EA013796B1 - Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам - Google Patents

Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам Download PDF

Info

Publication number
EA013796B1
EA013796B1 EA200800699A EA200800699A EA013796B1 EA 013796 B1 EA013796 B1 EA 013796B1 EA 200800699 A EA200800699 A EA 200800699A EA 200800699 A EA200800699 A EA 200800699A EA 013796 B1 EA013796 B1 EA 013796B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
peptide
fusion peptide
component
agd
Prior art date
Application number
EA200800699A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800699A1 (ru
Inventor
Петер Гайгле
Кристине Валльрапп
Эрик Тёнес
Original Assignee
Байокомпатиблз Юк Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байокомпатиблз Юк Лтд. filed Critical Байокомпатиблз Юк Лтд.
Publication of EA200800699A1 publication Critical patent/EA200800699A1/ru
Publication of EA013796B1 publication Critical patent/EA013796B1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/605Glucagons
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04Anorexiants; Antiobesity agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K19/00Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • GPHYSICS
    • G07CHECKING-DEVICES
    • G07FCOIN-FREED OR LIKE APPARATUS
    • G07F11/00Coin-freed apparatus for dispensing, or the like, discrete articles
    • G07F11/02Coin-freed apparatus for dispensing, or the like, discrete articles from non-movable magazines
    • G07F11/04Coin-freed apparatus for dispensing, or the like, discrete articles from non-movable magazines in which magazines the articles are stored one vertically above the other
    • G07F11/16Delivery means
    • G07F11/165Delivery means using xyz-picker or multi-dimensional article picking arrangements

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении описаны слитые пептиды, которые обладают активностью GLP-1 и повышенной стабильностью in vivo, прежде всего устойчивостью к дипептидилпептидазе IV. Слитый пептид содержит в качестве компонента (I) N-концевую последовательность GLP-1(7-35, 7-36 или 7-37) и в качестве компонента (II) С-концевую пептидную последовательность, которая состоит по меньшей мере из 9 аминокислот, или ее функционально активный фрагмент, вариант или производное. Компонент (II) предпочтительно представляет собой полную или частичную версию IP2 (интронный пептид 2). Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является последовательность GLP-1(7-35, -36 или -37)/IP2/GLP-1(7-35, -36 или -37) или GLP-2. Слитый пептид можно получать в сконструированных клетках или путем синтеза и его можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения различных заболеваний или нарушений, например диабета типа 1 или 2, связанных с апоптозом заболеваний или нейродегенеративных нарушений.

Description

Настоящее изобретение относится к новым слитым пептидам, содержащим ОЬР-1 с удлиненными С-концами, которые обладают устойчивостью к инактивации эндопептидазой IV, могут экспрессироваться с высоким уровнем в трансформированных клетках животных и которые можно применять, например, для лечения диабета типа II.
Ген глюкагона хорошо изучен (см., например, \У1Шс ГXV. и др., Ыис1е1с Лаб Кек. 14(12), 1986, с. 4719-4730). Молекула препроглюкагона в виде высокомолекулярной молекулы-предшественника синтезируется в панкреатических альфа-клетках и в Ь-клетках тощей кишки и ободочной кишки. Препроглюкагон представляет собой состоящий из 180 аминокислот прогормон, и его последовательность содержит помимо глюкагона две последовательности родственной структуры: глюкагон-подобный пептид-1 (ОЬР1) и глюкагон-подобный пептид-2 (ОЬР-2). В молекуле препроглюкагона между ОЬР-1 и ОЬР-2 находится состоящая из 17 аминокислот пептидная последовательность (или точнее состоящая из 15 аминокислот последовательность плюс С-концевой расщепляемый КК-сайт), интронный пептид 2 (1Р2). Последовательность 1Р2 (локализованная между ОЬР-1 и -2 в молекуле-предшественнике), как правило, расщепляется протеолитически после аминокислоты (ак) 37 ОЬР-1. Таким образом, молекула препроглюкагона в зависимости от клетки и ее окружения расщепляется на различные пептиды, включая ОЬР-1(1-37), состоящий из 37 аминокислот пептид в непроцессированной форме. Как правило, его процессинг происходит в поджелудочной железе и в кишечнике. Последовательность ОЬР-1(1-37) может подвергаться дополнительному протеолитическому расщеплению с образованием активной процессированной формы ОЬР-1(7-37), состоящей из 31 аминокислоты, или амида ОЬР-1(7-36). Таким образом, при формировании ОЬР-1(7-37) образуется представляющий интерес фрагмент, который состоит из аминокислотных остатков от (и включительно) остатка в положении 7 до (и включительно) остатка в положении 37, начиная с Ν-конца родительского пептида ОЬР-1. Аминокислотная последовательность амида ОЬР-1(7-36) и ОЬР1(7-37) имеет формулу I (8ЕО ГО N0:43)
Н18-А1а-С1и-О1у-Т11г-РЬе-ТЬг-Яег-Анр-Уа1-8ег-8ег-Туг-Ьеи-С1и-О1у-О1п-А1а-А1аЬу8-О1и-Рйе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу8-О1у-Аг§-Х (I) которая соответствует амиду ОЬР-1(7-36), когда X обозначает ΝΗ2, и ОЬР-1(7-37), когда X обозначает О1у-ОН.
ОЬР-1 представляет собой гормон желудочно-кишечного тракта и наиболее эффективный эндогенный инсулинотропный агент, активность которого включает стимуляцию аденилатциклазной и протеинкиназной активности в бета-клетках. Физиологически в сочетании с желудочным ингибирующим полипептидом из верхнего отдела кишечника он функционирует в качестве эндокринного гормона, который снижает уровень глюкозы в крови. Таким образом, ОЬР-1, секреция которого происходит в ответ на прием пищи, обладает несколькими видами воздействия на желудок, печень, поджелудочную железу и головной мозг, которые совместно обеспечивают регулирование содержания сахара к крови. Поэтому амид глюкагон-подобного пептида ОЬР-1(7-36) и его неамидированный аналог ОЬР-1(7-37) представляют значительный интерес благодаря их высокой эффективности в отношении метаболизма углеводов и возможности их применения для лечения диабета, включая диабет типа II. Диабет типа II характеризуется устойчивостью к инсулину, поскольку клетки не реагируют соответствующим образом на присутствие инсулина. Это является более сложной проблемой, чем диабет типа I. Диабет типа II может оставаться незамеченным у пациента в течение многих лет до его диагностирования, поскольку симптомы, как правило, являются менее выраженными (отсутствие кетоацидоза) и могут быть спорадическими. Однако последствием незамеченного диабета типа II могут быть серьезные осложнения, включая почечную недостаточность и ишемическую болезнь сердца. Это повышает заболеваемость и смертность.
Амид ОЬР-1(7-36) или ОЬР-1(7-37) обладает непродолжительным временем жизни в сыворотке. Пептид расщепляет дипептидилпептидазой IV (ЭРР-Γν) между остатками 8 и 9. Расщепленный пептид является неактивным. Таким образом, ОЬР-1 при его экзогенном введении является очень короткоживущим и имеет ограниченное терапевтическое применение.
Предпринимались многочисленные попытки синтеза более стабильных (в отношении воздействия ЭРРН'У) аналогов встречающегося в естественных условиях ОЬР-1 (ОЬР-1(7-37)). В частности остаток в положении 8, который ίη νίνο представляет собой А1а, заменяли на другой остаток, например О1у, 8ет или Тйг (Вигсейп К. и др., Ме1аЬоШш 48, 1999, с. 252-258). Было проведено обширное исследование О1у8- или О8-аналога как в виде синтезированной молекулы, так и в виде молекулы, полученной в клеточных линиях, которые создавали с помощью генной инженерии с целью секреции мутантного полипептида (Вигсейп К. и др., Аппа1к о£ 1йе №\ν Уогк Асабету о£ 8с1епсек 875, 1999, с. 277-285). Для повышения стабильности ш νίνο без снижения его биологической активности в ОЬР-1(7-37) интродуцировали различные другие модификации. Однако все эти подходы не привели к получению каких-либо важных для терапевтического применения результатов из-за серьезных проблем.
В А0/9953064 на имя Тйогеп В. описана стратегия создания мультимерной экспрессионной кассеты ОЬР-1, которую можно встраивать в различные типы клеток, представляющие собой доступные научной общественности иммортализованные линии клеток и культуры, обладающих способностью к делению первичных клеток. Их примерами являются чувствительные к ЕОЕ нейросферы, чувствительные к ЬЕОЕ стволовые клетки-предшественники нейронов из ЦНС млекопитающих, хотя в приведенных в ка
- 1 013796 честве вариантов осуществления примерах использовали клетки почки детеныша хомяка (ВНК). Установлено, что имплантированные трансфектированные клетки можно применять для успешного лечения больных диабетом мышей, благодаря осуществлению контроля уровня глюкозы его удавалось приводить практически в полное соответствие с уровнем глюкозы в организме контрольных не больных диабетом животных. Однако этот метод не удовлетворяет требованиям общепринятого лечения пациентов, страдающих диабетов.
Другой подход к экзогенной стабилизации уровня глюкозы основан на применении нового класса лекарственных средств, известного как эндокринные миметики, возможность применения которых для лечения диабета типа II исследуется в настоящее время. Эксенатид (Вуеба®) представляет собой синтетическую версию встречающегося в естественных условиях соединения, обнаруженного в слюне ящерицы Ойа шоийег. В клинических опытах установлено, что эндокринный миметик (эксенатид) снижает уровень сахара в крови и улучшает функцию бета-клеток на уровне маркеров. Однако эксенатид оказывает лишь ограниченные воздействия на человеческий эндокринный гормон глюкагон-подобный пептид1 (СЬР-1).
В целом, в настоящее время отсутствует доступная эффективная терапия диабета типа II, позволяющая снижать уровень глюкозы в крови аналогично СЬР-1, другими словами, терапия, которая обладает полным спектром благоприятных действий, характерных для СЬР-1, например его способностью при физиологических концентрация значительно снижать скорость проникновения питательных веществ в кровоток путем снижения скорости опорожнения желудка у страдающих ожирением пациентов или его инсулинстимулирующей активностью. Таким образом, объектом настоящего изобретения является создание пептидных молекул на основе СЬР-1, которые обладают биологической активностью и устойчиво стью к протеолитическому расщеплению.
В настоящем изобретении предложен слитый пептид, который содержит в качестве компонента (I) Ν-концевую последовательность СЬР-1(7-35, 7-36 или 7-37) и в качестве компонента (II) С-концевую пептидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 9 аминокислот, или ее функциональный фрагмент, вариант или производное.
В основу настоящего изобретения положен тот факт, что созданный пептид, предлагаемый в изобретении, защищен от протеолитического расщепления ίη νίνο, прежде всего протеолитической эндопептидазой IV. Предлагаемый в изобретении пептид, который содержит по меньшей мере два компонента (I) и (II), обладает биологической активностью, характерной для СЬР-1, и одновременно придает стабильность СЬР-1, который представляет собой компонент (I), в результате С-концевого удлинения.
Понятие «предлагаемый в изобретении пептид» в контексте настоящего описания относится к слитому пептиду, как он определен в контексте настоящего описания, его варианту, аналогу, фрагменту или производному, включая комбинации, например, дериватизированного фрагмента, аналога или варианта слитого пептида. Понятие «пептид СЬР-1» в контексте настоящего описания означает СЬР-1(7-35, -36 или -37), при этом подразумевается, что «модифицированный пептид СЬР-1» означает любой аналог СЬР-1, производное СЬР-1, вариант СЬР-1 или фрагмент СЬР-1, включая дериватизированный фрагмент, аналог или вариант СЬР-1(7-35, -36 или -37), который может присутствовать в любом из компонентов (I) и (III) предлагаемого в изобретении пептида. Понятие «пептид СЬР-2» в контексте настоящего описания означает СЬР-2(1-33, -34 или -35), при этом подразумевается, что «модифицированный пептид СЬР-2» означает любой аналог, фрагмент или вариант СЬР-2, включая дериватизированный фрагмент, аналог или вариант СЬР-2(1-33, -34 или -35). Варианты, аналоги, фрагменты и производные рассматриваются как модификации немодифицированной последовательности, например, СЬР-1(7-35, - 36 или -37) или СЬР-2(1-33, -34 или -35). В контексте настоящего изобретения подразумевается, что любой вариант, аналог, фрагмент или производное должно обладать функциональной активностью, например обладать таким же или подобным биологическим действием, что и немодифицированный пептид СЬР-1.
Предпочтительно предлагаемый в изобретении пептид представляет собой слитый пептид или его вариант, аналог, фрагмент или производное, в котором компонент (I) содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:1. 8Е0 ГО N0:1 представляет собой нативную аминокислотную последовательность СЬР-1(7-37) (состоящую из 31 аминокислоты), которая является высококонсервативной у млекопитающих.
Второй компонент (компонент (II)) слитого пептида, предлагаемого в изобретении (или в более общем смысле любого предлагаемого в изобретении пептида, включая аналоги, фрагменты, варианты или производные слитых пептидов), как правило, содержит последовательность, состоящую по меньшей мере из 9 аминокислот, которые могут иметь структуры типа β-изгиба (складки) или не иметь такую структуру. β-складчатая структура представляет собой, как правило, элемент вторичной структуры белков или пептидов. Она, как правило, образуется четырьмя аминокислотами, которые изменяют на противоположное направление каркасной цепи пептида или белка. Аминокислотная последовательность компонента (II) содержит по меньшей мере 9 аминокислот и предпочтительно содержит по меньшей мере один остаток пролина или аланина в последовательности. Остатки пролина являются обычными аминокисло
- 2 013796 тами в β-складке, формирующей тетрамерную аминокислотную последовательность. Остаток пролина обычно и чаще всего локализован в положении 2 или 3, предпочтительно 2, тетрамерной последовательности β-складки, которая входит в состав компонента (II) слитого пептида.
В состав предлагаемого в изобретении слияния может, как правило, входить компонент (II), последовательность которого состоит из 9-30, предпочтительно 9-20 и наиболее предпочтительно 9-15 аминокислот. Другими словами, более короткие последовательности компонента (II) могут быть предпочтительными из-за из повышенной способности связываться с ОЬР-рецептором по сравнению с более длинными последовательностями. Последовательность компонента (II), хотя это не является необходимым условием, предпочтительно может быть нейтральной или иметь отрицательный заряд при рН 7.
Слитый пептид, предлагаемый в изобретении, является предпочтительным, если его компонент (II) содержит последовательность-мотив, выбранную из группы, включающей УАМ, IΑЕЕ, РЕЕУ, АЕЕУ, ЕЕЬО, АААА, ААУА, ААЬО, ЭЕРЕ, ΑΑΌΧ, ΑΧΌΧ и ΧΑΌΧ, где X обозначает любую аминокислоту (встречающуюся в естественных условиях или модифицированную не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту). Эти тетрамерные мотивы могут быть локализованы в любом месте в последовательности компонента (II). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент (II) в предлагаемом в изобретении слитом пептиде представляет собой пептидную последовательность, связанную с С-концом компонента (I) через ее ^концевую последовательность-мотив, выбранную из группы, включающей АА, ХА, АХ, ЯК, ΚΧ и ΧΚ, где Χ обозначает любую аминокислоту (встречающуюся в естественных условиях или модифицированную не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту).
Предпочтительный мотив компонента (II) предлагаемого в изобретении слитого пептида содержит последовательность-мотив, представленную в 8ЕО ГО N0:25 (ЭЕРЕЕУА), или содержит последовательность, которая гомологична по меньшей мере на 80% последовательности мотива ЭЕРЕЕУА, которая соответствует частичной последовательности человеческого или мышиного ГР-2.
Особенно предпочтительным является слитый пептид, в котором компонент (II) представляет собой пептидную последовательность, которая содержит последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:22 (ККЭЕРЕЕУА!) или 8Е0 ГО N0:26 (ААЭЕРЕЕУА!) (все пептидные последовательности представлены в однобуквенном коде), или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:22 или 8Е0 ГО N0:26. 8Е0 ГО N0:22 представляет собой частичную последовательность полноразмерной последовательности (человеческого или мышиного) ГО-2 (интронный пептид 2), которая содержит ^концевые 10 аминокислот состоящей из 15 аминокислот полноразмерной последовательности ГО-2. 8Е0 ГО N0:26 является производной 8Е0 ГО N0:22, которая получена заменой ^концевых (ЯЯ) остатков на (АА). ГО-2 является предпочтительным примером содержащей βскладку пептидной последовательности. Таким образом, другими еще более предпочтительными последовательностями являются последовательности, в которых компонент (II) длиннее частичных аминокислотных последовательностей ГО-2, например, содержит ^концевую состоящую из 14 аминокислот последовательность, которая встречается в человеческой (8Е0 ГО N0:23 (ККЭЕРЕЕУА^ЕЕЕ)) или мышиной копии (8Е0 ГО N0:24 (ЯЯ^ЕРЕЕVΑIΑЕЕ^)), или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 23 или 24. Наиболее предпочтительными в качестве элементов, входящих в компонент (II) слитого пептида, являются полноразмерные последовательности ГО-2, которые содержат все 15 аминокислот встречающейся в естественных условиях последовательности ГО-2 (8Е0 ГО N0:2 (ЯЯ^ЕРЕЕVΑIVЕЕ^6), человеческая, или 8Е0 ГО N0:3 (ЯЯ^ЕРЕЕVΑIΑЕЕ^^), мышиная), или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:2 или 3. Под объем настоящего изобретения подпадают также все изоформы ГО2 млекопитающих (встречающиеся в естественных условиях в организме млекопитающих варианты ГО2). Все последовательности, упомянутые в этом параграфе, могут нести также ^концевой мотив (АА), (АХ) или (ХА) вместо встречающихся в естественных условиях (ЯЯ), например 8ЕО ГО N0:27 (ААЭЕРЕЕУА!УЕЕЕ), 8НО ГО N0:28 (ΑΑ^ЕРЕЕVΑIΑЕЕ^), 8ЕО ГО N0:29 (ААЭЕРЕЕУА[УЕЕЕО) и 8Е0 ГО N0:30 (ААЭЕРЕЕУАМЕЕЕС). Можно получать белки, содержащие более одной копии последовательности, включенной в компонент (II), например 2, 3 или даже большее количество копий ГО2 или фрагмента, варианта или аналога или производного ГО2.
Таким образом, предлагаемый в изобретении пептид предпочтительно содержит последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0:8 (НΑЕ6ТЕТ8^V88Υ^Е6^ΑΑΚЕЕIΑ№^VΚ6Я6ЯЯ^ЕРЕЕVΑIАЕЕЬО), т.е. ОЬР-1(7-37), связанный без какой-либо линкерной последовательности через его С-конец с мышиным ГО2, или последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:12 (НАЕСТЕТ8ЭУ88УЕЕООАΑΚЕЕIΑ^^VΚ6Я6ЯЯ^ЕРЕЕVΑIVЕЕ^6), т.е. ОЬР-1(7-37), связанный без какой-либо линкерной последовательности через его С-конец с человеческим ГО2. Кроме того, другими предпочтительными предлагаемыми в изобретении вариантами предлагаемых в изобретении пептидов, которые имеют последовательности, представленные в 8Е0 ГО N0:8 и 8Е0 ГО N0:12, являются 8Е0 ГО N0:31
- 3 013796 (Ц;\ГО1ЕТ8Оνδ8ΥΕΕθρΑΑΚΕΠΑν.·ΤνΚΟΚ<3ΑΑΟΕΡΕΕνΑΙΑΕΠΓ.Ω), 8ЕО ГО N0:32 (НАЕСтТРТЯОУЗЗУГЕОфА ΑΚΕΙ'ΙΑ'λ'ΈνΚΟΚΟΚ.ΕΟΡΑΕΕνΑΙΑΕΕΕΟ).
8Е0 ГО N0:33 (НАЕОТРТ8ОУ88УЕЕО9ААКЕР1А\¥ЬУКОЕОККОААААУА1АЕЕЕО), ЗЕО ГО N0:34 (НАР.ОТРТЗОУЗЗУТ.ЕООЛЛКЕРТАУДАКОКОААОААААУАЕАААЕС), 8Εί) ГО N0:35 (ΗΑΕ0ΤΡΤ80ν88ΥΕΕ09ΑΑΚΕΡΙΑλνΕνΚ0Κ0ΚΚ0ΡΡ), 8 Ер ГО N0: 36 (НАЕОТРТ8ОУ88УЕЕОфААКЕР1АУ7ЕУКОКОККОРРБЕУА), 8Еф ГО N0:37 (ΗΑΕΟΤΡΤ8θν38ΥΕΕΟΟΑΑΚΕΡΙΑΨΕνΚΟΚ.ΟΚΚΟΡΡΕΕνΑΙΑΕΕΕΟΒ.Κ.ΗΑΟ), 8Е0 ГО N0:38 (НАЕОТРТ8ОУ88УЬЕО0ААКЕР1А^ЕУКОК.ОААОРРЕЕУА1УЕЕЕО), 8Ер ГО N0:39 (ΗΑΕΟΤΡΤ8θνδ8ΥΕΕΟ(2ΑΑΚ.ΕΡΙΑλνΕνΚΟΚΟΚΚϋΡΑΕΕνΑΐνΕΕΕΟ), 8Еф ГО N0:40 (ΗΑΕΟΤΡΤδΟνδδΥΕΕΟΟΑΑΚΕΡΙΑΨΕνΚΟΚ,ΟΚΚϋΑΑΑΑνΑΐνΕΕΕΟ), ЗЕО ГО N0:41 (ΗΑΕΟΤΡΤ3ϋν88ΥΕΕΟΟΑΑΚΕΡΙΑ1¥ΕνΚΟΚ.ΟΑΑΟΑΑΑΑνΑΐνΑΑΕΟ), 8Е0 ГО N0:42 (ΗΑΕΟΤΕΤ8^V88Υ^ΕΟ^ΑΑΚΕΡIΑ^V^VΚΟΚ(ЖΚ.^ΡΡΕΕVΑIVΕΕ^ΟΚΕ.ΗΑС);
т.е. ОЬР-1 (7-37), связанный без какой-либо линкерной последовательности через его С-конец с конкретными аналогами или вариантами последовательности ΙΡ2. Варианты, аналоги или фрагменты, которые имеют последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% 8Е0 ΙΌ N0:8 и 12, или их производные также подпадают под объем изобретения и являются предпочтительными.
Не вдаваясь в какую-либо теорию, при создании настоящего изобретения сделано предположение, что нестабильность ОЬР-1(7-35, -36 или -37), при введении любому пациенту, который нуждается в этом, является следствием незащищенной 3-мерной структуры. Протеазы могут расщеплять пептид 0ЬР-1(735, -36 или -37) и быстро устранять его физиологическую активность ίη νίνο. Путем связывания пептидной последовательности с С-концом ОЬР-1(7-35, -36 или -37) его структура приобретает стабильность в отношении ферментативного расщепления. Приобретенную стабильность, вероятно, можно повышать, если дополнительная С-концевая пептидная последовательность (входящая в компонент (ΙΙ) слитого пептида, предлагаемого в изобретении) приобретает складчатость в результате присутствия β-складчатого структурного элемента, образованного из ее первичной структуры и придающего жесткость компоненту (II). Однако β-складчатая структура в компоненте (II) предлагаемого в изобретении пептида, вероятно, не является необходимым условием стабилизации последовательности ОЬР-1 компонента (I) в отношении ферментативного расщепления. Предлагаемый в изобретении пептид, благодаря его С-концевому пептидному удлинению, например, содержащему элемент β-складчатой структуры, как установлено, обладает повышенной устойчивостью к инактивации ЬРРЧ V. С-концевой пептид либо не отщепляется от последовательности ОЬР-1(7-35, -36 или -37) перед воздействием на его рецептор на клетках-мишенях, либо он может ферментативно отщепляться с образованием ОЬР-1(7-35, -36 или -37) ίη νίνο. Вне зависимости от точной формы связи предлагаемого в изобретении пептида в сайте ОЬР-1-рецептора, пептид, предлагаемый в изобретении, осуществляет свою функцию в качестве активного инсулинотропного соединения.
Пептидные последовательности, которые можно рассматривать в качестве пригодных для включения в компонент (II), из-за их первичной структуры, образующей элемент β-складчатой структуры, можно легко идентифицировать с помощью соответствующих, например, спектроскопических методов, например циркулярного дихроизма, или других методов, известных специалисту в данной области.
Компонент (II) и компонент (I) можно связывать непосредственно или связывать через линкерную последовательность. Предпочтительно оба компонента непосредственно связывают друг с другом. В случае их связывания через линкер (или спейсер), линкер предпочтительно представляет собой пептидный линкер или органический линкер. Пептидный линкер, как правило, состоит из от 1 до 10 аминокислот, предпочтительно от 1 до 5, еще более предпочтительно от 1 до 3 аминокислот, в некоторых случаях линкерная последовательность может быть длиннее и содержать от 11 до 50 аминокислот. Пептидный линкер может состоять из различных аминокислотных последовательностей. Предпочтительно пептидный линкер должен интродуцировать определенную структурную гибкость между компонентами, подлежащими связыванию. Для достижения структурной гибкости применяют, например, пептидный линкер, который содержит различные количества остатков глицина или пролина, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере 60% остатков пролина и глицина в линкерной последовательности. Вне зависимости от конкретной
- 4 013796 последовательности пептидный линкер предпочтительно должен быть иммунологически неактивным.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемый в изобретении пептид, т.е. слитый пептид или его аналоги, фрагмент, варианты или производные, содержит третий компонент (компонент (III)), который или связан с С-концом компонента (II) и/или с Ν-концом компонента (I). Предпочтительно компонент (III) локализован на С-конце компонента (II). Вне зависимости от того, связан ли компонент (III) с Ν-концом компонента (I) (с помощью его С-конца), или с С-концом компонента (II) (с помощью его Ν-конца), сочетание может быть непосредственным или косвенным через линкерную последовательность. К линкерной последовательности применимо все описанное выше для линкера, соединяющего компонент (I) и компонент (II). Как правило, компонент (III) содержит по меньшей мере 4 аминокислотных остатка, предпочтительно по меньшей мере 10 дополнительных аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 20 или по меньшей мере 30 остатков. С точки зрения функции компонент (III) применяют для дополнительного повышения стабильности предлагаемого в изобретении пептида. Считается, что компонент (III) не должен влиять на биологическую функцию предлагаемого в изобретении пептида, которая примерно сопоставима с биологической активностью ОЬР-1(7-37).
Предпочтительно компонент (III) предлагаемого в изобретении пептида содержит по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20 дополнительных аминокислотных остатков Ν-концевой последовательности изоформы ОЬР-2 из организма любого вида млекопитающих (другой встречающийся в естественных условиях вариант ОЬР-2 млекопитающих), например мышиной или человеческой изоформ, последовательности которых представлены в 8ЕО ГО N0:4 и 5. ОЬР-2 присутствует в проглюкагоне и также принимает участие в метаболизме углеводов. Также как и биологически активная последовательность, входящая в состав компонента (I) (пептид ОЬР-1), компонент (III) может также содержать аналоги, варианты или производные встречающихся в естественных условиях форм ОЬР-2. В альтернативном варианте компонент (III) может содержать также по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20 дополнительных аминокислотных остатков Ν-концевой последовательности ОЬР-1(7-37), в том числе соответственно все изоформы, характерные для млекопитающих, или, как указано в настоящем описании, все их функциональные варианты, аналоги или производные. Другими словами, компонент (III) может содержать любую форму пептида ОЬР-1 или модифицированного пептида ОЬР-1, которая представлена в настоящем описании в качестве приемлемой для компонента (I) предлагаемого в изобретении пептида. В другом альтернативном варианте компонент (III) может содержать также химерные формы ОЬР-1(7-37) и ОЬР-2. Химерные формы можно получать путем сочетания ОЬР-1(7-37) и ОЬР-2 (или фрагментов, аналогов, вариантов или производных их обоих) друг с другом и путем последующей интродукции указанной химерной формы в качестве компонента (III) в предлагаемый в изобретении пептид. Предпочтительно химерная форма состоит из части последовательности ОЬР-1(7-37) и части последовательности ОЬР2, связанных вместе. Например, химерная форма может включать от 5 до 30 Ν-концевых аминокислот ОЬР-1 и от 5 до 30 С-концевых аминокислот ОЬР-2 или наоборот, например, аминокислоты от 7 или 8 до 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 ОЬР-1(7-37) и аминокислотную последовательность от положения 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 до, например, С-конца ОЬР-2.
Если модификации встречающихся в естественных условиях форм ОЬР-2 или ОЬР-1(7-37) соответственно применяют в качестве компонента (III), то компонент (III) предпочтительно содержит последовательность, представленную в 8ЕО ГО Ν0:4 или 5, или в 8ЕО ГО Ν0:1 соответственно, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологичная последовательности, представленной в 8ЕО ГО Ν0:4 или 5 либо в 8ЕО ГО Ν0:1. Согласно настоящему изобретению производные этих предпочтительных последовательностей, например, полученные с помощью модификаций боковой цепи или модификаций пептидного каркаса и т.д. (обозначенные в контексте настоящего описания понятием «производные»), также можно применять в качестве компонента (III).
Согласно другому варианту осуществления изобретения компонент (III) может содержать несколько описанных выше последовательностей. Например, компонент (III) может содержать по меньшей мере 2, предпочтительно 2, 3 или 4 копии ОЬР-1(7-37) и/или ОЬР-2 или по меньшей мере 2 копии последовательностей, которые по меньшей мере на 80% гомологичны последовательности, представленной в 8ЕО ГО Ν0:1, 4 или 5. Кроме того, компонент (III) может содержать более одной копии описанной выше химерной версии ОЬР-1(7-37) или ОЬР-2, например, формирующие в конечной счете комбинацию химерной(ых) версии(ий) в сочетании с ОЬР-1(7-37) и/или ОЬР-2, или ее модификации, имеющей по меньшей мере 80%-ную гомологию последовательности. Под объем настоящего изобретения подпадает также применение двух или большего количества, предпочтительно двух компонентов (III), которые могут, например, быть (1) связаны своим Ν-концом с С-концом компонента (II) и (2) связаны своим С-концом с Ν-концом компонента (I) через линкер или непосредственно. Если применяют два компонента (III), то они могут быть одинаковыми или различными.
Таким образом, наиболее предпочтительными являются предлагаемые в изобретении слитые пептиды, которые содержат три компонента (I), (II) и (III). Четыре конкретных варианта, содержащих все эти компоненты, выбирают из группы, включающей: 8ЕО ГО Ν0:6 (Ν-ОЬР- 1(7-37)-[Р2(мышиный)-ВР
- 5 013796
СЬР-1(7-37)-С, обозначенный также в контексте настоящего описания как мышиный СМ1), 8ЕС ГО N0: 7 Ш-СЬР-1(7-37)-1Р2(мышиный)-КВ-СЬР2-С, обозначенный также в контексте настоящего описания как мышиный СМ2), 8Е0 ГО N0:10 (Ы-СЬР-1 (7-37)-1Р2(человеческий)-ВВ-СЬР-1(7-37)-С, обозначенный также в контексте настоящего описания как человеческий СМ1) и 8Е0 ГО N0:11 (№СЬР-1(7-37)1Р2(человеческий)-КВ-СЬР-2-С, обозначенный также в контексте настоящего описания как человеческий СМ2) или последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:6, 7, 10 или 11, или ее производное. Все последовательности 6, 7, 10 и 11 содержат ВВ-линкер (два остатка аргинина) на С-конце 1Р2 (компонент (II)), который в альтернативном варианте может отсутствовать. Компонент (I) в каждом из указанных вариантов, представленных в 8ЕС ГО N0:6, 7, 10 или 11, обозначает СЬР-1(7-37), а компонент (III) (в каждом из указанных вариантов связанный с С-концом компонента (II)) представляет собой либо СЬР-1(7-37), либо СЬР-2.
Предлагаемые в изобретении пептиды могут находиться в различных модифицированных формах. Эти модифицированные формы более подробно описаны ниже.
Понятие «соли» в контексте настоящего описания относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп описанных выше слитых пептидов или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов. Соли карбоксильной группы можно получать с помощью методов, хорошо известных в данной области, и они представляют собой неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т. п., и соли с органическими основаниями, образованные, например, с аминами, такими как этаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Кислотноаддитивные соли представляют собой, например, соли с минеральными кислотами, такими, например, как соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Естественно, любые указанные соли должны сохранять соответствующую биологическую активность предлагаемых в изобретении пептидов, т.е. способность снижать скорость проникновения питательных веществ в кровоток. Как будет описано ниже, пептиды в форме солей могут входить в состав фармацевтической композиции.
Понятие «фрагмент» слитого пептида, предлагаемого в настоящем изобретении, относится к любой субпопуляции молекул, т.е. укороченному пептиду, который сохраняет требуемую биологическую активность. Фрагменты легко можно получать путем удаления аминокислот из любого конца молекулы и осуществляя оценку образовавшейся молекулы в отношении ее свойств в качестве агента внутренней секреции. Протеазы, обладающие способностью удалять одномоментно одну аминокислоту или с N конца и/или с С-конца полипептида, известны в данной области и поэтому определение фрагментов, которые сохраняют требуемую биологическую активность, включает лишь осуществление общепринятых экспериментов. И, наконец, фрагменты можно получать в результате делеций аминокислот на концах пептида и/или аминокислот, локализованных внутри пептидной последовательности.
Кроме того, предлагаемый в изобретении пептид, обладающий активностью в отношении диабета типа II, который представляет собой сам слитый пептид, его аналог или вариант, соль, функциональное производное и/или фрагмент, может содержать также дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие предлагаемый в изобретении пептид. В случае, когда образовавшаяся молекула сохраняет устойчивость к действию протеаз или стабильность и способность проявлять активность в качестве агента внутренней секреции, то с помощью общепринятых экспериментов можно определять оказывают ли фланкирующие остатки какое-либо действие на основные или новые характеристики корового пептида, например, в результате их воздействия на панкреатические клетки. Понятие «состоит практически из» касательно конкретной последовательности означает, что в ней могут присутствовать дополнительные фланкирующие остатки, которые не оказывают влияния на основные и новые характеристики конкретного предлагаемого в изобретении пептида. Это понятие не включает замены, делеции или добавления в конкретной последовательности.
Понятие «вариант» в контексте настоящего изобретения относится к молекуле, которая практически аналогична либо полному предлагаемому в изобретении пептиду, как он определен выше, либо его фрагменту. Варианты пептидов можно получать путем прямого химического синтеза варианта пептида с использованием методов, хорошо известных в данной области. Естественно, указанный вариант предлагаемого в изобретении пептида должен обладать аналогичной противодиабетической, например, инсулинстимулирующей активностью, что и соответствующий встречающийся в естественных условиях пептид СЬР-1.
В другом случае варианты аминокислотной последовательности пептидов, как они определены выше, можно получать путем мутаций в ДНК, которые кодируют синтезированные производные. Такие варианты представляют собой, например, варианты, полученные в результате делеций или инсерций или замен остатков в аминокислотной последовательности. Для получения конечной конструкции можно также использовать комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемой активностью. Очевидно, что мутации, которые можно создавать в ДНК, кодирующей вариант пептида, не должны изменять рамку считывания и предпочтительно не должны создавать комплементарные области, которые могут приводить к образованию вторичной структуры мРНК.
Понятие «аналог» указанных выше пептидов согласно настоящему изобретению относится к не
- 6 013796 встречающейся в естественных условиях молекуле, которая практически аналогична либо полной молекуле, либо ее активному фрагменту. Такой аналог должен обладать такой же активностью, что и соответствующий встречающийся в естественных условиях пептид СБР-1.
Типы замен, которые можно осуществлять в предлагаемом в изобретении пептиде, согласно настоящему изобретению могут быть основаны на анализе частоты встречаемости аминокислотных замен в гомологичном белке/пептиде различных видов. На основе такого анализа можно определять консервативные замены, как изменения в пределах одной из следующих пяти групп:
I) небольшие алифатические неполярные или имеющие небольшую полярность остатки: А1а, 8ег, Тйг, Рго, О1у;
II) полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Аки, С1и. С1п;
III) полярные положительно заряженные остатки: Ηίκ, Агд, Бук;
IV) крупные алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, Не, να1, Сук;
V) крупные ароматические остатки: Рйе, Тгу, Тгр.
В пределах вышеуказанных групп «высококонсервативными» считаются следующие замены: Акр/О1и; Ηίκ/Агд/Ьук; Рйе/Туг/Тгр; Ме1/Беи/Не^а1. К полуконсервативным заменам относятся замены между двумя указанными выше группами (Ί)-(Γν), которые ограничены надгруппой (А), содержащей указанные выше группы (I), (II) и (III), или надгруппой (Б), содержащей указанные выше группы (IV) и (V). Замены не ограничены генетически кодируемыми или даже встречающимися в естественных условиях аминокислотами.
В целом, аналоги или варианты предлагаемого в изобретении пептида могут содержать также аминокислотные замены, которые осуществляют, например, для улучшения стабильности (замена гидрофобных аминокислот на гидрофильные аминокислоты). В одном из вариантов осуществления изобретения варианты/аналоги пептида ОБР-1, предлагаемого в изобретении (входящие в компонент (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида) (модифицированного) пептида СБР-1 отличаются наличием одной или нескольких замен в положениях 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 33, 34, 35, 36 или 37 пептида СБР-1. Например, следующее обозначение [Агд34-ОБР-1(7-37)] относится к аналогу ОБР-1, в котором встречающийся в естественных условиях лизин в положении 34 заменен на аргинин.
В частности, компонент (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида может содержать варианты и аналоги ОБР-1(7-35, -36 или -37), включая, например, (Ж9-6БР-1 (7-37), ϋ-Ο1η9-ΟΕΡ-1(7-37), ацетил-Буз9-ОБР-1(7-37), Тйг16-Еу818-ОБР-1(7-37) и Бу518-ОБР-1(7-37), Агд34-аЕР-1(7-37), Бу838-Агд26ОБР-1(7-38)-ОН, Буз36-Агё26-ОБР-1(7-36), Агё26,34-Буз38-ОЕР-1(7-38), Агё26,34-Еуз38-ОЕР-1(7-38), Агё26,34-Еуз38-ОЕР-1(7-38), Агё26,34-Бу838-ОБР1(7-38), Агё26,34-Буз38-ОБР-1(7-38), Агё26-Бу838-ОБР-1(7-38), Агё26-Буз38ОЬР-1(7-38), Агё26-Бу838-ОБР-1(7-38), Агд34-Ьуз38-ОЕР-1(7-38), А1а37-Ьуз38ОБР-1(7-38) и Бу837-ОБР-1(7-37).
В другом варианте осуществления изобретения предлагаемый в изобретении пептид содержит в качестве компонента (I) или (III) модифицированный пептид ОБР-1, который содержит аминокислотную последовательность следующей формулы II (8ЕО ГО N0:44):
Хаа7-Хаа8-(31и-С1уТЪг-Рйе-Т11г-8ег-А8р-Хаа16-8ег-Хаа18-Хаа19-Хаа20-О1и-Хаа22-Хаа23-А1а-Хаа25Хаа26-Хаа27-РЬе-11е-ХааЗо-Тгр-Беи-ХааЗЗ-Хаа34-Хаа35-Хаа36-Хаа37, где Хаа7 обозначает Ь-гистидин, Ό-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, 3-гидроксигистидин, гомогистидин, Ν-ацетилгистидин, а-фторметилгистидин, а-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2пиридилаланин или 4-пиридилаланин;
Хаа8 обозначает А1а, О1у, Vа1, Ьеи, Не, Бук, А1Ь, (1-аминоциклопропил)карбоновую кислоту, (1аминоциклобутил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклопентил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогексил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогептил)карбоновую кислоту или (1-аминоциклооктил)карбоновую кислоту, где О1у является наиболее предпочтительным значением;
Хаа16 обозначает Vа1 или Ьеи;
Хаа18 обозначает 8ег, Бук или Агд;
Хаа19 обозначает Туг или О1п;
Хаа20 обозначает Беи или Ме1;
Хаа22 обозначает О1у, О1и или А1Ь;
Хаа23 обозначает О1п, О1и, Бук или Агд;
Хаа25 обозначает А1а или Vа1;
Хаа26 обозначает Бук, О1и или Агд;
Хаа27 обозначает О1и или Беи;
- 7 013796
Хаа30 обозначает А1а, О1и или Агд;
Хаа33 обозначает Уа1 или Ьук;
Хаа34 обозначает Ьук, О1и, Акп или Агд;
Хаа35 обозначает О1у или А1Ь;
Хаа36 обозначает Агд, С1у или Ьук или амид или отсутствует;
Хаа37 обозначает С1у. А1а, С1и. Рго, Ьук, амид или отсутствует.
В другом варианте осуществления изобретения компонент (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида содержит модифицированный пептид ОЬР-1, который содержит аминокислотную последовательность следующей формулы III (8ЕО Ш N0:45):
Хаа7-Хаа8-О1и-С1у-ТЬг-Рйе-Т11г-8ег-А5р-Уа1-8егХаа8-Туг-Ьеи-О1и-Хаа22-Хаа23-А1а-А1а-Хаа26-О1и-РЬе-11е-Хаа30-Тгр-Ьеи-Уа1Хаа34-Хаа3 5-ХааЗ 6-ХааЗ 7 где Хаа7 обозначает Ь-гистидин, Ό-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, -гидроксигистидин, гомогистидин, Ν-ацетилгистидин, а-фторметилгистидин, а-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2пиридилаланил или 4-пиридилаланин;
Хаа8 обозначает А1а, О1у, Уа1, Ьеи, Не, Ьук, А1Ь, (1-аминоциклопропил)карбоновую кислоту, (1аминоциклобутил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклопентил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогексил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогептил)карбоновую кислоту или (1-аминоциклооктил)карбоновую кислоту;
Хаа18 обозначает 8ег, Ьук или Агд;
Хаа22 обозначает 01у, 01и или А1Ь;
Хаа23 обозначает О1п, О1и, Ьук или Агд;
Хаа26 обозначает Ьук, 01и или Агд;
Хаа30 обозначает А1а, 01и или Агд;
Хаа34 обозначает Ьук, 01и или Агд;
Хаа35 обозначает 01у или А1Ь;
Хаа36 обозначает Агд или Ьук, амид или отсутствует;
Хаа37 обозначает О1у, А1а, О1и или Ьук, амид или отсутствует.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида содержит (модифицированный) пептид ОЬР-1, который выбирают из ОЬР-1(7-35), ОЬР-1(7-36), ОЬР-1(7-36)-амида, ОЬР-1(7-37) или его варианта, аналога или производного. Предпочтительными являются также предлагаемые в изобретении пептиды, содержащие в их компонентах (I) и/или (III) модифицированный пептид ОЬР-1, который несет остаток А1Ь в положении 8 или аминокислотный остаток в положении 7 пептида ОЬР-1, который выбирают из группы, включающей Όгистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, гидроксигистидин, гомогистидин, Ν-ацетилгистидин, афторметилгистидин, а-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2-пиридилаланил или 4-пиридилаланин.
Примерами методов получения аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для создания аналогов, предлагаемых для применения согласно настоящему изобретению, являются любые стадии методов, представленных в и.8. КЕ 33653; 4959314; 4588585 и 4737462, на имя Магк и др.; 5116943 на имя Ко1115 и др.; 4965195 на имя №ипеп и др.; и 5017691 на имя Ьее и др., и метод получения замещенных лизином белков, описанный в И8 4904584 (8йате и др.).
Предпочтительно вариант или аналог, как они определены выше, которые входят в состав компонента (I), (II) и/или (III), должны иметь коровую последовательность, такую же как «нативная» последовательность, например ОЬР-1(7-37) или ОЬР-2, или ее биологически активный фрагмент или любую изоформу ГР2, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 70% идентична нативной аминокислотной последовательности и сохраняет присущую ей биологическую активность. Более предпочтительно такая последовательность по меньшей мере на 80% идентична, по меньшей мере на 90% идентична или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична нативной последовательности. Если говорят, что последовательность конкретного пептида характеризуется конкретным процентом идентичности относительно полипептиду определенной длины, с которым проводят сравнение, то процент идентичности оценивают относительно пептида, с которым проводят сравнение. Так, пептид, идентичный на 50% полипептиду, с которым проводят сравнение, который состоит из 100 аминокислот, представляет собой состоящий из 50 аминокислот полипептид, который полностью идентичен состоящей из 50 аминокислот области полипептида, с которым проводят сравнение. Он может представлять собой также состоящий из 100 аминокислот полипептид, который на 50% идентичен полипептиду, с которым проводят сравнение, по всей его длине. Естественно, другие полипептиды должны удовлетворять таким же критериям. Понятие «идентичность последовательности» в контексте настоящего описания означает, что последовательности сравнивают следующим образом. Осуществляют сравнительный анализ первичной структуры последовательностей с помощью версии 9 группы компьютерной генетики (Оепейе Сошрибпд Огоир'к) программы ОАР (глобальная программа сравнительного анализа первичной структуры), используя по умолчания матрицу (ВЬ08ИМ62) (значения от -4 до +11), принимая штраф за
- 8 013796 открытие бреши -12 (за первый нуль в бреши) и штраф за удлинение бреши -4 (за каждый последующий нуль в бреши). После сравнительного анализа первичной структуры рассчитывают процент идентичности, выражая количество совпадений в виде процента от количества аминокислот в заявляемой последовательности.
Под объем настоящего изобретения подпадают также производные слитого пептида или его аналога, фрагмента или варианта. Считается, что понятие «производное» предлагаемого в изобретении пептида относится только к таким модифицированным пептидам, предлагаемым в изобретении, в которых отсутствует замена одной аминокислоты на другую среди двадцати встречающихся в естественных условиях аминокислот. Таким образом, генетически кодируемые аминокислоты можно модифицировать путем взаимодействия с органическим дериватизирующим агентом, который обладает способностью к взаимодействию с выбранными боковыми цепями амино- и карбоксигрупп концевых остатков (предпочтительно путем ковалентной модификации) или путем интродукции не встречающихся в естественных условиях аминокислот (полученных путем химического синтеза, т.е. Ό-изомеров аминокислот, кодируемых генетическим кодом, А1Ь (а-аминоизомасляная кислота), ЛЬи (а-аминомасляная кислота), Т1е (третбут), η-аинаин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота), или встречающихся в естественных условиях аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, Ό-аланин и Ό-глутамин, или путем модификации каркаса пептида путем альтернативного устройства пептидного каркаса.
Описанные выше предпочтительные модификации аминокислот предлагаемого в изобретении пептида (в том числе, как указано выше, вариантов, аналогов или фрагментов слитого пептида) могут затрагивать любой сайт (любую аминокислоту) предлагаемого в изобретении пептида, например, расположенный в компоненте (I), (II) и/или (III).
Цистеинильные остатки, если присутствуют в любой форме предлагаемого в изобретении пептида, например, в аналоге предлагаемого в изобретении пептида, как правило, вступают во взаимодействие с альфа-галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с образованием карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Цистеинильные остатки дериватизируют также путем взаимодействия с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5имидазолил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Ν-алкилмалеимидами, 3-нитро-2пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, η-хлорбензоатом ртути, 2-хлор-4-нитрофенолом ртути или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.
Гистидильные остатки предлагаемого в изобретении пептида можно дериватизировать путем взаимодействия с диэтилпрокарбонатом при рН 5,5-7,0, поскольку этот агент относительно специфичен в отношении гистидильной боковой цепи. Можно применять также парабромфенацилбромид; реакцию предпочтительно осуществляют в 0,1М какодилате натрия при рН 6,0. В частности, Ν-концевой остаток гистидина (НЦ7)ОЬР-1(7-37), который входит в компонент (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида, является очень важным для инсулинотропной активности пептидов ОЬР-1, как установлено 8ιιζι.ι1<ί с соавторами (Ь|аЬе1е5 Век.; С11шса1 Ртасйсе 5 (приложение 1), 1988, с. 30). Таким образом, предлагаемый в изобретении пептид можно модифицировать на НЦ7 ОЬР-1, который является частью его компонента (I) и/или (III), с помощью алкильных или ацильных (С1-С6)групп или путем замены НЦ функционально эквивалентными кольцевыми С56-структурами. Предпочтительной модификацией является интродукция гидрофобного фрагмента на аминоконец НЬ7 или в его гистидильную боковую цепь.
Лизинильные и аминоконцевые остатки предлагаемого в изобретении пептида можно, например, подвергать взаимодействию с янтарным или другими ангидридами карбоновых кислот. Дериватизация с помощью этих агентов оказывает такое действие, как реверсия заряда лизинильных остатков. С помощью модификации ацилом (С1218) эпсилон-аминогруппы остатка(ов) лизина в предлагаемом в изобретении пептиде его время полужизни в кровотоке увеличивается. Аргинильные остатки можно, например, модифицировать путем взаимодействия с одним или несколькими общепринятыми реагентами, в том числе фенилглиоксалом; и нингидрином. Для дериватизации аргининовых остатков требуется осуществление реакции в щелочных условиях из-за высокого значения рКа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты можно подвергать взаимодействию с группами лизина, а также эпсилонаминогруппы аргинина.
Сама по себе специфическая модификация тирозильных остатков хорошо изучена. Для получения О-ацетилтирозильных видов и е-нитропроизводных предпочтительно можно применять Νацетилимидазол и тетранитрометан соответственно.
Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) можно избирательно модифицировать путем взаимодействия с карбодиимидами (Κ/Ν-^Ν-Κ.1), такими как 1-циклогексил-3-[2-морфолинил-(4этил)]карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид.
Кроме того, аспартильный и глутамильный остатки можно превращать в аспарагинильный и глутаминильный остатки путем взаимодействия с ионами аммония.
Глутаминильный и аспарагинильный остатки можно деамидировать с образованием соответствующих глутамильных и аспартильных остатков. В альтернативном варианте эти остатки можно деамидировать в слабо кислых условиях. Любая форма этих остатков подпадает под объем настоящего изобрете
- 9 013796 ния. У деамидированных предлагаемых в изобретении пептидов можно изменять чувствительность к протеолитическому расщеплению протеазами или пептидазами, исходя из предположения, что деамидирование может иметь важное физиологическое значение при непосредственном протеолитическом расщеплении предлагаемого в изобретении пептида. Следует отметить, что полученные в результате биосинтеза предлагаемые в изобретении пептиды могут расщепляться при определенных условиях хранения, что приводит к деамидированию в одном из нескольких положений в предлагаемом в изобретении пептиде. Остаток метионина в предлагаемых в изобретении пептидах может обладать чувствительностью к окислению, прежде всего до образования сульфоксида. В качестве других указанных выше производных можно использовать и дезамидированные предлагаемые в изобретении пептиды и/или сульфоксиды предлагаемых в изобретении пептидов, которые обладают полной биологической активностью.
Другими приемлемыми реагентами для дериватизации содержащих альфа-аминокислоты остатков являются сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксалфосфата; пиридоксал; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; О-метилизомочевина; 2,4-пентиндион; и катализируемая трансаминазой реакция с глиоксилатом.
Концевые аминокислотные остатки предлагаемого в изобретении пептида с карбокси-(С-конец) и амино-(П-конец) группами (а также карбокси- или амидные группы боковых цепей аминокислот, см. выше) могут присутствовать в защищенной форме (например С-конец защищен амидной группой) с помощью амино- или карбоксильных защитных групп и/или в незащищенной форме. Кроме того, можно применять кислотно-аддитивные соли предлагаемого в изобретении пептида. Обычными кислотноаддитивными солями являются соли галогенводородных кислот, т.е. НВг, ΗΙ или более предпочтительно НС1.
ПЭГилирование карбоксильных групп концевых или боковых цепей или эпсилон-аминогруппы лизина в предлагаемом в изобретении пептиде придает устойчивость к окислению и также подпадает под объем настоящего изобретения.
Другие модификации, приводящие к получению производных предлагаемых в изобретении пептидов, затрагивают углеводы и/или липиды, которые могут быть ковалентно сшиты с предлагаемым в изобретении пептидом. Предпочтительно сшивать липиды и/или углеводы с серином, треонином, аспарагином, глутамином или тирозином или глутаматом или аспартатом через их реактивные фрагменты боковой цепи. В альтернативном варианте углеводы и/или липиды можно связывать также с концевыми фрагментами предлагаемого в изобретении пептида. Кроме того, предлагаемый в изобретении пептид можно сшивать с отличным по функциональной активности пептидным или белковым фрагментом, который может также повышать стабильность предлагаемого в изобретении пептида и/или может служить для улучшения транспортных свойств предлагаемого в изобретении пептида в общей воде организма, прежде всего в крови. Приемлемые пептиды или белки можно выбирать, например, из альбумина, трансферрина и т.д., которые непосредственно сшивают (в качестве компонента IV) с предлагаемым в изобретении пептидом или сшивают через пептидную или органическую линкерную последовательность. Предпочтительно эти пептиды или белки связывают с одним из концов предлагаемого в изобретении пептида.
Для решения проблемы, связанной с расщеплением предлагаемого в изобретении пептида, следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является ретроинвертированный изомер предлагаемого в изобретении пептида, состоящий из Ό-аминокислот, или по меньшей мере частично состоящий из Ό-аминокислот. Понятие «ретро-инвертированный изомер» относится к изомеру линейного пептида, в котором направление последовательности является обратным, и хиральность каждого аминокислотного остатка является инвертированной (см., например, 1атс5оп и др., Ыа1иге, 368, 1994, с. 744-746; Вгабу и др., №1Шге. 368, 1994, с. 692-693). Касательно родительского пептида ретроинвертированной пептид собирают, используя обратный порядок аминокислот, как правило, защищенных с помощью Р-тос производных аминокислот. Как правило, неочищенные пептиды можно очищать с помощью ЖХВР с обращенной фазой.
Другие модификации, которые можно интродуцировать в предлагаемые в изобретении пептиды, представляют собой модификации пептидного каркаса. Предпочтительно модифицированные предлагаемые в изобретении пептиды представляют собой каркасные миметики. Их каркас отличается от встречающегося в естественных условиях каркаса, в то время как структуры боковых цепей идентичны структурам предлагаемых в изобретении пептидов, их фрагментов, вариантов, производных или аналогов. В целом, каркасные миметики несут модификацию одной или нескольких групп каркасной цепи (ΝΗ, СН, СО) либо в результате замены (предпочтительно) или в результате инсерции. Замены представляют собой, например, (I) -О-, -8- или -СН2- вместо -ΝΗ-; (II) -Ν-, С-алкил- или -ВН- вместо -СНВ- и (III) -С8-, -СН2-, -8Оп-, -Р=О(ОН)- или -В(ОН)- вместо -СО-. Пептидный миметик предлагаемого в изобретении пептида может представлять собой комбинацию каждой из указанных модификаций. В частности, можно объединять модификации каждой из групп I, II и III. В пептидном миметике можно модифицировать каждую группу каркасной цепи или в альтернативном варианте только некоторое количество групп цепи можно заменять на не встречающуюся в естественных условиях группу. Предпочтительно все группы каркасной цепи предлагаемого в изобретении пептида, такие как -ΝΗ-, -СНВ- или СО, заменяют
- 10 013796 на другую не встречающуюся в естественных условиях группу. В случае, когда амидную связь (-ΝΗ-СО-) каркаса предлагаемого в изобретении пептида заменяют (во всей молекуле или по меньшей мере в одном положении), предпочтительные для замены группы представляют собой биостерические, например, ретроинвертированные амидные связи (-СО-ΝΗ-), гидроксилэтилен (-СН(ОН)-СН2-), алкен (СН2=СН-), карба (СН2-СН2-) и/или -Р=О(ОН)-СН2-. В альтернативном варианте удлинение цепи каркаса путем встраивания можно осуществлять в каркасном миметике предлагаемого в изобретении пептида, например, с помощью групп, фланкирующих С-альфа атом. На любой стороне С-альфа атома можно встраивать, например, -О-, -8-, -СН-, -ΝΗ-.
Особенно предпочтительной является олигокарбаматная структура пептидного каркаса предлагаемых в изобретении пептидов. Амидную связь заменяют на карбаматную группу. Мономерные Νзащищенные аминоалкилкарбонаты можно получать на основе соответствующих аминокислот или аминоспиртов. Их превращают в активные сложные эфиры, например, сложный η-нитрофениловый эфир, с помощью Р-шое-группы или фоточувствительной нитроатрилоксикарбонильной группы путем твердофазного синтеза.
Предлагаемые в изобретении пептиды защищают от протеолитического расщепления согласно указанному выше методу. Прежде всего их защищают от действия дипептидиламинопептидазы-4 (ΌΡΡ-ΐν). Понятие «защищенный от действия ΌΡΡΗν» в контексте настоящего описания относится к пептиду по п.1 формулы изобретения. Предлагаемые в изобретении пептиды, а также их производные, аналоги, фрагменты и варианты, несущие ΟΕΡ-1(7-35, -36 или -37) в качестве части компонента (I) и/или (III) предлагаемого в изобретении пептида, обладают устойчивостью к присутствующей в плазме пептидазе (ΟΡΡΗν).
Устойчивость пептида к расщеплению дипептидиламинопептидазой IV определяют, например, с помощью изложенного далее анализа расщепления.
Аликвоты пептидов инкубируют при 37°С с аликвотой очищенной дипептидиламинопептидазы IV в течение 4-22 ч в соответствующем буфере при рН 7-8 (буфер не содержит альбумин). Ферментативные реакции прекращают, добавляя трифторуксусную кислоту, и продукты расщепления пептида отделяют и оценивают с помощью ЖХВР или ЖХ-МС-анализа. Один из методов осуществления анализа заключается в осуществлении следующей процедуры: смеси наносят на колонку 2огЬах3008В-С18 (диаметр пор 30 нм, частицы размером 5 мкм) 150x2,1 мм, и элюируют при скорости потока 0,5 мл/мин линейным градиентом ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (градиент от 0 до 100% ацетонитрила в течение 30 мин). Пептиды и их продукты расщепления можно оценивать по их абсорбции при 214 нм (пептидные связи) или 280 нм (ароматические аминокислоты), и определять количественно путем интеграции площадей их пиков. Схему расщепления можно определять с помощью ЖХ-МС, при использовании которых можно определять МС-спектры отдельного пика. Процентное соотношение интактного/расщепленного соединения в данный момент времени используют для оценки стабильности пептидов в отношении расщепления ΌΡΡΗν.
Предлагаемый в изобретении пептид рассматривается как стабилизированный (обладающий повышенной стабильностью) в отношении расщепления ΌΡΡΗν, когда его стабильность в 10 раз выше, чем у ΟΕΡ-1(7-37), при выражении в процентах интактного соединения в данный момент времени. Таким образом, стабилизированный в отношении расщепления ΌΡΡΗν предлагаемый в изобретении пептид предпочтительно по меньшей мере в 10, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз более стабилен, чем ΟΕΡ-1(7-37) сам по себе. Стабильность можно оценивать с помощью любого метода, известного специалисту в данной области, например, добавляя ΌΡΡ-Γν в раствор подлежащего оценке пептида, и определяя расщепление пептида, например, во времени, например, спектроскопическим методом, анализом методом Вестерн-блоттинга, путем скрининга с использованием антител и т.д. Параллельно предлагаемый в изобретении пептид оценивают в качестве соединения, которое обладает действием ΟΕΡ-1(737), например, оценивая связывание с его нативным рецептором (ΟΕΡ-1-рецептор). Предпочтительно предлагаемый в изобретении пептид обладает аффинностью к связыванию с ΟΕΡ-1-рецептором, составляющему по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 50% от аффинности связывания встречающегося в естественных условиях пептида ΟΕΡ-1. Аффинность связывания можно определять с помощью любого пригодного метода, например, с помощью резонанса поверхностного плазмона и т.д. Кроме того, предпочтительно, если предлагаемый в изобретении пептид вызывает формирование внутриклеточного цАМФ путем связывания с внеклеточным рецептором, который передает сигнал в клетку.
Пептиды, предлагаемые в изобретении, можно получать синтетически с помощью методов твердофазного пептидного синтеза, аналогично тому, как получают амид ΟΕΡ-1(7-36) и ΟΕΡ-1(7-37) в данной области, и можно очищать после этого в лабораторных условиях, например, с использованием одной стадии очистки на ЖХВР-колонке с обращенной фазой или с помощью приемлемых хроматографических методов.
Однако предпочтительно создают клетки, либо микробные клетки, либо клетки животных, для производства предлагаемого в изобретении пептида. Предлагаемый в изобретении пептид можно выделять из клеток, в которых он экспрессируется, например, с помощью общепринятых методов разделения. Так, клетки можно выращивать в соответствующих условиях, например, с использованием подложки и пита
- 11 013796 тельных веществ, ίη νίίτο, и секретируемый белок, т.е. предлагаемый в изобретении пептид, выделять из внеклеточной среды. Созданные таким образом в клетках последовательности предпочтительно включают лидерные последовательности и последовательности сигнальных пептидов, которые обеспечивают определенную направленность секреции предлагаемого в изобретении пептида. Клетки предпочтительно экспрессируют протеазу, которая обладает способностью расщеплять лидерные и сигнальные последовательности, либо эндогенные, либо сконструированные генные последовательности. В альтернативном варианте сконструированные генные последовательности, кодирующие предлагаемый в изобретении пептид, не содержат указанные лидерные последовательности и последовательности сигнальных пептидов, в результате экспрессируемый внутри клетки предлагаемый в изобретении пептид не может секретироваться и его выделяют из клеток с помощью процессов, включающих лизис клеток. При использовании таких методов кодирующие последовательности могут включать способствующие очистке метки, позволяющие эффективно экстрагировать пептидный продукт из среды, эти метки можно отщеплять для высвобождения выделенного предлагаемого в изобретении пептида.
Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, которая кодирует предлагаемый в изобретении пептид, представляющий собой слитый пептид или его фрагмент, аналог или вариант. Под объем настоящего изобретения подпадает любая нуклеиновая кислота, кодирующая предлагаемые в изобретении пептиды. В результате вырожденности генетического кода предлагаемый в изобретении пептид могут кодировать несколько нуклеотидных последовательностей. Подпадающая под объем настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую предлагаемый в изобретении пептид, и, кроме того, дополнительные (функционально активные) нуклеотидные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты может кодировать (а) полную аминокислотную последовательность СЬР-1 (СЬР-1(1-37)) или функционально активную последовательность СЬР-1(7-35, -36 или -37), (б) отщепляемую любой протеазой последовательность на Ν-конце последовательности СЬР-1, кодирующей последовательность, которая указана в (а), расположенную против хода транскрипции относительно последовательности, указанной в (б), которая может кодировать лидерную последовательность. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения расположенная против хода транскрипции относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность, которая указана в (б), в молекуле нуклеиновой кислоты может дополнительно присутствовать (в) последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. В альтернативном варианте предлагаемая в изобретении молекула нуклеиновой кислоты может иметь последовательность (в), слитую против хода транскрипции с последовательностью, указанной в (а), без какой-либо находящейся между ними последовательности, кодирующей лидерную последовательность (б). Предпочтительно лидерная последовательность и последовательность сигнального пептида являются гетерологичными относительно препроглюкагона.
Изобретение относится также к вектору, содержащему предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту (молекулу) и другие функционально активные компоненты для экспрессии предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты (молекулы). Как правило, предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту (молекулы) можно сливать с промоторной последовательностью и, наконец, объединять с другими регуляторными последовательностями, например с энхансерной последовательностью. Для репликации плазмида может содержать сайт инициации репликации. Для селекции клеток, трансфектированных предлагаемым в изобретении вектором, вектор можно снабжать одним или несколькими генами, обеспечивающими устойчивость к антибиотику(ам) (например, канамицину, ампициллину). Вектор может представлять собой плазмиду, которая содержит промотор бактериального происхождения и гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, и исходный промотор и гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих. Изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей экзогенно интродуцированную ДНК, предлагаемую в изобретении, которая обладает способностью к трансляции указанного белка-предшественника. Клетка-хозяин может представлять собой либо прокариотическую клетку-хозяина, либо эукариотическую клеткухозяина, например клетку млекопитающего.
Следующим объектом изобретения является способ лечения животного, предпочтительно человека, заключающийся в том, что вводят предлагаемый в изобретении пептид, который содержит компоненты (I) и (II) и необязательно компонент (III). Изобретение относится также к соответствующему применению указанных предлагаемых в изобретении пептидов для получения продукта, предназначенного для лечения или предупреждения заболевания или состояния, ассоциированного с метаболизмом глюкозы. Примерами связанных с глюкозой нарушений являются (но, не ограничиваясь ими): сахарный диабет типа I или типа II (ИНСД, инсулин-независимый (сахарный) диабет) или устойчивость к инсулину, нарушения или заболевания, связанные с весом тела, или связанные с ним состояния, где нарушения веса тела или связанные с ним состояния включают ожирение, состояния, связанные с избыточным весом, нарушение регуляции насыщения, пониженные уровни инсулина в плазме, повышенные уровни глюкозы в крови или пониженную массу панкреатических бета-клеток. Предложено предпочтительно применять предлагаемые в изобретении пептиды для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения диабета типа II (ИНСД). Следовательно, настоящее изобретение относится к применению
- 12 013796 предлагаемого в изобретении пептида, например, для снижения веса индивидуума, для снижения порога насыщения индивидуума, для послеобеденного повышения уровней инсулина в плазме у индивидуума, для снижения уровня глюкозы в крови натощак у индивидуума, для повышения массы панкреатических бета-клеток у индивидуума или для лечения диабета типа I или II у пациента.
Кроме того, с помощью предлагаемых в изобретении пептидов, т.е. слитых пептидов или их аналогов, фрагментов, вариантов или производных, можно лечить пациентов с другими заболеваниями или нарушениями. Предлагаемые в изобретении пептиды можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нейродегенеративных нарушений и заболеваний или связанных с ними состояний и для лечения нарушений и заболеваний, ассоциированных с апоптозом. Применение предлагаемого в изобретении пептида для лечения указанных нарушений обусловлено следующими причинами: рецепторы СЬР-1, которые связаны с путем вторичного мессенджера циклического АМФ, экспрессируются в головном мозге грызунов и людей. Хемоархитектура распределения рецепторов в головном мозге коррелирует не только с имеющей решающее значение ролью СЬР-1 в регуляции потребления пищи и ответом на вызывающий отвращение (к пище) стресс. Установлено также, что связь СЬР-1 со своим рецептором СЬР-1 приводит к проявлению нейротропной активности и служит защитой от индуцируемого глутаматом апоптоза и окислительного повреждения культивируемых нейронов. Кроме того, установлено, что СЬР-1 модифицирует процессинг предшественника амилоидного β-белка в культурах клеток и в зависимости от дозы снижает уровни амилодного β-пептида в головном мозге ίη νίνο. Так, СЬР-1 известен также в качестве регулятора центральной нервной системы. Предлагаемые в изобретении пептиды, имитирующие биологическую активность физиологически активного СЬР-1, обладают терапевтической ценностью для лечения, например, болезни Альцгеймера (АБ) и других нейродегенеративных состояний, связанных с центральной и периферической нервной системой (например, амиотрофический боковой склероз (АЬ8), болезнь Александера, синдром Альперса (прогрессирующая полидистрофия мозга), атаксия-телеангиэктазия, болезнь Канавана, синдром Кокейна, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, рассеянный склероз, болезнь Сандхоффа, болезнь Пика, атаксия спинного мозга, болезнь Шильдера и болезнь Паркинсона).
Кроме того, установлено, что физиологически активный СЬР-1 обладает антиапоптозным действием в отношении различных клеток, например, ценным действием СЬР-1 является возможность его применения для сохранения массы и функции свежевыделенных человеческих островковых или других типов клеток. В результате биологически активный предлагаемый в изобретении пептид можно применять для лечения нарушений, обусловленных апоптозом клеток или тканей.
Предлагаемый в изобретении пептид можно применять для приготовления композиции, которую вводят экзогенно и которая содержит выделенный предлагаемый в изобретении пептид. Полученную композицию можно применять также для лечения вышеуказанных нарушений. Указанные выше нарушения можно лечить также с помощью предлагаемых в изобретении клеток-хозяев, нуклеиновых кислот (молекул) или векторов или более предпочтительно предлагаемые в изобретении клетки-хозяева, нуклеиновые кислоты (молекулы) или векторы можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения указанных нарушений.
Приготовление форм, которые содержат в качестве действующего вещества последовательности предлагаемого в изобретении пептида, как правило, хорошо известно в данной области, например, описано в И8 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Как правило, такие формы приготавливают в виде предназначенных для инъекции или жидких растворов, или суспензий, которые предпочтительно содержат воду (водная форма) или могут быть эмульгированы. Понятие «водная форма» означает форму, содержащую по меньшей мере 50 мас.% воды. Аналогично этому понятие «водный раствор» означает раствор, содержащий по меньшей мере 50 мас.% воды, а понятие «водная суспензия» означает суспензию, содержащую по меньшей мере 50 мас.% воды.
Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в область поражения действующее вещество должно находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который не содержит пирогенов и имеет приемлемое значение рН, изотоничность и стабильность. Жидкие фармацевтические композиции, как правило, включают жидкий наполнитель, такой как вода. Предпочтительно жидкий наполнитель может представлять собой физиологический соляной раствор, декстрозный, этанольный или другой раствор сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль или их комбинации. Дополнительными примерами являются другие изотоничные наполнители, такие как раствор Рингера для инъекций или лактированный раствор Рингера (Рингер-лактат) для инъекций.
Если изобретение относится к фармацевтическому препарату, который содержит водный раствор соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, и буфер, то указанное соединение присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл или выше, и значение рН указанного препарата составляет от примерно 2,0 до примерно 10,0, предпочтительно от примерно 7,0 до примерно 8,5. Предпочтительно значение рН препарата находится в диапазоне по меньшей мере 1 единицы рН от изоэлектрической точки соединения,
- 13 013796 предлагаемого в настоящем изобретении, еще более предпочтительно значение рН препарата находится в диапазоне по меньшей мере 2 единицы рН от изоэлектрической точки соединения, предлагаемого в настоящем изобретении.
Можно приготавливать также твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Фармацевтический препарат может представлять собой высушенную вымораживанием форму, в которую лечащий врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением. Другими словами приготовленный препарат не требуется немедленно вводить индивидууму. Как правило, после приготовления ее упаковывают для хранения в замороженном состоянии или в виде высушенной формы для последующего восстановления с получением жидкой формы или другой формы, пригодной для введения индивидууму.
В другом варианте осуществления изобретения фармацевтический препарат представляет собой высушенный препарат (например, сушкой вымораживанием или распылительной сушкой), готовый к применению без какого-либо предварительного растворения. Под «высушенной формой» понимают высушенную фармацевтическую композицию или препарат, который сушат либо сушкой вымораживанием (т.е. лиофилизацией; см., например, А1Шатк и РоШ, 1. Рагеп1ега1 8с1. Тсе11по1. 38, 1984, с. 48-59), распылительной сушкой (см., Мак1егк, 1991 в: 8ргау-Эгутд НапбЬоок, 5-е изд.; изд-во Ьопдтап 8с1епбПс апб Тесйшса1, Еккех, и.К., с. 491-676; Вгоабйеаб и др., Эгид Эеуе1. 1пб. Рйагт. 18, 1992, с. 1169-1206; и Митеп1йа1ег и др., Рйагт. Кек. 11, 1994, с. 12-20) или воздушной сушкой (Сагрейег и Сго\\'е. СгуоЬю1оду 25, 1988, с. 459-470; и Кокег, Вюрйагт. 4, 1991, с. 47-53). Образование агрегатов полипептида в процессе хранения жидкой фармацевтической композиции оказывает отрицательной воздействие на биологическую активность полипептида, приводящее к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может приводить к другим проблемам, таким как блокада трубок, мембран или насосов, когда содержащую полипептид фармацевтическую композицию вводят с помощью системы для инфузии.
В содержащем пептид фармацевтическом препарате, предлагаемом в настоящем изобретении, могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут представлять собой смачивающие вещества, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, рН-забуферивающие агенты (например, фосфатный или цитратный, или малеатный буферы), консерванты, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, жирные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и/или цвиттерион (например, аминокислота, такая как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин).
Стабилизаторы, которые можно применять в предлагаемых в изобретении препаративных формах, предпочтительно следует выбирать из группы, включающей высокомолекулярные полимеры или низкомолекулярные соединения. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатор выбирают из группы, включающей полиэтиленгликоль (например, ПЭГ 3350), поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон, карбоксигидроксицеллюлозу или ее производные (например, НРС (гидроксипропилцеллюлоза), НРС-8Ь, НРС-Ь и НРМС (гидроксипропилметилцеллюлоза)), циклодестрины, серосодержащие субстанции, такие как монотиоглицерин, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол, и различные соли (например, хлорид натрия). Композиции, содержащие каждый из указанных стабилизаторов индивидуально, представляют собой альтернативный вариант осуществления изобретения. Фармацевтические композиции могут также содержать дополнительные стабилизирующие агенты, которые еще более повышают стабильность терапевтически активного полипептида. Представляющими наибольший интерес в контексте настоящего изобретения стабилизаторами являются (но, не ограничиваясь ими) метионин и ЭДТК, защищающая полипептид от метионинового окисления, и неионогенное поверхностно-активное вещество, которое защищает полипептид от агрегации, ассоциированной с замораживанием-оттаиванием или механическим сдвигом.
Поверхностно-активные вещества, которые можно применять в предлагаемых в изобретении препаративных формах, предпочтительно можно выбирать из группы, включающей детергент, этоксилированное касторовое масло, полигликолизированные глицериды, ацетилированные моноглицериды, эфиры жирных кислот и сорбитана, блок-полимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена (например, полоксамеры, такие как Р1игоше Е68, полоксамер 188 и 407, Тритон Х-100), эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбината, звездообразный ПЭО (полиэтиленоксид), производные полиоксиэтилена и полиэтилена, такие как алкилированные и алкоксилированные производные (Твины, например, Твин-20, Твин-40, Твин-80, и Вгу-35), полиоксиэтиленгидроксистеарат, моноглицериды или их этоксилированные производные, диглицериды или их полиоксиэтиленовые производные, спирты, глицерин, лецитины и фосфолипиды (например, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, дифосфатидилглицерин и сфингомиелин), производные фосфолипидов (например, дипальмитоилфосфатидная кислота) и лизофосфолипидов (например, пальмитоиллизофосфатидил-Ь-серин и сложные 1ацил-кп-глицеро-3-фосфатные эфиры этаноламина, холина, серина или треонина) и алкильные, алкоксильные (сложные алкиловые эфиры), алококси- (простые алкиловые эфиры) производные лизофосфатидила и фосфатидилхолинов, например лауроиловые и миристоиловые производные лизофосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, и модификаторы полярной головной группы, представляющие
- 14 013796 собой холины, этаноламины, фосфатидную кислоту, серины, треонины, глицерин, инозит, и положительно заряженные Э0ЭЛС. Ό0ΤΜΛ, ЭСР. ВКН0Р, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилтреонин, и глицерофосфолипиды (например, цефалины), глицерогликолипиды (например, галактопиранозид), сфингогликолипиды (например, церамиды, ганглиозиды), додецилфосфохолин, лизолецитин куриного яйца, производные фузидоновой кислоты (например, тауро-дигидрофузидат натрия и т.д.), жирные кислоты с длинной цепью и соли С6-С12кислот (например, олеиновой кислоты и каприловой кислоты), ацилкарнитины и их производные, Ν'Χ-ацилированные производные лизина, аргинина или гистидина, или производные с ацилированной боковой цепью лизина или аргинина, Ν-ацилированные производные дипептидов, содержащие любую комбинацию лизина, аргинина и нейтральных или кислотных аминокислот, Ν-ацилированное производное трипептида, содержащее любую комбинацию нейтральных аминокислот и двух заряженных аминокислот, Ό88 (докусат натрия, регистрационный номер СЛ8 [577-117], докусат кальция, регистрационный номер СЛ8 [128-49-4], докусат калия, регистрационный номер СЛ8 [7491-09-0]), ДСН (додецилсульфат натрия или лаурилсульфат натрия), каприлат натрия, холевую кислоту или ее производные, желчные кислоты и их соли и конъюгаты с глицином или таурином, урсодезоксихолевую кислоту, холат натрия, дезоксихолат натрия, таурохолат натрия, гликохолат натрия, Νгексадецил-^№диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, анионогенные (алкиларилсульфонаты) одновалентные поверхностно-активные вещества, цвиттерионные поверхностно-активные вещества (например, №алкил-^№диметиламмонио-1 -пропансульфонаты, 3 -холамидо -1 -пропилдиметиламмонио -1 -пропансульфонат), катионогенные поверхностно-активные вещества (четвертичные аммониевые основания) (например, цетилтриметиламмонийбромид, цетилпиридинийхлорид), неионогенные поверхностноактивные вещества (например, додецил-Э-глюкопиранозид), полоксамины (например, тетроники (Тейошс'к)), которые представляют собой тетрафункциональные блок-сополимеры, полученные в результате последовательного добавления пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамину, или поверхностно-активное вещество можно выбирать из группы, включающей имидазолиновые производные или их смеси. Композиции, содержащие каждое из указанных конкретных поверхностно-активных веществ индивидуально, представляют собой альтернативный вариант осуществления изобретения. Применение поверхностно-активного вещества в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства в качестве ссылки представлен справочник РепйпдЮп: Тйе 8с1епсе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу, 19-е изд., 1995.
Фарацевтически приемлемые консерванты предпочтительно можно выбирать из группы, включающей фенол, о-крезол, т-крезол, η-крезол, метил-п-гидроксибензоат, пропил-п-гидроксибензоат, 2феноксиэтанол, бутил-п-гидроксибензоат, 2-фенилэтанол, бензиловый спирт, этанол, хлорбутанол и тиомеросал, бронопол, бензойную кислоту, имидмочевину, хлоргекседин, дигидроацетат натрия, хлоркрезол, этил-п-гидроксибензоат, бензетонийхлорид, хлорфенесин (3-п-хлорфеноксипропан-1,2-диол) или их смеси.
Придающие изотоничность агенты предпочтительно можно выбирать из группы, включающей соль (например, хлорид натрия), сахар или сахарный спирт, аминокислоту (например, Ь-глицин, Ь-гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, аспарагиновая кислота, триптофан, треонин), альдит (например, глицерин, 1,2-пропандиол (пропиленгликоль), 1,3-пропандиол, 1,3-бутандиол), полиэтиленгликоль (например, ПЭГ 400) или их смеси. Можно применять любой сахар, такой как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, оксиэтилированный крахмал и Να-карбоксиметилцеллюлозу. В одном из вариантов осуществления изобретения добавка в виде сахара представляет собой сахарозу. Понятие «сахарный спирт» относится к С4С8углеводороду, содержащему по меньшей мере одну -ОН- группу, и включает, например, маннит, сорбит, инозит, галацитит, дульцит, ксилит и арабит. В одном из вариантов осуществления изобретения добавка в виде сахарного спирта представляет собой маннит. Указанные выше сахара или сахарные спирты можно применять индивидуально или в сочетании. Не существует точного предела применяемого количества, если сахар или сахарный спирт растворим в жидком препарате и не оказывает отрицательного действия на стабилизирующую активность, которую достигают с помощью способов, предлагаемых в изобретении.
Хелатирующие агенты предпочтительно можно выбирать из солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты и их смесей.
Буферы предпочтительно выбирают из группы, включающей ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат, глицилглицин, гистидин, глицин, лизин, аргинин, первичный кислый фосфат натрия, динатрийфосфат, фосфат натрия и трис(гидроксиметил)аминометан, гепес (Нерек), бицин, трицин, яблочную кислоту, сукцинат, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, аспарагиновую кислоту или их смеси. Композиции, содержащие каждый из указанных конкретных буферов индивидуально, представляют собой альтернативный вариант осуществления изобретения.
Применение вышеуказанных добавок в фармацевтических композициях, содержащих предлагаемый в изобретении терапевтический пептид, хорошо известно специалисту в данной области, прежде всего касательно диапазона их концентраций. Для удобства в качестве ссылки представлен справочник
- 15 013796
ВеттдЮп: ТНе 8с1епсе апб Ргасбсе о£ РЬагтасу, 19-ое изд., 1995.
Препаративные формы, содержащие предлагаемый в изобретении пептид, можно вводить парентерально путем инъекции, например, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. Композицию, предназначенную для парентерального введения предлагаемого в изобретении пептида, можно, например, приготавливать с помощью метода, описанного в \УО 03/002136.
Дополнительные препаративные формы, пригодные для других путей введения, представляют собой суппозитории и в некоторых случаях формы для орального, трансбуккального, подъязычного, внутрибрюшинного, внутривагинального, анального и внутричерепного введения. Для суппозиториев традиционные связующие вещества и носители могут представлять собой, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно приготавливать из смесей, содержащих действующее вещество в концентрации от 0,5 до 10%, предпочтительно 12%. В препаративные формы для орального введения входят такие, например, общепринятые эксципиенты, как имеющие чистоту, пригодную для фармацевтического применения, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния и т. п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаративных форм с пролонгированным высвобождением или порошков и содержат 10-95% действующего вещества, предпочтительно 25-70%.
Как отмечалось выше, для контроля продолжительности действия можно применять дополнительные фармацевтические методики. Для создания препаратов с контролируемым высвобождением можно применять полимеры, предназначенные для образования комплекса или абсорбции пептида, предлагаемого в настоящем изобретении. Для осуществления контролируемого введения действующего вещества (пептида) можно выбирать соответствующие макромолекулы (например, сложные полиэфиры, полиминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилена и винилацетата, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу и сульфат протамина), применять соответствующую концентрацию макромолекул и методы включения. Такие сведения указаны в Веттфоп! РЬагтасеибса1 8с1епсе§ (см. выше). Другой возможный метод регулирования продолжительности действия с помощью препаратов с контролируемым высвобождением заключается в том, что включают пептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частицы полимерного материала, такого как сложные полиэфиры, полиаминокислоты, гидрогели, поли(молочная кислота) или сополимеры этилена и винилацетата.
Предлагаемые в изобретении пептиды могут иметь нейтральную форму или форму соли. Пептид, предлагаемый в настоящем изобретении, может быть в достаточной степени кислым или в достаточной степени щелочным для взаимодействия с любым(ой) из многочисленных органических или неорганических оснований и органических и неорганических кислот с образованием (аддитивной) соли, например, образованной со свободными аминогруппами пептида. Обычно применяемые для образования кислотноаддитивных солей кислоты представляют собой неорганические кислоты, такие как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., и органические кислоты, такие как винная кислота, асп-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, миндальная кислота, п-бромфенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота. Примерами таких солей являются сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, вторичный кислый фосфат, первичный кислый фосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксиленсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гамма-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, можно получать также из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа(3), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п. Кислотно-аддитивные соли, соли карбоксилатов, сложных (низш.)алкиловых эфиров и амидов предлагаемых в изобретении пептидов можно приготавливать согласно методам, описанным в АО 91/11457 (1991); ЕР 0733644 (1996) и И8 5512549 (1996).
Препараты, содержащие предлагаемые в изобретении пептидные последовательности, вводят путем, который соответствует дозе препарата, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Подлежащее введению количество зависит от индивидуума, подлежащего лечению, включая, например, серьезность заболевания пациента. Приемлемые диапазоны доз составляют, например, порядка нескольких сотен микрограммов действующего вещества на терапевтическую дозу, предпочтительно от примерно 0,1 до 2000 мкг (даже рассматривается применение больших количеств, составляющих 1-10 мг), например, от примерно 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно от 1 до 500 мкг и особенно предпочтительно от примерно 10 до 100 мкг.
Препараты, содержащие предлагаемые в изобретении пептиды плюс, например, дополнительные эксципиенты, например глицин и маннит, или другие добавки, могут поступать в продажу в лиофилизированной форме в пузырьках. При этом прилагается входящий в комплект пузырек с разбавителем, что позволяет пациенту восстанавливать продукт с получением требуемой концентрации перед введением
- 16 013796 дозы. Предлагаемые в изобретении препараты могут также поступать в продажу в виде других хорошо известных приспособлений, таких как предварительно заполненные шприцы и т.д.
Ниже изобретение проиллюстрировано с помощью примеров.
Примеры
Пример 1.
Создание генетических конструкций.
Кодирующую последовательность кДНК СЬР-1(7-37) получали путем синтеза, включая в последовательность сайты НшсП и ЕсоК1, как показано на фиг. 1а. Отдельно синтезировали кДНК, проиллюстрированную на фиг. 1б, включая в кодирующие последовательности СЬР-1(7-37) 1Р2 и сайты рестрикции, распознаваемые 8Го1, ЕсоК! и ХЬа1, как проиллюстрировано на фиг. 1б. Для обеспечения пути секреции СЬР-1 использовали гетерологичную сигнальную последовательность стромелизина 3 (регистрационный номер ΝΜ_005940). Для этой цели кДНК, кодирующую сигнальную и лидерную последовательность стромелизина, амплифицировали с использованием ПЦР с обратной транскриптазой с человеческой РНК и применяли в сочетании с конструкцией, представленной на фиг. 1а или фиг. 1б, для создания конструкции, представленной на фиг. 1в и фиг. 1г соответственно.
Ншс11/ЕсоК1-фрагмент конструкции, представленной на фиг. 1а, клонировали в сайте 8Го1 последовательности, представленной на фиг. 1г, с получением конструкции, представленной на фиг. 1д. Аналогично этому ЕсоК1-фрагмент конструкции, представленной на фиг. 1г, клонировали в сайте ЕсоК! эукариотической экспрессионной плазмиды, получая конструкцию, представленную на фиг. 1е. Для создания конструкции, представленной на фиг. 1ж, Ншс11/ХЬа1-фрагмент конструкции, представленной на фиг. 1б, повторно клонировали в сайте 8!о1/ХЬа1 конструкции, представленной на фиг. 1г. На фиг. 1з представлена синтезированная последовательность с оптимизированным кодоном, которая кодирует лидерную и сигнальную последовательности стромелизина, со встроенной укороченной эндогенной интронной последовательностью, слитой с последовательностями, которые кодируют человеческий СЬР-1(7-37), 1Р2 и СЬР-2(1-35). Последовательность ДНК конструкции, представленной на фиг. 1з, показана в 8ЕЦ ΙΌ N0:16, а в 8Е0 ΙΌ N0:15 показана также последовательность транслированного пептида.
Синтезировали также последовательности, представленные на фиг. 1и и фиг. 1к. Их затем применяли для создания конструкции, представленной на фиг. 1л, путем клонирования №е1/Вк&НП-фрагмента конструкции, представленной на фиг. 1к, в линеаризованной с помощью №е1/ВккНП последовательности, представленной на фиг. 1з. Последовательность ДНК конструкции, представленной на фиг. 1л, показана в 8Е0 ΙΌ N0:14, а в 8Е0 ΙΌ N0:13 показана также последовательность транслированного пептида. Конструкцию, представленную на фиг. 1м, получали путем расщепления с помощью Вк&НП и повторного встраивания путем лигирования последовательности, представленной на фиг. 1з. Последовательность ДНК конструкции, представленной на фиг. 1м, показана в 8Е0 ΙΌ N0:18, а в 8Е0 ΙΌ N0:17 показана также последовательность транслированного пептида. Конструкцию, представленную на фиг. 1н, получали путем клонирования АГе1/Вк&Н11-фрагмента последовательности, представленной на фиг. 1и, в линеаризованной с помощью АГеЕВккНП последовательности, представленной на фиг. 1з. Последовательность ДНК конструкции, представленной на фиг. 1н, показана в 8Е0 ΙΌ N0:20, а в 8Е0 ΙΌ N0:19 показана также последовательность транслированного пептида.
Описанные выше конструкции специалист в данной области может получать с помощью общепринятых методов.
Пример 2.
Трансфекция, клональная селекция и экспрессия СЬР-1 в клетках млекопитающих.
Источник клеток: НЕК293 (линия клеток почки человеческого эмбриона, № АСС 305, Ό8ΜΖ коллекция клеточных культур, Германия), А!Т20 (линия клеток мышиного рака гипофиза ЬАГ1, № 87021902, Европейская коллекция клеточных культур, Великобритания), клетки линии ИТЕКТ-М8С, полученные от проф. Каккет, Университетский госпиталь Оденсе (Ишуегкйу Нокрйа1 оГ 0бепке), Дания.
Для трансфекции 106 клеток использовали 0,5-2 мкг плазмидной ДНК с различными конструкциями СЬР-1. Конструкции создавали с помощью пути, описанного в примере 1. НЕК293-клетки трансфектировали стандартным методом совместного осаждения фосфатом кальция, который описан в Сиггеи! РгоЮсо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1 и др., 1994ГГ, Нагуагб Мебюа1 8сйоо1, т.2., часть 9.1). А!Т20-клетки трансфектировали с использованием технологии ЕиСепе (фирма Косйе) согласно методу, описанному в Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1 и др., 1994ГГ, Нагуагб Мебюа1 8сйоо1, т. 2, часть 9.4). Трансфекцию ЬТЕКТ-М8С-клеток осуществляли с помощью технологии М.1с1еоГес1ог (фирма Атаха), представляющей собой метод, не связанный с применением вирусов, который основан на сочетании электрических параметров и специфических для типа клеток растворов. С помощью устройства типа М.1с1еоГесЮг (программа С17) и М.1с1еоГесЮг-раствора УРЕ-1001 достигали эффективности трансфекции >60%. Через 48 ч после трансфекции осуществляли отбор клеточных клонов со стабильной интегрированной в хромосому ДНК, добавляя в культуральную среду агент для селекции бластицидин (2 мкг/мл). Через 12-15 дней стабильно трансфектированные клеточные клоны можно было выделять и размножать для изучения их характеристик.
Кратковременную экспрессию различных конструкций СЬР-1 оценивали в клетках линии 11ТЕКТ
- 17 013796
М8С и НЕК293. В то время как только незначительный уровень активного ОЬР-1 был обнаружен в мономерных конструкциях ОЬР-1 № 103 и № 317 (которые несли только одну копию ОЬР-1(7-37)), выраженное увеличение уровня экспрессии обнаружено в димерной конструкции ОЬР-1 № 217 (которая содержала ОЬР-1(7-37) в качестве компонента (I) и в качестве компонента (III)) как в ЙТЕКТ-М8С-, так и в НЕК293-клетках. Полученные результаты обобщены на фиг. 2. Удлинение конструкции ОЬР-1 № 159 (содержащей четыре копии Ш2 в качестве компонента (II)) не приводило к дополнительному заметному повышению (данные не показаны). После трансфекции клеток линии ЙТЕКТ-М8С различными конструкциями отбирали клоны, которые стабильно экспрессировали ОЬР-1. Уровни экспрессии представлены в табл. I.
Таблица I
Конструкция Клеточный клон Уровень активного СЬР/106 клеток/ч (пмоль)
№ 103-6ЬР(7.з7) 49ТМ113/13 0,4
№317-ΟΕΡ(7.37)ΪΡ2-1ί ак 71ТМ169/1 0,3
№ 217-ОЬР(7-з7)1Р2-СЬР{7-37) 79ТМ217/13 2,7
Пример 3.
Анализ методом Вестерн-блоттинга пептидов ОЬР-1, секретируемых из клеток млекопитающих.
Супернатанты клеточных культур секретирующих ОЬР-1 клеток разделяли с помощью электрофореза на ПААГ с использованием 10-20%-градиента ДСН (120 В, 90 мин) и переносили на мембрану из ПВДФ (поливинилендифторид) (мембрана [шшоЬПоп-Р. 0,45 мкм, МИИроге ШАН 00010) путем полусухого блоттинга (2,0 мА/см2, 60 мин). После фиксации метанолом и блокирования (3% мас./об. БСА, 0,1 об.% Твин-20 в ТВ8) осуществляли иммуноблоттинг мембраны с использованием 1 мкг/мл антитела к ОЬР-1 (ΗΥΒ 147-12, фирма АпйЬобукйор) при 4°С в течение ночи (о/п). После отмывки и инкубации с использованием 0,02 мкг/мл идентифицирующего антитела (антитело к мышиному ЦО, конъюгированное с НКР (переоксидаза из хрена), фирма Регкш Е1тег, РС 2855-1197) при комнатной температуре (КТ) в течение 4 ч, использовали хемилюминесцентное обнаружение для локализации белка.
Данные анализа методом Вестерн-блоттинга представлены на фиг. 3 (1: 100 нг синтетического ОЬР1(7-37), растворенного в супернатанте подвергнутых мнимой трансфекции клеток линии ЙТЕКТ-М8С, 2: супернатант клеток линии ЙТЕКТ-М8С (клон 79ТМ217/13), секретирующих димерный ОЬР-1 из конструкции № 217, 3: супернатант клеток линии А1Т20 (клон 81-А-217/3), секретирующих димерный ОЬР-1 из конструкции № 217; М: предварительно окрашенный белковый маркер [кДа]). Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемые в изобретении пептиды, которые содержат ОЬР-1(7-3 7) и С-концевой дополнительный фрагмент (2 и 3 на фиг. 3) секретируются из трансфектированных линий клеток и их можно выявлять с помощью антитела к ОЬР-1, которое связывается с расположенными внутри молекулы эпитопами ОЬР-1(7-37).
Пример 4.
Стабильность ш νίΙΐΌ в плазме пептидов ОЬР-1, секретируемых из человеческих клеток.
Клетки линии НЕК293 и ЙТЕКТ-М8С подвергали кратковременной трансфекции конструкциями, кодирующими гетерологичную сигнальную последовательность стромелизина, которую функционально связывали с вариантами ОЬР-1, кодирующими следующие пептиды:
1: ОЬР-1(7-37)
2: ОЬР-1 (7-3 7)-1Р2-удлиненный на 11 ак
3: ОЬР1(7-37)-1Р2-ОЬР1(7-37).
Супернатанты клеточных культур, содержащие пептиды ОЬР-1, секретируемые из клеток, или синтетический ОЬР-1(7-37) (фирма ВасЙет), инкубировали с человеческой обогащенной лимфоцитами плазмой, обладающей дипептидилпептидной активностью, при 37°С и 5% СО2 в течение 3 или 4 ч. Синтетический ОЬР-1(7-37) в супернатанте подвергнутых мнимой трансфекции клеток использовали в качестве позитивного контроля ЭРГА У-активности, которая, как установлено, ингибировалась добавлением ингибитора ЭРР-1У 1пЙ1Ы1ог (№ ЭРР4, фирма Вю1гепб). Содержание активного ОЬР оценивали с помощью ЕЫ8А для ОЬР-1 (активного) (№ ЕОЬР-35К, фирма Вю1гепб), используя антитело, которое связывается с Ν-концевым эпитопом ОЬР-1(7-37), идентифицирующим расщепленный ЭРР-РУ неактивный пептид ОЬР-1(9-37).
Полученные результаты представлены на фиг. 4 (НЕК293-клетки) и 5 (ЙТЕКТ-М8С-клетки). Обе линии клеток НЕК293 и ЙТЕКТ-М8С представляли собой эффективных хозяев для генных конструкций. Нумерация вариантов 1-3 при изложении результатов, полученных для трасфектированных клеток, такая же, как и в примере 3 (1: 100 нг синтетического ОЬР-1(7-37), растворенного в супернатанте подвергнутых мнимой трансфекции клеток линии ЙТЕКТ-М8С, 2: супернатант клеток линии ЙТЕКТ-М8С (клон 79ТМ217/13), секретирующих димерный ОЬР-1 из конструкции № 217, 3: супернатант клеток линии А1Т20 (клон 81-А-217/3), секретирующих димерный ОЬР-1 из конструкции № 217). В то время как кон
- 18 013796 струкция 1, которая продуцировала ОЬР-1 дикого типа, инактивировалась ИРРйУ аналогично синтетическому ОЬР-1, предлагаемые в изобретении удлиненные на С-конце формы ОЬР-1 (2 и 3 на фиг. 4, 3 на фиг. 5) оказались более устойчивыми к расщеплению и сохраняли по меньшей мере 40% активности. Удлиненные на С-конце пептиды ОЬР-1 обладали в значительной степени повышенной стабильностью в человеческой плазме ίη νίίτο. Пептид ОЬР-1 с димерной последовательностью (3) оказался практически полностью стабильным в присутствии ЬРРйУ, не подвергаясь расщеплению ίη νίίτο.
Пример 5.
Анализ пептидов ОЬР-1 методом Вестерн блоттинга.
Различные пептиды ОЬР-1 получали с помощью твердофазного синтеза (8уп) или методом рекомбинации в Е.сой (гес). Пептиды ОЬР-1 (31 нг 8ЕЦ ГО Ν0:1 и 10 нг каждой из 8ЕЦ ГО Ν0:6, 8ЕЦ ГО Ν0:7, 8ЕЦ ГО Ν0:8) разделяли с помощью электрофореза на ПААГ с использованием 10-20%-градиента ДСН (120 В, 90 мин) и переносили на мембрану из ПВДФ (мембрана IттοЬ^1οη-Р, 0,45 мкм, Мййроге ГОУН 00010) путем полусухого блоттинга (2,0 мА/см2, 60 мин). После фиксации метанолом и блокирования (3% мас./об. БСА, 0,1 об.% Твин-20 в ТВ8) осуществляли иммуноблоттинг мембраны с использованием 1 мкг/мл антитела к ОЬР-1 (ΗΥΒ 147-12, фирма ЛпиЬойуйюр) при 4°С в течение ночи (о/п). После отмывки и инкубации с использованием 0,02 мкг/мл идентифицирующего антитела (антитело к мышиному ^О, конъюгированное с НИР, фирма Регкт Е1тег, РС 2855-1197) при КТ в течение 4 ч, использовали хемилюминесцентное обнаружение для локализации белка. На фиг. 6 показаны результаты, полученные методом Вестерн-блоттинга, для указанных пептидов. Использовали следующие обозначения: 8ЕЦ ГО Ν0:1 (ГОИуп) соответствует
ОЬР-1(7-37), 31 ак, 3,3 кДа; ЗЕО Ю N0:8 (Ю8 вуп, СМ3) соответствует 0ЬР-1(737)-1Р2,46 ак, 5,1 кДа; 8Е0 ГО N0:7 (ГО7гес, СМ2) соответствует СЬР-1(7-37)1Р2-КК.-ОЬР2, 83 ак, 9,4 кДа; ЗЕЦ ГО N0:6 (ГОбвуп, СМ1) соответствует ОЬР1(7-37)-1Р2-К.К.-ОЬР1(7-37), 79 ак, 8,7 кДа.
Пример 6.
Стабильность ίη νίίτο в человеческой плазме пептидов ОЬР-1СМ.
Синтетические пептиды ОЬР-1 (8ЕЦ ГО N0:^,уιι. 8ЕЦ ГО Ν0:6^, 8ЕЦ ГО Ν0:7Γ(Χ, 8ЕЦ ГО Ν0:84.η) инкубировали в концентрации 20 нг/мл с человеческой плазмой при 37°С и 5% СО2 в течение 3 ч. Дипептидилпептидазную активность плазмы ингибировали с помощью ингибитора ИРРйУ (№ ИРР4, фирма Вю1гепй). Содержание активного ОЬР оценивали с помощью ЕЫ8А для ОЬР-1 (активного) (№ ЕОЬР35К, фирма ΒίοΙίΌπά).
В отличие от нативного ОЬР-1(7-37) (8ЕЦ ГО Ν0:1) предлагаемые в изобретении удлиненные на Сконце пептиды ОЬР-1, последовательность которых представлена в 8ЕЦ ГО Ν0:6, 8ЕЦ ГО Ν0:7 и 8ЕЦ ГО Ν0:8, обладали в значительной степени повышенной стабильностью в человеческой плазме ίη νίίτο (фиг. 7). В качестве контроля (справа) представлены результаты, полученные в экспериментах с добавлением ИРРйУ. В этих контрольных экспериментах активность ОЬР-1 полностью сохранялась.
Пример 7.
Биологические исследования ίη νίίτο.
Производство циклического АМФ.
Клетки линии ΚΙΝ-5Ε (опухолевые крысиные островковые клетки; ЕСАСС Νο. 95090402) выращивали в 24-луночных планшетах в течение 4 дней до достижения 70% конфлюэнтности. Клетки промывали дважды средой ИМЕМ (Е15-009, фирма РАА) перед добавлением 0,5 мл среды ИМЕМ (Е15-009, фирма РАА), дополненной 1% Н8А (человеческий сывороточный альбумин (фирма АуеШЬ)), 0,2мМ ГОМХ (858455, фирма 81дта) и тестируемых пептидов. После инкубации в течение 20 мин при 25°С клетки дважды промывали охлажденным на льду ЗФР. Клеточный цАМФ экстрагировали, добавляя 0,1н. НС1, содержащую 0,5% Тритон Х-100. Циклический АМФ оценивали количественно с помощью набора для иммуноферментного анализа (ИФА) цАМФ (низкое значение рН) (каталожный номер ИЕ0355, фирма Κ&Ό). Для стимуляции использовали 3х10-8М 8ЕЦ ГО Ν0:1, 8ЕЦ ГО Ν0:6^, 8ЕЦ ГО Ν0:6Γ(!(;, 8ЕЦ ГО Ν0:7Γ(Χ, 8ЕС ГО \0:8. .„.
Полученные результаты представлены на фиг. 8. 100% производство цАМФ соответствует основному уровню производства в отсутствии ОЬР-1. ОЬР-1 связывается со сшитыми с белком О рецепторами и стимулирует производство цАМФ. Все изученные молекулы повышали производство клеточного цАМФ.
Пример 8.
Биологический анализ ίη νίνο.
Страдающих диабетом типа II 11-недельных мышей (С57ВЬ/К8-Ьерт<1Ь/<1Ь, фирма Наг1аи) обрабатывали 5 мкг пептида путем подкожной инъекции дважды в день в 9 ч утра и 5 ч вечера (η=5 особей на группу). Оценивали уровень глюкозы в крови до (день 0) и после обработки пептидами ОЬРСМ (день 2, 4, 7, 10) в 10 утра после голодания в течение ночи. Данные представлены относительно уровней глюкозы в крови, которые были определены в день 0.
- 19 013796
Все предлагаемые в изобретении пептиды (8Е0 ГО N0:6 (синтетическая или рекомбинантная) и 8Е0 ГО N0:7 (синтетическая или рекомбинантная)) обладали антигипергликемическим действием. Самые хорошие результаты получали при использовании рекомбинантной последовательности 8Е0 ГО N0:6 (СМ1) и синтетической последовательности 8Е0 ГО N0:8 (СМ3). На фиг. 9 (у-ось) показано относительное воздействие обработки. Уровень глюкозы в крови в день 0 принимали за 1. У необработанных животных обнаружено постоянное увеличение уровня глюкозы в крови с течением времени, а у животных, обработанных предлагаемыми в изобретении пептидами, в целом (дгокко тобо) выявлено постоянное снижение уровней глюкозы в крови с течением времени.
Пример 9.
Оценка стабильности в плазме ίη убго пептидов СЬР1 (метод изучения кинетики).
Инкубировали с 10% человеческой плазмы в буфере для инкубации (50мМ триэтаноламин-НС1 (рН 7,8), 0,2% Н8Л) аликвоты по 1мкМ следующих пептидов: СМ3, замещенные аланином аналоги СМ3 (СМ3-ΑNΑ01, СΜ3-ΑNΑ02, СΜ3-ΑNΑ03, СΜ3-ΑNΑ04), укороченные на С-конце аналоги СМ3 (СМ3ΑNΑ06, СΜ3-ΑNΑ07) или удлиненные на С-конце аналоги СМ3 (СΜ3-ΑNΑ09), при 37°С и 5% СО2 в течение 0, 3, 6 и 9 ч. Дипептидилпептидазную активность ингибировали, добавляя ингибитор ЬРРВ (№ ЭРР. фирма Вю1гспб) и уровень активного СЬР-1 определяли с помощью ЕЫ8Л для СЬР-1 (активного) (№ ЕСЬР-35К, фирма Ьшсо). Результаты получали в трех повторностях по меньшей мере в двух независимых экспериментах.
Предлагаемые в изобретении пептиды, включающие по меньшей мере девять аминокислот, добавленных к С-концу СЬР-1, представляют собой СМ3 (мышиный, СЬР-1(7-37)-ГР2) и их производные с модифицированными последовательностями, входящими в компонент (II) (ГР2), т.е. СМ3-ΑNΑ01, СМ3ЛХЛ01, СМ3-А^02, СМ3-А^03, СМ3-А^04, СМ3-А^05, СМ3-А^07, СМ3-ЛХЛ07. Пептиды СЬР-1 и СМ3-АNА06 использовали в качестве контрольных или референс-субстанций.
На фиг. 10 представлены данные об уровне активности СЬР-1 в виде % от уровня, полученного в момент начала эксперимента (0 ч) (0 ч=100%). Ясно видно, что СЬР-1 обладал очень низкой стабильностью в плазме, через 9 ч после обработки в плазме сохранялось только 9% активности. Для СМ3-АNА01 обнаружена наиболее высокая стабильность, при этом 84% продукта сохранялось через 9 ч. Активность предлагаемых в изобретении пептидов сохранялась на уровне по меньшей мере 30% через 9 ч, в то время как для пептидов с более короткими удлинениями этот показатель не достигался. Исходя из данных о кинетике изучаемой субстанции, можно определять время, необходимое для расщепления до 80% активного СЬР-1 относительно значения, полученного в 0 ч (ΌΤ80: время расщепления 80%).
Перечень последовательностей, перечисленных в порядке увеличения значений ΌΤ80
Предлагаемые в изобретении субстанции обладают существенно более продолжительной стабильностью ίη убго в плазме по сравнению с референс-субстанциями. Не вдаваясь в какую-либо теорию, можно предположить, что удлинение С-конца СЬР-1 вносит стерические помехи, препятствующие проникновению активного сайта ЭРР-ГУ в указанные аналоги, что и позволяет им избегать расщепления, в то время как у более коротких референс-субстанций не обнаружено это защитное действие, обусловливающее стабильность СЬР-1. Эта гипотеза подтверждается постоянно возрастающей стабильностью по мере увеличения длины С-концевых удлинений пептидов СМ3-АNА06 (36 ак), СМ3-АNА07 (40 ак) и СМ3 (46 ак). Однако это явление зависит не только от количества аминокислот, что показано при заменах на аланин в IР2-области СМ3. Пептид СМ3-АNА03, имеющий такое же количество аминокислот, что и СМ3, обладал существенно более низкой стабильностью, чем СМ3. С другой стороны, СМ3-АNА01, который также состоит из 46 аминокислот, обладал более высокой стабильностью в плазме, чем СМ3. Эти данные могут свидетельствовать о том, что помимо количества аминокислот, на стабильность могут влиять стерические эффекты. Наиболее предпочтительными являются пептиды, которые несут удлинение, содержащее ГО2, на С-конце СЬР-1 или удлинение, обладающее определенной степенью гомологи с !Р2, что может являться результатом специфической конформации, препятствующей проникновению в
- 20 013796
Ν-концевую область активного сайта ЭРР-ГУ.
Пример 10.
Исследование ίη νίνο - иммуногенность.
Для решения вопроса о наличии потенциальной иммуногенности изученной субстанции СМ1 осуществляли опыты на мышах на фирме РагаЬ1О5С1епсе (Гронинген, Германия). Исследование осуществляли на мышах линии ВАЬВ/с, которым вводили 5 повторных инъекций (70 мкг пептида/дозу, ί.ν.) в течение 22 дней (п=5).
Установлено, что СМ18уп не обладал токсичностью и индуцировал лишь минимальный Т-клеточный гуморальный иммунный ответ и титр антител, что показано на приведенном ниже чертеже. Нельзя исключать иммунологическое действие побочных продуктов (чистота пептида составляла лишь 95%). На фиг. 11 представлены результаты исследований по оценке потенциальных иммуногенных эффектов пептида СМ1§уп. На левой стороне (фиг. 11 А) показаны результаты оценки Т-клеточного вторичного иммунного ответа. Эксплантировали селезенку обработанных и контрольных мышей, выделяли Т-клетки и стимулировали возрастающими количествами антигена. Оценивали пролиферативный вторичный иммунный ответ. На правой стороне (фиг. 11Б) представлены результаты определения титра антигенспецифического антитела подтипа ЦС в иммунной сыворотке животных.
Пример 11.
Оценка зависимости эффективности от дозы на больных диабетом мышах.
После голодания в течение 2 ч болеющих диабетом мышей линии С57ВЬ/К51@К)-бЬ (бЬ/бЬ) обрабатывали СЬР-1, СМ1, СМ3, СМ3-АNА01 и эксендином-4 в пяти различных концентрациях. Шестую группу обрабатывали только физиологическим раствором. Обрабатывали по 7 животных на группу.
Уровень глюкозы в крови определяли после взятия крови из хвостовой вены непосредственно до инъекции, через 1 и 4 ч после инъекции.
Результаты в виде кривых зависимости ответа от дозы представлены на фиг. 12 (фиг. 12А (СЬР-1), фиг. 12Б (СМ1), фиг. 12В (СМ3) и фиг. 12Г (СМ3-АNА01)). Для каждой изучаемой субстанции строили график, характеризующий изменение в процентах уровня глюкозы в крови относительно исходного значения при использовании различных концентраций. Определяли значение ЕЭ50 для различных изученных субстанций из кривых зависимости ответа от дозы, при этом оценивали значения через 1 ч в виде снижения уровня глюкозы в процентах по сравнению с исходным уровнем. Для определения значения ЕЭ50 для СЬР-1, СМ3-АNА01, СМ3гес и эксендина 4 применяли модель Моргана-Меркера-Флодина (Могдап-Мегсег-Иобт) (ММЕ), для СМ1 применяли модель Ричардса (КгсЬагбк). Обе модели представляют собой модели на основе аппроксимации сигмовидной зависимостью, которые можно применять для оценки зависимости ответа от дозы. Для каждого пептида определяли значения ЕЭ50 для уровня глюкозы в плазме (однократная 5.с.-доза в мкг/мышь), исходя из процента снижения уровня глюкозы в крови. Эти данные обобщены в табл. 1.
Таблица 1
Пептид ЕО30 [мкг/мышь]
СЕР-1(7-37) 12,76
СМ1 0,61
СМ3 0,25
СМЗ-ΑΝΑΟΙ 0,55
Эксендин-4 0,03
Исходя из значений ЕЭ50, можно считать, что аналоги СЬР-1 СМ1, СМ3 и СМ3-АNА01 обладают более чем в 20 раз более высокой биологической активностью ш νίνο, что наиболее вероятно является результатом повышенной стабильности в плазме.
Все изученные пептиды приводили к значительному снижению уровней глюкозы в крови у больных гипергликемией мышей линии бЬ/бЬ, по меньшей мере, в наиболее высоких концентрациях. Данные о снижении уровней глюкозы в плазме после однократной 5.с.-инъекции 1,1-3,0 нмоль пептида (относительно контроля) обобщены в табл. 2. В табл. 2 представлены данные о понижающем уровень глюкозы действии тестируемых субстанций (относительно контроля). Данные о снижении уровня глюкозы в плазме и соответствующих уровнях значимости представлены для периода времени, составляющего 1 ч (@1ч) и 4 ч (@4ч) после инъекции пептида. Обнаружены различия в длительной эффективности пептидов. Только эксендин-4 и СМ3 обладали способностью значительно снижать уровни глюкозы в крови через 4 ч.
- 21 013796
Таблица 2
Пептид Концентрация Снижение уровня глюкозы в плазме Значение р (независимый 1критерий)
ОЬР-1 (7.37) 3,0 нмоля 15% ±24%® 1ч не значимо
3,0 нмоля 0%@4ч не значимо
СМ1 1,1 нмоля 50% ± 14%®1ч Р <0,0001
1,1 нмоля 0%®4ч не значимо
СМ3 2,0 нмоля 46% ± 6%®1ч Р < 0,01
2,0 нмоля 21% ± 10%®4ч Р < 0,05
СМЗ-ΑΝΑΟΙ 2,0 нмоля 62%.+ 12%®1ч Р< 0,001
2,0 нмоля 18% ± 11%®4ч не значимо
эксендин-4 2,4 нмоля 32% ± 14%@1ч Р < 0,01
2,4нмоля 29% ± 9%@4ч Р < 0,01
Пример 12.
Продолжительное лечение мышей линии ЙЬ/ЙЬ.
Исследовали 4 группы, η=12, мышей линии С57ВЬ/К51@.К)-йЬ (ЙЬ/ЙЬ): группа А - обработка наполнителем (0,9% физиологический раствор), один раз в день, группа Б - обработка 24 нмоль/кг тестируемого соединения 1: т.е. СМ1гес, один раз в день, группа В - обработка 24 нмоль/кг тестируемого соединения 2: т.е. СМ3-ΑNΑ01, один раз в день, группа Г - обработка 24 нмоль/кг референс-субстанции эксендин-4 (известное и разрешенное к применению в данной области соединение (однако эксендин-4 не является аналогом СЬР-1)), один раз в день.
Пептиды или наполнитель вводили один раз в день (группы А-Г) в период времени между 2-3 ч дня подкожно в кожную складку спины. Продолжительность обработки составляла 18 недель. В период времени с 12 по 18 неделю 6 из 12 животных в группе обрабатывали дважды в день.
У мышей исследовали различные параметры, т.е. такие как состояние здоровья (1), вес тела (2), потребление корма (3), уровень глюкозы в крови (4), проба на переносимость глюкозы (5), данные об уровне инсулина (6), уровень гликозилированного гемоглобина (7), патология (8) и рестимуляция Т-клеток (9).
Состояние здоровья (1) оказалось хорошим во всех группах, никаких побочных действий лечения не обнаружено.
Вес тела (2) был более низким во всех обработанных группах после лечения в течение 18 недель (фиг. 13). Относительное прибавление веса тела оказалось существенно пониженным в группе, обработанной СМ3-ΑNΑ01. На фиг. 13А показано воздействие обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) на вес тела мышей линии ЙЬ/ЙЬ. Представлены средние значения для 12 животных в группе. На фиг. 13Б показано воздействие обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) на вес тела мышей линии ЙЬ/ЙЬ. Представлены данные об относительном прибавлении веса 12 мышей в группе после обработки в течение 122 дней. Только обработка тестируемой субстанций СМ3-ΑNΑ01 (группа Б) привела к существенному снижению прибавления веса (р<0,001).
Потребление корма (3) оказалось существенно пониженным в группе, обработанной СМ1 и СМ3ΑΝΑ01, по сравнению с контролем. На фиг. 14 показано воздействие обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) на еженедельное потребление корма мышами линии ЙЬ/ЙЬ в течение 122-дневного периода обработки. Относительное потребление корма одной мышью оказалось существенно пониженным в группе Б и В (р<0,001).
Уровни глюкозы в крови (4) определяли в различных опытах. Данные об уровне глюкозы в крови не натощак (через 1 ч после инъекции пептида) представлены на фиг. 15 А, т.е. воздействие обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) на уровни глюкозы в крови не натощак. Для определения уровня глюкозы брали кровь из хвостовой вены через 1 ч после к.с.инъекции физиологического раствора (А) или пептидов СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендина (Г) в концентрации 24 нмоль/кг. По сравнению с контролем уровень глюкозы в крови не натощак через 1 ч после к.с.-инъекции пептида снижался на 55% в группе Б, 51% в группе В и 60% в группе Г (фиг. 15Б). Снижение уровней глюкозы в крови в обработанных группах оказалось достоверным с высоким уровнем значимости (р<0,0001).
Данные об уровне глюкозы в крови натощак (через 8 ч после инъекции пептида) представлены на фиг. 15В, т.е. воздействие обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) на уровни глюкозы в крови натощак. Для определения уровня глюкозы брали кровь из хвостовой вены после 12-часового периода голодания в течение ночи через 18 ч после к.с.-инъекции тестируемых субстанций. Уровни глюкозы в крови натощак снижались в СМ1- и СМ3-ΑNΑ01-группах.
Ьр.-пробу на переносимость глюкозы (5) (ГРСТТ) осуществляли через 8 недель после обработки мышей в группах А-Г. Исходный (основной) уровень глюкозы в крови (0 мин) у голодавших в течение
- 22 013796 ч животных определяли путем взятия крови из хвостовой вены после к.с.-инъекции тестируемой субстанции и 1.р.-инъекции 20%-ного раствора глюкозы (1 г глюкозы на кг). Уровень глюкозы в крови определяли также через 15, 30, 45, 60, 90 и 120 мин после инъекции глюкозы. Во всех обработанных группах обнаружена существенная нормализации переносимости глюкозы (фиг. 16А). На фиг. 16А представлены данные об абсолютных уровнях глюкозы в крови во время проведения ί.ρ.-пробы на переносимость глюкозы (4РСТТ) через 8 недель после обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СΜ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г) (средние значения для каждой группы (п=12)).
Другое представление данных, приведенных на фиг. 16А, касающихся пробы на переносимость глюкозы, дано на фиг. 16Б. На фиг. 16Б представлены относительные уровни глюкозы в крови при осуществлении ί.ρ.-пробы на толерантность к глюкозе ДРОТТ) через 8 недель после обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СΜ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г), стандартизованные относительно исходного уровня глюкозы в крови (100%).
Уровни инсулина (6) определяли у мышей после их 12-часового периода голодания в течение ночи. После обработки в течение 18 недель в организме всех мышей в опытных группах продуцировалось существенно больше инсулина, чем в необработанной контрольной группе. На фиг. 17 представлены данные об уровнях инсулина в сыворотке мышей после 18-недельной обработки 0,9%-ным физиологическим раствором (группа А), пептидом СМ1 (группа Б), пептидом СΜ3-ΑNΑ01 (группа В) или эксендином-4 (группа Г). Непосредственно после взятия образов крови их обрабатывали смесью протеазных ингибиторов для того, чтобы избежать расщепления инсулина. Анализировали уровень инсулина в сыворотке с помощью набора ^иБп Мойке ИНгакепзШуе ЕЫ8А (каталожный номер Е^-3440, фирма ЭЯС). Достоверность различий определяли с помощью ΐ-критерия Стьюднта.
Гликозилированный гемоглобин (7) образуется в результате избытка в плазме глюкозы, связывающейся с гемоглобином в эритроцитах (ЯВС). Поскольку продолжительность жизни ЯВС составляет 120 дней, оценка гликозилированного гемоглобина является показателем долговременного контроля глюкозы и рассматривается как более надежный показатель, чем уровень глюкозы в крови. Получали образцы цельной крови из заглазничного синуса и анализировали с помощью набора ЕпхутаНс НЬА1с Те5ΐ Κίΐ (№ ΌΖ121 А, фирма О|ахуте) для определения уровней гликозилированного гемоглобина. Рассматривая в качестве параметра уровень гликозилированного гемоглобина, обнаружено существенное снижение его повышения во всех обработанных группах.
На фиг. 18А показано относительное повышение уровня гликозилированного гемоглобина (СНЬ) в образцах цельной крови через 6, 12 и 18 недель после обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г). На фиг. 18Б показано относительное повышение уровня гликозилированного гемоглобина (СНЬ) в образцах цельной крови через 18 недель после обработки физиологическим раствором (А), СМ1 (Б), СМ3-ΑNΑ01 (В) или эксендином (Г). Результаты представлены в виде среднего значений для всех животной в каждой группе (п=12). Повышение уровня гликозилированного гемоглобина во всех обработанных группах оказалось существенно ниже, чем в контроле.
Оценивали патологию (8) мышей. По данным аутопсии не обнаружено различий в органах в группах обработанных и необработанных животных (группа А) за исключением объема поджелудочных желез. Определяли массу поджелудочных желез и установлено ее существенное увеличение во всех обработанных группах. На фиг. 19 представлены данные о массе поджелудочных желез в день умерщвления животных после 18-недельной обработки 0,9%-ным физиологическим раствором (группа А, п=11), пептидом СМ1 (группа Б, п=12), пептидом СМ3-ΑNΑ01 (группа В, п=12) или эксендином-4 (группа Г, п=12).
Для оценки потенциальных иммунологических действий тестируемых субстанций оценивали тип IV иммуногенности (9) с помощью вторичной стимуляции Т-клеток. Для этой цели вырезали селезенку у 8 животных в каждой группе, выделяли Т-клетки и повторно стимулировали различными концентрациями соответствующей тестируемой субстанции. По сравнению с необработанными контрольными животными не обнаружено существенного повышения пролиферации повторно стимулированных пептидом Тклеток. На фиг. 20 показаны полученные ш νίΐτο данные о вторичном иммунном ответе клеток селезенки на обработку различными концентрациями тестируемых субстанций СМ1 (фиг. 20А) и СМ3-ΑNΑ01 (фиг. 20Б) и референс-субстанции эксендина-4 (фиг. 20В). С помощью нерадиоактивного метода анализа клеточной пролиферации (Се11 РгоПГегаЕоп ЕЫ8А, ВгбИ (5-бромдезоксиуридин), хемилюминесцентный анализ) оценивали ш νίΐτο вторичный иммунный ответ клеток селезенки мышей из групп А-Г на обработку 3-кратными разбавлениями тестируемых субстанций СМ1 и СМ3-ΑNΑ01 и референс-субстанции эксендина-4, начиная с концентрации 50 мкг/мл, в трех повторностях для каждой мыши. Индекс стимуляции (8Σ) рассчитывали как отношение уровня ответа в присутствии соответствующего пептида к уровню ответа в отсутствии пептидов. Представлены средние значения ± среднеквадратические отклонения, полученные для соответствующей обработанной группы и контрольной группы (группа А: п=3, группа Б: п=6, группа В: п=7, группа Г: п=6). При расчете средних значений анализировали только мышей, у которых величина 8I превышала более чем в 6,5 величину, полученную в позитивных контрольных культурах, обработанных 5 мкг/мл Соп А (конканавалин А).
Продолжительное исследование с использованием больных диабетом мышей дополнительно подтвердило эффективность предлагаемых в изобретении удлиненных на С-конце пептидов. При оценке
- 23 013796 всех изученных параметров (вес тела, потребление корма, уровень глюкозы в крови, уровень гликозилированного гемоглобина, переносимость глюкозы, секреция инсулина, масса поджелудочных желез) для удлиненных на С-конце пептидов выявлено заметное терапевтического действие. С учетом гомологии удлиненных на С-конце Се11Ме6-пептидов с эндогенной последовательностью, установлено, что указанные предлагаемые в изобретении пептиды обладают преимуществом с позиций иммуногенности по сравнению с имеющим происхождения из организмов, не относящихся к млекопитающим, эксендином-4. Данные, полученные в опыте по оценке иммуногенности на мышах, подтверждают отсутствие клинически значимой иммуногенности пептида СМ1.
Перечень последовательностей
ΗΆΕΟΤΓΤΞϋν ЗЗУЬЕСОААК ΕΡΙΑΗΟνΚΘΕ О
Зедиепсе ГО N0:1
НКОРРЕЕУА! УЕЕЬб
Зедиепсе ГО N0:2
ΚΚϋΓΡΕΕνΑΙ АЕЕЬС
Зедиепсе ГО N0:3
НАОСЗРЗОЕМ ΝΤΙΕΟΝΣΑΑΚ ΏΡΙΝΝΕΙΟΤΚ ΙΤϋΚΚ
Зедиепсе ГО N0:4
НАОСЗЕЗБЕМ ЗТ1ЬОИЬАТЕ НПЫИЫОТК ΙΤΏΚΚ
Зедиепсе ГО N0:5
НАЕОТЕТЗОУ ЗЗУЬЕООААК ЕЕТАНЬУКвЕ (ЗКР.ОРРЕЕУА 1АЕЕБ6КЕНА
ΕΟΤΡΤ3ϋν33 ΥΕΕΟΟΑΑΚΕΡ 1АИЬУКСЕС
Зедиепсе 10 N0:6
НАЕОТРТЗОУ ЗЗУЬЕООААК ЕГ1АИЬ'7КСЕ ОЕР-ОРРЕЕЛ/А 1АЕЕЬСЕЕНА
ОСЗРЗОЕМ8Т ШЭНЬАТР.ОЕ ΙΝΝΣΙβΤΚΙΤ ϋΚΚ
Зедиепсе 10 N0:7
НАЕОТРТЗОУ ЗЗУЬЕООААК ЕР1АИЬУКОЕ СР.КОГРЕЕ'/А 1АЕЕЫЭ
Зедиепсе ГО N0:8 марааньеза ААЕАЬЬРРМЬ ЬЬЬЫЭРРРЬЬ акаьрроунн ьнаеееорор
ИНААЬРЗЗРА РАРАТОЕАРЕ РАЗЗЬКРРЕС СУРОРЗООЬЗ ΑΕΝΗΟΚΚ
Зедиепсе ΙΟ N0:9
НАЕОТРТЗОУ ЗЗУЬЕООААК ЕР1АИЬУКСЕ СР.НОЕРЕЕ’ТА 1УЕЕЬСЕННА
ЕОТРТЗОУЗЗ УЪЕООААКЕР ГАКЬУКСЕО
Зедиепсе ГО N0:10
ΗΑΕ0ΤΡΤ3ϋν ЗЗУЬЕСОААК ЕПАИЬУКСЕ ОЕНОРРЕЕУА 1УЕЕЬСНР.НА
Ο63Ρ30ΕΜΝΤ 1ЬОИЬААКОР ГОНЫОТКТТ ΏΕΚ
Зедиепсе ГО N0:11
ΗΑΕ0ΤΡΤ3ϋν ЗЗУЬЕООААК ЕПАНЬУКбЕ ΟΚΕϋΡΡΕΕνΑ 1ЧЕЕЬ<3 зедиепсе ГО N0:12
1 дакаЪссасс аЪддсссссд ссдсс1:ддсС даддадсдсс дссдссаддд
М А Р А АНЬ К £ А А А К А
51 сссЬдсСдсс асссаСдсСд седсСдсСдс Ъдсадссссс ассСсСдсЬд
Ь Ь Р Р м Ь Ь Ь Ь 0 ₽ Р Р Ь ь
- 24 013796
101 дсссдддссс ЬдсссссддС дадСдсссдс сасСсдссдС ссдсЬссСсд
А Е Ά Ь Р Р
151 сЬдадддддс дссдддсасд сдддсСдддс ссадсддсдС аЬссддасдс 201 саадааасса дададссадс садаЬдссаа адддсссСдс саСдСдссдд 251 СдсссСССсс с С с ί: сса ϋ С С дсссЬдссас асадСдддсС ддддсЬдсас 3 01 дЬдЬдСССдс Едасаддсса саЕсЕсЕаас ЕдСдддссаЕ дЕддассЕЕа 351 ддссЕдасса дасссСсаСд ЕсЕЕссЕссС Есссаддасд ЬдсассассЬ РУ Η Н Ь
401 дсасдссдад аддсдсддсс сСсадсссЬд дсасдссдсс сьдссаадса Η А Е ЯРЗР ОРИ И А А Ь Р 3 8
451 дсссЬдсссс Ьдссссадсс асссаддадд сссссаддсс Едссадсадс РАР АРА Т о Е А РРР А 8 8
501 сЬдаддссас ссаддкдсдд едЬдссЕдаЕ сссЬссдаЬд дссЕдадсдс
Ь Е Р Р Е С О V Р Б Р 5 Ό в Ь 8 А
551 ЬсддааЪсдд садаададдс асдссдаддд сассСЕсасс ЕссдасдЬда
Е N Е О К Р Н ЛЕС ТРТ 5 Б V 5
601 дсадсЕассЕ ддадддссад дссдссаадд адСЕсаЕсдс сЬддсЬддСд
Υ Ь Е <3 О А А К Е Р I А ИЬУ
651 аадддсаддд дссдсаддда сЪЕсссЬдад даддЕддсса ЬсдЬддадда
К (3 Р (3 Е Е Б ЕРЕ Е V А I V Е Е
701 дсСдддссдд сдасасдссд адддсассЕЕ сассЕссдас дЬдадсадсЬ
Ь О Е Е Η А Е ОТЕ Т 8 Б V 8 8 Υ
751 ассЬддаддд ссаддссдсс ааддадЬЬса ЕсдссЬддсЬ ддьдаадддс ЬЕО О А А К Е Г I А И Ь V К <3
801 аддддсЬдад сдсдс
Е <3 *
Зедиепсе ΙΡ N0:13 даЬаЬссасс аЕддсссссд ссдссЬддсЪ даддадсдсс дссдссаддд сссЕдсЕдсс асссаедсСд сЪдсСдсЕдс едсадссссс ассЬсСдскд дсссдддссс ЬдсссссддЬ 121 дадЬдсссдс сасЬсдссдЬ ссдсйссЕсд сЬдадддддс дссдддсасд сдддсЬдддс 181 ссадсддсдЪ аЪссддасдс саадааасса дададссадс садаЕдссаа адддсссЬдс 241 саСдЬдссдд СдсссЬЬЕсс сЬсЪссаЬЪЪ дсссЕдссас асадЬдддсЪ ддддЪЬдсас 301 дЬдЬдСЬЬдс Сдасаддсса саСсСсЪаас СдЬдддссаЬ дсддассъеа ддссЕдасса 361 дасссЕсаЕд ЪсЬЬссЪссЬ Есссаддасд ЕдсассассЕ дсасдссдад аддсдсддсс 421 сЬсадсссЪд дсасдссдсс сЕдссаадса дсссЬдсссс Ъдссссадсс асссаддадд 481 сссссаддсс Ьдссадсадс сЕдаддссас ссаддьдсдд сдедссЕдаЬ сссЪссдаЪд 541 дссЬдадсдс псддааЬсдд садаададдс асдссдаддд сассЪЬсасс СссдасдСда 601 дсадсЕассЬ ддадддссад дссдссаадд адЬЪсаЪсдс сЬддсЪддЬд аадддсаддд 661 дссдсаддда сЬЬсссЬдад даддЪддсса ъсдЬддадда дсЕдддссдд сдасасдссд 721 адддсассЪЬ сассСссдас дСдадсадск ассСддаддд ссаддссдсс ааддадЬЬса 781 ЬсдссЬддсЬ ддСдаадддс аддддсЬдад сдсдс Зедиепсе Ιϋ N0:14 даЬаЕссасс аЕддсссссд ссдссЕддсЕ даддадсдсс дссдссаддд МАРА АНЬ Е Б А ААРА сссЬдсЬдсс асссаЬдсЬд съдспдсьдс Ьдсадссссс ассьсьдсьд ььр рмь ььъь о₽р РЬЬ
101 дсссдддссс ЬдсссссддЕ дадЬдсссдс сасЕсдссдЕ ссдсЕссЕсд АРАБ Р Р
151 сЬдадддддс дссдддсасд сдддсСдддс ссадсддсдС аЬссддасдс
201 саадааасса дададссадс садаСдссаа адддсссСдс са£д£дссдд
251 ЕдсссЕЕЕсс сЕсЕссаЕЕЕ дсссСдссас асад£дддс£ ддддЕЕдсас 301 дСдСдСССдс Ьдасаддсса саСсСсСаас СдЬдддссаС дЕддассЕСа
351 ддссЕдасса дасссЕсаЕд Ссеессессе есссаддасд ЪдсассассС
Р V Н Н Ь
401 дсасдссдад НАЕ аддсдсддсс Р И <3 Р сЬсадсссЕд ОРИ дсасдссдсс Н А А сЕдссаадса Ь Р 3 5
451 дсссЪдсссс РАР Ъдссссадсс АРА асссаддадд Т О Е А сссссаддсс РРР Едссадсадс А 3 3
501 сЕдаддссас Ь Е Р Р ссаддЕдсдд Н С О сдЕ.дссЕдаЕ V Р Р сссЕссдаЕд Р 3 Р <3 дссЬдадсдс ЬЕА
551 ЕсддааЕсдд Е N Е садаададдс О К Е И асдссдаддд А Е С сассЕЕсасс ТРТ ЕссдасдЕда 3 Б V 3
601 дсадсЕассЕ 3 Υ Ь ддадддссад Е а о дссдссаадд А А К Е адСЬсаСсдс Р I А сЬддсЕддЬд ИЬУ
651 аадддсаддд КОРС дссдсаддда РРР сЬЪсссЬдад Р Р Е даддЬддсса Е V А I ЕсдЕддадда V Е Е
- 25 013796
701 дсСдддссдд сдасасдссд асддсадсСС садсдасдад аСдаасасса
Ь О Е Ε Η А Р СЭР ε Ώ Ε ΜΝΤΙ
751 СссСддасаа ссСддссдсд сдсдасССса ссаасСддсС даСссадасс
Ъ Ό N Ъ А Α К ϋ Ρ I ННЬ I 0 Т
801 аадаСсассд аСсддаадСд адсдсдсСда Расс
К I Τ ϋ К К *
Зедиепсе Ю N0:15 даСаСссасс аСддсссссд ссдссСддсС даддадсдсс дссдссаддд сссСдсСдсс асссаСдсСд сСдсСдсСдс Сдсадссссс ассСсСдсСд дсссдддссс СдсссссддС
121 дадСдсссдс сасСсдссдС ссдсСссЬсд сСдадддддс дссдддсасд сдддсСдддс
181 ссадсддсдС аСссддасдс саадааасса дададссадс садаСдссаа адддсссСдс
241 саСдСдссдд СдсссСССсс сСсСссаССС дсссСдссас асадСдддсС ддддССдсас
301 дСдСдСССдс Сдасаддсса саСсСсСаас СдСдддссаС дСддассССа ддссСдасса
361 дасссСсаСд СсССссСссС Ссссаддасд СдсассассС дсасдссдад аддсдсддсс
421 сссадсссСд дсасдссдсс сСдссаадса дсссСдсссс сдссссадсс асссаддадд
481 сссссаддсс Сдссадсадс сСдаддссас ссаддСдсдд сдСдссСдаС сссСссдаСд
541 дсссдадсдс ссддааСсдд садаададдс асдссдаддд сасссссасс Сссдасдсда
601 дсадсСассС ддадддссад дссдссаадд адССсаСсдс сСддсСддСд аадддсаддд
661 деедсаддда сССсссСдад даддСддсса СсдСддадда дсСдддссдд сдасасдссд
721 асддсадсСС садсдасдад аСдаасасса сссСддасаа ссСддссдсд сдсдасССса
781 СсаасСддсС даСссадасс аадаСсассд аСсддаадСд адсдсдсСда СаСс
Зедиепсе Ю N0:16 даСаСссасс аСддсссссд ссдссСддсС даддадсдсс дссдссаддд МАРА А И Ь КЗА А А К А сссСдсСдсс асссаСдсСд сСдсСдсСдс Сдсадссссс ассСсСдсСд Ь Ь Р Ρ М Ь ЬЬЬЬ 0 Ρ Р Р Ь Ь
101 дсссдддссс СдсссссддС дадСдсссдс сасСсдссдС ссдсСссСсд А к А ь р р
151 сСдадддддс дссдддсасд сдддсСдддс ссадсддсдС асссддасдс 201 саадааасса дададссадс садаСдссаа адддсссСдс саСдСдссдд 251 СдсссССССС ССсСссаССС дсссСдссас асадСдддсС ддддккдсас 301 дСдСдСССдс Сдасаддсса саСсСсСаас СдСдддссаС дСддассССа 351 ддссСдасса дасссссаСд есССсссссС Ссссаддасд СдсассассС ϋ V Н н ъ
401 дсасдссдад аддсдсддсс сСсадсссСд дсасдссдсс сСдссаадса
Η А Е Ε И 6 Р Ω Р И Н А А Ь Р 8 3
дсссСдсссс Сдссссадсс асссаддадд сссссаддсс Сдссадсадс
РАР АРА Т 0 Е А РЕР АЗЗ
501 сСдаддссас ссаддСдсдд сдСдссСдаС сссСссдаСд дссСдадсдс ЬЕРР Е С С V Ρ ϋ РЗБС Ь 3 А
551 СсддааСсдд садаададдс асдссдаддд сассССсасс СссдасдСда
Ε Ν Ε О К Ε Η А Е О Τ Ρ Т 5 Ρ V 3 601 дсадсСассС ддадддссад дссдссаадд адССсаСсдс сСддсСддСд 3 Υ Ь ЕСС А А К Ε Ρ I А И Ь V 651 аадддсаддд дссдсаддда сССсссСдад даддСддсса СсдСддадда К О Е <3 Ε Ε ϋ РРЕ Ε V А I V Ε Е 701 дсСдддссдд сдасасдссд асддсадсСС садсдасдад аСдаасасса
ЬОЕ К Η Α ϋ О 3 Ρ 8ΌΕ ΜΝΤΙ 751 СссСддасаа ссСддссдсд сдсСда сас с
Ь О N Ь А А Е *
Зедиепсе Ю N0:17 даСаСссасс аСддсссссд ссдссСддсС асссаСдсСд сСдсСдсСдс Сдсадссссс 121 дадСдсссдс сасСсдссдС ссдсСссСсд 181 ссадсддсдС аСссддасдс саадааасса 241 саСдСдссдд СдсссСССсс сЪсСссаССС 301 дСдСдСССдс Сдасаддсса саСсСсСаас 361 дасссСсаСд СсССссСссС Ссссаддасд 421 сссадсссСд дсасдссдсс сСдссаадса 481 сссссаддсс сдссадсадс сСдаддссас 541 дссСдадсдс СсддааСсдд садаададдс 601 дсадсСассС ддадддссад дссдссаадд 721 асддсадсСС садсдасдад аСдаасасса Зедиепсе ΙΏ N0:18 даддадсдсс ассСсСдсСд ссдадддддс дададссадс дсссСдссас СдСдддссаС СдсассассС дсссСдсссс ссаддСдсдд асдссдаддд адССсаСсдс СссСддасаа дссдссаддд дсссдддссс дссдддсасд садаСдссаа асадСдддсС дСддассССа дсасдссдад Сдссссадсс сдСдссСдаС сассССсасс сСддсСддСд ссСддссдсд ссссдссдсс СдсссссддС сдддсСдддс адддсссСдс ддддССдсас ддссСдасса аддсдсддсс асссаддадд сссСссдаСд Сссдасдсда аадддсаддд сдсСдаСаСс
- 26 013796 даСа+ссасс а+ддсссссд ссдссСддсЬ даддадсдсс дссдссаддд МАРА АНЬ Е 3 А А А К А 51 ссс+дс+дсс асссаСдсСд сПдсЕдсЬдс Сдсадссссс асс+сЬдсСд Ь Ь Р РМЪ ЬЬЪЪ О Ρ Р РЬЬ 101 дсссдддссс ЬдсссссддХ дад&дсссдс сасесдссдС ссдсСссСсд АКАЕ Ρ Р
151 ссдадддддс дссдддсасд сдддсСдддс ссадсддсди аессддасдс 201 саадааасса дададссадс садаедссаа адддссседс саЬдьдссдд 251 +дсссСС(:сс сСсЕссаСЫ: дсссСдссас асадЕдддсЬ ддддСЕдсас 301 дЬдЬдССЬдс сдасаддсса саЬсСсСаас сдСдддссаЬ дСддассССа 351 ддссСдасса дасссЬсаСд &с££ссСсс(: Ьсссаддасд ЬдсассассЬ О V ИНЕ
401 дсасдссдад аддсдсддсс сЁсадссс+д дсасдссдсс с+дссаадса НАЕ Е Е С Р ОРИ Н А А Ъ Р 3 3
451 дссс+дсссс Едссссадсс асссаддадд сссссаддсс Сдссадсадс РАР АРА ТОЁА Ρ Ρ. Ρ А 3 3
501 с+даддссас ссадд+дсдд сд+дсседас ссс+ссда+д дссЬдадсдс Ь Е Ρ Р ЕСО V Р О Р 5 ϋ <3 Е 3 А
551 Ьсддаа+сдд садаададдс асдссдаддд сассЕСсасс сссдасдСда К N К 0 К К К А Е <3 ТРТ 8 Ώ V 3 601 дсадссасси ддадддссад дссдссаадд адССсаСсдс сЬддскддСд ЗУЬ ЕСО А А К Е ΡΙΑ И Ь V
651 аадддсаддд дссдсаддда сС+сссЪдад даддЬддсса ЪсдСддадда
К С Е 6 Е Е О р р Е Е V А I V Е Е
701 дс+дддс+да дсдсдс
Е С *
Зедиепсе ТО N0:19
даеаЪссасс аьддсссссд ссдссСддсЬ даддадсдсс дссдссаддд ссседс+дсс асссаСдсСд сЬдс+дсСдс Ьдсадссссс ассЬсЬдсСд дсссдддссс ЬдсссссддС
121 дадСдсссдс сасХсдссдЬ ссдсСссСсд с+дадддддс дссдддсасд сдддсСдддс
1Θ1 ссадсддсдХ а+ссддасдс саадааасса дададссадс садаЬдссаа адддсссСдс
241 саЬдСдссдд СдсссСССсс сСсСсса+СЬ дсссЬдссас асад+дддсЬ ддддСЪдсас
301 д+дСд+ЕСдс Едасаддсса саесСсХаас Ъд+дддссас дСддассСЬа ддсс+дасса
361 дасссЬсаЬд СсЬ+ссЬссЬ Ссссаддасд ЬдсассассС дсасдссдад аддсдсддсс
421 сХсадсссСд дсасдссдсс сСдссаадса дсссЬдсссс Ьдссссадсс асссаддадд
481 сссссаддсс Ьдссадсадс сЬдаддссас ссаддСдсдд сдЬдсс+даЬ сссЬссдаЪд
541 дссСдадсдс СсддааСсдд садаададдс асдссдаддд сассЬ+сасс СссдасдЬда
601 дсадсЬассЬ ддадддссад дссдссаадд ад+Ссассдс сСддсСдд+д аадддсаддд
661 дссдсаддда сЬ+сссЬдад даддЬддсса ЪсдЪддадда дсСдддсСда дсдсдс
Зедиепсе Ιϋ N0:20
НСЕСТЕТЗОУ ЗЗУЬЕООААК ΕΡΙΑΜβνΚΟΚ С
Зедиепсе ТО N0:21
ΚΕΌΡΡΕΕνΑΙ
Зедиепсе ТО N0:22
ΕΕΌΕΡΕΕνΑΙ νΕΕΙ:
Зедиепсе ТО N0:23
ΚΕΌΓΡΕΞνΑΙ АЕЕЬ
Зедиепсе 10 N0:24
Азр РЬе Рго <31и С1и 7 а. 1 А1а
Зедиепсе Ю N0:25
- 27 013796
А1а А1а Авр Зедиепсе М РЬе Рго <Э1и <31и Уа1 А1а N0:26 Не
А1а А1а Авр РЬе Рго С1и <31и Уа1 А1а Не Уа1 С1и О1и Ьеи
Зециепсе ю N0:27
А1а А1а Авр РЬе Рго 01и <31и Уа1 А1а Не А1а 01и <31и Ьеи
Зедиепсе Ю N0:28
А1а А1а Авр РЬе Рго С1и С1и Уа1 А1а 11е νβΐ 01и 01и Ьеи С1у
Зедиепсе 10 N0:29
А1а А1а Авр РЬе рго 01и С1и Уа1 А1а Не А1а <31и В1и Ьеи С1у
Зедиепсе Ιϋ N0:30
Нхз А1а С1и <31у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег туг Ьеи <31и (31у
О1п А1а А1а Ьув 01и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьув С1у Агд С1у А1а
А1а Авр РЬе Рго <31и 61и Уа1 А1а 11е А1а С1и С1и Ьеи ©1у
Зедиепсе Ю N0:31
Нхв А1а 61и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр ν31 Зег Зег Туг Ьеи С1и <31у
01п А1а А1а Ьуз С1и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз О1у Агд <31у Агд
Агд Авр РЬе А1а С1и С1и Уа1 А1а Не А1а <31и О1и Ьеи <31у
Зедиепсе ΤΌ N0:3 2
нхв А1а С1и С1у ТЬг РЬе ты Зег Авр Уа1 Зег Зег туг Ьеи <31и <31у
<31п А1а А1а Ьув С1и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьув 01у Агд С1у Агд
Агд Авр А1а А1а А1а А1а Уа1 А1а Не А1а С1и С1и ьеи (31у
Зедиепсе ΙΒ N0:33
Нхв А1а С1и <31у ТНг РЬе ты Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи <31и <31у
С1п А1а А1а Ьуз <31и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз <31у Агд <Э1у А1а
А1а Авр А1а А1а А1а А1а Уа1 А1а 11е А1а А1а А1а Ьеи С1у
Зедиепсе Ю N0: 34
Нхв А1а 01и <31у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг ьеи (31и С1у
<31п А1а А1а Ьуз С1и РЬе 11е А1а Тгр ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд С1у Агд
Агд Авр РЬе Рго
Зедиепсе Ю N0:35
Нхв А1а 01и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи О1и <31у
С1п А1а А1а Ьув С1и РЬе Не А1а тгр Ьеи Уа1 Ьуз 61у Агд 61у Агд
Агд Авр РЬе Рго О1и <31и Уа1 А1а
Зедиепсе ιπ N0:3 6
Нхз А1а О1и С1у ТНг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и <31у
<31п А1а А1а Ьув <31и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд О1у Агд
- 28 013796
Агд Азр РЬе Нхз А1а Суз Рго 01и 01и Уа1 А1а Не А1а 01и <31и ьеи О1у Агд Агд
Зедиепсе Ю N0:37
Н1в А1а О1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи 01и <31у
<31п А1а А1а Ьув С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд <31у А1а
А1а Азр РЬе Рго <31и С1и ν»ι А1а Не <31и 01и Ьеи С1у
Зедиепсе Ю N0:38
Н1з А1а <31и О1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи О1и <31у
01п А1а А1а Ьуз <31и РЬе 11а А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз <31у Агд <31у Агд
Агд Авр РЬе А1а С1и 01и Уа1 А1а Не Уа1 <31и (31и Ьеи <31у
Зедиепсе Ю N0:39
Н1з А1а С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи <31и <31у
С1п А1а А1а Ьув <31и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз 31у Агд С1у Агд
Агд Азр А1а А1а А1а А1а Уа1 А1а Не Уа1 С1и С1и Ьеи О1у
Зедиепсе ΙΟ N0:40
Н1з А1а <Э1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Авр νΒ1 Зег Зег Туг ьеи С1и С1у
ί*1Ί «е М е 7\1 -5 ла а ги-о. Ьуз <31и РЬе Не А1а Тгр ν= 1 Ζ ΠΊ чл — 2 **“ э — — 2 А1а
А1а Авр А1а А1а А1а А1а Уа1 А1а Не Уа1 А1а А1а Ьеи <31у
Зедиепсе ΙΟ N0:41
Ηίθ А1а 61и <31у ТЬг РЬе Ткг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг ьеи 01и (Пу
(31п А1а А1а Ьуз <31и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз (31у Агд С1у Агд
Агд Авр РЬе Нгз А1а Сув Рго <31и С1и Уа1 А1а Не Уа1 01и 01и Ьеи Й1у Агд Агд
Зедиепсе Ю N0:42
Ηίθ А1а С1и С1у ТНг РЬе Ткг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи 61и <31у
С1п А1а А1а Ьуз <31и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд Хаа
Зедиепсе 10 N0:43 (формула (1} )
Хаа хаа О1и О1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Хаа Зег Хаа Хаа Хаа 31и Хаа
Хаа А1а Хаа Хаа Хаа РЬе Не Хаа Тгр Ьеи Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
Зечиепсе Ю N0:44 (формула (II) )
Хаа Хаа <31и О1у ТЬг РЬе Ткг Зег Авр νβΐ Зег Хаа Туг Ьеи С1и Хаа
Хаа А1а А1а Хаа 01и РЬе 11е Хаа Тгр Ьеи ν&1 Хаа Хаа Хаа Хаа
Зедиепсе Ю N0:45 (формула (III))
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

1. Слитый пептид, содержащий в качестве компонента (I) Ν-концевую последовательность (ί) СЬР-1(7-37) 8Е0 ГО Ν0:1 или функциональную последовательность, обладающую функциональной активностью СЬР-1, как инкретинового гормона, а именно его антиапопатическим действием или его нейротрофическими свойствами, и имеющую последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную СЬР-1(7-37), (ίί) модифицированный пептид СЬР-1, включающий аминокислотную последовательность формулы II
Хаа7-Хаа8-О1и-О1у-ТЬг-РЬе-Т11г-8ег-А8р-Хаа16-8ег-Хаа18-Хаа19-Хаа2061и-Хаа22-Хаа23-А1а-Хаа25-Хаа26-Хаа27-РЬе-Пе-ХааЗо-Тгр-Ьеи-ХааЗЗХаа34-Хаа35-Хаа36-Хаа37, где Хаа7 обозначает Ь-гистидин, Ό-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, 3-гидроксигистидин, гомогистидин, Ν-ацетилгистидин, а-фторметилгистидин, а-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2пиридилаланин или 4-пиридилаланин;
- 29 013796
Хаа8 обозначает А1а, С1у, Vа1, Ьеи, Не, Бук, А1Ь, (1-аминоциклопропил)карбоновую кислоту, (1аминоциклобутил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклопентил)карбоновую кислоту, (1аминоциклогексил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогептил)карбоновую кислоту или (1аминоциклооктил)карбоновую кислоту, где С1у является наиболее предпочтительным;
Хаа16 обозначает Vа1 или Беи;
Хаа18 обозначает 8ег, Бук или Агд;
Хаа19 обозначает Туг или С1п;
Хаа20 обозначает Беи или Ме1;
Хаа22 обозначает С1у, С1и или А1Ь;
Хаа23 обозначает С1п, С1и, Бук или Агд;
Хаа25 обозначает А1а или Vа1;
Хаа26 обозначает Бук, С1и или Агд;
Хаа27 обозначает С1и или Беи;
Хаа30 обозначает А1а, С1и или Агд;
Хаа33 обозначает Vа1 или Бук;
Хаа34 обозначает Бук, С1и, Акп или Агд;
Хаа35 обозначает С1у или А1Ь;
Хаа36 обозначает Агд, С1у, или Бук, или амид или отсутствует;
Хаа37 обозначает С1у, А1а, С1и, Рго, Бук, амид или отсутствует, и в качестве компонента (II) С-концевую пептидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 9 аминокислот и содержащую последовательность согласно 8ЕС ГО N0:22 (ΚΚ^ΡРЕЕVАI) или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность 8ЕС ГО N0:22, и удостаивающую слитый пептид лучшей устойчивостью к инактивации с помощью ОРР-Ш, причем Ν-терминальная последовательность слитого пептида является компонентом (I) как таковым или сигнальной пептидной последовательностью, слитой с помощью последовательности, которая расщепляется протеазой, с Νтерминальной последовательностью компонента (I), или сигнальным пептидом, слитым без помощи расщепляемой протеазой последовательности между ними с Ν-терминальным компонентом (I), или лидерной последовательностью, слитой с помощью последовательности, которая расщепляется протеазой с Ν-терминальным компонентом (I) и является гетерологичной по отношению к препроглюкагону.
2. Слитый пептид по п.1, где компонент (I) является модифицированным СБР-1, включающим аминокислотную последовательность формулы III
Хаа7-Хаа8-С1и-О1у-ТЬг-Р11е-ТЬг-8ег-А8р-Уа1-8ег-Хаа8-Туг-Беи-С1и-Хаа22Хаа23-А1а-А1а-Хаа26-61и-РЬе-11е-Хаа30-Тгр-Ъеи-Уа1-Хаа34-Хаа35-Хаа36-Хаа37, где Хаа7 обозначает Б-гистидин, Ό-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, 3-гидроксигистидин, гомогистидин, Ν-ацетилгистидин, а-фторметилгистидин, а-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2пиридилаланил или 4-пиридилаланин;
Хаа8 обозначает А1а, С1у, Vа1, Беи, Не, Бук, А1Ь, (1-аминоциклопропил)карбоновую кислоту, (1аминоциклобутил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклопентил)карбоновую кислоту, (1аминоциклогексил)карбоновую кислоту, (1-аминоциклогептил)карбоновую кислоту или (1аминоциклооктил)карбоновую кислоту;
Хаа18 обозначает 8ег, Бук или Агд;
Хаа22 обозначает С1у, С1и или А1Ь;
Хаа23 обозначает С1п, С1и, Бук или Агд;
Хаа26 обозначает Бук, С1и или Агд;
Хаа30 обозначает А1а, С1и или Агд;
Хаа34 обозначает Бук, С1и или Агд;
Хаа35 обозначает С1у или А1Ь;
Хаа36 обозначает Агд или Бук, амид или отсутствует;
Хаа37 обозначает С1у, А1а, С1и или Бук, амид или отсутствует.
3. Слитый пептид по п.1, где компонент (I) является СБР-1(7-35) или СБР-1(7-36).
4. Слитый пептид по любому из пп.1-3, в котором компонент (II) представляет собой пептидную последовательность, которая содержит последовательность, выбранную из 8ЕС ГО Ν0:23 (ΚΚ^ΡРЕЕVАIVЕЕ^) или 8ЕС ГО Ν0:24 (ΚΚ^ΡРЕЕVАIАЕЕ^), или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной 8ЕС ГО Ν0:23 или 24.
5. Слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-4, в котором компонент (II) представляет собой пептидную последовательность, которая содержит последовательность, выбранную из 8ЕС ГО Ν0:2 (ΚΚ^ΡРЕЕVАIVЕЕ^С) или 8ЕС ГО Ν0:3 (ΚΚ^ΡРЕЕVАIАЕЕ^С), или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% любой последовательности, представленной в 8ЕС ГО Ν0:2 или 3.
6. Слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-5, в котором компонент (I) и компонент (II) связаны непосредственно или связаны через линкерную последовательность.
7. Слитый пептид по п.6, в котором последовательность состоит из 1-10 аминокислот.
- 30 013796
8. Слитый пептид по одному из пп.1-7, где слитый пептид содержит последовательность, выбранную из 8Е0 ГО N0:8 (НАЕСТРТ8ПУ88УЬЕ6(2ААКЕР1А\УЬУК(ЖОВ.1ГОГРЕЕУА1АЕЕЬС1) или 8ЕО ГО N0:12 (НАЕСТРТ8ОУ88УЕЕО(ЗААКЕР1А^ЕУКОК<лК.КОРРЕЕУА1УЕЕЕС)! или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% последовательностям, представленным в 8Е0 ГО N0: 8 или 12.
9. Слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-8, где слитый пептид содержит дополнительный компонент (III), связанный с С-концом компонента (II) и/или с ^концом компонента (I).
10. Слитый пептид по п.9, в котором компонент (III) содержит по меньшей мере четыре аминокислотных остатка, предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислотных остатков или включает по меньшей мере 20 аминокислотных остатков.
11. Слитый пептид по п.9 или 10, в котором компонент (III) содержит по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20 дополнительных аминокислотных остатков в ^концевой последовательности СЬР-2, такой как проглюкагон или СЬР-1(7-37).
12. Слитый пептид по одному из пп.9-11, в котором компонент (III) содержит последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:4 или 5, или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:4 или 5.
13. Слитый пептид по одному из пп.9-12, где слитый пептид содержит пептидную последовательность, выбранную из группы, которая включает 8Е0 ГО N0:6, 7, 10 и 11, или последовательность, гомологичную по меньшей мере на 80% последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:6, 7, 10 или 11.
14. Слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-13, в котором по меньшей мере одну из аминокислот дериватизируют путем ковалентной модификации боковой цепи встречающейся в естественных условиях аминокислоты, путем модификации пептидного каркаса, путем модификации №Н2- или карбоксильных концевых групп.
15. Слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-14, где слитый пептид содержит белок-носитель, прежде всего трансферрин или альбумин, в качестве компонента (IV).
16. Слитый пептид по п.14, в котором по меньшей мере одну из аминокислот дериватизуют с помощью липидной или углеводной группы.
17. Слитый пептид по п.14 или 16, в котором ^концевой остаток НЬ СЬР-1 (СЬР-1(7)) химически модифицируют на его №Н2-конце и/или гистидильной боковой цепи, прежде всего с помощью гидрофобного остатка.
18. Способ получения слитого пептида по одному из предыдущих пп.1-17 с помощью твердофазного пептидного синтеза.
19. Слитый пептид по любому из пп.1-17 в качестве лекарственного средства для применения при терапии человека или животных.
20. Нуклеиновая кислота, кодирующая слитый пептид по одному из предыдущих пп.1-13 или 15.
21. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.20.
22. Клетка-хозяин, содержащая экзогенно интродуцированную ДНК по п.20, в частности вектор по п.21, которая обладает способностью экспрессировать слитый пептид, где клетка-хозяин не является человеческой эмбриональной или зародышевой клеткой.
23. Способ получения слитого пептида по одному из предыдущих пп.1-13 или 15, в котором микроорганизм, трансформированный путем включения нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый пептид, ферментируют и выделяют белок.
24. Способ получения белка по п.23, заключающийся в том, что клетки животного выращивают в условиях, при которых белок экспортируется из клеток.
25. Применение слитого пептида по одному из предыдущих пп.1-17, нуклеиновой кислоты по п.20, вектора по п.21 или клетки-хозяина по п.22 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения сахарного диабета типа I или II, устойчивости к инсулину, нарушений веса и связанных с ними заболеваний или состояний.
26. Применение слитого пептида по одному из предыдущих пп.1-17, нуклеиновой кислоты по п.20, вектора по п.21 или клетки-хозяина по п.22 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нейродегенеративных нарушений и связанных с ними заболеваний или состояний.
27. Применение слитого пептида по одному из предыдущих пп.1-17, нуклеиновой кислоты по п.20, вектора по п.21 или клетки-хозяина по п.22 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушений и заболеваний или состояний, ассоциированных с апоптозом.
EA200800699A 2005-09-22 2006-09-22 Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам EA013796B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05020718A EP1767545B1 (en) 2005-09-22 2005-09-22 GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) fusion polypeptides with increased peptidase resistance
PCT/EP2006/009226 WO2007039140A1 (en) 2005-09-22 2006-09-22 Glp-1 ( glucagon-like peptide-1 ) fusion polypeptides with increased peptidase resistance

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800699A1 EA200800699A1 (ru) 2008-10-30
EA013796B1 true EA013796B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=35700191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800699A EA013796B1 (ru) 2005-09-22 2006-09-22 Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам

Country Status (24)

Country Link
US (2) US8431533B2 (ru)
EP (5) EP2045265B1 (ru)
JP (2) JP5222729B2 (ru)
KR (1) KR20080064840A (ru)
CN (1) CN101273058A (ru)
AT (1) ATE448247T1 (ru)
AU (1) AU2006299134B2 (ru)
BR (1) BRPI0616107A2 (ru)
CA (1) CA2619053A1 (ru)
CY (1) CY1109778T1 (ru)
DE (1) DE602005017628D1 (ru)
DK (1) DK1767545T3 (ru)
EA (1) EA013796B1 (ru)
ES (3) ES2397289T3 (ru)
HK (1) HK1129121A1 (ru)
HR (1) HRP20100062T1 (ru)
IL (1) IL188904A0 (ru)
PL (1) PL1767545T3 (ru)
PT (1) PT1767545E (ru)
RS (1) RS51319B (ru)
SG (1) SG165414A1 (ru)
SI (1) SI1767545T1 (ru)
WO (1) WO2007039140A1 (ru)
ZA (1) ZA200803488B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2681857C2 (ru) * 2013-08-13 2019-03-13 ДжиМАКС БАЙОФАРМ ЭлЭлСи. Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок
WO2024144431A1 (ru) * 2022-12-29 2024-07-04 Авва Фармасьютикалс Лтд Новый штамм-продуцент escherichia coli, продуцирующий гибридный белок cbd-hs-es-glp1, и способ получения полипептида glp-1

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2397289T3 (es) 2005-09-22 2013-03-06 Biocompatibles Uk Ltd. Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a peptidasa incrementada
JP2009513627A (ja) * 2005-10-27 2009-04-02 ペプトロン カンパニー リミテッド 生理活性物質−血液蛋白質複合体及びこれを利用する生理活性物質の安定化方法
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
EP1854455B1 (en) * 2006-05-10 2009-10-07 Biocompatibles UK Limited Spherical microcapsules comprising GLP-1 peptides, their production and use
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
CN105727261A (zh) 2008-06-27 2016-07-06 杜克大学 包含弹性蛋白样肽的治疗剂
EP2163243A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-17 Biocompatibles UK Limited Treatment of acute myocardial infarction (AMI) using encapsulated cells encoding and secreting GLP-1 peptides or analogs thereof
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
BR112012019992A2 (pt) * 2010-02-11 2020-08-18 F. Hoffmann-La Roche Ag. conjugados de igf-i poli (etileno glicol)
KR20130099126A (ko) * 2010-10-01 2013-09-05 가부시키가이샤 엠엠티 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드
CN102766204B (zh) * 2011-05-05 2014-10-15 天津药物研究院 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法和其应用
CN102363633B (zh) * 2011-11-16 2013-11-20 天津拓飞生物科技有限公司 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用
JP6525456B2 (ja) * 2012-11-20 2019-06-05 メデリス ダイアビーティーズ,エルエルシー インスリン抵抗性のための改善されたペプチド製剤
CN104707131A (zh) * 2013-12-13 2015-06-17 上海建华精细生物制品有限公司 一种药物组合物及其制备方法和用途
CN117180445A (zh) 2014-05-28 2023-12-08 梅德瑞斯糖尿病有限责任公司 针对胰岛素抵抗的改良肽药物
JP6731953B2 (ja) 2015-02-11 2020-07-29 ジーエムエーエックス バイオファーム エルエルシー. Glp−1r抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤
US11123405B2 (en) 2015-12-23 2021-09-21 The Johns Hopkins University Long-acting GLP-1R agonist as a therapy of neurological and neurodegenerative conditions
CN107818433B (zh) * 2016-09-14 2022-07-05 菜鸟智能物流控股有限公司 取件方法、物流信息处理方法及装置、系统
WO2018104559A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Glp-1/glp-2 dual agonists
WO2018104558A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
MX2019006486A (es) 2016-12-09 2019-08-01 Zealand Pharma As Agonistas duales acilados de glp-1/glp-2.
CN108341880B (zh) * 2017-01-23 2023-07-04 天津药物研究院有限公司 含有胰高血糖素样肽-1和胰高血糖素的片段类似物的嵌合多肽及其用途
KR101827245B1 (ko) * 2017-12-26 2018-02-08 (주)제이유타이드 알라린을 주성분으로 하는 요독증 치료제
US11541028B2 (en) 2018-01-03 2023-01-03 Altimmune Inc. Peptide pharmaceuticals for treatment of NASH and other disorders
KR101903564B1 (ko) * 2018-01-31 2018-11-13 한국지질자원연구원 제지공정에서 발생되는 부산물의 재활용 방법
HRP20221054T1 (hr) 2018-04-05 2022-11-11 Sun Pharmaceutical Industries Limited Novi analozi glp-1
EP3901173A4 (en) 2018-12-21 2022-11-23 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. BISPECIFIC PROTEIN
WO2021182928A1 (ko) * 2020-03-12 2021-09-16 주식회사 에스엘메타젠 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도
KR102349717B1 (ko) * 2020-03-12 2022-01-11 주식회사 에스엘메타젠 신규 대사증후군 및 그와 관련된 질환 치료용 약학 조성물
WO2022015039A1 (ko) * 2020-07-14 2022-01-20 (주)지아이이노베이션 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
JP2023553362A (ja) * 2020-11-27 2023-12-21 ディーアンドディー ファーマテック インコーポレイテッド ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せを連結されて有する生物学的活性材料結合体
CN116940384A (zh) * 2020-11-27 2023-10-24 D&D制药技术股份有限公司 具有与生物素部分、脂肪酸部分或其组合偶联的生物活性材料缀合物的口服制剂
CN112661862B (zh) * 2020-12-25 2023-03-31 深圳大学 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN113846124A (zh) * 2021-09-26 2021-12-28 康霖生物科技(杭州)有限公司 一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体
CN114621339B (zh) * 2021-12-28 2022-09-23 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效glp-1衍生物

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008871A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
US5861284A (en) * 1991-02-19 1999-01-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing a biologically active recombinant cysteine-free parathyroid hormone (1-34)
WO1999046283A1 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
WO2003058203A2 (en) * 2002-01-08 2003-07-17 Eli Lilly And Company Extended glucagon-like peptide-1 analogs
US20030195154A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-16 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
US20030221201A1 (en) * 2001-08-30 2003-11-27 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin fusion proteins
US20040146985A1 (en) * 2001-07-19 2004-07-29 Shanghai Hua-Yi Bio-Tech Lab Method of producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptide and/or GLP-1 analogs
EP1454629A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Insulinotrophic agent based on preproglucagon
US6858576B1 (en) * 1996-08-08 2005-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for regulating gastrointestinal motility
WO2005058958A2 (en) * 2003-12-18 2005-06-30 Novo Nordisk A/S Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586128A (en) * 1897-07-13 Toilet-paper holder
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
ATE6548T1 (de) 1979-10-16 1984-03-15 Winfried Dr. Med. Stoecker Vorrichtung zur durchfuehrung von mikroanalysen.
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
DD224119A1 (de) 1983-11-07 1985-06-26 Univ Schiller Jena Temperierbarer probentraeger
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4608251A (en) 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5144139A (en) * 1985-08-05 1992-09-01 Biotrack, Inc. Capillary flow device
US4687529A (en) * 1985-08-30 1987-08-18 Miles Laboratories, Inc. Method of making a reagent test device containing hydrophobic barriers
CA1292176C (en) 1985-09-18 1991-11-19 Joel M. Blatt Volume metering capillary gap device for applying a liquid sample onto a reactive surface
US5017691A (en) 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US6849708B1 (en) * 1986-05-05 2005-02-01 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone and uses thereof
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
ES2113879T3 (es) 1990-01-24 1998-05-16 Douglas I Buckley Analogos de glp-1 utiles para el tratamiento de diabetes.
CA2062338A1 (en) 1991-03-15 1992-09-16 Zia Yassinzadeh Electronic control cartridge and method of simulating light transmission patterns
GB9311147D0 (en) 1993-05-28 1993-07-14 Long Ashton Research Station Regulation of plant growth
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US5512549A (en) 1994-10-18 1996-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptide analogs, compositions, and methods of use
BE1008987A3 (fr) 1995-01-06 1996-10-01 Robyn Pierre Blocs refractaires a canalisations pour sols de fours verriers et installation dans les sols de circuits de refroidissement ou de chauffage, permettant d'ameliorer le controle thermique des sols et la qualite du verre.
JP3643863B2 (ja) 1995-08-09 2005-04-27 アークレイ株式会社 液体保持具とその製造方法
DE69740176D1 (de) 1996-03-01 2011-05-26 Novo Nordisk As Appetithemmendes Peptid, Zusammensetzung und Verwendung
US6165739A (en) * 1996-03-13 2000-12-26 Compucyte Corporation Multiple simultaneous testing media
ATE289517T1 (de) 1996-11-12 2005-03-15 Novo Nordisk As Verwendung von glp-1 peptiden
CA2318376A1 (en) 1998-01-12 1999-07-15 Betagene, Inc. Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines
WO1999044638A1 (en) * 1998-03-06 1999-09-10 Spectrx, Inc. Photothermal structure for biomedical applications, and method therefor
AU3047299A (en) 1998-04-13 1999-11-01 Modex Therapeutiques, S.A. Methods of delivering glp-1
US7259136B2 (en) * 1999-04-30 2007-08-21 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating peripheral vascular disease
US6267954B1 (en) * 1999-11-24 2001-07-31 Universite De Paris V Rene-Descartes Intraocular transplantation of encapsulated cells
US6706159B2 (en) * 2000-03-02 2004-03-16 Diabetes Diagnostics Combined lancet and electrochemical analyte-testing apparatus
AU2001237254A1 (en) 2000-03-08 2001-09-17 Novo-Nordisk A/S Lowering serum lipids
DE10039643A1 (de) * 2000-08-14 2002-02-28 Max Planck Gesellschaft Funktionalisierte Perylentetracarbonsäurediimide
WO2002076878A2 (en) 2001-02-09 2002-10-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and structure for microfluidic flow guiding
EP1401480B1 (en) 2001-02-22 2012-11-28 Novartis AG Viral vectors encoding endostatin in the treatment of ocular neovascularization
US20030034147A1 (en) * 2001-05-31 2003-02-20 Houck Glenn M. Apparatus which eliminates the need for idling by trucks
EP1412384B1 (en) 2001-06-28 2007-12-26 Novo Nordisk A/S Stable formulation of modified glp-1
WO2003010305A1 (en) 2001-07-27 2003-02-06 Arhus Amt Immortilized stem cells
US7576050B2 (en) 2001-07-31 2009-08-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services GLP-1 exendin-4 peptide analogs and uses thereof
US20040143104A1 (en) * 2001-08-08 2004-07-22 Wadsworth Samuel C. Methods of treating diabetes and other blood sugar disorders
CN1635900A (zh) 2001-08-28 2005-07-06 伊莱利利公司 Glp-1和基础胰岛素的预混合物
US7166208B2 (en) * 2004-03-03 2007-01-23 Stephen Eliot Zweig Apoenzyme reactivation electrochemical detection method and assay
EP1790353A1 (en) * 2001-12-29 2007-05-30 Novo Nordisk A/S Combined use of a GLP-1 compound and a modulator of diabetic late complications
GB2388898B (en) 2002-04-02 2005-10-05 Inverness Medical Ltd Integrated sample testing meter
US20030143113A2 (en) * 2002-05-09 2003-07-31 Lifescan, Inc. Physiological sample collection devices and methods of using the same
EP1539210A4 (en) 2002-09-06 2006-06-07 Bayer Pharmaceuticals Corp GLP-1 RECEPTOR MODIFIED AGONISTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE
US6969166B2 (en) 2003-05-29 2005-11-29 3M Innovative Properties Company Method for modifying the surface of a substrate
US7057116B2 (en) 2003-06-02 2006-06-06 Intel Corporation Selective reference plane bridge(s) on folded package
JP4629047B2 (ja) * 2003-06-12 2011-02-09 イーライ リリー アンド カンパニー Glp−1アナログ複合タンパク質
EP1498143A1 (en) 2003-07-18 2005-01-19 Aventis Pharma S.A. Self-emulsifying and self-microemulsifying formulations for the oral administration of taxoids
JP2007501811A (ja) 2003-08-08 2007-02-01 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 治療的な関心対象のタンパク質に対する遅延分子の選択的な化学物質接合のためのガラクトースオキシダーゼの使用。
WO2005034988A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Novo Nordisk A/S Long-acting molecules in sustained release formulations
WO2005072216A2 (en) 2004-01-20 2005-08-11 The Curators Of The University Of Missouri Supported molecular biofluid viscosity sensors for in vitro and in vivo use
BRPI0507594A (pt) 2004-02-11 2007-07-03 Amylin Pharmaceuticals Inc polipetìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
DE602004011688D1 (de) 2004-03-05 2008-03-20 Egomedical Swiss Ag Analyttestsystem zur bestimmung der konzentration eines analyten in einer physiologischen flüssigkeit
JP2008537873A (ja) 2004-03-31 2008-10-02 セントカー・インコーポレーテツド ヒトglp−1ミメティボディ、組成物、方法および用途
BRPI0419004A (pt) 2004-08-13 2007-12-11 Egomedical Technologies Ag sistema de testes de analitos para determinar a concentração de um analito em um fluido fisiológico ou aquoso
US7442682B2 (en) 2004-10-19 2008-10-28 Nitto Denko Corporation Transepithelial delivery of peptides with incretin hormone activities
EP1909823A2 (en) 2005-07-29 2008-04-16 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
ES2397289T3 (es) 2005-09-22 2013-03-06 Biocompatibles Uk Ltd. Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a peptidasa incrementada
EP1854455B1 (en) 2006-05-10 2009-10-07 Biocompatibles UK Limited Spherical microcapsules comprising GLP-1 peptides, their production and use
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
EP2163243A1 (en) 2008-09-12 2010-03-17 Biocompatibles UK Limited Treatment of acute myocardial infarction (AMI) using encapsulated cells encoding and secreting GLP-1 peptides or analogs thereof

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5861284A (en) * 1991-02-19 1999-01-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing a biologically active recombinant cysteine-free parathyroid hormone (1-34)
US6858576B1 (en) * 1996-08-08 2005-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for regulating gastrointestinal motility
WO1998008871A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
WO1999046283A1 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Zealand Pharmaceuticals A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
US20040146985A1 (en) * 2001-07-19 2004-07-29 Shanghai Hua-Yi Bio-Tech Lab Method of producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptide and/or GLP-1 analogs
US20030221201A1 (en) * 2001-08-30 2003-11-27 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin fusion proteins
WO2003058203A2 (en) * 2002-01-08 2003-07-17 Eli Lilly And Company Extended glucagon-like peptide-1 analogs
US20030195154A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-16 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
EP1454629A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Insulinotrophic agent based on preproglucagon
WO2005058958A2 (en) * 2003-12-18 2005-06-30 Novo Nordisk A/S Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DRUCKER D.J.: "Glucagon-like peptides: regulators of cell proliferation, differentiation, and apoptosis", MOLECULAR ENDOCRINOLOGY, BALTIMORE, MD, US, vol. 17, no. 2, February 2003 (2003-02), pages 161-171, XP002979356, ISSN: 0888-8809 * abstract; figure 1; from the last paragraph on page 164 to the first paragraph on page 167 * *
KIEFFER T.J. ET AL.: "THE GLUCAGON-LIKE PEPTIDES", ENDOCRINE REVIEWS, BALTIMORE, MD, US, vol. 20, no. 6, December 1999 (1999-12), pages 876-913, XP008010226, page 899, right-hand column, lines 8-30; figures 4, 8 *
PERRY TRACY ANN ET AL.: "Enhancing central nervous system endogenous GLP-1 receptor pathways for intervention in Alzheimer's disease", CURRENT ALZHEIMER RESEARCH, vol. 2, no. 3, July 2005 (2005-07), pages 377-385, XP001246463, ISSN: 1567-2050, abstract *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2681857C2 (ru) * 2013-08-13 2019-03-13 ДжиМАКС БАЙОФАРМ ЭлЭлСи. Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок
WO2024144431A1 (ru) * 2022-12-29 2024-07-04 Авва Фармасьютикалс Лтд Новый штамм-продуцент escherichia coli, продуцирующий гибридный белок cbd-hs-es-glp1, и способ получения полипептида glp-1

Also Published As

Publication number Publication date
ES2336575T3 (es) 2010-04-14
CY1109778T1 (el) 2014-09-10
AU2006299134A1 (en) 2007-04-12
ES2394218T3 (es) 2013-01-23
ATE448247T1 (de) 2009-11-15
RS51319B (sr) 2010-12-31
US8853159B2 (en) 2014-10-07
ES2397289T3 (es) 2013-03-06
SI1767545T1 (sl) 2010-03-31
KR20080064840A (ko) 2008-07-09
BRPI0616107A2 (pt) 2011-06-07
JP2009508505A (ja) 2009-03-05
WO2007039140A1 (en) 2007-04-12
EP1767545B1 (en) 2009-11-11
AU2006299134B2 (en) 2012-02-23
JP5222729B2 (ja) 2013-06-26
ZA200803488B (en) 2009-10-28
EP1767545A1 (en) 2007-03-28
EP2174952A2 (en) 2010-04-14
SG165414A1 (en) 2010-10-28
EP2174952A3 (en) 2010-11-17
US20110130329A1 (en) 2011-06-02
US20120238497A1 (en) 2012-09-20
PL1767545T3 (pl) 2010-04-30
HK1129121A1 (en) 2009-11-20
IL188904A0 (en) 2008-04-13
CA2619053A1 (en) 2007-04-12
EP2261245A1 (en) 2010-12-15
EP2045265B1 (en) 2012-11-21
CN101273058A (zh) 2008-09-24
HRP20100062T1 (hr) 2010-03-31
EP1926748B1 (en) 2012-08-29
DK1767545T3 (da) 2010-03-15
EP1926748A1 (en) 2008-06-04
DE602005017628D1 (de) 2009-12-24
US8431533B2 (en) 2013-04-30
JP2013099352A (ja) 2013-05-23
EA200800699A1 (ru) 2008-10-30
EP2045265A1 (en) 2009-04-08
PT1767545E (pt) 2010-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013796B1 (ru) Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам
US20220249614A1 (en) Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
EP1975176A1 (en) Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
ES2949553T3 (es) Composición para el tratamiento de la diabetes, que contiene conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y conjugado de péptido de secreción de insulina de acción prolongada
EP1972349A1 (en) GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP2552951A1 (en) Novel glucagon analogues
JP2012051894A (ja) 修飾glp−1の安定な処方剤
WO2012130866A1 (en) Novel glucagon analogues
US11130794B2 (en) Bifunctional compounds
WO2004089985A1 (en) Stable pharmaceutical compositions
AU2012202972A1 (en) GLP-1 fusion peptides, their production and use

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU