EA020425B1

EA020425B1 - Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека

Info

Publication number: EA020425B1
Application number: EA201101663A
Authority: EA
Inventors: Сергей Викторович Шереметьев; Сергей Анатольевич Коровкин; Антон Викентьевич Катлинский; Андрей Викторович Семченко; Владимир Антонович Катлинский
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт")
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2014-11-28
Also published as: EA201101663A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, в котором ПЕГ присоединен к тирозиновым или гистидиновым фрагментам полипептида посредством азогруппы общей структуры:где n - целое число в интервале от 100 до 1200; А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина; Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Конъюгат Г-КСФ обладает большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным полипептидом при сохранении существенной доли его активности.

Description

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, в котором полимер присоединён к полипептиду посредством азогруппы.

Сведения о предшествующем уровне техники

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ, О-С8Р) - полипептидный гормон, стимулирующий в культуре клеток формирование колоний гранулоцитов. Г-КСФ стимулирует пролиферацию и дифференцировку поздних клеток-предшественников в нейтрофилы. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является главным гемопоэтическим фактором роста, регулирующим гранулоцитопоэз, и широко применяется в медицине при лечении нейтропений различной этиологии.

Показаниями к применению О-С8Р являются нейтропения наследственная, периодическая или идиопатическая, при которой число нейтрофилов ниже или равно 500 клеток/мкл (в том числе у больных, получающих цитостатические лекарственные средства по поводу немиелоидных злокачественных новообразований, а также имеющих в анамнезе тяжелые или рецидивирующие инфекции в последние 12 месяцев), сокращение продолжительности периода нейтропений и ее клинических последствий у пациентов, готовящихся к трансплантации костного мозга, стойкая нейтропения у пациентов с развернутой стадией ВИЧ-инфекции (абсолютное число нейтрофилов 1000 клеток/мкл и менее), мобилизация периферических стволовых клеток (в том числе после миелосупрессивной терапии).

Известны препараты Г-КСФ, например Филграстим - метионилколониестимулирующий фактор с молекулярной массой 18800 Да, представляющий собой негликозилированный протеин, состоящий из 175 аминокислот (производство: Мастерклон, Россия). Тем не менее, применение Г-КСФ в медицине ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является недостаточная энзиматическая стабильность в организме, которая приводит к необходимости увеличения частоты введения препарата, что в ряде случаев сопряжено с усилением побочных эффектов.

Среднее значение периода полувыведения филграстима из сыворотки как у здоровых людей, так и у больных с опухолями составляет около 3,5 ч; скорость клиренса приблизительно 0,5-0,7 мл/(мин-кг). Только при непрерывных 24-часовых в/в инфузиях филграстима в дозе 20 мкг/кг в течение 11-20 дней достигается равновесная концентрация в крови.

В связи с этим возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы Г-КСФ с целью преодоления указанных недостатков.

Для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой [Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и перспективы, в сб.: Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. № 3 (13) (2001), с. 3-8].

Как правило, в ковалентных конъюгатах полимерный фрагмент присоединен к полипептиду через одну из свободных аминогрупп последнего Κοζ1ο\ν5ΐ<ί А., СЬаг1ск 8.А., Натк ГМ. Осус1ортсп1 οί Рсду1а1сб 1п1сгГсгоп5 ίοτ 1Нс ТгеаНпсШ οί СЬготс НсраИИк С. ΒιοΌγη^κ.; νοί. 15(7) (2001), ρ. 419-429], а препарат представляет собой смесь позиционных изомеров, химическая структура которых друг от друга отличается местом прикрепления полимера к полипептиду. Теоретически число позиционных изомеров в данном случае равно количеству свободных аминогрупп в полипептиде при условии их доступности для пегилирующего агента [Блохин Н.П., Никитин И.Г. Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа) Пегасис: новые возможности терапии хронического гепатита С. В сб.: Материалы VII Российской конференции Гепатология сегодня. РЖГГК. 2002, с. 6].

В заявке РИ 2009122976 (опубл. 27.12.2010) предложен конъюгат трехветвистого ПЕГ-Г-КСФ следующей общей формулы:

/ ,—о\—Ζ—Υ—Θ-СЗР —ο-ν / η ииг в котором отношение связывания трехветвистого полиэтиленгликоля и Г-КСФ составляет 1:1 (моль/моль) и ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу от 200 до 45000 Да, где η представляет собой целое число от 1 до 1000; т представляет собой целое число от 10 до 1000;

Ζ представляет собой (СН₂)_к или (СН₂)_кЫНСО(СН₂)_к в качестве линкера Г-КСФ и ПЭГ, где к представляет собой целое число от 1 до 6;

Υ представляет собой амидную связь, образованную объединением одной из ИН₂-функциональной

- 1 020425 группы в Г-КСФ и функциональной группы производного ПЭГ.

В заявке И8 2008/0287659 (опубл. 20.11.2008) раскрыт пегилированный мутеин Г-КСФ, представляющий собой смесь ковалентных конъюгатов с разной степенью пегилирования, имеющих общую формулу

где С - мутеин Г -КСФ;

К - низший алкил; η - целое число от 420 до 550; т - целое число от 1 до 5.

Таким образом, предложенная смесь конъюгатов представляет собой смесь различных позиционных изомеров разной степени пегилирования.

Известно, что позиционные изомеры полипептидов имеют различную биологическую активность (И8 2004/0223950, опубл. 11.11. 2004). Это создаёт предпосылки для расширения арсенала таких средств за счёт различных вариантов модифицирования молекул протеинов. Например, изменение положений и способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров в конечном продукте.

Одним из способов снижения числа позиционных изомеров является присоединение ПЕГ преимущественно к Ν-терминальной аминогруппе полипептида с использованием разности значений рК_а для Ν-концевой α-аминогруппы и ε-аминогруппы лизиновых фрагментов белка.

Так, в международной заявке \УО 96/011953 (опубл. 25.04.1996) предложен ковалентный конъюгат Г-КСФ с ПЕГ, полученный восстановительным алкилированием Ν-терминальной аминогруппы пептида метоксиполиэтиленгликоль-альдегидом в присутствии Ν;·ιί'.'ΝΒΗ₃ при рН 5. Однако условия конъюгации в данном патенте полностью не исключают вероятность побочных реакций, в том числе присоединения ПЕГ к ε-аминогруппам лизиновых фрагментов, часть которых, несмотря на высокое значение рК_а, даже при кислых рН депротонирована, а их количество в белке, в отличие от Ν-терминальной α-аминогруппы, больше одной.

Другим направлением снижения числа позиционных изомеров является присоединение ПЕГ к тиольной группе цистеинового фрагмента полипептида.

Так, в патенте \УО 03/078461 (опубл. 25.03.2003) раскрыт ковалентный конъюгат, в котором полиэтиленгликоль связан с Г-КСФ в соотношении 1:1 через малеимидную группу с тиолом цистеинового фрагмента полипептида. Однако приведенные в патенте значения относительных активностей конъюгатов показывают, что модификация по тиольным фрагментам значимых преимуществ перед конъюгатами, образованным по аминогруппам лизина, не имеют.

Таким образом, дальнейшая разработка новых типов конъюгатов, включая те, в которых не затронуты аминогруппы полипептидов, является весьма перспективной задачей.

Наиболее близкими по технической сущности рассматриваются физиологически активные конъюгаты, в частности, инсулина, раскрытые в И8 4179337 (опубл. 18.12.1979), содержащие в молекуле фрагмент парафенилендиазония и имеющие строение аминоазопроизводного формулы

где К представляет РЕС-О-СН2-, РЕС-О-СН2-СН(ОН)-СН2-О- или РЕС-О-С(=О)-;

представляет пептидную цепь.

Недостатками таких производных являются относительно большое количество возможных вариантов позиционных изомеров вследствие присоединения полимерной части к аминогруппам полипептидов и их невысокая стабильность в организме и, как следствие, связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности диазосоединений.

Сущность изобретения

Авторы изобретения неожиданно установили, что конъюгаты ПЕГ с Г-КСФ, в которых полимер присоединен к тирозиновым или гистидиновым фрагментам полипепетида посредством азогруппы, имеющие общую структуру (I), приобретают способность длительной циркуляции в крови и сохраняют значительную часть биологической активности немодифицированного Г-КСФ.

- 2 020425 где η - целое число в интервале от 100 до 1200;

А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина;

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

Для доказательства строения конъюгата как азосоединения применяют, в частности, электронную спектроскопию поглощения (ЭСП), сравнивают спектральные характеристики (интенсивность, ширину и положение максимумов полос поглощения) растворов пегилированного и немодифицированного Г-КСФ и интерпретируют полученные закономерности с позиций теории цветности органических соединений, необязательно, с привлечением адекватных методов квантово-химического моделирования.

Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики максимумов полос поглощения пегилированного и немодифицированного Г-КСФ (вода, рН 4,5, 11 см)

Появление полос поглощения у пегилированного Г-КСФ с максимумами при 339 и 400 нм может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными электронными переходами в хромофорных системах не связанных сопряжением диарилазогрупп, образовавшихся в результате ковалентного присоединения ПЭГ-агента к тирозиновым и гистидиновым звеньям Г-КСФ. Уширение полос обусловлено наличием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронно-колебательных переходов.

Достижение технического результата, заключающегося в увеличении времени циркуляции в кровотоке пегилированного Г-КСФ, подтверждают в сериях исследований на мышиной модели (табл. 2).

Таблица 2

Время достижения максимальной концентрации (Т_тах) и период полупревращения (Т_1/2) Г-КСФ и его конъгата в соответствии с изобретением в крови мышей после п/к инъекции

Препарат	Тщах	1*1/2/ ч
Г-КСФ	3,9+0,3	3,9±1,б
ПЕГ-Г-КСФ	9,8±1,4	15,4±3,1

Приведённые данные показывают, что конъюгат Г-КСФ в соответствии с изобретением обладает большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным протеином.

Результаты исследования биологической активности конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением приведены в табл. 3.

Таблица 3

Биологическая активность пегилированного и немодифицированного Г-КСФ

Препарат	МЕ/мг	Остаточная активность, %
Г-КСФ	КО*	100
ПЕГ-Г-КСФ	2,4-Ю⁷	24

Таким образом, конъюгат в соответствии с настоящим изобретением сохраняет существенную часть биологической активности немодифицированного Г-КСФ.

- 3 020425

В соответствии с изобретением конъюгат Г -КСФ с высокой степенью чистоты может быть получен способом, включающим стадии, на которых:

а) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты

где η принимает значения от 10 до 1200, диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента - ([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония:

где η - принимает вышеуказанные значения;

б) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию азосочетания с Г-КСФ в молярном соотношении ПЕГ-агента к Г-КСФ 1-10:1 соответственно в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°С; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси конъюгатов разной степени пегилирования, немодифицированного полипептида и блокированного ПЭГ -агента;

в) полученную смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с выделением монопегилированного Г-КСФ.

При реализации заявленного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного Г-КСФ и увеличение времени его циркуляции в кровотоке.

Повышение выхода пегилированного Г-КСФ достигается за счет количественного переведения ПЕГ-агента в активную форму непосредственно перед конъюгацией, исключая деградацию активной группировки - диазогруппы при транспортировке и хранении.

Увеличение времени циркуляции пегилированного Г-КСФ в кровотоке возможно за счёт способности тирозиновых и гистидиновых звеньев полипептида вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных Г-КСФ.

В случае необходимости, повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования.

В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии НС1 в тетрагидрофуране.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания рН применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения Г-КСФ составляет 75100%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ЫаС1.

На стадии а) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С.

В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°С. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например с помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или нерганических кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочти- 4 020425 тельно от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.

Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°С. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Кислую среду в полярной органической среде создают растворами НС1 или НВг в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Термин пониженная температура означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды. Перед применением активированного ПЭГ -агента для пегилирования Г-КСФ требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно, применяют азиды щелочных или щелочно-земельных металлов.

На стадии б) пегилирование Г-КСФ достигается в результате протекания реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с Г-КСФ в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал рН при пегилировании составляет от 9 до 10. Поддержание рН обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратно-карбонатного буферного раствора. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к Г-КСФ составляет от 1:1 до 10:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1.

Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращенно-фазовой ВЭЖХ. По достижении требуемой степени превращения полипептида реакцию пегилирования останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей. Для этого в качестве низкомолекулярной азосотавляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых гетероцикл способен выступать в качестве азосоставляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно тирозин. Предпочтительно степень превращения Г -КСФ, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 75-100%.

Выделение пегилированного Г-КСФ из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию Г-КСФ определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя соответствующее значение А₂₈₀ для раствора с концентрацией полипептида 1 мг/мл.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.

Пример 1. Получение пегилированного Г-КСФ.

К охлажденному до 3°С раствору 0,5 мкмоль Г-КСФ в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 2,5 мкмоль 4-([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония (М.м. 30 кДа), поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 2 ч, контролируя протекание превращений обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка Кготакй 300-5С4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил + 0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил + 0,2% ТФУ). По достижении степени превращения Г-КСФ равной 70-80% приливают раствор тирозина, перемешивают 10 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного Г-КСФ, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ЫаС1. Выход очищенного пегилированного Г-КСФ

39% (считая на Г-КСФ). ЭСП (вода, рН 4,5, 11 см), Х_макс, нм ^(Δ|“'>: 219 (36,4), 279 (6,6), 339 (5,9), 400 (3,8).

Пример 2. Определение времени циркуляции пегилированного Г-КСФ в крови на мышиной модели.

- 5 020425

Самцам мышей линии СВА вводят подкожно по 5 мкг пегилированного Г-КСФ в соответствии с изобретением, после чего собирают кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля используют немодифицированный Г-КСФ, который вводят по той же схеме. Взятые пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при -65°С до проведения тестов. Содержание в сыворотках крови (пг/мл) определяют с помощью ИФА набора Нитап 0-С8Р ЕЫ§А Κίΐ, далее рассчитывают время достижения максимальной концентрации и период полупревращения. Данные представлены в табл. 2.

Пример 3. Определение активности пегилированного Г-КСФ.

Человеческую миелоидную клеточную линию НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) культивируют в среде ΚΡΜΙ 1640, в которую добавлен 10% РВ§. Культивированные клетки суспендируют при плотности примерно 2,2х10⁵ клеток/мл и добавляют ДМСО (диметилсульфоксид со степенью чистоты, пригодной для культивирования, §1§та) при конечной концентрации 1,25% (об./об.). Затем 90 мкл клеточной суспензии высевают в каждую лунку 96-луночного планшета (Сотшд/96-луночный планшет с выпариванием при низкой температуре), после чего планшет оставляют до достижения плотности примерно 2х10⁴ клеток на лунку и культивируют в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 72 ч.

Каждый образец разводят средой ΚΡΜΙ 1640 до идентичной концентрации 10 мкг/мл, а затем проводят двукратное разведение средой ΡΡΜΙ 1640 в 19 раз. Эти серийные двукратные разведения отдельно добавляют в каждую лунку, содержащую клетки НЬ-60 в объеме 10 мкл, так, чтобы концентрация каждого образца изначально составляла 1 мкг/мл. Затем клетки культивируют в инкубаторе при 37°С в течение 72 ч.

Пролиферацию клеток НЬ-60 анализируют с использованием реагента 96 (Се11 Тйет 96ТМ, Са£ Νο. 04100, Рготеда) для определения клеточного титра и увеличивающееся число клеток определяют путем измерения оптической плотности при 670 нм. Результаты измерения приведены в табл. 3.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгат полиэтиленгликоля с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, в котором полимер присоединен к тирозиновым или гистидиновым фрагментам полипептида посредством азогруппы, имеющий общую структурную формулу где п - целое число в интервале от 100 до 1200;

А - аминокислотный фрагмент тирозина или гистидина; Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.