WO2010074082A1 - バソヒビン修飾体 - Google Patents

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WO2010074082A1
WO2010074082A1 PCT/JP2009/071328 JP2009071328W WO2010074082A1 WO 2010074082 A1 WO2010074082 A1 WO 2010074082A1 JP 2009071328 W JP2009071328 W JP 2009071328W WO 2010074082 A1 WO2010074082 A1 WO 2010074082A1
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bathohibin
vasohibin
polyethylene glycol
peg
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PCT/JP2009/071328
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靖史 佐藤
巧 中村
光史 松本
公昭 佐藤
完二 北条
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塩野義製薬株式会社
国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to a modified bathohibin. More specifically, a modified vasohibin modified with a specific active polyethylene glycol, a production method thereof, a modified preparation containing the modified vasohibin, a pharmaceutical composition, and the modified vasohibin, modified preparation
  • the present invention relates to a method for treating a disease requiring an anti-angiogenic action, characterized by administering a product or a pharmaceutical composition.
  • Polyethylene glycol is a non-toxic and non-immunogenic polymer and has a feature that the size and side chain structure can be changed according to the use.
  • PEG modification to the target protein has attracted attention as a method for improving the pharmacokinetic properties and immune properties of proteins with poor in vivo stability using this feature.
  • Non-Patent Document 1 reports various PEG-modified drugs that have been approved by the FDA or are undergoing clinical trials.
  • Non-Patent Document 2 describes various methods relating to PEG modification of proteins.
  • Non-Patent Document 3 describes PEG (NHS-PEG) having N-succinimide (N-succinimidyl group).
  • the PEG modification by N-acylation reaction used is described. Specifically, PEG modification is carried out by reacting PEG having an N-succinimidyl group and an antibody at respective molar ratios (antibodies / PEG) in a neutral buffer of pH 8.4. It is carried out.
  • Non-Patent Document 4 an example of modifying a protein by reductive amination reaction using PEG (CHO-PEG) having an aldehyde group as a functional group has been reported.
  • Vasohibin is expressed in vascular endothelial cells by stimulation of angiogenesis promoting factors (VEGF, FGF-2, etc.) secreted from tumor cells, stromal cells, macrophages, etc. (see Patent Document 1) and autocrine in the endothelial cells themselves. It is a polypeptide having an action of suppressing angiogenesis by acting on the body. Accordingly, Vasohibin is expected to be applied as a drug that exhibits an anti-angiogenesis inhibitory effect in vivo, and thus an anti-tumor effect.
  • angiogenesis promoting factors VEGF, FGF-2, etc.
  • the present inventors have found that in the process of preparing bathohibin, the solubility in the neutral region of bathohibin is extremely low.
  • the solubility in the neutral pH range is poor, there is a high risk of insolubilization and aggregation, which makes it difficult to apply as a pharmaceutical due to dose restrictions and antigenic problems, which need to be resolved. It was.
  • Vasohibin since Vasohibin has low solubility in the vicinity of neutrality, it has been found that modification of Vasohibin with polyethylene glycol having an N-succinimidyl group among various polyethylene glycols is difficult to perform according to a conventional method.
  • An object of the present invention is to improve a modified bathohibin bound with polyethylene glycol, which has improved solubility in the vicinity of neutrality and exhibits an excellent anti-angiogenic effect and an antitumor effect in vivo, a method for producing the same, and the method Provided are a modified preparation containing a modified vasohibin, a pharmaceutical composition, and a method for treating a disease requiring an anti-angiogenic action, characterized by administering the modified vasohibin, modified preparation, and pharmaceutical composition There is to do.
  • the present inventors have made the reaction between polyethylene glycol having an N-succinimidyl group and vasohibin react in an acidic region and in a large excess of polyethylene glycol.
  • a modified vasohibin to which polyethylene glycol was bound was obtained, and it was found that the solubility in the vicinity of neutrality and the in vivo stability were remarkably improved while maintaining the physiological activity of vasohibin by the modification.
  • vasohibin by reacting polyethylene glycol having an aldehyde group with vasohibin, a modified vasohibin in which polyethylene glycol is specifically bound only to the N-terminus is obtained, and the neutrality is maintained while maintaining the physiological activity of vasohibin by the modification. It has been found that the solubility in is significantly improved. It has been found that these modifications impart the above-mentioned properties that are extremely excellent for using Vasohibin as a pharmaceutical, and the present invention has been completed.
  • a modified vasohibin preparation comprising the modified vasohibin according to [1] or [2], [5] The modified bathohibin according to the above [1], wherein polyethylene glycol having an aldehyde group is reacted with bathohibin.
  • a pharmaceutical composition comprising the modified bathohibin according to any one of [1], [2], or [5], and [7] the above [1], [2], or [5]
  • the present invention relates to a method for treating a disease requiring an angiogenesis-suppressing action, comprising administering any one of the modified vasohibin according to [4], the modified vasohibin preparation according to [4], and the pharmaceutical composition according to [6].
  • the modified bathohibin of the present invention has an excellent effect that solubility in the vicinity of neutrality is improved and an excellent angiogenesis inhibitory effect and antitumor effect can be exhibited in vivo.
  • a modified product using polyethylene glycol having an N-succinimidyl group also has an excellent effect of improving blood stability in addition to the above properties.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of a gel filtration purified fraction of PEG (NHS) -Vh1.
  • M represents a molecular weight marker
  • L represents a gel filtration load solution
  • the number represents a fraction number.
  • FIG. 2 shows the results of MALDI-TOF-MS analysis of Vh1 and PEG (NHS) -Vh1.
  • the upper column is a mass chromatograph of Vh1 and the lower column is PEG (NHS) -Vh1, the numerical value at the top of the peak in the lower column indicates the molecular weight, and from the left, a modified form in which two molecules of PEG are bonded (molecular weight: 56664), three molecules are bonded.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of evaluation of inhibition of intracorneal angiogenesis by Vh1, PEG (NHS) -Vh1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of blood stability evaluation of PEG (NHS) -Vh1.
  • FIG. 5 shows the results of MALDI-TOF-MS analysis of Vh1 and PEG (CHO) -Vh1.
  • the upper part is a mass chromatograph of PEG (CHO) -Vh1 obtained by reacting CHO-PEG with a molecular weight of 5,000 in the lower part. Peak 1 in the lower part is a modified form in which one molecule of PEG is bound, and peak 2 is a part in which PEG is present. A modified form in which two molecules are bound is shown.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE analysis of PEG (CHO) -Vh1.
  • M represents a molecular weight marker
  • 5-40K represents a lane with the molecular weight of CHO-PEG used for modification of Vh1 for PEG (CHO) -Vh1.
  • b40K a branched lane of Vh1 modified with CHO-PEG having an average molecular weight of 40,000 is shown.
  • the modified bathohibin of the present invention is obtained by binding polyethylene glycol to bathohibin, (1) Solubility at 25 ° C (25 ° C) is 1mg / mL or more (2) It has the property of having an anti-angiogenic action.
  • a modified vasohibin having excellent solubility in the vicinity of neutrality and having an anti-angiogenic action specifically, polyethylene glycol having vasohibin and N-succinimidyl group (hereinafter also referred to as NHS-PEG).
  • CHO polyethylene glycol having an aldehyde group obtained by reacting at a specific molar ratio (vasohibin / NHS-PEG) in the acidic region (modified vasohibin of embodiment 1).
  • vanadium carbide a polyethylene glycol having an aldehyde group obtained by reacting at a specific molar ratio (vasohibin / NHS-PEG) in the acidic region (modified vasohibin of embodiment 1).
  • Which may be described as -PEG) and the like
  • modified vasohibin of embodiment 2 modified vasohibin of embodiment 2.
  • modified vasohibin means vasohibin to which polyethylene glycol is bound
  • modified vasohibin of Embodiments 1 and 2 is exemplified.
  • Unmodified basohibin means free vasohibin.
  • the protein concentration of the solution of the modified bathohibin can be measured by a known protein quantification method such as Bradford method, BCA method, Raleigh method, ultraviolet absorption method and the like.
  • the pH 7.4 phosphate buffered saline (PBS) is preferably PBS showing any pH within the range of pH 7.35 to 7.44, more preferably pH 7.40.
  • the angiogenesis inhibitory activity can be evaluated by an anti-angiogenesis assay using a mouse cornea. Specifically, as shown in Test Example 1 of Examples described later, a buffer solution alone, VEGF alone, VEGF and vasohibin unmodified, VEGF and vasohibin modified of embodiment 1 (vasohibin in protein conversion) The area of blood vessels newly formed in the cornea when the same amount of unmodified compound is administered is measured. The value obtained by subtracting the vascular area when VEGF and vasohibin unmodified are administered from the vascular area when only VEGF is administered is defined as the angiogenesis inhibitory activity of vasohibin unmodified.
  • the value obtained by subtracting the vascular area when VEGF and the modified vasohibin of aspect 1 are administered from the vascular area when only VEGF is administered is defined as the angiogenesis inhibitory activity of the modified vasohibin of aspect 1.
  • the modified vasohibin of aspect 1 has an angiogenesis inhibitory activity.
  • the angiogenesis inhibitory activity (%) of the modified bathohibin of aspect 1 is preferably 50% or more, and more preferably 80% or more.
  • the angiogenesis inhibitory activity can also be evaluated by a tumor growth inhibition assay in mice. Specifically, as shown in Test Example 3 of Examples described later, 90% Matrigel and 10% of Vasohibin of Aspect 2 were used in the back skin of BALB / c mice. 0.05 mL (1 ⁇ 10 6 ) transplantation of the modified body (final concentration 50 ⁇ g / mL) or a composition containing human serum albumin (final concentration 50 ⁇ g / mL), which is a negative control, into the dorsal skin in advance. The tumor is collected on the 13th day after transplantation and the weight is measured.
  • the tumor growth inhibition activity in the control administration group is 0%, and the tumor weight after administration is 0 mg.
  • Tumor growth inhibitory activity (%) when the activity is 100% is calculated and used as angiogenesis inhibitory activity (%).
  • the modified vasohibin is judged to have an angiogenesis inhibitory activity.
  • the angiogenesis inhibitory activity (%) of the modified bathohibin of aspect 2 is preferably 35% or more, more preferably 45% or more, and further preferably 60% or more.
  • the PEG modification of proteins using NHS-PEG is usually performed by nucleophilic reaction of the electron donating group of NHS-PEG activated by setting the pH of the reaction solution to near neutrality. -Amino group or ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid residue, thereby forming a complex of PEG and protein from which the N-succinimidyl group is eliminated.
  • the number of PEG modifications can be controlled by the amount of NHS-PEG added. For example, when the number of PEG modifications per protein molecule is 1 to 7 molecules, NHS-PEG and protein used in the reaction The molar ratio (NHS-PEG / protein) is about 20/1 to 1/1.
  • the solubility in the vicinity of the neutrality of Vasohibin is low (solubility at pH 7.4: 0.01 mg / mL or less), so the reaction between NHS-PEG and protein is highly soluble in Vasohibin.
  • 100 mol or more of NHS-PEG was added to 1 mol of vasohibin and mixed to obtain vasohibin in which 2 to 7 molecules of PEG were bound to 1 molecule of vasohibin.
  • PEG modification of proteins using CHO-PEG can be performed by reductive amination of the amino group of the protein, utilizing the difference in pKa between the N-terminal amino group and the amino group of the lysine side chain. Can be done. For example, if the reaction is performed in a low pH range, the aldehyde group and the N-terminal amino group selectively undergo a reductive amination reaction, and N-terminal specific modification with PEG is also possible.
  • vasohibin-1 and vasohibin-2 examples include vasohibin-1 and vasohibin-2.
  • vasohibin refers to vasohibin-1.
  • Vasohibin 1 and Vasohibin 2 are different genes existing on different chromosomes, but the amino acid sequence of the protein encoded by these genes is 58%. Have homology.
  • Vasohibin 1 is a protein encoded by a vasohibin 1 polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by 386th A to 1480th C of SEQ ID NO: 1, and a vasohibin 1 polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. I mean.
  • Vasohibin 1 polynucleotide examples include polynucleotides that can hybridize under stringent conditions with the polynucleotide or a complementary strand thereof, in addition to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions refers to a polynucleotide fragment as a probe and a commonly used method such as colony hybridization, plaque hybridization or Southern blotting.
  • SSC Seline Sodium Citrate: 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate
  • hybridizable polynucleotide refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions.
  • Specific examples of such a polynucleotide include a polynucleotide having at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more homology with the Vasohibin 1 polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1. be able to.
  • the homology is determined by, for example, using a search program BLAST using an algorithm developed by Altschul et al. (The Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)). Can be calculated.
  • the polynucleotide can be prepared according to a known method, for example, according to the method disclosed in WO02 / 090546. It can also be prepared by chemically synthesizing DNA encoding Vasohibin 1 polypeptide based on the amino acid sequence. Chemical synthesis of DNA can be performed using a Shimadzu DNA synthesizer using the thiophosphite method, a Perkin Elmer DNA synthesizer model 392 using the phosphoramidite method, or the like.
  • vasohibin 1 polypeptide in addition to the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a polypeptide having a deletion, addition, insertion or substitution of one or several amino acid residues in the amino acid sequence, and Their derivatives as well as their salts are exemplified.
  • polypeptide derivative means, for example, acetyl derivative, palmitoyl derivative, myristyl derivative, amide derivative, acrylic derivative, dansyl derivative, biotin derivative, phosphate derivative, succinyl derivative, anilide derivative, benzyloxy Carbonyl derivatives, formyl derivatives, nitro derivatives, sulfone derivatives, aldehyde derivatives, cyclized derivatives, glycosyl derivatives, monomethyl derivatives, dimethyl derivatives, trimethyl derivatives, guanidyl derivatives, amidine derivatives, maleyl derivatives, trifluoroacetyl derivatives, carbamyl derivatives, trinitro Examples thereof include phenyl derivatives, nitrotroponyl derivatives, and acetoacetyl derivatives.
  • salt refers to any pharmacologically acceptable salt of a polypeptide or a derivative thereof (including inorganic salts and organic salts), for example, sodium of the polypeptide or a derivative thereof.
  • Salt potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate, organic acid salt (acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate Succinate, fumarate, propionate, formate, benzoate, picrate, benzenesulfonate, etc.).
  • sodium salts, potassium salts, and phosphates are preferable.
  • the polypeptide can be prepared according to a known method, for example, according to the method disclosed in WO02 / 090546, WO2006 / 073052, and the like.
  • a derivative of the above polypeptide can be prepared by a method known in the art.
  • the salt of the said polypeptide can also be easily produced by those skilled in the art by any method known in the art.
  • polyethylene glycol refers to a polymer compound having a structure [polymer of (—CH 2 CH 2 O—)] obtained by polymerizing ethylene glycol.
  • the polyethylene glycol having an N-succinimidyl group in Embodiment 1 is not particularly limited as long as it has an N-succinimidyl group at the end of the polyethylene glycol. From the viewpoint of ease of synthesis and quality, Formula (I):
  • X in the formula (I) represents a divalent organic group, and can be various functional groups from the viewpoint of imparting various physical properties to the resulting PEG-modified product. Specifically, -COCH 2 CH 2 -, - COCH 2 CH 2 CH 2 -, - CH 2 -, - (CH 2) 5 - and others as mentioned, from the viewpoint of stability, - (CH 2) 5- is preferred.
  • n is preferably an integer of 100 to 120 from the viewpoint of average molecular weight.
  • Examples of the compound represented by the formula (I) include monomethoxy PEG-succinyl-NHS, monomethoxy PEG-glutaryl-NHS, monomethoxy PEG-carboxymethyl-NHS, monomethoxy PEG-carboxyheptyl-NHS and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the average molecular weight of the compound represented by the formula (I) is preferably 2000 to 20000, more preferably 4000 to 6000, and further preferably 4500 to 5500.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol is measured by gel filtration chromatography (GPC) or the like.
  • a compound produced by a known method can be used, but a commercially available product may be used.
  • Examples of commercially available products include NOF SUNBRIGHT (registered trademark) CS series, GS series, AS series, HS series, and the like.
  • the polyethylene glycol having an aldehyde group in Embodiment 2 is not particularly limited as long as it has an aldehyde group at the end of polyethylene glycol, but from the viewpoint of ease of synthesis and quality, the formula (II) : CH 3 O— (CH 2 CH 2 O) m—Y—CHO (II) (In the formula, Y represents a divalent organic group, and m represents a positive integer.) The compound represented by these is preferable.
  • Y in the formula (II) represents a divalent organic group, and can be various functional groups from the viewpoint of imparting various physical properties to the resulting PEG-modified product.
  • Y is not particularly limited as long as it is a divalent organic group, but —CH 2 CH 2 — is preferable from the viewpoint of stability.
  • M in the formula (II) is preferably an integer of 100 to 800 from the viewpoint of the average molecular weight.
  • Preferable examples of the compound represented by the formula (II) include monomethoxy PEG-ethylene aldehyde and the like.
  • the average molecular weight of the compound represented by the formula (II) is preferably 35000 or less, more preferably 4500 to 35000, further preferably 4750 to 32500, and further preferably 5000 to 30000 from the viewpoint of maintaining an angiogenesis inhibitory action.
  • the reaction is carried out under acidic conditions, specifically, preferably at a pH of 3.0 to 4.0, more preferably at a pH of 3.00 to 4.00, even more preferably at a pH of 3.25 to 3.75, and even more preferably at a pH of 3.40 to 3.60. Done.
  • the buffers used for the reaction under the pH conditions in the above range include acetate buffer (acetic acid solution / sodium acetate solution), citrate buffer (citric acid / sodium citrate solution), phosphate- Examples include citrate buffer (disodium hydrogen phosphate / citric acid).
  • acetate buffer acetic acid solution / sodium acetate solution
  • citrate buffer citric acid / sodium citrate solution
  • phosphate- Examples include citrate buffer (disodium hydrogen phosphate / citric acid).
  • Vasohibin exhibits high solubility (solubility (25 ° C., pH 3.5): 3 mg / mL or more), and NHS-PEG also exhibits high solubility.
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably 25 to 50 mM from the viewpoint of buffering action and ease of subsequent purification operation.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 20 to 50 ° C, more preferably 30 to 40 ° C.
  • the reaction time cannot be generally determined depending on the reaction conditions, for example, when the reaction is carried out at 30 to 40 ° C., it is preferably 1 to 4 hours, more preferably 3 to 4 hours.
  • the molar ratio of NHS-PEG to vasohibin is preferably 350/1 to 450/1, more preferably 375/1 to 425/1, and further preferably 390/1 to 410/1. Since the number of PEG modifications, that is, the number of PEG addition molecules per vasohibin can be controlled by the amount of NHS-PEG added, the concentration of vasohibin, etc., when increasing the number of modifications, NHS-PEG What is necessary is just to increase the addition amount, ie, to enlarge the said molar ratio, or to make a bathohibin density
  • the reaction is performed between the N-terminal amino group of vasohibin and the amino group of the lysine side chain.
  • it is performed in a low pH range. Specifically, it is preferably performed at pH 3.0 to 6.0, more preferably at pH 3.00 to 6.00, further preferably at pH 4.00 to 6.00, and further preferably at pH 4.75 to 5.25.
  • the buffers used for the reaction under the pH conditions in the above range include acetate buffer (acetic acid solution / sodium acetate solution), citrate buffer (citric acid / sodium citrate solution), phosphate- Examples include citrate buffer (disodium hydrogen phosphate / citric acid).
  • vasohibin exhibits high solubility [solubility (25 ° C., pH 5.0): 1 mg / mL or more], and CHO-PEG also exhibits high solubility.
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably 25 to 200 mM from the viewpoint of buffer action and ease of subsequent purification operation.
  • a reducing agent such as sodium cyanoborohydride is preferably added.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 3 to 25 ° C, more preferably 3 to 5 ° C.
  • the reaction time cannot be generally determined depending on the reaction conditions, for example, when the reaction is carried out at 3 to 5 ° C., it is preferably 10 to 20 hours, more preferably 15 to 17 hours.
  • the molar ratio of CHO-PEG to vasohibin is preferably 200/1 to 4/1, and more preferably 50/1 to 15/1.
  • the number of PEG modifications that is, the number of PEG addition molecules per vasohibin molecule can be controlled by the amount of CHO-PEG added, the concentration of vasohibin, etc. What is necessary is just to increase the addition amount, ie, to enlarge the said molar ratio, or to make a bathohibin density
  • the amount of CHO-PEG added may be reduced, that is, the molar ratio may be reduced, or the bathohibin concentration may be reduced. If the reaction is carried out in the low pH range, PEGylation can be carried out on the N-terminal amino group of bathohibin by reacting at such a molar ratio.
  • the position where PEG is bound in the modified form of the obtained embodiment 1 Specifically, among the amino acid sequences of Vasohibin 1 polypeptide, SEQ ID NO: 2, 5, 6, 79, 83, 90, 103, 145, 146, 158, 162, 168, 194, 229, 255, 256 258, 276, 292, 304, 307, 316, 319, 320, 347, 348 and the 353rd lysine residue, and at least one selected from the group consisting of N-terminal amino acid residues.
  • the binding position of PEG can be determined by a conventionally known method such as a peptide mapping method.
  • the modified vasohibin of embodiment 1 of the present invention may be modified according to the number of PEG binding molecules to one molecule of vasohibin, for example, a modification in which two molecules of PEG are bound, a modification in which three molecules are bound, a modification in which four molecules are bound, and a five molecule binding.
  • the number of PEG-bound molecules in the modified bathohibin of aspect 1 is calculated by the method described in Examples described later.
  • CHO-PEG binds to the amino group of the N-terminal amino group and the lysine side chain.
  • the reaction for obtaining the modified product of Embodiment 2 is performed in a low pH range, the modification of Embodiment 2 is performed.
  • the position where PEG is bonded in the body is only the N-terminal amino acid residue.
  • the solubility of the modified vasohibin in both aspects 1 and 2 in the vicinity of neutrality is improved. 1 mg / mL or more, preferably 5 mg / mL or more.
  • the modified vasohibin of aspect 1 is stable in the blood because the glomerular filtration efficiency and the efficiency of passing between cells decrease due to the increase in molecular weight due to PEGylation, and the resistance to protease is acquired.
  • Good properties Specifically, for example, the half-life in mouse blood is preferably 1 hour or longer, more preferably 4 hours or longer.
  • the half life in mouse blood can be measured by the following procedure. First, 0.1 mg (0.3 to 0.4 mL) of the vasohibin modified form of embodiment 1 is administered from the tail vein of a mouse in the amount of protein, and blood is collected from the heart over time immediately after administration.
  • the present invention also provides a method for producing a modified vasohibin comprising a step of reacting polyethylene glycol having an N-succinimidyl group (NHS-PEG) with vasohibin under acidic conditions.
  • a method for producing a modified vasohibin comprising a step of reacting polyethylene glycol having an N-succinimidyl group (NHS-PEG) with vasohibin under acidic conditions.
  • a solution containing 0.6 to 0.9 mg / mL of vasohibin is prepared using an acetate buffer (pH 3.50), and a polyethylene glycol (NHS-containing N-succinimidyl group) is prepared there.
  • An example is an embodiment in which 400 mol of PEG) is added per mol of vasohibin and the mixture is reacted at 37 ° C. with stirring for 1 to 4 hours.
  • the obtained reaction product may be subjected to gel filtration purification or may be concentrated.
  • the preparation of the bathohibin-containing solution is preferably pH 3.0 to 4.0, more preferably pH 3.00 to 4.00, and further preferably pH 3.25 to allow the reaction of NHS-PEG and bathohibin to be under acidic conditions. It is desirable to use a buffer of 3.75, more preferably pH 3.40-3.60.
  • a preparation for modified vasohibin comprising a plurality of modified vasohibin according to aspect 1, wherein the number of PEG molecules bound to one molecule is different.
  • modified vasohibin preparations include 2 to 7 molecules of PEG per protein molecule obtained by reacting NHS-PEG and vasohibin in a molar ratio (NHS-PEG / vasohibin) 400/1.
  • a modified vasohibin preparation comprising the modified vasohibin of aspect 1 may be mentioned.
  • the thus-prepared modified vasohibin is prepared by known methods such as gel filtration, ion exchange column chromatography, hydrophobic column chromatography, reverse phase column chromatography, affinity chromatography, salting out, crystallization, and heating.
  • the desired modified bathohibin can be obtained by performing fractionation, purification, and the like.
  • the modified bathohibin is modified with polyethylene glycol, stability in vivo is improved. As a result, it is presumed that the angiogenesis inhibitory effect of bathohibin can be exerted more in vivo, and therefore it is suitably used for diseases requiring angiogenesis inhibitory action. Therefore, the present invention further provides a pharmaceutical composition containing the modified bathohibin of the present invention.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include those prepared by combining the modified vasohibin of the present invention with a known pharmaceutical carrier.
  • the modified vasohibin the modified vasohibin of aspect 1 alone, the modified vasohibin of aspect 2 alone, or the modified vasohibin of aspects 1 and 2 may be used.
  • Production of the pharmaceutical composition of the present invention is usually carried out by blending the modified vasohibin of the present invention with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and optionally, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, Add stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc., solids such as tablets, granules, powders, powders, capsules, etc., and liquids such as normal solutions, suspensions, emulsions, etc. It can be. Moreover, it can also be used as a dried product which can be made liquid by adding an appropriate carrier before use, and other external preparations.
  • the pharmaceutical carrier can be selected according to the administration form and formulation form of the pharmaceutical composition, and is not particularly limited.
  • the pharmaceutical compositions in various preparation forms as described above can be appropriately produced by conventional methods using known pharmaceutical carriers and the like.
  • the content of the modified vasohibin of the present invention in such a pharmaceutical composition may be an amount that allows the expression of the desired effect of the present invention to be obtained in consideration of its administration form, administration method, etc. It is not limited.
  • the content of the modified bathohibin of the present invention in the pharmaceutical composition of the present invention is usually about 1 to 100% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered by an appropriate administration method according to the preparation form.
  • administration method There is also no particular limitation on the administration method, and for example, it can be administered by internal use, external use or injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, or the like.
  • external use for example, as an external preparation such as a suppository. And may be administered by the appropriate administration method.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set according to the formulation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptom of the patient to whom the composition is administered, and is not constant. Further, the administration may be performed once or divided into several times within one day within a desired dose range. The administration period is also arbitrary.
  • the disease requiring an anti-angiogenic action as long as it is a disease that exhibits a therapeutic effect by inhibiting the progression of angiogenesis.
  • arteriosclerosis, rheumatism, age-related macular degeneration, and angiogenesis Related diabetic retinopathy or cancer is exemplified.
  • the present invention also provides a method for treating a disease requiring an angiogenesis inhibitory action, comprising administering an effective amount of a modified bathohibin to a subject.
  • the subject is preferably a human who needs an anti-angiogenic action, but may be a pet animal or the like.
  • the effective amount in the present specification means that when a modified vasohibin is administered to the subject, the modified vasohibin that exhibits an angiogenesis inhibitory effect compared to a subject not administered with the modified vasohibin Is the amount.
  • the specific effective amount is appropriately set according to the administration form, administration method, purpose of use, age, weight, symptom, etc. of the subject, and is not constant.
  • an effective amount of a modified vasohibin may be administered to the subject as it is, and a vasohibin modified preparation or a pharmaceutical composition as described above may be used. It may be administered as a pharmaceutical.
  • a vasohibin modified preparation or a pharmaceutical composition as described above may be used. It may be administered as a pharmaceutical.
  • the administration method For example, what is necessary is just to administer by oral administration, injection, etc. similarly to said pharmaceutical composition.
  • the disease targeted by the pharmaceutical composition of the present invention can be treated.
  • the effect of treating a disease that develops by angiogenesis can be exhibited.
  • room temperature means 25 ° C. unless otherwise specified.
  • Preparation Example 1 Preparation of vasohibin 1 ⁇ Construction of vasohibin 1 expression strain> Based on a vasohibin 1 polynucleotide (base sequence from 386 to 1480 of SEQ ID NO: 1), it can be expressed in E. coli by methods well known to those skilled in the art (Current Opinion in Biotechnology, 6,494-500 (1995), etc.).
  • Vh1 The vasohibin 1 (Vh1) gene changed to a suitable codon was introduced into the pET-32 LIC / Xa vector (Novagen) for thioredoxin (Trx) fusion expression, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed (BL21 ( DE3) / TrxVh1-pET32).
  • LB medium (1.0% Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 0.5% NaCl, 50 ⁇ g / mL ampicillin, pH 7.0
  • LB medium (1.0% Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 0.5% NaCl, 50 ⁇ g / mL ampicillin, pH 7.0
  • 3L of main culture medium (4.0% glycerol, 2.4% Bacto yeast extract, 1.2% Bacto tryptone, 1.25% K 2 HPO 4 , 0.23% KH 2 PO 4 , 500 ⁇ g / mL polypropylene glycol # 2000, 50 ⁇ g / mL ampicillin, pH 7 .0) was inoculated with 1% of the pre-cultured culture solution in a 5 L culture tank and cultured at 37 ° C. for 22 hours. Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added so that the final concentration would be 1 mM when the OD 650 value reached 4-5 after the start of culture.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • TrxVh1 which is a fusion protein of thioredoxin (Trx) and Vh1 was confirmed by SDS-PAGE analysis.
  • TrxVh1 The culture completion solution was collected by centrifugation (10,000 g, 30 min) and washed with a suspension buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.6). The cells were disrupted (55 Pa, 5 times) using a high-pressure homogenizer, then centrifuged (10,000 g, 30 min), and further washed with the same buffer to obtain an insoluble fraction.
  • a suspension buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.6
  • the cells were disrupted (55 Pa, 5 times) using a high-pressure homogenizer, then centrifuged (10,000 g, 30 min), and further washed with the same buffer to obtain an insoluble fraction.
  • the obtained fraction is solubilized with a solubilization buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 7 M Guanidine-HCl, pH 8.0), and the insoluble fraction is centrifuged. (72,000 g, 30 min), and then subjected to Ni Chelating Sepharose column ( ⁇ 16 mm ⁇ 125 mm) previously equilibrated with the same solubilization buffer.
  • a solubilization buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 7 M Guanidine-HCl, pH 8.0
  • the non-adsorbed fraction was washed with a washing buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 8 M Urea, pH 8.0), and then eluted buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M Elution was performed with NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 300 mM imidazole, 8 M Urea, pH 8.0).
  • the flow rate during adsorption, washing and elution was 1.0 mL / min, and all operations were performed at room temperature.
  • the eluted fraction was monitored by SDS-PAGE, and the TrxVh1 fraction was collected.
  • TrxVh1 obtained as described above was dialyzed against glycine buffer (20 mM Glycine-HCl, pH 3.5), then Factor Xa (Novagen) cleavage buffer (final concentration: 50 mM Tris-HCl, It was diluted with 100 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 , pH 8.0) to 0.5 mg / mL.
  • Factor Xa was added to a final concentration of 2 U / mL, and limited digestion was performed at 25 ° C. for 1 h.
  • the precipitate fraction that appears at the end of the reaction is collected by centrifugation (70,000 g, 30 min), and then solubilized buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 7 M Guanidine-Cl, pH 8 0.0) and applied to a Ni Chelating Sepharose column ( ⁇ 16 mm ⁇ 125 mm) previously equilibrated with the same solubilization buffer.
  • solubilized buffer 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 7 M Guanidine-Cl, pH 8 0.0
  • the non-adsorbed fraction was washed with a washing buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM imidazole, 8 M Urea, pH 8.0), and then eluted buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M Elution was performed with NaCl, 1 mM PMSF, 5 mM 2-mercaptoethanol, 300 mM imidazole, 8 M Urea, pH 8.0).
  • the flow rate during adsorption, washing and elution was 1.0 mL / min, and all operations were performed at room temperature.
  • the eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE, and the Vh1 fraction was collected, dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and purified by reprecipitation. Further, the precipitated Vh1 was dissolved in an ion exchange column buffer (25 mM sodium phosphate, 4 M Urea, pH 7.2) and applied to an anion exchange column (Q Sepharose, ⁇ 16 mm ⁇ 140 mm) equilibrated with the same buffer. Vh1 was eluted with an elution buffer (25 mM sodium phosphate, 4 M Urea, 1 M NaCl, pH 7.2). The flow rate was 2.0 mL / min, and all operations were performed at room temperature. The eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE, and the Vh1 fraction was collected and dialyzed against an acetate buffer (20 mM sodium acetate, pH 3.5).
  • Example 1 Preparation of Polyethylene glycol (PEG) Modified Vh1 (Modified Form of Aspect 1) [Modification of Vh1 with Polyethylene Glycol with N-succinimidyl Group (NHS-PEG)] ⁇ Preparation of PEG (NHS) -Vh1>
  • the acetate buffer solution of Vh1 obtained in Preparation Example 1 was adjusted to a final concentration of 0.6 to 0.9 mg / mL.
  • NHS-PEG SUNBRIGHT (registered trademark) ME-050HS, manufactured by NOF) with an average molecular weight of 5000 was added to this Vh1 solution at a molar ratio of 10, 100, and 400 times with respect to Vh1, respectively, and reacted at 37 ° C for 4 hours.
  • reaction solution pH 3.50 Reaction solution pH 3.50.
  • the reaction-finished solution was immediately subjected to gel filtration purification using a Sephacryl S200 packed column (column size: ⁇ 16 mm x 600 mm (120 mL), flow rate: 1.0 mL / min) equilibrated with acetate buffer (20 mM sodium acetate, pH 3.5). Went.
  • FIG. 1 shows that when NHS-PEG is reacted with Vh1 at a molar ratio of 400 times, a high molecular weight reactant is obtained.
  • NHS-PEG was reacted with Vh1 at a molar ratio of 10 and 100 times, it was confirmed that unreacted Vh1 remained in addition to the high molecular weight product.
  • solubility of PEG-Vh1 was measured by protein quantification using the Bradford method. As a result, the solubility (25 ° C.) was 6.5 mg / mL or more at pH 7.4 (PBS). As a reference example, the solubility of Vh1 (unmodified product) was also measured by the Bradford method. As a result, most of Vh1 was precipitated when dialyzed against pH 7.4 (PBS), and the protein concentration in the supernatant of centrifugation (70,000 g, 30 min) was below the detection limit of 0.01 mg / mL.
  • Test Example 1 Evaluation of PEG (NHS) -Vh1 (in vitro) ⁇ Angiogenesis inhibitory activity> Evaluated in an anti-angiogenesis assay using mouse cornea.
  • vascular endothelial growth factor (VEGF) that induces angiogenesis is administered to the cornea of mice, and at the same time, Vh1 (unmodified) and PEG (NHS) -Vh1 added at the same time.
  • PEG (NHS) -Vh1 obtained in Example 1 with VEGF (80 ng) only, VEGF (80 ng) and Vh1 (4 ng) or VEGF (80 ng) on the cornea of BALB / c mice purchased from Charles River Japan Hydron pellet (IFN Science) impregnated with 4 ng (protein equivalent) was transplanted under anesthesia. Seven days after transplantation, the cornea was peeled off, and the area of blood vessels newly formed in the cornea was measured with a photometer. To the control group, an acetate buffer (20 mM sodium acetate, pH 3.5) was administered. The results are shown in FIG.
  • the amount of Vasohibin in plasma collected from mice was calculated using the ELISA method. Specifically, assay buffer (0.5% BSA, 0.05% Tween 80, 10 ⁇ g / mL ⁇ -globullin and 0.1% ProClin150, 100 mM PBS, pH 7.0) was added in advance to anti-vasohibin antibody (VR1-12E7, literature: BBRC® 2006, 342, p640-646) 25 ⁇ L of each well was added to a solid phase immunoplate. Next, 25 ⁇ L of standard vasohibin prepared with a plasma sample or assay buffer was added, HRP-labeled anti-vasohibin antibody (VC-12F6) Fab ′ was added, and the plate was agitated.
  • assay buffer 0.5% BSA, 0.05% Tween 80, 10 ⁇ g / mL ⁇ -globullin and 0.1% ProClin150, 100 mM PBS, pH 7.0
  • anti-vasohibin antibody VR1-12E7,
  • each well was washed 3 times with physiological saline containing 0.01% Tween20 and 0.05% ProClin150, and 100 ⁇ L of each well was added to TMB solution (Colorburst Blue, manufactured by ALerCHEK) and stirred. Thereafter, it was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 0.5N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • TMB solution Colorburst Blue, manufactured by ALerCHEK
  • PEG (NHS) -Vh1 has greatly improved stability in blood compared with Vh1, and the concentration at the time of administration is maintained even after 240 minutes, and the residual rate is after 60 minutes. 91% and 91% even after 240 minutes, and the blood half-life was 4 hours or more.
  • Test Example 2 Evaluation of PEG (NHS) -Vh1 (in vivo) ⁇ Tumor growth inhibitory activity (1)> BALB / c mice ( ⁇ , 7-9 weeks old) purchased from Charles River, Japan, 90% Matrigel (purchased from BD Biosciences) and 10% of the PEG (NHS) obtained in Example 1 -Vh1 (final protein concentration in 0.8,8,80 ⁇ g / mL) or 0.05mL (1 ⁇ 10 6 cells) previously mixed mice Jingankabu the (Renca) in dorsal skin with a composition containing 10% PBS transplantation On day 11 after transplantation, tumors were collected and weighed (6 mice in each group). A composition containing 10% Vh1 (unmodified) was also prepared in the same manner.
  • the tumor growth inhibitory activity (%) was calculated by setting the tumor growth inhibitory activity of the PBS administration group to 0% and the tumor growth inhibitory activity at which the tumor weight after administration was 0 mg to 100%. .
  • the results are shown in Table 1.
  • the result of the significant difference test based on the PBS administration group is also shown.
  • Table 1 shows that the group transplanted with PEG (NHS) -Vh1 showed a tumor growth inhibitory effect in a concentration-dependent manner, and in particular, PEG (NHS) -Vh1 was administered at a protein concentration of 80 ⁇ g / mL. In the group, 53% growth inhibitory effect was observed.
  • ⁇ Tumor growth inhibitory activity > BDF1 mice purchased from CLEA Japan ( ⁇ , 7-9 weeks old) were mixed with 90% Matrigel (purchased from BD Biosciences) and 10% of the PEG (NHS) -Vh1 obtained in Example 1 (final) Mouse lung cancer strain (Lewis) premixed with a composition containing 0.8%, 8, 80 ⁇ g / mL (protein concentration) or 10% PBS is transplanted into the back skin 0.05 mL (1 ⁇ 10 6 ), and after transplantation On day 8, tumors were collected and weighed (5 mice in each group). A composition containing 10% Vh1 (unmodified) was also prepared in the same manner.
  • the tumor growth inhibitory activity (%) was calculated by setting the tumor growth inhibitory activity of the PBS administration group to 0% and the tumor growth inhibitory activity at which the tumor weight after administration was 0 mg to 100%. .
  • the results are shown in Table 2. In addition, the result of the significant difference test based on the PBS administration group is also shown.
  • PEG (NHS) -Vh1 has angiogenesis inhibitory activity.
  • PEG modification was performed using Vh1 obtained in Preparation Example 1.
  • a final concentration of 25 ⁇ M VH1, 100 mM sodium acetate (pH 5.0), 1 mM CHO-PEG, and 8 mM sodium cyanoborohydride was reacted at 4 ° C. for 16 hours.
  • the reaction was stopped by dialysis against 50 mM sodium acetate (pH 5.0).
  • the CHO-PEG used has a molecular weight of 5,000 (5K-CHO-PEG), 10,000 (10K-CHO-PEG), 20,000 (20K-CHO-PEG), 30,000 (30K-CHO-PEG), 40,000 (40K-CHO -PEG), branch type 40,000 (b40K-CHO-PEG), SUNBRIGHT ME-050AL, SUNBRIGHT ME-100AL, SUNBRIGHT ME-200AL, SUNBRIGHT ME-300AL, SUNBRIGHT ME-400AL2, and GL2-400AL3 all made by NOF)
  • the type and reaction purification conditions were all the same as described above.
  • Test Example 3 Evaluation of PEG (CHO) -Vh1 (in vivo) ⁇ Tumor growth inhibitory activity> BALB / c mice purchased from Charles River, Japan ( ⁇ , 7-9 weeks old), 90% Matrigel (purchased from BD Biosciences), and 10% of the PEG (CHO) ⁇ obtained in Example 2
  • the tumor growth was significantly suppressed in the group transplanted with Vh1 modified with CHO-PEG having a molecular weight of 5K-30K.
  • the modified bathohibin of the present invention has high solubility in the vicinity of neutrality, it is suitably used for the treatment of diseases that require an anti-angiogenic effect.
  • Sequence number 1 of a sequence table is a vasohibin 1 polynucleotide and polypeptide encoded there.
  • Sequence number 2 of a sequence table is a vasohibin 1 polypeptide.

Abstract

　(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である、及び(２)血管新生抑制作用を有する、を満たすポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体。本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が高いことから、血管新生抑制効果を要する疾患の治療等に好適に用いられる。

Description

バソヒビン修飾体
　本発明は、バソヒビン修飾体に関する。より詳しくは、特定の活性型ポリエチレングリコールを用いて修飾されたバソヒビン修飾体、その製造方法、及び該バソヒビン修飾体を含有する修飾体調製物、医薬組成物、ならびに、該バソヒビン修飾体、修飾体調製物、医薬組成物を投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法に関する。
　ポリエチレングリコール(polyethylene glycol：PEG)は、無毒性かつ非免疫原性の高分子であり、用途に応じてサイズや側鎖構造を変化させることができるという特徴を有する。この特徴を利用して、近年、生体内での安定性が悪いタンパク質の薬物動態特性や免疫特性を改善する方法として、目的タンパク質へのPEG修飾が注目されている。
　例えば、非特許文献１には、FDAに認可されたり、臨床試験が行われたりしている種々のPEG修飾薬物が報告されている。また、非特許文献２には、タンパク質のPEG修飾に関する種々の方法が記載されており、そのうち、非特許文献３には、N-succinimide(Ｎ-スクシンイミジル基)を有するPEG(NHS-PEG)を用いるＮ-アシル化反応によるPEG修飾が記載されている。具体的には、pH8.4の中性領域の緩衝液中で、Ｎ-スクシンイミジル基を有するPEGと抗体とを、1、3、6の各モル比(抗体／PEG)で反応させてPEG修飾を行っている。また、非特許文献４のようにアルデヒド基を官能基として有するPEG(CHO-PEG)を用いて還元的アミノ化反応によりタンパク質を修飾する例も報告されている。
　バソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子(ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２等)の刺激により血管内皮細胞に発現し(特許文献１参照)、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する作用を有するポリペプチドである。従って、バソヒビンは、生体内における抗血管新生阻害効果、ひいては抗腫瘍効果を奏する薬物として、適用が期待される。
ＷＯ０２／０９０５４６号パンフレット
C. Simone. Fishburn、Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、10、p1-17 M. J. Roberts, et al.、Advanced Drug Delivery Reviews、2002、54、p459-476 Eizo Sada, et al.、Journal of Fermentation and Bioengineering、1991、71、No.2、p137-139 O. Kinstler, et al.、Advanced Drug Delivery Reviews、2002、54、p477-485
　本発明者らはバソヒビンを調製する過程において、バソヒビンの中性域での溶解性が著しく低いことを見出した。中性pH域での溶解性が悪い場合には不溶化や凝集が発生するリスクが高く、これに伴う投与量の制限や抗原性の問題により医薬品としての応用が困難であり、解決する必要が生じた。
　また、バソヒビンは中性付近での溶解性が低いため、各種ポリエチレングリコールのなかでもＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールによるバソヒビン修飾は、常法に従って行うことが困難であることが判明した。
　本発明の課題は、中性付近における溶解性が向上し、生体内において優れた血管新生阻害効果及び抗腫瘍効果を発揮する、ポリエチレングリコールが結合しているバソヒビン修飾体、その製造方法、及び該バソヒビン修飾体を含有する修飾体調製物、医薬組成物、ならびに、該バソヒビン修飾体、修飾体調製物、医薬組成物を投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンとの反応を、酸性領域で、かつ、ポリエチレングリコールを大過剰で反応させることにより、ポリエチレングリコールが結合したバソヒビン修飾体が得られ、当該修飾によりバソヒビンの生理活性を維持しつつ中性付近での溶解性及び生体内での安定性が著しく向上することを見出した。また、アルデヒド基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンとを反応させることにより、Ｎ末端にのみ特異的にポリエチレングリコールが結合したバソヒビン修飾体が得られ、当該修飾によりバソヒビンの生理活性を維持しつつ中性付近での溶解性が著しく向上することを見出した。これらの修飾がバソヒビンを医薬品として用いるのに極めて優れた上記性質を付与することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕　下記(１)及び(２)を満たす、ポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体、
(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
(２)血管新生抑制作用を有する
〔２〕　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、前記〔１〕記載のバソヒビン修飾体、
〔３〕　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、前記〔２〕記載のバソヒビン修飾体の製造方法、
。
〔４〕　前記〔１〕又は〔２〕記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、バソヒビン修飾体調製物、
〔５〕　アルデヒド基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、前記〔１〕記載のバソヒビン修飾体、
〔６〕　前記〔１〕、〔２〕、又は〔５〕いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、医薬組成物、ならびに
〔７〕　前記〔１〕、〔２〕、又は〔５〕記載のバソヒビン修飾体、前記〔４〕記載のバソヒビン修飾体調製物、前記〔６〕記載の医薬組成物のいずれかを投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法
に関する。
　本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が向上し、生体内において優れた血管新生阻害効果及び抗腫瘍効果を発揮することができるという優れた効果を奏する。また、前記修飾体のなかでも、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールによる修飾体は、前記特性に加えて、血中安定性も向上するという優れた効果も奏する。
図１は、PEG(NHS)-Vh1のゲルろ過精製画分についてSDS-PAGE分析を行った結果を示す図である。Mは分子量マーカー、Lはゲルろ過ロード液、番号はフラクションNo.を示す。 図２は、Vh1とPEG(NHS)-Vh1のMALDI-TOF MS分析を行った結果を示す図である。上段がVh1、下段がPEG(NHS)-Vh1のマスクロマトグラフであり、下段におけるピークトップの数値は分子量を示し、左から、PEGが2分子結合した修飾体(分子量:56664)、3分子結合した修飾体(分子量:67388)、4分子結合した修飾体(分子量:67388)、5分子結合した修飾体(分子量:72200)、6分子結合した修飾体(分子量:78188)、7分子結合した修飾体(分子量:83441)を示す。 図３は、Vh1、PEG(NHS)-Vh1による角膜内血管新生阻害評価の結果を示す図である。 図４は、PEG(NHS)-Vh1の血中安定性評価の結果を示す図である。 図５は、Vh1とPEG(CHO)-Vh1のMALDI-TOF MS分析を行った結果を示す図である。上段がVh1、下段が分子量5,000のCHO-PEGを反応させて得られたPEG(CHO)-Vh1のマスクロマトグラフであり、下段におけるピーク1はPEGが1分子結合した修飾体、ピーク2はPEGが2分子結合した修飾体を示す。 図６は、PEG(CHO)-Vh1のSDS-PAGE分析結果を示す。Mは分子量マーカー、5-40KはPEG(CHO)-Vh1についてVh1の修飾に用いたCHO-PEGの分子量でレーンを示した。b40Kには分岐型で平均分子量40,000のCHO-PEGを用いて修飾したVh1のレーンを示した。
　本発明のバソヒビン修飾体は、バソヒビンにポリエチレングリコールが結合したものであり、
(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
(２)血管新生抑制作用を有する
の特性を有する。このような中性付近における溶解性に優れ、血管新生抑制作用を有するバソヒビン修飾体としては、具体的には、バソヒビンとＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(以下、NHS-PEGと記載することもある)とを、酸性領域で特定のモル比(バソヒビン／NHS-PEG)で反応させることにより得られるもの(態様１のバソヒビン修飾体)、及び、バソヒビンとアルデヒド基を有するポリエチレングリコール(以下、CHO-PEGと記載することもある)とを反応させることにより得られるもの(態様２のバソヒビン修飾体)が挙げられる。なお、本明細書において「バソヒビン修飾体」とはポリエチレングリコールが結合したバソヒビンを意味し、態様１及び２のバソヒビン修飾体が例示される。「バソヒビン未修飾体」とはフリーのバソヒビンのことを意味する。
　本発明において、バソヒビン修飾体の「pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である」とは、バソヒビン修飾体がタンパク質換算で、25℃におけるpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、PBS)に1mg/mL以上の濃度で溶解することを意味する。バソヒビン修飾体の溶解液のタンパク質濃度は例えばブラッドフォード法、BCA法、ローリー法、紫外吸光法などの公知のタンパク質の定量方法により測定できる。なお、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、PBS)とは、pH7.35～7.44範囲内のいずれかのpHを示すPBSが好ましく、pH7.40のPBSがより好ましい。
　本発明において、血管新生抑制活性は、マウスの角膜を用いた抗血管新生アッセイで評価することができる。具体的には、後述の実施例の試験例１に示すように、マウスの角膜に、緩衝液のみ、VEGFのみ、VEGFとバソヒビン未修飾体、VEGFと態様１のバソヒビン修飾体(蛋白質換算でバソヒビン未修飾体と等量)をそれぞれ投与した場合の角膜内に新生した血管面積を測定する。VEGFのみを投与した場合の血管面積から、VEGFとバソヒビン未修飾体を投与した場合の血管面積を差し引いた値をバソヒビン未修飾体の血管新生抑制活性とする。一方、VEGFのみを投与した場合の血管面積から、VEGFと態様１のバソヒビン修飾体を投与した場合の血管面積を差し引いた値を態様１のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性とする。バソヒビン未修飾体の血管新生抑制活性を100％とした場合の、バソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)が20％以上である場合に、態様１のバソヒビン修飾体は血管新生抑制活性を有すると判断する。なお、態様１のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)は、50％以上が好ましく、80％以上がより好ましい。
　また、血管新生抑制活性は、マウスにおける腫瘍増殖抑制アッセイにより評価することもできる。具体的には、後述の実施例の試験例３に示すように、BALB/cマウスの背皮内に、マウス腎癌株(Renca)を90％のマトリジェルと、10％の態様２のバソヒビン修飾体(最終濃度50μg/mL)又はネガティブコントロールであるヒト血清アルブミン(最終濃度50μg/mL)を含有する組成物で予め混和したものを背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後13日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なう。コントロール投与群の腫瘍重量から態様２のバソヒビン修飾体投与群における腫瘍重量を差し引いた値を用いて、コントロール投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％とした場合の腫瘍増殖抑制活性(％)を算出して血管新生抑制活性(％)とする。バソヒビン修飾体の有意な腫瘍増殖抑制活性が認められる場合に、バソヒビン修飾体は血管新生抑制活性を有すると判断する。なお、態様２のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)は、35％以上が好ましく、45％以上がより好ましく、60％以上がさらに好ましい。
　NHS-PEGを用いたタンパク質のPEG修飾は、通常、反応液のpHを中性付近にすることにより活性化したNHS-PEGの電子供与基の求核反応が主にタンパク質のリジン残基のε-アミノ基又はＮ末端アミノ酸残基のα-アミノ基に対して行われて、それにより、Ｎ-スクシンイミジル基が脱離したPEGとタンパク質の複合体が形成される。また、PEGの修飾数は、NHS-PEGの添加量によってコントロールすることができ、例えば、タンパク質1分子に対するPEGの修飾数が1～7分子である場合、反応に供されるNHS-PEGとタンパク質のモル比(NHS-PEG／タンパク質)は、20/1～1/1程度である。しかし、本発明では、バソヒビンの中性付近での溶解性が低い(pH7.4での溶解度：0.01mg/mL以下)ことから、NHS-PEGとタンパク質間の前記反応を、バソヒビンの溶解度が高い酸性領域において、バソヒビン1モルに対して、NHS-PEGを100モル以上添加混合して行うことにより、バソヒビン1分子に対してPEGが2～7分子結合したバソヒビンが得られた。
　一方、CHO-PEGを用いたタンパク質のPEG修飾は、タンパク質のアミノ基に対して還元的アミノ化反応により行うことができ、Ｎ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基とのｐＫａの差を利用することで行うことができる。例えば、低pH域で反応を行えば、アルデヒド基とＮ末端アミノ基とが、選択的に還元的アミノ化反応を起こしてPEGによるＮ末端特異的修飾も可能である。
　態様１及び２のバソヒビン修飾体におけるバソヒビン(Vasohibin)としては、バソヒビン１(Vasohibin-１)及びバソヒビン２(Vasohibin-２)が挙げられるが、本明細書において、バソヒビンとは、バソヒビン１のことをいう。なお、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示されているようにバソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有している。バソヒビン１は配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表される塩基配列からなるバソヒビン１ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるバソヒビン１ポリペプチドのことをいう。
　バソヒビン１ポリヌクレオチドとしては、配列番号１に表される塩基配列からなるポリヌクレオチド以外に、前記ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが例示される。
　ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ(Ｓａｌｉｎｅ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム)溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９８９)(Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ)、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ(１９９４)(Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ)、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９９５)(Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ)などに記載されている方法に準じて行うことができる。
　本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号１で表されるバソヒビン１ポリヌクレオチドと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３－４１０(１９９０))の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度を算出することができる。
　上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６に開示された方法に従って調製することができる。また、アミノ酸配列に基づいて、バソヒビン１ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などを用いて行うことができる。
　バソヒビン１ポリペプチドとしては、配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド、及びそれらの誘導体、ならびにそれらの塩が例示される。
　本明細書中において、「ポリペプチドの誘導体」とは、例えば、アセチル誘導体、パルミトイル誘導体、ミリスチル誘導体、アミド誘導体、アクリル誘導体、ダンシル誘導体、ビオチン誘導体、リン酸誘導体、サクシニル誘導体、アニリド誘導体、ベンジルオキシカルボニル誘導体、ホルミル誘導体、ニトロ誘導体、スルフォン誘導体、アルデヒド誘導体、環状化誘導体、グリコシル誘導体、モノメチル誘導体、ジメチル誘導体、トリメチル誘導体、グアニジル誘導体、アミジン誘導体、マレイル誘導体、トリフルオロアセチル誘導体、カルバミル誘導体、トリニトロフェニル誘導体、ニトロトロポニル誘導体、又はアセトアセチル誘導体等が挙げられる。
　本明細書において、「塩」とは、ポリペプチド又はそれらの誘導体の薬理学的に許容される任意の塩(無機塩及び有機塩を含む)をいい、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩(酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等)等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、燐酸塩が望ましい。
　上記ポリペプチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。
　また、上記ポリペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
　本願明細書において、「ポリエチレングリコール」とは、エチレングリコールが重合した構造〔(－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－)の重合体〕を有する高分子化合物をいう。
　態様１におけるＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)としては、ポリエチレングリコールの末端にＮ-スクシンイミジル基を有するものであれば特に限定はないが、合成の容易さ及び品質の観点から、式(I):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
(式中、Ｘは２価の有機基を示し、ｎは正の整数を示す)
で表わされる化合物が好ましい。
　式(I)中のＸは２価の有機基を示し、得られるPEG修飾体に種々の物性を付与する観点から、各種官能基とすることができる。具体的には、－ＣＯＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２－、－(ＣＨ２)５－等が挙げられるが、安定性の観点から、－(ＣＨ２)５－が好ましい。
　式(I)中のｎは、平均分子量の観点から、好ましくは100～120の整数である。
　かかる式(I)で表される化合物としては、モノメトキシPEG－スクシニル－NHS、モノメトキシPEG－グルタリル－NHS、モノメトキシPEG－カルボキシメチル－NHS、モノメトキシPEG－カルボキシヘプチル－NHS等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　式(I)で表される化合物の平均分子量は、2000～20000が好ましく、4000～6000がより好ましく、4500～5500がさらに好ましい。なお、本明細書において、ポリエチレングリコールの平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー(GPC)等により測定される。
　式(I)で表される化合物は、公知の方法で製造されたものを用いることできるが、市販品を用いてもよい。市販品としては、NOF社のSUNBRIGHT(登録商標)CSシリーズ、GSシリーズ、ASシリーズ、HSシリーズ等が挙げられる。
　態様２におけるアルデヒド基を有するポリエチレングリコール(CHO-PEG)としては、ポリエチレングリコールの末端にアルデヒド基を有するものであれば特に限定はないが、合成の容易さ及び品質の観点から、式(II):
ＣＨ３Ｏ－(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍ－Ｙ－ＣＨＯ               (II)
(式中、Ｙは２価の有機基を示し、ｍは正の整数を示す)
で表わされる化合物が好ましい。
　式(II)中のＹは２価の有機基を示し、得られるPEG修飾体に種々の物性を付与する観点から、各種官能基とすることができる。Ｙは２価の有機基であれば特に限定されないが、安定性の観点から、－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。
　式(II)中のｍは、平均分子量の観点から、好ましくは100～800の整数である。
　かかる式(II)で表される化合物の好適例としては、モノメトキシPEG－エチレンアルデヒド等が挙げられる。
　式(II)で表される化合物の平均分子量は、血管新生抑制作用を保持する観点から、35000以下が好ましく、4500～35000がより好ましく、4750～32500がさらに好ましく、5000～30000がさらに好ましい。
　式(II)で表される化合物は、公知の方法で製造されたものを用いることできるが、市販品を用いてもよい。市販品としては、NOF社のSUNBRIGHT(登録商標)ALシリーズ等が挙げられる。
　次に、バソヒビンとNHS-PEGとの反応について説明する。
　反応は、酸性条件下で行われ、具体的には、好ましくはpH3.0～4.0、より好ましくはpH3.00～4.00、さらに好ましくはpH3.25～3.75、さらに好ましくはpH3.40～3.60で行われる。
　なお、上記範囲のpH条件下で反応を行うために使用する緩衝液としては、酢酸緩衝液(酢酸溶液／酢酸ナトリウム溶液)、クエン酸緩衝液(クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液)、リン酸－クエン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム／クエン酸)等が挙げられる。これらの緩衝液において、バソヒビンは高い溶解性〔溶解度(25℃、pH3.5)：3mg/mL以上〕を示し、また、NHS-PEGも高い溶解性を示す。なお、緩衝液の濃度は特に限定はないが、緩衝作用と以後の精製操作の容易さの観点から、25～50mMが好ましい。
　反応温度は、特に限定はないが、20～50℃が好ましく、30～40℃がより好ましい。反応時間は、反応条件によって一概には決定できないが、例えば、30～40℃で反応を行う場合、好ましくは１～４時間、より好ましくは３～４時間である。
　NHS-PEGとバソヒビンのモル比(NHS-PEG／バソヒビン)は、350/1～450/1が好ましく、375/1～425/1がより好ましく、390/1～410/1がさらに好ましい。なお、PEGの修飾数、即ち、バソヒビン1分子に対するPEGの付加分子数は、NHS-PEGの添加量、バソヒビン濃度等によってコントロールすることができることから、修飾数を増加させる場合には、NHS-PEGの添加量を増加、即ち、前記モル比を大きくしたり、バソヒビン濃度を高くしたりすればよい。また、修飾数を低減させる場合には、NHS-PEGの添加量を低減、即ち、前記モル比を小さくしたり、バソヒビン濃度を低くしたりすればよい。
　バソヒビンとNHS-PEGとの反応後には、公知の方法に従って精製、分画、希釈、濃縮等を行ってもよい。
　次に、バソヒビンとCHO-PEGとの反応について説明する。
　本発明においては、均一な修飾体を得る観点から、さらに部位特異的なPEG化によるバソヒビンへの影響をコントロールする観点から、反応は、バソヒビンのＮ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基とのｐＫａの差を利用してＮ末端に特異的に修飾を行うために低pH域で行われる。具体的には、好ましくはpH3.0～6.0、より好ましくはpH3.00～6.00、さらに好ましくはpH4.00～6.00、さらに好ましくはpH4.75～5.25で行われる。
　なお、上記範囲のpH条件下で反応を行うために使用する緩衝液としては、酢酸緩衝液(酢酸溶液／酢酸ナトリウム溶液)、クエン酸緩衝液(クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液)、リン酸－クエン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム／クエン酸)等が挙げられる。これらの緩衝液において、バソヒビンは高い溶解性〔溶解度(25℃、pH5.0)：1mg/mL以上〕を示し、また、CHO-PEGも高い溶解性を示す。なお、緩衝液の濃度は特に限定はないが、緩衝作用と以後の精製操作の容易さの観点から、25～200mMが好ましい。また還元的アミノ化反応のために、ホウ化水素シアン酸ナトリウム(sodium cyanoborohydride)等の還元剤が添加されることが好ましい。
　反応温度は、特に限定はないが、3～25℃が好ましく、3～5℃がより好ましい。反応時間は、反応条件によって一概には決定できないが、例えば、3～5℃で反応を行う場合、好ましくは10～20時間、より好ましくは15～17時間である。
　CHO-PEGとバソヒビンのモル比(CHO-PEG／バソヒビン)は、200/1～4/1が好ましく、50/1～15/1がより好ましい。なお、PEGの修飾数、即ち、バソヒビン1分子に対するPEGの付加分子数は、CHO-PEGの添加量、バソヒビン濃度等によってコントロールすることができることから、修飾数を増加させる場合には、CHO-PEGの添加量を増加、即ち、前記モル比を大きくしたり、バソヒビン濃度を高くしたりすればよい。また、修飾数を低減させる場合には、CHO-PEGの添加量を低減、即ち、前記モル比を小さくしたり、バソヒビン濃度を低くしたりすればよい。なお、前記低pH域で反応が行われるのであれば、かかるモル比で反応することで、バソヒビンのＮ末端アミノ基にPEG化を行うことができる。
　バソヒビンとCHO-PEGとの反応後には、公知の方法に従って精製、分画、希釈、濃縮等を行ってもよい。
　かくしてバソヒビンにPEGが結合したバソヒビン修飾体が得られる。
　NHS-PEGは、タンパク質のリジン残基のε-アミノ基又はＮ末端アミノ酸残基のα-アミノ基に対して結合することから、得られた態様１の修飾体においてPEGが結合している位置は、具体的には、バソヒビン１ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、配列番号２の５、６、７９、８３、９０、１０３、１４５、１４６、１５８、１６２、１６８、１９４、２２９、２５５、２５６、２５８、２７６、２９２、３０４、３０７、３１６、３１９、３２０、３４７、３４８及び３５３番目のリジン残基ならびにＮ末端のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つである。なお、PEGの結合位置は、ペプチドマッピング法などの従来から知られた方法により分かる。
　本発明の態様１のバソヒビン修飾体は、バソヒビン1分子に対するPEGの結合分子数によって、例えば、PEGが2分子結合した修飾体、3分子結合した修飾体、4分子結合した修飾体、5分子結合した修飾体、6分子結合した修飾体、7分子結合した修飾体等が挙げられ、これらは、単独で、又は２種以上組み合わせて使用してもよい。なお、本明細書において、態様１のバソヒビン修飾体におけるPEGの結合分子数は、後述の実施例に記載の方法により算出される。
　また、CHO-PEGは、Ｎ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基に対して結合するが、本発明においては、態様２の修飾体を得る反応を低pH域で行うため、態様２の修飾体においてPEGが結合している位置は、Ｎ末端アミノ酸残基のみである。
　本発明のバソヒビン修飾体は、態様１及び２のバソヒビン修飾体のいずれもが中性付近での溶解性が向上することから、pH7.4におけるバソヒビン修飾体の溶解度(25℃)は、タンパク質換算で1mg/mL以上であり、5mg/mL以上であることが好ましい。
　また、態様１のバソヒビン修飾体は、PEG化による分子量の増大に起因して糸球体ろ過効率や細胞間を通過する効率が減少することや、プロテアーゼに対する耐性が獲得されるために、血中安定性が良好である。具体的には、例えば、マウス血中での半減期が好ましくは1時間以上であり、より好ましくは4時間以上である。なお、マウス血中での半減期は以下の手順により測定することができる。まず、マウスの尾静脈より、態様１のバソヒビン修飾体をタンパク量で0.1mg(0.3～0.4mL)投与し、投与直後から経時的に心臓より採血を行う。バソヒビンを定量できるELISA法により血漿中のバソヒビン量を算出し、投与直後のバソヒビン量を100％とした場合の残存率を求め、60分後における残存率が50％以上である場合に、マウス血中での半減期が１時間以上であると判断する。同様に240分後における残存率が50％以上である場合、マウス血中の半減期は4時間以上であると判断する。
　本発明は、また、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)と、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、バソヒビン修飾体の製造方法を提供する。
　上記工程の具体例としては、例えば、酢酸緩衝液(pH3.50)を用いて0.6～0.9mg/mL濃度のバソヒビン含有溶液を調製し、そこに、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)をバソヒビン1モルあたり400モル添加して、37℃において、１～４時間攪拌して反応させる態様が挙げられる。得られた反応物は、ゲルろ過精製を行ったり、濃縮したりしてもよい。なお、バソヒビン含有溶液の調製には、NHS-PEGとバソヒビンとの反応が酸性条件下となるよう、好ましくはpH3.0～4.0、より好ましくはpH3.00～4.00、さらに好ましくはpH3.25～3.75、さらに好ましくはpH3.40～3.60の緩衝液を用いることが望ましい。
　また、本発明の別の態様として、１分子に結合するPEGの分子数が異なった複数の態様１のバソヒビン修飾体からなるバソヒビン修飾体調製物を提供する。バソヒビン修飾体調製物の具体例としては、NHS-PEGとバソヒビンをモル比(NHS-PEG／バソヒビン)400/1で反応させることで得られる、タンパク質1分子に対して2～7分子のPEGが修飾した態様１のバソヒビン修飾体からなるバソヒビン修飾体調製物が挙げられる。このようにして得られたバソヒビン修飾体調製物は、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、塩析、結晶化、加熱等の公知の方法による分画、精製等を行うことで、所望のバソヒビン修飾体を得る事が出来る。
　また、バソヒビン修飾体は、ポリエチレングリコールによる修飾を受けているため、生体内での安定性が向上する。それにより、生体内において、バソヒビンが有する血管新生抑制効果をより発揮することができると推定されることから、血管新生抑制作用を要する疾患に好適に用いられる。従って、本発明は、さらに、本発明のバソヒビン修飾体を含有する医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬組成物としては、本発明のバソヒビン修飾体を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。なお、バソヒビン修飾体としては、態様１のバソヒビン修飾体単独で、態様２のバソヒビン修飾体単独で、又は態様１及び２のバソヒビン修飾体を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の医薬組成物の製造は、通常、本発明のバソヒビン修飾体を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、医薬組成物の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。
　上記のような各種製剤形態での医薬組成物は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる医薬組成物における本発明のバソヒビン修飾体の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の医薬組成物中の本発明のバソヒビン修飾体の含有量としては通常１～１００重量％程度である。
　本発明の医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の医薬組成物を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。
　本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該組成物の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
　血管新生抑制作用を要する疾患としては、血管新生の進展を抑制することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症又は癌が例示される。
　本発明はまた、被験体に、有効量のバソヒビン修飾体を投与することを含む、血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法を提供する。
　本明細書中において被験体とは、好ましくは血管新生抑制作用を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。
　また、本明細書中において有効量とは、バソヒビン修飾体を上記被験体に投与した場合に、バソヒビン修飾体を投与していない被験体と比較して、血管新生抑制作用を発揮するバソヒビン修飾体の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。
　本発明の血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法においては、有効量のバソヒビン修飾体をそのまま上記被験体に投与してもよく、また、上記のようなバソヒビン修飾体調製物や医薬組成物等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬組成物と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。
　本発明の治療方法によれば、前記の本発明の医薬組成物の対象となる疾患を治療することができ、例えば、血管新生によって進展する疾患の治療を行う効果が発揮され得る。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。なお、これらの実施例において、室温とは、特に断りのない限り、２５℃を意味する。
調製例１．バソヒビン１の調製
＜バソヒビン１発現株の構築＞
　バソヒビン１ポリヌクレオチド(配列番号１の３８６番目から１４８０番目の塩基配列)を基に当業者にとって周知な方法(Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４９４－５００(１９９５)、等)により大腸菌での発現に適したコドンに変更したバソヒビン１(Vh1)遺伝子をthioredoxin(Trx)融合発現用のpET-32 LIC/Xaベクター(Novagen社製)に導入し、Escherichia coli BL21(DE3)を形質転換した(BL21(DE3)/TrxVh1-pET32)。形質転換株は単一コロニーを単離した後、LB培地(1.0％ Bacto tryptone、0.5％ Bacto yeast extract、0.5％ NaCl、50μg/mL ampicillin、pH7.0)を用いて試験管で37℃、16h培養した。培養後、30％ glycerolを等量添加して-80℃で保管した(バソヒビン発現株保存液)。
＜Vh1発現株の発酵・培養＞
　50mLのLB培地を仕込んだ500mL容三角フラスコに、バソヒビン発現株保存液500μLを添加し、37℃、9h前培養を行った。その後3Lの本培養培地(4.0％glycerol、2.4％ Bacto yeast extract、1.2％ Bacto tryptone、1.25％ K2HPO4、0.23％ KH2PO4、500μg/mL polypropylene glycol #2000、50μg/mL ampicillin、pH7.0)を仕込んだ5L培養槽に前培養した培養液を1％植菌し、37℃で22h培養した。培養開始後OD650値が4～5になれば最終濃度が1mMとなるようにisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を添加した。培養中のpHは28％アンモニア水と35％りん酸を用いてpH7.0に制御した。培養終了後の培養液をサンプリングし、SDS-PAGE分析によってthioredoxin(Trx)とVh1との融合タンパク質であるTrxVh1の発現を確認した。
＜TrxVh1の調製＞
　培養終了液を遠心分離(10,000g、30min)によって集菌し、懸濁緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)、pH7.6)で洗浄した。高圧ホモジナイザーを用いて菌体を破砕(55Pa、5回)した後、遠心分離(10,000g、30min)を行い、さらに同緩衝液で洗浄して不溶性画分を取得した。得られた画分を可溶化緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、7M Guanidine-HCl、pH8.0)で可溶化し、不溶性画分を遠心分離(72,000g、30min)によって除去した後、予め同可溶化緩衝液で平衡化したNi Chelating Sepharose column(φ16mm×125mm)に供した。非吸着画分を洗浄緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で洗い流した後、溶出緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、300mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で溶出した。吸着、洗浄、溶出時の流速は1.0 mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分をSDS-PAGEでモニタリングし、TrxVh1画分を捕集した。
＜Vh1の調製＞
　上記のようにして得られたTrxVh1をグリシン緩衝液(20mM Glycine-HCl、pH3.5)に対して透析した後、Factor Xa(Novagen社製)切断用緩衝液(最終濃度：50mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM CaCl2、pH8.0)で希釈して0.5mg/mLとした。Factor Xaを最終濃度2U/mLとなるように添加し、限定分解を25℃で1h実施した。反応終了時に現れる沈殿画分を遠心分離(70,000g、30min)で回収後、可溶化緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、7M Guanidine-Cl、pH8.0)で可溶化し、予め同可溶化緩衝液で平衡化したNi Chelating Sepharose column(φ16mm×125mm)に供した。非吸着画分を洗浄緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で洗い流した後、溶出緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、300mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で溶出した。吸着、洗浄、溶出時の流速は1.0mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分をSDS-PAGEで分析し、Vh1画分を捕集後、20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で透析し、再沈殿化精製した。さらに沈殿化Vh1をイオン交換カラム用緩衝液(25mM sodium phosphate、4M Urea、pH7.2)で溶解し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム(Q Sepharose、φ16mm×140mm)に供した。Vh1の溶出は、溶出緩衝液(25mM sodium phosphate、4M Urea、1M NaCl、pH7.2)によってグラジェント溶出した。流速は2.0mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分はSDS-PAGEで分析し、Vh1画分を捕集後、酢酸緩衝液(20mM sodium acetate、pH3.5)に対して透析を行った。
実施例１．Polyethylene glycol(PEG)修飾Vh1(態様１の修飾体)の調製〔Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)によるVh1の修飾〕
＜PEG(NHS)-Vh1の調製＞
　調製例１で得られたVh1の酢酸緩衝液溶液を、最終濃度が0.6～0.9mg/mLになるようにした。このVh1溶液に平均分子量5000のNHS-PEG〔SUNBRIGHT(登録商標)ME-050HS、NOF社製〕をVh1に対してモル比でそれぞれ10、100、400倍添加し、37℃、４時間反応させた(反応液pH3.50)。反応終了液は、直ちに酢酸緩衝液(20mM sodium acetate、pH3.5)で平衡化したSephacryl S200充填カラム(カラムサイズ：φ16mm×600mm(120mL)、流速：1.0mL/min)に供してゲルろ過精製を行った。
＜PEG(NHS)-Vh1生成の確認＞
　得られた溶出画分について、SDS-PAGE分析を行った。結果を図１に示す。図１より、Vh1に対してNHS-PEGをモル比400倍濃度で反応させた場合には、高分子量の反応物が得られていることが分かる。一方、Vh1に対してNHS-PEGをモル比10、100倍濃度で反応させた場合には、高分子量の生成物以外に、未反応のVh1が残存することが確認された。
＜PEG(NHS)-Vh1画分の捕集＞
　次に、Vh1に対してNHS-PEGをモル比400倍濃度で反応させて得られた反応液について、紫外吸収測定(Abs 280nm)とSDS-PAGE分析を実施して、NHS-PEGと反応して得られたVh1〔PEG(NHS)-Vh1とする。〕画分を捕集した。捕集したPEG(NHS)-Vh1は、リン酸緩衝液(phosphate-buffered saline、PBS)に対して透析を行い、限外ろ過膜によってタンパク濃縮をした。
＜PEG(NHS)-Vh1のPEG付加分子数＞
　得られたPEG(NHS)-Vh1を、MALDI-TOF MS分析〔Ultraflex II (Bruker社製)、マトリックス：Sinapinic acid〕に供することによってPEG付加分子数を確認した。結果を図２に示す。図２より、反応物には、バソヒビン1分子に対して、PEGが2分子、3分子、4分子、5分子、6分子、7分子それぞれ結合した修飾体が含まれていることが分かった。
＜PEG-Vh1の溶解性＞
　PEG(NHS)-Vh1の溶解性はブラッドフォード法を用いるタンパク質定量によって測定した。その結果、pH7.4(PBS)において6.5mg/mL以上の溶解度(25℃)を示した。なお、参照例として、Vh1(未修飾体)の溶解性もブラッドフォード法で測定した。結果、pH7.4(PBS)で透析するとVh1のほとんどが沈殿し、遠心分離(70,000g、30min)の上清液のタンパク質濃度は0.01mg/mLの検出限界以下であった。
試験例１、PEG(NHS)-Vh1の評価(in vitro)
＜血管新生抑制活性＞
　マウスの角膜を用いた抗血管新生アッセイで評価した。本方法は、マウスの角膜に対して血管新生を誘導する血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)を投与し、その時、同時に加えたVh1(未修飾体)、PEG(NHS)-Vh1がこの血管新生の領域をどこまで抑制するかで血管新生抑制効果を評価するモデルである。
　日本チャールス・リバー社より購入したBALB/cマウスの角膜に、VEGF(80ng)のみ、VEGF(80ng)とVh1(4ng)もしくはVEGF(80ng)と実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(タンパク換算で4ng)を染み込ませたhydron pellet(IFN Science社製)を麻酔下で移植した。移植７日後に角膜を剥離し、角膜内に新生した血管面積をフォトメーターで測定した。対照群には、酢酸緩衝液(20 mM Sodium acetate、pH3.5)を投与した。結果を図３に示す。
　図３より、VEGFのみを投与した場合では、対照と比較し、明らかな血管新生の亢進が確認されるが、VEGFとVh1及びVEGFとPEG(NHS)-Vh1を投与した場合では、強く血管新生抑制効果が観察され、PEG修飾体においても活性が保持されていることが示された。なお、Vh1を投与した場合の血管新生抑制活性を100％とした場合、PEG(NHS)-Vh1を投与した場合の血管新生抑制活性(％)は98％であった。
＜血中安定性＞
　日本チャールス・リバー社より購入したC57BL/6(♀、13週齢)の尾静脈より、Vh1及び実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1をタンパク量で各0.1mg(0.3～0.4mL)投与し、投与直後、10分後、30分後、60分後、240分後にエーテル麻酔下においてEDTA-2K処理した注射筒にて心臓より採血を行った。対照マウスには20mM酢酸緩衝液(pH3.5)を0.3mL投与した(n=3)。
　マウスより採血した血漿中のバソヒビン量は、ELISA法を用いて算出した。具体的には、あらかじめアッセイバッファー(0.5％ BSA、0.05％Tween 80、10μg/mL γ-globullin及び0.1％ProClin150を含む、100mM PBS、pH7.0)を、抗バソヒビン抗体(VR1-12E7、文献：BBRC 2006、342、p640-646)固相イムノプレートに、各ウェル25μL添加した。次に、血漿サンプルあるいはアッセイバッファーで調製した標準用のバソヒビンを25μLずつ添加した後、HRP標識抗バソヒビン抗体(VC-12F6)Fab'を添加し、プレートを攪拌した。4℃にて終夜静置した後、各ウェルを0.01％ Tween20及び0.05％ ProClin150を含む生理食塩水で３回洗浄し、各ウェル100μLのTMB溶液(Colorburst Blue、ALerCHEK社製)を添加し、攪拌後室温にて15分間静置した。0.5N 硫酸を50μL添加することにより反応停止し、450nmにおける吸光度を測定した。各標準バソヒビン(2000、667、222、74、24.7、0fmol/mL)の吸光度から標準曲線を作製して血漿中のバソヒビン量を算出し、投与直後のバソヒビン量を100％とした場合の残存率を求めた。結果を図４に示す。
　図４より、PEG(NHS)-Vh1はVh1に比較して血中での安定性が大きく改善され、240分経過後においてもほぼ投与時の濃度が維持され、残存率は60分経過後で91％、240分経過後においても91％であり、血中半減期が４時間以上であった。
試験例２、PEG(NHS)-Vh1の評価(in vivo)
＜腫瘍増殖抑制活性(１)＞
　日本チャールス・リバー社より購入したBALB/cマウス(♀、7～9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(最終タンパク濃度で0.8、8、80μg/mL)又は10％ PBSを含有する組成物であらかじめ混和したマウス腎癌株(Renca)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後11日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なった(各群6匹)。10％ Vh1(未修飾体)を含有する組成物についても同様の方法での調製を試みたが、Vh1の殆どが沈殿し、サンプルを調製する事が出来ず、Vh1(未修飾体)についての腫瘍増殖抑制活性の測定は出来なかった。得られた測定値の平均値から、PBS投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％として、腫瘍増殖抑制活性(％)を算出した。結果を表１に示す。なお、PBS投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１より、PEG(NHS)-Vh1を混ぜて移植した群においては濃度依存的に腫瘍増殖抑制効果が示されており、なかでも80μg/mLのタンパク濃度でPEG(NHS)-Vh1を投与した群においては53％の増殖抑制効果が認められた。
＜腫瘍増殖抑制活性(２)＞
　日本クレア社より購入したBDF1マウス(♀、7～9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(最終タンパク濃度で0.8、8、80μg/mL)又は10％ PBSを含有する組成物であらかじめ混和したマウス肺癌株(Lewis)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後8日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なった(各群5匹)。10％ Vh1(未修飾体)を含有する組成物についても同様の方法での調製を試みたが、Vh1の殆どが沈殿し、サンプルを調製する事が出来ず、Vh1(未修飾体)についての腫瘍増殖抑制活性の測定は出来なかった。得られた測定値の平均値から、PBS投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％として、腫瘍増殖抑制活性(％)を算出した。結果を表２に示す。なお、PBS投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２より、Lewisに対する増殖抑制効果はRencaに比べ若干弱いものの、PEG(NHS)-Vh1の80μg/mLのタンパク濃度においては45％の有意な増殖抑制効果を示した。
　これらの結果より、PEG(NHS)-Vh1は血管新生抑制活性を有すると判断することができる。
実施例２．Polyethylene glycol(PEG)修飾Vh1の調製(態様２の修飾体)〔アルデヒド基を持ったPEG(CHO-PEG)によるVh1の修飾〕
　事前にVh1に対するCHO-PEGによる修飾反応時のpHを検討した結果、pH5.0付近において最も特異的にVh1のＮ末端をPEG修飾することが可能であることを確認した。
　調製例１で得られたVh1を用いてPEG修飾を行った。PEG修飾反応は、最終濃度が25μM Vh1、100mM sodium acetate(pH5.0)、1mM CHO-PEG、8mM sodium cyanoborohydrideの溶液を4℃、16時間反応させた。反応停止は50mM sodium acetate(pH 5.0)に対して透析することにより行った。その後50mM sodium acetate(pH 5.0)で平衡化したCM sepharoseカラム(GEヘルスケア社製)へロードし、NaCl濃度を30分間かけて0.0Mから0.8Mまで変化させ、PEG修飾Vh1〔PEG(CHO)-Vh1〕を溶出させた。得られたPEG(CHO)-Vh1はPBSに対して透析を行い、最終サンプルとした。また用いたCHO-PEGは、分子量5,000(5K-CHO-PEG)、10,000(10K-CHO-PEG)、20,000(20K-CHO-PEG)、30,000(30K-CHO-PEG)、40,000(40K-CHO-PEG)、branch type 40,000(b40K-CHO-PEG)それぞれSUNBRIGHT ME-050AL、SUNBRIGHT ME-100AL、SUNBRIGHT ME-200AL、SUNBRIGHT ME-300AL、SUNBRIGHT ME-400AL2、GL2-400AL3全てNOF社製)の6種類で、反応精製条件は全て上記と同一で行った。
＜PEG(CHO)-Vh1生成の確認＞
　実施例２で得られたCHO-PEGと反応して得られた修飾Vh1〔PEG(CHO)-Vh1〕におけるＮ末端へのPEGの特異的修飾はMALDI-TOF MS分析〔Ultraflex II(Bruker社製)、マトリックス：Sinapinic acid〕により、1分子修飾体への収束(図５)とペプチドマッピングによるＮ末端フラグメントの消失により確認した。さらに、精製したPEG(CHO)-Vh1はSDS-PAGE分析によって予想される分子量を示すことを確認した(図６)。いずれについてもバンドは1本に収束した。
＜PEG(CHO)-Vh1の溶解性＞
　実施例２で得られたPEG(CHO)-Vh1の溶解性はブラッドフォード法を用いるタンパク質定量によって測定した。その結果、調製したPEG化体はいずれもpH7.4(PBS)において1mg/mL以上の溶解度(25℃)を示した。
試験例３、PEG(CHO)-Vh1の評価(in vivo)
＜腫瘍増殖抑制活性＞
　日本チャールス・リバーより購入したBALB/cマウス(♀、7～9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例２で得られたPEG(CHO)-Vh1(最終タンパク濃度50μg/mL)又は10％のヒト血清アルブミン(最終濃度50μg/mL)を含有する組成物であらかじめ混和したマウス腎癌株(Renca)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後13日目に腫瘍を採取し重量の測定を行ない、試験例２の(１)と同様にして評価を行った(各群5匹、但しPEG(40K-CHO)の群は4匹)。結果を表３に示す。なお、HSA投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　対照群であるHSAを混ぜて移植した場合の腫瘍重量に比べ、分子量5K～30KのCHO-PEGで修飾したVh1を混ぜて移植した群において有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。
　本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が高いことから、血管新生抑制効果を要する疾患の治療等に好適に用いられる。
配列表の配列番号１は、バソヒビン１ポリヌクレオチド及びそこにコードされているポリペプチドである。
配列表の配列番号２は、バソヒビン１ポリペプチドである。

Claims (21)

  1. 　下記(１)及び(２)を満たす、ポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体。
    (１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
    (２)血管新生抑制作用を有する
  2. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、請求項１記載のバソヒビン修飾体。
  3. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させてなる、請求項２記載のバソヒビン修飾体。
  4. 　酸性条件がpH3.0～4.0である、請求項３記載のバソヒビン修飾体。
  5. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンをモル比(ポリエチレングリコール／バソヒビン)350/1～450/1で反応させる、請求項２～４いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  6. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールの平均分子量が4000～6000である、請求項２～５いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  7. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールが、式(Ｉ)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (式中、Ｘは２価の有機基を示し、ｎは正の整数を示す)
    で表わされる化合物である、請求項２～６いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  8. 　バソヒビン1分子に対して、ポリエチレングリコールが2分子～7分子結合してなる、請求項２～７いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  9. 　ポリエチレングリコールが結合する位置が、配列番号２の５、６、７９、８３、９０、１０３、１４５、１４６、１５８、１６２、１６８、１９４、２２９、２５５、２５６、２５８、２７６、２９２、３０４、３０７、３１６、３１９、３２０、３４７、３４８及び３５３番目のリジン残基ならびにＮ末端のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項２～８いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  10. 　マウス血中での半減期が1時間以上である請求項１～９いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  11. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、請求項２～１０いずれか記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
  12. 　酸性条件がpH3.0～4.0である、請求項１１記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
  13. 　Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンをモル比(ポリエチレングリコール／バソヒビン)350/1～450/1で反応させる、請求項１１又は１２記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
  14. 　請求項１～１０いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、バソヒビン修飾体調製物。
  15. 　アルデヒド基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、請求項１記載のバソヒビン修飾体。
  16. 　アルデヒド基を有するポリエチレングリコールの平均分子量が35000以下である、請求項１５記載のバソヒビン修飾体。
  17. 　アルデヒド基を有するポリエチレングリコールが、式(II)：
    ＣＨ３Ｏ－(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍ－Ｙ－ＣＨＯ               (II)
    (式中、Ｙは２価の有機基を示し、ｍは正の整数を示す)
    で表わされる化合物である、請求項１５又は１６記載のバソヒビン修飾体。
  18. 　ポリエチレングリコールが、バソヒビンのＮ末端のアミノ酸残基にのみ結合してなる請求項１５～１７いずれか記載のバソヒビン修飾体。
  19. 　請求項１～１０、１５～１８いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、医薬組成物。
  20. 　血管新生抑制作用を要する疾患の治療に用いられる請求項１９記載の医薬組成物。
  21. 　請求項１～１０、１５～１８いずれか記載のバソヒビン修飾体、請求項１４記載のバソヒビン修飾体調製物、請求項１９又は２０記載の医薬組成物のいずれかを投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法。
     
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