PT1767545E

PT1767545E - Polipéptidos de fusão glp-1 (péptido 1 do tipo glucagom) com resistência aumentada à peptidase

Info

Publication number: PT1767545E
Application number: PT05020718T
Authority: PT
Inventors: Peter Geigle; Christine Wallrapp; Eric Thoenes
Original assignee: Biocompatibles Uk Ltd
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2010-02-05
Also published as: KR20080064840A; ATE448247T1; SG165414A1; US8853159B2; EP1926748A1; EP1767545B1; EA013796B1; ES2394218T3; EA200800699A1; CA2619053A1; US20110130329A1; CY1109778T1; EP2174952A3; HRP20100062T1; PL1767545T3; AU2006299134B2; SI1767545T1; DE602005017628D1; EP2174952A2; EP2045265B1

Description

DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS DE FUSÃO GLP-1 (PÉPTIDO 1 DO TIPO GLUCAGOM) COM RESISTÊNCIA AUMENTADA À PEPTIDASE" A presente invenção refere-se a novos péptidos de fusão GLP-1 que possuem o terminal C estendido, são resistentes à inactivação da endopeptidase IV, podem ser expressos em níveis elevados nas células animais transformadas e são úteis, e. g., no tratamento da diabetes do tipo 2 . 0 gene do glucagom está bem estudado, ver, e. g., White, J.W. et al., 1986 Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730. A molécula de pré-pró-glucagom como uma molécula precursora de alto peso molecular é sintetizada nas células alfa pancreáticas e nas células L do jejuno e cólon. O pré-pró-glucagom é uma pró-hormona de 180 aminoácidos de comprimento e a sua sequência contém, além do glucagom, duas sequências de estrutura relacionada: péptido-1 do tipo glucagom (GLP-1) e péptido-2 do tipo glucagom (GLP-2). Na molécula de pré-pró-glucagom, entre GLP-1 e GLP-2 encontra-se uma sequência de 17 aminoácidos (ou, em vez disso, uma sequência de 15 aminoácidos mais o sítio de clivagem RR do terminal C), péptido 2 de intervenção (IP2). A sequência de IP2 (localizada entre GLP-1 e -2 na molécula precursora) é normalmente proteoliticamente clivada após o aminoácido 37 do GLP-1. A molécula de pré-pró-glucagom é, portanto, clivada em vários péptidos, dependendo da célula e do ambiente, incluindo GLP-1 (1-37), um péptido de 37 aminoácidos na sua forma não processada. De modo geral, esse processamento 1 ocorre no pâncreas e no intestino. A sequência de GLP-1 (1-37) pode ser processada adicionalmente no GLP-1 activo (7-37), na forma processada de 31 aminoácidos ou na amida de GLP-1 (7-36). Consequentemente, a designação de GLP-1(7-37) indica que o fragmento em questão compreende os resíduos de aminoácido (e incluindo) do número 7 ao (e incluindo) número 37, quando contados a partir da extremidade do terminal N do péptido de origem, o GLP-1. A sequência de aminoácido de GLP-1 (7-36) amida e de GLP-1(7-37) é fornecida na fórmula I:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I), que mostra GLP-1(7-36)amida, quando X é NH2 e GLP-1(7-37), quando X é Gly-OH. GLP-1 é uma hormona dos intestinos e é o agente insulinotrópico endógeno mais potente com acções que incluem a estimulação da actividade da adenilato ciclase e proteína cinase na célula beta. Fisiologicamente, em conjunto com o polipéptido inibidor gástrico do intestino superior, funciona como uma hormona de incretina, baixando o nível de glucose no sangue. Consequentemente, o GLP-1, segregado em resposta à ingestão de alimentos, possui, e. g., múltiplos efeitos no estômago, fígado, pâncreas e cérebro que trabalham em conjunto para regular o açúcar no sangue. Consequentemente, a amida do péptido do tipo glucagom GLP-1(7-36) e seu análogo GLP-1 (7-37) não amidado tem atraído interesse considerável devido às suas potentes açcões no metabolismo de hidratos de carbono e à sua potencial aplicabilidade para o tratamento da diabetes, incluindo diabetes do tipo 2. A diabetes do tipo 2 é caracterizada por resistência à insulina, uma vez que as células não respondem apropriadamente quando a insulina está presente. Esse é um problema mais 2 complexo que o da diabetes do tipo 1. A diabetes do tipo 2 pode passar despercebida durante anos num doente antes do diagnóstico, uma vez que os sintomas são tipicamente mais brandos (sem cetoacidose) e podem ser esporádicos. Contudo, podem resultar graves complicações da diabetes tipo 2 não percebida, incluindo falência renal e doenças das coronárias do coração. Isso leva a morbidez e mortalidade aumentadas. GLP-1 (7-36) amida ou GLP-1 (7-37) possui uma vida curta no soro. 0 péptido é clivado pela dipeptidilpeptidase iv (dpp-iv) entre os resíduos 8 e 9. 0 péptido clivado é inactivo. Assim, o GLP-1 administrado exogenamente possui uma vida extremamente curta e utilidade limitada em aplicações terapêuticas.

Foram feitas várias tentativas para sintetizar análogos estabilizados (contra DPP-IV) de GLP-1 (GLP-1 (7-37)) que ocorrem naturalmente. Especificamente, o resíduo 8 que in vivo é Ala foi substituído por outro resíduo, e.g., Gly, Ser ou Thr (Burcelin, R., et al. (1999) Metabolism 48, 252-258). 0 análogo Gly8 ou G8 foi extensivamente testado, como molécula sintetizada e produzido por linhagens de células geneticamente transformadas para segregar o polipéptido mutante (Burcelin, R., et al. (1999) Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285). Várias outras modificações foram introduzidas no GLP-1 (7-37) para melhorar sua estabilidade in vivo, sem comprometer a sua actividade biológica. Contudo, todas essas abordagens não obtiveram qualquer significado terapêutico expressivo devido aos problemas consideráveis envolvidos. 0 documento WO 02/46227 divulga proteínas de fusão GLP-1, compreendendo os compostos do tipo glucagom-1 em fusão com proteínas adequadas para estender in vivo a semi-vida dos 3 péptidos. Particularmente, o documento WO 02/46227 descreve uma proteína de fusão de GLP-1 com albumina ou imunoglobulina. De acordo com o documento WO 02/46227 estas proteínas podem ser utilizadas para tratar diabetes mellitus não dependente de insulina assim como uma variedade de outros estados. Contudo, o documento WO 02/46227 não divulga proteínas de fusão compreendendo como componente (I) GLP-1 N-terminais (7-35, 7-36 ou 7-37) ou um seu derivado como componente (II) uma sequência peptídica C terminal contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 22 (RRDFPEEVAI).

Do mesmo modo, o documento US 2003/0221201 divulga proteínas de fusão de transferrina e GLP-1. Do mesmo modo, o documento US 2003/0195154 descreve uma proteína de fusão de GLP-1 e transtiretina como parceiros de fusão. Contudo, não são divulgadas ou sugeridas outras proteínas de fusão com GLP-1 no documento US 2003/0221201 ou no documento US 2003/0195154, particularmente possíveis parceiros de fusão para GLP-1, capazes de estabilizar GLP-1 in vivo. O documento WO 99/46283 descreve um conjugado de um péptido farmacologicamente activo compreendendo uma sequência peptídica farmacologicamente activa (X), como GLP-1, e uma sequência peptídica estabilizante (Z) de 4 a 20 resíduos de aminoácidos, que estão covalentemente ligados à sequência peptídica farmacologicamente activa (X) . A sequência peptídica estabilizante (Z) pode ser, e. g., sequências Lysp-Xaaq ou Xaap-Lysq, em que p e q são inteiros no intervalo de 1 a 14, com a condição de p+q estar no intervalo de 3-15 e cada Xaa ser independentemente seleccionado do grupo consistindo em Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Arg, His, Orn, 2,4-ácido diaminobutanóico, ácido 2,3-diaminopropanóico e Met, 4 particularmente sequências péptidicas curtas das fórmulas Lys3-Glu3 ou Glu3-Lys3. o documento WO 99/46283 não divulga proteínas de fusão compreendendo como componente (I) GLP-1 N-terminal (7-35, 7-36 ou 7-37) ou um seu derivado e como componente (II) uma sequência de péptido C-terminal contendo uma sequência de acordo com a SEQ id N° 22 (RRDFPEEVAI). 0 documento WO 03/058203 divulga um péptido de GLP-1 acoplado com um terminal C estendido que proporciona estabilidade aumentada. Este terminal C estendido compreende, pelo menos, 6 aminoácidos, de um modo preferido, 7 a 9 aminoácidos. O documento WO 03/058203 não divulga proteínas de fusão com GLP-1 compreendendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 22 (RRDFPEEVAI) como um terminal C estendido. O documento US 2004/0146985 descreve uma proteína de fusão com GLP-1 (7-37) contendo múltiplas cópias do péptido GLP-1 (7-37) para produção deste agente terapeuticamente em larga escala. O documento US 2004/0146985 não divulga uma proteína de fusão com GLP-1 (7-37) compreendendo como componente (I) GLP-1 N-terminal (7-35, 7-36 ou 7-37) ou um seu derivado e como componente (II) uma sequência de péptido C-terminal contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 22 (RRDFPEEVAI). O documento US 5861284 divulga péptidos de fusão de GLP-1 (7-37) e uma sequência de aminoácidos derivada do factor de crescimento de fibroblastos no terminal C. A invenção do documento US 5861284 é particularmente dirigida para a produção de péptidos sem cisteína, produzidos por uma proteína de fusão compreendendo uma proteína possuindo cisteína na sua extremidade N-terminal e um péptido sem cisteína ligado à extremidade N-terminal e subsequentemente clivando e separando o péptido sem 5 cisteína. 0 documento US 5861284 não divulga péptidos de fusão com GLP-1 (7-37) e uma sequência peptidica contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 22 (RRDFPEEVAI).

Uma revisão de Kieffer et al. (Endocrine Revlews (1999) vol . 20, N° 6, Pgs 876-913) e uma revisão de Drucker et al. (Mol . Endocrinol. , (2003) Vol. 17 , N° 2, pgs 161- -171) divulgam a sequência de aminoácidos de pró-glucagom em que neste péptido que ocorre naturalmente, o GLP-1, IP-2 e o péptido GLP-2 estão fundidos. Não são ai divulgados outros péptidos de fusão com GLP-1 (7-37, 7-36 ou 7-35).

Além disso, uma revisão de Perry et al. (Current Alzheimer's Research, 2005, 2, 377-385) refere-se à relação entre a via do receptor GLP e a doença de Alzheimer. Não são divulgados péptidos de fusão com GLP-1 de acordo com a presente invenção em Perry et al. (2005). O documento WO 98/08871 divulga vários derivados de GLP-1, particularmente um derivado de GLP-1, em que, pelo menos, um aminoácido de GLP-1 possui um substituinte lipofilico ligado. Contudo, o documento WO 98/08871 não divulga péptidos de fusão com GLP-1 de GLP-1 (7-37, 7-36 ou 7-35) ou uma extensão peptidica do terminal C de GLP-1.

No documento WO/9953064, Thorens, B. divulga uma estratégia para criar uma cassete de expressão de GLP-1 multimérico que pode ser incorporada numa variedade de tipos de células que são linhagens de células imortalizadas, publicamente disponíveis e culturas de células primárias em divisão. Os exemplos incluem, neuroesferas sensíveis a EGF, células estaminais progenitoras neurais sensíveis a bFGF do SNC de mamíferos, enquanto o exemplo 6 trabalhado utiliza células BHK de rim de hamster bébé. É referido que as células transfectadas implantadas têm sido utilizadas para tratar murganhos diabéticos com sucesso, permitindo o controlo da glucose substancialmente equivalente aos controlos não diabéticos. Contudo, estas técnicas não se adequam aos requisitos de um tratamento a ser administrado rotineiramente aos doentes com diabetes.

Outra abordagem para estabilizar exogenamente o nível de glucose baseia-se numa nova classe de medicamentos conhecidos como miméticos de incretina sob investigação para o tratamento do diabetes do tipo 2. Exenatido (Byetta®) é uma versão sintética de um composto natural encontrado na saliva do género de lagarto venenoso do deserto. Em experiências clínicas, um mimético de incretina (exenatido) demonstrou reduções no açúcar do sangue e aperfeiçoamentos nos marcadores da função da célula beta. Contudo, o exenatido exibe apenas determinados efeitos do péptido-1 do tipo glucagom (GLP-1).

Em resumo, actualmente, não existe terapia eficiente disponível para a diabetes do tipo 2, que permita baixar o nível de glucose no sangue com base no GLP-1, em outras palavras, para proporcionar uma terapia que reflita todo o espectro de efeitos benéficos conhecidos do GLP-1, e. g., a sua actividade nas concentrações fisiológicas para reduzir potencialmente a taxa de entrada de nutrientes na circulação por uma redução da taxa de esvaziamento gástrico em indivíduos obesos ou sua actividade de estimulação da insulina. Portanto, é um objetivo da presente invenção proporcionar moléculas de péptido com base em GLP-1 que são biologicamente activas e resistentes em relação à degradação proteolítica. 7 A presente invenção refere-se a um péptido de fusão compreendendo como componente (I) N-terminal (i) GLP-1 (7-37) de SEQ ID N°: 1 ou uma sequência funcional que exerce os efeitos biológicos de GLP-1 como a hormona incretina, a sua acção antiapoptótica ou as suas actividades neurotróficas e possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com GLP-1 (7-37), ou (ii) um péptido GLP-1 modificado consistindo na sequência de aminoácidos da fórmula II: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxilico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclo pentil)carboxilico, ácido (1-aminociclo-hexil)carboxilico, ácido (1-aminociclo-heptil)carboxilico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxilico; Xaal6 é Vai ou Leu; Xaal8 é Ser, Lys ou Arg; Xaal9 é Tyr ou Gin; Xaa20 é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg; Xaa25 é Ala ou Vai; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa27 é Glu ou Leu; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa33 é Vai ou Lys; Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Gly ou Lys ou amida ou ausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida ou está ausente, e como componente (II) C-terminal uma sequência peptídica de, pelo menos, 9 aminoácidos e contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 22 (RRDFPEEVAI) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com SEQ ID N°: 22, e proporcionado uma resistência melhorada a inactivação de DPP-IV do péptido de fusão, em que o terminal N do péptido de fusão é o componente (I) como tal ou uma sequência de péptido sinal, que é fundida através de uma sequência de clivagem de protease com o terminal N do componente (I), ou um péptido sinal, que é fundido sem a sequência de clivagem de protease entre o terminal N do componente (I), ou uma sequência lider, que é fundida através de uma sequência de clivagem de protease com o terminal N do componente (I), em que o péptido sinal e a sequência lider são heterólogos em relação ao pré-pró-glucagom.

De um modo preferido, a presente invenção refere-se a um péptido de fusão como definido acima, em que o componente (I) é GLP-1 (7-35) ou GLP-1 (7-36). A presente invenção baseia-se na observação de que o péptido resultante da invenção é protegido contra a degradação proteolítica in vi vo, principalmente devido à actividade proteolitica da endopeptidase IV. 0 péptido da invenção possuindo, pelo menos, dois componentes (I) e ( II), como definido acima, exibe actividade biológica de GLP-1 e, 9 simultaneamente, confere estabilidade ao GLP-1 como seu componente (I) por um alongamento do terminal C. 0 termo "péptido da invenção", como aqui utilizado, é um péptido de fusão conforme definido aqui, uma variante, um análogo, um fragmento ou um seu derivado, incluindo combinações, e. g., um fragmento derivado, análogo ou variante de um péptido de fusão. 0 termo "péptido GLP-1" como aqui utilizado significa GLP-1 (7-35, 36 ou 37), enquanto que "péptido GLP-1 modificado" pretende significar qualquer análogo de GLP-1, um derivado de GLP-1, uma variante de GLP-1 ou um fragmento de GLP-1, incluindo um fragmento derivado, análogo ou variante de GLP-1 (7-35, 36 ou 37), que pode ocorrer tanto no componente (I) como no (III) do péptido da invenção. 0 termo "péptido GLP-2" como aqui utilizado significa GLP-2 (1-33, 34 ou 35), considerando-se que "péptido GLP-2 modificado" significa qualquer análogo de GLP-2, fragmento ou variante, um derivado de GLP-2 ou um derivado de análogo de GLP-2, incluindo um fragmento derivado, análogo ou variante de GLP-2(1-33, 34 ou 35). Variantes, análogos, fragmentos e derivados são categorizados como modificações da sequência não modificada, e. g., GLP-1 (7-35, 36 ou 37) ou GLP-2 (1-33, 34 ou 35) . Dentro do significado da presente invenção qualquer variante, análogo, fragmento ou derivado tem de ser funcional, e. g., precisa exercer os mesmos efeitos biológicos ou semelhantes ao péptido GLP-1 não modificado. 0 péptido da invenção é um péptido de fusão, como definido acima ou uma variante, análogo, fragmento ou seu derivado, em que o componente (I) pode conter uma sequência possuindo, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 85% e de um modo muito preferido, pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID N° 1. A SEQ ID N° 1 representa a sequência de 10 aminoácidos nativa de GLP-1 (7-37) (comprimento de 31 aminoácidos) que é estritamente conservada entre os mamíferos. 0 segundo componente (componente (II)), como definido acima, do péptido de fusão de acordo com a invenção, contém tipicamente uma sequência peptídica que forma uma estrutura de tipo volta β. Uma estrutura de volta β é um elemento de estrutura secundária típico de proteínas ou péptidos. É tipicamente formada por quatro aminoácidos, que revertem a direcção da cadeia de estrutura da proteína ou do péptido. A sequência de aminoácidos do componente (II) contém, pelo menos, nove aminoácidos e contém, pelo menos, um resíduo de prolina ou alanina na sua sequência. Os resíduos de prolina são aminoácidos comuns dentro da sequência de aminoácidos tetramérica que forma uma volta β. 0 resíduo de prolina localiza-se de modo geral e tipicamente na posição 2 ou 3, de um modo preferido 2, da sequência de volta β tetramética que ocorre no componente (II) do péptido de fusão.

Como definido acima, no péptido de fusão da invenção, o componente (II) é uma sequência peptídica contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 22 (RRDFPEEVAI) (todas as sequências peptídicas são apresentadas no código de uma letra) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação à sequência SEQ ID N°: 22. A SEQ ID N°: 22 é uma sequência parcial da sequência IP-2 de comprimento total (péptido de intervenção 2), que contém os 10 aminoácidos do terminal N da sequência IP-2 de comprimento total de 15 aminoácidos. A IP-2 é um exemplo preferido de uma sequência peptídica contendo volta β. Consequentemente, outras sequências mais preferidas que estão contidas no componente (II) são sequências de aminoácido 11 parcial de IP-2 mais longas, tais como a sequência de 14 aminoácidos de terminal N que ocorre nos seres humanos (SEQ ID N°: 23 (RRDFPEEVAIVEEL)) ou sua contraparte de murino (SEQ ID N°: 24 (RRDFPEEVAIAEEL) ) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação às SEQ ID N°: 23 ou 24. São mais preferidas como elementos contidos no componente (li) do péptido de fusão, as sequências IP-2 de comprimento total possuindo 15 aminoácidos da sequência IP-2 que ocorre naturalmente (SEQ ID N°: 2 (RRDFPEEVAIVEELG), humana, ou SEQ ID N°: 3 (RRDFPEEVAIAEELG), murino) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação às sequências SEQ ID N°: 2 ou 3. Dentro do âmbito da presente invenção estão também todas as isoformas de mamíferos de IP2 (variantes naturais de IP2 entre os mamíferos). Pode ser proporcionada mais de uma cópia de uma sequência a ser incluída no componente (II), e. g., 2, 3 ou mesmo mais cópias de IP2 ou um fragmento, variante, análogo ou derivado de IP2.

Consequentemente, é preferido um péptido de fusão da invenção, contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), í. e., GLP-1(7-37) ligado sem qualquer sequência ligante através de seu terminal C ao IP2 de murino ou de acordo com a SEQ ID N°: 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) , í. e., GLP-1(7-37) ligado sem qualquer sequência ligante através de seu terminal C ao IP2 humano. Variantes, análogos ou fragmentos da mesma possuindo uma identidade em relação à sequência de, pelo menos, 80% com as SEQ ID N°: 8 e 12 ou derivados das mesmas são também englobados.

Sem estar limitado por qualquer teoria, é concluído pelo requerente da presente invenção que a instabilidade de 12 GLP-1(7-35, 36 ou 37), se administrado a qualquer doente que precise do mesmo, deve-se à sua estrutura tridimensional não protegida. As proteases podem clivar o péptido GLP-1 (7-35, 36 ou 37) e abolir sua actividade fisiológica rapidamente in vivo. Por ligação de uma sequência peptidica ao terminal C de GLP-1 (7-35, 36 ou 37) a sua estrutura ganha estabilidade com relação à degradação enzimática. 0 ganho em estabilidade parece ser melhorado, se a sequência peptidica de terminal C adicional (estando contida no componente (II) do péptido de fusão de acordo com a invenção) dobrar de volta devido à presença de um elemento estrutural de volta β, formado pela sua estrutura primária e proporcionando rigidez ao componente (II) . Foi verificado que o péptido de fusão da invenção, em virtude de sua extensão de péptido de terminal C, contendo de um modo preferido um elemento estrutural volta β, possui resistência melhorada em relação à inactivação de DPP-IV. 0 péptido de terminal C ou não é clivado da sequência de GLP-1 (7-35, 36 ou 37) antes de actuar no seu receptor nas células-alvo ou pode ser clivado enzimaticamente para formar GLP-1 (7-35, 36 ou 37) in vivo.

Independente da forma exacta do péptido da invenção ligado no sítio do receptor GLP-1, um péptido da invenção exerce a sua função como um composto insulinotrópico activo.

As sequências peptídicas, que são consideradas como sendo apropriadas para serem contidas no componente (II) devido à estrutura primária que forma um elemento de volta β podem prontamente ser identificadas por métodos adequados, e. g., espectroscópicos, e. g., dicroismo circular ou outros métodos conhecidos de um especialista na técnica. 0 componente (II) e o componente (I) podem ser ligados diretamente ou ligados através de uma sequência ligante. De um 13 modo preferido, ambos os componentes são ligados diretamente um ao outro. No caso deles serem ligados através de um ligante (ou espaçador), o ligante é, de um modo preferido, um ligante peptidico ou um ligante orgânico. Um ligante peptidico possui tipicamente um comprimento de 1 a 10 aminoácidos, de um modo preferido 1 a 5, de um modo muito preferido 1 a 3 aminoácidos, em alguns casos a sequência ligante pode ser mesmo mais longa compreendendo 11 a 50 aminoácidos. Um ligante peptidico pode ser composto por várias sequências de aminoácido. De um modo preferido, um ligante peptidico introduzirá alguma flexibilidade estrutural entre os componentes a serem ligados. A flexibilidade estrutural é alcançada, e. g., possuindo um ligante peptidico contendo vários resíduos de glicina ou prolina, de um modo preferido, pelo menos, 30%, de um modo mais preferido, pelo menos, 40% e de um modo muito preferido, pelo menos, 60% de resíduos de prolina e glicina dentro da sequência ligante. Independente da sequência específica, o ligante peptidico pode ser, de um modo preferido, imunologicamente inactivo.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, um péptido da invenção, i. e., um péptido de fusão ou seus análogos, fragmento, variantes ou derivados, contém um terceiro componente (componente (III)) que é ligado ao terminal C do componente (II). 0 acoplamento pode ser direto ou indireto através de uma sequência ligante. Em relação à sequência ligante, ela é referida na descrição acima para um ligante ligando o componente (I) e o componente (II) . De modo geral, o componente (III) compreende, pelo menos, quatro resíduos de aminoácido, de um modo preferido, pelo menos, 10 resíduos de aminoácido adicionais, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 ou, pelo menos, 30. Em termos funcionais, o componente (III) é proporcionado para melhorar adicionalmente a estabilidade do 14 péptido de fusão da invenção. Espera-se que o componente (III) não interfira com a função biológica do péptido de fusão da invenção que é aproximadamente comparável à actividade biológica de GLP-1(7-37) .

De um modo preferido, o componente (III) do péptido de fusão da invenção compreende, pelo menos, 4, de um modo preferido, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 resíduos de aminoácidos adicionais da sequência de terminal N de uma isoforma de GLP-2 de qualquer organismo mamífero (outra variante de GLP-2 que ocorre naturalmente entre os mamíferos), e. g., isoformas de murino ou seres humanos, conforme mostrado nas SEQ ID N°: 4 e 5. GLP-2 ocorre no pró-glucagom e também está envolvido no mebabolismo do carboidrato. Como com a sequência biologicamente activa incluída no componente (I) (péptido GLP-1), o componente (III) também pode compreender análogos, variantes ou derivados de formas de GLP-2 ocorrendo naturalmente. Alternativamente, o componente (III) também pode compreender, pelo menos, 4, de um modo preferido, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 resíduos de aminoácido adicionais da sequência de terminal N de GLP-1(7-37), correspondentemente incluindo todas as isoformas de mamíferos ou - conforme descrito aqui - todas as variantes funcionais, análogos ou derivados do mesmo. De modo geral, o componente (III) pode conter qualquer forma de um péptido GLP-1 ou um péptido GLP-1 modificado, que é divulgada aqui como apropriada para o componente (I) do péptido de fusão da invenção. Numa alternativa adicional, o componente (III) também pode conter formas quiméricas de GLP-1 (7-37) e GLP-2. Uma forma quimérica pode ser produzida por acoplamento de GLP-1 (7-37) e GLP-2 (ou fragmentos, análogos, variantes ou derivados de ambos) um com o outro e por introdução subsequente dessa 15 forma quimérica como o componente (III) no péptido da invenção. De um modo preferido, a forma quimérica é composta por uma sequência parcial de GLP-1 (7-37) e uma sequência parcial de GLP-2 ligadas. E.g., a forma quimérica pode incluir os 5 a 30 aminoácidos do terminal N de de GLP-1 e os 5 a 30 aminoácidos do terminal C de GLP-2 ou vice-versa, e.g., aminoácidos 7 ou 8 a 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 de GLP-1 (7-37) e sequência de aminoácidos da posição 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 ou 24 até, e. g., o terminal C de GLP-2.

Se as modificações das formas de GLP-2 ou GLP-1 (7-37) que ocorrem naturalmente, forem utilizadas, respectivamente, como o componente (III), o componente (III), de um modo preferido, contém a sequência da SEQ id N°: 4 ou 5 ou SEQ id N°: 1, respectivamente, ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação à sequência SEQ ID N°: 4 ou 5 ou SEQ ID N°: 1. Derivados dessas sequências preferidas, e. g., devido às modificações de cadeia lateral ou modificações de estrutura de péptido, etc. (conforme descrito aqui com relação aos "derivados"), também são englobados como o componente (III) da presente invenção.

Noutra forma de realização, o componente (III) pode conter várias sequências conforme descrito acima. E. g., o componente (III) pode conter, pelo menos, duas, de um modo preferido 2, 3 ou 4 cópias de GLP-1 (7-37) e/ou GLP-2 ou, pelo menos, duas cópias de sequências possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação à sequência SEQ ID N°: 1, 4 ou 5. Também o componente (III) pode conter mais de uma cópia de uma versão quimérica de GLP-1 (7-37) ou GLP-2, conforme descrito acima, e.g., formando eventualmente uma combinação de versão(ões) quimérica(s) em conjunto com GLP-1 (7-37) e/ou GLP-2 ou suas modificações, com, 16 pelo menos, 80% de identidade de sequência. Dentro do âmbito da presente invenção também se encontram dois ou mais, de um modo preferido dois componentes (III), que podem ser, e. g., (1) ligados pelo seu terminal N ao terminal C do componente (II) através de um ligante ou diretamente. Se forem proporcionados dois componentes (III) eles poderão ser idênticos ou diferentes.

Consequentemente, péptidos de fusão da invenção contendo três componentes (I), (II) e (III) são particularmente preferidos. Quatro formas de realização especificas contendo todos esses componentes são selecionadas de um grupo consistindo em: SEQ ID N° 6 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP-1(7-37)-C, também aqui denominado CMl de murino), SEQ ID N° 7 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP2-C, também aqui denominado CM2 de murino), SEQ ID N° 10 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-1(7-37)-C, também aqui denominado CMl humano) e SEQ ID N° 11 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-2-C), também aqui denominado CM2 humano) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação à sequência SEQ ID N° 6, 7, 10, ou 11 ou um derivado da mesma. Todas as sequências 6, 7, 10 e 11 contêm um ligante RR (dois resíduos de arginina) no terminal C de IP2 (componente (II)), que pode ser alternativamente descartado. O componente (I) em cada uma das formas de realização de acordo com as SEQ ID N°: 6, 7, 10 ou 11 é GLP-l(7-37), considerando-se que o componente (III) é GLP-l(7-37) ou GLP-2.

Os péptidos de fusão da invenção, ou um seu componente, podem ocorrer em várias formas modificadas. Essas formas modificadas são divulgadas a seguir e descritas em maior detalhe. O termo "sais" refere-se aqui a ambos, os sais dos grupos 17 carboxilo e aos sais de adição de ácido dos grupos amino dos péptidos de fusão descritos acima ou análogos, fragmentos, derivados ou variantes dos mesmos. Sais de um grupo carboxilo podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, e. g., sais de sódio, cálcio, amónio, ferro ou zinco e semelhantes e sais com bases orgânicas como aqueles formados, e. g., com aminas, tais como, etanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaina e semelhantes. Os sais de adição ácidos incluem, e. g., sais com ácidos minerais, tais como, e. g., ácido clorídrico ou ácido sulfúrico e sais com ácidos orgânicos, tais como, e. g., ácido acético ou oxálico. Naturalmente, qualquer desses sais deve reter a actividade biológica dos péptidos da invenção relevantes para a presente invenção, i. e., a capacidade de reduzir a taxa de entrada de nutrientes na circulação. Conforme descrito a seguir, as formas de péptido de sal podem estar contidas numa formulação farmacêutica.

Um "fragmento" de um péptido de fusão, de acordo com a presente invenção, refere-se a qualquer subconjunto de moléculas, isto é, um péptido mais curto que mantém a actividade biológica desejada. Os fragmentos podem ser preparados prontamente por remoção dos aminoácidos da extremidade da molécula e teste do resultante quanto às suas propriedades como uma incretina. As proteases para remoção de um aminoácido de cada vez, tanto na extremidade do terminal N e/ou terminal C de um polipéptido, são conhecidas e assim os fragmentos determinantes que retêm a actividade biológica desejada envolvem apenas experimentação de rotina. Conclusivamente, os fragmentos podem ser devidos a deleções de aminoácidos nos terminais do péptido e/ou de aminoácidos posicionados dentro da sequência de péptido. 18 variante

Uma "variante" de acordo com a presente divulgação refere-se a uma molécula que é substancialmente semelhante tanto ao péptido de fusão da invenção completo definido acima quanto a um fragmento do mesmo. Péptidos variantes podem ser convenientemente preparados por síntese química directa do péptido variante, utilizando métodos bem-conhecidos na técnica. Naturalmente, tal variante de um péptido de fusão da invenção teria actividade antidiabética semelhante, e. g., de actividade de estimulação da insulina como o péptido de GLP-1 correndo naturalmente correspondente.

Alternativamente, as variantes de sequência de aminoácido dos péptidos de fusão definidos acima podem ser preparadas por mutações nos ADN que codificam derivados sintetizados. Tais variantes incluem, e. g., deleções ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácido. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode também ser feita para se chegar à construção final, contanto que a construção final possua a actividade desejada. Obviamente, as mutações que serão feitas na codificação do ADN do péptido variante não devem alterar a grelha de leitura e, de um modo preferido, não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de ARNm secundária.

Um "análogo" dos péptidos de fusão definidos acima, refere-se a uma molécula não natural que é substancialmente semelhante tanto à molécula completa quanto a um fragmento activo da mesma. Tal análogo exibiria a mesma actividade que o correspondente péptido GLP-1 que ocorre naturalmente.

Os tipos de substituições que podem ser feitas no péptido 19 de fusão da invenção ou um seu componente, podem basear-se na análise das frequências de alterações de aminoácidos entre uma proteina/péptido homólogo de espécies diferentes. Com base nessa análise, as substituições de conservação podem ser definidas aqui como trocas dentro de um dos cinco grupos que se seguem: I. Resíduos pequenos, alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gin; III. Resíduos polares, carregados positivamente: His, Arg, Lys; iv. Resíduos grandes, alifáticos, não polares: Met, Leu, He, Vai, Cys; V. Resíduos aromáticos, grandes: Phe, Try, Trp.

Dentro dos grupos precedentes, são consideradas as substituições que se seguem como sendo "altamente conservadoras": Asp/Glu; His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/lle/Val. Substituições semiconservadoras são definidas como sendo as trocas entre dois dos grupos (I)-(IV) acima que são limitados ao supergrupo (A), compreendendo (I), (II) e (III) acima, ou ao grupo (B), compreendendo (IV) e (V) acima. As substituições não estão limitadas aos aminoácidos geneticamente codificados ou mesmo que ocorrem naturalmente.

Em geral, os análogos ou variantes do péptido de fusão da invenção, ou seus componentes, também podem conter substituições de aminoácido feitas, e. g., com a intenção de melhorar a solubilidade (substituição de aminoácidos hidrófobos com aminoácidos hidrófilos). Numa forma de realização das variantes/análogos do péptido GLP-1 do péptido da invenção (ocorrendo no componente (I) e/ou (III) do péptido da invenção) o péptido (modificado) GLP-1 é caracterizado por uma ou mais substituições) nas posições 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 20 27, 30, 33, 34, 35, 36, ou 37 do péptido GLP-1. Como um exemplo da nomenclatura que se segue [Arg34-GLP-1 (7-37)] designa um análogo de GLP-1 onde a lisina que ocorre naturalmente na posição 34 foi substituída por arginina.

Especificamente, o componente (I) e/ou (111) de um péptido de fusão da invenção pode compreender variantes e análogos de GLP-1 (7-35, 36 ou 37) seleccionados de, Gln9-GLP-1 (7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), acetil-Lys9-GLP-l (7-37), Thr16-Lysl8-GLP-1 (7-37), e Lysl8-GLP-1 (7- 37), Arg34-GLP-1 (7-37), Lys38-Arg26-GLP-1 (7-38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1 (7-36), Arg26,34-Lys38-GLP-l (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-l(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-l (7-38), Arg26,34-Lis38-GLP-l (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-l (7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38), Ala37-Lys38-GLP-1 (7-38), e Lys37-GLP-1 (7-37).

Noutra forma de realização da invenção, o péptido de fusão da invenção contém como o componente (I) ou (III) um péptido GLP-1 modificado compreendendo a sequência de aminoácido da seguinte fórmula II:

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-

Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-

Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3- piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é

Alai Gly, Vai, Leu, He, Lys, Aib, ácido carboxílico (1-aminociclopropilo), ácido carboxílico (1-aminociclobutilo), 21 ácido carboxílico (1-aminociclopentilo), ácido carboxilico (1-aminociclo-hexilo), ácido carboxilico (1-aminociclo-heptilo), ou ácido carboxilico (1-aminociclooctilo), em que Gly é especificamente preferido; Xaal6 é Vai ou Leu; Xaal8 é Ser, Lys ou Arg; Xaal9 é Tyr ou Gin; Xaa20 é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg; Xaa25 é Ala ou Vai; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa27 é Glu ou Leu; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa33 é Vai ou Lys; Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Gly ou Lys ou amida ou ausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida ou está ausente.

Noutra forma de realização da invenção, o componente (I) e/ou (III) do péptido de fusão da invenção contém um péptido GLP-1 modificado compreendendo a sequência de aminoácido da seguinte fórmula III:

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-

Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-

Xaa35-Xaa36-Xaa37, em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, -hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil- histidina, a-flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3- piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é

Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido carboxilico (1-aminociclopropilo), ácido carboxilico (1-aminociclobutilo), ácido carboxilico (1-aminociclopentilo), ácido carboxilico (1-aminociclo-hexilo), ácido carboxilico (1-aminociclo-heptilo), ou ácido carboxilico (1-aminociclooctilo); Xaal8 é Ser, Lys ou Arg; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg;

Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa34 é Lys, Glu ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg ou Lys, amida ou 22 está ausente; Xaa37 é Gly, Ala, GIu ou Lys, amida ou está ausente.

Numa forma de realização especificamente preferida da invenção o componente (I) e/ou (III) do péptido de fusão da invenção contém um péptido GLP-1 (modificado), que é selecionado de GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-amida, GLP-1 (7-37). Também são preferidos os péptidos da invenção compreendendo nos seus componentes (I) e/ou (III) um péptido GLP-1 modificado possuindo um resíduo Aib na posição 8 ou um resíduo de aminoácido na posição 7 do péptido GLP-1, que é selecionado do grupo consistindo em D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-fluormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina e 4-piridilalanina.

Exemplos de produção de substituições de aminoácido nas proteínas que podem ser utilizadas para obtenção de análogos para utilização na presente invenção incluem quaisquer etapas de método conhecidas, tais como as apresentadas nas Patentes U.S. RE 33653; 4959314; 4588585 e 4737462 de Mark et al.; 5116943 de Koths et al.; 4965195 de Namen et al.; e 5017691 de Lee et al. e proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente U.S. 4904584 (Shaw et al.). A variante ou análogo, conforme definido acima e contido no componente (I), (II) e/ou (III), terá uma sequência de núcleo, que é a mesma que aquela da sequência "nativa", e. g., GLP-1 (7-37) ou GLP-2 ou fragmento biologicamente activo dos mesmos ou qualquer isoforma IP2, que possui uma sequência de aminoácidos possuindo, pelo menos, 80% de identidade em relação à sequência de aminoácido nativa e mantém a actividade biológica da mesma. 23

De um modo mais preferido, pelo menos, 90% de identidade, ou de um modo muito preferido, pelo menos, 95% de identidade em relação à sequência nativa. Quando um péptido especifico possui uma percentagem de identidade especifica em relação a um polipéptido de referência de um comprimento definido, a percentagem de identidade é relativa ao péptido de referência. Assim, um péptido que é 50% idêntico a um polipéptido de referência que possui 100 aminoácidos de comprimento pode ser um polipéptido de 50 aminoácidos que é completamente idêntico a uma porção de 50 aminoácidos de comprimento do polipéptido de referência. Ele também pode ser um polipéptido de 100 aminoácidos de comprimento, que é 50% idêntico ao polipéptido de referência por todo seu comprimento. Naturalmente, outros polipéptidos satisfarão os mesmos critérios. O termo "identidade da sequência" como aqui utilizado, significa que as sequências são comparadas como se segue. As sequências são alinhadas utilizando a Versão 9 do Genetic Computing Group's GAP (programa de alinhamento global), utilizando a matriz de padrão (BLOSUM62) (valores -4 a +11) com uma penalidade de intervalo de -12 (para o primeiro nulo de um intervalo) e uma penalidade de extensão de intervalo de -4 (para cada nulo consecutivo adicional no intervalo). Após o alinhamento, a percentagem de identidade é calculada por expressão do número de combinações como uma percentagem do número de aminoácidos na sequência reivindicada.

Derivados de um péptido de fusão ou um análogo, fragmento ou variante do mesmo são também englobados pela presente invenção. O termo "derivados" de um péptido de fusão da invenção pretende incluir apenas aqueles péptidos da invenção modificados que não alteram um aminoácido em outro dos vinte aminoácidos naturais que ocorrem naturalmente. Correspondentemente, um 24 aminoácido geneticamente codificado pode ser modificado por reacção do mesmo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reacção com cadeias laterais selecionadas de resíduos ou grupos amino ou carboxilo de resíduos terminais (de um modo preferido, por modificação covalente) ou por introdução de aminoácidos não naturais (fabricados por síntese química, i. e., isómeros D dos aminoácidos codificados pelo código genético, Aib (a-ácido aminoisobutírico), Abu (a-ácido aminobutírico), Tie (terc-butilglicina), p-alanina, ácido 3-aminometilbenzóico, ácido antranílico) ou aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, e. g., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alalina e D-glutamina ou por uma modificação da estrutura do péptido por disposições alternativas da estrutura do péptido.

Nas modificações preferidas que se seguem, os aminoácidos do péptido de fusão da invenção (que - conforme definido acima -também compreendem variantes, análogos do péptido de fusão) são descritos, os quais podem ocorrer num péptido de fusão da invenção em qualquer lugar (qualquer aminoácido), e. g., posicionado no componente (I), (II) e/ou (III).

Os resíduos de cisteinilo, se estiverem presentes em qualquer forma de um péptido de fusão da invenção, e. g., um análogo de um péptido de fusão da invenção, mais comumente são reagidos com alfa-haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como, ácido cloroacético ou cloroacetamida, para fornecer derivados de carboxiemetilo ocarboxiamidometilo. Os resíduos de cisteinilo também são derivados por reacção com bromotrifluoracetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidazoil)propió-nico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, persulfureto de 3-nitro-2-piridila, persulfureto de metil-2-piridila, 25 p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol.

Resíduos de histidilo num péptido de fusão da invenção podem ser derivados por reacção com procarbonato de dietilo em pH 5,5-7,0 por esse agente ser relativamente específico para a cadeia lateral de histidilo. Brometo de parabromofenacilo também é útil; a reacção é, de um modo preferido, realizada em cacodilato de sódio a 0,1 M em pH 6,0. Especif icamente, o resíduo de histidina de terminal N (His7) de GLP- 1(7-37) quando contido no componente (I) e/ou (III) do péptido de fusão da invenção é muito importante para a actividade insulinotróica dos péptidos de GLP-1, conforme mostrado por Suzuki et al. (Diabetes Res.; Clinicai Practice 5 (Sup. 1): S30 (1988)). Correspondentemente, o péptido de fusão da invenção pode ser modificado no His7 de seu GLP-1 como parte do componente (I) e/ou (III) pelos grupos alquila ou acila (C1-C6) ou substituição de His por estruturas de anel C5-C6 de funcionalidade equivalente. Uma modificação preferida é a introdução de uma porção hidrófoba no terminal amino de His ou sua cadeia lateral histidila. 0 lisinilo e resíduos de terminal amino de um péptido de fusão da invenção podem ser, e. g., reagidos com ácido succinico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivação com esses agentes possui o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Por modificações de acilo (C12-C18) do grupo épsilon-amino do(s) resíduo(s) de lisina no péptido de fusão da invenção, a sua semi-vida em circulação é aumentada. Os resíduos de arginilo podem ser, e. g., modificados por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal; e ninidrina. A derivação dos resíduos de arginina requer que a 26 reacção seja realizada nas condições alcalinas de pKa alto do grupo funcional de guanidina. Adicionalmente, esses reagentes podem interagir com os grupos de lisina, bem como o grupo épsilon-amino de arginina. A modificação específica dos resíduos de tirosilo per se foi estudada extensivamente. Mais geralmente, N-acetilimidazol e tetranitrometano podem ser utilizados para formar espécies O-acetil tirosilo e derivados e-nitro, respectivamente.

Grupos carboxilo laterais (aspartilo ou glutamilo) podem ser seletivamente modificados por reacção com carbodiimidas (R'N-C-N-R'), tais como, l-ciclo-hexil-3-[2-morfolinil-(4-etil)]cardodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)car- bodiimida.

Adicionalmente, resíduos de aspartilo e glutamilo podem ser convertidos em resíduos de asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões amónia.

Resíduos de glutaminilo e asparaginilo podem ser desaminados nos resíduos de glutamilo e aspartilo correspondentes. Alternativamente, esses resíduos podem ser desaminados sob condições ácidas moderadas. Cada forma desses resíduos se encontra dentro do âmbito desta invenção. Péptidos de fusão da invenção desaminados podem sofrer uma susceptibilidade alterada à proteólise com enzimas de protease ou peptidase, sugerindo que a desaminação pode ter significado fisiológico no direcionamento da clivagem proteolítica de um péptido de fusão da invenção. É observado que os péptidos de fusão biossintéticos da invenção podem degradar-se sob determinadas condições de armazenamento, resultando em 27 desaminação numa ou mais posições do péptido de fusão da invenção. Resíduos de metionina nos péptidos de fusão da invenção podem ser suscetíveis à oxidação, principalmente ao sulfóxido. Como os outros derivados mencionados acima, ambos os péptidos da invenção desamida e/ou péptidos da invenção sulfóxido podem ser utilizados para exibir actividade biológica plena.

Outros reagentes apropriados para derivação de resíduos contendo aminoácido alfa incluem imidoésteres, tais como, picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; clorobromoidreto; ácido trinitrobenzenossulfónico; O-metiliosureia; 2,4-pentanodiona e reacção catalisada de transaminase com glioxilato.

Os resíduos de aminoácido terminais de um péptido de fusão da invenção com seus grupos carboxilo (terminal C) e amina (terminal N) (bem como grupos carboxilo ou de cadeia lateral de ácido aminoácido, ver acima) podem estar presentes na sua forma protegida e/ou não protegida (e. g., o terminal C por um grupo amida), utilizando grupos de proteção amino ou carboxilo apropriados. Também, os sais de adição de ácido do péptido de fusão da invenção podem ser proporcionados. Sais de adição de ácido comuns são sais de ácidos halídricos, i. e., HBr, Hl ou de um modo mais preferido, HC1. PEGilação de grupos carboxila de cadeia lateral ou terminal ou o grupo de épsilon-amino da lisina que ocorre no péptido de fusão da invenção, confere resistência à oxidação e também está dentro do âmbito da presente invenção.

Outras modificações que resultam nos derivados dos péptidos 28 de fusão da invenção baseiam-se nos hidratos de carbono e/ou lípidos que podem ser covalentemente acoplados ao péptido de fusão da invenção. É preferido acoplar lipidos e/ou hidratos de carbono à serina, treonina, asparagina, glutamina ou tirosina ou glutamato ou aspartato através das porções de cadeia lateral reactivas. Alternativamente, os hidratos de carbono e/ou lipidos podem também ser ligados às porções terminais do péptido de fusão da invenção. Adicionalmente, um péptido de fusão da invenção pode ser acoplado a um péptido funcionalmente diferente, que pode também estabilizar o péptido de fusão da invenção e/ou pode servir para melhorar as propriedades de transporte de um péptido de fusão da invenção em fluidos corporais, especificamente sangue. Os péptidos de fusão ou proteínas apropriados podem ser seleccionados, e. g., da

Albumina, Transferrina, etc., que são diretamente acoplados (como componente IV) ao péptido de fusão da invenção ou através de um péptido ou sequência ligante orgânica. De um modo preferido, esses péptidos ou proteínas são ligados a um dos terminais do péptido de fusão da invenção.

De modo a contornar o problema de degradação do péptido de fusão da invenção, pode ser proporcionado um isómero retroinverso do péptido de fusão da invenção, composto de aminoácidos D ou, pelo menos parcialmente, composto de aminoácidos D. 0 termo "isómero retroinverso" refere-se a um isómero de um péptido linear em que a direção da sequência é revertida e a quiralidade do resíduo de cada resíduo de aminoácido é invertida (ver, e. g., Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)). Em relação ao péptido de origem, o péptido retroinverso é montado na ordem reversa dos aminoácidos, tipicamente com derivados de aminoácidos F-moc. Tipicamente, os péptidos brutos podem ser 29 purificados por HPLC de fase reversa.

Outras modificações, que podem ser introduzidas nos péptidos de fusão da invenção referem-se às modificações da estrutura do péptido. De um modo preferido, os péptidos da invenção modificados são construções miméticas. A sua estrutura é diferente da estrutura que ocorre naturalmente, embora as suas estruturas de cadeia lateral sejam idênticas aos péptidos de fusão da invenção ou suas variantes, derivados ou análogos. Em geral, construções miméticas exibem uma modificação de um ou mais dos elementos da cadeia de estrutura (NH, CH, CO), tanto como substituição (de um modo preferido) ou como uma inserção. Substituintes são, e. g., (I) -0-, -S-, ou -CH2- em vez de -NH-; (ii) -N-, c-Aquil-, ou -BH- em vez de -chr- e (ui) -CS-, -ch2-, -S0n-, -P=0(0H)-, ou -B(OH)- em vez de -CO-. Um mimético de péptido de um péptido de fusão da invenção pode ser uma combinação de cada uma dessas modificações. Especificamente, as modificações de cada um dos grupos I, II e ΙΙΙ podem ser combinadas. Num mimético de péptido, cada elemento de cadeia de estrutura pode ser modificado ou alternativamente, apenas um determinado número de elementos de cadeia pode ser alterado para uma porção que não ocorre naturalmente. De um modo preferido, todos os elementos da cadeia de estrutura de um péptido de fusão da invenção de cada um de -NH-, -CHR- ou CO são alterados noutro grupo que não ocorre naturalmente. No caso da ligação amida (-NH-C0-) do péptido de fusão da invenção a estrutura é substituída (em toda a molécula ou, pelo menos, numa posição simples), de um modo preferido, as porções de substituição são bioisoestéricas, e. g., ligações de amida retroinversa (-C0-NH-), hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), alceno (CH2=CH-), carba (CH2-CH2-) e/ou -P=0 (OH)-CH2-) . Alternativamente, o alongamento da cadeia de estrutura pelas inserções pode ocorrer numa 30 construção mimética do péptido de fusão da invenção, e. g., porções flanqueando o átomo de carbono alfa. Noutro lado do átomo de carbono alfa, pode ser inserido e. g., -0-, -S-, -CH, -NH-.

Especificamente preferida é a estrutura do péptido de oligocarbamato dos péptidos de fusão da invenção. A ligação de amida é substituída por uma porção de carbamato. Os carbonatos de amino alquila N-protegidos monoméricos são acessíveis através dos aminoácidos correspondentes ou amino álcoois. Eles são convertidos em ésteres activos, e. g., éster de p-nitro fenilo por emprego da porção F-moc ou um grupo nitroatriloxicarbonilo fotossensível por síntese de fase sólida.

Os péptidos de fusão da invenção são protegidos contra clivagem proteolítica conforme delineado acima. Eles são especificamente protegidos contra dipeptidil aminopeptidase-4 (DPP-IV). 0 termo "protegido por DPP-IV" como aqui utilizado refere-se a um péptido de fusão de acordo com a reivindicação 1. Péptidos de fusão da invenção bem como seus derivados, análogos, fragmentos e variantes tornam GLP-l(7-35, 36 ou 37) como parte do componente (I) e/ou (III) do péptido da invenção resistente à peptidase plasmática (DPP-IV). A resistência de um péptido à degradação por dipeptidil aminopeptidase IV é determinada, e. g., pelo ensaio de degradação que se segue: alíquotas de péptidos são incubadas a 37 °C com uma alíquota de dipeptidil aminopeptidase IV purificada durante 4-22 horas num tampão apropriado a pH 7-8 (tampão não sendo albumina). As reações enzimáticas são terminadas por adição de ácido trifluoracético e os produtos de degradação de péptido são separados e quantificados utilizando 31 análise de HPLC ou LC-MS. Um método para realizar essa análise é: as misturas são aplicadas num Zorbax300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 pm) coluna de 150 x 2,1 mm e eluídas numa taxa de fluxo de 0,5 mL/min com um gradiente linear de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoracético (0%—100% de acetonitrilo durante 30 minutos). Os péptidos e seus produtos de degradação podem ser monitorizados em relação à sua absorvência a 214 nm (ligações de péptido) ou 280 nm (aminoácidos aromáticos) e são quantificados por integração de suas áreas do pico. O padrão de degradação pode ser determinado pela utilização de LC-MS onde os espectros EM do pico separado podem ser determinados. A percentagem de composto intacto/degradado num dado momento é utilizada para estimativa da estabilidade dos péptidos DPP-iv.

Um péptido de fusão da invenção é definido como estabilizado em DPP-IV quando ele é dez vezes mais estável que GLP-1 (7-37) com base no composto de percentagem intacta num dado momento. Assim, um péptido de fusão da invenção com DPPV-IV estabilizada é, de um modo preferido, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 vezes mais estável que GLP-1 (7-37) como tal. A estabilidade pode ser avaliada por qualquer método conhecido de um especialista na técnica, e. g., por adição de DPP-IV a uma solução do péptido de fusão a ser testada e por determinação da degradação do péptido, e. g., com o tempo, e. g., por um método espectroscópico, análise Western-Blot, rastreio com anticorpo, etc. Em paralelo, um péptido da invenção é definido como um composto que exerce o efeito de GLP-1 (7-37) e. g., por ligação ao seu receptor nativo (receptor de GLP-1). De um modo preferido, um péptido de fusão da invenção possui uma afinidade de ligação ao receptor GLP-1, que corresponde a, pelo menos, 10%, de um modo preferido, pelo menos, 50% da afinidade 32 de ligação do péptido GLP-1 que ocorre naturalmente. A afinidade de ligação pode ser determinada por qualquer método apropriado, e. g., ressonância de plasmon de superfície, etc. Além disso, é preferido, se o péptido de fusão da invenção evocar a formação de AMPc intracelular pela sua ligação ao seu receptor extracelular, que transmita o sinal dentro da célula.

Os péptidos de fusão da invenção podem ser produzidos sinteticamente, utilizando técnicas de síntese de péptido de fase sólida, semelhantees ao modo de produção de amida GLP-1 (7-36) e GLP-1 (7-37) na técnica e podem ser purificados após isso a uma escala laboratorial, e. g., por uma etapa de purificação simples numa coluna de HPLC de fase inversa ou métodos de cromatografia apropriados.

Contudo é, de um modo preferido, formado em células transformadas geneticamente, tanto em linhagens de células microbianas quanto em células animais para produzir o péptido de fusão da invenção. 0 péptido de fusão da invenção pode ser isolado de células nas quais é expresso, e. g., utilizando técnicas de separação convencionais. Assim, as células podem desenvolver-se em condições apropriadas, e. g., incluindo suporte e nutrientes, in vitro e proteína secretada, i. e., o péptido de fusão da invenção, é recuperado do meio extracelular. As sequências transformadas geneticamente nas células incluem assim, de um modo preferido, sequências líder e sequências peptídicas de sinal direcionado a secreção do péptido de fusão da invenção. As células de um modo preferido expressam protease capaz de clivar as sequências líder e de sinal tanto endogenamente quanto por sequências genéticas transformadas. Numa alternativa, as sequências genéticas transformadas codificando um péptido de fusão da invenção não incluem tais 33 sequências líder e de sinal, pelo que, o péptido de fusão da invenção expresso intracelularmente não será segregado e será recuperado das células por processos envolvendo lise celular. Nesses métodos, as sequências de codificação podem incluir marcadores de purificação permitindo a extração eficiente do produto péptido de fusão do meio, os marcadores podem ser clivados para libertar o péptido de fusão da invenção isolado. A invenção proporciona ainda, adicionalmente, um ácido nucleico, que codifica o péptido de fusão da invenção, sendo o mesmo um péptido de fusão ou um fragmento, análogo ou variante do mesmo. Qualquer codificação de ácido nucleico para um péptido de fusão da invenção está englobada pela presente invenção. Devido à degeneração do código genético, várias sequências de ácido nucleico podem codificar um péptido de fusão da invenção. Uma molécula de ácido nucleico dentro do âmbito da presente invenção também pode conter a codificação de ácido nucleico para o péptido de fusão da invenção e, adicionalmente, sequências de nucleotídeo adicionais (funcionais). Numa forma de realização preferida da presente invenção, essa outra molécula de ácido nucleico pode codificar (a) toda a sequência GLP-1 aa (GLP-1(1-37) ou a sequência GLP-1(7-35, 36 ou 37) funcional, (b) uma sequência de clivagem no terminal N da sequência GLP-1 de acordo com (a) para qualquer protease, a montante de (b) pode codificar uma sequência líder. Noutra forma de realização preferida, a montante da sequência de ácido nucleico codificando (b), a molécula de ácido nucleico pode compreender adicionalmente (c) uma sequência codificando um péptido de sinal. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico da invenção pode possuir uma sequência (c) fundida a montante de (a) sem qualquer sequência codificando uma sequência líder (b) entre as mesmas. De um modo preferido, a sequência líder e a 34 sequência de péptido de sinal são heterólogas ao pré-pró-glucagom. A invenção proporciona, adicionalmente, um vector compreendendo um ácido nucleico da invenção (molécula) e outros componentes funcionais para expressão do ácido nucleico da invenção (molécula). Tipicamente, o ácido nucleico da invenção (molécula) será fundido a uma sequência promotora e, eventualmente, combinado com outras sequências reguladoras, e. g., uma sequência intensificadora. Para replicação, o plasmideo pode conter uma origem de replicação. De modo a seleccionar as células transfectadas com o vector da invenção, um ou mais genes de resistência antibiótica (e. g., canamicina, ampicilina) podem ser proporcionados no vector. 0 vector pode ser um plasmideo que inclua o promotor original bacteriano e genes de resistência antibiótica e o promotor de origem e genes de resistência antibiótica para replicação e expressão nas células de mamíferos. A invenção proporciona adicionalmente uma célula hospedeira compreendendo ADN da invenção introduzido exogenamente, capaz de traduzir a proteína precursora. A célula hospedeira pode ser tanto uma célula hospedeira procariótica como uma célula hospedeira eucariótica, e. g., uma célula de mamífero. A célula hospedeira não é uma célula embrionária ou célula germinal humana.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionada a utilização do péptido de fusão da invenção para o fabrico de uma medicamento para o tratamento de um animal, de um modo preferido um ser humano, por administração de um péptido da invenção compreendendo os componentes (I) e (II) e eventualmente o componente (III). É também proporcionada a utilização correspondente de tais péptidos da invenção no 35 fabrico de um produto para o tratamento ou prevenção de uma doença ou estado associados ao metabolismo da glucose. Exemplos não limitantes de distúrbio da glucose incluem: diabetes mellitus de tipo I ou tipo II (NIDDM) ou resistência à insulina, distúrbios de peso e doenças ou estados associados ao mesmo, em que tais distúrbios de peso ou estados associadas incluem obesidade, estados associadas ao peso em excesso, desregulação da saciedade, niveis de insulina no plasma reduzidos, niveis aumentados de glucose no sangue ou massa celular beta pancreática reduzida. De um modo preferido, a utilização de péptidos de fusão da invenção para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes do tipo 2 (NIDDM) é aqui descrito. Como uma consequência, a presente invenção refere-se à utilização do péptido de fusão da invenção, e. g., para abaixar o peso de um indivíduo, para reduzir a saciedade de um indivíduo, para aumento dos niveis pós-prandiais de insulina no plasma num indivíduo, para reduzir o nível de glucose no sangue em jejum num indivíduo, para aumentar a massa de célula beta pancreática em um indivíduo ou para tratar diabetes do tipo I ou II em um indivíduo.

Os doentes com outras doenças ou distúrbios podem ser tratados pelos péptidos de fusão da invenção, i. e., péptidos de fusão ou seus análogos, variantes ou derivados. Os péptidos de fusão da invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos e doenças ou estados associados ao mesmo e para o tratamento de distúrbios e doenças ou estados associadas à apoptose. A utilização do péptido de fusão da invenção para tratar esses distúrbios resulta do que se segue: receptores de GLP-1, que são acoplados à segunda via de mensageiro AMP cíclico, são expressos através de todo o cérebro de roedores e seres humanos. A 36 quimioarquitectura da distribuição de receptor no cérebro não apenas se correlaciona com um papel central para GLP-1 na regulação da ingestão de alimentos e resposta ao stresse aversivo. Também foi mostrado que a ligação de GLP-1 ao seu receptor GLP-1 exerce propriedades neurotróficas e oferece proteção contra apoptose induzida por glutamato e lesão oxidativa nas células neuronais cultivadas. Adicionalmente, GLP-1 mostrou modificar o processamento do precursor da proteína β-amilóide na cultura da célula e reduz de forma dependente da dose os níveis de β-péptido amilóide no cérebro in vivo. GLP-1 é portanto, também conhecido como regulador do sistema nervoso central. Os péptidos da invenção mimetizando a actividade biológica de GLP-1 fisiologicamente activo, possuem relevância terapêutica no tratamento, e.g., da doença de Alzheimer (AD) e outras condições neurodegenerativas centrais e periféricas (e.g., esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Alexander, doença de Alper, Ataxia telangiectasia, doença de Canavan, síndrome de Cockayne, doença de Creutzfeldt-Jakob, Esclerose Múltipla, doença de Sandhoff, doença de Pick, Ataxia Espinocerebelar, doença de Schilder e doença de Parkinson).

Além disso, foi mostrado que GLP-1 fisiologicamente activo exerce acção antiapoptótica em várias células, e. g., GLP-1 é benéfico à preservação da massa e função de ilhotas humanas isoladas recentemente ou outros tipos de célula. 0 péptido da invenção biologicamente activo também pode ser utilizado para tratar distúrbios que são causados por apoptose celular ou tecidual.

A utilização de um péptido de fusão da invenção pode ser para o fabrico de uma composição que é administrada exogenamente e compreende o péptido de fusão da invenção isolado. A 37 composição resultante pode ser tamb+em utilizada para o tratamento dos distúrbios acima. Os distúrbios descritos aqui podem também ser tratados pelas células hospedeiras da invenção, ácido nucleico (moléculas) ou vectores ou em vez disso, as células hospedeiras da invenção, ácido nucleico (moléculas) ou vectores podem ser utilizados para preparação de um medicamento para o tratamento desses distúrbios. A preparação das formulações que contêm sequências de péptido de fusão da invenção como ingredientes activos é geralmente bem entendida na técnica, conforme exemplificado pelas Patentes U.S. 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792; e 4578770. Tipicamente, tais formulações são preparadas como injectáveis, tanto como soluções ou suspensões liquidas, de um modo preferido, contendo água (formulação aquosa) ou podem ser emulsionadas. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo, pelo menos, 50% em peso/peso de água. Da mesma forma, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução compreendendo, pelo menos, 50% peso/peso de água e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendo, pelo menos, 50% peso/peso de água.

Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea ou injecção no sítio de aflição, o ingrediente activo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, que é isenta de pirogénio e possui pH, isotonicidade e estabilidade apropriados. As composições farmacêuticas líquidas geralmente incluem um veículo líquido, tal como água. De um modo preferido, o veículo líquido incluirá uma solução de soro fisiológico, dextrose etanol ou outra solução de sacárido ou glicóis, tais como, etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol ou podem ser incluídas combinações dos mesmos. Exemplos adicionais são outros 38 veículos isotónicos, tais como, injecção de Ringer ou injecção de Ringer Lactada.

Se a invenção se referir a uma formulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa do composto de acordo com a presente invenção, e um tampão, onde o composto está presente numa concentração de 0,1 mg/mL ou acima, e em que a formulação possui um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0, de um modo preferido, de cerca de 7,0 a cerca de 8,5. De um modo preferido, o pH da formulação é, pelo menos, uma unidade de pH do ponto isoelétrico do composto, de acordo com a presente invenção, de um modo ainda mais preferido, o pH da formulação é de, pelo menos, 2 unidades de pH do ponto isoelétrico do composto, de acordo com a presente invenção.

Formas sólidas apropriadas para solução, ou suspensão em líquido antes da injeção podem também ser preferidas. A formulação farmacêutica pode ser uma formulação liofilizada, pelo que, o médico ou o doente adiciona solventes e/ou diluentes antes da utilização. Por outras palavras, a formulação, uma vez preparada, pode não ser administrada imediatamente a um indivíduo. Em vez disso, após a preparação, ela é embalada para armazenamento num estado congelado ou numa forma seca para reconstituição posterior em forma líquida ou outra forma apropriada para administração a um indivíduo. Noutra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (e. g., liofilizada ou seca por pulverização) pronta para utilização, sem qualquer dissolução anterior. O termo "forma seca" refere-se à composição farmacêutica líquida ou formulação sendo seca tanto por í. e., liof ilização; ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38: 48-59), secagem por pulverização (ver, Masters (1991) em Spray-Drying 39

Handbook (5a edição; Longman Scientific e Technical, Essez, Reino Unido), pp. 491-676 ; Broadhead et al. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11 : 12-20), ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). A formação de agregados por um polipéptido durante o armazenamento da composição farmacêutica liquida pode afetar adversamente a actividade biológica daquele polipéptido, resultando em perda da eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Adicionalmente, a formação de agregado pode causar outros problemas, tais como, bloqueio da tubagem, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica contendo polipéptido é administrada utilizando um sistema de infusão. É possivel que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica do péptido da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem incluir agentes humidificantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de volume, agentes de tamponamento de pH (e. g., tampões de fosfato ou citrato ou maleato), conservantes, agentes tensioactivos, estabilizadores, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, iões metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (e. g., albumina de soro humano, gelatina ou proteínas) e/ou um zwitterião (e. g., um aminoácido, tal como, betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina) .

Em relação aos estabilizadores para formulações da invenção esses podem ser, de um modo preferido, seleccionados do grupo de polímeros de peso molecular elevado ou compostos de peso molecular baixo. Numa forma de realização adicional da invenção, o estabilizador é selecionado de polietilenoglicol (e. g., PEG 3350), álcool polivinilico (PVA), polivinilpirrolidona, 40

HPC carboxi-hidroxicelulose ou derivados da mesma (e. g., HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre, tais como, monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol e sais diferentes (e. g., cloreto de sódio). Cada um desses estabilizadores específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. As composições farmacêuticas podem também compreender agentes estabilizadores adicionais, que adicionalmente aumentam a estabilidade de um polipéptido activo terapêutico. Os agentes estabilizadores de interesse especifico da presente invenção incluem, porém não estão limitados a metionina e EDTA, que protegem o polipéptido contra oxidação por metionina e um agente tensioactivo não iónico que protege o polipéptido contra agregação associada ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.

Em relação aos agentes tensioactivos para formulações da invenção, esses podem ser de um modo preferido seleccionados de um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres do ácido gordo sorbitano, polímeros de polioxipropileno-polioxietileno em bloco (e. g., poloxâmeros, tais como, Pluronic F68, poloxâmero 188 e 407, Triton x-100), ésteres do ácido gordo polioxietileno sorbitano, PEO em forma de estrela, derivados de polioxietileno e polietileno, tais como, derivados alquilados e alcoxilados (tweens, e. g., Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), polioxietilenohidroxiestearato, monoglicéridos ou derivados etoxilados dos mesmos, diglicéridos ou derivados de polioxietileno dos mesmos, álcoois, glicerol, lecitinas e fosfolípidos (e. g., fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilisonitol, difosfatidilglicerol e esfingomielina), derivados de fosfolípidos (e. g., ácido dipalmitoilfosfatídico) e lisofosfolípidos (e. g., palmitoil 41 lisofosfatidil-L-serina e ésteres de l-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina e treonina) e derivados de alquilo, alcoxi(éster alquílico), alcoxi(éter alquílico) de lisofosfatidilo e fosfatidilcolinas, e. g., derivados de lauroilo e miristoilo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e modificações do grupo principal polar, isto é, colinas, etanolaminas, ácido fosfatidico, serinas, treoninas, glicerol, inositol e DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP carregados positivamente, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina e glicerofosfolipidos (e. g., cefalinas), gliceroglicolipidos (e. g., galactopiransóide), esfingoglicoli-pidos (e. g., ceramidas, gangliosidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de ovos de galinha, derivados de ácido fusidico (e. g., tauro-di-hidrofusidato de sódio), ácidos gordos de cadeia longa e sais dos mesmos C6-C12 (e. g., ácido oleico e ácido caprilico), acilcarnitinas e derivados, derivados Ν'Χ-acilados de lisina, arginina ou histidina ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou derivados N-acilados de arginina de dipéptidos compreendendo qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado N-acilado de um tripéptido compreendendo qualquer combinação de aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato de sódio, registro CAS número [577-11-7]), docusato de sódio, registro CAS número [128- 49-4]), docusato de potássio, registro CAS número [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido eólico ou derivados do mesmo, ácidos biliares e sais dos mesmos e glicina ou conjugados de taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amónia-l-propanossulfonato, agentes tensioactivos monovalentes aniónicos (alquil-aril-sulfonatos), tensioactivos zwitteriónicos (e. g., 42 N-alquil-N,N-dimetilamónia-l-propanossulfonatos, 3-colamido-l-propildimetilamónia-l-propanossulfonato, agentes tensioactivos catiónicos (bases de amónia quaternária) (e. g., brometo de cetil-trimetilamónia, cloreto de cetilpiridinio), agentes tensioactivos não iónicos (e. g., Dodecil-D-glicopiranosídeo), poloxaminas (e. g., Tetronic's) que são copolimeros de bloco tetrafuncionais derivados da adição sequencial de óxido de propileno e óxido de etileno à etilenodiamina ou o agente tensioactivo pode ser seleccionado do grupo de derivados de imidazolina ou misturas dos mesmos. Cada um desses agentes tensioactivos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. A utilização de um agente tensioactivo nas formulações farmacêuticas é bem-conhecido de um especialista na técnica. Para conveniência, é feita referência a Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

Em relação aos conservantes farmaceuticamente aceitáveis, esses podem ser seleccionados, de um modo preferido, do grupo consistindo em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, álcool benzilico, etanol, clorobutanol e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imidureia, clorexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloreto de benzetónio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) ou misturas dos mesmos.

Em relação aos agentes isotónicos, esses podem ser, de um modo preferido, seleccionados do grupo consistindo em um sal (e. g., cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (e. g., L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol 43 (e. g., glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (e. g., PEG400) ou misturas dos mesmos. Qualquer açúcar, tal como, mono, di ou polissacarideo ou glucanos solúveis em água, incluindo, e. g., frutose, glucose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietilo e carboximetilcelulose-Na pode ser utilizado. Numa forma de realização, o aditivo de açúcar é sacarose. 0 álcool de açúcar é definido como hidrocarboneto C4-C8 possuindo, pelo menos, um grupo OH e inclui, e. g., manitol, sorbitol, inositol, galacititol, dulcitol, xilitol e arabitol. Numa forma de realização, o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares, ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Não existe limite fixo para a quantidade utilizada, desde que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação liquida e não afecte adversamente os efeitos de estabilização obtidos utilizando os métodos da invenção.

Em relação aos agentes quelantes, esses podem ser, de um modo preferido, seleccionados de sais de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e misturas dos mesmos.

Em relação aos tampões, esses são, de um modo preferido, seleccionados do grupo consistindo em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato de sódio diidrogenado, fosfato de dissódio hidrogenado, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)-aminometano, hepes, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico 44 ou misturas dos mesmos. Cada um desses tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. A utilização de todos os aditivos mencionados acima nas composições farmacêuticas contendo o péptido de fusão (terapêutico) da invenção é bem-conhecida dos especialistas na técnica, especificamente com relação aos intervalos de concentração dos mesmos. Para conveniência, é feita referência a Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

As formulações contendo o péptido de fusão da invenção são convencionalmente administradas parentericamente, por injecção, e. g., tanto subcutânea, intradérmica, subdérmica ou intramuscularmente. Uma composição para administração parentérica do péptido da invenção pode ser preparada, e. g., conforme descrito no documento WO 03/002136.

Formulações adicionais que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais, bucais, sublinguais, intraperitoneais, intravaginais, anais e intracranianas. Para os supositórios, os aglutinantes e veículos tradicionais podem incluir, e. g., polialquilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados de misturas contendo o ingrediente activo na gama de 0,5% a 10%, de um modo preferido 12%. As formulações orais incluem os excipientes empregados normalmente, tais como, e. g., graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantees. Essas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação prolongada ou pós e contêm 10-95% do ingrediente activo, de um modo preferido 25-70%. 45

Conforme mencionado acima, os métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregados para controlar a duração da acção. As preparações de libertação controlada podem ser obtidas pela utilização de polímeros para complexação ou absorção de um péptido de fusão da presente invenção. A libertação controlada do ingrediente activo (péptido de fusão) pode ser exercida por seleção das macromoléculas apropriadas (e. g., poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolimeros de acetato etilenovinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose e sulfato de protamina), a concentração das macromoléculas bem como os métodos de incorporação. Tais ensinamentos são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (ver acima). Outro método possível para controlar a duração da acção por preparações de libertação controlada é a incorporação de um péptido da presente invenção nas partículas do material polimérico, tais como, poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, poli(ácido láctico) ou copolimeros de acetato etilenovinilo.

Os péptidos de fusão da invenção podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Um péptido de fusão da presente invenção pode ser suficientemente ácido ou suficientemente básico para reagir com qualquer uma de várias bases orgânicas e inorgânicas e ácidos orgânicos e inorgânicos, para formar um sal (de adição), e. g., formado com os grupos amino livres do péptido. Os ácidos geralmente empregados para formar os sais de adição de ácido são ácidos inorgânicos, tais como, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodrídico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e semelhantes e ácidos orgânicos, tais como, tartárico, ácido asp-toluenossulfónico, ácido metanossulfónico, ácido oxálico, ácido mandélico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzóico. 46

Exemplos de tais sais incluem sulfato, pirossulfato, bissufato, sulfito, bissulfito, fosfato, mono-hidrogenfosfato, di-hidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butina-1,4-dioato, hexina-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartarato, metanossulfonato, propanossulfonato. Os sais formados com os grupos carboxilo livre podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, e. g., hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio ou férricos e bases orgânicas, tais como, isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina e semelhantes. Os sais de adição de ácido, sais de carboxilato, ésteres de alquilo inferiores e amidas dos péptidos da invenção podem ser formulados de acordo com os documentos WO 91/11457 (1991); EP 0733644 (1996); e U.S. 5512549 (1996).

Formulações contendo as sequências do péptido de fusão da invenção são administradas de modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade que seja terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, e. g., a gravidade da doença do doente. Gamas de dosagem apropriadas são, e. g., da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente activo por dose terapêutica com uma gama preferida de cerca de 0,1 pg a 2000 pg (mesmo que quantidades maiores na gama de 1-10 mg sejam contempladas), tais como na gama de cerca de 0,5 pg a 1000 pg, de um modo preferido, na gama de 1 pg a 500 pg e especialmente 47 na gama de cerca de 10 pg a 100 pg.

Formulações contendo os péptidos de fusão da invenção mais e. g., excipientes adicionais, e. g., glicina e manitol ou outros aditivos, podem ser comercializados numa forma liofilizada como ampolas. É proporcionada uma ampola anexa contendo diluente, o que permite ao doente reconstituir o produto a uma concentração desejada antes da administração da dose. As formulações da invenção podem também ser comercializadas de outros modos conhecidos, tais como, seringas pré-enchidas. A invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos anexos.

Exemplos

Exemplo 1

Criação de construções genéticas A sequência de codificação para ADNc de GLP-l(7-37) foi sintetizada sinteticamente, numa sequência incluindo os sítios Hincll e UcoRI conforme indicado na Fig. la. Separadamente, o ADNc ilustrado na Fig. lb foi sintetizado, incluindo as sequências de codificação para GLP-l(7-37), IP2 e sítios de restrição para SfoI, EcoRI e Xbal, conforme ilustrado na Fig. lb. De modo a direcionar GLP-1 para a via secretora, foi empregue a sequência de sinal heteróloga de estromelisina 3 (N° de acesso NM_005940). Portanto o ADNc, codificando a sequência de sinal e sequência líder de estromelisina foi 48 amplificada por PCR de transcriptase inversa a partir de ARN humano e empregue com a construção da Fig. la ou Fig. lb para formar a construção apresentada na Fig. lc e Fig. ld, respectivamente. 0 fragmento HincII/EcoRl da construção da Fig. la é clonado no sitio SfoI da sequência da Fig. ld para formar a construção da Fig. le. De modo semelhante, o fragmento EcoRI da Fig. ld é clonado no sitio EcoRI de um plasmideo de expressão eucariótico, para produzir a construção apresentada na Fig. lf. Para formar a construção mostrada na Fig. lg, o fragmento HincII/Xbal da construção mostrada na Fig. lb é clonado repetitivamente no sitio Sfol/Xabl da construção mostrada na Fig. ld. A Fig. lh mostra uma sequência optimizada de codão, sintetizada, codificando as sequências líder e de sinal de estromelisina interrompidas pela sequência de intrão endógena encurtada, fundida às sequências codificando [GLP-1 (7-37), IP2 e GLP-2(l-35) humanos. A sequência de ADN da construção da Fiq. lh é a SEQ ID N° 16, enquanto que a SEQ ID N° 15 também mostra a sequência do péptido traduzido.

Também são sintetizadas as sequências nas Figs. li e lj.

Essas são então empregues para formar a construção da Fig. lk, por clonagem do fragmento Eael/BssHII da Fig. lj na sequência

Naei/BssRii linearizada da Fig. lh. A sequência de ADN da construção da Fig. lk é a SEQ ID N° 14, enquanto que 3 SEQ ID N° 13 também mostra a sequência do péptido traduzido. A construção da Fig. 11 é formada por digestão de BssHII e religação da sequência da Fig. lh. A sequência de ADN da construção da Fig. 11 é SEQ ID N 0 18, enquanto que a SEQ ID N° 17 também mostra a sequência do péptido traduzido. A construção da Fig. lm é formada por clonagem do fragmento 49

Afel/BssRII da sequência da Fig. li na sequência linearizada de Afel/BssHll da Fig. lh. A sequência de DNA da construção da Fig. lm é a SEQ ID N° 20, enquanto que a SEQ ID N° 19 também mostra a sequência do péptido traduzido.

As construções acima podem ser fabricadas por um especialista na técnica utilizando técnicas de rotina.

Exemplo 2

Transfecção, seleção clonal e expressão de GLP-1 de células de mamíferos

Fonte das células: HEK293 (linhagem de células dos rins, embrionárias, humanas, N° ACC 305, DSMZ Cell Culture Collection, Alemanha), AtT20 (linhagem de células tumorais da glândula pituitária de Murganho LAF1, N° 87021902, European Cell Culture Collection, Reino Unido), células hTERT-MSC geradas pelo Prof. Kassem, University Hospital of Odense, Dinamarca.

Para transfecção de 106 células, foram empregues 0,5-2 pg de ADN de plasmídeo com construções diferentes de GLP-1. As construções foram geradas conforme descrito no Exemplo 1. Células HEK293 foram transfectadas pelo método padrão de coprecipitação de fosfato de cálcio conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. 1994ff Harvard Medicai School Vol 2., Unidade 9.1). Células AtT20 foram transfectadas empregando FuGene (Roche) conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1994ff, Harvard Medicai School Vol 2., Unidade 9.4). A transfecção das células hTERT-MSC foi realizada usando a tecnologia Nucleofector 50 (Amaxa), um método não virai que se baseia na combinação de parâmetros eléctricos e soluções específicas de tipo de célula. Quando da utilização do dispositivo Nucleofector (programa C17) e da solução Nucleofector VPE-1001, foram obtidas eficiências de transfecção superiores a 60%. Quarenta e oito horas após a transfecção, a seleção dos clones de células com integração estável de ADN no cromossoma foi realizada por adição de agente seletivo blasticidina (2 pg/mL) no meio de cultura. Doze a quinze dias mais tarde, os clones de células transfectadas estáveis seriam isolados e expandidos para caracterização. A expressão transiente das construções de GLP-1 diferentes foi medida nas células hTERT-MSC e HEK293. Considerando-se que apenas um nível marginal de GLP-1 activo pode ser encontrado nas construções monoméricas de GLP-1 N° 103 e N° 317 (possuindo apenas uma cópia de GLP-1 (7-37) um enorme ganho na expressão pode ser encontrado na construção de GLP-1 dimérica N° 217 (possuindo GLP-1(7-37) como o componente (I) e como 0 componente (III)) ambos nas células hTERT-MSC e HEK293. Os resultados são resumidos na Fig. 2. Um alongamento da construção para a construção de GLP-1 N° 159 (possuindo quatro cópias de IP2 como o componente (II) resulta em um aumento adicionalmente significactivo (não mostrado). Após transfecção das células hTERT-MSC com diferentes construções, os clones foram seleccionados, o que expressa estavelmente GLP-1. Os níveis de expressão são mostrados na Tabela 1. 51

Tabela 1 construção clone de célula GLP activo por 106 células e hora [pmol] N° 103 GLP1 (7_37, 49TM113/13 0,4 N° 317 GLPl (7_37) - lP2-llaa 71TM169/1 0,3 N° GLPl (7_37) -Ip2-GLP1 (7_ 79TM217/13 2,7

Exemplo 3

Análise de Transferência de Western de péptidos GLP-1, segregados das células de mamíferos. 0 sobrenadante de cultura de células das células secretando GLP-1 foi separado num gradiente de 10%-20% SDS PAGE (120 V, 90 minutos) e transferido para uma membrana PVDF (Membrana Immobilon-P 0,45 pm Millipore IPVH 00010) por transferência semi-seca (2, 0 mA/cm2, 60 minutos). Após fixação de metanol e bloqueio (3% (peso:volume) BSA, 0,1% (v:v) Tween-20 em TBS) a membrana foi imunotransferida com anticorpo anti-GLP-1 de 1 pg/mL (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4 °C de um dia para 0 outro. Após lavagem e incubação com 0,02 pg/mL de anticorpo de detecção (igG antimurganho, HRP conjugado, Perkin Elmer PC 2855-1197) à temperatura ambiente durante 4 horas, a detecção de quimioluminescência mostra a localização da proteína. A Análise de Western é apresentada na Fig. 3 (1:100 ng de GLP-1(7-37) sintético) dissolvido no sobrenadante de células simuladamente transfectadas hTERT-MSC; 2: sobrenadante das células hTERT-MSC (clone 79TM217/13) secretando GLP-1 dimérico 52 da construção N° 217, 3: sobrenadante das células AtT20 (clone 81-A-217/3) secretando GLP-1 dimérico da construção N° 217; M: marcador de proteína pré-corada [kDa]). Os resultados mostram que os péptidos da invenção contendo GLP-1 (7-37) e um apêndice de terminal C (2 e 3 na Fig. 3) são segregados das linhagens de células transfectadas e podem ser detectados utilizando um anticorpo anti-GLP-1, que se liga aos epitopos de meia molécula de GLP-1 (7-37).

Exemplo 4

Estabilidade do plasma in vitro para péptidos de GLP-1 segregados a partir de células humanas Células HEK293 e hTERT-MSC foram transfectadas transientemente com construções, codificando a sequência de sinal de estromelisina heteróloga, que é ligada às variantes de GLP-1 codificando os péptidos que se seguem: 1: GLP-1 (7-37)

2: GLP-1 (7-37)-lP2-estendido com 11 AA 3: GLP1(7-37)-IP2-GLP1(7-37)

Sobrenadante de cultura de célula, contendo péptidos GLP-1 segregados dos células ou GLP-1(7-37) (Bachem) sintético, foi incubado num plasma enriquecido com linfócitos humanos contendo actividade de dipeptidilpeptidase a 37 °C e C02 a 5% durante 3 ou 4 horas. GLP-1 (7-37) sintético no sobrenadante de células simuladamente transfectadas foi utilizado como um controlo positivo para actividade de DPP-IV, que mostrou ser inibida por um inibidor DPP-IV (N° DPP4, Biotrend). GLP activo foi medido 53 utilizando o GLP-1 (Active) ELISA (N°EGLP-35K, Biotrend), utilizando um anticorpo que se liga ao epitopo de terminal N de GLP-1 (7-37) discriminando o péptido GLP-1 (9-37) inactivo, degradado por DPP-IV.

Os resultados são apresentados nas Figs. 4 (células HEK293) e 5 (células hTERT-MSC). As células HEK293 e hTERT-MSC são ambas hospedeiros eficazes para a construção de genes. A numeração dos resultados para as células transfectadas dos tipos 1 a 3 é como no Exemplo 3 (1:100 ng de GLPl(7-37) sintético dissolvido no sobrenadante das células simuladamente transfectadas hTERT-MSC, 2: sobrenadante das células hTERT-MSC (clone 79TM217/13) secretando GLP-1 dimérico da construção N° 217, 3: sobrenadante das células AtT20 (clone 81-A-217/3) secretando GLP-1 dimérico da construção N° 217) . Embora a construção 1 produz GLP-1 do tipo selvagem, que é inactivado por DPP-IV, de um modo semelhante ao GLP-1 sintético, as formas de GLP-1 alongadas terminalmente em C da invenção (2 e 3 na Fig. 4, 3 na Fig. 5) são mais resistentes à degradação e mantêm, pelo menos, 40% da actividade. Os péptidos GLP-1 estendidos de terminal C são significactivamente estabilizados no plasma humano in vitro. O péptido com a sequência GLP-1 dimérica (3) é quase que completamente estabilizado quanto à degradação por DPP-IV in vitro.

Exemplo 5

Análise de Transferência de Western dos péptidos GLP-1 Vários péptidos GLP-1 foram produzidos sinteticamente por fase sólida (syn) ou recombinante utilizando E.coli {rec) . Os 54 péptidos GLP-1 (31 ng SEQ ID N°:l e 10 ng de cada SEQ ID N°:6, SEQ ID N°:7, SEQ ID N°:8) foram separados numa SDS PAGE de gradiente 10-20% (120 V, 90 minutos) e transferidos para uma membrana PVDF (Immobilon-P Membran 0,45 pm Millipore IPVH 00010) por transferência semi-seca (2,0 mA/cm2, 60 minutos). Após fixação de metanol e bloqueio (3% (peso:volume) BSA, 0,1% (v:v)

Tween-20 em TBS) a membrana foi imunotransferida com 1 pg/mL de anticorpo anti-GLP-1 (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4 °C durante a noite. Após lavagem e incubação com 0,02 pg/mL de anticorpo de detecção (IgG antimurganho, conjugado HRP, Perkin Elmer PC 2855-1197) a temperatura ambiente durante 4 horas, a detecção da quimioluminescência descreve a localização da proteína. A Fig. 6 mostra um Western Blot para os péptidos indicados. Os valores que se seguem podem ser fornecidos: SEQ ID N° 1 (ID1 syn) corresponde ao GLP- 1(7-37), 31 aa, 3,3 kD; SEQ ID N° 8 (ID8 syn, CM3) corresponde ao GLP-1 (7-37)-IP2, 46 aa, 5,1 kD; SEQ ID N° 7 (ID7rec, CM2) corresponde ao GLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP2, 83 aa, 9,4 kD; SEQ ID N° 6 (ID6 syn, CM1) corresponde ao GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLPl(7- 37), 79 aa, 8,7 kD.

Exemplo 6

Estabilidade dos péptidos GLP-1CM no plasma humano in vitro

Os péptidos GLP-1 sintéticos (SEQ ID N°:lsyn, SEQ ID N0:6syn, SEQ ID N°:7rec, SEQ ID N°:8syn) foram incubados em concentrações de 20 ng/mL com plasma humano a 37 °C e C02 a 5% durante 3 horas. A actividade de dipeptidilpeptidase do plasma foi inibida por um inibidor DPP-IV (N°DPP4, Biotrend). GLP activo foi medido utilizando o GLP-1 (Active) ELISA (N°EGLP-35K, Biotrend). 55

Em contraste com o GLP-1(7_37) nativo (SEQ ID N°:l) os péptidos GLP-1 alongados no terminal C SEQ ID N°:6, SEQ ID N°:7, e SEQ ID N°:8 são significativamente estabilizados no plasma humano in vitro (Fig. 7) . Como controlo são mostrados (no lado direito), os resultados obtidos para experiências com a adição de DPP-IV. A actividade de GLP-1 é completamente mantida nessas experiências de controlo. EXEMPLO 7

Bioensaio in vitro

Produção Cíclica de amp

As células RIN-5F (célula tumoral de ilhéus de rato; ECACC N° 95090402) foram desenvolvidas em placas de 24 poços por 4 dias, alcançando 70% de confluência. As células foram lavadas duas vezes com DMEM (E15-009, PAA) antes da adição de 0,5 mL de DMEM (E15-009, PAA) suplementado com 1% de HSA (Aventis), 0,2 mM de IBMX (858455, Sigma) e os péptidos de teste. Após uma incubação de 20 minutos a 25 °C, as células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo. O AMPc celular foi extraído por adição de 0,1 N de HC1 contendo Triton X-100 a 0,5%. O AMP cíclico foi quantificado utilizando AMPc (pH baixo) EIA (Cat. DE0355, R&D). Para estimulação foram utilizados 3*10~8 M SEQ ID N°:l, SEQ ID N°:6syn, SEQ ID N°:6rec, SEQ ID N°:7rec, SEQ ID N° : 8syn.

Os resultados são mostrados na Fig. 8. A produção de AMPc a 100% corresponde à produção basal na ausência de GLP-1. O GLP-1 liga-se aos receptores acoplados à proteína e estimula a 56 produção de AMPc. Todas as moléculas testadas aumentam a produção AMPc celular. EXEMPLO 8

Bioactividade in vivo

Os murganhos diabéticos do tipo 2 com onze semanas de vida (C57BL/Ks-Leprdb/db, Harlan) foram tratados com 5 pg de péptido por injeção subcutânea, duas vezes ao dia, às 9 horas da manhã e 5 horas da tarde (n=5 por grupo). A glucose no sangue foi medida antes (dia 0) e após o tratamento com os péptidos GLP™ (Dia 2, 4, 7, 10) às 10 horas da manhã após um periodo de jejum por toda a noite. Os dados foram apresentados em relação aos níveis de glucose no sangue medidos no dia 0.

Todos os péptidos da invenção testados (SEQ ID N°:6 (sintéticos ou recombinantes) e SEQ ID N°:7 (sintéticos ou recombinantes) tiveram um efeito de anti-hiperglicemia. Os melhores resultados foram obtidos com SEQ ID N°:6 (CMl) e a SEQ ID N°:8 sintética (CM3) . Na Fig. 9 (eixo y) é mostrado o efeito relativo do tratamento. A glucose no sangue no dia 0 foi estabelecida como sendo 1. Os animais não tratados sofreram aumento contínuo no nível de glucose no sangue com o tempo, considerando-se que os animais tratados com os péptidos da invenção mostram, grosso modo, uma diminuição continua do nível de glucose no sangue ao longo do tempo. 57

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G Sequência ID N2: 1 RRDFPEEVAI VEELG Sequência ID N2: 2 RRDFPEEVAI AEELG Sequência ID P: 3 HADGSFSDEM NTILDNLAAR DFINWLIQTK ITDRK Sequência ID N2: 4 HADGSFSDEM STILDNLATR DFINWLIQTK ITDKK Sequência ID N2: 5

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHA EGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG

Sequência ID n^: 6

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHA DGSFSDEMST ILDNLATRDF INWLIQTKIT DKK

Sequência ID N®: 7 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAESLG Sequência ID N2: 8

MAPAAWLRSA AARALLPPML LLLLQPPPLL ARALPPDVHH LHAERRGPQP WHAALPSSPA PAPATQEAPR PASSLRPPRC GVPDPSDGLS ARNRQKR

Secruência ID N2: 9 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHA EGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG Sequência ID N2: 10

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHA DGSFSDEMNT ILDNLAARDF INWLIQTKIT DRK

Sequência ID N2: 11 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELG Sequência ID N2: 12 58

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg MAPA A W L R S A A A R A 51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg L L P P M L L L L L Q P P P L L 101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg A R A L P P 151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc 201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg 251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta 351 ggcctgacca gaccctcatg LCttCCtCCZr tcccaggacg tgcaccacct D V Η H L 401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca Η A E R R G P Q P W Η A A L P S S 451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc P A P A P A T Q E A P R P A S S 501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc L R P P R C G V P D P S D G L S A 551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga R N R Q K R H AEG TFT S D V S 601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg S Y L E G Q A A K E FIA W L V 651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga K G R G R R D F P E E V A I V E E 701 gctgggccgg cgacacgccg agggcacctt cacctccgac gtgagcagct L G R R Η A E G T £ T S D V S S Y 751 acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca tcgcctggct ggtgaagggc L E G Q A A K E F I A W L V K G 801 aggggctgag cgcgc R G *

Sequência ID N2: 13 1 gatatccacc 61 acccatgctg 121 gagtgcccgc 181 ccagcggcgt 241 catgtgccgg 301 gtgtgtttgc 361 gaccctcatg 421 ctcagccctg 481 cccccaggcc 541 gcctgagcgc 601 gcagctacct 661 gccgcaggga 721 agggcacctt 781 tcgcctggct atggcccccg ctgctgctgc cactcgccgt atccggacgc tgccctttcc tgacaggcca tcttcctcct gcacgccgcc tgccagcagc tcggaatcgg ggagggccag cttccctgag cacctccgac ggtgaagggc ccgcctggct tgcagccccc ccgctcctcg caagaaacca ctctccattt catctctaac tcccaggacg ctgccaagca ctgaggccac cagaagaggc gccgccaagg gaggtggcca gtgagcagct aggggctgag gaggagcgcc acctctgctg ctgagggggc gagagccagc gccctgccac tgtgggccat tgcaccacct gccctgcccc ccaggtgcgg acgccgaggg agttcatcgc tcgtggagga acctggagga cgcgc gccgccaggg gcccgggccc gccgggcacg cagatgccaa acagtgggct gtggacctta gcacgccgag tgccccagcc cgtgcctgat caccttcacc ctggctggtg gctgggccgg Ccaggccgcc ccctgctgcc tgcccccggt cgggctgggc agggccctgc ggggttgcac ggcctgacca aggcgcggcc acccaggagg ccctccgatg tccgacgtga aagggcaggg cgacacgccg aaggagttca

Sequência ID Ns: 14 59 1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg MAPA A W L R S A A A R A 51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg L L P P M L L L L L Q P P P L L 101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg A R A L P P 151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc 201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg 251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta 351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct D V Η H L 401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca Η A E R R G P Q P W Η A A L P S S 451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc P A P A P A T Q E A P R P A S S 501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc L R P P R c" G V P D P S D G L S A 551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga R N R Q K R H AEG TFT S D V S 601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg S Y L E G Q A A K E FIA W L V 651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga K G R G R R D F P E E V A I V E E 701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca L G R R Η A D G S F S D E Μ N T I 751 tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca tcaactggct gatccagacc L D N L A Á R D F I N W L I Q T 801 aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tate K I T D R K *

Sequência ID Ns: 15 1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggaga 481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg 721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca 781 tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tate

Sequência ID Ns: 16

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg MAPA A W L R S A A A R Ά 51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg L L P P M L L L L L Q P P P L L 60 101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg A R A L P P 151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc 201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg 251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta 351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct D V Η H L 401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca Η A E R R G P Q P W Η A A L P S S 451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc P A p A P A T Q E A E R P A S S 501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc L R ? P R C G V P D P S D G L S A 551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga R N R Q K R H A E G^ TFT S D V S 601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg S Y L Ξ G Q A A K E FIA W L V 651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga K G R G R R D F P E E V A I V E E 701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca L G R R Η A D G S F S D E Μ N T I 751 tcctggacaa cctggccgcg cgctga tat c L D N L A A R *

Sequência ID N2: 17 1 gatatccacc 61 acccatgctg 121 gagtgcccgc 181 ccagcggcgt 241 catgtgccgg 301 gtgtgtttgc 361 gaccctcatg 421 ctcagccctg 481 cccccaggcc 541 gcctgagcgc 601 gcagctacct 721 acggcagctt atggcccccg ctgctgctgc cactcgccgt atccggacgc tgccctttcc tgacaggcca tcttcctcct gcacgccgcc tgccagcagc tcggaatcgg ggagggccag cagcgacgag ccgcctggct tgcagccccc ccgctcctcg caagaaacca ctctccattt catctctaac tcccaggacg ctgccaagca ctgaggccac cagaagaggc gccgccaagg atgaacacca gaggagcgcc acctctgctg ctgagggggc gagagccagc gccctgccac tgtgggccat tgcaccacct gccctgcccc ccaggtgcgg acgccgaggg agttcatcgc tcctggacaa gccgccaggg gcccgggccc gccgggcacg cagatgccaa acagtgggct gtggacctta gcacgccgag tgccccagcc cgtgcctgat caccttcacc ctggctggtg cctggccgcg ccctgctgcc tgcccccggt cgggctgggc agggccctgc ggggttgcac ggcctgacca aggcgcggcc acccaggagg ccctccgatg tccgacgtga aagggcaggg cgctgatatc

Sequência ID N2: 18 i 51 101 151 201 251 301 351 gatatccacc

ccctgctgcc li ij P gcccgggccc A R A L ctgagggggc caagaaacca tgccctttcc gtgtgtttgc

ggcctgacca atggcccccg MAPA acccatgctg P M L tgcccccggt P P gccgggcacg gagagccagc ctctccattt tgacaggcca gaccctcatg ccgcctggct A W L ctgctgctgc L jj L t gagtgcccgc cgggctgggc cagatgccaa gccctgccac catctctaac tcttcctcct gaggagcgcc R S A tgcagccccc Q P P cactcgccgt

ccagcggcgt agggccctgc acagtgggct tgtgggccat tcccaggacg D V gccgccaggg A A R A acctctgctg P L L ccgctcctcg

atccggacgc catgtgccgg ggggttgcac gtggacctta tgcaccacct Η H L 61

ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca Q P W Η A A L P S S acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc T Q E A P R P A S S cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc V P D P S D G L S A acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga AEG TFT S D V S gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg A A K E FIA W L V cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga E P E E V A I V E E 401 gcacgccgag aggcgcggcc Η A E R R G P 451 gccctgcccc tgccccagcc P A P A P A 501 ctgaggccac ccaggtgcgg L R P P R C G 551 tcggaatcgg cagaagaggc R N R Q K R H 601 gcagctacct ggagggccag S Y L E G Q 651 aagggcaggg gccgcaggga K G R G R R D 701 gctgggctga 1> G * gcgcgc

Sequência ID N2: 19 1 gatatccacc 61 acccatgctg 121 gagtgcccgc 181 ccagcggcgt 241 catgtgccgg 301 gtgtgtttgc 361 gaccctcatg 421 ctcagccctg 481 cccccaggcc 541 gcctgagcgc 601 gcagctacct 661 gccgcaggga atggcccccg ctgctgctgc cactcgccgt atccggacgc tgccctttcc tgacaçgcca tcttcctcct gcacgccgcc tgccagcagc tcggaatcgg ggagggccag cttccctgag ccgcctggct tgcagccccc ccgctcctcg caagaaacca ctctccattt eatctctaac tcccaggacg ctgccaagca ctgaggccac cagaagaggc gccgccaagg gaggtggcca gaggagcgcc acctctgctg ctgagggggc gagagccagc gccctgccac tgtgggccat tgcaccacct gccctgcccc ccaggtgcgg acgccgaggg agttcatcgc tcgtggagga gccgccaggg gcccgggccc gccgggcacg cagatgccaa acagtgggct gtggacctta goacgccgag tgccccagcc cgtgcctgat caccttcacc ctggctggtg gctgggctga ccctgctgcc tgcccccggt cgggctgggc agggccctgc ggggttgcac ggcctgacca aggcgcggcc acccaggagg ccctccgatg tccgacgtga aagggcaggg gcgcgc

Sequência ID N2: 20

HGEGTFTSDV SSYLEGQAM EFIAWLVKGR G

Sequência ID N2: 21

RRDFPEEVAI

Sequência ID N2: 22 RRDFPEEVAI VF1ET,

Sequência ID N2: 23

RRDFPEEVAI AEEL

Sequência ID N2: 24

Lisboa, 28 de Janeiro de 2010 62

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de fusão compreendendo como componente (I) N-terminal: (i) GLP-1 (7-37) de SEQ ID N°: 1 ou uma sequência funcional que exerce os efeitos biológicos de GLP-1 como hormona incretina, a sua acção antiapoptótica ou as suas propriedades neurotróficas e possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com GLP-1 (7-37), ou (ii) um péptido GLP-1 modificado consistindo na sequência de aminoácidos da fórmula II: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Xaa35-Xaa36-Xaa37, em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-fluormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclo- pentil)carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil)carboxílico, ácido (1-aminociclo-heptil)carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaal6 é Vai ou Leu; Xaa é Ser, Lys ou Arg; Xaal9 é Tyr ou Gin; Xaa20 é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg; Xaa25 é Ala ou Vai; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa27 é Glu ou Leu; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa33 é 1 Vai ou Lys; Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Gly ou Lys ou amida ou está ausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida ou está ausente, e como componente (li) C-terminal uma sequência peptídica de, pelo menos, 9 aminoácidos e contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 22 (RRDFPEEVAI) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com SEQ ID N°: 22 e proporcionando resistência melhorada a inactivação por DPP-IV do péptido de fusão, em que o terminal N do péptido de fusão é o componente (I) como tal ou uma sequência de péptido sinal, que é fundida através de uma sequência de clivagem de protease com o terminal N do componente (I), ou um péptido sinal, que é fundido sem a sequência de clivagem por protease entre o terminal N do componente (I), ou uma sequência líder, que é fundida através de uma sequência de clivagem por protease com o terminal N do componente (I), sendo heterólogo do pré-pró-glucagom.
2. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que o componente (i) é um péptido GLP-1 modificado compreendendo a sequência de aminoácidos de fórmula III: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-fluormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, Me, Lys, Aib, 2 ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclo-butil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil)carboxílico, ácido (1-aminociclo-heptil)carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaal8 é Ser, Lys ou Arg; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa34 é Lys, Glu ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg ou Lys, amida ou está ausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu ou Lys, amida ou está ausente.
3. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que o componente (I), é GLP-l(7-35) ou GLP-1 (7-36).
4. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 1 a 3, em que o componente (I) é uma sequência peptídica contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 23 (RRDFPEEVAIVEEL) ou SEQ ID N° 24 (RRDFPEEVAIAEEL) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com as SEQ ID N°: 23 ou 24.
5. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 4, em que o componente (II) é uma sequência peptídica contendo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° : 2 (RRDFPEEVAIVEELG) ou SEQ ID N° 3 (RRDFPEEVAIAEELG) ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com as SEQ ID N°: 2 ou 3.
6. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 5, em que o componente (I) e o componente (II) estão directamente ligados ou ligados através de uma sequência ligante. 3
7. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 6, em que a sequência ligante possui um comprimento de 1 a 10 aminoácidos.
8. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o péptido de fusão contém uma sequência de acordo com SEQ ID N°: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG) OU SEQ ID N° 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) OU uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com as SEQ ID N°: 8 ou 12.
9. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 8, em que o péptido de fusão contém outro componente (III) ligado ao terminal C do componente (II).
10. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 9, em que o componente (III) compreende, pelo menos, quatro resíduos de aminoácidos, ou compreende, de um modo preferido, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos, ou compreende de um modo mais preferido, pelo menos, 20 resíduos de aminoácidos.
11. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o componente (III) compreende, pelo menos, 4, de um modo preferido, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 resíduos de aminoácidos da sequência N-terminal de GLP-2 como no pró-glucagom ou de GLP-l(7-37).
12. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 11, em que o componente (III) contém as sequências de SEQ ID N°: 4 ou 5 ou uma sequência possuindo, pelo menos, 4 80% de identidade de sequência com as SEQ ID N°: 4 ou 5.
13. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 12, em que o péptido de fusão contém uma sequência peptidica seleccionada de um grupo consistindo em: SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 10 e SEQ ID N° 11 ou uma sequência possuindo, pelo menos, 80% de identidade de sequência com as SEQ ID N°: 6, 7, 10, ou 11.
14. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 13, em que, pelo menos, um dos aminoácidos é derivado através de uma modificação covalente de uma cadeia lateral de um aminoácido que ocorre naturalmente, por modificação dos grupos terminais NH2 ou carboxilo.
15. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 14, em que o péptido de fusão compreende uma proteína veiculo, em particular transferrina ou albumina, como componente (IV).
16. Péptido de fusão de acordo com a reivindicação 14, em que, pelo menos, um dos aminoácidos é derivado por um grupo lípido ou hidrato de carbono.
17. Péptido de fusão de acordo com reivindicação 14 ou 16, em que um residuo de His N-terminal de GLP- (GLP-1 (7)) é quimicamente modificado no seu terminal NH2 e/ou na sua cadeia lateral de histidilo, em particular através de uma unidade hidrofóbica.
18. Método para produzir um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 17, através de síntese de péptidos em estado sólido. 5
19. Péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 17 como um medicamento para utilização em terapia humana ou animal.
20. Ácido nucleico que codifica um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 13 ou 15.
21. Vector compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20.
22. Célula hospedeira compreendendo ADN exogenamente introduzido de acordo com a reivindicação 20, em particular um vector de acordo com a reivindicação 21, sendo capaz de expressar o referido péptido de fusão, em que a célula hospedeira não é uma célula estaminal embrionária humana.
23. Método para produzir um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 13 ou 15, em que é fermentado um microrganismo transformado para incluir um ácido nucleico que codifica o péptido de fusão e a proteína é recuperada.
24. Método para produzir proteína de acordo com a reivindicação 23, em que as células animais são cultivadas sob condições em que a proteína é exportada a partir das células.
25. Utilização de um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 17, um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, um vector de acordo com a reivindicação 21 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22, para a preparação de um medicamento para 6 o tratamento de diabetes mellitus do tipo 1 ou tipo 2, resistência a insulina, distúrbios de peso e doenças ou estados associados a estas.
26. Utilização de um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 17, um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, um vector de acordo com a reivindicação 21 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22, para a preparação de um medicamento para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos e doenças ou estados associados a estes.
27. Utilização de um péptido de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 17, um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, um vector de acordo com a reivindicação 21 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22, para a preparação de um medicamento para o tratamento de distúrbios e doenças ou estados associados a apoptose. Lisboa, 28 de Janeiro de 2010 7