 항종양 특성을 가질 수 있는 농도가 되도록 하는 임의의 적합한 수단에 의해 이루어질 수도 있다. 화합물은 임의의 적합한 담체 물질 내에서 임의의 적절한 양으로 포함될 수도 있는데, 일반적으로 조성물의 전체 중량의 1-95%의 양이다. 상기 조성물은 비경구(예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내) 투여 경로에 적합한 투약 형태로 제공될 수도 있다. 제약학적 조성물은 통상의 제약학적 절차(예를 들면, 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000」 및 「Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J.Swarbrick」 및 「J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York」참조.)에 따라 제형화될 수도 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 투여 즉시 활성 화합물을 방출하거나 투여 이후에 임의의 정해진 시간 또는 시간 간격으로 방출되도록 제형화될 수도 있다. 후자의 조성물 형태는 일반적으로 조절 방출 제형이라고 알려져 있는 것으로, (i) 정해진 시간 전체에 걸쳐 체내에서 변형 아시알로 인터페론의 실질적인 일정 농도를 생산할 수 있는 제형; (ii) 정해진 휴지기 이후에 연장된 시간 전체에 걸쳐 체내에서 변형 아시알로 인터페론의 실질적인 일정 농도를 생산할 수 있는 제형; (iii) 활성 변형 아시알로 인터페론 물질(sawtooth kinetic pattern)의 플라즈마 내 농도에서의 기복(fluctuation)과 과련된 바람직하지 않은 부작용이 최소화된 일정하고, 유효한 체내 아시알로 인터페론 농도를 지속시킴으로써 정해진 시간 내에 변형 아시알로 인터페론 작용을 유지하는 제형; (iv) 예를 들면, 질병이 있는 조직 또는 기관에 인접하거나 또는 그 내부에 조절 방출 조성물을 공간 배치함으로써 위치화시키는 제형; (v) 예를 들면, 1주에 1회 또는 2주에 1회 조성물을 투여하는 것과 같은 투약 편의성을 달성하기 위한 제형; 및 (vi) 특정 표적 세포 타입에 변형 아시알로 인터페론을 운반하기 위한 담체 또는 화학적 유도체를 사용함으로써 변형 아시알로 인터페론 작용을 표적화하는 제형을 포함한다. 조절 방출 제형의 변형 아시알로 인터페론 화합물의 투여는 특히 위장관 내의 좁은 흡수창을 갖거나 또는 상대적으로 짧은 생물학적 반감기를 갖는 변형 아시알로 인터페론에 적합하다.
현안이 되는 화합물의 대사 속도에 앞서는 방출 속도를 갖는 조절 방출을 달성하기 위해 다수의 전략 중 임의의 것이 수행될 수 있다. 한 실시예에서, 예를 들면 다양한 형태의 조절 방출 조성물 및 코팅을 포함하는 다양한 제형 파라미터 및 성분의 적절한 선택에 의해 조절 방출이 달성된다. 따라서, 변형 아시알로 인터페론은 제약학적 조성물에 들어가는 적합한 부형제와 함께 제형화되어 투약 직후 조절된 방식으로 변형 아시알로 인터페론을 방출한다. 그 예로서는 단일 또는 다수의 단위 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 서스펜젼, 에멀젼, 마이크로캡슐, 분자 복합체, 마이크로구, 나노입자, 패치, 및 리포좀이 포함된다.
비경구용 조성물
상기 제약학적 조성물은 통상의 무독성의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬번트를 포함한 투약 형태, 제형 또는 적절한 운반 장치 또는 임플란트에 의해 주사, 주입, 또는 이식(피하, 정맥내, 근육내, 또는 그 유사경로)와 같은 비경구적 경로로 투여될 수도 있다. 그러한 조성물의 제형 및 제조는 제약학적 제형과 관련한 기술 분야에 잘 알려져 있다. 제형은 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra.」에서 찾을 수 있다. 비경구용 조성물은 단일 투약 형태(예를 들면, 단일 도스 앰플), 또는 적절한 보존제(하기 참조)를 포함하는 몇몇 도스를 포함하는 바이알의 형태로 제공될 수도 있다. 상기 조성물은 용액, 서스펜젼, 에멀젼, 융합 장치 또는 이식을 위한 운반 장치의 형태일 수도 있거나, 또는 물 또는 다른 적합한 담체로 사용 전에 재구성될 수 있는 건조 분말 상태로 존재할 수도 있다. 활성 변형 아시알로 인터페론와 별도로, 상기 조성물은 적절한 비경구로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함할 수도 있다. 활성 아시알로 인터페론은 조절 방출을 위해 마이크로구, 마이크로캡슐, 나노미터, 리포좀, 또는 그 유사체에 삽입될 수도 있다. 나아가, 상기 조성물은 서스펜젼제, 용해제, 안정제, pH 조절제, 강직성 조절제, 및/또는 분산제를 포함할 수도 있다.
상기에 나타난 것처럼, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 멸균 주입에 적합한 적절한 형태일 수도 있다. 그러한 조성물을 제조하기 위해, 적절한 활성 변형 아시알로 인터페론이 비경구적으로 허용가능한 액상 비히클 내에 용해되거나 또는 서스펜젼화된다. 허용가능한 비히클 및 용매로서 물, 적합한 양의 염산 첨가로 pH 조정된 물, 나트륨 하이드록사이드, 또는 적절한 완충액, 1,3-부탄디올, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 등장 식염수가 채택될 수도 있다. 수용성 제형은 또한 1이상의 보존제(예를 들면, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤젠)가 포함될 수도 있다. 1종의 화합물이 거의 용해되지 않거나 일부만 물에 용해가능한 경우, 용해 상승제 또는 용해제를 첨가하거나, 또는 용매에 60% w/w의 프로필렌 글라이콜 또는 그 유사체를 포함할 수도 있다.
조절 방출 비경구용 조성물
조절 방출 비경구용 조성물은 액상 서스펜젼, 마이크로구, 마이크로캡슐, 자기 마이크로구, 오일 용액, 오일 서스펜젼, 또는 에멀젼의 형태일 수도 있다. 한편, 활성 변형 아시알로 인터페론이 생체친화적인 담체, 리포좀, 나노입자 또는 주입 장치에 포함될 수도 있다.
마이크로구 및/또는 마이크로구를 제조하는데 사용되는 재료는 예를 들면, 폴리갈락틴, 폴리-(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(2-하이드록시에틸 L-글루타민), 폴리(락트산), 폴리글리콜산, 및 이들의 혼합물과 같은 생분해성/생물학적 침식가능한 고분자이다.
조절 방출 비경구용 제재의 제형시에 사용될 수도 있는 생체적합한 담체는 탄수화물(예를 들면, 덱스트란), 단백질(예를 들면, 알부민), 리포프로테인, 또는 항체이다. 임플란트에 사용되는 재료는 비생분해성(예를 들면, 폴리디메틸 실록산) 또는 생분해성(예를 들면, 폴리(카프로락톤)), 폴리(락트산), 폴리(글리코산) 또는 폴리(오르소 에스테르) 또는 이들의 조합이다.
경구용 고체 투약 제형
경구용 제형으로는 비독성의 제약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 혼합된 활성 성분을 갖는 정제가 포함되고, 그러한 제형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 미국특허 Nos.: 5,817,307, 5,824,300, 5,830,456, 5,846,526, 5,882,640, 5,910,304, 6,036,949, 6,036,949, 6,372,218, 본원에 참조로 포함).
이들 부형제는 예를 들면, 불활성 희석제 또는 충진제(예를 들면, 슈크로즈, 소르비톨, 당, 만니톨, 미세결정성 셀룰로오스, 감자 녹말을 포함한 녹말, 칼슘 카보네이트, 소디움클로라이드, 락토스, 칼슘 포스페이트, 또는 소디움 포스페이트); 입자화 및 분해제(예를 들면, 미세결정성 셀룰로오스, 감자 녹말을 포함한 녹말, 크로카멜로스 소디움, 알지네이트 또는 아르긴산을 포함하는 셀룰로오즈 유도체);바인딩제(예를 들면, 슈크로즈, 글루코즈, 소르비톨, 아카시아, 아르긴산, 소디움 알지네이트, 젤라틴, 녹말, 선젤라틴화된 녹말, 미세결정성 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 카르복실메틸셀룰로스 소디움, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 광택제, 글리던트(glidants), 및 항점착제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 징크 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수화된 식물성 오일, 또는 탈크)를 들 수 있다. 다른 제약학적으로 허용가능한 부형제는 착색제, 가소체, 습윤제, 완충제, 및 이들과 유사한 것일 수 있다.
상기 정제는 코팅되지 않거나 또는 선택적으로 장관내의 분해 및 흡수를 지연시켜서 장시간의 지속적인 작용을 제공하기 위한 알져진 기술들에 의해 코팅될 수도 있다. 코팅은 정해진 패턴(예를 들면, 조절 방출 제형)으로 활성 변형 아시알로 인터페론 물질을 방출하기 위해 채택되거나 또는 위를 통과한 이후까지 활성 변형 아시알로 인터페론 물질을 방출하도록 채택(장용 피복)될 수도 있다. 상기 코팅은 당 코팅, 필름 코팅(예를 들면, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 메틸 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아크릴레이트 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리비닐피롤리돈에 기초함), 또는 장용 피복(예를 들면, 메타크릴산 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙신산염, 폴립닐 아세테이트 프탈레이트, 쉘락(shellac), 및/또는 에틸셀룰로오스)일 수도 있다. 나아가, 예를 들면 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수도 있다.
고체 정제 조성물은 원하지 않는 화학 변화(예를 들면, 활성 변형 아시알로 인터페론 물질의 방출 전에 일어나는 화학적 분해)로부터 조성물을 보호하기 위해 채택될 수도 있다. 코팅은 「Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra. 」에 개시된 것과 유사한 방식으로 고체 투약 형태로 채택될 수도 있다.
두 개의 변형 아시알로 인터페론들은 함께 정제내에서 혼합되거나, 구획될 수도 있다. 예를 들면, 제 1 변형 아시알로 인터페론은 정제 내부에 포함되고, 제 2 변형 아시알로 인터페론은 정제 밖에 포함되어, 제 2 변형 아시알로 인터페론의 실질적인 부분은 제 1 변형 아시알로 인터페론의 방출 이전에 방출된다.
경구용 제형은 또한 씹을 수 있는 정제이거나, 활성 성분이 불활성 고형 희석제(예를 들면, 감자 녹말, 락토스, 미세결정성 셀룰로오스, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린)와 혼합된 고형 젤라틴 캡슐이거나, 활성 성분이 예를 들면, 피넛 오일, 액상 파라핀, 또는 올리브 오일과 같은 물 또는 오일 배지와 혼합된 연성 젤라틴일 수도 있다. 통상의 정제 및 캡슐을 만드는 방식 하에서 예를 들면 믹서, 유체 베드 기구, 또는 스프레이 건조 장치를 이용하여 분말 및 입자를 제조할 수도 있다.
조절 방출 경구용 투약 형태
경구용 조절 방출 조성물은 활성 변형 아시알로 인터페론 물질의 용해 및/또는 분산을 조절함으로써 예를 들면, 활성 변형 아시알로 인터페론을 방출하기 위해 구축될 수도 있다.
용해 또는 분산 조절 방출은 정제, 캡슐, 펠렛, 또는 화합물의 입자 제형의 적절한 코팅에 의해 달성되거나 적합한 매트릭스에 화합물을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 조절 방출 코팅은 1이상의 상기 언급한 코팅 물질 및/또는 예를 들면, 쉘락, 밀랍, 글라이코 왁스, 카스토르 왁스, 카르나우바 왁스, 스테아릴 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 에틸셀룰로오스, 아크릴 수지, dl-폴리락트산, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌, 폴리메타클릴레이트, 2-하이드록시메타크릴레이트, 메타크릴레이트 하이드로겔, 1,2-부틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 의해 달성될 수 있다. 조절 방출 매트릭스 제형에서, 매트릭스 물질은 또한 예를 들면, 수화 메틸셀룰로오스, 카르나우바 왁스 및 스테아릴 알코올, 카르보폴 934, 실리콘, 글리세릴 트리스테아레이트, 메틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌 및/또는 수화된 플루오로카본일 수도 있다.
1이상의 청구될 조합의 화합물을 포함하는 조절 방출 조성물은 부양성 있는 정제 또는 캡슐(즉, 경구 투여 후에 특정 기간 동안 위장내 내용물 상부에 떠있음)의 형태일 수도 있다. 상기 화합물의 부양성 있는 정제 제형은 변형 아시알로 인터페론과 부형제의 혼합물, 및 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 20-75% w/w의 하이드로콜로이드를 입자화함으로써 제조될 수 있다. 그 뒤 수득된 입자는 정제로 압축된다. 위장 액과 접촉하였을 때, 정제는 실질적으로 그 표면 주위의 물-투과성 겔 배리어를 형성한다. 이 겔 배리어는 1이하의 밀도를 유지하도록 함으로써 정제가 위액에서 부유하면서 남아 있도록 한다.
다른 구현예들
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 본원에 참조로 포함되는 것으로 지시되었던 바와 같이, 본원에 참조로 포함된다. 앞선 발명들이 이해를 명확히 하기 위한 목적으로 도시 및 예를 드는 방식으로 상세하게 기술되어 있음에도 불구하고, 청구항의 정신 및 범위에서 벗어나지 않도록 변화 및 개조될 수도 있음이 본 발명의 관점에서본 기술 분야의 당업자에게 보다 명확할 것이다.

Claims (29)

  1. 평균 분자량이 대략 1,000 내지 60,000인 수용성 고분자와 컨쥬게이트된 아시알로 인터페론을 포함하는 변형 아시알로 인터페론.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 수용성 고분자가 약 10,000 내지 20,000의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론은 페길레이트 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페길레이트 아시알로 인터페론은 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파틱산 또는 글루탐산 잔기; C-말단 카르복실기; 또는 N-말단 아민에서 페길레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페길레이트 아시알로 인터페론은 시스테인 잔기에서 페길레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페길레이트 아시알로 인터페론은 리신 잔기에서 페길레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론은 피브이필레이트 아시알로 인터페론(a pvpylated asialo-interferon)인 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 피브이필레이트 아시알로 인터페론은 시스테인, 리신, 세린, 트레오닌, 타이로신, 아스파트산, 또는 글루탐산 잔기; C-말단 카르복실기; 또는 N-말단 아민에서 피브이필레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 아시알로 인터페론은 시스테인 잔기에서 피브이필레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 피브이필레이트 아시알로 인터페론은 리신 잔기에서 피브이필레이트된 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론은 아시알로 인터페론-α, 아시알로 인터페론-β, 또는 아시알로 인터페론-γ를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 아시알로 인터페론은 인간의 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아시알로 인터페론의 폴리펩티드 서열은 성숙 인터페론 폴리펩티드(mature interferon polypeptide)의 서열과 비교할 때 추가적인 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 시스테인이 상기 성숙 인터페론 폴립펩티드의 트레오닌 또는 세린 잔기를 대신하는 것을 특징으로 하는 변형 아시알로 인터페론.
  15. 상기 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 변형 아시알로 인터페론, 및 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 수용성 고분자가 약 1,000 내지 60,000 돌턴(daltons)의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 수용성 고분자가 약 10,000 내지 20,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 페길레이트 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  19. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 피브이필레이트된 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  20. 제 15항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 아시알로 인터페론-α, 아시알로 인터페론-β, 또는 아시알로 인터페론-γ을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  21. 제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 인간의 변형 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  22. 약 1,000 내지 60,000 돌턴의 평균 분자량을 갖는 수용성 고분자와 콘쥬게이트된 포유류의 아시알로 인터페론을 포함하는 제약학적 조성물을 치료 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 간(肝)장 질환 환자으 치료 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 페길레이트 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론이 페길레이트 아시알로 인터페로인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간(肝)장 질환이 바이러스성 간염, 간암, 또는 간의 섬유증(症)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  26. 제 22항 내지 제 24항에 있어서, 상기 환자는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의해 간염된 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  27. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간장 질환은 광범위 간세포암종(diffuse-type hepatocellular carcinoma), 열성 간세포암종(febrile-type hepatocellular carcinoma), 담즙정체 간세포암종(cholestatic hepatocellular carcinoma), 간모세포종(肝母細胞腫)(hepatoblastoma), 유사간 샘암종(hepatoid adenocarcinoma), 또는 국소 결절과다형성(focal nodular hyperplasia)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  28. 제 22항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 아시알로 인터페론은 아시알로 인터페론-α, 아시알로 인터페론-β, 또는 아시알로 인터페론-γ를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  29. 제 22항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아시알로 인터페론이 인간의 아시알로 인터페론인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
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