KR20220077590A - Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 요산산화효소-복합체를 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 요산산화효소-복합체에 관한 것이다. 본 출원에서는 비천연 아미노산이 특정 자리에 치환된 요산산화효소와 지속형 단백질이 결합하여, 치료용 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 출원의 요산산화효소는 특정 위치에 선택적으로 지속형 단백질이 결합되어 약물 지속성이 증가되며 종래의 고요산혈증 약물보다 효능이 현저하여 다양한 바이오 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법 {Urate oxidase of Candida Utilis - albumin conjugate, and manufacturing method thereof}
본 출원은 특정 위치에 비천연아미노산이 치환된 Candida Utilis 유래 요산산화효소 생산방법 및 그의 복합체 생산 공정에 관한 것이다. 상기 비천연아미노산을 통하여 알부민을 연결시킴으로써 요산산화효소-복합체 (urate oxidase conjugate)의 제조가 가능하다.
또한, Candida Utilis 유래 요산산화효소를 이용한 알부민 복합체로 지속성 및 안정성이 향상된 요산산화효소-복합체 제조 방법에 관한 것이다.
지난 30년 동안 치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에서 임상적인 성공을 거두어 왔으며, 이는 계속해서 제약 분야의 중요한 성장 동기로 작용하고 있다. 하지만, 치료용 단백질은 뛰어난 약효에도 불구하고 체내 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 파괴되거나 혈중 반감기가 극히 짧아 단 회 투여가 아닌 반복 투여를 하게 되어 면역 원성 등의 부작용이 발생하기 쉽다. 따라서 치료용 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 반복 투여를 피하기 위하여 약효의 지속시간을 연장시키는 것이다. 종래엔 치료용 단백질 의약품의 약효 지속성을 높이기 위해 합성 고분자 polyethylene glycol(PEG) 를 치료용 단백질에 결합하는 방법이 주로 사용되어 왔다. 하지만 무작위적으로 결합된 PEG분자가 치료용 단백질의 활성에 중요한 위치에 결합되어 오히려 치료용 단백질의 효능을 크게 감소시키는 경우가 많았다. 또한, 요산산화효소에 결합된 PEG 분자는 면역반응을 일으킨다는 보고가 많아 요산산화효소의 약효 지속성을 높이기 위해 새로운 결합 파트너에 대한 연구가 필요하다.
약효 지속성을 높이기 위한 치료용 단백질 결합 파트너로 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA)을 이용하는 것은 생체 내에서 치료용 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는 효율적인 방법 중 하나이다. 세포내로 흡수된 HSA는 내피세표 (endothelium)의 FcRn receptor에 결합하여 다시 혈액으로 방출됨으로써 세포 내에서 2주 이상의 긴 반감기를 가질 수 있게 된다. 따라서 HSA는 유전적 결합이나 화학적인 결합으로 치료용 단백질에 연결시킴으로써, 치료용 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 하지만 HSA는 크기가 크기 때문에 직접적으로 치료용 단백질과 결합하게 되면 생산 수율이 낮아지거나 치료용 단백질 활성 저하되는 등의 역효과가 발생한다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 위치 특이적인 단백질 연결 (site-specific protein conjugation)에 의해 해결하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 연결 위치의 유연한 선택 및 특정 위치의 결합은 생산 수율의 문제, 다른 부작용 등에 관계없이 어떤 치료용 단백질도 HSA에 연결되어 사용될 수 있을 것이다.
또한, 혈관에 직접 주입하는 치료용 단백질의 경우 혈액 내 pH 범위에서 효소의 활성을 잃지 않고 유지하는 것이 중요하다. 치료용 단백질이 혈액 내에서 안정화되는 것을 전제된 이후, 알부민과 연결하여 약물의 지속성을 증가시키고 반감기가 늘어날 수 있기 때문이다.
이에 본 발명자들은 몇 개의 미생물 유래의 후보군 중 Candida utilis 유래 요산산화효소가 Aspergillus flavus 유래의 요산산화효소 또는 Arthrobacter globiformis 유래의 요산산화효소보다 효소 활성을 갖는 pH 범위가 보다 상대적으로 넓음을 선행 문헌을 통해 알았다 (The journal of Reumatology. 2002.29(9).1942-1949). 따라서 Candida utilis 유래 요산산화효소를 이용하여 HSA 결합체를 제조하였고, 그 결과로 단백질 치료제의 지속성 및 안정성이 향상된 것을 확인하여 본 출원을 완성시켰다.
US 2016-0160188 A1
Protein Science (2008), 17:1827-1833 Chem Biol Drug Des. 2011 Sep;78(3):353-60
본 출원의 하나의 목적은, 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은, 상기 제조방법에 따른 요산산화효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은, 상기 제조방법에 따른 요산산화효소와 지속형 단백질을 포함하는 요산산화효소-복합체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 요산산화효소와 지속형 단백질을 포함하는 체내 요산 증가로 발병하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원은 요산산화효소 단량체를 제공한다.
상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가진다.
일 구현예에서, 본 출원은 서열번호 1의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 AzF로 치환된 요산산화효소 단량체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의, 200번째 타이로신이 비천연 아미노산인 AzF로 치환된 구조를 가진다.
본 출원은 요산산화효소를 제공한다.
상기 요산산화효소는 위에서 서술된 요산산화효소 단량체 4개가 결합된 형태를 가진다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가진다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소는 각각 독립적으로 요산산화효소 단량체가 서열번호 1의 , 200번째 타이로신이 비천연 아미노산인 AzF로 치환되어 4개의 요산산화효소 단량체가 결합된 구조를 가진다.
본 출원은 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 Uox-연결체를 제공한다.
Uox-[L]n (화학식 1)
상기 Uox는 요산산화효소 단량체이며, L은 링커이다.
일 구현예에서, 상기 Uox는 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine),200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가진다.
상기 Uox와 링커는 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결된다. 상기 L은 티올 잔기와 공유결합을 형성할 수 있는 티올(thiol) 반응기를 포함한다.
상기 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 m은 1 내지 5 중 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는 m=4일 수 있다.
상기 화학식 1의 n은 1 내지 4 중 선택되는 하나 일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 티올 반응기는 말레이미드 (Maleimide; MAL), 또는
아릴프로피오로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles ; APN) 중 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 Uox 는 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine),200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판이 비천연 아미노산인 AzF로 치환된 구조를 가진다.
일 구현예에서, 상기 링커와 요산산화효소 단량체가 결합하는 구조는
Figure pat00001
, 또는
Figure pat00002
중 선택되는 하나일 수 있다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결되며, 상기 구조의 A2는 링커와 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는
Figure pat00003
, 또는
Figure pat00004
일 수 있다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소 단량체와 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)으로 치환된 구조이다. 상기 요산산화효소 단량체와 링커는 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결될 수 있다. 상기 요산산화효소 단량체에는 하나의 링커가 결합할 수 있다.
본 출원은 화학식 2의 구조를 갖는 요산산화효소-복합체를 제공한다.
U-[L-P]n (화학식 2)
이때, U는 요산산화효소 단량체 4개가 결합되어 구성된다.
상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌, 215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa)중 선택되는 하나 이상의 비천연아미노산으로 치환될 수 있다.
상기 화학식 2의 L은 링커이다.
상기 화학식 2의 상기 U와 상기 L은 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결될 수 있다.
상기 화학식 2의 상기 P는 지속형 단백질이다.
일 구현예에서, 본 출원의 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 티로신에 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine(HPG), O-propargly-L-tyrosine(oPa), 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 비천연 아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine (AzF),
인 요산산화효소-복합체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 U와 L은 클릭화학에 의해 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 U와 L은
Figure pat00005
로 연결되며, 상기 구조는 DBCO와 치환된 요산효소의 아자이드가 결합한 구조인 요산산화효소-복합체를 제공한다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결되며, 상기 구조의 A2는 링커와 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 U와 L은
Figure pat00006
로 연결되며, 상기 구조는 BCN과 치환된 요산효소의 아자이드가 결합한 구조인 요산산화효소-복합체를 제공한다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결되며, 상기 구조의 A2는 링커와 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 본 출원은 상기 P는 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함하는 요산산화효소-복합체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 링커는 (CH2O)4 인 요산산화효소-복합체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 링커는
Figure pat00007
, 또는
Figure pat00008
중 선택되는 하나일 수 있다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결되며, 상기 구조의 A2는 인간 혈청 알부민과 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는 티올(thiol) 반응기를 포함하며, 이를 통해 thiol 잔기와 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커와 상기 인간 혈청 알부민은
Figure pat00009
로 연결될 수 있다. 상기 구조는 아릴프로피오로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles :이하 APN으로 통칭) 과 알부민의 시스테인의 티올이 반응하여 결합한 것이다. 상기 구조의 A1은 링커와 연결되며, 상기 구조의 A2는 인간 혈청 알부민과 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커와 상기 인간 혈청 알부민은
Figure pat00010
로 연결될 수 있다. 말레이미드 (MAL)과 알부민의 시스테인의 티올이 반응하여 결합한 것이다. 상기 구조의 A1은 링커와 연결되며, 상기 구조의 A2는 인간 혈청 알부민과 연결 될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소는 1개, 2개 또는 3개의 L-P가 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 요산산화효소는 하나의 요산산화효소 단량체에 하나의 L-P 가 결합된 요산산화효소-복합체를 제공한다.
또한, 본 출원은 상기 요산산화효소-복합체를 제공하기 위한 제조방법을 제공한다.
상기 방법은
제 2항의 요산산화효소를 생산하는 단계,
친화크로마토그래피로 상기 요산산화효소를 분리하는 단계,
상기 요산산화효소를 지속형 단백질과 연결(conjugation)하는 단계, 및
상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함한다.
본 출원에 따른, 요산산화효소-복합체를 제조하는 방법은 유가식 배양 (Fed-batch)과 3단계 크로마토그래피를 이용하여 요산산화효소-복합체를 고수율로 수득하면서 질환의 치료에 적합한 요산산화효소-복합체를 고순도로 제공할 수 있다는 점에서 우수한 장점을 가진다.
일 구현예에서, 상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리함은 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행될 수 있다.
본 출원은 위에서 서술된 요산산화효소-복합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증, 통풍성 신병증, 및 고요산혈증이 특징인 종양용해증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 일 수 있다.
본 출원의 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 단백질에 약물전달체가 효율적으로 연결되어, 약물전달체를 연결하기 어려웠던 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 특정위치에 선택적으로 약물전달체가 결합되어 약효가 유지되고 약물 지속성이 증가되며 면역반응 위험성이 감소하고, 균일한 복합체 생성으로 분리에 용이하여 다양한 바이오 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은, 야생형 요산산화효소 벡터를 도식화한 것이다.
도 2는, 요산산화효소 단량체의 치환될 수 있는 위치의 아미노산 잔기의 용매 접근성에 관한 것이다.
도 3은, 요산산화효소 단량체의 치환될 수 있는 위치의 아미노산 잔기의 용매 접근성에 관한 것이다.
도 4는, 요산산화효소 단량체 내의 최적의 치환 위치를 선택한 것을 도식화한 것이다.
도 5는, QE80L-AmpR-C.Uox-AzF 의 4가지 치환된 형태를 (Tyr163UAG, Phe170UAG, Tyr200UAG 그리고 Trp271UAG)시퀀싱 한 것이다.
도 6은, 야생형 요산산화효소를 NI-NTA 정제 후 확인한 것이다.
도 7은, QE80L-AmpR-C.Uox-AzF 의 4가지 치환된 형태를 (Tyr163UAG, Phe170UAG, Tyr200UAG 그리고 Trp271UAG) SDS PAGE로 확인한 것이다.
도 8은, QE80L-AmpR-C.Uox-AzF 의 4가지 치환된 형태를 (Tyr163UAG, Phe170UAG, Tyr200UAG 그리고 Trp271UAG) 웨스턴 블랏 분석법으로 확인한 것이다.
도 9는, .Uox-WT-optz 서열의 cloning하는 단계를 중간 확인한 결과와, LB 플레이트에 도말 후 콜로니 사진을 찍은 것이다.
도 10은, C.Uox-AzF-optz. 4가지 치환된 형태를 (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG, W271UAG) 시퀀싱 한 것이다.
도 11은, C.Uox-AzF-optz. 4가지 치환된 형태를 (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG, W271UAG) MfeI/HindIII 제한효소와 반응한 것이다. 도 12는, C321.β.)(6xHis-Tag] 의 4가지 치환 형태 (genotype: Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 colony를 사진 찍은 것이다.
도 13은, C321.β의 4가지 치환 형태(Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 의 solubility 및 발현을 확인한 것이다.
도 14는, 치환된 요산산화효소를 Ni-NTA 분리정제 후 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 15는, C.Uox-200AzF의 3반복 분리정제를 확인한 것이다.
도 16은, 각각의 샘플을 3개의 다른 효소로 단백질 서열 커버리지를 분석한 것이다.
도 17은, C.Uox-WT Sequence Coverage를 분석한 것이다.
도 18은, C.Uox-163AzF Sequence Coverage를 분석한 것이다.
도 19는, C.Uox-163AzF PTM 분석한 것이다.
도 20은, C.Uox-163AzF PTM 분석한 것이다.
도 21은, C.Uox-200AzF Sequence Coverage 분석한 것이다.
도 22는, C.Uox-200AzF PTM 분석한 것이다.
도 23은, 요산산화효소-복합체의 제조 과정을 도식화한 것이다.
도 24는, 요산산화효소의 AzF 치환 위치에 따른 C.Uox-HSA의 양이온 교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 25는, 요산산화효소의 AzF 치환 위치에 따른 C.Uox-HSA의 음이온 교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 26은, AzF 치환 위치별 C.Uox-HSA conjugation 수율 비교 및 SDS PAGE로 확인한 것이다.
도 27은, HSA : DBCO-PEG4-APN linker의 몰비율 및 pH 조건에 따른 수율을 비교한 것이다.
도 28은, 반응 pH 에 따른 C.Uox-HSA의 양이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 29는, 반응 pH 에 따른 C.Uox-HSA의 음이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 30은, 반응 pH에 따른 C.Uox-HSA conjugation 수율을 비교한 것이다.
도 31은, 반응 pH 에 따른 C.Uox-HSA의 분리 후 SDS PAGE로 확인한 것이다.
도 32는, 반응 몰 비율에 따른 C.Uox-HSA의 양이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 33은, 반응 몰 비율에 따른 C.Uox-HSA의 음이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 34는, 반응 몰 비율에 따른 C.Uox-HSA conjugation 수율 비교 및 반응 몰 비율에 따른 C.Uox-HSA의 활성을 비교한 것이다.
도 35는, 반응 몰 비율에 따른 C.Uox-HSA의 SDS-PAGE를 확인한 것이다.
도 36은, C.Uox 와 C.Uox-HSA의 양이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 37은, C.Uox-HSA의 음이온교환 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 38은, C.Uox-HSA의 크기배제 크로마토그래피 분리한 것이다.
도 39는, 분리 정제 단계별 산물에 대한 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 40은, C.Uox-HSA의 농도 및 conjugation 수율을 비율로 표기하고, C.Uox-HSA의 활성을 표기한 것이다.
도 41은, C.Uox-HSA conjugation 수율을 표기한 것이다.
도 42는, C.Uox200, C.Uox200-HSA, C.Uox163-HSA의 pI를 분석한 것이다.
도 43은, C.Uox-200AzF의 SEC-HPLC 분석한 것이다.
도 44는, C.Uox-HSA의 SEC-HPLC 분석한 것이다.
도 45는, 고요산혈증 질환동물모델의 군 구성 및 투여 용량을 표기한 것이다.
도 46은, 고요산혈증 모델에서 C.Uox-HSA 투여에 따른 혈중 내 요산 농도에 관한 그래프이다.
도 47은, 고요산혈증 모델에서 C.Uox-HSA 투여에 따른 혈중 내 요소질소 농도에 관한 그래프이다.
도 48은, 고요산혈증 모델에서 C.Uox-HSA 투여에 따른 혈중 내 크레아티닌 농도에 관한 그래프이다.
도 49는, 반감기를 실험하기 위해 사용한 실험군과 C.Uox-WT, C.Uox-HSA(DM), 또는 C.Uox-HSA(DM)를 투여한 군에서의 체내 반감기를 측정한 것이다.
본 명세서에 개시된 내용을 기술하기 위하여, 필요한 경우 용어들이 본 명세서 내에서 정의될 것이다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인정되는 의미를 가질 것이다. 상충되는 경우, 본 명세서의 정의에 의해 해석될 수 있다.
본 출원의 용어 '컨쥬게이트'는 두 개의 단백질이 연결된 복합체 형태로, 서로 다른 단백질을 연결하는 링커 구조도 같이 포함된 구조를 의미한다.
본 출원의 용어 '링커'는 두 개의 단백질을 연결하기 위한 연결체로서의 의미 뿐만 아니라, 화학 반응에 의하여 결합되는 컨쥬게이트 (conjugate)의 구조에 있어 두 단백질을 연결하는 구조를 통칭하는 것이기도 하다.
본 출원의 용어 "알킬렌," "알케닐렌," "알키닐렌," "아랄킬렌," 및 "아릴알킬렌"은 통상적으로 이해되는 탄화수소 사슬 및/또는 방향족 고리를 포함하는 구조의 의미를 가진다. 추가적으로 허용되는 만큼 치환되거나, 또는 헤테로 원자를 포함하는 구조를 모두 포함하도록 의도되었다.
본 출원의 용어 "클릭화학 (click-chemistry)"은 Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의하여, 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학 반응을 설명하기 위해 도입된 화학적 개념이다. 클릭화학은 특정한 반응을 의미하는 것이 아니라, 이러한 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 클릭화학으로 분자들 사이의 결합을 형성하기 위해서는 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 상기 조건은 높은 수득률, 반응 자리에 대한 뛰어난 선택성, 모듈식으로 작동하여 유기적으로 분자가 결합되는 것, 및 열역학적으로 안정화된 방향으로 진행되어 빠르고 정확한 생성물을 만드는 것이다.
본 출원의 용어 "Uox-연결체 (Uox-linker)"란 요산산화효소 단량체에 링커가 결합된 것으로 정의된다. 상기 링커는 연결체의 형태로, 요산산화효소 단량체와 다른 물질을 연결할 수 있다.
본 출원의 용어 "지속형 단백질(long acting protein)"은 체내에서 반감기가 높은 단백질, 고분자 등의 물질로 정의된다. 예를 들어, 지속형 단백질은 혈청 단백질일 수 있다. 혈청단백질은 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 글로불린, 알부민 (albumin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin:HSA) 일 수 있다. 상기 지속형 단백질은 고분자일 수 있다. 상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG), 폴리글루타메이트(polyglutamate), 또는 히알루론산 (hyaluronic acid) 등일 수 있다. 상기 지속형 단백질은 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 부위일 수 있다. 상기 지속형 단백질은 이 외에도 체내에서 반감기가 높은 단백질 또는 고분자 등의 물질로 정의될 수 있으며, 위의 예에 한정하지는 않는다.
본 출원의 용어 "요산산화효소-복합체(urate oxidase-conjugate)"는 요산산화효소 단량체 4개가 결합한 형태에 링커, 지속형 단백질 순으로 연결된 것으로 정의된다.
본 출원의 용어 "고요산혈증 (Hyperuricemia)"이란 혈액에 요산의 농도가 증가되어 있는 질환이다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생한다. 37℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7 mg/dl이다. 그러므로 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 표준편차를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 대부분의 역학 조사에서 남자의 상위 한계는 7 mg/dl, 여자는 6 mg/dl이다. 이러한 이유 때문에 고요산혈증의 실질적인 상위 한계 수준은 7.0 mg/dl 이상인 경우로 정의되고 있다.
1. 요산산화효소
1-1 기능
요산산화효소는 요산을 알란토인(allantoin)으로 산화시키는 기능을 갖는 효소이다. Allantoin은 요산에 비해 용해도가 5 내지 10 배 높아 신장으로 배설되기 쉬우며, 포유동물에 정상적으로 존재하나 인간과 같은 영장류에서는 무의미돌연변이 (nonsense mutation)으로 결핍되어 있다. 인간은 요산산화효소를 생산하지 않기 때문에 요산의 산화가 원활하지 않은 경우 통풍이 발생할 수 있다. 따라서, 요산산화효소는 요산에 의해 발생하는 질병, 대표적으로 통풍을 치료하기 위한 물질로 쓰일 수 있다.
1-2. 형태
요산산화효소는 4개의 동일한 구조의 요산산화효소 단량체가 결합한 형태를 갖는 사량체이다. 상기 단량체는 301개의 아미노산 잔기에 의해 형성되며, 각 단량체는 구조적으로 동등한 두 개의 도메인을 가지고 있다. 상기 단량체의 176번 아르기닌 (arginine) 및 228번 글루타민(glutamine)은 요산과 수소 결합을 하는 것으로 알려져 있다.
1-3. 유래
본 출원의 일 실시형태에서, 요산산화효소는 Candida Utilis 유래 요산산화효소이다. . 이때, 자연계에서 존재하는 Candida Utilis 유래 요산산화효소 단량체의 아미노산 서열은 서열번호 1이다. 다른 실시형태에서, 요산산화효소는 효모 유래 요산산화효소일 수 있다. 다른 실시형태에서, 요산산화효소는 미생물 유래 요산산화효소일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 요산산화효소는 포유류 유래 요산산화효소일 수 있다.
1-4. 본 출원의 요산산화효소
본 출원의 요산산화효소는 요산산화효소 단량체 4개 결합된 형태를 갖는다. 본 출원에서 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것이다.
일 실시형태에서, 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌, 215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 치환된 구조일 수 있다. 바람직하게, 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan) 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가질 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신이 비천연 아미노산으로 치환된 구조일 수 있다.
본 출원의 요산산화효소는 각각 독립적으로 치환된 요산산화효소 단량체 4개가 결합된 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 요산산화효소 단량체의 특정 아미노산 잔기가 치환된 비천연 아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택된 하나 이상 일 수 있다. 바람직하게 상기 치환된 비천연 아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)일 수 있다.
2. 지속형 단백질
본 출원의 지속형 단백질은 체내에서 반감기가 높은 단백질, 고분자 등의 물질을 의미한다.
본 출원의 일 실시형태에서, 지속형 단백질은 혈청 단백질일 수 있다. 혈청단백질은 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 글로불린, 알부민 (albumin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin:HSA) 등이 있으며, 혈청에서 발견되며, 높은 반감기를 갖는다.
본 출원의 다른 일 실시형태에서, 지속형 단백질은 고분자일 수 있다. 상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG), 폴리글루타메이트(polyglutamate), 또는 히알루론산 (hyaluronic acid) 등일 수 있다.
본 출원의 다른 일 실시형태에서, 지속형 단백질은 면역글로불린(immunoglobulin)의 Fc 부위일 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 실시형태에서, 지속형 단백질은 알부민일 수 있다. 이때, 알부민은 통상적으로 지칭되는 알부민을 의미한다. 바람직하게는 상기 알부민은 포유류 유래 알부민일 수 있다. 더 바람직하게는 상기 알부민은 인간혈청 알부민 (Human serum albumin; HSA)일 수 있다. 일 예로, 상기 알부민은 야생형 (wild-type)일 수 있다. 다른 예로, 상기 알부민은 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 출원의 구조식에서 지속형 단백질은 P (long acting protein)로 표시된다.
3. 링커
본 출원에서는 요산산화효소와 알부민을 연결시키기 위한 링커를 포함한다.
본 출원의 구조식에서 링커는 L로 표시된다.
3-1 구조
본 출원의 링커는 요산산화효소와 결합을 형성하기 위한 작용기, 알부민과 결합을 형성하기 위한 작용기 및 두 개의 작용기를 연결하는 구조로 구성된다.
본 출원의 일 실시형태에서, 링커는 요산산화효소와 결합을 형성하기 위한 요산산화효소 단량체에 대한 반응 작용기 (functional group reactive to urate oxidase monomer)를 포함할 수 있다. 상기 요산산화효소 단량체에 대한 반응 작용기는 클릭화학작용기일 수 있다. 상기 클릭화학작용기는 디벤조시클로옥틴 (dibenzocyclooctyne; DBCO), 비시클로노닌 (Bicyclo[6.1.0]nonyne (BCN)), 아자이드, 테트라진, 또는 트렌스시클로옥텐 (transcyclooctene) 중 선택되는 하나 이상 일 수 있다. 바람직하게는 본 출원의 클릭화학작용기는 디벤조시클로옥틴일 수 있다.
본 출원의 일 실시형태에서, 링커는 알부민과 결합을 형성하기 위한 알부민에 대한 반응 작용기를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 반응 작용기는 시스테인 잔기의 티올 (-SH)과 반응하는 것일 수 있다. 바람직하게 본 출원에서는 상기 반응 작용기는 인간 혈청 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올과 반응하는 것일 수 있다.
상기 반응 작용기는 말레이미드 (Maleimide; MAL), 3-아릴프로피올로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles), 할로아세탈 (haloacetal), 피리딜 디설파이드 (pyridyl disulfide), 및 아릴프로피오로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles :이하 APN으로 통칭) 등 통상적으로 사용되는 것을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 반응 작용기가 말레이미드일 경우, 34번 시스테인의 티올과 말레이미드간의 Michael addition 반응을 통해 결합하는 것일 수 있다.
본 출원의 링커는 요산산화효소와 결합을 형성하기 위한 요산산화효소 단량체에 대한 반응 작용기 및 알부민과 결합을 형성하기 위한 알부민에 대한 반응 작용기를 포함한다. 그 외에도, 두 작용기를 서로 연결하는 연결 구조도 포함한다.
본 출원의 일 실시형태에서, 상기 연결 구조는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아랄킬렌, 아릴알킬렌 또는 (CH2O)n을 포함할 수 있다. 상기 n은 1 내지 5일 수 있다. 바람직하게 상기 연결 구조는 (CH2O)n을 일 수 있다. 더 바람직하게, 상기 연결 구조는 (CH2O)4일 수 있다.
4. Uox-연결체 (Uox-linker)
본 출원에서는 요산산화효소 단량체의 특정 아미노산 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 요산산화효소 단량체와 이를 지속형 단백질과 연결시키기 위한 링커가 결합된 형태를 포함할 수 있다. 이하, 본 출원의 Uox-연결체 의 형성에 관여하는 클릭화학 및 결합 반응을 설명한다.
4-1 클릭화학
하기에는 클릭화학에 대한 몇 가지 예시를 서술하였다. 본 출원에서는 하기 예시의 클릭화학을 적절하게 사용하여 Uox-연결체의 구성 요소들을 결합할 수 있다.
(1) 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition) (예시적으로, Cu(I)-촉매 고리화첨가 반응을 포함하며, 종종 "클릭 반응 (click reaction)"으로 일반화되어 지칭됨; Tornoe et al., Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3057-3064 등 참조): 구리 또는 루테늄이 일반적으로 촉매로 사용된다;
[휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가의 모식도]
Figure pat00011
(2) 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction), 예를 들어 정상 전자-요구 디엘스-알더 반응 (normal electron-demand Diels-Alder reaction) 및 역 전자-요구 디엘스-알더 반응 (inverse electron-demand Diels-Alder reaction)을 포함하나 이에 한정되지 않는 고리화첨가 반응임 (예시적으로, 스트레인 유도 고리화첨가 (strain-promoted cycloaddition; SPAAC));
[디엘스-알더 반응 모식도]
Figure pat00012
[디엘스-알더 반응의 예시; TCO와 테트라진]
Figure pat00013
[스트레인 유도 고리화첨가반응의 모식도]
Figure pat00014
[스트레인 유도 고리화첨가반응의 예시; 아자이드와 DBCO]
Figure pat00015
(3) 에폭사이드 (epoxide) 및 아지리딘 (aziridine)과 같은 작은 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응 (Nucleophilic addition);
(4) 활성화된 카르보닐 기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응;
(5) 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응.
[티올과 알켄의 첨가반응]
Figure pat00016
일반적으로 클릭화학은 서로 상보적인 클릭화학작용기를 각각 포함하는 적어도 두 개의 분자를 필요로 한다. 이렇게 서로 반응성을 갖는 클릭화학작용기의 쌍은 "파트너 클릭화학작용기 (partner click-chemistry functional group)"로 명명한다. 일 예로, 아자이드와 시클로옥틴의 스트레인-유도 고리화첨가 반응 (strain-promoted cycloaddition)에 있어 아자이드는 시클로옥틴 및 기타 다른 알킨들의 파트너 클릭화학작용기이다. 본 출원에서 사용되는 예시적인 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨 (strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴 (trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 및 테트라진 (tetrazine)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 그 밖의 클릭화학작용기는 당업자에게 알려진 것을 사용할 수 있다.
4-2 Uox-연결체의 결합 (요산산화효소 단량체와 링커의 결합)
본 출원은 하기의 화학식 1의 구조의 Uox-연결체를 포함한다.
Uox-[L]n (화학식 1)
화학식 1의 Uox 는 요산산화효소 단량체를 의미한다.
상기 화학식 1의 L은 링커를 의미한다.
상기 Uox와 링커는 상기 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결되며,
상기 L은 티올(thiol) 반응기를 포함한다. 따라서, 지속형 단백질과 결합할 때, 이를 통해 thiol 잔기와 결합할 수 있다.
상기 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함하여, 며, 요산산화효소 단량체와 결합하는 작용기와 지속형 단백질과 결합하는 작용기를 연결할 수 있다.
m은 1 내지 5 중 선택되는 하나이며, 바람직하게는 4일 수 있다.
상기 화학식 1의 n은 1 내지 4 중 선택되는 하나일 수 있는 인 것을 특징으로 하는 Uox-연결체 상기 Uox 에 결합할 수 있는 링커는 1 내지 4 중 선택되는 하나 일 수 있다.
상기 화학식 1에 있어 UoX와 L 은 L에 포함되는 요산산화효소에 대한 반응 작용기를 통해 연결된다.
상기 링커는 요산산화효소 단량체와 결합을 형성하기 위한 작용기를 포함한다.
상기 링커와 요산산화효소 단량체의 결합은 상기 링커와 요산산화효소 단량체는 상기 요산산화효소 단량체 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 위치를 통해 연결될 수 있다. 상기 Uox 에 결합할 수 있는 링커는 1 내지 4 중 선택되는 하나 일 수 있다.
본 출원의 일 실시형태에서, 요산산화효소 단량체와 링커는, 1-4 에서 설명된 바와 같이, 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결될 수 있다.
본 출원의 다른 일 실시형태에서, 요산산화효소 단량체와 링커의 연결 구조는 클릭화학에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다.
일 예로, 요산산화효소 단량체와 링커의 연결 구조는 디벤조시클로옥틴 (DBCO)와 아자이드의 반응에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다. 상기 구조는,
Figure pat00017
형태일 수 있다.
상기 구조의 A1은 요산산화효소 단량체와 결합할 수 있다.
상기 구조의 A2는 링커와 결합할 수 있다.
본 출원에서 상기 요산산화효소 단량체의 특정 아미노산 잔기를 치환할 수 있는 비천연 아미노산 AzF는 아자이드를 포함하므로, 예시적으로 상기 결합 구조를 형성하는 데에 사용될 수 있다.
일 예로, 요산산화효소 단량체와 링커의 연결 구조는 BCN과 아자이드의 반응에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다. 상기 구조는,
Figure pat00018
형태일 수 있다.
상기 구조의 A1은 요산산화효소 단량체와 결합할 수 있다.
상기 구조의 A2는 링커와 결합할 수 있다. 상기 A2는 물결표시의 결합으로 연결되어 있는데, 이는 입체 화학 또는 혼합물에서의 두 가지의 입체이성질체를 모두 포함할 수 있음을 의미한다. 물결 선이 앞으로 튀어나오는 형태일 경우 exo-BCN, 들어가는 형태의 경우 endo-BCN이다.
본 출원에서 상기 요산산화효소 단량체의 특정 아미노산 잔기를 치환할 수 있는 비천연 아미노산 AzF는 아자이드를 포함하므로, 예시적으로 상기 결합 구조를 형성하는 데에 사용될 수 있다.
본 출원의 일 실시형태에서,상기 링커는
Figure pat00019
, 또는
Figure pat00020
중 선택되는 하나일 수 있다. 상기 구조의 A1은 요산산화효소 단량체와 연결 될 수 있다.
5. 요산산화효소- 복합체
본 출원에서는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 요산산화효소-복합체를 제공한다.
U-[L-P]n (화학식 2)
화학식 2에 있어, 구성요소 U는 요산산화효소 단량체 4개가 결합한 형태이다.
상기 화학식 2의 L은 링커이다.
상기 화학식 2의 P는 지속형 단백질이다.
상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌, 215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa)중 선택되는 하나 이상의 비천연아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게, 상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan) 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가질 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신이 비천연 아미노산으로 치환된 구조일 수 있다.
상기 U와 상기 L은 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결될 수 있다.
상기 L은 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함하며, m은 1 내지 5 중 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 m은 4일 수 있다.
상기 화학식 2의 n은 1 내지 5일 수 있다. 나아가, n은 1 내지 4일 수 있다. 바람직하게는, n은 1, 2 또는 3 중 선택되는 하나일 수 있다. 이 때, 하나의 요산산화효소 단랑체에는 1개 이하의 L-P가 결합할 수 있다.
본 출원의 일 실시형태에서, P는 지속형 단백질이다. 상기 지속형 단백질은 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 글로불린, 알부민 (albumin), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG) 중 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈청 알부민일 수 있다.
5-1 링커와 인간 혈청 알부민의 연결
상기 화학식 2에 있어 링커과 인간 혈청 알부민 사이의 연결 관계에 관하여 보다 자세히 설명한다. L과 인간 혈청 알부민은 L의 티올에 대한 반응 작용기를 통해 연결된다.
본 출원의 일 실시형태에서, 링커와 인간 혈청 알부민은 상기 인간 혈청 알부민의 시스테인 잔기를 통해 연결될 수 있다. 바람직하게는 34번 시스테인 잔기일 수 있다.
링커와 알부민의 연결 구조는 말레이미드 (Maleimide; MAL), 3-아릴프로피올로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles), 할로아세탈 (haloacetal), 피리딜 디설파이드 (pyridyl disulfide), 및 아릴프로피오로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles :이하 APN으로 통칭) 중 선택되는 하나의 작용기와 알부민의 시스테인 잔기의 반응에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다.
본 출원의 일 예로, 상기 연결 구조는
Figure pat00021
이며, 상기 연결 구조는 APN과 알부민의 시스테인 잔기의 반응에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다. 상기 연결 구조의 A1은 링커와 연결되며, A2는 알부민과 연결된다.
본 출원의 일 예로, 상기 연결 구조는
Figure pat00022
이며, 상기 연결 구조는 MAL과 알부민의 시스테인 잔기의 반응에 의하여 형성된 결합 구조일 수 있다. 상기 연결 구조의 A1은 링커와 연결되며, A2는 알부민과 연결된다.
위에서 서술된 연결 구조의 MAL과 인간 혈청 알부민의 시스테인 잔기의 연결은 체내에서 가역반응으로 결합이 해리 될 수 있다. 따라서, 본 출원에서는 인간 혈청 알부민과 링커의 결합은 APN으로 연결하는 것이 바람직하다.
5-2 요산산화효소- 링커-알부민 결합
본 출원에서는 상기 화학식 2의 구조를 가지는 요산산화효소-복합체 를 제공한다.
상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF) 으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 200번째 타이로신이 비천연 아미노산인 AzF로 치환되는 것일 수 있다.
이 때, L은
Figure pat00023
, 또는
Figure pat00024
중 선택되는 하나이다.
상기 L의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결될 수 있다.
상기 L의 A2는 지속형 단백질과 연결될 수 있다. 이 때, 상기 지속형 단백질은 인간 혈청 알부민이다.
상기 화학식 2의 n은 1, 2, 또는 3 중 선택되는 하나일 수 있다. 본 출원의 일 예로, 하나의 n이 3일 경우, 요산산화효소 단량체에는 3개의 L-P 가 결합할 수 있다. 본 출원의 다른 일 예로, 제 1 요산산화효소 단량체에는 1개의 L-P 가 결합하며, 제 2 요산산화효소 단량체에 2개의 L-P 가 결합할 수 있다. 본 출원에서는 바람직하게 하나의 요산산화효소 단량체에 하나의 L-P 만 결합하는 것일 수 있다.
5-3 제조 방법
본 출원은 상기 서술된 요산산화효소-복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 출원의 제조 방법은,
특정 아미노산 잔기를 비천연 아미노산으로 치환된 요산산화효소를 생산하는 단계;
친화크로마토그래피로 상기 치환된 요산산화효소를 분리하는 단계;
상기 요산산화효소를 지속형 단백질과 연결(conjugation)하는 단계; 및
상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함한다.
본 출원의 요산산화효소는 미생물을 통해 배양할 수 있다. 상기 요산산화효소는 유가식 배양 (fed-batch culture)으로 배양할 수 있다. 또한, 상기 요산산화효소는 인공적인 합성 방법으로도 얻을 수 있으며, 상기 요산산화효소를 수득하는 방법에 있어서 제한을 두지 않는다.
상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리함은 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행 할 수 있다.
상기 요산산화효소는163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 바람직하게는 200번째 타이로신 일 수 있다.
본 출원의 일 실시 형태에서 지속형 단백질은 인간 혈청 알부민일 수 있다. 상기 인간 혈청 알부민은 요산산화효소와 연결하기 전, 시스테인의 티올 잔기에 반응하는 작용기와 결합한다.
5-4 약학적 조성물
본 출원은 서술된 상기 요산산화효소-복합체를 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증, 통풍성 신병증 및 고요산혈증이 특징인 종양용해증후군 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 제공한다.
본 출원의 조성물에 있어서, 상기 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애는 요산이 정상 수치보다 많아져서 신장이 요산을 배설시키는 능력이 저하될 경우 혈액 중에 여분의 요산이 남아있게 되고 혈중 요산치가 높아져 발생되는 질환이나 질병을 말한다.
구체적으로, 상기 고요산혈증 관련 대사 장애에는 통풍, 요산 결정, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 단일 관절성 관절염, 염증성 관절염의 통증 발작, 요로 결석증, 신결석증, 통풍성 신병증, 및 고요산혈증이 특징인 종양용해증후군이 포함된다.
상기 통풍은 통상적으로 급성 염증성 관절염의 재발성 발작을 특징으로 하는 의학적 상태이며, 엄지 발가락 기저부의 중족-지골 관절에서 흔하게 발생한다. 또한, 통풍은 관절, 힘줄 및 주변 조직들 내에서 결정화되고 침착 되는 혈중 요산에 의해 유발되며, 통풍 결절, 신장 결석 또는 요산염 신병증으로서 존재할 수도 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 상기 요산산화효소-복합체를 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 출원의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물에 있어서, 상기 요산산화효소-복합체는 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％ 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 출원의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 통풍, 고요산혈증, 또는 고요산혈증 관련 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
6. 요산산화효소-복합체의 효능
본 출원의 상기 서술된 요산산화효소-복합체는 야생형의 요산산화효소와 비교하여 개선된 효능을 가질 수 있다. . 나아가, 현재 사용되고 있는 고요산혈증을 치료하는 약품과 비교할 때 갖는 개선된 효능을 가질 수 있다.
6-1. 요소분해효소의 활성
종래에 고분자 지속형 단백질과 연결된 단백질 치료제는 활성이 크게 낮아지는 문제가 있었다. 이는, 연결된 고분자 지속형 단백질이 단백질 치료제의 활성 부위 등에 영향을 주는 문제가 발생할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 종래 기술 중 Pegylation 등 무작위 치환을 통해 고분자 지속형 단백질을 연결하는 기술의 경우, 고분자 지속형 단백질의 연결 위치가 특정되지 않는다. 따라서, 단백질 치료제의 활성 위치를 고려하여 지속형 단백질을 연결하는 것이 불가능하다.
설혹, 위치 특이적인 결합이 가능한 경우에도 단백질 치료제의 활성을 저해 하지 않는 연결 위치를 찾는 데는 고려해야 할 것이 많다. 단백질 치료제의 활성부위로부터 떨어져 있는지, 단백질 치료제의 입체구조 형성을 저해하지 않는지,또 높은 수율을 위해서는 용매접근성이 높은 지를 고려하여 특정 위치에 치환해야 한다.
추가적으로, 인체 내에서 단백질 치료제의 약리기전 (mode of action)을 고려하여, 각종 조효소 등 부가적인 상호작용도 억제되지 않는 특정 위치를 찾아야 한다. 그 외에도, 요산을 조절하는데 있어 추가적인 부작용이 발생하지 않는 형태의 단백질 치료제여야만 할 것이다.
본 출원에서는 위에서 서술한 기준에 따른 특정 위치를 찾기 위해 기준에 의해 치환 후보 위치를 선정하였고, 실제로 실험하여 활성이 높은 위치를 선택하였다 (도 2 내지 도 4 참조).
본 출원의 요산산화효소-복합체는 야생형 요산산화효소와 비교하여 동일하거나 개선된 활성을 가진다. 구체적으로, 본 출원의 요산산화효소-복합체는 다음의 활성을 가진다.
본 출원의 일 실시형태에서, 고요산혈증이 유도된 군에서 요산산화효소-복합체를 투여한 군이 야생형의 요산산화효소를 투여한 군과 비교하여 낮은 혈중 요산 수치를 가진다. 본 출원의 다른 일 실시형태에서, 고요산혈증 약물인 알로푸리놀(allopurinol)에 비해 요산산화효소-복합체는 요소 질소 및 크레아티닌 농도를 감소시킨다.
종래의 지속형 단백질이 결합된 단백질 치료제가 야생형 단백질에 비하여 효능이 좋지 못한 것을 볼 때, 본 출원의 요산산화효소-복합체의 효능은 의미가 있다.
6-2 지속성의 향상
본 출원의 요산산화효소-복합체는 지속형 단백질을 포함하므로 반감기가 야생형 단백질에 비하여 크게 개선될 수 있다.
본 출원의 일 실시 형태에서 상기 지속형 단백질은 인간 혈청 알부민일 수 있다. 본 출원의 다른 일 실시형태에서, 요산산화효소-복합체는 야생형 요산산화효소에 비하여 7.5배 이상의 반감기를 가진다. 본 출원의 다른 일 실시형태에서, 상기 요산산화효소-복합체의 링커가
Figure pat00025
일 때, 요산산화효소-복합체의 반감기는 더욱 커진다.
이하 본 출원에 있어서 사용된 실험 재료는 다음과 같다. p-아지도-L-페닐알라닌(AzF)은 Chem-Impex International (Wood Dale, IL)로부터 구입하였으며, 인간혈청 유래의 알부민주는 Albumedix(Nottingham, UK) 로부터, Vivaspin centrifuge concentrator는 Sartorius Corporation (Bohemia, NY)로부터, DBCO-PEG3-FITC는 Conju-Probe, LLC (San Diego, CA)로부터, DBCO-PEG4-MAL은 Click chemistry tools (Scottsdale, AZ)로부터, PD-10 desalting column, Hitrap phenyl FF hydrophobic interaction column, HiTrap Q HP cation exchange column, HiTrap SP HP anion exchange column, Superdex 200 increase 10/300 GL size exclusion column 및 AKTA pure 25L은 GE Health care (Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. 그 외 모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1. 6x 히스-태그(His-tag)가 포함된 Candida utilis 유래 요산산화효소-야생형 발현벡터의 제작
pQE80-AmpR vector 의 EcoRI/HindIII site 에 야생형 candida utilis 요산산화효소 벡터를 암호화하는 서열을 Integrated DNA Technologies, Inc. 에 DNA 합성 의뢰 하여 template 를 제작하여 Candida utilis Uox-WT (야생형 요산산화효소 벡터; 이하, C.Uox-WT) 단백질 발현 백터를 제작하였다.
하기에 6x 히스 태그가 결합된 Candida utilis Uox의 DNA 암호화 서열은 서열번호 2와 같다.
PCR-cloning 진행을 위해 high-fidelity 계열의 Phusion DNA polymerase (Thermo fisher scientific, F540L) 를 활용하였다. 50 ng Template (pUCIDT-AmpR-C.Uox-WT), 10 uM Forward primer 1 μL, 10 uM Reverse primer 1 μL, 5X HF buffer 10 μL, 10 mM dNTP 1 μL, Phusion DNA polymerase (2U/μL) 1 μL를 혼합하고 D.W.로 50 μL를 조정하였다. (서열번호 3 5'-CAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTatgtcaacaacg-3' (Uox-WT candida F), 서열번호 4 5'- ATTAAGCTTAATGGTGATGGTGATGGTGcaacttggtct-3' (Uox-WT candida R))
PCR은 Initial denaturation (98℃ 30초), Denaturation (95℃ 10초), Annealing (59℃ 20초), Elongation (72℃ 30초), Final elongation (72℃ 5분), Cycle은 30회 진행하였다.
Cloning 을 위한 insert 삽입 서열인 PCR-amplified C.Uox-WT 40 μL, EcoRI 1 μL, HindⅢ 1 μL,, NEB buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 를 맞추어 37℃ 1시간 반응하고, PCR-amplified C.Uox-WT 서열의 양끝을 cohensive end 로 절단 하였으며, FavorPrepTM GEL/ PCR Purification Kit 을 이용하여 desalting 하였다.
Cloning 을 위한 empty vector 로서 pQE80L-AmpR vector 1ug을 EcoRI 1 μL, HindⅢ 1 μL를, NEB buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 맞추어 1시간동안 반응하여 cohensive end 로 절단 하였으며, FavorPrepTM GEL/ PCR Purification Kit (Favorgen, FAGCK 001) 을 이용하여 desalting 하였다.
Ligation 은 T4 DNA Ligase (Enzynomics, M001S) 를 이용하여 vector : insert = 1 : 3 비율로 1시간 진행하였다. Ligate DNA 는 DH5a Chemically Competent E. coli (Enzynomics, CP010) 에 transformation 을 진행 하였다.
Competent cell은 DH5a 50ul 및 pQE80L-AmpR-C.Uox-WT ligate DNA 를 2μL 혼합하고 15분간 ice incubation 하였다. 42℃에서 30초 동안 heat shock을 진행하였으며, 2분간 ice incubation 하였다. pQE80L-AmpR-C.Uox-WT 가 도입된 DH5a 의 recovery 는 37℃으로 1시간동안 inbubation 하고, 50ug/mL 농도의 ampicillin 농도의 LB agar plate에 배양액을 도말하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 colony를 확인하였다.
pQE80L-AmpR-C.Uox-WT plasmid 의 mini-prep 을 진행하기 위하여 DH5a[(pQE80L-AmpR-C.Uox-WT)(6xHis-Tag)] single colony 를 LB brooth 에 접종하고, 37℃온도의 220 rpm 조건에서 13시간 배양한 후 spin down 하여 배양균을 침전시켰다. 이후 DNA-spin Plasmid DNA Purification Kit Miniprep kit (iNtRON, 17908)를 이용하여 plasmid를 정제하였으며, EcoRI/HindIII 제한효소 처리 및 (주)마크로젠 사에 sequencing 의뢰하였다. Cloning 서열은 NCBI 의 BLAST를 통해 상기 Candida utilis Uox의 DNA 암호화 서열과 동일함을 확인하였다.
도 1에서 Uox 야생형 벡터를 도식화 하였다.
도 1에서 pQE80L-AmpR-C.Uox-WT의 모식도를 나타내었다.
실시예 2. Candida utilis 유래 Uox 의 Site-directed mutagenesis 를 통한 amber codon (UAG) 의 치환 및 발현벡터의 제작
요산산화효소에 비천연아미노산(AzF)를 포함시키더라도 본래 요산산화효소의 구조와 기능에 가능한 영향을 미치지 않아야 하므로, 최적의 위치를 결정하기 위하여, AzF와 구조적으로 유사한 방향족 아미노산 (Phe, Trp, Tyr)을 잠정적인 타겟으로 선택하였다.
Candida utilis 유래 야생형 요산산화효소에는 12개의 페닐알라닌, 5개의 트립토판, 15개의 타이로신이 있다. 높은 용매접근성을 가지고 있는 위치가 AzF를 포함시키기에 더 적합 하였는데, 왜냐하면 링커와의 결합 가능성이 높아질수록 컨쥬게이션이 더 효율적으로 이루어질 수 있기 때문이다. 12개의 페닐알라닌, 5개의 트립토판, 15개의 타이로신에 대해 용매 접근성을 NerSurfP-2.0을 이용하여 분석한 결과, 5 개의 위치 (Y163, F170, Y200, Y253, W271)가 상대적으로 높은 용매 접근성을 나타내었다. 이 중에서 Y253은 위치상 요산산화효소 활성부위에 영향을 미칠 수 있는 곳에 위치하였기 때문에 배제하였다.
상기 삽입 위치 선정 방법에 대한 도면은 도 2 내지 도 4에서 확인할 수 있다. 따라서, 상기의 결과로 Y163, F170, Y200, W271의 아미노산 잔기가 치환할 수 있는 최적의 위치로 선정되었다.
Cloning 이 완료 된 pQE80L-AmpR-C.Uox-WT plasmid 의 coding 서열 내 아미노산을 지정하는 codon 번호 163Tyr, 170Phe, 200Tyr, 271Trp 을 amber codon (UAG)로 치환하는 Site-directed mutagenesis 를 수행 하였다.
C.Uox-WT 의 codon 번호 163Tyr, 170Phe, 200Tyr, 271Trp 의 amber codon 치환을 위한 Site-directed mutagenesis oligo set
서열
번호		 Oligo name Sequence ( 5' to 3' ) bp
5 Candida_Uox-Y163UAG-F CGG CAG CAT GTT TTA GGG TTA TA 23
6 Candida_Uox-Y163UAG-R TAT AAC CCT AAA ACA TGC TGC CG 23
7 Candida_Uox-F170UAG-F AAA TGC GAT TAG ACA ACC CTG 21
8 Candida_Uox-F170UAG-R CAG GGT TGT CTA ATC GCA TTT 21
9 Candida_Uox-Y200UAG-F GTA GCG TGT AGG ATA TTG CCA A 22
10 Candida_Uox-Y200UAG-R TTG GCA ATA TCC TAC ACG CTA C 22
11 Candida_Uox-W271UAG-F ACC TGA AAT AGA AGG GCC TTG 21
12 Candida_Uox-W271UAG-R CAA GGC CCT TCT ATT TCA GGT 21
Site-directed mutagenesis 방법은 PCR-reaction 을 수행하기 위해서 high-fidelity 계열의 Phusion DNA polymerase (Thermo fisher scientific, F540L) 를 활용하였다. 또한, 각각의 163Tyr, 170Phe, 200Tyr 및 271Trp 의 아미노산을 지정하는 codon을 amber codon 으로 치환하기 위한 oligo-set 을 제작하여 PCR-reaction 에 접목하였다 [표 1].
PCR-reaction은 50 ng Template (pQE80L-AmpR-C.Uox-WT), 10 uM Forward primer 1 μL, 10 uM Reverse primer 1 μL, 5X HF buffer 10 μL, 10 mM dNTP 1μL, Phusion DNA polymerase (2U/μL) 1 μL를 혼합하고 D.W.로 50 μL를 조정하였다. PCR은 Initial denaturation (98℃ 30초), Denaturation (95℃ 10초), Annealing (55℃ 30초), Elongation (72℃ 3분), Final elongation (72℃ 5분), Cycle은 20회 진행하였다. PCR-reaction 후 PCR-amplicon 은 DpnI 으로 37℃에서 1시간 incubation하여 미 변이 가닥을 제거하였으며, DH5a 를 이용하여 transformation 을 수행 하였다.
Competent cell은 DH5a 5 μL 및 pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 각각 2 μL를 혼합하고 15분간 ice incubation 하였다. 42℃에서 30초 동안 heat shock을 진행하였으며, 2분간 ice incubation 하였다. Competent cell은 DH5a 5ul 및 pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG)가 도입된 DH5a 의 recovery 는 37℃으로 1시간동안 incubation 하고, ampicillin 50ug/mL 의 LB agar plate에 배양액을 도말하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 colony를 확인하였다.
pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) plasmid DNA확보를 위한 mini-prep 을 수행하였다. DH5a[(pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF)(6xHis-tag)] 균주 single colony 를 LB brooth 에 접종하고 37℃ 220 rpm에서 13시간 배양한 후 spin down 하여 배양균을 침전시켰다. 이후 DNA-spin?? Plasmid DNA Purification Kit Miniprep kit (iNtRON, 17908)를 이용하여 plasmid를 정제하였다.
pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 유전자 서열을 확인하기 위해서 EcoRI/HindIII 제한효소 반응 후 agarose gel electrophoresis 로 insert 를 분석 하였다. Template DNA 1 μg과 EcoRI 1 μL, HindⅢ 1 μL, NEB buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 조정하였다. 37℃ 1시간 반응시키고 0.8 % agarose gel을 만들어 시료 2 μL와 6x loading dye 와 혼합하여 20분간 전기영동한 후 chemidoc으로 확인하였다. EcoRI/HindIII 제한효소 반응 후 insert 확인 및 (주)마크로젠 사에 sequencing 의뢰하여 C.Uox-AzF 의 genotype 을 확인하여 변이된 서열을 최종 확인하였다.
상기 결과는 도 5에서 확인 할 수 있다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 각각의 위치에서 서열 변이가 된 것을 확인하였다.
실시예 3. C321.β의 4가지 vatiant 균주 (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG)제조 및 발현 확인
pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 의 발현 연구용 세포주를 제작하였다. C321.△A.opt (addgene, #87359) 균주를 LB brooth에 inoculation 후 37℃에서 O.D 600 에서 0.5~0.6 까지 키웠다. C321.△A.opt 는 5000rpm 으로 10분동안 spin down 하고 0.1M CaCl2 를 처리하여 competent cell 을 제작 하였다. 이후 C321.β에 pEVOL-pAzF (addgene, 31186) vector 를 transformation하여 동일한 조건으로 배양 및 CaCl2 를 처리하였고, pEVOL-pAzF가 도입된 C321.△A.opt (pEVOL-pAzF) chemically competent cell 이 제작 되었다.
C321.△A.opt (pEVOL-pAzF) chemically competent cell 50 μL 및 pQE80L-AmpR-C.Uox-WT 및 pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) plasmid 2 μL 를 혼합하고 15분간 ice incubation 하였다. 42℃에서 30초 동안 heat shock을 진행하였으며, 2분간 ice incubation 하였다. Plasmid가 도입된 C321.△A.opt (pEVOL-pAzF) competent cell의 recovery 는 37℃으로 1시간동안 incubation 하고, ampicillin (50ug/ml) chloramphenicol (35ug/mL) 농도의 2xYT agar plate에 배양액을 도말하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 C321.△A.opt [(pEVOL-pAzF)(pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF)(6xHis-Tag)]의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) colony를 확인하였다.
CC321.△A.opt [(pEVOL-pAzF)(pQE80L-AmpR-C.Uox-AzF)(6xHis-Tag)]의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 내 재조합 단백질의 발현 분석을 위한 배양을 수행하였다. 균주 배양을 위한 2xYT 배지를 제작하기 위하여 Tryptone (16 g/L), Yeast extract (10 g/L), NaCl (5 g/L)과 3차증류수 1L 를 autocleave 기기를 이용해 멸균 하였으며, 멸균된 배지는 실온에서 충분히 식혀준 후 항생제를 ampicillin (50 ug/mL) chloramphenicol (35 ug/mL) 조건으로 첨가한다. 종배양 (seed culture) 을 위하여 각 균주의 colony를 각각 1개씩 5ml 의 2xYT (ampicillin 50 ug/mL, chloramphenicol 35 ug/mL) 배지에 접종하고 37℃ 220 rpm 조건에서 15시간 이상 배양한다. 종배양 (seed culture) 종료 후 1L baffle flask 에 200ml 의 2xYT (ampicillin 50 ug/mL, chloramphenicol 35 ug/mL) 에 접종하여 O.D 600 에서 0.5~0.6 사이 C.Uox-WT 발현 균주는 IPTG induction, C.Uox-AzF 발현 균주는 4-azido-L-phenylalanine, arabinose, IPTG 를 각각 첨가하여 균주 내 재조합단백질의 과발현을 유도시킨다. 5시간 induction 배양 후 최종 O.D. 및 pellet를 확인한 결과 genotype 에 따라 O.D 600에서 genotype 에 따른 배양 종료시점의 absorbance 및 wetcell 의 질량 차이가 발생하였다.
Candida Uox genotype 에 따른 C321.△A.opt 균주 배양 결과
Candida Uox genotype Final OD600nm Pellet (g)
WT 5.50 2.1
Y163UAG 5.44 2.9
F170UAG 3.89 3.1
Y200UAG 6.99 2.7
W271UAG 2.45 4.9
도 6에서는 정제된 형태를 확인하였다.
배양 종료시점에서 C.Uox-WT 은 Ni-NTA 정제를 통한 수율을 확인 하였다.
C.Uox-AzF 는 발현 분석을 위하여 wetcell 을 lysis buffer (50 mM Sodium phosphate 300 mM Nacl)로 lysis 후 sonication (35% amplify, 5sec sonicate, 10sec rest) 하여 total protein 을 얻었다. Total protein을 BCA 정량 후 40 ug을 반영하여 SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE gel 은 Commassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution (BIORAD, #1610436)으로 염색하여 발현된 C.Uox-WT 및 C.Uox-AzF를 확인하였다. Western-blot은 별도의 SDS-PAGE을 통해 분리된 단백질을 PVDF membrane에 transfer 하였으며, membrane을 세척하고 skim milk로 blocking하고 1:1000으로 희석한 1차 Uricase Ab을 1시간 반응시킨 후 세척하고 3:10000으로 희석한 2차 항체 (Mouse lgG lambda binding protein conjugated HRP)를 1시간 반응시켰다. 30분간 3회 세척 후 luminol reagent와 혼합 후 chemidoc으로 밴드를 확인하였다. 요산산화효소의 발현확인을 위해 induction 전후 배양 후 SDS-PAGE 및 western blot analysis 로 발현 분석으로 34 kDa의 C.Uox-WT 및 C.Uox-AzF의 발현이 확인하였다.
도 7과 도 8에서 C.Uox-AzF의 발현을 SDS-PAGE와 Western blot 으로 확인 하였다.
실시예 4. 6xHis-tag가 포함된 Candida utilis 유래 codon optimized Uox-WT (C.Uox-WT-optz.) 발현벡터의 제작
Candida utilis 유래 codon optimization 을 수행한 Uox-WT (C.Uox-WT-optz.) DNA 서열을 (주)마크로젠 에 DNA 합성 의뢰 하여 pTOP Blunt V2 에 cloning 된 C.Uox-WT-optz. template (서열번호 13)를 확보 하였다.
(주)마크로젠 에 DNA 합성하여 얻은 pTOP Blunt V2-C.Uox-WT-optz. vector 를 EcoRI/HindIII digestion 하여 insert 서열로서 C.Uox-WT-optz. 를 얻었으며, pQE80L-KanR vector 에 sub-cloning 을 수행하였다. C.Uox-WT-optz. 40 μL, MfeI 1 μL, HindIII 1 μL, NEB cutsmart buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 를 맞추어 37℃ 1시간 반응하여 C.Uox-WT-optz.의 양끝을 cohensive end 로 절단 하였다. 이후, FavorPrepTM GEL/ PCR Purification Kit 을 이용하여 desalting 하였다. Cloning 을 위한 empty vector 로서 pQE80L-KanR vector 1ug을 MfeI 1 μL, HindIII 1 μL, NEB cutsmart buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 맞추어 1시간동안 반응하여 cohensive end 로 절단 하였으며, FavorPrepTM GEL/ PCR Purification Kit (Favorgen, FAGCK 001) 을 이용하여 desalting 하였다. Ligation 은 T4 DNA Ligase (Enzynomics, M001S) 를 이용하여 menual 을 기반으로 vector : insert = 1 : 3 비율로 1시간 진행하였다. Ligate DNA 는 DH5a Chemically Competent E. coli (Enzynomics, CP010) 에 transformation 을 진행 하였다.
도 9에서 transformation 을 진행한 뒤 colony가 생긴 것을 확인할 수 있다.
실시예 5. pQE80L-KanR-C.Uox-WT-optz. 의 Site-directed mutagenesis 를 통한 amber codon (UAG) 의 치환 및 발현벡터의 제작
Cloning 이 완료 된 pQE80L-KanR-C.Uox-WT-optz. plasmid 의 coding 서열 내 아미노산을 지정하는 codon 번호 163Tyr, 170Phe, 200Tyr, 271Trp 을 amber codon (UAG)로 치환하는 Site-directed mutagenesis 를 수행 하였으며, 본 목적으로 mutagenesis oligo-pairs 를 design 하였다 [표 3].
C.Uox-WT-optz. 의codon 번호 163Tyr, 170Phe, 200Tyr, 271Trp 의 amber codon 치환을 위한 Site-directed mutagenesis oligo set
서열 번호 Oligo name Sequence ( 5' to 3' ) bp
14 CU-163Y_amb-F cggctcgatgttctaGggctacaac 25
15 CU-163Y_amb-R gttgtagccCtagaacatcgagccg 25
16 CU-170F_amb-F tgactAGaccaccttgcaaccaacaac 27
17 CU-170F_amb-R gttgttggttgcaaggtggtCTagtca 27
18 CU-200Y_amb-F ttggctctgtctaGgacatcgcca 24
19 CU-200Y_amb-R tggcgatgtcCtagacagagccaa 24
20 CU-271W_amb-F aagcactacttcctcattgacttgaaatAgaaagg 35
21 CU-271W_amb-R cctttcTatttcaagtcaatgaggaagtagtgctt 35
High-fidelity 계열의 Phusion DNA polymerase (Thermo fisher scientific, F540L) 를 활용하였으며, C.Uox-WT-optz. 서열 내 Site-directed mutagenesis 를 위한 oligo-pair 를 각각의 codon을 amber codon로 치환하기 위하여 적용하였다 (표 3). PCR-reaction은 50 ng Template (pQE80L-KanR-C.Uox-WT-optz.), 10 uM Forward primer 1 μL, 10uM Reverse primer 1 μL, 5X HF buffer 10 μL, 10 mM dNTP 1 μL, Phusion DNA polymerase (2U/μL) 1 μL를 혼합하고 D.W.로 50 μL를 조정하였다. PCR은 Initial denaturation (98℃ 30초), Denaturation (95℃ 10초), Annealing (55℃ 30초), Elongation (72℃ 3분), Final elongation (72℃ 5분), Cycle은 20회 진행하였다. PCR-reaction 후 PCR-amplicon 은 DpnI 으로 37℃에서 1시간 incubation하여 미 변이 가닥을 제거하였으며, DH5a 를 이용하여 transformation 을 수행 하였다.
Competent cell은 DH5a 5 μL 및 Site-directed mutagenesis 를 수행한 PCR-amplicon을 2 μL를 혼합하고 15분간 ice incubation 하였다. 42℃에서 30초 동안 heat shock을 진행하였으며, 2분간 ice incubation 하였다. DH5a 의 recovery 는 37℃온도의 220rpm 조건에서 1시간동안 인큐베이션 하고, 35 ug/mL 농도의 kanamycin LB agar plate에 배양액을 도말하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 colony를 확인하였다. pQE80L-KanR-C.Uox-AzF-optz. 의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG)의 plasmid 확보를 위한 mini-prep 을 위하여 single colony 를 LB brooth 에 접종하고 37℃ 220 rpm에서 13시간 배양한 후 spin down 하여 배양균을 침전시켰다. 이후 DNA-spin Plasmid DNA Purification Kit Miniprep kit (iNtRON, 17908)를 이용하여 plasmid를 정제하였다.
pQE80L-KanR-C.Uox-AzF-optz 의 4가지 variants (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 유전자 서열을 확인하기 위해서 MfeI/HindIII 제한효소 반응 후 아가로스 젤 전기영동으로 삽입된 플라스미스 크기를 통해 분석 하였다. Template DNA 1 μg과 MfeI1 μL, HindIII 1 μL, NEB cutsmart buffer 5 μL를 첨가하고 D.W로 50 μL 조정하였다. 37 ℃ 1시간 반응시키고 0.8 % agarose gel을 만들어 시료 2 μL와 6x loading dye 와 혼합하여 20분간 전기영동한 후 케미독(chemidoc)으로 확인하였다 (도 10). MfeI/HindIII 제한효소 반응 후 insert 확인 및 (주)마크로젠 사에 시퀀싱 의뢰하여 C.Uox-AzF-optz의 유전자 타입을 최종 확인하였다 (도 11).
실시예 5. C321.△A.exp[(pEVOL-pAzF)(pQE80L-KanR-C.Uox-AzF-optz.)(6xHis-Tag)]의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 제조 및 발현 확인
C321.△A.exp의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주를 제조하였으며, 발현 세포주를 제작하기 위한 competent cell 을 우선 제작 하였다.C321.△A.exp (addgene, #49018) 균주를 LB brooth에 inoculation 후 37℃에서 O.D 600 에서 0.5~0.6 까지 키웠다. .C321.△A.exp는 5000rpm 으로 10분동안 spin down 하고 0.1M CaCl2 를 처리하여 competent cell 을 제작 하였다. 이후 C321.△A.exp에 pEVOL-pAzF (addgene, 31186) vector 를 transformation하여 동일한 조건으로 배양 및 CaCl2 를 처리하였고, pEVOL-pAzF가 도입된 .C321.△A.exp(pEVOL-pAzF) chemically competent cell 이 제작 되었다.
C321.△A.exp (pEVOL-pAzF) competent cell 50 μL 및 pQE80L-KanR-C.Uox-WT-optz. 및 pQE80L-KanR-C.Uox-AzF-optz. (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) plasmid 2 μL 를 혼합하고 15분간 ice incubation 하였다. 42℃에서 30초 동안 heat shock을 진행하였으며, 2분간 ice incubation 하였다. Plasmid가 도입된 C321.△A.exp (pEVOL-pAzF) competent cell의 recovery 는 37℃으로 1시간동안 inbubation 하고, kanamycin (35 ug/mL) chloramphenicol (35 ug/mL) 농도의 2xYT agar plate에 배양액을 도말하여 37℃에서 18시간 동안 배양 후 C321.△A.exp의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 colony 를 확인 후 별도로 streaking 하였다 (도 12).
C321.△A.exp(pEVOL-pAzF)(pQE80L-KanR-C.Uox-AzF--optz.)(6xHis-Tag)] 의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 내 재조합 단백질의 발현 분석을 위한 배양을 수행하였다. 균주 배양을 위한 2xYT 배지를 제작하기 위하여 Tryptone (16 g/L), Yeast extract (10 g/L), NaCl (5 g/L)과 3차증류수 1L 를 autocleave 기기를 이용해 멸균 하였으며, 멸균된 배지는 실온에서 충분히 식혀준 후 항생제를 kanamycin (35 ug/mL) chloramphenicol (35 ug/mL) 조건으로 첨가하였다. 종배양 을 위하여 각 균주의 colony를 각각 1개씩 5ml 의 2xYT (kanamycin 35 ug/mL, chloramphenicol 35 ug/mL) 배지에 접종하고 37 ℃ 220 rpm 조건에서 15시간 이상 배양한다. 종배양 종료 후 500 ml baffle flask 에 100ml 의 2xYT (kanamycin (35 ug/mL) chloramphenicol (35 ug/mL)) 에 접종하여 O.D 600 에서 0.5~0.6 사이에 4-azido-L-phenylalanine, arabinose, IPTG 를 각각 첨가하여 균주 내 재조합단백질의 과발현을 유도하였다. 5시간 induction 배양 후 최종 O.D. 및 pellet를 확인한 결과 C.Uox-AzF-optz.의 genotype 에 따라 O.D 600에서 배양 종료시점의 흡광도 값 및 wetcell 의 질량 차이가 나타났다 [표 4].
C.321.△A.exp　[(pEVOL-pAzF)(pQE80L-KanR-C.Uox-AzF--optz.)(6xHis-Tag)]　의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 배양 결과
Candida Uox genotype Final OD600nm Pellet (g)
Y163UAG 6.73 0.86
F170UAG 7.28 0.8
Y200UAG 4.39 0.65
W271UAG 4.01 0.57
C.321.△A.exp　[(pEVOL-pAzF)(pQE80L-KanR-C.Uox-AzF--optz.)(6xHis-Tag)]　의 4가지 variant (Y163UAG, F170UAG, Y200UAG 그리고 W271UAG) 균주 내 재조합단백질의 발현량 및 solubility 를 분석하기 위하여, lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM Nacl)로 lysis 하였다. lysis 후 상층액을 따로 수집하였으며, pellet 으로 나오는 insoluble body 를 6M UREA 를 3배 volume 첨가 후 sonication (35% amplify, 5sec sonicate, 10sec rest) 하여 solubilization 을 진행하였다. Lysis 후 얻은 soluble 및 insoluble 단백질은 BCA 정량 후 60ug을 반영하여 SDS-PAGE를 통해 4-Azido-L-phealanine 의 도입여부, solubility 및 재조합단백질의 발현을 SDS-PAGE 및 western blot analysis 를 통하여 검증하였다. 유사 아미노산인 4-Azido-L-phealanine의 도입은 lysate 60 ug 에 40 uM 농도의 DBCO-PEG3-FITC 를 5ul 처리 후 SDS-PAGE 를 통해 DUALED Blue/White Transilluminator (BIONEER, #A-6020) 을 통해 확인 하였다 (도 13). Western-blot은 SDS-PAGE을 통해 분리된 단백질을 PVDF membrane에 transfer 하였으며, membrane을 세척하고 skim milk로 blocking하고 1:1000으로 희석한 1차 Uricase antibody (SANTACRUZ, #sc-166214)을 1시간 반응시킨 후 세척하고 3:10000으로 희석한 2차 항체로 m-IgGλ BP-HRP (SANTA CRUZ, sc-516132)를 1시간 반응시켰다. 30분간 3회 세척 후 luminol reagent와 혼합 후 chemidoc으로 밴드를 확인하였다. 요산산화효소의 발현확인을 위해 induction 전후 배양 후 SDS-PAGE 및 western blot analysis 로 발현 분석으로 34 kDa의 C.Uox-AzF-optz.의 발현이 확인되었다.
실시예 5. Ni-NTA 컬럼을 이용한 Candida utilis 요산산화효소 분리 정제
Wet cell에 5x lysis buffer를 혼합하여 초음파 파쇄 후 원심 분리하여 상등액을 모아 syringe filter로 여과하여 cell lysate를 준비하였다.
Lysis buffer로 세척한 Ni-NTA resin과 cell lysate을 binding시켜 polypropylene column에 충진하였다. washing buffer로 세척 후 elution buffer로 단백질을 용출하여 C.Uox-AzF를 분리하여 단백질 농도를 측정하였다.C.Uox 활성 측정은 Uric acid와 C.Uox-AzF를 혼합하여 UV 293 nm에서 30초 간격으로 5분간 kinetics을 측정하여 분당 소비되는 uric acid량을 계산하여 Uox 활성(Units/mL)을 확인하였다. Specific activity (Units/mg)는 사용된 Uox량 (mg/mL)으로 나누어 계산하였다. 분자량 분석(SDS-PAGE)은 10% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free gel을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 분리된 C.Uox에 5x sample buffer를 첨가하여 150V에서 40분간 running하여 Coomassie Brilliant Blue 염색하여 분자량을 확인하였다.분리정제 결과 수율은 wet cell 1g 당 20.3 mg의 고순도 요산산화효소를 얻을 수 있었으며, SDS-PAGE분석결과 요산산화효소의 단량체인 약 34 kDa의 밴드를 확인하였다 (도 14).
AzF 치환 위치별로 C.Uox-163AzF, C.Uox-170AzF, C.Uox-200AzF, C.Uox-271AzF를 분리 정제하여 SDS-PAGE로 분자량과 순도를 확인하였다. 이후 C.Uox-HSA 분리 정제 과정을 위하여 효율이 가장 우수한 C.Uox-200AzF에 대하여 반복적으로 분리과정을 진행하였다 (도 15).
실시예 6. C.Uox 의 AzF 삽입 여부 확인
C.Uox의 AzF 도입 확인을 위해 LC/MS를 분석하였다. 분석시료(C.Uox-WT, C.Uox-163AzF, C.Uox-200AzF)는 In-gel digestion 방법으로 3종류의 enzyme(Chymotrypsin, Lys-C, Trypsin)으로 전처리하여 Q-Exactive LC/MS로 분석하고 Proteome Discoverer 1.4 Target database로 분석하였다.
상기 C.Uox-163AzF는 163번 tyrosine 위치가 AzF로 치환된 형태이다.
상기 C.Uox-200AzF는 200번 tyrosine 위치가 AzF로 치환된 형태이다.
그 결과 3종(C.Uox-WT, C.Uox-163AzF, C.Uox-200AzF) 분석 시료는 93.2~96.1%의 Coverage를 얻었다. C.Uox-163AzF에서는 163위치의 아미노산이 AzF로 치환되어 41Da 정도 shift된 PTM를 2개 얻었으며, C.Uox-200AzF에서는 200위치의 아미노산이 AzF로 치환되어 41Da shift된 PTM를 얻었다. 결과적으로 C.Uox-163AzF, C.Uox-200AzF 모두 각 위치에 AzF가 삽입되어 있음을 확인하였다.
도 16 내지 도 22에서 각 위치에 AzF가 삽입된 것을 확인 하였다.
실시예 7. AzF 위치별 C.Uox-HSA conjugate 수율
약물전달체로 영국 Albumedix사의 재조합 인간혈청알부민 (Recombinant Human serum albumin, rHSA)을 사용하였으며, 별도 분리공정 없이 버퍼만 (PBS pH 9.0) 교환하여 사용하였다. 기존에 요산산화효소와 알부민 연결에 사용한 DBCO-PEG4-MAL 링커의 경우 알부민 34번 히스티딘의 thiol기와 말레이미드간 Michael addition 반응을 통해 결합하나 Thiol-maleimide coupling의 경우 가역반응으로 혈액 내에서 25 % 이상이 분해된다는 연구가 보고되었다. 따라서, pH 안정성이 높은 Candida utilis 유래 요산산화효소를 이용하여 비천연아미노산을 삽입하고, 혈액 내에서 안정한 결합을 유지할 수 있는 thoi-APN coupling을 활용한 위치 특이적 요산산화효소-복합체 제조공정으로 개선하고자 하였다.
AzF 치환 위치별 개발된 C.Uox163, 170, 200, 271를 HSA와 conjugation 후 각 분리 정제 과정에 C.Uox-HSA 생산 수율을 단계별로 비교하였다. 모든 단계에서 C.Uox200-HSA의 conjugation 수율이 가장 높았고, C.Uox170-HSA, C.Uox163-HSA, C.Uox271-HSA 순서대로 수율을 보였다.
도 24은 AzF 치환 위치에 따른 C.Uox-HSA의 양이온교환 크로마토그래피 분리 결과를 도식화한 것이다.
도 25 는 AzF 치환 위치에 따른 C.Uox-HSA의 음이온교환 크로마토그래피 분리 결과를 도식화한 것이다.
도 26은 AzF 치환 위치별 C.Uox-HSA conjugation 수율 비교 및 AzF 치환 위치에 따른 C.Uox-HSA의 SDS-PAGE 분석 결과를 표기한 것이다.
실시예 8: C.Uox-HSA 제조공정 최적화
본 출원에서는 C.Uox-HSA의 생산 수율을 극대화하기 위한 다양한 반응 조건과 3단계 분리 정제 과정을 확립하였다.
상기 과정을 도면 23에서 도식화하였다.
8-1. 링커와 알부민 conjugation 최적화
HSA와 DBCO-PEG4-APN linker의 반응 수율을 최적화하기 위하여 HSA : DBCO-PEG4-APN linker의 몰 비율을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4로 진행하여 비교하였다. 그 결과 linker의 농도가 높을수록 conjugation 수율이 높아지는 것으로 확인되었다. pH7.0-7.4 조건에서는 DBCO-PEG4-APN linker농도가 높아질수록 침전 발생이 증가 되었으나, 반응 pH를 9.0으로 높여 안정화 시킨 결과 1:4 비율로 반응시켜도 침전 발생 없이 평균 204%의 높은 conjugation 수율을 얻을 수 있었다.
도 27에서 볼 수 있듯이, HSA : DBCO-PEG4-APN linker의 몰 비율은 1:4로 pH를 9.0에서 침전 없이 높은 수율로 얻는 것을 확인하였다.
8-2. 반응 pH에 따른 C.Uox-HSA conjugation 수율 비교
생산 수율을 향상시키기 위하여 최적 pH 조건을 확립하고자 pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0조건을 비교한 결과 pH 9.0에서 C.Uox-HSA가 보다 더 안정적이고 높은 생산 수율을 나타내었다.
상기 결과는 도 28 내지 도 31에서 확인하였다.
8-3. 반응 몰비율에 따른 C.Uox-HSA conjugation 수율 비교
C.Uox와 HSA 몰비율의 최적 조건을 확립하기 위하여 C.Uox : HSA의 몰 비율을 1:2, 1:4, 1:8, 1:12 조건으로 conjugation을 시행하였다. 최종 산물의 수율은 1:4와 1:8 조건에서 가장 양호한 것으로 확인되었다. Uox 활성을 측정한 결과에서는 1:8과 1:12에서 보다 우수한 양상을 나타내었다. 결과적으로 수율과 Uox 활성 모두에서 효과적인 1:8 몰 비율을 최종적으로 적용하였다.
위의 결과는 도 32 내지 도 35에서 확인하였다.
8-4. C.Uox-HSA 분리공정 최적화
4가지 AzF 치환체 중에서 C.Uox200의 HSA와의 반응 생성물의 수율이 가장 우수하여 최종적으로 C.Uox200을 중심으로 생산 공정을 확립하였다.
알부민과 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-APN의 반응 몰 비율은 1:4로, 반응 pH는 9.0으로 하여 25
Figure pat00026
에서 2시간 반응시켰다.
Uox-AzF에 위치 특이적으로 HSA를 연결하기 위하여 C.Uox-AzF와 HSA-PEG4-DBCO를 1:8의 몰비율로 pH 9.0조건에서 25
Figure pat00027
에서 15시간 반응시켜 C.UoX-HSA를 제조하였다. 반응 후 잔존 링커 제거 및 버퍼를 교환하기 위해 Desalting column을 이용하여 20 mM sodium phosphate pH 6.0로 교환하여 1차 정제를 진행하였다 .
C.Uox-HSA conjugate는 1차 SP-HP (도 36), 2차 Q-HP (도 37), 3차 SEC column (도 38)을 이용한 3단계 FPLC 정제 과정을 통해 C.Uox-HSA를 얻었다. SDS-PAGE 분석결과 C.Uox와 HSA가 결합된 크기인 101 kDa의 밴드와 C.Uox 크기인 34 kDa의 밴드를 확인하였다 (도 39).
C.Uox-HSA conjugation 수율은 9.7%를 얻었으며, in vitro 활성에서도 큰 감소 없이 높은 활성을 보였다 (도 40).
실시예 9: C.Uox-HSA conjugation 수율
Conjugation 수율을 분석하기 위해 원료인 C.Uox-200AzF의 단백질 함량과 완제품인 C.Uox-HSA의 단백질 농도를 측정하여 conjugation 수율을 분석하였다. 단백질 정량은 UV 280nm에서 Microplate reader(Spectramax-plus)를 이용하여 측정하였다. C.Uox-200AzF의 몰 흡광계수는 203,920 M-1cm-1이며, C.Uox-HSA의 몰 흡광계수는 242,006 M-1cm-1로 계산하여 산출하였다.
그 결과 C.Uox-200AzF의 농도는 2.74 uM(10 mL)로 측정되었으며, C.Uox-HSA의 농도는 5.05 uM(0.7 mL)로 측정되었다. 결과적으로 conjugation 수율은 12.9%를 보였다 (도 41).
실시예 10: C.Uox-HSA의 pI 분석
C.UoX pI 분석 : IEF-PAGE Precast gel (pH3-10)을 이용해서 pI를 측정하였다. sample과 2x sample buffer를 혼합하여 IEF gel에 loading한 후 125 V 1시간, 200 V 1시간, 500 V 30분 running 한 후 fixing 용액에 고정하여 Coomassie Brilliant Blue로 염색하여 pI를 분석하였다.
C.Uox200, C.Uox200-HSA, C.Uox163-HSA의 pI를 분석하였다. pI 마커를 사용하여 시료의 pI를 분석한 결과 C.Uox200의 경우 pI가 7.5, 7.6, 7.7에서 밴드가 관찰되었고, C.Uox200-HSA와 C.Uox163-HSA는 pI 6.3에서 관찰되었다(도 42)
실시예 11: C.Uox-HSA 순도분석
C.Uox-200AzF와 C.Uox-HSA의 순도를 확인하기 위해 (재)오송첨단의료산업진흥재단에 SEC-HPLC를 의뢰하였다. HPLC는 Waters HPLC(Alliance 2695), 컬럼은 TSKgel G3000SWxL, 이동상 용매는 PBS (pH 7.4), 유속은 0.8mL/min, UV 검출파장은 220nm를 사용하였다.
그 결과 C.Uox-200AzF는 3개의 Peak가 검출 (도 43)되었으며, 그중 main peak의 순도는 90.5%를 보였으며, C.Uox-HSA는 4개의 peak가 검출 (도 44)되었으며, 그 중 main peak의 순도는 76.2%로 나타났다.
실시예 12: 고요산혈증 질환동물모델 효능평가
고요산혈증 동물모델에서 C.Uox-HSA의 혈중 요산 수치감소효과를 확인하기 위해 DT/CRO에 실험을 의뢰하였다. 실험동물은 랫드(Sprague-Dawley (NTacSam:SD), 6주령, 수컷)를 사용하여 Hypoxanthine(500mg/kg)과 Potassium oxonate(250mg/kg)를 이용하여 고요산혈증 모델을 제작하고 시험약물 투여하여 시간별 혈중요산수치를 분석하였다. 비교물질은 시판중인 경구용 약제인 Allopurinol (50 mg/kg)과 비교하였다.
도 45의 테이블에 군 구성 및 투여용량을 표기하였다.
총 3회 고요산혈증을 유도하였으며, control군에서 고요산혈증이 유도된 것을 볼 수 있었다. 시험물질인 C.Uox-HSA 투여군에서는 C.Uox-WT 투여군과 비교하여 낮은 혈중 요산 수치 (도 46)를 보였으며, 12시간까지 유지되었다. 또한 24시간 재 유도했을 때 control군에 비해 낮은 혈중 요산수치를 보였다. 요산 형성억제제인 Allopurinol은 24시간까지 낮은 요산 농도를 유지하다가 28시간 이후 혈중 요산수치가 증가하는 경향을 보였다. 또한, 시험물질에 비해 Allopurinol 투여군에서 비정상적으로 요소질소 (도 47) 및 크레아티닌 (도 48)의 농도가 높아지는 것을 알 수 있었다. 이는 Allopurinol 투여가 신장을 손상시켜 크레아티닌을 제대로 배출하지 못하기 때문이다. 이에 반해 C.Uox-WT 및 C.Uox-HSA는 고요산혈증 유도군에 비해 요소질소 및 크레아티닌 농도를 다소 감소시키는 결과를 얻었다.따라서, 본 출원의 요산산화효소-복합체는 종래의 고요산혈증 치료제보다 더 효과적으로 혈증 요산 농도, 요소 질소 및 크레아티닌 농도를 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 13: C.Uox-HSA의 약동학 시험(반감기)
C.Uox-HSA의 링커(DBCO-PEG4-MAL, DBCO-PEG4-APN)에 따른 반감기를 분석하기 위해 아래와 같이 시험하였다. 실험동물은 습도 42.6~47.8 %, 온도 21.8~23.4
Figure pat00028
로 유지되는 환경에서 사육된 5주령의 수컷 스프라그-도올리 랫 (Sparague-dawley rat, male, 165 ~ 190 g)을 사용하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 시험약물의 투여용량은 C.UoX-HSA(DBCO-PEG4-MAL) 및 C.UoX-HSA(DBCO-PEG4-APN)는 3.0 mg/kg으로 정맥 투여하여 시간에 따라 혈중 내 요산수치의 감소여부를 평가하였다. 대조약물로는 C.Uox-WT 을 2.0 mg/kg으로 정맥 투여하여 시간에 따라 혈중 내 요산수치의 감소여부를 평가하였다. 혈액은 꼬리 정맥으로부터 채취하여 원심분리하고 혈장을 분리하여 Uricase in vitro activity assay 방법으로 분석하였다.
위의 결과를 도 49에서 도식화 하였다.
그 결과 C.Uox-WT의 경우 반감기가 1.9시간으로 짧은 반감기를 보인 반면 C.Uox-HSA(DM)는 14.3시간, C.Uox-HSA(DA)는 16.7의 반감기를 보였다. C.Uox-WT 대비 C.Uox-HSA(DM)의 반감기는 약 7.5 배 증가되었으며, C.Uox-HSA(DA)의 반감기는 약 8.8배 증가되었다. 이는 DBCO-PEG4-APN 링커를 사용한 C.Uox-HSA가 체 내 안정성이 높아 반감기가 증가한 것으로 보인다.
그러므로, 본 출원의 요산산화효소-복합체는 DBCO-PEG4-APN 링커의 구조가 가장 바람직하게 체내에서 반감기가 증가한 형태로 사용될 수 있음을 확인하였다.
<110> PROABTECH <120> Urate oxidase of Candida Utilis - albumin conjugate, and manufacturing method thereof <130> CP20-229 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candida utilis urate oxidase <400> 1 Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val 20 25 30 Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys 50 55 60 Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu 65 70 75 80 Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His 85 90 95 Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr 100 105 110 Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly 115 120 125 Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp 180 185 190 Asn Lys Lys Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys 195 200 205 Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr 210 215 220 Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 225 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser 245 250 255 Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys 260 265 270 Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn 275 280 285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> candida utilis urate oxidase with 6x his tag <400> 2 atgtcaacaa cgctctcatc atccacctac ggcaaggaca acgtcaagtt cctcaaggtc 60 aagaaggacc cgcaaaaccc aaagaagcag gaggttatgg aggccaccgt cacgtgtctg 120 cttgaaggtg ggttcgacac ctcgtacacg gaggctgaca actcgtccat cgtgccaaca 180 gacaccgtga agaacaccat tctcgtgttg gcaaagacca cggagatttg gccaattgag 240 agatttgcag ccaagctggc cacgcacttt gttgagaagt actcgcacgt ctctggcgtc 300 tccgtcaaga ttgtccagga cagatgggtc aagtacgccg ttgatggcaa gccacacgac 360 cactctttta tccacgaagg tggtgagaag agaatcactg acctgtacta caagagatcc 420 ggtgattaca agctgtcgtc tgccatcaag gacttgacgg tgctgaagtc caccggctcg 480 atgttctacg gctacaacaa gtgtgacttc accaccttgc aaccaacaac tgacagaatc 540 ttgtccaccg acgtcgatgc cacctgggtt tgggataaca agaagattgg ctctgtctac 600 gacatcgcca aggctgcaga caagggaatc tttgacaacg tttacaacca ggctagagag 660 atcaccttga ccacctttgc tctcgagaac tctccatctg tgcaggccac gatgttcaac 720 atggctactc agatcttgga aaaggcatgc tctgtctact cggtttcata cgccttgcca 780 aacaagcact acttcctcat tgacttgaaa tggaaaggtt tggagaacga caacgagttg 840 ttctacccat ctccacatcc aaatgggttg atcaagtgta ctgttgtccg taaggagaag 900 accaagttgc accatcacca tcaccattaa 930 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uox-wt candida F <400> 3 cagaattcat taaagaggag aaattaacta tgtcaacaac g 41 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uox-wt candida R <400> 4 attaagctta atggtgatgg tgatggtgca acttggtct 39 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-Y163UAG-F <400> 5 cggcagcatg ttttagggtt ata 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-Y163UAG-R <400> 6 tataacccta aaacatgctg ccg 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-F170UAG-F <400> 7 aaatgcgatt agacaaccct g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-F170UAG-R <400> 8 cagggttgtc taatcgcatt t 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-Y200UAG-F <400> 9 gtagcgtgta ggatattgcc aa 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-Y200UAG-R <400> 10 ttggcaatat cctacacgct ac 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-W271UAG-F <400> 11 acctgaaata gaagggcctt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Candida_Uox-W271UAG-R <400> 12 caaggccctt ctatttcagg t 21 <210> 13 <211> 992 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C.Uox-WT-optz. template <400> 13 caattgtgag cggataacaa tttcacacag aattcattaa agaggagaaa ttaactatga 60 gcaccacact gagcagcagc acctatggta aagataatgt gaaattcctg aaagtgaaaa 120 aagatccgca gaacccgaaa aaacaagaag ttatggaagc aaccgttacc tgtctgctgg 180 aaggtggttt tgataccagc tataccgaag cagataatag cagcattgtt ccgaccgata 240 ccgtgaaaaa taccattctg gttctggcaa aaaccaccga aatttggccg attgaacgtt 300 ttgcagccaa actggcaacc cattttgttg agaaatattc tcatgttagc ggtgtgagcg 360 ttaaaattgt tcaggatcgt tgggttaaat atgccgttga tggtaaaccg catgatcaca 420 gctttattca tgaaggtggt gaaaaacgta tcaccgacct gtattacaaa cgtagcggtg 480 attataaact gtccagcgca attaaagatc tgaccgttct gaaaagcacc ggcagcatgt 540 tttatggtta taacaaatgc gatttcacaa ccctgcagcc gaccaccgat cgtattctga 600 gcaccgatgt tgatgcaacc tgggtttggg ataataagaa aattggtagc gtgtacgata 660 ttgccaaagc agcagataaa ggcatcttcg ataatgtgta taatcaggca cgtgaaatta 720 ccctgaccac ctttgcactg gaaaatagcc cgagcgttca ggcaaccatg tttaatatgg 780 cgacccagat tctggaaaaa gcgtgtagcg tttatagcgt tagctatgca ctgccgaaca 840 aacactattt tctgattgac ctgaaatgga agggccttga aaatgataac gaactgtttt 900 atccgagtcc gcatccgaat ggtctgatta aatgtaccgt tgtgcgtaaa gagaaaacca 960 aactgcatca tcatcaccat cactaaaagc tt 992 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-163Y_amb-F <400> 14 cggctcgatg ttctagggct acaac 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-163Y_amb-R <400> 15 gttgtagccc tagaacatcg agccg 25 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-170F_amb-F <400> 16 tgactagacc accttgcaac caacaac 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-170F_amb-R <400> 17 gttgttggtt gcaaggtggt ctagtca 27 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-200Y_amb-F <400> 18 ttggctctgt ctaggacatc gcca 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-200Y_amb-R <400> 19 tggcgatgtc ctagacagag ccaa 24 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-271W_amb-F <400> 20 aagcactact tcctcattga cttgaaatag aaagg 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CU-271W_amb-R <400> 21 cctttctatt tcaagtcaat gaggaagtag tgctt 35

Claims (19)

  1. 요산산화효소 단량체로,
    상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 갖는 것이 특징인 요산산화효소 단량체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 요산산화효소 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 구조를 갖는 것이 특징인 요산산화효소 단량체.
  3. 요산산화효소는 요산산화효소 단량체 4개가 결합된 형태를 가지며,
    상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 갖는 것이 특징인 요산산화효소.
  4. 요산산화효소는 요산산화효소 단량체 4개가 결합된 형태를 가지며,
    상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)으로 치환된 구조를 갖는 것이 특징인 요산산화효소.
  5. 화학식 1의 구조를 갖는, 티올 잔기를 갖는 물질과 컨주게이트를 형성하기 위한 Uox-연결체:
    Uox-[L]n (화학식 1)
    상기 Uox는 요산산화효소 단량체로,
    L은 링커이며,
    이때, 상기 Uox는 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine),200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa) 중 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환된 구조를 가지며,
    상기 Uox와 상기 링커는 상기 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결되며,
    상기 L은 티올 잔기와 공유결합을 형성할 수 있는 티올(thiol) 반응기를 포함하고 ,
    상기 링커는 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함하며,
    m은 1 내지 5 중 선택되는 하나이며,
    n은 1 내지 4 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 티올 반응기는 말레이미드 (Maleimide; MAL), 또는
    아릴프로피오로니트릴 (3-Arylpropiolonitriles ; APN) 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 링커가 Uox와 결합하는 구조는
    Figure pat00029
    , 또는
    Figure pat00030
    이며,
    상기 구조에 있어 A1은 요산산화효소 단량체와 연결되고, 또한 A2는 링커와 연결되는 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 링커는
    Figure pat00031
    , 또는
    Figure pat00032
    이며,
    상기 구조의 A1은 요산산화효소 단량체와 연결되는 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 Uox는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)으로 치환된 구조를 가지며, 상기 Uox와 상기 링커는 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결되고, n=1인 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  10. 제 5항에 있어서,
    상기 링커는 (CH2O)4
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 Uox-연결체.
  11. 화학식 2의 구조를 갖는 요산산화효소-복합체:
    U-[L-P]n (화학식 2)
    이때, U는 요산산화효소 단량체 4개가 결합되어 구성되며,
    상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌, 215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신 중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), L-Homopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa) 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa)중 선택되는 하나 이상의 비천연아미노산으로 치환되며,
    L은 링커이며,
    상기 U와 상기 L은 상기 요산산화효소 단량체의 치환된 비천연 아미노산을 통해 연결되며,
    상기 L은 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 또는 (CH2O)m 중 선택되는 하나 이상을 포함하며,
    상기 P는 지속형 단백질이며,
    m은 1 내지 5 중 선택되는 하나이며,
    n은 1, 2, 또는 3 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 지속형 단백질은 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 글로불린, 알부민 (albumin), 또는 인간 혈청 알부민 (human serum albumin), 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 지속형 단백질은 인간 혈청 알부민 (human serum albumin), 인 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 200번째 타이로신이 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 요산산화효소 단량체는 각각 독립적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan)중 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF) 으로 치환되어 L과 연결되며,
    이 때, L은
    Figure pat00033
    , 또는
    Figure pat00034
    이며,
    상기 L의 A1은 요산산화효소의 단량체와 연결되며,
    상기 L의 A2는 지속형 단백질과 연결되며,
    n은 1, 2, 또는 3 중 선택되는 하나이고, 이때 하나의 요산산화효소 단량체에는 1개 이하의 L-P가 결합하는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체
  16. 제 11항에 있어서,
    상기 L은 (CH2O)4
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체
  17. 제11항에 의한 요산산화효소-복합체를 제조하는 방법으로,
    상기 방법은
    제 2항의 요산산화효소를 생산하는 단계,
    친화크로마토그래피로 상기 요산산화효소를 분리하는 단계,
    상기 요산산화효소를 지속형 단백질과 연결(conjugation)하는 단계, 및
    상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함하는 요산산화효소-복합체 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 지속형 단백질과 연결된 요산산화효소를 분리함은 양이온교환 크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 요산산화효소-복합체 제조 방법.
  19. 제11항의 요산산화효소-복합체를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증, 통풍성 신병증, 및 고요산혈증이 특징인 종양용해증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.


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