KR20210047143A - 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물 - Google Patents

위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210047143A
KR20210047143A KR1020190130849A KR20190130849A KR20210047143A KR 20210047143 A KR20210047143 A KR 20210047143A KR 1020190130849 A KR1020190130849 A KR 1020190130849A KR 20190130849 A KR20190130849 A KR 20190130849A KR 20210047143 A KR20210047143 A KR 20210047143A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
uric acid
natural amino
uox
amino acid
acid oxidase
Prior art date
Application number
KR1020190130849A
Other languages
English (en)
Inventor
조정행
김현우
이자연
권인찬
양병섭
박준용
Original Assignee
주식회사 프로앱텍
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 프로앱텍, 광주과학기술원 filed Critical 주식회사 프로앱텍
Priority to KR1020190130849A priority Critical patent/KR20210047143A/ko
Publication of KR20210047143A publication Critical patent/KR20210047143A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/314—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on lung or respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 요산산화효소에 관한 것이다. 본 발명에서 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법이 단백질에 약물전달체가 효율적으로 연결되어, 약물전달체를 연결하기 어려웠던 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 특정위치에 선택적으로 약물전달체가 결합되어 약효가 유지되고 약물 지속성이 증가되며 면역반응 위험성이 감소하고, 균일한 복합체 생성으로 분리에 용이하여 다양한 바이오 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물 {METHOD FOR PRODUCING URATE OXIDASE WITH NON-NATURAL AMINO ACID INCORPORATED SITE-SPECIFICALLY, ALBUMIN CONJUGATE MANUFACTURING PROCESS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF}
본 발명은 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법 및 그의 알부민 복합체 생산 공정에 관한 것이다.
지난 30년 동안 치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에서 임상적인 성공을 거두어 왔으며, 이는 계속해서 제약 분야의 중요한 성장 동기로 작용하고 있다. 치료용 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 반복적인 주사를 피하기 위하여 약효의 지속시간을 연장시키는 것이다. 환자에 투여된 치료용 단백질은 환자의 체내에서 계속해서 제거되기 때문에, 치료용 단백질을 사구체의 여과 (glomerulus filtration) 및 면역반응으로부터 보호하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다.
약물전달체로 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA)을 이용하는 것은 생체 내에서 약물의 반감기를 증가시킬 수 있는 효율적인 방법 중 하나이다. HSA는 특이하게도 2주 이상의 긴 혈청에서의 반감기를 가지고 있는데, 이는 신장에서의 정전기적 반발력 (electrostatic repulsion) 및 내피세표 (endothelium)에서 FcRn에 의해 매개되는 재순환 작용으로 인한 것으로 보인다. HSA를 유전적 결합이나 화학적인 결합에 의해 다른 단백질에 연결시킴으로써, 치료용 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는데, 이러한 기술을 알부미내이션 (albumination)이라고 한다. 펩타이드 또는 작은 사이즈의 단백질의 경우, 알부미내이션 (albumination)에 의해 성공적으로 반감기가 증가하고 약물학적 효과 (PD, pharmacodynamics)가 향상되는 효과를 나타내었다. 하지만 멀티-서브유닛과 복잡한 3차 구조를 가지고 있는 치료용 단백질의 경우, 알부민에 의한 효과를 얻기가 쉽지 않은데, 이는 충분하지 못한 단백질 발현량과 잘못된 폴딩 (misfolding)으로 인한 단백질 활성의 손실이 현저하기 때문이다. 이와 같은 일반적인 알부미내이션 (albumination) 방법의 문제점을 위치 특이적인 단백질 연결 (site-specific protein conjugation)에 의해 해결하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 연결 위치의 유연한 선택 및 특정 위치의 결합은 단백질 폴딩 문제, 멀티-서브유닛의 문제 등에 관계없이 어떤 치료용 단백질도 HSA에 연결되어 사용될 수 있는 가능성을 보여준다.
한편, 확장된 유전자코드는 단백질 연결에 있어 획기적인 전환점을 가져왔는데, 이로 인해 비천연 아미노산 (non-natural amino acids, NNAAs)을 타겟 단백질에 위치 특이적으로, 어떠한 위치에든지 포함시키는 것이 가능해졌으며, 이는 E. coli, yeast 또는 CHO 세포주 등 다양한 발현균주에서 모두 가능하다. 반응적인 비천연 아미노산은 화학적인 핸들로서 작용하는데, 이는 기원이 같은 작용기 (functional group)를 가진 분자가 다른 천연 아미노산과의 교차반응 없이 연결되는 것을 가능하게 해준다. 가장 주목할 점은 이와 같은 기술을 위치 특이적인 PEGylation 및 항체-약물 컨쥬게이트 (antibody-drug conjugate) 등의 다양한 단백질 치료제에 응용하는 것이 가능하다는 것이다. 비천연 아미노산 및 위치 특이적인 단백질 연결방법을 함께 사용하는 경우, 단백질의 본래 기능의 손실 없이 목표로 하는 치료 단백질을 만드는 것이 가능하며, 제작과정을 효율화하는 것이 가능하므로 치료용 단백질을 임상학적으로 더 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 치료 단백질의 반감기를 늘리고, 상기 비천연아미노산을 단백질에 위치특이적으로 결합하여 활성을 떨어뜨리지 않도록 하는 새로운 제조방법이 요구된다.
이에 본 발명자는 알부민과 연결 (Conjugation)된 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는데 있어서, 유가식 배양 (Fed-batch)과 3단계 크로마토그래피를 이용하는 것이, 위 요산산화효소를 고수율로 수득하면서 질환의 치료에 적합한 특정의 Mono-HSA-UoX, di-HSA-UoX를 고순도로 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
WO 2006076571 A1 US 6924264 B1
본 발명의 하나의 목적은, 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 제조방법에 따른 요산산화효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 제조방법에 따른 요산산화효소를 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 제조방법에 따른 요산산화효소를 포함하는 통풍의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, (1) 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계;
(2) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 분리하는 단계;
(3) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결(conjugation)하는 단계; 및
(4) 상기 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함하는, 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 유가식 배양 (Fed-batch)과 3단계 크로마토그래피를 이용하여 요산산화효소를 고수율로 수득하면서 질환의 치료에 적합한 특정의 Mono-HSA-UoX(인간 혈청 알부민이 단일 결합된 요산산화효소), di-HSA-UoX(인간 혈청 알부민이 이중 결합된 요산산화효소)를 고순도로 제공할 수 있다는 점에서 우수한 장점을 가진다.
본 발명에 따른 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 (1) 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계;를 포함한다.
본 발명에서 "비천연아미노산"은 20가지 통상의 아미노산, 파이로리신, 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭하며, 용어 "비천연아미노산"과 유사한 의미로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비천연적으로 코딩된 아미노산", "자연적으로 존재하지 않는 아미노산" 등이 있다. "비천연아미노산"은 천연적으로 코딩된 비천연아미노산의 변형에 의해 자연적으로 발생하나, 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 내로 도입되지는 않는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열의 8번째 타이로신(tyrosine), 16번째 타이로신, 30번째 타이로신, 46번째 타이로신, 65번째 타이로신, 79번째 페닐알라닌(phenylalanine), 87번째 페닐알라닌, 91번째 타이로신, 106번째 트립토판, 120번째 페닐알라닌, 159번째 페닐알라닌, 160번째 트립토판, 162번째 페닐알라닌, 167번째 타이로신, 174번째 트립토판, 186번째 트립토판, 188번째 트립토판, 191번째 페닐알라닌, 204번째 페닐알라닌, 208번째 트립토판, 219번째 페닐알라닌, 233번째 타이로신, 251번째 타이로신, 258번째 타이로신, 259번째 페닐알라닌, 265번째 트립토판 및 279번째 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), 또는 p-propargyloxyphenylalanine (pPa)로 치환된 것일 수 있다. p-azido-L-phenylalanine (AzF)는 아지드기 (azide group)를 포함하고 있는 비천연아미노산 (Non-natural amino acid, NAA)이다.
구체적으로, 160번째 트립토판, 174번째 트립토판 또는 160번째 트립토판과 174번째 트립토판이 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 것일 수 있다. 160번째 트립토판이 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다. 174번째 트립토판이 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타내었다. 160번째 트립토판과 174번째 트립토판이 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 치환된 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열일 수 있다.
요산산화효소에 AzF를 포함시키더라도 본래 요산산화효소의 구조와 기능에 가능한 영향을 미치지 않아야 하므로, 최적의 위치를 결정하기 위하여, AzF와 구조적으로 유사한 방향족 아미노산 (Phe, Trp, Tyr)을 잠정적인 타겟으로 선택하였다. 천연형 요산산화효소에는 10개의 페닐알라닌, 7개의 트립토판, 10개의 타이로신이 있다. 또한, 높은 용매접근성을 가지고 있는 위치가 AzF를 포함시키기에 더 적합하였는데, 왜냐하면 링커와의 충돌 가능성이 높아질수록 컨쥬게이션이 더 효율적으로 이루어질 수 있기 때문이었다. 10개의 페닐알라닌, 7개의 트립토판, 10개의 타이로신에 대해 용매 접근성을 ASA-View server을 이용하여 분석한 결과, 네 개의 위치 (W160, W174, F258, W264)가 상대적으로 높은 용매 접근성을 나타내었다. 이 중에서 F258과 W264는 위치상 요산산화효소 서브유닛의 멀티 복합체형성에 영향을 미칠 수 있는 곳에 위치하였기 때문에 배제하였고, 결과적으로 각각 0.46 및 0.62의 용매 접근성을 나타낸 W160과 W174를 AzF를 포함시키기 위한 위치로 선택하였다. W160 과 W174의 경우, 이전까지 요산산화효소의 구조/기능에서 중요한 역할을 한다는 것이 보고된 바가 없었기 때문에 더욱 적합한 위치라고 판단하였다. 이러한 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소에 관한 내용은 대한민국등록특허공보 10-1637010에 관련 내용이 기재되어 있으며, 해당 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
본 발명에서 "요산산화효소 (urate oxidase)"는 요산을 산화하여 알란토인 (allantoin)과 과산화수소를 생성하는 효소로서 영장류 외의 모든 포유류의 간, 신장 등에 다량 존재한다. 사람의 경우, 요산산화효소의 유전자는 가지고 있으나, 활성화되지 않아서 요산산화효소를 가지고 있지 않으므로 요산의 최종 대사산물이 퓨린이 된다. 혈액 속에 요산의 농도가 과도하게 높아질 경우 통풍의 원인이 되기도 한다. 요산산화효소는 동일한 서브유닛으로 구성된 4합체 (tetramer)의 형태를 가지며, 4개 서브유닛 사이의 인터페이스에 동일한 4개의 활성부위가 위치하고 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 요산 산화효소는 Aspergillus flavus로부터 얻은 것으로서 각각의 서브 유닛은 301개의 아미노산으로 구성되며 분자량은 약 34 kDa이다.
본 발명에서 박테리아는 예를 들어, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 렙토스피라 (Leptospira) 속, 살모넬라 (Salmonellar) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 하이포모나스 (hyphomonas) 속, 크로모박테리움 (Chromobactorium) 속, 노카디아 (Norcardia) 속 또는 펀자이류 (fungi), 또는 효모류 (yeast)에서 선택되는 균주이다. 바람직하게 Escherichia coli 균주이다.
보다 바람직하게, 선행특허 (KR101637010)에 기재된 바와 같은 발현벡터 및 생산 균주를 이용할 수 있다. 일 실시양태에 따르면, E. Coli C321.△A.exp[(pEVOL-AzF)(pQE80-UoX.W160,174amb)]를 이용할 수 있다.
바람직하게 상기 벡터는 기존 pQE80-UoX 플라스미드의 C 말단에 6개의 His이 제거된 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 벡터는 Methanococcus jannaschii로부터 기원한 tyrosyl-tRNA synthetase와 amber suppressor tRNA로 이루어진 AzF 특이적인 engineered pair를 포함하고 있는 pEVOL-pAzF 플라스미드 (Plasmid ID: 31186)를 사용할 수 있다.
pQE80-UoX 플라스미드의 C 말단에 6개의 His이 제거된 발현 벡터를 제작하기 위해 다음과 같은 프라이머를 사용할 수 있다:
F: 5-CTCTCTGAAGAGCAAGCTGTAAGCTTAATTAGCTGAGC-3 (서열번호 6)
R: 5-GCTCAGCTAATTAAGCTTACAGCTTGCTCTTCAGAGAG-3 (서열번호 7)
그리고 나서, 요산산화효소의 160번 및 174번 위치의 트립토판을 amber 코돈 (UAG)으로 대체하기 위하여 상기 pQE80-Uox를 템플레이트로 Site-directed mutagenic PCR을 수행할 수 있으며, 160번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CAATTCACAGTTTTAGGGGTTTCTGAG-3 (서열번호 8) 및 5-CTCAGAAACCCCTAAAACTGTGAATTG-3 (서열번호 9) 프라이머를 사용할 수 있으며, 174번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CACTGAAGGAGACTTAGGATAGAATCCTG-3 (서열번호 10) 및 5-CAGGATTCTATCCTAAGTCTCCTTCAGTG-3 (서열번호 11) 프라이머를 사용할 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
즉, 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 pQE80-UoX.W160,174amb와 pEVOL-pAzF 플라스미드를 포함하는 E.Coli이다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 박테리아는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 pQE80-UoX.W160,174amb와 pEVOL-pAzF 플라스미드를 포함하는 E. Coli C321.이다. 보다 더 바람직하게 본 발명에 따른 박테리아는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 pQE80-UoX.W160,174amb와 pEVOL-pAzF 플라스미드를 포함하는 E. Coli C321.이다.
상기 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 본 발명에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 (1)의 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계에서, 발현 벡터를 통해 요산산화효소를 제작할 수 있다. 기존 요산산화효소의 발현 벡터가 분리정제의 용이성을 위해 N-말단에 6개의 His이 결합된 형태인 것에 반해, 본 발명에서의 발현 벡터는 6개의 His가 제거된 형태일 수 있다. 기존의 6개의 His가 달린 요산산화효소의 발현 벡터는 상업적으로 이용하는 과정에서 예상치 못한 부작용을 야기할 수 있는 반면, 본 발명에 따른 발현 벡터는 His-tag를 포함하지 않음으로써 인체 적용 및 사용에 적합한 효소를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 (1)의 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계에서, 배양 방법은 유가식 배양에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는, 유가식 배양 (fed-batch culture)을 통하여 대장균을 배양하는 것일 수 있다. 대장균은 일정수준으로 균체가 증식하면 pH가 상승하거나 배지 내 영양성분인 탄소원의 고갈로 인하여 성장 저해가 일어날 수 있다. 이를 계속 방치하면 세포의 파괴가 유발된다. 추가 배지를 일정 속도로 공급하는 유가식 배양을 이용하여 배지 농도를 일정한 수준으로 조절이 가능하여 균의 성장을 적절하게 유지할 수 있으며, 성장을 방해하는 부산물인 유기산의 농도를 줄임으로 고농도의 균을 배양할 수 있어, 대장균의 배양 효율을 최대화할 수 있다는 장점을 가진다. 즉, 연속적인 배지 보충으로 소비되는 배지를 다시 채우는, 세포를 성장시킴으로써, 배지 배합물, 세포주, 및 다른 세포 성장 조건에 따라서 고 세포 밀도를 달성하는 잠재력을 가지고 있다. 세포 배양 시, 생산성 확보를 위해 많은 수의 wet cell을 확보하는 것이 중요한데, 유가식으로 배양함으로써 회분식 배양 (Batch culture)에 비해 2배 이상의 wet cell을 얻을 수 있다. 바람직하게는 유가식 배양으로 약 130 g/L의 wet cell을 수득할 수 있다.
상기 배양은 2회에 걸친 종배양 후, 본 배양하는 것일 수 있다. 종 배양은 필요에 따라 1 내지 3회 수행될 수 있다.
구체적으로, 배지는 예컨대 아래의 배지 조건을 포함할 수 있다:
8 내지 16 g/L, 바람직하게 10 내지 14 g/L, 보다 바람직하게 약 12 g/L의 tryptone;
8 내지 16 g/L, 바람직하게 10 내지 14 g/L, 보다 바람직하게 약 12 g/L의 yeast extract;
1.6 내지 4.8 g/L, 바람직하게 2.4 내지 4.0 g/L, 보다 바람직하게 약 3.2 g/L의 KH2PO4,
14 내지 20 g/L, 바람직하게 15.5 내지 18.5 g/L, 보다 바람직하게 약 17.4 g/L의 K2HPO4,
0.02 내지 0.3 g/L, 바람직하게 0.05 내지 0.2 g/L, 보다 바람직하게 약 0.1 g/L thiamine-HCl,
10 내지 30 g/L, 바람직하게 15 내지 25 g/L, 보다 바람직하게 약 20 g/L의 글루코즈, 및
0.8 내지 1.6 g/L, 바람직하게 1.0 내지 1.4 g/L, 보다 바람직하게 약 1.2 g/L MgSO4.
상기 배지는 항생제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린 및 클로람페니콜을 포함할 수 있다. 구체적으로, 50 내지 200 μg/mL, 바람직하게 75 내지 150 μg/mL, 보다 바람직하게 약 100 μg/mL의 암피실린; 및
10 내지 60 μg/mL, 바람직하게 20 내지 50 μg/mL, 보다 바람직하게 약 35 μg/mL의 클로람페니콜을 포함할 수 있다.
종 배양 후, 배양을 위한 inoculation은 약 5 내지 20%, 바람직하게는 10 내지 15%, 보다 바람직하게는 약 13.3%로 수행할 수 있으며, 산소 공급 조건 하에 28 내지 32℃, 바람직하게 30℃ 조건하에 배양할 수 있다.
탄소원 또는 질소원의 농도가 떨어지는 시점에 맞추어 추가 탄소원 배지로서 300 내지 900 g/L, 바람직하게는 500 내지 700 g/L, 보다 바람직하게는 약 600 g/L의 글루코즈; 및
0.8 내지 1.6 g/L, 바람직하게는 1.0 내지 1.4 g/L, 보다 바람직하게는 약 1.2 g/L의 MgSO4; 및
추가 질소원 배지로서 80 내지 160 g/L, 바람직하게는 100 내지 140 g/L, 보다 바람직하게는 약 120 g/L의 yeast extract; 및
1.0 내지 2.0 g/L, 바람직하게는 1.25 내지 1.75 g/L, 보다 바람직하게는 약 1.5 g/L의 ammonium sulfate를 추가적으로 첨가할 수 있다.
이 때, 첨가는 pulse 방식으로 이루어질 수 있으며, 약 10시간 후 1 내지 5시간 간격, 바람직하게는 2 내지 4시간 간격으로 첨가되는 것일 수 있다.
O.D.가 약 10 이상일 때, 0.5 내지 10 mM, 바람직하게 1 내지 5 mM, 보다 바람직하게 약 3 mM의 AzF를 첨가하면서 IPTG 및 Arabinose를 첨가하여 단백질의 발현을 유도할 수 있다.
이후, O.D.가 약 80 내지 100 이상이 되도록 배양한 후, 0℃ 내지 10℃, 바람직하게는 2℃ 내지 6℃, 보다 바람직하게는 4℃에서, 1000 rpm 내지 10000 rpm, 바람직하게는 5000 rpm 내지 7000 rpm, 보다 바람직하게는 약 6000 rpm으로 원심분리한 후, 얻은 펠렛을 -100℃ 내지 -60℃, 바람직하게는 -90℃ 내지 -70℃, 보다 바람직하게는 약 -80℃에서 보관할 수 있다.
본 발명의 상기 (1)의 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계는, pH 6.5 내지 7.5, 바람직하게 약 7.0에서 배양되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태에 의하면 아래 조건으로 유가식 배양을 수행한다:
지속적인 산소공급 하에서 배양온도 30℃, pH 7.0, 600 rpm, 1 vvm, D.O. 100%로 조절하여 배양한다.
1차 종배양은 12 g/L tryptone, 24 g/L yeast extract, 5 g/L glycerol, 2.3 g/L KH2PO4, 12.53 g/L K2HPO4, 100 μg/mL 암피실린, 및 35 μg/mL 클로람페니콜이 포함된 배지에서 0.75% inoculation한 후, 37℃, 200 rpm에서 15시간 배양한다.
2차 종배양은 1차 종배양액을 5% inoculation하고 30℃, 500 rpm, 1 vvm, D.O. 100%에서 O.D.값이 5 이상 되게 배양한다.
본 배양은 12 g/L tryptone, 24 g/L yeast extract, 3.2 g/L KH2PO4, 17.4 g/L K2HPO4, 100 μg/mL 암피실린, 35 μg/mL 클로람페니콜, 및 0.1 g/L thiamine이 포함된 배지에서 2차 종배양액을 13.3% inoculation하고, 30℃, pH 7.0, 600 rpm, 1 vvm, D.O.100%로 조절하여 배양한다.
O.D.가 10 이상일 때 3 mM AzF, 1 mM IPTG, 0.2% arabinose를 첨가하여 단백질의 발현을 유도한다.
탄소원의 농도가 떨어지는 시점에 맞추어 600 g/L의 글루코즈 및 1.2 g/L의 MgSO4를 포함하는 추가 탄소원배지, 및 240 g/L yeast extract 및 1.5 g/L ammonium sulfate를 포함하는 추가 질소원배지를 일정한 속도로 공급해주면서 세포의 성장을 유도한다.
배양 종료 후, 4℃, 6000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻고 이를 -80℃에서 보관한다.
본 발명에 따른 일실시양태에 따르면, (1) 박테리아를 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계는 하기를 포함한다:
서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 pQE80-UoX.W160,174amb와 pEVOL-pAzF 플라스미드로 형질전환된 E. Coli C321. 를 유가식 배양으로 배양하는 것을 포함하며, 이에 따라 요산산화효소의 160번, 174번 위치, 또는 이들 위치의 조합에서의 트립토판을 비천연아미노산인 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)으로 치환하여, 요산산화효소의 160번, 174번 위치, 또는 이들 위치의 조합에 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 (2) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 (2) 단계에서의 요산산화효소를 분리하는 단계는, 2단계, 바람직하게 3단계 이상의 크로마토그래피에 의한 것일 수 있다. 상기 요산산화효소를 분리하는 단계는 구체적으로 소수성 크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 위 소수성 크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피를 순차적으로 진행하여 수율을 높일 뿐만 아니라 Mono-HSA-UoX, di-HSA-UoX와 같이 특정의 요산산화효소-알부민 복합체를 생산하기에 가장 적합한 효소를 제공할 수 있다.
본 발명에서 크기배제크로마토그래피를 추가로 수행함으로써 고순도의 요산산화효소, 바람직하게 95% 이상의 순도를 가지는 요산산화효소를 수득할 수 있다.
이러한 분리된 고순도의 요산산화효소를 이용하여 약물전달체와 결합하는 경우 기존의 방법들에서의 요산산화효소-알부민 복합체보다 높은 순도와 고함량으로 요산산화효소를 포함하기 때문에, 생산 수율을 증가시킬 수 있고 의약 용도로서의 사용에 보다 더 적합하다.
구체적으로, 상기 소수성 크로마토그래피는 Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose FF, Phenyl Bestarose HP, Phenyl Bestarose FF, 또는 Hitrap Phenyl FF(HS)로부터 선택된 수지에서 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는, Hitrap Phenyl FF(HS) 수지에서 수행될 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 Capto-Adhere, Bestarose Diamond MMA, 또는 Hitrap Q HP로부터 선택된 음이온 교환수지에서 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는, Hitrap Q HP 수지에서 수행될 수 있다.
본 발명에서 "크기배제크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC)"라 함은 다양한 크기의 용질이 다공성 매트릭스를 통과하는 속도 (투과도)를 기반으로 혼합물을 분리하는 기술을 의미한다. 즉 분석대상 시료를 젤, 매트릭스, 구슬 (bead)과 같은 다공성 정지상 (stationary phase)이 채워진 컬럼을 통과시키면, 컬럼의 구멍을 통과할 수 없는 큰 분자들은 구멍에 들어가지 못하고 주변의 빈 공간을 통해 빠르게 컬럼을 빠져나오는 반면, 작은 분자들은 컬럼의 구멍을 통해 나오면서 상대적으로 천천히 이동하여 컬럼을 빠져나오는 원리를 이용한 것이다. 이 방법은 일반적으로 완충액 교환 (buffer exchange)을 위한 탈염화 (desalting), 정제를 위한 분리 또는 용질 크기에 따른 분자량 측정에 사용된다.
크기배제 크로마토그래피에서 가장 널리 사용되는 젤은 세파로즈(Sepharose; GE Healthcare), 수퍼로즈 (Superose; GE Healthcare), 세파덱스(Sephadex; Pharmacia), Bio-Gel P(Bio-Rad), 수퍼덱스 ®(superdex' GE Healthcare)와 TSKgel® (silicabased; Sigma) 등의 계열이며, 본 발명의 일실시양태에 따르면, Superdex 200 increase 10.300 GL를 사용할 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따르면 소수성 크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 또는 크기배제크로마토그래피는 아래 조건 하에 수행되는 것일 수 있다:
소수성 크로마토그래피는 소수성 컬럼인 Hitrap phyneyl FF를 이용하여 1 M (NH4)2SO4가 포함된 용매로 평형화한 후 시료를 주입하고 (NH4)2SO4가 포함되지 않은 용매를 이용하여 용출시킨다. 이후 농축하여 버퍼를 20 mM Tris-HCl pH 8.5로 교환하여 2단계의 음이온교환크로마토그래피를 수행한다.
음이온교환크로마토그래피는 음이온 교환 컬럼인 Hitrap Q HP를 이용하여 NaCl gradient 방법으로 용출한다.
더욱 순수하게 분리하기 위해 크기배제 크로마토그래피를 수행한다. 컬럼으로 Superdex 200 increase 10/300 GL을 이용한다.
본 발명에 따른 일실시양태에 따르면, (2) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 분리하는 단계는 하기를 포함한다:
Hitrap phyneyl FF 컬럼을 이용한 소수성 크로마토그래피를 수행하는 단계;
Hitrap Q HP 컬럼을 이용한 음이온교환크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
Superdex 200 increase 10/300 GL 컬럼을 이용한 크기배제크로마토그래피를 수행하는 단계로서,
상기 소수성 크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피의 수행은 순차적으로 진행된다.
본 발명에 따른 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 (3) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결 (conjugation)하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 (3)의 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결하는 단계는 요산산화효소: 약물전달체의 몰비를 1:1 내지, 1:5, 바람직하게 1:1 내지 1:3, 구체적으로 1:1, 1:2, 또는 1:3으로 혼합하여 반응시키는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 약물전달체는 바람직하게는 알부민일 수 있다.
본 발명에서 "알부민"이란 생체 내에 가장 다량으로 널리 분포하여 존재하고 있는 단백질을 지칭한다. 사람 알부민은 아미노산 585개로 이루어지며, 분자량 66 kDa이고, 분자 내에 17개의 디설파이드 결합과 1개의 유리(遊離) 시스테인 잔기를 갖는 단순 단백질이다. 알부민은 간장에서 만들어지고, 혈액 중으로 분비되고, 전 혈장 중 존재하는 단백질의 약 60%를 차지하며, 이의 생리 기능으로서는, (1) 혈장 삼투압의 조절·유지, (2) 빌리루빈, 아미노산, 지방산, 호르몬, 금속 이온, 약물 등의 수송, (3) 영양 불량 시의 아미노산 공급원, (4) 산화·환원 완충능 등이 알려져 있다.
본 발명에서 상기 (3)의 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결하는 단계로 알부민 복합체가 생성된다. 상기 알부민 복합체 (conjugate)는 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소와 약물전달체가 연결된 물질을 의미하며, 본 발명은 특정 조건 하에서 상기 요산산화효소와 약물전달체를 반응시켜 약물전달체가 요산산화효소의 목적하는 위치에 결합된 알부민 복합체를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 (3)에서 요산산화효소를 약물전달체와 연결하는 단계는, 약물전달체가 요산산화효소에 위치특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 요산산화효소를 약물전달체 (예컨대 알부민)와 연결한 복합체는 요산 산화요소에 위치특이적으로 링커를 통하여 약물전달체, 바람직하게는 알부민이 컨쥬게이션 (conjugation)되어 있는 것일 수 있다. 위치특이적으로 컨쥬게이션이 되어있다는 것은 요산산화효소의 특정한 아미노산 잔기 위치에 알부민이 컨쥬게이션되어있다는 것을 의미한다. 이를 위해 요산산화효소의 특정한 위치의 아미노산 잔기를 비천연아미노산으로 대체한 것이며, 대체한 비천연아미노산에 링커를 통하여 알부민이 컨쥬게이션될 수 있다.
이에 따라 본원발명에 따른 비천연아미노산은 첫째, 천연형 요산산화효소의 활성 및 구조에 있어 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기는 제외한 것이다. 즉, 비천연아미노산으로 대체를 하더라도 천연형의 활성 및 구조에 최소한의 영향을 미칠 수 있는 아미노산 잔기를 선택한 것이다. 둘째, 대체하고자 하는 아미노산과 비천연아미노산이 구조적으로 유사해야 한다. 구체적으로 방향족 아미노산을 대체하는 경우 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), p-propargyloxyphenylalanine (pPa), O-propargyl-L0tyrosine (oPa), 또는 L-Homopropargylglycine (HPG)과 같은 비천연아미노산이 적합하다. 셋째, 상대적 용매 접근성이 높을수록 유리하다. 용매 접근성이 높을수록 링커와 연결된 알부민이 컨쥬게이션될 가능성이 높기 때문이다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 요산산화효소를 구성하고 있는 방향족 아미노산 중 상대적 용매접근성이 높은 두 개의 트립토판을 p-Azido-L-phenylalanine (AzF)로 대체한 경우, 효율적으로 알부민을 컨쥬게이션할 수 있다.
이때 사용되는 용어 "위치특이적"은 요산산화효소의 아미노산 중 약물전달체와 결합시키고자 하는 아미노산 위치에 약물전달체가 특이적으로 결합하는 것, 바람직하게, 트립토판 잔기의 아민에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이와 같이 위치특이적으로 약물전달체를 결합시키는 경우, 제조하고자 하는 복합체 외에, 생리활성 등에 중요한 아미노산 잔기와 약물전달체가 결합하여 지속형 제제의 생리활성이 저하된 부수적인 결합체가 제조되는 문제점을 미연에 방지할 수 있다.
본 발명에서 알부민은 링커를 통하여 상기 대체된 비천연아미노산에 연결이 되며, 대체된 비천연아미노산의 종류 및 비천연아미노산과 링커를 연결하는 화학반응의 종류에 따라 사용하는 링커의 종류가 달라질 수 있다. 예를 들어, 비천연아미노산으로서 p-Azido-L-phenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC)을 통해 링커를 연결하는 경우, cycloalkyne이 포함되어 있는 링커를 사용할 수 있으며, 비천연아미노산으로서 p-ethynyl-phenylalanine이나 p-propargyloxyphenylalanine을 사용하고 copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) 반응을 통해 링커를 연결하는 경우, azide 그룹을 가지고 있는 링커를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 비천연아미노산으로서 p-Azido-L phenylalanine을 사용하고 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) 반응을 통해 연결하는 경우, cyclooctyne이 포함되어 있는 DBCO-PEG4-MAL(DBCO-PEG4-Maleimide)을 링커로 사용하였다. DBCO-PEG4-MAL은 이형의 서로 다른 기능을 가지고 있는 친수성 링커로서, DBCO (Dibenzocyclooctyne)는 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 반응을 통해 아지드 작용기 (azide functional group)에 화학 선택적으로 연결될 수 있다. 따라서 Uox의 특정 위치에 AzF가 포함되도록 유전공학적으로 조작하면, Uox가 DBCO에 대해 반응하도록 만들 수 있다.
SPAAC는 스트레인 프로모티드된 아지드-알킨 고리 첨가 반응 (strain-promoted azidealkyne cycloaddition)을 의미하고, CuAAC는 구리 촉매 아지드-알킨 고리 첨가 반응을 의미한다.
상기 SPAAC 반응은 구리 촉매를 사용하지 않아 표적 단백질의 기능 및 특성을 손상시키지 않는다. 또한, SPAAC 반응은 상온 및 수용액 조건에서 반응이 활성화되기 때문에, 단백질 고정화 방법에 적합하다.
본 발명에 있어서, DBCO는 디벤조시클로옥틴을 의미한다.
본 발명의 알부민과 링커의 연결에 있어서, 링커는 알부민의 FcRn-결합 도메인에서 이격된 아미노산 잔기에 결합하는 것을 특징으로 한다. 알부민의 FcRn-결합 도메인은 알부민으로 인한 단백질의 반감기를 증가시키는 FcRn-매개 리싸이클링 (FcRn-mediated recycling)에서 중요한 역할을 하는 부위이기 때문에 링커는 가능한 FcRn-결합 도메인에서 이격된 아미노산 잔기에 결합하는 것이 유리하다. 바람직하게는, 알부민이 2개 결합된 요산산화효소(Di-HSA-UoX)에서, 알부민이 1개 결합된 요산산화효소(Mono-HSA-UoX)보다 FcRn-매개 리싸이클링에 의해 반감기가 증가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 알부민과 링커는 다양한 결합방법에 의해 연결될 수 있다. 바람직하게는, FcRn-결합 도메인에서 이격된 위치에 있는 상기 알부민의 34번째 시스테인 (Cystein) 아미노산 잔기에 링커가 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 알부민에는 천연형 알부민 및 알부민 변이체가 포함되며, 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA)을 요산산화효소에 컨쥬게이션하는 경우 요산산화효소의 혈청 내 반감기가 현저하게 증가하는 효과를 나타내었다.
상기 알부민과 링커의 연결은 (3) 단계 전에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (3) 단계에서 반응이 종결된 후, 미반응 링커를 제거하기 위해 PD-10으로 desalting하는 과정이 추가로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 10 내지 30 mM의 sodium phosphate를 이용하여 pH 5 내지 8에서 desalting이 일어나는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 20 mM의 sodium phosphate를 이용하여 pH 6에서 desalting이 일어나는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일실시양태에 따르면, (3) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결 (conjugation)하는 단계는 하기를 포함한다:
약물전달체인 알부민의 34번 위치에 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-MAL을 연결하여 HSA-PEG4-DBCO를 제조하는 단계, 여기서 상기 알부민과 링커의 반응 몰 비율은 1:1 내지 1:8이다; 및
비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC)을 이용하여 HSA-PEG4-DBCO와 연결하여 위치특이적으로 알부민과 요산산화효소를 연결하는 단계, 여기서 요산산화효소와 알부민의 반응 몰 비율은 1:1 내지 1:5이다.
본 발명에 따른 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 (4) 상기 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 (4) 단계에서의 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계는, 2단계, 바람직하게 3 단계 이상의 크로마토그래피에 의한 것일 수 있다. 상기 요산산화효소를 분리하는 단계는 양이온교환크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 위 양이온 크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피를 순차적으로 진행하여 수율을 높일 뿐만 아니라 Mono-HSA-UoX, di-HSA-UoX와 같이 특정의 요산산화효소-알부민 복합체를 생산하기에 가장 적합한 효소를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 크기배제크로마토그래피를 추가로 수행함으로써 고순도의 요산산화효소-알부민 복합체를 수득할 수 있다. 또한, 알부민이 1개 결합된 mono-HSA-UoX와 알부민이 2개 결합된 di-HSA-UoX의 분리를 위해 크기배제크로마토그래피가 사용될 수 있다.
이러한 분리된 요산산화효소를 이용하여 약물전달체와 결합하는 경우 기존의 방법들에서의 UoX-HSA의 결합체보다 높은 순도와 고함량으로 효소를 포함하기 때문에, 의약 용도로서의 사용에 보다 더 적합하다.
구체적으로, 상기 양이온교환크로마토그래피는 Capto-MMC, Bestarose Diamond MMC, 또는 Hitrap SP HP로부터 선택된 양이온 교환수지에서 수행된다. 바람직하게는, Hitrap SP HP 양이온 교환수지에서 수행될 수 있다. 상기 양이온교환크로마토그래피는 미반응된 알부민을 제거하기 위한 것일 수 있다.
상기 음이온교환크로마토그래피는 Capto-Adhere, Bestarose Diamond MMA, 또는 Hitrap Q HP로부터 선택된 음이온 교환수지에서 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는, Hitrap Q HP 수지에서 수행될 수 있다. 상기 음이온교환크로마토그래피는 잔존하는 요산산화효소를 제거하기 위한 것일 수 있다.
크기배제 크로마토그래피에서 가장 널리 사용되는 젤은 세파로즈(Sepharose; GE Healthcare), 수퍼로즈 (Superose; GE Healthcare), 세파덱스(Sephadex; Pharmacia), Bio-Gel P (Bio-Rad), 수퍼덱스® (superdex' GE Healthcare)와 TSKgel® (silicabased; Sigma) 등의 계열이며, 본 발명의 일실시양태에 따르면, Superdex 200 increase 10.300 GL를 사용할 수 있다. 상기 크기배제 크로마토그래피는 물질을 보다 더 순수하게 분리하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따르면 양이온교환크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 또는 크기배제크로마토그래피는 아래 조건 하에 수행되는 것일 수 있다:
양이온교환크로마토그래피는 양이온 교환 컬럼인 Hitrap SP HP를 이용한다. 20 mM sodium phosphate pH 6.0으로 평형화한 후 시료를 주입하고 0~100% NaCl gradient를 적용하여 용출시킨다. 분획을 모아 농축하고 20 mM Bis-tris pH 6.5로 버퍼를 교환한다.
음이온교환크로마토그래피는 음이온 교환 컬럼인 Hitrap Q HP를 이용하여 NaCl gradient 방법으로 용출한다. 20 mM Bis-tris pH 6.5로 평형화한 후 시료를 주입하고 0~100% NaCl gradient를 적용하여 용출한다.
더욱 순수하게 분리하기 위해 크기배제 크로마토그래피를 수행한다. 컬럼으로 Superdex 200 increase 10/300 GL을 이용한다.
본 발명에서 상기 (4)의 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계에서
상기 음이온교환크로마토그래피와 크기배제크로마토그래피는 상기 단계 (2)에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (4)의 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계에서 크기배제크로마토그래피에 의하여 약물전달체가 1개 결합된 복합체 (Mono-HSA-UoX)와 약물전달체가 2개 이상 결합된 복합체 (Di-HSA-UoX)가 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 일실시양태에 따르면, (4) 상기 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계는 하기를 포함한다:
Hitrap SP HP 컬럼을 이용한 양이온교환크로마토그래피를 수행하는 단계;
Hitrap Q HP 컬럼을 이용한 음이온교환크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
Superdex 200 increase 10/300 GL 컬럼을 이용한 크기배제크로마토그래피를 수행하는 단계로서,
상기 양이온교환크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피의 수행은 순차적으로 진행된다.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소를 제공한다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 약물전달체가 1개 결합된 복합체 (Mono-HSA-UoX)와 약물전달체가 2개 이상 결합된 복합체 (Di-HSA-UoX)로서 순도가 매우 높을 뿐만 아니라 단백질에 약물전달체가 효율적으로 연결되어, 약물전달체를 연결하기 어려웠던 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 약물전달체로서 알부민이 사용되는 경우, 알부민은 인체유래 물질로 면역원성이 거의 없기 때문에 면역원성이 있다고 알려진 요산산화효소를 알부민과 결합시킴으로써 면역원성을 감소시킬 수 있다.
약물전달체와 요산산화효소가 결합함으로써 요산산화효소 단독일 때보다 요산산화효소-약물전달체 복합체의 크기가 증가하게 되어 신장 사구체 여과(glomerular filtration)를 막아 약물의 반감기를 향상시킬 수 있다.
발명에서 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 특정위치에 선택적으로 약물전달체가 결합되어 약효가 유지되고 약물 지속성이 증가되며 면역반응 위험성이 감소하였다. 따라서 균일한 복합체의 이용을 통해 질환의 치료에 장점을 가진다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 지속형 단백질 치료제뿐만 아니라 이중항체 (bi-specific antibody), 항체약물복합체 (antibody-drug conjugate)에 적용할 수 있다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 바람직하게는 약물전달체가 2개 이상 결합되어 안정성이 개선된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소 중 약물전달체가 2개 이상 결합된 복합체는 약 230 내지 310 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 약물전달체가 2개 결합된 복합체일 수 있으며, 약 250 내지 290 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 약물전달체가 2개 결합된 복합체이고, 약 270 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 약물전달체로서 인간 혈청 알부민이 2개 결합된 요산산화효소를 제공한다. 이러한 약물 전달체들은 앞서 언급된 비천연 아미노산을 포함하는 위치에서, 바람직하게 160번째 트립토판과 174번째 트립토판이 비천연아미노산으로 치환된 위치에 연결된 요산산화효소일 수 있다.
상기 약물전달체가 2개 이상 결합된 복합체는 약물전달체가 1개 결합된 복합체보다 분자량이 커 신장 여과율이 낮아 반감기가 향상되며, 상기 약물전달체가 알부민인 경우, 인체로부터 유래하여 면역원성이 거의 없는 알부민이 2개 이상 결합된 것이므로 1개 결합된 경우보다 면역원성이 낮다는 측면에서 장점을 가진다.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "고요산혈증 (Hyperuricemia)"이란 혈액에 요산의 농도가 증가되어 있는 질환이다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생한다. 37℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7 mg/dl이다. 그러므로 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 표준편차를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 대부분의 역학 조사에서 남자의 상위 한계는 7 mg/dl, 여자는 6 mg/dl이다. 이러한 이유 때문에 고요산혈증의 실질적인 상위 한계 수준은 7.0 mg/dl 이상인 경우로 정의되고 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애는 요산이 정상 수치보다 많아져서 신장이 요산을 배설시키는 능력이 저하될 경우 혈액 중에 여분의 요산이 남아있게 되고 혈중 요산치가 높아져 발생되는 질환이나 질병을 말한다.
구체적으로, 상기 고요산혈증 관련 대사 장애에는 통풍, 요산 결정, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 단일 관절성 관절염, 염증성 관절염의 통증 발작, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증이 포함된다. 장기적인 신결석증 및 통풍성 신병증은 신장 손상 및 신부전의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
상기 통풍은 통상적으로 급성 염증성 관절염의 재발성 발작을 특징으로 하는 의학적 상태이며, 엄지 발가락 기저부의 중족-지골 관절에서 흔하게 발생한다. 또한, 통풍은 관절, 힘줄 및 주변 조직들 내에서 결정화되고 침착 되는 혈중 요산에 의해 유발되며, 통풍 결절, 신장 결석 또는 요산염 신병증으로서 존재할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 통풍, 고요산혈증, 또는 고요산혈증 관련 대사 장애를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 통풍, 고요산혈증, 또는 고요산혈증 관련 대사 장애에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 요산산화효소를 포함하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 요산산화효소를 유효 성분으로 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 요산산화효소는 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％ 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 통풍, 고요산혈증, 또는 고요산혈증 관련 대사 장애를 예방 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 조성물의 투여로 질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 요산산화효소의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명의 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법은 단백질에 약물전달체가 효율적으로 연결되어, 약물전달체를 연결하기 어려웠던 단백질의 반감기를 향상시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 방법에 의하여 생산된 요산산화효소는 특정위치에 선택적으로 약물전달체가 결합되어 약효가 유지되고 약물 지속성이 증가되며 면역반응 위험성이 감소하고, 균일한 복합체 생성으로 분리에 용이하여 다양한 바이오 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은, 요산산화효소 발현 벡터의 기존의 UoX-W160,174AzF(6xHis)(Templete)와 His-tag가 제거된 서열(Deletion)을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는, 요산산화효소 생산 균주의 유가식 배양 프로파일을 나타낸 도이다.
도 3은, 요산산화효소 분리를 위한 소수성 크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, 요산산화효소 분리를 위한 음이온교환크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 요산산화효소 분리를 위한 크기배제크로마토그래피 결과, SDS-PAGE 겔 사진, SEC-HPLC 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 5(a)는 요산산화효소 분리를 위한 크기배제크로마토그래피 결과 및 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸 도이다. 도 5(b)는, 요산산화효소 순도 분석을 위한 고성능액체크로마토그래피-크기배제크로마토그래피(SEC-HPLC) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, SDS-PAGE 분석을 통한 요산산화효소의 AzF 도입을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은, 요산산화효소-약물전달체 복합체의 분리를 위한 양이온교환크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다.
도 8은, 요산산화효소-약물전달체 복합체의 분리를 위한 음이온교환크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다.
도 9는, 요산산화효소-약물전달체 복합체의 분리를 위한 크기배제크로마토그래피 결과 및 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸 도이다. 구체적으로 도 9의 (a)는 UoX : HSA-DBCO = 1 : 1 반응 몰 비율에 따른 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX의 크기배제크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다. 도 9의 (b)는 UoX : HSA-DBCO = 1 : 3 반응 몰 비율에 따른 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX의 크기배제크로마토그래피 결과를 나타낸 도이다.
도 10은, mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX 분리 결과를 SEC-HPLC로 분석한 도이다.
도 11은, 고요산혈증 Mouse 동물모델에서 요산산화효소-약물전달체 복합체의 혈액 내 요산수치 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 12는, 고요산혈증 Rat 동물모델에서 요산산화효소-약물전달체 복합체의 혈액 내 요산수치 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 13은, 고요산혈증 Rat 동물모델의 신장 부검 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 13의 (a)는 동물모델의 신장 외관을 나타낸 도이다. 도 13의 (b)는 동물모델의 조직형태학적 변화를 나타낸 도이다.
도 14는, SD-Rat에서의 혈액 내 요산산화효소와 요산산화효소-약물전달체 복합체의 시간 별 효소 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는, SD-Rat내에서의 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX 효소 활성 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명에 있어서 사용된 실험 재료는 다음과 같다. p-아지도-L-페닐알라닌(AzF)은 Chem-Impex International (Wood Dale, IL)로부터 구입하였으며, 인간혈청 유래의 20% 알부민주는 녹십자 (Korea , Gyeonggi-do)로부터, Vivaspin centrifuge concentrator는 Sartorius Corporation (Bohemia, NY)로부터, DBCO-PEG3-FITC는 Conju-Probe, LLC (San Diego, CA)로부터, DBCO-PEG4-MAL은 Click chemistry tools (Scottsdale, AZ)로부터, PD-10 desalting column, Hitrap phenyl FF hydrophobic interaction column, HiTrap Q HP cation exchange column, HiTrap SP HP anion exchange column, Superdex 200 increase 10/300 GL size exclusion column 및 AKTA pure 25L은 GE Health care (Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. 그 외 모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
실시예 1. 요산산화효소 생산을 위한 6개의 His가 제거된 발현벡터의 제작
기존 요산산화효소 제작을 위한 발현 세포주 (선행특허 KR 10-1637010에서 개발)는 C 말단에 6개의 His (히스티딘)이 붙어 있어 향후 비임상 또는 임상시험 시 면역원성 및 예측할 수 없는 부작용이 발생할 가능성이 있어 상용화 균주로는 부적합하다. 따라서 6개의 His이 제거된 상용화 균주를 제작하였다.
비천연아미노산을 삽입할 수 있는 벡터는 Methanococcus jannaschii로부터 기원한 tyrosyl-tRNA synthetase와 amber suppressor tRNA로 이루어진 AzF 특이적인 engineered pair를 포함하고 있는 pEVOL-pAzF 플라스미드(Plasmid ID: 31186)를 Addgene(Cambridge, MA)로부터 구입하여 추가적인 수정 없이 사용하였다.
기존 pQE80-UoX 플라스미드의 C 말단에 6개의 His이 제거된 발현 벡터를 제작하기 위해 다음과 같은 프라이머를 사용하였다:
F: 5-CTCTCTGAAGAGCAAGCTGTAAGCTTAATTAGCTGAGC-3 (서열번호 6)
R: 5-GCTCAGCTAATTAAGCTTACAGCTTGCTCTTCAGAGAG-3 (서열번호 7)
요산산화효소의 160번 및 174번 위치의 트립토판을 amber 코돈(UAG)으로 대체하기 위하여 상기 pQE80-Uox를 템플레이트로 Site-directed mutagenic PCR을 수행하였다. 160번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CAATTCACAGTTTTAGGGGTTTCTGAG-3 및 5-CTCAGAAACCCCTAAAACTGTGAATTG-3 프라이머를 사용하였으며, 174번 위치에 amber 코돈을 도입하기 위해 5-CACTGAAGGAGACTTAGGATAGAATCCTG-3 및 5-CAGGATTCTATCCTAAGTCTCCTTCAGTG-3 프라이머를 사용하였다.
사용한 균주의 유전자 서열분석 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 균주에서 His-tag이 제거되었음을 확인하였다.
실시예 2. 요산산화효소 생산균주의 유가식 배양 공정
비천연아미노산이 도입된 요산산화효소의 대량 생산을 위해 탄소원과 질소원을 일정한 속도로 공급해주는 유가식 배양 (Fed-batch)공정을 실시하였다. 균주는 E. Coli C321.△A.exp[(pEVOL-AzF)(pQE80-UoX.W160,174amb)]을 사용하였다. 상기 E. Coli C321.△A.exp[(pEVOL-AzF)(pQE80-UoX.W160,174amb)]는 E. coli C321.△A.exp(Addgene, ID: 49018)에 pEVOL-pAzF와 실시예 1의 pQE80-UoxW160.174amb로 동시에 형질전환시켜 제조된 것으로, 이하 E. Coli C321.△A.exp[(pEVOL-AzF)(pQE80-UoX.W160,174amb)]로 명명한다.
본 배양기는 75 L 배양기 (Sartorius Corporation, Bohemia, NY)를 사용하였다. 종배양은 2회 실시하였으며, 본 배양의 배지 용량 30 L로 조절하여 시작하였다. 배양온도 30℃, pH 7.0, 600 rpm, 1 vvm, D.O. 100%로 조절하여 배양하면서 배양 과정중 산소를 지속적으로 공급해주었다. 1차 종배양은 배지 (12 g/L tryptone, 24 g/L yeast extract, 5 g/L glycerol, 2.3 g/L KH2PO4, 12.53 g/L K2HPO4, 100 μg/mL ampicillin, 35 μg/mL chloramphenicol)를 제조하여 0.75% 접종하고 37℃, 200 rpm에서 15시간 배양하였다. 2차 종배양은 1차 종배양액을 5% 접종하고 30℃, 500 rpm, 1 vvm, D.O. 100%에서 O.D. 5 이상 배양하였다. 본 배양은 배지 (12 g/L tryptone, 12 g/L yeast extract, 3.2 g/L KH2PO4, 17.4 g/L K2HPO4, 100 μg/mL ampicillin, 35 μg/mL chloramphenicol, 0.1 g/L thiamine)제조하여 2차 종배양액을 13.3% 접종하고, 30℃, pH 7.0, 600 rpm, 1 vvm, D.O. 100%로 조절하여 배양하면서 O.D. 10이상일 때 3 mM AzF, 1 mM IPTG와 0.2% arabinose를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 또한, 탄소원의 농도가 떨어지는 시점에 맞추어 추가 탄소원배지 (600 g/L glucose, 1.2 g/L MgSO4)와 추가 질소원 배지 (240 g/L yeast extract, 1.5 g/L ammonium sulfate)를 일정한 속도로 공급해주면서 세포의 성장을 유도하였다. 배양종료 후 4℃, 6,000 rpm으로 10분 동안 원심분리를 하여 펠렛을 얻은 다음 -80℃에서 보관하고 실험에 사용하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대장균은 일정수준으로 균체가 증식하면 pH가 상승하거나 배지 내 영양성분인 탄소원의 고갈로 인하여 성장저해가 일어나며, 계속 방치하면 세포의 파괴가 유발되기 때문에 이를 해결하고자 추가 배지를 일정속도로 공급하는 유가식 배양 (Fed-batch)을 이용하여 배양하였다. 초기 본 배양배지를 30 L로 맞추어 배양하였고, O.D. 10이상일 때 AzF와 과발현유도를 위해 IPTG, arabinose를 첨가하였다. 탄소원인 포도당이 거의 소모되는 시점인 배양 11시간 후 추가배지를 일정속도로 공급하면서 유가식 배양을 진행하였다. 그 결과 57시간 후 O.D. 47.9에 도달하였고, 최종 배지량은 51 L이며 수거한 펠렛은 6.6 kg으로 약 130 g/L의 수율을 보였다.
실시예 3. AzF가 도입된 요산산화효소(UoX)의 분리정제 공정
수거한 펠렛으로부터 UoX를 분리정제하기 위해 3단계 크로마토그래피를 수행하였다. 펠렛을 용해용 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 8.5, 1 M (NH4)2SO4에 용해시켜주고 1 mg/mL Lysozyme를 첨가하여 30분 용해시켰다. 10,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액만을 얻은 다음 크로마토그래피로 정제하였다. 1단계로 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법으로 소수성 컬럼 (Hitrap phenyl FF)을 이용하여 1 M (NH4)2SO4가 포함된 용매로 평형화한 후 시료를 주입하고 (NH4)2SO4가 포함되지 않은 용매를 이용하여 용출시켰다. 이후 농축하여 버퍼를 20 mM Tris-HCl pH 8.5로 교환하여 주고 2단계 음이온교환크로마토그래피를 수행하였다. 음이온 교환 컬럼 (Hitrap Q HP)을 이용하여 NaCl gradient 방법으로 용출시켰다. 이후 순도를 높이기 위해 3단계 크기배제 크로마토그래피를 수행하였으며, 크기배제 컬럼 (Superdex 200 increase 10/300 GL)을 이용하여 분리하고, SDS-PAGE와 SEC-HPLC로 분석하여 순도를 확인하였다. 비교실험을 위해 E. Coli Top10 (pQE80-UoX-WT)을 사용하여 AzF를 주입하는 공정을 제외하고는 동일한 방법으로 배양 및 분리하여 UoX-WT를 생산하였다.
그 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
도 3 내지 도 5의 (a)에서 확인할 수 있듯이, 요산산화효소의 총 수율은 1 내지 10 mg/g이었다.
도 5의 (b)에서 확인할 수 있듯이, SEC-HPLC로 분석한 결과 순도 95% 이상의 UoX를 분리하였다.
고순도로 분리정제한 요산산화효소에서 엔도톡신과 불순물 확인을 위하여 Endotoxin Kinetics 방법을 이용하여 세균성 독소 존재유무를 판단하였으며, 숙주 유래 단백질 분석을 위해 Host cell protein kit를 이용하여 불순물을 확인하고 정량화하였다.
그 결과 고순도로 분리정제한 요산산화효소에서 엔도톡신은 5 EU/mg 이하로 검출되었고, HCP는 10 ppm 이하로 검출되었다.
실시예 4. Strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC)를 이용한 UoX의 AzF 도입여부 확인
10 μM의 농도로 맞춘 UoX-WT와 UoX-AzF를 각각 80 μM의 DBCO-PEG3-FITC와 2시간 반응시킨 후 PD-10 컬럼으로 미 반응 DBCO-PEG3-FITC를 제거한 후 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. DBCO-PEG3-FITC와 반응시켜 SDS-PAGE를 통해 분석하였고, Blue/white transilluminator (Bioneer, Daejoen)로 시각화하였다. Azide기와 DBCO는 결합하여 triazole을 형성하고, FITC (Fluorescein isothiocyanate)는 blue light (470 nm) 영역에서 excitation되어 녹색을 띠는 성질을 이용하여 UoX의 AzF 도입 여부를 확인하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, UoX-WT은 형광을 나타내지 않았고, UoX-AzF는 강한 형광을 나타내었다. 이는 요산산화효소의 특정위치(W160, W174)에 AzF가 도입되어 있음을 알 수 있다.
실시예 5. HSA와 UoX의 conjugate 제조 및 분리공정
약물전달체로 인간혈청알부민 (Human serum albumin, HSA)을 사용하였으며, 별도 분리공정 없이 버퍼만(PBS pH 7.4) 교환하여 사용하였다. HSA의 34번 위치의 Cystein과 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-MAL을 마이클첨가 (Michael addition) 반응을 통해 연결하여 HSA-PEG4-DBCO를 만들었다. 알부민과 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-MAL의 반응 몰 비율은 1:1, 1:2, 1:4, 1:8로 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 잔존 링커 제거 및 버퍼를 교환하기 위해 PD-10 column을 이용하여 20 mM sodium phosphate pH 6.0로 교환하였다.
HSA-PEG4-DBCO의 conjugation 수율을 확인한 결과 1:4로 반응 시 93.2%의 수율을 얻을 수 있었으며, 1:8로 반응 시 103.9%의 수율을 얻을 수 있었다. 이중기능성 링커인 DBCO-PEG4-MAL의 경우 가격이 고가인 점을 감안하여 1:4 몰 비율로 실험에 사용하였다.
UoX-AzF에 위치 특이적으로 HSA를 연결하기 위하여 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC)을 이용하여 UoX와 HSA의 conjugate를 제조하였다. Cu-free 조건에서 Azide기와 DBCO가 결합하여 안정한 triazole를 형성하는 클릭화학반응을 이용하였다. 아지드기가 도입된 UoX-AzF와 HSA-PEG4-DBCO를 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:3 몰 비율로 상온에서 반응시켜 3단계 크로마토그래피를 진행하여 conjugation 수율을 산출하였다. 1단계로 미 반응된 알부민을 제거하기 위해 양이온 교환 컬럼 (Hitrap SP HP)를 이용하였다. 20 mM sodium phosphate pH 6.0으로 평형화한 후 시료를 주입하고 0~100% NaCl gradient를 적용하여 용출시켰다. 분획을 모아 농축하고 20 mM Bis-tris pH 6.5로 버퍼를 교환하였다. 2단계로 잔존 UoX를 제거하기 위해 음이온 교환 컬럼 (Hitrap Q HP)를 이용하여 하였다. 20 mM Bis-tris pH 6.5로 평형화한 후 시료를 주입하고 0~100% NaCl gradient를 적용하여 용출시켰다. 분획을 모아 농축하고 3단계로 크기배제 컬럼 (Superdex 200 increase 10/300 GL)을 이용하여 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX를 순수하게 분리하고 SEC-HPLC분석과 SDS-PAGE를 분석하여 순도를 확인하였다. 분리된 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX는 Alburicase로 명명하였다.
이를 표 1 및 도 7 내지 10에 나타내었다.
Figure pat00001
표 1에서 확인할 수 있듯이 HSA-DBCO와 UoX의 몰 비율에 따른 conjugation 수율은 2:1의 몰 비율로 반응시 가장 높은 수율을 보였다.
도 9의 (a)에서 확인할 수 있듯이, SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 101 kDa 사이즈의 새로운 밴드가 생긴 것을 확인할 수 있었다.
도 9의 (b)에서 확인할 수 있듯이, 몰 비율이 높아짐에 따라 mono-HSA-UoX보다 di-HSA-UoX의 비율이 높아짐을 확인할 수 있었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, SEC-HPLC로 분석한 결과 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX가 분리되었음을 확인하였다.
실시예 6. UoX-HSA의 효소 활성 측정
UoX-HSA의 효소 활성을 분석하기 위해 분광분석방법을 사용하였다. 60 nM의 UoX-HSA에 100 μM 요산 (uric acid)를 반응시켜 시간당 감소하는 요산의 농도를 요산의 최대흡광 파장인 293 nm에서 Ultrospec 2100 pro UV/Visible spectrophotometer (Biochrom, cambridge, UK)을 사용하여 분석하였다. 효소활성의 단위 (U/mL)는 흡광도 변화량 (△ABS293nm/min)에 총 반응부피를 곱하고 요산의 몰 흡광계수 (12.3 mM-1cm-1)로 나눈 다음 효소의 부피를 나누어 산출하였다. 효소활성의 단위인 U/mL은 실온에서 1분당 1 μM의 요산을 알란토인 (allanton)으로 전환할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 단위질량 당 효소의 활성 (specific activity, U/mg)은 반응에 사용된 효소의 양으로 나누어 산출하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, UoX-WT, mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX의 효소활성을 비교한 결과 각각 0.38 U/mL, 0.35 U/mL 및 0.37 U/mL로 측정되었다. 이는 알부민 conjugation이 UoX의 효소 활성에 영향을 미치지 않으며, UoX-HSA 복합체가 알부민의 1개 또는 2개 결합에도 활성을 유지하고 있음을 확인하였다. 단위질량 당 효소활성 (U/mg)의 차이는 알부민이 결합된 UoX-HSA 복합체의 분자량 증가에 의한 것이다.
알부민이 2개 결합된 Di-HSA-UoX가 알부민이 1개 결합된 Mono-HSA-UoX보다 더 높은 효소 활성을 보임을 확인하였다.
실시예 7. 통풍 유도 동물모델을 이용한 UoX-HSA의 요산수치 감소 효과 확인
통풍 유도 동물모델을 이용한 UoX-HSA의 요산수치 감소 효과는 Mouse와 Rat에서 실험을 진행하였다.
Mouse 실험동물은 습도 50 ± 5%, 온도 24～26℃로 유지되는 환경에서 사육된 8~10주령의 수컷 C57BL 마우스(C57BL mouse, male, 20-25 g, 샘타코)을 사용하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 고요산혈증 유도는 요산의 전구체인 하이포잔틴 (Hypoxanthine)을 3% starch 용액 1mL에 녹여서 500 mg/kg의 농도로 경구 투여하고 투여 10분 후 요산산화효소 억제제인 칼륨 옥소네이트 (Potassium oxonate)를 0.5% sodium carboxymethylcellulose 1 mL에 용해시키고 250 mg/kg의 농도로 복강 주사하여 고요산혈증을 유도하였다. 대조군으로 사용한 Allopurinol은 요산 형성 억제제로써 하이포잔틴과 칼륨 옥소네이트 복강주사하고 10분 후 50 mg/kg 농도로 경구투여 하였다. UoX-WT (Rasburicase)와 UoX-HSA (Alburicase)를 각각 3.4 mg/kg과 5.0 mg/kg의 농도로 정맥 투여하여 시간에 따라 혈중 내 요산수치의 감소여부를 평가하였다. 실험군을 하기 표 3와 같이 투여경로와 투여용량에 따라 나누어 UoX-HSA를 투여하고 시간에 따라 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈중 내 요산 수치는 FRAP 방법으로 수치화 하였다. 혈액 30 uL와 working 용액(10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3, 300 mM Acetate buffer) 300 uL를 혼합하여 흡광도 593 nm에서 측정하였다.
Rat 실험동물은 습도 50 ± 5%, 온도 24～26℃로 유지되는 환경에서 사육된 7주령의 수컷 스프라그-도올리 랫 (Sparague-dawley rat, male, 250-280 g, 샘타코)을 사용하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 고요산혈증 유도는 요산의 전구체인 하이포잔틴 (Hypoxanthine)을 3% starch 용액 1 mL에 녹여서 500 mg/kg의 농도로 경구 투여하고 투여 1시간 후 요산산화효소 억제제인 칼륨 옥소네이트 (Potassium oxonate)를 0.5% sodium carboxymethylcellulose 1 mL에 용해시키고 250 mg/kg의 농도로 7일간 경구 투여하여 고요산혈증을 유도하였다. 대조군으로 사용한 Allopurinol은 요산 형성 억제제로 고요산혈증 유도와 함께 7일간 투여하여 요산 형성을 억제하였다. UoX-WT (Rasburicase)와 UoX-HSA (Alburicase)를 각각 3.4 mg/kg과 5.0 mg/kg으로 정맥 투여하여 시간에 따라 혈중 내 요산수치의 감소여부를 평가하였다. 실험군을 하기 표 4와 같이 투여경로와 투여용량에 따라 나누어 UoX-HSA를 투여하고 시간에 따라 꼬리 정맥으로부터 채취하여 3,000 rpm, 10분 원심분리하고 혈장을 분리하여 uric acid assay kit (Abnova, Taipei, Taiwan)를 이용하여 수치화 하였다.
Figure pat00003
Figure pat00004
그 결과를 도 11와 도 12에 나타내었다.
도 11 에서 확인할 수 있는 바와 같이, Mouse 동물모델에서 UoX-HSA의 경우 투여 30분 후부터 2시간까지 혈중 내 요산수치가 빠르게 감소하기 시작하여 12시간까지 유지되었다. UoX-WT는 5시간까지 혈중 내 요산 수치를 감소시켰으나 5시간 후부터 요산수치가 증가하기 시작하였다.
도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, Rat 동물모델에서는 UoX-HSA의 경우 투여 후 30분부터 혈중 내 요산이 감소하기 시작하여 16시간까지 유지되었다. 이는 UoX-HSA가 기존 약물인 UoX-WT (Rasburicase)와 비교 시 활성이 유지되고 지속성도 증가하는 경향을 보임을 의미한다. 이에 반해 대조군으로 사용한 요산 형성 억제제인 Allopurinol은 30분까지 요산수치가 감소하다가 1시간 후부터 요산수치가 증가하기 시작하였다.
또한, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신장부검 결과 Allopurinol 투여에 의해 다른 군과 비교하여 심각한 신장 손상이 관찰되었다.
실시예 8. SD-Rat내에서의 UoX-HSA 효소 활성 분석
실험동물은 습도 50 ± 5%, 온도 24 내지 26℃로 유지되는 환경에서 사육된 7주령의 수컷 스프라그-도올리 랫 (Sparague-dawley rat, male, 250-280 g, 샘타코)을 사용하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. UoX-WT(Rasburicase)와 UoX-HSA (Alburicase)를 각각 3.4 mg/kg, 5.0 mg/kg으로 정맥투여하고 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 168 시간 후 혈액샘플을 채취하여 효소활성을 분석하였다. 혈액 내에서 효소의 활성을 측정하기 위하여 10 μL 시료를 100 μM의 요산을 포함하는 버퍼 190 μL와 혼합한 후 시간에 따라 감소하는 요산의 농도를 요산의 최대흡광 파장인 293 nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 효소활성의 단위인 mU/mL은 실온에서 1분당 1 nM의 요산을 알란토인 (allanton)으로 전환할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.
그 결과를 도 14 및 표 5에 나타내었다.
도 14 및 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, UoX-WT의 반감기는 3.2시간이었으며, UoX-HSA의 반감기는 21.7시간이었다. 즉, 혈액 내에서 UoX-HSA의 반감기가 UoX-WT에 비해 6.8배 연장되었다는 것을 알 수 있었다.
Figure pat00005
실시예 9. SD-Rat내에서의 mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX 효소 활성 분석
실험동물은 습도 50 ± 5%, 온도 24 내지 26℃로 유지되는 환경에서 사육된 7주령의 수컷 스프라그-도올리 랫트 (Sparague-dawley rat, male, 250-280 g, 샘타코)를 사용하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. mono-HSA-UoX와 di-HSA-UoX를 각각 5.0 mg/kg, 6.6 mg/kg으로 정맥투여하고 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 및 96 시간 후 혈액샘플을 채취하여 효소활성을 분석하였다.
그 결과를 도 15 및 표 6에 나타내었다.
Figure pat00006
도 15 및 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, mono-HSA-UoX의 반감기는 21.8시간이었으며, di-HSA-UoX의 반감기는 22.6시간이었다. 즉, 알부민 1개 결합된 conjugate보다 알부민 2개 결합된 conjugate에서 약간 높은 반감기를 보였다. 이는 알부민이 2개 결합된 di-HSA-UoX의 분자량이 알부민이 1개 결합된 mono-HSA-UoX보다 커 신장 여과률이 낮아짐에 따른 것으로 보인다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> ProAbtech Co., Ltd. Gwangju Institute of Science and Technology <120> METHOD FOR PRODUCING URATE OXIDASE WITH NON-NATURAL AMINO ACID INCORPORATED SITE-SPECIFICALLY, ALBUMIN CONJUGATE MANUFACTURING PROCESS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF <130> PA-1 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus flavus_Uox <400> 1 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus flavus_Uox <220> <221> VARIANT <222> (160) <223> p-Azido-L-phenylalanine <400> 2 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 3 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus flavus_Uox <220> <221> VARIANT <222> (174) <223> p-Azido-L-phenylalanine <400> 3 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 4 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus flavus_Uox <220> <221> VARIANT <222> (160) <223> p-Azido-L-phenylalanine <220> <221> VARIANT <222> (174) <223> p-Azido-L-phenylalanine <400> 4 Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr 1 5 10 15 Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg 115 120 125 Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 150 155 160 Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205 Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 270 Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 <210> 5 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus flavus_Uox <400> 5 atgtctgctg tgaaggccgc aagatatggc aaggataatg tgagggtgta caaggtgcat 60 aaggacgaaa agactggcgt gcagacagtg tacgagatga ccgtgtgcgt cctgctggag 120 ggcgaaatcg agacttctta taccaaagcc gacaactccg tgattgtggc cacagattct 180 atcaagaaca ctatctatat caccgccaaa cagaacccag tgacaccacc tgaactgttc 240 ggcagcattc tcggcacaca ctttattgag aagtacaacc acatccatgc tgcacacgtg 300 aatatcgtgt gtcatcgctg gacccgcatg gacatcgacg gaaagccaca cccccactct 360 tttatcagag actctgaaga aaagagaaac gtgcaggtcg acgtggtgga gggaaaaggt 420 atcgacatca agagctcact ctccggcctg accgtgctga agagtaccaa ttcacagttt 480 tgggggtttc tgagagacga atacactaca ctgaaggaga cttgggatag aatcctgagt 540 accgacgtgg atgcaacctg gcagtggaag aatttttccg ggctgcagga agtgcggtcc 600 cacgtgccca agtttgatgc aacctgggca accgcaaggg aggtgacact gaaaaccttt 660 gccgaggaca actccgctag cgtgcaggcc acaatgtaca agatggccga acagatcctg 720 gccagacagc agctgattga gactgtggag tactctctgc ctaacaagca ctatttcgaa 780 atcgacctgt cctggcacaa gggactgcag aatactggta aaaacgcaga ggtgttcgcc 840 cctcagagtg atcccaatgg tctgatcaaa tgcacagtgg ggagatcctc tctgaagagc 900 aagctgcacc atcaccatca ccattaa 927 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for his tag deletion vector <400> 6 ctctctgaag agcaagctgt aagcttaatt agctgagc 38 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for his tag deletion vector <400> 7 gctcagctaa ttaagcttac agcttgctct tcagagag 38 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amb 160 <400> 8 caattcacag ttttaggggt ttctgag 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amb 160 <400> 9 ctcagaaacc cctaaaactg tgaattg 27 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amb 174 <400> 10 cactgaagga gacttaggat agaatcctg 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amb 174 <400> 11 caggattcta tcctaagtct ccttcagtg 29 <210> 12 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amb variant UoX <400> 12 tctgctgtga aggccgcaag atatggcaag gataatgtga gggtgtacaa ggtgcataag 60 gacgaaaaga ctggcgtgca gacagtgtac gagatgaccg tgtgcgtcct gctggagggc 120 gaaatcgaga cttcttatac caaagccgac aactccgtga ttgtggccac agattctatc 180 aagaacacta tctatatcac cgccaaacag aacccagtga caccacctga actgttcggc 240 agcattctcg gcacacactt tattgagaag tacaaccaca tccatgctgc acacgtgaat 300 atcgtgtgtc atcgctggac ccgcatggac atcgacggaa agccacaccc ccactctttt 360 atcagagact ctgaagaaaa gagaaacgtg caggtcgacg tggtggaggg aaaaggtatc 420 gacatcaaga gctcactctc cggcctgacc gtgctgaaga gtaccaattc acagttttag 480 gggtttctga gagacgaata cactacactg aaggagactt aggatagaat cctgagtacc 540 gacgtggatg caacctggca gtggaagaat ttttccgggc tgcaggaagt gcggtcccac 600 gtgcccaagt ttgatgcaac ctgggcaacc gcaagggagg tgacactgaa aacctttgcc 660 gaggacaact ccgctagcgt gcaggccaca atgtacaaga tggccgaaca gatcctggcc 720 agacagcagc tgattgagac tgtggagtac tctctgccta acaagcacta tttcgaaatc 780 gacctgtcct ggcacaaggg actgcagaat actggtaaaa acgcagaggt gttcgcccct 840 cagagtgatc ccaatggtct gatcaaatgc acagtgggga gatcctctct gaagagcaag 900 ctg 903

Claims (17)

  1. (1) 박테리아를 유가식 배양 (fed-batch culture)으로 배양하여 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 생산하는 단계;
    (2) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 분리하는 단계;
    (3) 상기 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 약물전달체와 연결(conjugation)하는 단계; 및
    (4) 상기 약물전달체와 연결된 요산산화효소를 분리하는 단계를 포함하는, 비천연아미노산을 포함하는 요산산화효소를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 2단계 이상의 크로마토그래피에 의한 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 2단계 이상의 크로마토그래피는 소수성 크로마토그래피와 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (3) 단계는 약물전달체와 상기 요산산화효소를 1:1 내지 1:5의 몰비로 혼합하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 연결(conjugation)은 링커에 의한 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 링커는 약물전달체에 연결되어 있는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    약물전달체와 링커의 연결은 (3) 단계 전에 수행되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (4) 단계는 3단계 이상의 크로마토그래피에 의한 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (4) 단계는 양이온교환크로마토그래피, 음이온교환크로마토그래피, 및 크기배제크로마토그래피가 순차적으로 수행되는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달체는 알부민인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 비천연아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine(AzF), p-ethynyl-phenylalanine(pEthF), p-propargyloxyphenylalanine(pPa), O-propargyl-L-tyrosine(oPa), 또는 L-Homopropargylglycine(HPG)인 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의하여 생산된 요산산화효소.
  13. 제12항에 있어서, 상기 요산산화효소는 약물전달체로서 알부민이 2개 결합된 것인, 요산산화효소.
  14. 제12항의 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제12항의 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. 제13항의 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제13항의 요산산화효소를 유효성분으로 포함하는 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
KR1020190130849A 2019-10-21 2019-10-21 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물 KR20210047143A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190130849A KR20210047143A (ko) 2019-10-21 2019-10-21 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190130849A KR20210047143A (ko) 2019-10-21 2019-10-21 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210047143A true KR20210047143A (ko) 2021-04-29

Family

ID=75728264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190130849A KR20210047143A (ko) 2019-10-21 2019-10-21 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210047143A (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
WO2006076571A1 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Sealing valve assembly for medical products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
WO2006076571A1 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Sealing valve assembly for medical products

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7390349B2 (ja) 病的石灰化状態を治療するための組成物およびそれを使用する方法
RU2176646C2 (ru) Инсулин и его производные с повышенной способностью связывать цинк
CN104024273A (zh) 用于治疗代谢疾病的双功能蛋白
JP2017518298A (ja) インスリン及びｇｌｐ−１／グルカゴン二重アゴニストを含む糖尿病治療用組成物
TW200817432A (en) Amidated insulin glargine
JP2013545782A (ja) 長時間作用型インスリンと組み合わせた速効型インスリン
KR20200061688A (ko) 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체
AU2018239037B2 (en) Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN113265007A (zh) 一种治疗代谢疾病的融合蛋白及其制备方法和应用
JP7091248B2 (ja) 低減されたｌ－グルタミナーゼ活性および増強された安定性を有するｌ－アスパラギナーゼ変異体および融合タンパク質
US20170368147A1 (en) Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production
KR100570846B1 (ko) 안정한 활성 인체 ｏｂ 단백질 및 항체 ｆｃ 사슬 복합체를 함유하는 조성물 및 방법
JPWO2018181638A1 (ja) 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体
KR20210047143A (ko) 위치특이적으로 비천연아미노산이 도입된 요산산화효소 생산방법, 그의 알부민 복합체 생산 공정 및 그의 약학조성물
JP7066067B2 (ja) 組み換えヘモグロビン、その製造方法およびその使用
US20230020297A1 (en) Uox-albumin conjugate with certain numbers of albumin conjugated thereto, and manufacturing method thereof
CN113286876A (zh) 用于生物降解酒精的组合物和方法
KR20220077590A (ko) Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법
KR20240031241A (ko) Bcn 링커를 이용한 요산산화효소-알부민 컨쥬게이트의 생산 방법 및 이의 용도
JP2022514835A (ja) インスリン及びグルカゴンを含む薬学組成物