EA020220B1 - Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с полипептидом, имеющим активность интерферона-гамма - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с полипептидами, имеющими биологическую активность интерферона-гамма (IFN-γ), формулы (I)где n - целое число в интервале от 100 до 1200, А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина, РР - полипептид с активностью IFN-γ, и способа его получения. Изобретение позволяет расширить арсенал лекарственных средств, увеличив при этом длительность циркуляции активного вещества в крови с сохранением значительной части биологической активности немодифицированного полипептида.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с полипептидами, имеющими биологическую активность интерферона-гамма (ΙΕΝ-γ), в котором полимер присоединён к полипептиду посредством азогруппы.

Сведения о предшествующем уровне техники

Интерферон-гамма (ΙΕΝ-γ) является димеризованным растворимым цитокином с молекулярной массой около 17 кДа и единственным представителем интерферонов II типа [Сгау Р.^., Сосййс1 Ό.ν. 81гис1иге о! (Нс Питан 1ттиие йКсгГсгоп депе. №1(игс. νοί. 298 (5877) (Аидиз1 1982). Р. 859-863]. В отличие от интерферона-α и интерферона-β, которые могут экспрессироваться всеми клетками, ΙΕΝ-γ производится только ТН1-, Т- и ΝΚ-клетками.

ΙΕΝ-γ необходим для врожденного и адаптивного иммунитета к вирусным и внутриклеточным бактериальным инфекциям, а также для контроля опухолей. Роль ΙΕΝ-γ в иммунной системе состоит, в частности, в его способности ограниченно подавлять репликацию вируса как таковую. Но основными активностями ΙΕΝ-γ являются иммуностимулирующая и иммуномодулирующая активности [8сНоеиЬот 1.К., ^йзои С.В. Кеди1айоп оГ йКегГегоп-датта йиппд шиа(е аий айарйуе 1ттипе гезропзез. Λάν. Iттиηο1. ^1. 96 (2007). Р. 41-101]. Аберрантная экспрессия ΙΕΝ-γ связана с рядом воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

Интерферон-гамма применяют для лечения хронических гранулематозных заболеваний [Тойй Р.А., Соа К.Ь. ШегГегоп датта-1Ь. А ге\'1е\\· оГ Из рНагтасо1оду апй 1Негареийс ро!епйа1 ίη сНгошс дгапи1ота1оиз Шзеазе. Бгидз. ^1. 43(1) (Гапиагу 1992). Рр. 111-122], остеопороза [Кеу Ь.Ь., К1ез \ν.Ε. Койпдтх К.М., На1сНег Н.С. КесотЬтагК Нитап йКегГегоп датта (Негару Гог оз(еоре(гоз1з. 1. РеШа(г. ^1. 121(1) (Му 1992). Р. 119].

В комплексной терапии хронических вирусных гепатитов В и С, ВИЧ/СПИД-инфекции, туберкулеза, онкологических заболевания, урогенитального хламидиоза и генитальной герпес-вирусной инфекции применяют препарат Ингарон (производитель - НШ1 Фармаклон, РФ), который представляет собой лиофилизат рекомбинантного интерферона-гамма человека с молекулярной массой 16,9 кДа, состоящего из 144 аминокислотных остатков, в начале последовательности которых первые три Суз-Туг-Суз заменены на Ме1. Препарат получен микробиологическим синтезом в рекомбинантном штамме ЕзсНейсЫа сой и очищен колоночной хроматографией.

Тем не менее, применение препаратов ΙΕΝ-γ в медицине ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является недостаточная энзиматическая стабильность в организме |Сап(е11 К. е( а1. РНагшасокшейс зШШез \νί(1ι Нитап апй га! йКегГегопз т ййТегеЩ зрешез. 1. !п(егГегоп Кез. ^1.6 (1986). Р.671-675; БоЬеН Н., Сеп(з К., 1искег V., Сагойа С., Найтапп Ό.ν., НосНиН Е. Ко1е оГ (Не сагЬоху(егтта1 зецпепсе оГ (Не Ью1одюа1 ас(^ν^(у оГ Нитап 1ттипе 1п(егГегоп. 1. Бю1есНпо1. ^1.7 (1988). Р.199216; КШепП'ап/ Ι., Ваиег А., КпсНпег Н. РНагтасокгпейс з(пйу оГ Нрозоте-епсарзи1а(ей Нитап т1егГегопдатта айег т(га\'епоиз апй тйатизси1аг т]ес(юп ш писе. 1. ШегГегоп Кез. ^1. 10(3) (1ипе 1990). Р.337341], которая приводит к необходимости увеличения дозы и частоты введения препарата, что, в ряде случаев, сопряжено с побочными эффектами, например, аллергией. Так, например, препарат Ингарон вводятся ежедневно или через день. В связи с этим возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы интерферона-гамма с целью преодоления указанных недостатков.

Одним из путей является изменение аминокислотной последовательности и получение более стабильных полипептидов с активностью ΙΕΝ-γ. В патенте КИ 2326944 (опубл. 20.06.2008) предложен рекомбинантный аналог ΙΕΝ-γ человека - дельтаферон с молекулярной массой 16,2 кДа, который имеет делецию 10 аминокислотных остатков на С-конце молекулы и замену кластера КККК на КС8А по сравнению с природным ΙΕΝ-γ. В результате данной модификации у молекулы-аналога ΙΕΝ-γ (дельтаферона) появилась устойчивость к протеолизу.

В другом случае для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой [Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и перспективы, в сборнике Вирусные гепатиты: достижения перспективы. №3 (13) (2001). С. 3-8].

Как правило, в ковалентных конъюгатах полимерный фрагмент присоединен к полипептиду через одну из свободных аминогрупп последнего [Ко/1о^зк1 А., СНаг1ез 8.А., Натз ЕМ. Оете1ортеп( оГ Реду1а(ей Iη(е^Те^οηз Гог (Не Тгеа(теп( оГ СНгошс Нераййз С. ВюБгидз.; ^1. 15(7) (2001). Р. 419-429].

В патенте И8 5109120 (опубл. 28.04.1992) предложен конъюгат рекомбинантного ΙΝΕ-γ, в котором полиэтиленгликолевый фрагмент присоединен к полипептиду через Ν-терминальную аминогруппу или концевую аминогруппу одного из фрагментов лизина.

Такие препараты представляют собой смеси позиционных изомеров, химическая структура которых отличается местом присоединения полимера к полипептиду. Теоретически число позиционных изомеров в данном случае равно количеству свободных аминогрупп в полипептиде [Блохин Н.П., Никитин И.Г. Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа)

- 1 020220

Пегасис: новые возможности терапии хронического гепатита С в сборнике Материалы VII Российской конференции Гепатология сегодня. РЖГГК. 2002. С. 6.].

Известно, что позиционные изомеры полипептидов имеют различную биологическую активность (И8 2004/0223950, опубл. 11.11.2004). Это создаёт предпосылки для расширения арсенала таких средств за счёт различных вариантов модифицирования молекул протеинов. Например, изменение положений и способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипепти дов.

В патенте И8 6958388 (опубл. 25.10.2005) и международной заявке АО 2002/081507 (опубл. 17.10.2002) раскрыты полипептидные варианты интерферона-гамма, имеющие способность связываться с рецептором ΙΡΝΟ, содержащие от 1 до 10 модификаций его аминокислот, предпочтительно - введение звена цистеина, ковалентно присоединённого к неполипептидному фрагменту, которым является, например, линейный или разветвлённый полиэтиленгликоль, причем в качестве пегилирующих агентов использованы ортопиридилдисульфидные (ПЕГ-ОР88) и малеимидные (ПЕГ-МЛЬ) производные ПЕГ.

При использовании ПЕГ-ОР88 в образующемся конъюгате полимер связан с цистеиновым фрагментом полипептида малостабильной дисульфидной связью, а при использовании ПЕГ-МЛЬ полимер связывается как с тиольными, так и с аминогруппами полипептидов, образуя смесь соответствующих позиционных изомеров [Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Киев, Наукова Думка. 1992; 8Нап 8. Аопд. СНсшЫгу о£ рто!ет сопщдабоп апб сго55-1й1кйщ. СВС Ргс55. 1пс. 1993].

В патенте И8 179337 (опубл. 18.12.1979) раскрыты физиологически активные конъюгаты инсулина, содержащие в молекуле фрагмент пара-фенилендиазония и имеющие строение аминоазопроизводного формулы

где В представляет РЕО-О-СН₂-, РЕО-О-СН₂-СН(ОН)-СН₂-О- или РЕО-О-С(=О)-, а представляет пептидную цепь, которые можно рассматривать в качестве ближайших аналогов.

Недостатками таких производных являются относительно большое количество возможных вариантов позиционных изомеров вследствие присоединения полимерной части к аминогруппам полипептидов и их невысокая стабильность в организме и, как следствие, связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности - диазосоединений.

Таким образом, существует потребность в новых конъюгатах полипептидов с активностью ΙΓΝ-γ.

Сущность изобретения

Авторы изобретения неожиданно установили, что недостатки известного уровня техники можно преодолеть, синтезировав монопегилированные полипептиды с активностью ΙΓΝ-γ, имеющие общую структуру (I)

где п - целое число в интервале от 100 до 1200,

А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,

РР - полипептид с активностью ΙΓΝ-γ, в которых полимер присоединен к тирозиновым или гистидиновым фрагментам полипептида посредством азогруппы.

Техническим результатом такого модифицирования химической структуры является увеличение длительности циркуляции активного вещества в крови при сохранении им значительной части биологической активности немодифицированного полипептида.

В соответствии с изобретением в качестве полипептида с активностью ΙΓΝ-γ можно применять интерферон-гамма (ΙΝΓ-γ) или дельтаферон.

- 2 020220

Таким образом, первым объектом изобретения является ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с полипептидом, имеющим активность интерферона-гамма (ΙΕΝ-γ) формулы (I)

где η - целое число в интервале от 100 до 1200,

А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,

РР - полипептид с активностью ΙΕΝ-γ.

Ковалентный конъюгат получают азосочетанием 4-([метоксиполэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония (М.м. 30 кДа) с гистидиновыми и тирозиновыми фрагментами полипептидов, выступающими в данной реакции в качестве азосоставляющих.

Для доказательства строения конъюгата как азосоединения применяют, в частности, электронную спектроскопию поглощения (ЭСП), сравнивают спектральные характеристики (интенсивность, ширину и положение максимумов полос поглощения) растворов исходных и модифицированных полипептидов с активностью ΙΕΝ-γ и интерпретируют полученные закономерности с позиций теории цветности органических соединений, необязательно, с привлечением адекватных методов квантово-химического моделирования. Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристики максимумов полос поглощения ΙΕΝ-γ, дельтаферона и их монопегилированных аналогов (вода, рН 6,5, 1 1,0 см)

Соединение	Характеристика	Значение
ΙΓΝ-Υ	НМ	219	280	-	-
р1% Осы	86,2	9,7	-	-
ПЕГ-ΙΓΝ-γ η = 670-630	λ-макс/ НМ	224	281	344	414 *
С-1% ^1см	75,0	10,2	2,7	3,0
Дельтаферон	Аймаке г НМ	205	280	-	-
*1см	83,1	σ. . оо ___________________________________________ί	-	-
ПЕГ-дельтаферон η = 670-680	Амане/ НМ	208	278	346	412*
р|% £1см	71,7	9,3	2,9	3,1

г-1% ^|ск - поглощение 1% (мас./об.) раствора при 1 1 см. * - проявляется в виде плеча.

Появление полос поглощения у монопегилированных ΙΕΝ-γ и дельтаферона с максимумами при 344,414 и 346,412 нм может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными электронными переходами в хромофорных системах не связанных сопряжением диарилазогрупп, ΙΕΝ-γ образовавшихся в результате ковалентного присоединения ПЭГ -агента к тирозиновыми и гистидиновыми звеньями молекул полипептидов. Уширение полос обусловлено наличием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронно-колебательных переходов.

Достижение технического результата, заключающегося в увеличении времени циркуляции в кровотоке ковалентных конъюгатов (пегилированных полипептидов) с активностью ΙΕΝ-γ, подтверждают в сериях исследований на мышиной модели. Результаты сравнительных исследований ίη νίνο приведены в табл. 2.

- 3 020220

Таблица 2. Относительные концентрации ΙΤΝ-γ и дельтаферона и их конъюгатов в соответствии с изобретением в крови мышей

День	Относительная концентрация (а % от максимальной)
ΙΓΝ-Υ	ПЭГ-ΙΕΝ-γ η = 670-680	Дельтаферон	ПЭГ-Дельтаферон η = 670-680
1	100, 0	48,5	100, 0	39, Θ
2	2,3	100	6,1	100
3	0	28,7	0	42,3
4	0	6,4	0	11, 6
5	0	1,2	0	4,1
6	0	0	0	0

Полученные данные показывают, что конъюгаты ΙΤΝ-γ и дельтаферона в соответствии с изобретением обладают большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с непегилированными поли пептидами.

Достижение технического результата, заключающегося в сохранении ковалентными конъюгатами значительной части биологической активности исходных полипептидов, подтверждается результатами определения остаточной активности пегилировнных полипептидов с активностью ΙΝΤ-γ.

Таблица 3. Активность ΙΝΤ-γ, дельтаферона и их конъюгатов (остаточная активность)

Препарат	Активность полипептида, МЕ/мг	% остаточной активности полипептида
ΪΝΕ-γ	2,0 ·107	-
ПЭГ-ΙΝΕ-γ η = 670-680	3,4-106	17%
Дельтаферон	7,9-10*	-
ПЭГ-Дельтаферон η = 670-680	1,8·106	23%

Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля гамма (ΙΤΝ-γ) формулы (I) с полипептидом, имеющим активность интерферона-

где η - целое число в интервале от 100 до 1200,

А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина,

РР - полипептид с активностью ΙΤΝ-γ, можно получить способом, включающим стадии, на которых:

а) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты

где η принимает значения от 100 до 1200, диазотируют нитритом щелочного или щелочноземельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органи ческим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с во дой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента - 4-([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония

- 4 020220 где η - принимает вышеуказанные значения;

б) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию азосочетания с полипептидом, имеющим активность ΙΝΕ-γ в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30 °С; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированого и немодифицированного полипептида с активностью интерферона гаммма и блокированного ПЭГ-агента, и

в) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированого полипептида, имеющего активность ΙΝΕ-γ.

При реализации указанного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного полипептида, имеющего активность ΙΝΕ-γ, и расширение арсенала лекарственных средств для борьбы с вирусными и некоторыми бактериальными инфекциями.

Повышение выхода пегилированного полипептида, имеющего активность ΙΝΕ-γ, достигается за счет количественного переведения ПЕГ -агента в активную форму непосредственно перед конъюгацией, исключая деградацию активной группировки - диазогруппы при транспортировке и хранении.

Увеличение времени циркуляции пегилированного полипептида с активностью ΙΝΕ-γ в кровотоке возможно за счёт способности тирозиновых и гистидиновых звеньев ΙΝΕ-γ вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных полипептидов с активностью ΙΝΕ-γ.

В случае необходимости, повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования.

В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии НС1 в тетрагидрофуране.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания рН применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения полипептидов с активностью ΙΝΕ-γ составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют тирозин.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М №С1.

На стадии а) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С.

В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°С. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например, с помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или нерганических кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно - от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.

Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°С. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно - трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Кислую среду в полярной органической среде создают растворами НС1 или НВг в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде, или не более 24 ч в полярной

- 5 020220 органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Термин пониженная температура означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды. Перед применением активированного ПЭГ-агента для пегилирования интерферона требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно применяют азиды щелочных или щелочно-земельных металлов.

На стадии б) пегилирование полипептида с активностью ΙΝΤ-γ достигается в результате протекания реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с интерфероном а-2Ь в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал рН при пегилировании составляет от 9 до 10. Поддержание рН обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратнокарбонатного буферного раствора. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к полипептиду с активностью ΙΝΤ-γ составляет от 1:1 до 20:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1.

Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ. По достижении требуемой степени превращения полипептида реакцию пегилирования останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосотавляющей. Для этого в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых гетероцикл способен выступать в качестве азосотавляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно - тирозин. Предпочтительно степень превращения полипептида, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 80-90%.

Выделение монопегилированного полипептида с активностью ΙΝΤ-γ из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию полипептида с активностью ΙΝΤ-γ определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя соответствующее значение А₂₈₀ для раствора с концентрацией полипептида 1 мг/мл.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.

Пример 1. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).

К охлажденному до 1°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (м.м. 30 кДа) в 1 мл 0,1 М НВг приливают 1 мл охлажденного 0,01 М ΝαΝΟ₂ и выдерживают в ледяной бане 20 мин, после чего приливают 1 мл 0,01 М Η₂Ν8Ο₃Η и сразу же используют для пегилирования или хранят в холодильнике не более 2 ч.

ЭСП (вода, рН 4) λ, нм (1§ ε): 203 (4,86), 256 (4,51), 275 (4,43, плечо).

Пример 2. Диазотированный монометоксиполиэтиленгликолевый эфир 4-аминобензойной кислоты (активированный ПЭГ-агент с м.м. 30 кДа).

К охлажденному до -35°С раствору 0,077 г (2,5 мкмоль) монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (м.м 30 кДа в 0,5 мл 0,2 М раствора НС1 в тетрагидрофуране приливают 0,5 мл 0,01 М трет-бутилнитрита в тетрагидрофуране и оставляют при -35°С не менее чем на 30 мин (но не более чем на 24 ч), после чего прибавляют 0,5 мл 0,01 М Η₂Ν8Ο₃Η и сразу же используют для пегилирования.

Пример 3а. Получение монопегилированного полипептида, имеющего активность ΙΝΤ-γ (интерферона-гамма).

К охлажденному до 3°С раствору 0,5 мкмоль полипептида с активностью интерферона ΙΝΤ-γ в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 0,077 г (2,5 мкмоль) диазотированного монометоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты (м.м. 30 кДа), полученный в соответствии с примером 1 или 2, поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращенофазовой ВЭЖХ (колонка Ктошакй 300-5С4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ). По достижении степени превращения соответствующего полипептида, равной 80-85%, приливают раствор тирозина, перемешивают 5 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного полипептида с активностью ΙΝΤ-γ, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ЫаС1.

- 6 020220

Выход очищенного монопегилированного ΙΕΝ-γ 44% (считая на ΙΕΝ-γ).

ЭСП (вода, рН 6,5, 1 1,0 см), Х_макс, нм (Е¹%_{1 см}): 224 (75,0), 281 (10,2), 344 (2,7), 414 (3,0).

Пример 3б. Получение монопегилированного полипептида, имеющего активность ΙΝΕ-γ (дельтаферона).

В условиях, приведённых в примере 3 а, получают очищенный монопегилированный дельтаферон с выходом 51% (считая на дельтаферон).

ЭСП (вода, рН 6,5, 1 1,0 см), Х_макс, нм (Е^1%! _см): 208 (71,7), 278 (9,3), 346 (2,9), 412 (3,1).

Пример 4. Определение времени циркуляции монопегилированных ΙΕΝ-γ и дельтаферона в крови на мышиной модели.

Самцам мышей линии СВА внутримышечно вводят по 1 мкг пегилированного полипептида с активностью ΙΕΝ-γ в соответствии с изобретением (30 кДа), после чего собирают кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля используют соответствующий немодифицированный полипептид, который вводят по той же схеме. Взятые пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при -65°С до проведения тестов. Содержание полипептидов (пг/мл) в сыворотках крови определяют с помощью иммуно-ферментного анализа, результаты усредняют. Вычисляют относительное содержание полипептида (в %), при этом за 100% принимают среднюю максимальную концентрацию белка в крови в каждой группе животных.

Пример 5. Определение активности монопегилированных и немодифицированных ΙΕΝ-γ и дельтаферона.

Противовирусную активность определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном по подавлению цитопатического действия тест-вируса в диплоидной культуре клеток Л-68 (200000 кл/мл). Для этого используют тест-вирус ЕМС штамм Колумбия в дозе 100 ЦПД₅₀ и питательную среду Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки КРС. Остаточную активность конъюгатов выражают по отношению к результатам параллельного титрования активности стандартного раствора соответствующего полипептида, имеющего биологическую активность ΙΕΝ-γ.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с полипептидом, имеющим активность интерферонагамма (ΙΕΝ-γ) формулы (Ι) (I) где η - целое число в интервале от 100 до 1200;

   А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина;

   РР - полипептид с активностью ΙΕΝ-γ, выбранный из группы, состоящей из ΙΕΝ-γ и дельтаферона.

   О Евразийская патентная организация, ЕАПВ

   Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2