KR20200061688A - 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체 - Google Patents
알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 알부민이 링커를 통해 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체의 특정 위치에 결합된 유사체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 GLP-1 유사체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체는 GLP-1의 특정 위치, 구체적으로 13Y 또는 22F에 알부민을 결합시켜 입체 장애로 인한 약효 감소를 최소화하였다. 또한, 본 발명에 따른 유사체는 알부민과의 결합을 통해 체내 반감기를 증가시켰다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체는 당뇨병을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체에 관한 것이다. 보다 상세하게는 알부민이 링커를 통해 글루카곤 유사 펩타이드-1 변이체의 특정 위치에 결합된 유사체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
지난 30년 동안 치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에서 임상적인 성공을 거두어 왔으며, 이는 계속해서 제약분야의 중요한 성장 동기로 작용하고 있다. 치료용 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 반복적인 주사를 피하기 위하여 약효의 지속시간을 연장시키는 것이다. 환자에 투여된 치료용 단백질과 펩타이드는 환자의 체내에서 계속해서 제거된다. 따라서, 치료용 단백질을 사구체의 여과(glomerular filtration), 세포흡수작용(pinocytosis) 및 면역반응으로부터 보호하기 위한 다양한 방법들이 연구되고 있다.
이에 따라, 체내에서 약물의 반감기를 증가시키기 위해 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 이용한 방법이 활발히 연구되고 있다. 2주 이상의 긴 반감기를 가지는 HSA를 유전적 결합 또는 화학적인 결합에 의해 치료용 단백질에 연결시킴으로써, 치료용 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 하지만, 펩타이드에 알부민을 결합시킬 경우 알부민이 수용체와의 신호전달을 방해하고 알부민에 의한 입체장애로 약효가 감소하는 문제점이 있다(J. T. Bukrinski et al., 2017 및 Z. Gao et al., 2009).
한편, 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬이다. 췌장의 베타 세포, 뇌 등의 조직에 발현되어 있는 G단백질 결합 수용체인 GLP-1 수용체를 통하여 세포 내로 신호를 전달하여 활성을 나타낸다. GLP-1은 췌장의 베타 세포에서 혈중 포도당 농도에 따른 인슐린 분비를 촉진시키기 때문에 저혈당을 유발하지 않으면서 강력한 혈당 강하 작용을 보인다. 하지만, 혈중으로 분비된 GLP-1은 체내 반감기가 2분 이내로 아주 짧다. 이는 체내의 디펩티딜 펩디다아제-4(dipeptidyl peptidase-4; DPP-4) 효소에 의한 N-말단 아미노산 절단으로 인한 활성 상실에 기인하는 것으로 알려져 있다.
체내에서 긴 반감기를 가지는 HSA를 이용한 GLP-1 변이체 연구가 활발히 이루어지고 있다. 구체적으로, HSA를 이용한 GLP-1 변이체로 알부민을 융합시킨 GLP-1 유사체인 알비글루티드(WO 2003/059934)가 있다. 알비글루티드는 주 1회 투여만으로 우수한 혈당 강화효과와 체중 감소 효과를 나타내며, 환자의 치료 편의성을 크게 개선시켰다. 하지만, 알비글루티드의 임상 3상 시험에서 당화혈색소(HbA1c)수치를 낮추는데 효과적인 것으로 확인됐으나, 혈당 감소 효과와 관련해서는 기존의 당뇨병 치료제로 사용되는 피오클리타존(pioglitazone)보다 우수한 효과를 보이진 못하였다. 또한, 부작용과 관련하여 피오클리타존 복용환자보다 위장관계 부작용이 더 빈번하게 발생하는 것으로 보고되었다.
따라서, 안전하고 효과적이면서 반감기가 증가된 당뇨병 치료제에 대한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.
J. T. Bukrinski et al., Biochemistry, 56: 4860-4870, 2017
Z. Gao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem, 73(3): 688-694, 2009
이에 본 발명자들은 안전하고 효과적이면서 체내 반감기가 증가된 당뇨병 치료제를 개발하기 위해 지속적으로 연구한 결과, GLP-1의 13번째 위치의 아미노산인 타이로신(13Y) 또는 22번째 위치의 아미노산인 페닐알라닌(22F)이 비천연 아미노산으로 치환된 GLP-1 변이체를 인간 혈청 알부민과 결합시킨 유사체를 제조하였다. 또한, 상기 유사체가 GLP-1의 활성을 유지하면서 체내에서 반감기가 증대됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알부민이 결합된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1)의 13번째 위치의 타이로신(13Y) 또는 22번째 위치의 페닐알라닌(22F)이 비천연 아미노산인 아지드페닐알라닌(p-Azido-L-phenylalanine, AzF)으로 치환된 GLP-1 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 GLP-1 또는 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체를 제공한다. 이때, 상기 GLP-1 변이체는 GLP-1의 13번째 위치의 타이로신이 페닐알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 상기 링커는 GLP-1의 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 연결된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 GLP-1 유사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) GLP-1의 13Y 또는 22F가 AzF로 치환된 GLP-1 변이체를 알킨기가 포함되도록 개질된 알부민과 반응시키는 단계; 및 2) 알부민이 결합된 GLP-1을 분리하는 단계를 포함하는 알부민이 결합된 GLP-1 유사체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체는 GLP-1의 특정 위치, 구체적으로 GLP-1의 13째 또는 22번째의 아미노산에 알부민을 결합시켜 입체 장애로 인한 약효 감소를 최소화하였다. 또한, 본 발명에 따른 변이체는 알부민과의 결합을 통해 체내 반감기를 증가시켰다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체는 당뇨병을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SDS-PAGE를 이용하여 sfGFP-GLP-1_F22amb 발현을 나타낸 것이다. 왼쪽 이미지는 IPTG 유도 전(1) 및 후(2)를 나타낸 것이다. 오른쪽 이미지는 각각 파쇄된 세포에 Ni-NTA 레진을 넣기 전(1) 및 후(2)이며, 3 및 4는 Ni-NTA 레진에서 분리된 단백질이다.
도 2는 sfGFP-GLP-1_F22amb 정제를 위해 진행한 음이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. F5 및 F6은 얻고자 하는 sfGFP-GLP-1_F22amb의 밴드이다.
도 3은 LC-MS를 통해 AzF가 GLP-1의 22번째 위치인 페닐알라닌을 대체한 것을 확인한 데이터이다. 위 이미지는 GLP-1_WT이고, 아래 이미지는 GLP-1_F22amb이다. WT의 피크는 3383.6 Da, 그리고 F22amb의 피크는 3424. 7 Da으로 각각의 이론값인 3383.7 Da 및 3424.7 Da와 유사한 값을 보였다.
도 4는 HSA와 sfGFP-GLP-1_F22amb의 위치 특이적 결합 반응 확인을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 아래의 SDS-PAGE 이미지에서 1은 HSA, 2는 sfGFP-GLP-1_F22amb, 3은 GLP-1 유사체(conjugate), 그리고 F1, F2 및 F3은 양이온 교환 크로마토그래피의 F1, F2 및 F3이다. F1은 칼럼에 붙지 않은 HSA, 100 kDa의 F2는 GLP-1 유사체, F3는 반응하지 않은 sfGFP-GLP-1_F22amb이다.
도 5는 Factor Xa 처리 후, HSA-GLP-1의 정제 데이터를 나타낸 것이다. 절단 후의 sfGFP는 칼럼에 붙지 않아 검출되지 않았으며, 절단 전의 100 kDa의 GLP-1 유사체와 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 함께 검출되었다.
도 6은 HSA-GLP-1의 약동학적 결과를 나타낸 것이다. 혈액은 각각 10분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간에 채취되었다.
도 7은 Factor Xa 처리 후, 순도 높은 HSA-GLP-1의 정제 데이터를 나타낸 것이다. Fraction 2에서 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 높은 순도로 검출되었다.
도 8은 SDS-PAGE를 이용하여 sfGFP-GLP-1_Y13amb의 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 1은 IPTG 유도 전, 2는 유도 후, 3은 파쇄된 세포의 펠렛, 4는 상층액, 5는 결합하지 않은 단백질, 6은 씻어낸 후, E1-E9는 용출액이다. 빨간 화살표는 32 kDa sfGFP-GLP-1_Y13amb 밴드를 표시한 것이다.
도 9는 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 sfGFP-GLP-1_Y13amb 정제 결과를 나타낸 것이다. F3에서 순도 높은 sfGFP-GLP-1_Y13amb를 수득하였다.
도 10은 MALDI-TOF를 이용하여 GLP-1_Y13amb를 확인한 것이다. 위 이미지는 GLP-1_WT이고, 아래 이미지는 GLP-1_Y13amb다.
도 11은 HSA-DBCO 및 sfGFP-GLP-1_Y13amb의 반응성을 확인한 것이다.
도 12는 양이온 교환 크로마토그래피 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이다. 우측의 SDS-PAGE 이미지에서 각각 레인은 HSA, sfGFP-GLP-1_Y13amb, HSA-sfGFP-GLP-1_Y13amb 및 F1-4이다. F1 및 F2는 HSA, 100 kDa의 F3는 GLP-1 유사체, F4는 반응하지 않은 sfGFP-GLP-1_Y13amb이다.
도 13은 Factor Xa 처리 결과를 나타낸 SDS-PAGE 이미지로서, 1은 HSA, 2는 sfGFP-GLP-1_Y13amb, 3은 HSA-sfGFP-GLP-1_Y13amb, 그리고 18h, 21h 및 24h는 시간대별 Factor Xa 처리 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 24시간 factor Xa 처리 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 HSA-GLP-1을 정제한 결과를 나타낸 것이다. Fraction 1(1)은 잘리고 남은 sfGFP로 추정되며, Fraction 2(2)에서 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 검출되었다.
도 2는 sfGFP-GLP-1_F22amb 정제를 위해 진행한 음이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. F5 및 F6은 얻고자 하는 sfGFP-GLP-1_F22amb의 밴드이다.
도 3은 LC-MS를 통해 AzF가 GLP-1의 22번째 위치인 페닐알라닌을 대체한 것을 확인한 데이터이다. 위 이미지는 GLP-1_WT이고, 아래 이미지는 GLP-1_F22amb이다. WT의 피크는 3383.6 Da, 그리고 F22amb의 피크는 3424. 7 Da으로 각각의 이론값인 3383.7 Da 및 3424.7 Da와 유사한 값을 보였다.
도 4는 HSA와 sfGFP-GLP-1_F22amb의 위치 특이적 결합 반응 확인을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 아래의 SDS-PAGE 이미지에서 1은 HSA, 2는 sfGFP-GLP-1_F22amb, 3은 GLP-1 유사체(conjugate), 그리고 F1, F2 및 F3은 양이온 교환 크로마토그래피의 F1, F2 및 F3이다. F1은 칼럼에 붙지 않은 HSA, 100 kDa의 F2는 GLP-1 유사체, F3는 반응하지 않은 sfGFP-GLP-1_F22amb이다.
도 5는 Factor Xa 처리 후, HSA-GLP-1의 정제 데이터를 나타낸 것이다. 절단 후의 sfGFP는 칼럼에 붙지 않아 검출되지 않았으며, 절단 전의 100 kDa의 GLP-1 유사체와 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 함께 검출되었다.
도 6은 HSA-GLP-1의 약동학적 결과를 나타낸 것이다. 혈액은 각각 10분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간에 채취되었다.
도 7은 Factor Xa 처리 후, 순도 높은 HSA-GLP-1의 정제 데이터를 나타낸 것이다. Fraction 2에서 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 높은 순도로 검출되었다.
도 8은 SDS-PAGE를 이용하여 sfGFP-GLP-1_Y13amb의 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 1은 IPTG 유도 전, 2는 유도 후, 3은 파쇄된 세포의 펠렛, 4는 상층액, 5는 결합하지 않은 단백질, 6은 씻어낸 후, E1-E9는 용출액이다. 빨간 화살표는 32 kDa sfGFP-GLP-1_Y13amb 밴드를 표시한 것이다.
도 9는 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 sfGFP-GLP-1_Y13amb 정제 결과를 나타낸 것이다. F3에서 순도 높은 sfGFP-GLP-1_Y13amb를 수득하였다.
도 10은 MALDI-TOF를 이용하여 GLP-1_Y13amb를 확인한 것이다. 위 이미지는 GLP-1_WT이고, 아래 이미지는 GLP-1_Y13amb다.
도 11은 HSA-DBCO 및 sfGFP-GLP-1_Y13amb의 반응성을 확인한 것이다.
도 12는 양이온 교환 크로마토그래피 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이다. 우측의 SDS-PAGE 이미지에서 각각 레인은 HSA, sfGFP-GLP-1_Y13amb, HSA-sfGFP-GLP-1_Y13amb 및 F1-4이다. F1 및 F2는 HSA, 100 kDa의 F3는 GLP-1 유사체, F4는 반응하지 않은 sfGFP-GLP-1_Y13amb이다.
도 13은 Factor Xa 처리 결과를 나타낸 SDS-PAGE 이미지로서, 1은 HSA, 2는 sfGFP-GLP-1_Y13amb, 3은 HSA-sfGFP-GLP-1_Y13amb, 그리고 18h, 21h 및 24h는 시간대별 Factor Xa 처리 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 24시간 factor Xa 처리 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 HSA-GLP-1을 정제한 결과를 나타낸 것이다. Fraction 1(1)은 잘리고 남은 sfGFP로 추정되며, Fraction 2(2)에서 잘린 70 kDa의 HSA-GLP-1이 검출되었다.
본 발명은 일 측면으로, 글루카곤 유사 펩타이드 1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)의 13번째 위치의 타이로신(13Y) 또는 22번째 위치의 페닐알라닌(22F)이 비천연 아미노산인 아지드페닐알라닌(p-azido-L-phenylalanine, AzF)으로 치환된 GLP-1 변이체를 제공한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "글루카곤 유사 펩타이드 1"은 음식물로부터의 단백질, 탄수화물 섭취 및 지방에 반응하여 장내 내분비(intestinal endocrine) L-세포로부터 방출된 인크레틴(incretin)이다. 상기 인크레틴은 음식을 먹으면 소장에서 분비되는 물질로, 음식을 먹으면 췌장을 자극하여 인슐린 분비 양을 증가시키며 항인슐린 작용을 하는 글루카곤을 억제하여 인슐린의 작용을 정상화시키는 물질이다. 본 발명의 "GLP-1"은 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 GLP-1의 1 내지 6번째 아미노산이 잘려나간 폴리펩타이드로서. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 GLP-1에서 아지드페닐알라닌으로 치환되는 아미노산 위치는 서열번호 1로 표시되는 GLP-1의 아미노산 서열의 13번째 또는 22번째 아미노산 중 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로, 서열번호 1로 표시되는 GLP-1의 아미노산 서열 중 13Y가 아지드페닐알라닌으로 치환될 수 있다. 다른 구체예로, 서열번호 1로 표시되는 GLP-1의 아미노산 서열 중 22F가 아지드페닐알라닌으로 치환될 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, GLP-1 또는 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체를 제공한다. 이때, 상기 GLP-1 변이체는 GLP-1의 13번째 위치의 타이로신 또는 22번째 위치의 페닐알라닌이 아지드페닐알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 상기 링커는 GLP-1의 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 연결된 것일 수 있다.
체내에서 GLP-1의 반감기는 2분 이내로 짧으며, GLP-1의 반감기를 늘리기 위해 긴 반감기를 가지는 물질을 결합시킬 수 있다. 구체적으로, GLP-1의 반감기를 증가시키면서 GLP-1의 활성을 유지하기 위해, GLP-1에 알부민을 결합시킬 수 있다. 특히, 아지드(azide)-알킨(alkyne) 고리화 반응(클릭 반응; click reaction)을 이용하여 GLP-1의 특정 위치에 알부민을 결합시킬 수 있다. 아지드-알킨 고리화 반응은 다른 화학 반응과 달리 체내에서도 전구체를 대상으로 화학 반응이 가능한 것은 전구체에 미리 도입된 반응기가 아지드나 알킨으로서 체내에 존재하는 물질의 방해 없이 화학 반응이 가능하다. 본 발명에서, GLP-1 유사체는 GLP-1의 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 연결된 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)"은 인간의 혈청 속에 포함된 알부민으로, 전체 혈청 단백질의 약 60% 정도를 차지하고, 체내에서 2주 이상의 긴 반감기를 가지는 혈청 단백질이다. 상기 인간 혈청 알부민은 각종 이온과 결합하기 쉽고 혈액 속에서 영양물질, 약제, 대사산물 등의 수송에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 인간 혈청 알부민은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
또한, 인간 혈청 알부민 체내에서 2주 이상의 긴 반감기를 가져, 치료용 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 GLP-1의 반감기를 증가시키기고 GLP-1의 활성을 유지하기 위하여, 아지드-알킨 고리화 반응을 통해 인간 혈청 알부민을 GLP-1의 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 결합시킬 수 있다. 이때, 상기 아지드-알킨 고리화 반응을 위하여, 알부민에 DBCO-Maleimide를 사용하여 알킨기를 도입할 수 있다.
일 구체예로, 아지드-알킨 고리화 반응을 통해 인간 혈청 알부민을 GLP-1의 13번째 위치에 상응하는 아미노산인 타이로신(Tyr)에 결합시킬 수 있다. 다른 구체예로, 아지드-알킨 고리화 반응을 통해 인간 혈청 알부민을 GLP-1의 22번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌(Phe)에 결합시킬 수 있다. 또 다른 구체예로, 인간 혈청 알부민은 아지드-알킨 고리화 반응을 통해 GLP-1의 13번째 위치에 상응하는 타이로신 및 GLP-1의 22번째 위치에 상응하는 페닐알라닌에 결합될 수 있다.
본 발명은 일 실시예에서, GLP-1의 13번째 아미노산인 타이로신을 p-azidophenylalanine으로 치환한 후, 알킨기가 포함되도록 개질된 인간 혈청 알부민과 반응시켜, GLP-1에 알부민을 결합하였다. 또한, 본 발명은 다른 실시예에서, GLP-1의 22번째 아미노산인 페닐알라닌을 p-azidophenylalanine으로 치환한 후, 알킨기가 포함되도록 개질된 인간 혈청 알부민과 반응시켜, GLP-1 알부민을 결합하였다. 상기 알부민이 결합된 각각의 GLP-1 유사체는 마우스에서 체내 반감기가 크게 증가됨을 확인하였다.
상기 아지드기가 도입된 GLP-1 변이체와 알킨기가 도입된 인간 혈청 알부민을 혼합하여 아지드-알킨 고리화 반응을 통해 GLP-1 변이체와 인간 혈청 알부민을 결합시켰다.
이때, GLP-1 유사체와 인간 혈청 알부민을 연결하는 링커는 하기 화학식 1 내지 11로 표시되는 화학 구조식을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
이때, L은 단일결합, C1- 8알킬, C6- 12아릴, -CO-, -R1CONR1-, -OCONR1- 또는 -R1NCOR1- 일 수 있다(상기 R1은 각각 독립적으로 H, C1- 4알킬, C6- 12아릴로부터 선택될 수 있다).
본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 유효성분으로서 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예로, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 첨가제는 감미제, 결합제, 용매, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 붕해제, 산화방지제, 보존제, 윤활제, 충전제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 첨가제는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 글리신, 실리카, 활석, 스테아르산, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 알루미노실리케이트, 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 한천, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화 나트륨, 염화 칼슘, 오렌지 에센스, 딸기 에센스, 바닐라 향 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에서 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로는 체중 kg 당 0.1 내지 1000 mg, 구체적으로는 5 내지 200 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 이를 필요로 하는 대상에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 일 구체예로, 상기 투여는 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경구, 비내, 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 1) GLP-1의 13Y 또는 22F가 AzF로 치환된 GLP-1 변이체를 알킨기가 포함되도록 개질된 알부민과 반응시키는 단계; 및 2) 알부민이 결합된 GLP-1을 분리하는 단계를 포함하는 알부민이 결합된 GLP-1 유사체의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 단계 1)에서 GLP-1 변이체에 대한 상기 개질된 알부민의 반응 몰비는 1:2일 수 있다. 또한, 상기 개질된 알부민은 DBCO-Maleimide가 결합된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
준비예
1. GLP-1
변이체
-
HSA
유사체 제조를 위한 준비
아지드페닐알라닌(p-Azido-L-phenylalanine, AzF)는 Chem-Impex International(Wood Dale, IL)로부터 구입하였으며, 0.2 M NaOH에 용해하여 100 mM 스톡(stock solution)을 만들어 사용하였다. Ni-NTA 아가로즈 및 pQE80 플라스미드는 Qiagen(Valencia, CA)으로부터 구입하였다. Vivaspin centrifugal concentrators는 Sartorius Corporation(Bohemia, NY)로부터 구입하였다. DBCO-PEG4-Carboxyrhodamine, 및 DBCO-MAL은 Click Chemistry Tools LLC(Scottsdale, AZ)로부터 구입하였다. PD-10 desalting columns, HiTrap SP HP cation exchange column 및 Superdex 200 10/300 GL size exclusion column은 GE Healthcare(Little Chalfont, Buckinghamshare, U.K.)로부터 구입하였다. UNO Q1 anion exchange column 및 NGC Quest 10 System은 Bio-Rad(Hercules, CA)로부터 구입하였다. 그 외 모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich Corporation의 제품을 사용하였다.
실시예
1. GLP-1의 22번째 아미노산 위치에 알부민 결합
실시예
1.1.
sfGFP
-GLP-1_
F22amb
발현 및 정제
발현 균주를 준비하기 위하여 E. coli C321.A.exp(addgene (Cambridge, MA))에 [pEVOL-pAzF](addgene (Cambridge, MA))와 [pQE80-6xHis-sfGFP-GGKKKKKGG linker-Factor Xa cleavage site-GLP-1_F22amb] 플라스미드를 도입하였다. 균주를 100 ㎍/ml 암피실린(ampicillin)과 35 ㎍/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)이 들어있는 2xYT에서 37℃ 및 220 rpm의 조건으로 12시간 이상 배양한 후, 1/100 희석하여 같은 조건에서 200 mL 배지에 대량 발현하였다. OD600 값이 0.4에 도달하면 p-Azido-L-phenylalanine(AzF)를 1 mM가 되도록 넣었다. 이후, OD600 값이 0.5일 때 1 mM의 IPTG(Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside) 및 0.2% 아라비노오스(arabinose)를 도입하여 단백질을 과발현하였다. 7시간 후, 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤 펠렛을 -80℃에서 보관하거나 정제하였다.
정제시 펠렛을 50 mM의 인산 완충액(phosphate buffer), 300 mM NaCl 및 10 mM의 이미다졸(imidazole)(pH 7.5)로 구성된 용해 버퍼 10 mL에 녹였다. 이후, 라이소자임 1 mg을 넣어 얼음에 두고, 10분 후 초음파분쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, 상층액을 분리하여 Ni-NTA resin과 얼음에 둔 채로 쉐이킹하였다. 1시간 후 폴리프로필렌 컬럼(polypropylene column)에 부어 용액을 흘려준 뒤, 50 mM의 인산 완충액, 300 mM의 NaCl 및 20 mM의 이미다졸(pH 7.5)로 구성된 세척 버퍼로 세척하고, 50 mM의 인산 완충액, 300 mM의 NaCl 및 2,500 mM 이미다졸(pH 7.5)로 구성된 용출 버퍼를 흘려주며 분리된 단백질을 수득하였다. 이후, 20 mM Tris(pH 8.0)로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap Q-HP 컬럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 한번 더 정제하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, tRNA synthethase/tRNATAG 유전자를 가진 E. coli C321.A.exp에 22번 Phe 유전자가 amber codon(TAG)으로 치환된 pQE80 sfGFP-GLP-1_F22amb 벡터를 넣고 발현하여 GLP-1의 22번 자리에 AzF를 도입할 수 있는 시스템을 구축하였다. IPTG 유도로 과발현된 sfGFP-GLP-1_F22amb를 두 단계의 과정을 통해 정제하였다(도 1 및 도 2). F5와 F6 샘플의 밴드가 32 kDa인 것으로 보아 sfGFP-GLP-1_F22amb임을 알 수 있다. 정제된 sfGFP-GLP-1_F22amb에서 GLP-1_F22amb를 얻기 위해 몰수비 800:1 비율로 Factor Xa 효소를 37℃의 온도에서 10시간 동안 처리하였다. 이후, LC-MS를 통해 AzF가 GLP-1의 22번 Phe을 대체한 것을 확인하였다(도 3).
실시예
1.2.
HSA와
sfGFP
-GLP-1_
F22amb의
위치 특이적 결합 반응 및
HSA
-PEG
4
-GLP-1 정제
동결건조된 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 20 mM Bis-tris(pH 6) 버퍼에 녹인 후, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 high MW aggregate를 제거하였다. 정제된 HSA를 PBS 버퍼에서 maleimide-PEG4-DBCO 링커와 몰수비 1:2로 섞은 뒤 쉐이킹하며 실온에서 반응하도록 하였다. 이때, DMSO가 5% 미만이 되도록 농도를 조절하였다. 3시간 후, PBS로 버퍼를 바꿔 반응을 종결하였다. 앞서 정제한 sfGFP-GLP-1_F22amb를 농축하고 PBS로 버퍼를 바꾸어 15 μM 내지 30 μM의 농도로 맞추었다. 이후, 몰수비 1:2로 HSA-PEG4-DBCO와 실온에서 쉐이킹하며 반응하도록 하였다. 6시간 후, 20 mM의 인산나트륨(pH 6)으로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap SP-HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피로 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1_F22amb를 정제하였다.
정제된 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1_F22amb를 PBS로 버퍼를 바꾼 뒤, 1,600:1 몰수비로 Factor Xa를 넣고 37℃의 온도에서 쉐이킹하며 효소 반응하도록 하였다. 15시간 후, 억제제를 넣어 반응을 종결하였다. HSA-GLP-1_F22amb를 정제하기 위하여 20 mM Bis-tris(pH 6)로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, HSA-PEG4-DBCO와 sfGFP-GLP-1_F22amb를 실온에서 6시간 반응하도록 한 뒤 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리하였다(도 4). 반응하지 않은 HSA-PEG4-DBCO는 PI값이 5.67로 칼럼에 붙지 않아 완벽하게 제거되었으나 sfGFP-GLP-1_F22amb는 일부 분리되지 않았다. 정제된 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1에 15시간 동안 Factor Xa 효소를 처리하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 효소 반응 후 99 kDa의 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1 밴드가 제거되고 70 kDa의 단백질 밴드가 새로 형성된 것으로 보아 HSA-PEG4-GLP-1가 생성됨을 확인하였다. 이후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 순도 75%의 HSA-PEG4-GLP-1를 수득하였다.
실시예
1.3.
HSA
-GLP-1의 약동학적 분석
정제된 HSA-GLP-1를 PBS로 버퍼를 바꿔준 뒤, 암컷 balb/c 마우스(n=3)의 꼬리를 통해 25 nmol/kg를 정맥주사 하였다. 이후, 각각 10분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 뒤에 혈액을 채취하였다. 모든 절차는 GIST의 동물윤리위원회에서 승인한 실험 지침을 따라 진행하였다. 채취한 혈액은 2,500 rpm에서 7분 동안 원심분리한 뒤, 혈청을 분리하고 활성형 GLP-1(7-37) ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, HSA-GLP-1를 암컷 balb/c 마우스(n=3)의 꼬리를 통해 정맥주사 하여, 약동학적으로 분석하고 체내 반감기가 7.18 시간임을 확인하였다. 반감기가 분 단위인 GLP-1에 비해 200배 이상 증가하였다.
실시예
1.4.
sfGFP
-GLP-1_
F22amb
순도 증가 실험
정제된 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1-F22amb를 농축한 후, 20 mM Tris, 100 mM NaCl 및 2 mM CaCl2(pH 8)로 버퍼를 바꾸었다. 1/500(w/w) Factor X를 넣고 실온에서 쉐이킹하며 효소 반응하도록 하고, 24시간 후 억제제를 넣어 반응을 종결하였다. HSA-GLP-1_F22amb를 정제하기 위하여 20 mM Bis-tris(pH 6)으로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1에 실온에서 24시간 동안 Factor Xa 효소를 처리한 후, 99 kDa의 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1 밴드가 제거되고 70 kDa의 단백질 밴드가 새로 형성된 것으로 보아 HSA-PEG4-GLP-1이 생성됨을 확인하였다. 이후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 높은 순도의 HSA-PEG4-GLP-1를 수득하였다.
실시예
2. GLP-1의 13번째 아미노산 위치에 알부민 결합
실시예
2.1.
sfGFP
-GLP-1_
Y13amb
발현 및 정제
발현 균주를 준비하기 위하여 E. coli C321.A.exp에 [pEVOL-pAzF]와 [pQE80-6xHis-sfGFP-GGKKKKKGG linker-Factor Xa cleavage site-GLP-1_Y13amb] 플라스미드를 도입하였다. 균주를 100 ㎍/ml의 암피실린 및 35 ㎍/ml의 클로람페니콜이 들어있는 2xYT에서, 37℃의 온도 및 220 rpm 조건으로 12시간 이상 배양한 후 1/100 희석하여 같은 조건에서 200 mL 배지에 대량발현 하였다. OD600 값이 0.4일 때, p-Azido-L-phenylalanine(AzF)를 1 mM 되도록 넣었다. 이후, OD600 값이 0.5에 도달하면, 1 mM IPTG 및 0.2% 아라비노오스를 도입하여 단백질을 과발현하였다. 7시간 후, 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 한 뒤 펠렛을 분리하여 -80℃에서 보관하거나 정제하였다.
정제시 펠렛을 50 mM의 인산완충액, 300 mM의 NaCl 및 10 mM의 이미다졸(pH 7.5)로 구성된 용해 버퍼 10 mL에 녹인 후, 라이소자임 1 mg을 넣어 얼음에 두었다. 10분 후, 초음파분쇄기를 이용하여 [amplitude-28%, 10 sec on/20 sec off]의 조건으로 18분 동안 세포를 파쇄하였다. 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, 상층액을 분리하여 Ni-NTA 레진과 얼음에 둔 채로 쉐이킹하였다. 1시간 후, 폴리프로필렌 컬럼에 부어 용액을 흘려준 뒤, 50 mM의 인산완충액, 300 mM의 NaCl 및 20 mM의 이미다졸(pH 7.5)로 구성된 세척 버퍼로 세척하였다. 그리고, 50 mM의 인산완충액, 300 mM의 NaCl 및 2500 mM 이미다졸(pH 7.5)로 구성된 용출 버퍼를 흘려주며 분리된 단백질을 수득하였다. 이후, 20 mM의 Tris(pH 8.5)로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 한번 더 정제하였다. 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
도 8 내지 도 10에 나타난 바와 같이, tRNA synthethase/tRNATAG 유전자를 가진 E. coli C321.A.exp에 13번 Tyr 유전자가 amber codon(TAG)으로 치환된 pQE80 sfGFP-GLP-1_Y13amb 벡터를 넣고 발현하여 GLP-1의 13번 자리에 AzF를 도입할 수 있는 시스템을 구축하였다. IPTG 유도로 과발현된 sfGFP-GLP-1_Y13amb를 두 단계의 과정을 통해 정제하였다(도 8 및 도 9). 정제된 sfGFP-GLP-1_Y13amb에서 GLP-1_Y13amb를 얻기 위해 몰수비 800:1 비율로 Factor Xa 효소를 37℃, 10시간 처리하였다. 이후, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry)를 통해 AzF가 GLP-1의 13번 Tyr을 대체한 것을 확인하였다(도 10).
실시예
2.2.
HSA와
sfGFP
-GLP-1_
Y13amb의
위치 특이적 결합 반응
동결건조된 HSA를 20 mM의 Bis-tris(pH 6) 버퍼에 녹인 후, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 high MW aggregate를 제거하였다. 이후, PBS 버퍼에서 maleimide-PEG4-DBCO 링커와 DMSO가 5% 미만이 되도록 농도를 조절하여 몰수비 1:2로 섞은 뒤 쉐이킹하며 실온에서 반응하도록 하였다. 3시간 후, PBS로 버퍼를 바꿔 반응을 종결하였다. 앞서 정제한 sfGFP-GLP-1_Y13amb를 농축하고 PBS로 버퍼를 바꾸어 15 μM 내지 30 μM 농도로 맞추었다. 이후, 몰수비 1:2로 HSA-PEG4-DBCO와 실온에서 쉐이킹하며 반응하도록 하였다. 6시간 후, 20 mM의 인산나트륨 및 400 mM의 NaCl(pH 6)로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap SP-HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피로 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1_Y13amb를 정제하였다.
실시예
2.3.
HSA
-
PEG
4
-GLP-1 정제
정제된 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1_Y13amb를 농축한 후, 20 mM Tris, 100 mM NaCl 및2 mM CaCl2(pH 8)로 버퍼를 바꾸었다. 1/500(w/w) Factor Xa를 넣고 실온에서 쉐이킹하며 효소 반응하도록 하였다. 24시간 후 억제제를 넣어 반응을 종결하였다. HSA-GLP-1_Y13amb를 정제하기 위하여 20 mM의 Bis-tris(pH 6)로 버퍼를 바꾼 뒤, HiTrap Q-HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 그 결과를 도 11 내지 도 14에 나타내었다.
sfGFP-GLP-1_Y13amb의 AzF, Rhodamin-DBCP 및 HSA-PEG4-DBCO를 Rhodamin-Azide와 각각 반응하도록 한 뒤, SDS-PAGE를 통해 반응성을 확인하였다(도 11). HSA-PEG4-DBCO및 sfGFP-GLP-1_Y13amb를 실온에서 6시간 동안 반응하도록 한 뒤 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리하였다(도 12). 반응하지 않은 HSA-PEG4-DBCO는 PI값이 5.67로 칼럼에 붙지 않아 완벽하게 제거되었으나 sfGFP-GLP-1_Y13amb는 일부 분리되지 않았다. 정제된 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1에 24시간 동안 Factor Xa 효소를 처리하였다. 효소 반응 후 99 kDa의 HSA-PEG4-sfGFP-GLP-1 밴드가 제거되고 70 kDa의 단백질 밴드가 새로 형성된 것으로 보아 HSA-PEG4-GLP-1이 생성됨을 확인하였다(도 13). 이후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 HSA-PEG4-GLP-1를 정제하였다. 잘린 sfGFP가 완벽하게 정제되지 않아 순도는 73%에 그쳤다(도 14).
<110> Gwangju Institute of Science and Technology
<120> GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 DERIVATIVE CONJUGATED WITH ALBUMIN
<130> FPD/201811-0028
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP-1
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 610
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human serum albumin
<400> 2
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Ala
610
<210> 3
<211> 732
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sfGFP
<400> 3
catcaccatc accatcacgg atctatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 60
ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt ccgtggagag 120
ggtgaaggtg atgcaacaaa cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 180
ctacctgttc catggccaac acttgtcact actctgacct atggtgttca atgcttctcc 240
cgttatccgg atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 300
gtacaggaac gcactataag cttcaaagat gacgggacct acaagacgcg tgctgaagtc 360
aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 420
gatggaaaca ttctcggaca caaactcgag tacaacttta actcacacaa tgtatacatc 480
accgcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacgttgaa 540
gatggatccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 600
gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg tcctttcgaa agatcccaac 660
gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc 720
atggatgagc tc 732
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GGKKKKKGG linker
<400> 4
ggtgggaaga aaaagaagaa aggaggc 27
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Factor Xa cleavage site
<400> 5
atcgaaggta gg 12
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP-1_F28amb
<400> 6
catgccgaag gcacctttac cagcgatgtg agtagctatc tggaaggtca ggcggccaaa 60
gaatagattg cctggctggt gcgggggcgt ggctaa 96
<210> 7
<211> 867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [pQE80-6xHis-sfGFP-GGKKKKKGG linker-Factor Xa cleavage
site-GLP-1_F28amb] plasmid
<400> 7
catcaccatc accatcacgg atctatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 60
ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt ccgtggagag 120
ggtgaaggtg atgcaacaaa cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 180
ctacctgttc catggccaac acttgtcact actctgacct atggtgttca atgcttctcc 240
cgttatccgg atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 300
gtacaggaac gcactataag cttcaaagat gacgggacct acaagacgcg tgctgaagtc 360
aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 420
gatggaaaca ttctcggaca caaactcgag tacaacttta actcacacaa tgtatacatc 480
accgcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacgttgaa 540
gatggatccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 600
gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg tcctttcgaa agatcccaac 660
gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc 720
atggatgagc tcggtgggaa gaaaaagaag aaaggaggca tcgaaggtag gcatgccgaa 780
ggcaccttta ccagcgatgt gagtagctat ctggaaggtc aggcggccaa agaatagatt 840
gcctggctgg tgcgggggcg tggctaa 867
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild type GLP-1
<400> 8
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg
35
Claims (10)
- 글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1)의 13번째 위치의 타이로신(13Y) 또는 22번째 위치의 페닐알라닌(22F)이 비천연 아미노산인 아지드페닐알라닌(AzF)으로 치환된 GLP-1 변이체.
- 제1항에 있어서,
상기 GLP-1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, GLP-1 변이체. - GLP-1 또는 GLP-1 변이체가 링커를 통해 인간 혈청 알부민과 결합된 GLP-1 유사체로서, 상기 GLP-1 변이체는 GLP-1의 13번째 위치의 타이로신이 페닐알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 상기 링커는 GLP-1의 13번째 또는 22번째 위치의 아미노산에 연결된 것인, GLP-1 유사체.
- 제3항에 있어서,
상기 인간 혈청 알부민은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP-1 유사체. - 제3항에 있어서,
상기 링커는 하기 화학식 1 내지 11로 표시되는 화학 구조식을 포함하는 것인, GLP-1 유사체:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
이때, L은 단일결합, C1- 8알킬, C6- 12아릴, -CO-, -R1CONR1-, -OCONR1- 또는 -R1NCOR1- 일 수 있다(상기 R1은 각각 독립적으로 H, C1- 4알킬, C6- 12아릴로부터 선택될 수 있다). - 제3항에 따른 GLP-1 유사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것인, 약학 조성물. - 1) GLP-1의 13Y 또는 22F가 AzF로 치환된 GLP-1 유사체를 알킨기가 포함되도록 개질된 알부민과 반응시키는 단계; 및
2) 알부민이 결합된 GLP-1을 분리하는 단계를 포함하는 알부민이 결합된 GLP-1 유사체의 제조방법. - 제8항에 있어서,
상기 단계 1)에서 GLP-1 유사체에 대한 상기 개질된 알부민의 반응 몰비는 1:2인 것인, GLP-1 유사체의 제조방법. - 제8항에 있어서,
상기 개질된 알부민은 DBCO-Maleimide가 결합된 것인, GLP-1 유사체의 제조방법.
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-
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