JP2023553362A - ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せを連結されて有する生物学的活性材料結合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、生物学的活性材料がビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体に関し、より詳しくは、ビオチン部分及び脂肪酸部分を連結されて有する生物学的活性材料結合体に関する。本発明に係る生物学的活性材料は、それに連結されているビオチン部分及び脂肪酸部分によって、優れたｉｎ－ｖｉｖｏ経口吸収率を発揮し、優れた薬物動態作用を有する。生物学的活性材料結合体であって、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せが生物学的活性材料に結合している、前記生物学的活性材料結合体。

Description

本発明は、生物学的活性材料がビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体に関するものであり、詳しくは、優れたｉｎ－ｖｉｖｏ経口吸収率を発揮し、優れた薬物動態作用を有する、生物学的活性材料がビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体に関するものであり、より詳しくは、ビオチン部分及び脂肪酸部分を連結されて有する生物学的活性材料結合体に関するものである。

薬物が有効に作用するためには、高い生物学的利用率が保証されていなければならない。生物学的利用率は、薬物投与後に標的部位で利用される薬物の度合いを意味し、当該度合いは、投与方法、標的環境などによって異なる。投与の様式によっては薬物が投与の部位から標的への送達の過程で消失または分解することがある。

典型的には、タンパク質及びポリペプチドなどを含めた治療剤の薬物送達は、非経口投与と経口投与とに分かれる。非経口投与法には、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、舌下投与などが含まれる一方、経口投与法は、薬物を経口的に服用することを意味する。ほとんどの治療剤、例えばタンパク質及びポリペプチドは、生物学的利用率、標的環境及び送達過程などの考慮から非経口法によって投与され、非経口投与法は、直接的かつ迅速な効果を発揮することが知られている。しかしながら、非経口投与は、患者に痛みまたは不快感を引き起こすことがあり、経路によっては副作用、例えば、注射による感染症、及び空気塞栓症が現れることがある。他方、経口投与は、［薬剤］が口から直接投与されるという点で簡便であり、持続的効果が発揮され得るという点において利点が存在する。それゆえ、多くの製薬会社は治療剤を経口投与によって投与することを試みてきたが、経口投与［によって投与された薬物］が消化管を通過するため酸性環境及び酵素的分解などに対する耐性が要求されるという点において課題がある。特に、タンパク質及びペプチドは、経口投与された場合に約０．１％という低い生物学的利用率を有することが知られている。

経口投与の課題を解決するために、界面活性剤及び吸収増強剤などを一緒に使用して別個な［経口］製剤を調製する試み、または薬物粒子を微粒子化すること及び投与の回数を調整することによって薬物の送達を増進する試みがなされてきた。そのような経口インスリン及び経口ＧＬＰ－１類似体が大手製薬会社によって開発されつつあり、加えて、インターフェロンアルファなどの経口投与のための様々な研究開発活動が進行中である。しかしながら、ペプチド及びタンパク質薬は経口投与するのが難しい材料であり、この課題を解決するために様々な試みがなされてきたが、今までのところ、それは明確には解決されていない。特に、ペプチド及びタンパク質薬は、経口投与された場合に経口吸収率が高くないという点で課題があり、この課題を解決するために様々な試みがなされているにもかかわらず、今までのところ、まだ明確な解決策がない。

本発明の目的は、生物学的活性材料がビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体を提供することであり、より詳しくは、優れたｉｎ－ｖｉｖｏ経口吸収率を発揮し、優れた薬物動態作用を有する、ビオチン部分及び脂肪酸部分を連結されて有する生物学的活性材料結合体を提供することである。

本発明の一態様は、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体、及びそれを調製する方法を提供する。

本発明の別の態様は、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体を含む医薬製剤を提供する。

本発明のまた別の態様は、経口投与のための製剤であって、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体を含む、当該製剤を提供する。

本発明の特定の態様は、ビオチン部分及び脂肪酸部分を連結されて有する生物学的活性材料結合体、ならびにそれを調製する方法を提供する。

本発明のまた別の態様は、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、過敏性腸症候群、神経変性疾患、骨疾患、骨粗鬆症、ヒト成長ホルモン欠乏症、がんまたは非アルコール性脂肪性肝疾患を予防または治療するための医薬製剤であって、ビオチン部分及び脂肪酸部分を連結されて有する生物学的活性材料結合体を含む、当該製剤を提供する。

本発明の一実施形態によるビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体は、それに連結された水溶性ビオチンを有して優れた作用を示す。具体的には、当該作用は、経口吸収を改善すること、薬物動態作用を改善すること、酵素による生理活性材料の分解から保護すること、生理活性材料の腸管膜透過を、またはナトリウム依存性マルチビタミントランスポーターによる能動輸送及び吸収を促進することを含む。

さらには、本発明の一実施形態によるビオチン部分及び脂肪酸部分と結合体化した生物学的活性材料結合体は、ビオチン部分のみと、または脂肪酸部分のみと結合体化した結合体と比較して、上記作用の各々に関してさらに改善された作用を発揮する。

本発明の一実施形態による結合体１４の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体１５の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体１６の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体１７の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体１８の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体１９の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体２０の最終生成物のクロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体２４の最終生成物のクロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体２０及び２４について、グルコースを投与した後の血中グルコースレベルの変化を示す図である。 本発明の一実施形態による結合体５１の最終生成物のクロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５２の最終生成物のクロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５３の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５４の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５３及び５４について、グルコースを投与した後の血中グルコースレベルの変化を示す図である。 本発明の一実施形態による結合体５５の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５７の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５８の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５９の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５６の最終生成物のクロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体５８～５９を２週間にわたって皮下注射した後の体重変化を示す図である。 本発明の一実施形態による結合体６０の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６１の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６２の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６３の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６４の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体３３、３６、３９、４２、６１、６２、６３及び６４を経口投与した後の食餌摂取レベルを示す図である。 本発明の一実施形態による結合体６６の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６５及び６６を経口投与した後の血中グルコース調節能力を示す図である。 本発明の一実施形態による結合体６９の精製クロマトグラムである。 本発明の一実施形態による結合体６８及び６９の細胞内蓄積量を示す図である。

［発明を実施するための最良の形態］
本発明の一態様は、ビオチン部分及び脂肪酸部分と結合体化した生物学的活性材料結合体、ならびにそれを調製する方法を提供する。

［発明を実施するための形態］
以下本明細書において、本発明の実施形態及び実用実施例を、本発明が属する分野の当業者が本発明を容易に実施し得るように詳しく記載することにする。

しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具現され得、本明細書に記載の実施形態及び実用実施例に限定されない。本発明の明細書全体を通して、一部分が、ある特定の成分を「含む」場合、それは、特に断らない限り、他の成分を排除することではなく他の成分がさらに含まれていてもよいことを意味する。

「約」、「実質的に」などの用語は、本発明の明細書全体を通して使用されている限りにおいて、記されている製造及び材料公差に本来備わっている数値と等しいかまたはそれに近い値を指すために使用され、本発明の理解を助けるためまたは本開示の不正利用による不当な侵害を防ぐために使用される。本発明の明細書全体を通して使用される「～（する）ステップ」または「のステップ」という用語は、「～のためのステップ」を意味しない。

本発明の明細書全体を通して、マーカッシュ形式の表現の中に含まれている「その組合せ」という用語は、マーカッシュ形式の表現の中に記されている構成要素を含む群から選択される少なくとも１つの混合物または組合せを指しており、構成要素を含む群から選択される少なくとも１つが含まれることを意味している。本発明の明細書全体を通して、「及び／またはＢ」という語句は、「及びＢ、またはＡもしくはＢ」を意味する。

本発明の一態様は、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと結合体化した生物学的活性材料結合体、及びそれを調製する方法を提供する。

本発明の１つの特定の態様は、ビオチン部分及び脂肪酸部分と結合体化した生物学的活性材料結合体、ならびにそれを調製する方法を提供する。

典型的には、ペプチド及びタンパク質薬は、水溶性が高く、消化管での吸収部位に制限があるため、生物薬剤学分類システム（ＢＣＳ）のクラス３に相当する。ペプチド及びタンパク質薬は、高い親水性及び大きな分子量を有し、低ｐＨの胃酸によって分解し得、トリプシンなどの酵素による攻撃に起因して腸内吸収率が低い。典型的には、ペプチド及びタンパク質薬の経口生物学的利用率（ＢＡ）は約０．１％であり、このため、医薬製剤としてそれらを使用することが難しくなっている。この課題に対処するために、腸溶性カプセルを使用して胃内を通過させる技術が用いられるが、この方法には、ペプチド及びタンパク質の吸収率が根本的に改善され得ないという点において限界がある。

対照的に、本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体は、腸管膜透過を増進することによって腸内での吸収を促進することができる。

さらには、本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体は、傑出した薬物動態作用を発揮することができる。

さらには、本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体は、酵素による生物学的活性材料、例えばペプチドの分解から保護することができ、究極的には、生物学的活性材料による腸管膜の透過、及び腸内でのその吸収を促進することができる。

さらには、本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体は、水溶性ビタミンの一種であるビオチンに結合していることによって、ナトリウム依存性マルチビタミントランポーターによる能動輸送によって吸収され得る。

さらには、本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せは、生物学的活性材料の活性部位または不活性部位に結合され得、それゆえ、生物学的活性材料の活性を阻害しない。

本発明において、「非置換または置換」は、非置換または置換を意味する。「置換された」は、１つ以上の置換基を有することを意味し、置換基は、主要基、例えばアルキレンまたはヘテロアルキレンの任意の原子に共有結合または縮合している化学部分を指す。

本発明において、「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などを意味する。

本発明において、「アルキル」は、脂肪族または脂環式の飽和または不飽和炭化水素化合物、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ネオペンチルなどの炭素原子から水素原子を除去することによって得られる一価部分を指す。

本発明において、「ヘテロアルキル」は、１つ以上のヘテロ原子を含有するアルキルであり、当該ヘテロ原子は、アルキルの任意の１つの炭素原子に位置してＣ、ＣＨ、ＣＨ_２またはＣＨ_３を置き換えているヘテロ原子である。

本発明において、「アルキレン」は、脂肪族または脂環式の飽和または不飽和炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を除去することによって得られる二価部分を意味する。

本発明において、「アルケニレン」は、脂肪族または脂環式の飽和または不飽和炭化水素化合物の炭素原子から水素原子を除去することによって得られる一価部分を意味する。

本発明において、「ヘテロアルキレン」は、１つ以上のヘテロ原子を含有するアルキレンを意味する。

本発明において、「アリール」は、環原子を有する芳香族化合物の芳香環原子から水素原子を除去することによって得られる一価部分を意味する。例えば、「Ｃ_５－１０アリール」は、５～１０個の炭素の環原子を有する芳香族化合物の芳香環原子から水素原子を除去することによって得られる一価部分を意味する。アリールの例としては、ベンゼン、アセナフテン、フルオレン、フェナレン、アセフェナントレン及びアセアントレンから誘導される基が挙げられる。

本発明において、「ヘテロアリール」は、１つ以上のヘテロ原子を含むアリール、例えば、ピリジン、ピリミジン、ベンゾチオフェン、フリル、ジオキサラニル、ピロリル、オキサゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンゾジオキサン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ベンゾオキサジン、ベンゾジアジン、ピリドピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジン、ナフチリジン、プテリジン、ペリミジン、ピリドインドール、オキサントレン、フェノキサチン、フェナジン、フェノキサジンなどである。

本発明において、「アリーレン」は、環原子を有する芳香族化合物の芳香環原子から水素原子を除去することによって得られる二価部分を意味する。

本発明において、「ヘテロアリーレン」は、１つ以上のヘテロ原子を含有するアリーレンを意味する。

本発明において、「アルケニル」は、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有するアルキル、例えば、ビニル（－ＣＨ＝ＣＨ_２）、１－プロペニル（－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３）、イソプロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどである。

本発明において、「アルキニル」は、１つ以上の炭素－炭素三重結合を有するアルキル基であり、その例としては、エチニル及び２－プロピニルが挙げられる。

本発明において、一般式の一部分が特定の化合物として定義されている場合、それは、当該化合物を他の成分と化合させた形態を含む。

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分は、以下の一般式Ａで表され得る。
〔一般式Ａ中、
Ｘは、生物学的活性材料に結合することができる官能基であり、
Ｙはスペーサーであり、
Ｚは結合単位であり、
Ｂは、以下の化学式Ａ－１、


で表され得、
Ｚは、化学式Ａ－１の
と連結されており、
Ｔは末端基であり、
ｍは１～１０の整数であり、
ｎは０または１～１０の整数であり、ｎ＝０である場合にはＹはＢまたはＴに直接結合しており、
ｐは０または１の整数である〕。

本発明の一実施形態によれば、一般式Ａにおいて、Ｘは、生物学的活性材料に結合することができる官能基である。それに限定されないが、官能基は、チオール基、カルボキシル基及び／またはアミン基と反応することができる官能基、例えば、マレイミド、スクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、カルボキシル基、カルボキシルエステル、スクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニル、－Ｏ－テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ、２，３，５，６－テトラフルオロフェニル）、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）、ペンタフルオロフェニルエステル、－Ｏ－ベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）、ニトロフェノール及び炭酸ニトロフェニル（ＮＰＣ）である。

本発明の一実施形態では、官能基Ｘは、生物学的活性材料に結合したとき、その構造を保持していてもよく、または除去もしくは改変されていてもよい。

Ｙはスペーサーであり、体内における開裂性を有する構造を有し得る。それに限定されるわけではないが、例えば、Ｙは、直接結合であってもよく、または置換もしくは非置換アルキレン、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－もしくは－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ－、－ＮＯＲ－、またはそれに類似するものを含んでいてもよい。より詳しくは、Ｙは、直接結合であってもよく、あるいはＹの構造が、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリーレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０ヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－または－ＮＯＲ－を含む群の少なくとも１つを含んでいてもよく、Ｒは、水素、または非置換Ｃ_１－５０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリール、またはエチレングリコール繰り返し単位（－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－、式中、ｎは、少なくとも１であるが２０を上回らない整数である）である。

Ｚは、Ｂと結合することができる結合単位であり、例えば、限定はされないが、アミノ酸、ポリペプチド、アルキレン、アミンまたはポリアミドアミン構造を含み得る。

アミノ酸の非限定的な例には、リジン、５－ヒドロキシリジン、４－オキサリシン、４－チアリジン、４－セレナリジン、４－チアホモリジン、５，５－ジメチルリジン、５，５－ジフルオロリジン、ｔｒａｎｓ－４－ジヒドロリジン（ｔｒａｎｓ－４－デヒドロリジン）、２，６－ジアミノ－４－ヘキシン酸、ｃｉｓ－４－ジヒドロリジン（ｃｉｓ－４－デヒドロリジン）、６－Ｎ－メチルリジン、ジアミノピメリン酸、オルニチン、３－メチルオルニチン、α－メチルオルニチン、シトルリン、ホモシトルリン、アルギニン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、オルニチン、プロリン、セリン、スレオニンなどが含まれ得る。

本発明において、ｎが０である場合、ＢまたはＴはＸまたはＹ（スペーサー）と直接結合し得る。

本発明において、Ｔは末端基であり、水素またはＮＨ_２であり得るが、これらに限定されない。

本発明において、ｐが０である場合、Ｂは末端部であり得る。

本発明において、Ｘ－Ｙは、一緒になって生物学的活性材料結合部位を形成していてもよい。

本発明の実施形態によれば、一般式Ａにおいて、ｍは１～１０の整数であり得、詳しくは、整数、または１～８、１～５もしくは１～４であり得る。

本発明の一態様では、Ｘは、マレイミド、スクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、スクシンイミジル メチルエステル、スクシンイミジル ペンチルエステル、炭酸スクシンイミジル、炭酸ｐ－ニトロフェニル、アルデヒド、アミン、チオール、オキシアミン、ヨードアセトアミド、アミノオキシル、ヒドラジド、ヒドロキシ、プロピオネート、ピリジル、アルキルハライド、ビニルスルホン、カルボキシル、ヒドラジド、ハロゲンアセトアミド、Ｃ_２－５アルキニル、Ｃ_６－２０アリールジスルフィド、Ｃ_５－２０ヘテロアリールジスルフィド、イソシアネート、チオエステル、イミノエステル、及びその誘導体からなる群から選択され得る。

本発明の特定の態様では、Ｘは、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、炭酸スクシンイミジル、炭酸ｐ－ニトロフェニル、チオール、アミノオキシル、アルデヒドまたはアミンである。

本発明の特定の態様では、Ｘは、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒドまたはアミンである。

本発明の一態様では、Ｙは、存在していないか、あるいは置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－５０アルキレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－５０ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_６－５０アリーレン、または置換もしくは非置換Ｃ_６－５０ヘテロアリーレンであり、置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ及び－ＮＨ_２を含む群から選択される少なくとも１つを含む。

本発明の一態様では、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－を含む。本発明の一態様では、Ｙは－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－を含む。

本発明の一態様では、Ｙは、置換直鎖状または分岐状Ｃ_１－５０ヘテロアルキレンであり、少なくとも１つの－Ｃ（Ｏ）－を含む。

本発明の一態様では、Ｙは、－（Ｃ（Ｏ））_ｑ－（ＣＨ_２）_ｒ－（Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｓ－（ＣＨ_２）_ｒ－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｔ－（Ｃ（Ｏ））_ｑであり、式中、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは独立して選択され、ｑ及びｓは０または１であり、ｒは１～２０の整数であり、ｔは０～２０の整数である。

本発明の一態様では、Ｙは、－（ＣＨ_２）_ｒＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ－であり、ｒは１～２０の整数である。

本発明の一態様では、Ｙは、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み、式中、ｕは１～２０の整数である。

本発明の一態様では、Ｙは、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み、式中、ｕは２～４の整数である。

本発明の一態様では、Ｙは成分としてアミノ酸を含む。

本発明の特定の態様では、Ｙは、成分としてグルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシンまたはリジンを含み、各アミノ酸は、結合した形態で存在し得る。

本発明の特定の態様では、Ｙは、成分としてグルタミン酸またはリジンを含む。

本発明の態様では、Ｙは、成分として脂肪酸を含む。

本発明の特定の態様では、ＹはＣ_{１２－２４}脂肪酸を含み、当該脂肪酸は、結合した形態で存在し得る。

本発明の一態様では、Ｙは直接結合である。

本発明の一態様では、Ｚは、各々独立して選択され得る以下：
Ａ）Ｘと一緒に、またはＸとは別個に、アミノ酸またはその誘導体を形成している；
Ｂ）置換または非置換直鎖状または分岐状Ｃ_１－５０ヘテロアルキレン（ｈｅｔｅｒｏａｌｋｙｅｎｅ）であり、
置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ及び－ＮＨ_２を含む群から選択される少なくとも１つを含む、
のいずれか１つである。

本発明の一態様では、Ｚは－ＮＨ－によってＢに連結されている。

本発明の一態様では、Ｚは親水性アミノ酸またはその誘導体である。

本発明の特定の態様では、Ｚは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラゲン、スレオニン、システイン、セリン及びその誘導体から構成される群から選択され得る。

本発明の一態様では、Ｚは、少なくとも１つのグリセロール、少なくとも１つのポリエチレングリコール、またはその組合せを含む。

本発明の一態様では、Ｚは、
を含み、
は結合部位を表し、当該結合部位の少なくとも１つに、少なくとも１つの
が結合し、式中、ｕは１～２０の整数である。

本発明の一態様では、Ｚは、
を含み、
に－（ＣＨ_２）_３ＮＨ－がさらに結合している。

本発明の実施形態では、ビオチン部分は、

から構成される群から選択される。

本発明の一実施形態によれば、脂肪酸部分は、以下の一般式Ｂ：
［一般式Ｂ］
Ｘ’－Ｙ’－Ｗ
〔上記式中、
Ｘ’は、生物学的活性材料に結合することができる官能基であり、
Ｙ’はスペーサーであり、
Ｗは脂肪酸である〕
で表され得る。

本明細書において、脂肪酸は、長い飽和または不飽和脂肪族鎖を有するカルボン酸を含み、これには、例えば、限定はされないが、カプリル酸、飽和脂肪酸の一種であるラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、セロチン酸、不飽和脂肪酸の一種であるミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファリノレン酸などが含まれる。

本発明の一実施形態によれば、一般式Ｂにおいて、Ｘ’は、生物学的活性材料に結合することができる官能基である。ここで、Ｘ’は、一般式Ａ中のＸと同じである。したがって、本発明の一実施形態では、官能基Ｘ’は、生物学的活性材料に結合したとき、その構造を保持していてもよく、または除去もしくは改変されていてもよい。

本発明の一実施形態によれば、一般式Ｂにおいて、Ｗは脂肪酸に相当し得る。ここで、脂肪酸には、単純なもの、修飾されたもの、付加されたもの、欠失されたものなどを含めたあらゆる種類の脂肪酸が含まれる。

本発明の一態様では、Ｙ’は、一般式Ｙ中のＹと同じである。したがって、本発明の一実施形態では、スペーサーＹ’は、直接結合であってもよく、あるいは置換もしくは非置換アルキレン、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、もしくは－Ｓ－、－ＮＲ－、－ＮＯＲ－、または類似するものを含んでいてもよい。より詳しくは、Ｙは、直接結合であってもよく、あるいはＹの構造が、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリーレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０ヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－または－ＮＯＲ－を含む群の少なくとも１つを含んでいてもよく、Ｒは、水素、または非置換Ｃ_１－５０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリール、またはエチレングリコール繰り返し単位（－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－、式中、ｎは、少なくとも１であるが２０を上回らない整数である）である。

本発明の一態様では、Ｗは、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０アルキレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０アルケニレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０ヘテロアルキレン、または置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０ヘテロアルケニレンであり、置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ、－ＮＨ_２及びハロを含む群から選択される少なくとも１つで置換されていてもよい。

本発明の一態様では、Ｗは、少なくとも１つが置換されているＣ_{１２－２４}アルキレン、または少なくとも１つが置換されているＣ_{３６－４８}ヘテロアルキレンであり、置換されている場合には＝Ｏまたは－ＣＯＯＨを含み得る。

本発明の特定の態様では、少なくとも１つが置換されているＷは、置換または非置換Ｃ_{１２－２４}飽和脂肪酸であり、置換されている場合には－ＣＯＯＨを含む。

本発明の一態様では、脂肪酸部分は、以下の一般式Ｂ１の化学式：
［一般式Ｂ１］
Ｘ’_１－Ｙ’－Ｃ（Ｏ）－Ｆ_１
〔上記式中、
Ｘ’_１は、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、アミン、テトラフルオロフェニルエステルまたはニトロフェノールであり、
Ｙ’はスペーサーであり、
Ｆ_１は、Ｃ_６－２８置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状アルキレン、または置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状ヘテロアルキレンである〕
を有し得る。

本発明の一態様によれば、一般式Ｂ－１において、Ｘ_１は、一般式Ａ及びＢの中のＸと同じであり得る。したがって、本発明の一態様では、官能基Ｘ_１は、生物学的活性材料に結合したとき、その構造を保持していてもよく、または除去もしくは改変されていてもよい。

さらには、一般式Ｂ１において、Ｙ’は、一般式Ａ及びＢの中のＹと同じであり得る。

本発明の一態様では、Ｙ’は、置換または非置換Ｃ_６－５０直鎖状または分岐状ヘテロアルキレンであり、置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ及び－ＮＨ_２を含む群から選択される少なくとも１つを含む。

本発明の一態様では、Ｙ’は、繰り返し単位として－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）－を含み得る。

本発明の一態様では、Ｙ’は、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み得、式中、ｕは１～２０の整数である。

本発明の特定の態様では、Ｙ’は、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み、式中、ｕは２～４の整数である。

本発明の一態様では、Ｙ’は、成分としてアミノ酸またはその誘導体を含む。

本発明の特定の態様では、Ｙ’は、成分としてグルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシンまたはリジンを含み、各アミノ酸は、結合した形態で存在し得る。

本発明の特定の態様では、Ｙ’は、成分としてグルタミン酸またはリジンを含む。

本発明の一態様では、Ｆ_１は、置換または非置換Ｃ_{１０－２８}直鎖状または分岐状アルキレンであり得る。

本発明の特定の態様では、少なくとも１つが置換されているＷは、置換または非置換Ｃ_{１２－２４}飽和脂肪酸であり、置換されている場合には－ＣＯＯＨを含む。

本発明の特定の態様では、Ｆ_１は－（ＣＨ_２）_ｖ－ＣＯＯＨであり、式中、ｖは１０～２０の整数である。

本発明の特定の態様では、Ｆ_１は－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｖ－ＣＯＯＨであり、式中、ｖは１０～２０の整数である。

本発明の特定の態様では、脂肪酸部分は、

から構成される群から選択され得る。

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分と生物学的活性材料との間の結合は、様々な結合によって形成され得る。それは、ビオチン部分の官能基を生理活性材料の官能基と結合させることによって形成され得、例えば、限定はされないが、チオール－エーテル結合、またはアミド結合として形成され得る。

１つの特定の例では、ビオチン部分と生物学的活性材料との間の結合は、以下の反応式１の方法によって形成され得る。反応式１では、
が、チオール基を含む生物学的活性材料を表しており、本発明の実施形態によるマレイミドを含むビオチン部分と生物学的活性材料中に存在するシステイン残基のチオール基（－ＳＨ）との反応を表す。

１つの特定の例では、ビオチン部分と生物学的活性材料との間の結合は、以下の反応式２の方法によって形成され得る。反応式２では、
が、アミン基を含む生物学的活性材料を表しており、本発明の実施形態によるＮ－ヒドロキシスクシンイミドを含むビオチン部分と生物学的活性材料中に存在するアミン基（－ＮＨ_２）との反応を表す。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料に対する限定は特に存在し得ない。

本発明において、生物学的活性材料は、特定の目的のために体に投与され得る、及び体内で生理学的または生化学的応答を生じさせる、材料である。

本発明の実施形態によれば、生物学的活性材料は、医薬製剤に使用される材料であり得る。例えば、それは、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、過敏性腸症候群、神経変性疾患、骨疾患、骨粗鬆症、ヒト成長ホルモン欠乏症、抗がん性または非アルコール性脂肪性肝疾患の予防または治療のために使用される材料であり得る。これらは非限定的な例である。なぜなら、適応症は生物学的活性材料の種類によって様々であり得るからである。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料は、限定はされないが、ポリペプチドまたは非ペプチド性ポリマーであり得る。非限定的な例としては、ポリペプチド、タンパク質、多糖、またはその誘導体が挙げられる。生物学的活性材料の非限定的な例としては、グルカゴン（グルガコン）、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）、ＧＬＰ－２（グルカゴン様ペプチド－２）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、エキセンジン－４、インスリン、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、エリスロポエチン、カルシトニン、アミリン、セロトニン、リツキシマブ、トラスツズマブ、ウリカーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、サイモグロビン、ワクチン、ヘパリンまたはヘパリン類似体、アンチトロンビンＩＩＩ、フィルグラスチム、酢酸プラムリンチド、エキセナチド、エプチフィバチド、アンチベニン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＨＧＨ、サイロキシン、第ＶＩＩ及び第ＶＩＩＩ血液凝固因子、治療剤として作用する糖脂質、ならびにその誘導体が挙げられる。

本発明の一実施形態によれば、［生物学的活性材料］をビオチン部分に結合させてもよい。

ビオチン部分を生物学的活性材料に結合させることによって、生物学的活性材料の生物学的活性を阻害しないことが可能であり、それによって、生物学的活性材料と同じ生物学的活性、または改善された生物学的活性を有することが可能である。

生物学的活性材料は、限定はされないが、ビオチン部分が－ＳＨ基に結合し得るように、露出した－ＳＨ基を含み得る。加えて、生物学的活性材料は、露出した－ＮＨ_３ ^＋基または－ＮＨ_２基にビオチン部分が結合し得るように、露出した－ＮＨ_３ ^＋基または－ＮＨ_２基を含み得る。

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分の生物学的活性材料との結合部位は、活性を呈する部位を避けつつ結合するように調整され得る。

さらには、本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料に脂肪酸部分が直接結合していてもよい。さらには、脂肪酸部分の一部がビオチン部分と共有されていてもよい。例えば、以下の実施形態の一実施形態では、ビオチン部分Ｂ３５及びＢ３６は、脂肪酸部分の一部分である脂肪酸構成部分を共有している。但し、これは一例にすぎず、本発明はこれに限定されない。

さらには、本発明の一実施形態によれば、脂肪酸部分は、ビオチン部分が結合している部位以外の生物学的活性材料の部位で生物学的活性材料に結合していてもよい。

さらには、脂肪酸部分は、ビオチン部分と同様に、生物学的活性材料の活性部位または不活性部位に結合していてもよく、上記と同じ特性を呈し得る。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料にはビオチン部分及び脂肪酸部分の両方が結合していてもよく、ビオチン部分及び脂肪酸部分の両方が結合した生物学的活性材料結合体は、ビオチン部分のみまたは脂肪酸部分のみが結合した結合体に比べて優れた経口吸収率、薬物動態、酵素分解阻害、腸管膜透過などを発揮し得る。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料は、グルカゴン、カルシトニン、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－２、ＧＩＰ、エキセンジン－４、副甲状腺ホルモン、インスリン、アミリン、ヒト成長ホルモン、またはその誘導体であり得る。

本発明の実施形態によれば、生物学的活性材料は、以下の配列番号１～７のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドまたはその誘導体であり得る。詳しくは、配列番号１～７の生物学的活性材料はそれぞれ、グルカゴン誘導体（配列番号１）、ＧＬＰ－１（配列番号２）、ＧＬＰ－２（配列番号３）、ＧＩＰ（配列番号４）、エキセンジン－４（配列番号５）、副甲状腺ホルモン（配列番号６）及びグルカゴン（配列番号７）である。
配列番号１：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＶＱＷＬＭＮＴ
配列番号２：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ
配列番号３：ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ
配列番号４：ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ
配列番号５：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号６：ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ
配列番号７：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ

加えて、生物学的活性材料は、配列番号１５及び１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１７及び１６のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

加えて、生物学的活性材料は、配列番号１５及び１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１７及び１６のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得、当該タンパク質は、配列番号１５または１７の第６及び第１１システイン間、配列番号１５または１７の第７システインと配列番号１６の第７システインとの間、ならびに配列番号１５または１７の第２０システインと配列番号１６の第１９システインとの間のジスルフィド結合によって連結されている。詳しくは、配列番号１５及び１６のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１７及び１６のアミノ酸配列を有する生物学的活性材料は、インスリン（配列番号１５（インスリンＡ鎖誘導体）及び１６（インスリンＢ鎖）／配列番号１７（インスリンＡ鎖）及び１６（インスリンＢ鎖））を表す。
配列番号１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮ
配列番号１６：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
配列番号１７：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分との結合の部位を調整するためにポリペプチドに対してシステインによる置換または挿入がなされ得る。

非限定的な例において、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸の任意の少なくとも１つは、システインアミノ酸で置換または挿入され得る。ここで、ビオチン部分は、システインアミノ酸の－ＳＨ基に結合する。

さらには、上記アミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸の任意の少なくとも１つは、リジンアミノ酸で置換または挿入され得る。ここで、ビオチン部分は、リジンアミノ酸の－ＮＨ_２基に結合する。

さらには、システインアミノ酸が挿入されるポリペプチドは、以下の配列番号８～１４のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドであり得る。詳しくは、以下の配列番号８～１４の生物学的活性材料は、システインアミノ酸で置換または挿入された配列番号１～７の生物学的活性材料を表す（例えば、配列番号８の生物学的活性材料では、配列番号１の生物学的活性材料のアミノ酸の少なくとものいずれか１つがシステインで置換されている）。
配列番号８：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＶＱＷＬＭＮＴＣ
配列番号９：ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ
配列番号１０：ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤＣ
配列番号１１：ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱＣ
配列番号１２：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ
配列番号１３：ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦＣ
配列番号１４：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＣ

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分との結合の部位を調整するためにポリペプチドの一部が置換され得る。

さらには、本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分との結合の部位を調整するためにポリペプチドに対してアミノ酸リジンによる置換または挿入がなされ得る。

非限定的な例において、配列番号５で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つは、アミノ酸リジンで置換または挿入され得る。

別の非限定的な例において、配列番号５で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つは、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され得るとともにリジンアミノ酸が挿入され得る。ここで、ビオチン部分はリジンアミノ酸の－ＮＨ_２基に結合する。

さらには、一部が置換された、またはリジンアミノ酸で置換もしくは挿入されたポリペプチドは、以下の配列番号１８～２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。詳しくは、以下の配列番号１８～２１の生物学的活性材料は、配列番号５の生物学的活性材料のアミノ酸の一部に対して置換または挿入がなされたエキセンジン－４誘導体を表す。
配列番号１８：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ
配列番号１９：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫＫＫ
配列番号２０：Ｈ（Ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ
配列番号２１：Ｈ（Ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫＫＫ

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料は、以下の配列番号２２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体であり得る。以下の配列番号２２の生物学的活性材料はアミリンを表す。
配列番号２２：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分との結合の部位を調整するために、配列番号２２で表されるアミノ酸配列の一部に置換または挿入がなされ得る。

非限定的な例において、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸の任意の少なくとも１つは、アミノ酸プロリン、アスパラギン酸またはアルギニンで置換され得る。別の非限定的な例において、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸の任意の少なくとも１つは、アミノ酸リジンで置換され得る。

さらには、配列番号２２で表されるアミノ酸の一部に置換または挿入がなされたポリペプチドは、以下の配列番号２３～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。詳しくは、以下の配列番号２３～３１の生物学的活性材料は、配列番号２２の生物学的活性材料のアミノ酸の一部に置換または挿入がなされたアミリン誘導体を表す。
配列番号２３：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹＫ
配列番号２４：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ
配列番号２５：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹＫ
配列番号２６：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＬＡＤＦＬＲＨＳＳＰＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＲＴＹ
配列番号２７：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＤＦＬＬＲＨＳＳＰＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＲＴＹＫ
配列番号２８：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＤＦＬＬＲＨＳＳＮＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＲＴＹ
配列番号２９：ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＤＦＬＬＲＨＳＳＮＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＲＴＹＫ
配列番号３０：ＲＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＤＦＬＬＲＨＳＳＮＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＫＴＹ
配列番号３１：ＲＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＤＦＬＬＲＨＳＳＮＮＦＧＡＩＰＳＳＴＮＶＧＳＫＴＹＫ

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料は、以下の配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体であり得る。以下の配列番号３２の生物学的活性材料はエキセンジン－４誘導体を表す。
配列番号３２：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分との結合の部位を調整するために配列番号３２のアミノ酸配列の一部に欠失、置換または挿入がなされ得る。

非限定的な例において、配列番号３２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つは、アミノ酸メチオニン、リジン、イソロイシン、トリプトファンまたはグリシンで置換され得る。別の非限定的な例において、配列番号３２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つは欠失され得る。

さらには、配列番号３２で表されるアミノ酸の一部に欠失、置換または挿入がなされたポリペプチドは、以下の配列番号３３～３７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。詳しくは、配列番号３２の生物学的活性材料のアミノ酸の一部に欠失、置換または挿入がなされた以下の配列番号３３～３７の生物学的活性材料は、エキセンジン－４誘導体を表す。
配列番号３３：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＭＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号３４：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＫＩＡＡＱＤＦＶＱＷＬＩＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号３５：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＷＹＬＤＫＩＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＧＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号３６：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＷＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＭＧＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
配列番号３７：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＷＬＤＫＩＡＡＱＤＦＶＱＷＬＩＧＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ

本発明の一実施形態によれば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つは２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され得る。

本発明の一実施形態によれば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つが２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され、任意の少なくとも１つがＤｅｓ－アミノ－Ｈｉｓ（ｈ）で置換されたポリペプチドは、以下の配列番号３８～３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。詳しくは、配列番号１２の生物学的活性材料のアミノ酸が置換された以下の配列番号３８または３９の生物学的活性材料は、エキセンジン－４誘導体を表す。より詳しくは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する生物学的活性材料は、アミノ酸の少なくとも１つがＤｅｓ－アミノ－Ｈｉｓ（ｈ）で置換された生物学的活性材料である。
配列番号３８：Ｈ（Ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ
配列番号３９：ｈ（Ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ

本発明の一実施形態によれば、配列番号８で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つはリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）で置換され得る。

配列番号８で表されるアミノ酸配列のアミノ酸の任意の少なくとも１つがリジンまたはアルギニンで置換されたポリペプチドは、以下の配列番号４０～４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。詳しくは、配列番号８の生物学的活性材料のアミノ酸が置換された以下の配列番号４０または４１の生物学的活性材料は、グルカゴン誘導体を表す。
配列番号４０：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＶＱＷＬＭＮＴＫ
配列番号４１：Ｈ（Ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＫＲＡＫＥＦＶＱＷＬＭＮＴＣ

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体であり得る。詳しくは、配列番号４２の生物学的活性材料はヒト成長ホルモン誘導体を表す。
配列番号４２：
ＭＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＩＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せが結合した生理活性材料は、ペプチド及び非ペプチド性ポリマー、脂肪酸、コレステロール、抗体、抗体断片、アルブミン及びその断片、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン、ＦｃＲｎ結合性材料、糖、エラスチン、ヘパリン、ならびにその誘導体を含む群から選択される任意の少なくとも１つと共有結合され得る、またはそれによる封入体（マイクロスフェア）を形成し得る。

非ペプチド性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸－グリコール酸）、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、及びその組合せから構成される群から選択され得る。

本発明の別の態様は、ビオチン部分と結合体化された生物学的活性材料を調製する方法であって、ビオチン部分を得るステップ；ビオチン部分を生物学的活性材料と反応させるステップ；及びビオチン部分と結合体化された生物学的活性材料を反応の完了後に単離するステップを含む、当該方法を提供する。

本発明のまた別の態様は、ビオチン部分及び脂肪酸部分と結合体化された生物学的活性材料を調製する方法であって、ビオチン部分を得るステップ；ビオチン部分を生物学的活性材料と反応させるステップ；ビオチン部分と生物学的活性材料との反応の完了後に［生成物］を脂肪酸部分と反応させるステップ；ならびにビオチン部分及び脂肪酸部分と結合体化された生物学的活性材料を反応の完了後に単離するステップを含む、当該方法を提供する。

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分を得るステップにおいて、ビオチン部分は、上記一般式Ａで表され得る。

本発明の一実施形態によれば、脂肪酸部分は、上記一般式Ｂで表され得る。

本発明の一実施形態によれば、混合物を得るステップにおいて、生物学的活性材料に対するビオチン部分の反応モル比率は０．５以上であり得る。詳しくは、生物学的活性材料に対するビオチン部分の反応モル比率は０．５～３０であり得る。上記反応モル比率は、ビオチン部分の分子構造、分子量または溶解性、反応混合物のｐＨ、反応温度、反応時間などを考慮して適切に選択され得る。

本発明の一実施形態によれば、混合物を得るステップにおいて、生物学的活性材料に対する脂肪酸部分の反応モル比率は０．５以上であり得る。詳しくは、生物学的活性材料に対する脂肪酸部分の反応モル比率は０．５～２０であり得る。上記反応モル比率は、脂肪酸部分の分子構造、分子量または溶解性、反応混合物のｐＨ、反応温度、反応時間などを考慮して適切に選択され得る。

生物学的活性材料の形態に応じて、混合物を得るステップでの生物学的活性材料に対するビオチン部分の反応モル比率は２０以上であり得る。詳しくは、生物学的活性材料に対するビオチン部分の反応モル比率は２０～２５であり得る。

さらには、生物学的活性材料の形態に応じて、混合物を得るステップでの生物学的活性材料に対する脂肪酸部分の反応モル比率は６以上であり得る。詳しくは、生物学的活性材料に対する脂肪酸部分の反応モル比率は６～１２であり得る。

本発明の一実施形態によれば、反応は、緩衝液または有機溶媒を使用して行われ得る。緩衝液または有機溶媒に関しては特に限定はなく、当技術分野で典型的に使用される緩衝液が、ビオチン部分及び脂肪酸部分の構造に応じて適切に選択され得る。

本発明の一実施形態では、反応ステップの温度及び継続時間は、ビオチン部分、脂肪酸部分及び生物学的活性材料の特質に応じて適切に調整され得る。本発明はこれに限定されるものではないが、反応は、例えば、４℃で３時間以上にわたって行われ得る、または室温でより短い時間にわたって行われ得る。これは、使用されているビオチン部分もしくは脂肪酸部分の反応性の度合い、またはその組合せに関係し得る。適切な反応時間が経過した時点で、反応混合物のｐＨを下げることによって反応が停止され得る。

本発明の一実施形態によれば、反応ステップの後に、未反応材料を除去するステップが行われ得る。未反応材料を除去するステップは、当該分野で通常用いられている方法を用いて行われ得る。例えば、本発明は以下に限定されないが、除去は、適切な緩衝液、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの溶液を使用して透析などを用いて行われ得る。

本発明の一実施形態によれば、単離ステップの後に精製ステップが含められ得る。単離及び精製ステップは、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われ得るが、これらに限定されない。

本発明のまた別の態様は、上記のビオチン部分もしくは脂肪酸部分に、またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体を含む医薬製剤を、提供する。

本発明の別の特定の態様は、上記のビオチン部分及び脂肪酸部分に結合した生物学的活性材料結合体を含む医薬製剤を提供する。

ここで、医薬製剤の使用は、生物学的活性材料の種類に応じて決定され得る。さらには、医薬製剤は経口投与のために製剤化され得る。

本発明の一実施形態によれば、糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、過敏性腸症候群、神経変性疾患、骨疾患、骨粗鬆症、ヒト成長ホルモン欠乏症、がんまたは非アルコール性脂肪性肝疾患の予防または治療のために使用される医薬製剤が提供され得る。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料がＧＬＰ－１、ＧＬＰ－２、ＧＩＰ、インスリン、アミリンまたはその誘導体である場合、結合体は、糖尿病の予防または治療のために使用され得る。詳しくは、配列番号１２の生物学的活性材料を含む結合体は、糖尿病を予防または治療するために使用され得る。但し、この例は例示的なものであり、本発明はこれに限定されない。

さらには、本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料が副甲状腺ホルモンまたはその誘導体である場合、結合体は、骨疾患の予防または治療のために使用され得る。詳しくは、配列番号６の生物学的活性材料を含む結合体は、骨疾患の予防または治療のために使用され得る。但し、この例は例示的なものであり、本発明はこれに限定されない。

本発明の一実施形態によれば、生物学的活性材料がｈＧＨまたはその誘導体である場合、結合体は、ヒト成長ホルモン欠乏症を予防または治療するために使用され得る。詳しくは、配列番号４２の生物学的活性材料を含む結合体は、ヒト成長ホルモン欠乏症を予防または治療するために使用され得る。但し、この例は例示的なものであり、本発明はこれに限定されない。

本発明の別の態様は、経口投与のための製剤であって、上記のビオチン部分または脂肪酸部分に、またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体を含む、当該製剤を提供する。

本発明の別の特定の態様は、経口投与のための製剤であって、上記のビオチン部分及び脂肪酸部分に結合した生物学的活性材料結合体を含む、当該製剤を提供する。

本発明の一実施形態による、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料結合体は、水溶性ビタミンの一種であるビオチンに結合していることによって、ナトリウム依存性マルチビタミントランポーターによる能動輸送によって吸収され得、腸管膜を介した腸内での吸収を改善し得る。より詳しくは、ビオチン部分及び脂肪酸部分との結合によって優れた作用が発揮される。

本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分に結合した生物学的活性材料を含む医薬製剤は、経口または非経口投与のための様々な形態に製剤化することによって投与され得るが、本発明はこれに限定されない。

さらには、本発明の一実施形態によれば、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料を含む医薬製剤は、経口または非経口投与のための様々な形態に製剤化することによって投与され得るが、本発明はこれに限定されない。

製剤化するとき、製剤は、一般的に使用される希釈剤または賦形剤、例えば、充填剤、溶解助剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤及び吸収促進剤を使用することによって調製され得る。

経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、そのような固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤を化合物、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどと混合することによって調製され得る。

さらには、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を使用してもよい。

経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、内用液、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、一般的に使用される単純な希釈剤、例えば水及び流動パラフィンに加えて様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、着香剤、香料、保存料などを含み得る。非経口投与のための製剤は、無菌水性液剤、非水性溶媒、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥調製物及び坐剤を含む。非水性溶媒及び懸濁剤は、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用エステル、例えばオレイン酸エチルを含み得る。加えて、増殖性疾患または自己免疫疾患のための治療剤としての有効性を増強するためにカルシウムまたはビタミンＤ３を添加してもよい。

本発明の実施形態による医薬製剤の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、及び疾患の重症度に応じて様々であり得る。しかしながら、一般的には、それは、１日１回投与され得、または有効一日用量範囲内で数回用量に分割され得る。加えて、有効用量の投与を１～２週間内での数回投与によって行うことさえ可能であり得る。

以下では、本発明を実施形態及び実験例によって詳しく記載する。但し、以下の実施形態及び実験例は本発明を例示することを意図しており、本発明はそれに限定されない。

［実用実施例］

＜ビオチン部分の調製＞

略語の一覧
ＨＢＴＵ：３－［ビス（ジメチルアミノ）メチリウミル］－３Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オキシドヘキサフルオロホスフェート）
ＤＩＥＡ：エチルジイソプロピルアミン
ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアコロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＨＯＢｔ：：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭＢＨＡ：４－メチルベンズヒドリルアミン塩酸塩
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析

典型的なＳＰＰＳ法
場合によっては、ペプチドの固相合成は、酸性条件下で切断され得る基を有するジペプチドアミド結合によって保護されたジペプチドを使用することによって、改善され得る。例えば、２－Ｆｍｏｃ－オキシ－４－メトキシベンジル、または２，４，６－トリメトキシベンジルである。使用したＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体は、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍによって供給されている推奨標準物質、例えば、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、またはＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨなどであった。Ｎ末端アミノ酸は、アルファアミノ基においてＢｏｃ保護された。例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍによって供給されているＦｍｏｃ－８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、Ｆｍｏｃ－トラネキサム酸、Ｆｍｏｃ－イソニペコチン酸、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨを使用した。

ＳＰＰＳを用いるペプチド合成

ペプチドは、カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、またはＤＩＣ／ＨＯＢｔを使用してｌｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂において一般的Ｆｍｏｃ化学を用いて合成され得る。合成に使用した反応物質とカップリング試薬との組合せは、以下を含む。

ＳＰＰＳを用いるペプチド合成プロセスのための例示的プロトコールは、以下を含む：１）ｌｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂が入った容器にＤＭＦを加え、２時間にわたって膨張させる（ｓｕｂ：０．６８ｍｍｏｌ／ｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．４７ｇ、または５ｍｍｏｌ、７．３５ｇ、ｓｕｂ：０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）。２）２０％のピペリジン／ＤＭＦを添加した後、３０分間混合する。３）１）～２）の溶媒を除去した後、ＤＭＦを使用して洗浄する（３０秒間×５回）。４）反応物質を添加し（反応物質＃１～＃５のうちの１つ）、３０秒間混合し、その後、反応物質に対応するカップリング試薬（カップリング試薬＃１～＃５のうちの１つ）を添加し、窒素バブリングを１時間行う。５）２０％のピペリジン／ＤＭＦを添加した後、３０分間混合する。上記１）～５）の例示的プロトコールにおいて、反応物質及びカップリング反応物質＃１～＃５の組合せを１回よりも多く使用して反復合成を実施してもよい。Ｆｍｏｃを除去するためには、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液による３０分間の処理を用いた。

ペプチド精製及び分析のための典型的手順

未精製ペプチドを、水とＴＦＡとＡＣＮとの適切な混合物に溶解させ、分取ＨＰＬＣを用いて精製し、乾燥させ、定量した。分取ＨＰＬＣを用いる精製のための条件は、以下の表２に示されるものを含む。

分取ＨＰＬＣを用いる精製の後、最終生成物を、分析用ＨＰＬＣまたはＬＣＭＳを用いて特性評価した。分析の結果、以下の表３のビオチン部分が得られた。

さらには、ＳＰＰＳを用いるペプチド合成のためのプロトコール１）～５）、精製、及び分析によって、以下のビオチン部分Ｂ６～Ｂ７が得られた。以下の表４において、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＢは、本明細書の一般式Ａの定義の中に含まれているものである。

＜脂肪酸部分＞

脂肪酸部分は、当技術分野で知られている方法を用いて調製され得、または商業的に入手される材料を使用してもよい。

脂肪酸部分として、以下の表５の脂肪酸部分を使用した。

＜ポリペプチド＞

ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法を用いて調製され得、または商業的に入手される材料を使用してもよい。本発明において、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合した生物学的活性材料の配列は、以下の表６に示される。

＜実施形態：ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと化合した生物学的活性材料の調製＞

［調製例］

反応溶媒として０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を使用して、表６のポリペプチドと表３～４のビオチン部分との１：Ｘのモル比混合物を、各々少なくとも３０分間、室温で反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と表５の脂肪酸部分との１：Ｙ（１：０．５～２０）のモル比混合物を調製し、各々少なくとも９０分間、室温で反応させた。各混合物の体積と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

［単離、精製及び確認］

反応生成物を、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて単離及び精製した。カラムとしてＳＵＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ－１カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ、ＬＢ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用した。

３０～５０％の溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）、及び溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）を使用して、４．７ｍｌ／分の流速を維持しながら移動相条件を線形的に変化させた。２８０ｎｍでＵＶ吸収分光計によって監視しながら１０分と２０分との間に検出されたピークを回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製材料の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温付近の一定温度で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速で、トリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（様々な混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

［分子量の確認］

反応生成物の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて測定された。マトリックス溶液としては、ＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロケイ皮酸）で飽和された０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。これにより、分離された材料の分子量が理論分子量と一致していることが確認された。

＜実施形態：ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せと化合したポリペプチド＞

上記の材料をビオチン部分、脂肪酸部分及びポリペプチドとして使用した。ポリペプチドをビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合させるために、当技術分野で知られている方法、または上記実施形態の方法を用いた。

ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せに結合したポリペプチドは、以下の表７に示すとおりである（ここで、分子量は実測分子量または理論分子量を表す）。

結合体１４～１７

１）調製例
以下の方法を用いて下表８の結合体を調製した。

０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、上記表６からの配列番号１２のポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：２の混合物に混合し、室温で少なくとも３０分間反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５の脂肪酸部分との１：１～１：２のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも９０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認 逆相高速液体クロマトグラフィー（これ以降、ＨＰＬＣ）を用いて結合体１４～１７の反応生成物を単離及び精製した。

ＳＵＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ－１カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ、ＬＢ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用した。溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を以下のとおり線形的に変化させた：結合体１４：３０～８０％、結合体１５：４０～７０％、結合体１６：３０～６０％、結合体１７：４０～６０％。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら１０分と１７分との間に検出されたピークを回収した（結合体１４：１５分、結合体１５：１６分、結合体１６：１６分、結合体１７：１１分）。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製物質の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温付近の一定温度で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７０：３０、及び２０分後に２０：８０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体１４～１７の精製クロマトグラムは図１に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体１４～１７の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体１４～１７から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は上記表８に示すとおりである。

結合体１８～１９

１）調製例
以下の方法を用いて下表９の結合体を調製した。

０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、上記表６からの配列番号１２のポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：２の混合物に混合し、室温で少なくとも３０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィー（これ以降、ＨＰＬＣ）を用いて結合体１８～１９の反応生成物を単離及び精製した。

ＳＵＰＥＲＳＩＬ ＯＤＳ－１カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ、ＬＢ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用し、溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を３０％から８０％まで線形的に変化させた。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら１２分と１３分との間に検出されたピークを回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製物質の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温付近の一定温度で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７０：３０、及び２０分後に２０：８０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体１８～１９の精製クロマトグラムは図２に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体１８～１９の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体１８～１９から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は上記表９に示すとおりである。

結合体２０及び２４

１）調製例
結合体２０及び２４については、上記の典型的なＳＰＰＳ法を用いて以下の表１０の結合体を合成した。

２）精製された結合体２０及び２４の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温付近の一定温度で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７０：３０、及び２０分後に５０：５０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体２０及び２４の精製クロマトグラムは図３に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体２０及び２４の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体２０及び２４から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は上記表１０に示すとおりである。

結合体５１～５４

１）調製例
結合体５１～５４については、標準的Ｆｍｏｃ調製法を用いて以下の表１２の結合体を合成した。

標準的Ｆｍｏｃ調製法とは、以下のとおりに行われる方法を意味する：

Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ ａｍｉｄ ＡＭ樹脂が入った容器にＤＭＦを加え、２時間かけて膨張させた。ＤＭＦで洗浄した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦを添加し、３０分間混合した。ＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ－アミノ酸溶液を３０分間混合し、その後、活性化用緩衝液を添加し、窒素ガスを１時間当てた。上記プロセスを、目標ペプチド配列が完成するまで繰り返した。ここで、Ｆｍｏｃ－アミノ酸試薬は、以下の表１１の材料を含んでいた。

－結合体５３～５４は以下の方法を用いて調製された：０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、上記表６からの配列番号３９～４０のポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：２の混合物に混合し、室温で少なくとも１０分間反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５の脂肪酸部分との１：３のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも９０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて結合体５１～５４の反応生成物を単離及び精製した。

Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を４０％から６０％まで線形的に変化させた。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら１１分と１３分との間に検出されたピーク（結合体５３：１２分、結合体５４：１３分）を回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製材料の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して室温付近の一定温度で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７０：３０、及び２０分後に２０：８０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体５１～５２からの最終生成物の精製クロマトグラムは図５に示すとおりであり、結合体５３～５４の精製クロマトグラムは図６に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体５１～５４の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体５１～５４から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は表１２に示すとおりである。

結合体５５～５９

－結合体５６を、上記結合体５１～５４に用いられた標準的Ｆｍｏｃ調製法を用いて合成した。

－結合体５５及び結合体５７～５９を、以下の方法を用いて調製した。０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、上記表６からの配列番号８、４０及び４１のポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：２の混合物に混合し、室温で少なくとも１０分間反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５の脂肪酸部分との１：１または１：２のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも９０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて結合体５５～５９の反応生成物を単離及び精製した。

Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を以下のとおりに線形的に変化させた：結合体５５及び５７：４０～６０％、結合体５８～５９：４０～７０％。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら１０分と１５分との間に検出されたピーク（結合体５５：１３分、結合体５７：１０分、結合体５８：１３分、結合体５９：１５分）を回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製材料の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して一定温度（３５℃）で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（６０：４０、及び２０分後に３０：７０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体５５及び結合体５７～５９からの最終生成物の精製クロマトグラムは図８に示すとおりであり、結合体５６の精製クロマトグラムは図９に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体５５～５９の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体５５～５９から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は表１３に示すとおりである。

結合体６０～６４

１）調製例
下表１４の結合体を、以下の方法を用いて調製した：０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、上記表６からの配列番号２２、２４、２６、２８及び３０のポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：１の混合物に混合し、室温で少なくとも３０分間反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５の脂肪酸部分との１：２のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも１２０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて結合体６０～６４の反応生成物を単離及び精製した。

Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を以下のとおりに線形的に変化させた：実施形態１８～２０：３０～６０％、実施形態２１～２２：２５～５０％。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら５分と１８分との間に検出されたピーク（実施形態１８：２０分、実施形態１９：１５分、実施形態２０：１３分、実施形態２１：１７分）を回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製材料の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して一定温度（３５℃）で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７５：２５、及び２０分後に５０：５０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体６０～６４からの最終生成物の精製クロマトグラムは図１１に示すとおりである。

ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体６０～６４の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体６０～６４から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は表１４に示すとおりである。

結合体６６

１）調製例
下表１５の結合体を、以下の方法を用いて調製した：０．３％のトリメチルアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ）が添加されたＤＭＳＯ溶液を反応溶媒として使用して、タンパク質が配列番号１５の第６及び第１１システイン間、配列番号１５の第７システインと配列番号１６の第７システインとの間、ならびに配列番号１５の第２０システインと配列番号１６の第１９システインとの間でジスルフィド結合によって連結されたものである上記表６からのポリペプチドと、上記表３及び表４のビオチン部分とをモル比１：１の混合物に混合し、室温で少なくとも３０分間反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５の脂肪酸部分との１：２のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも１２０分間反応させた。混合物と同じ体積の１％のトリフルオロ酢酸溶液を添加することによって反応を停止した。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて結合体６６の反応生成物を単離及び精製した。Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（１０×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡが添加された蒸留水）及び溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡが添加されたアセトニトリル）を４．７ｍｌ／分の流速で維持しながら移動相条件を３５％から４５％まで線形的に変化させた。その後、２８０ｎｍでＵＶ分光器によって監視しながら１３分と１４分との間に検出されたピークを回収した。回収ピークの濃縮及び精製は、真空下で有機溶媒及びＴＦＡを揮発させた後に適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行われた。精製材料の純度を、ＨＰＬＣ分析法を用いて確認した。分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ｕｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して一定温度（３５℃）で行われた。分析は、勾配溶離法を用いて１ｍＬ／分の流速でトリフルオロ酢酸溶液：アセトニトリル混合物からなる移動相を（７０：３０、及び２０分後に４０：６０の混合比で）使用して行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観測した。

測定された結合体６６の精製クロマトグラムは図１３に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体６６の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体６６から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。分析の結果は表１５に示すとおりである。

結合体６９

１）調製例
下表１６の結合体を、以下の方法を用いて調製した：
上記表６からの配列番号４２のポリペプチドをｐＨ７．８のリン酸緩衝液に溶解させた後、ＤＭＳＯに溶解させることによってビオチン部分を調製し、材料を９０：１０の体積比で反応させた。室温でそれらを１：２２のモル比で少なくとも６０分間にわたって反応させた。その後、ポリペプチド－ビオチン部分混合物と上記表５からの脂肪酸部分との１：９のモル比での混合物を調製し、室温で少なくとも６０分間反応させた。反応生成物の貯蔵温度を４度に下げることによって反応を減速させ、その後すぐに精製を行った。

２）単離、精製及び純度確認
逆相高速液体クロマトグラフィー法を用いて、結合体６９について反応が進行したこと及び該当する材料が生成したことを確認した。精製は、適切な分子量カットオフを有する超遠心分離フィルターを使用して行った。

測定された結合体６９の精製クロマトグラムは図１５に示すとおりである。さらには、ＵＶ検出器によって分析したところ、ビオチン部分及び脂肪酸部分に結合したポリペプチドのピーク以外にはピークが観測されなかった。それぞれのクロマトグラムからのピークの面積を百分率として表して、結合体６９の純度は少なくとも９５％であることが確認された。

３）分子量の確認
結合体６９から得られた最終材料の分子量を測定した。

分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて確認された。マトリックス溶液としては、０．１％のＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの中に飽和したＣＨＣＡ（ａ－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）の溶液を使用した。質量スペクトルは線形及びポジティブモードで確認され、分子量は、最終材料の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定することによって確認された。反応の前及び後の平均分子量を用いてビオチン部分の平均結合数が見出された。結合体６９は平均ビオチン結合数が１０～２０であると分かった。分析の結果は表１６に示すとおりである。

実験例。ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験

ＧＬＰ－１受容体に対する力価の確認

結合体３及び１４～２０

結合体３及び１４～２０のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定した。

まず、ＧＬＰ－１受容体に対する力価を確認するために、ヒトＧＬＰ－１受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をＥｕｒｏｆｉｎｓから購入して使用した。７×１０^３個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに配分し、その後、３７℃の温度条件下、ＣＯ_２インキュベータ内で培養した。少なくとも２４時間後に培養流体を各ウェルから除去し、１５分間にわたって３０μｌの０．５ｍＭのＩＢＭＸで処理した。その後、各実施形態を０．００１～１０００ｎＭ及びエキセンジン－４で処理し、その後、３７℃の温度条件下、ＣＯ_２インキュベータ内で３０分間培養した。次いで、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイキットを使用して、生成したｃＡＭＰ（ルシフェラーゼ活性）の量を測定してＧＬＰ－１受容体に対するＥＣ_５０値を算出した。測定の結果は表１７に示すとおりであった。

吸収率の測定

結合体３及び１４～２０

薬物の吸収率を測定するために、薬物動態挙動を比較した。

試験体をそれぞれ体重およそ２００ｇの実験ラット（ＳＤラット）の十二指腸に１００及び５００ｕｇ／ｋｇの量で投与し、その後、血液試料を採取した。投与用量の各試験体を、０．０２％のポリソルベート８０を含有する１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、その後、それぞれ６８ｍｇ／ｋｇ及び３４ｍｇ／ｋｇのＮａＣＤＣ及びＰＧを添加し、次いで、投与前に１，０００ｒｐｍで２０分間混合した。血中の薬物の濃度の経時変化を、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定した。血液試料は頸静脈から採取した。結果は平均として算出され、結果は表１８に示すとおりであった。

結合体１５～１７を実験ラット（ＳＤラット）に静脈内投与し、薬物動態挙動を観察した。実験結果は以下の表１９に示すとおりであった。

血中グルコース調節能力の測定

結合体３、１７及び２０

グルコース耐性を観察するために、ＧＬＰ－１アゴニストの経口製剤をマウスに経口投与し、腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を行って血中グルコース調節有効性を測定した。

動物モデルにおける腹腔内グルコース耐性を測定するために、１００μｌの試験体（配列番号１は１０ｕｇ／マウス）を－６０分の時点で９週齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に経口投与し、続いて、２００μｌのグルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。－６０、０、２０、４０、６０、９０及び１２０分の時点で尾静脈から採取された血液試料で血中グルコースの変化を観察した。対照群１には、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを皮下投与し、対照群２には同じものを経口投与した。

結合体２０及び２４

結合体２０及び２４をマウスに経口投与し、グルコース耐性試験を行って血中グルコース調節有効性を測定した。

測定の結果は図４に示すとおりであった。結合体２０及び２４を投与された群では未処置群と比較して血中グルコースが実質的に低減されたことが確認された。

結合体５３～５４

結合体５３～５４の血中グルコース調節有効性をグルコース耐性試験によって測定した。結合体をマウスに経口投与し、続いて、６時間後にグルコースを腹腔内投与し、その後、血中グルコースの変化を測定した。測定の結果は表７に示すとおりであった。結合体５３及び５４を投与された群では未処置群と比較して血中グルコースが実質的に低減されたことが確認された。

結合体６５及び６６

結合体６５及び６６をマウスに経口投与し、その後、それらの血中グルコース調節有効性をグルコース耐性試験によって測定した。

動物モデルにおける腹腔内グルコース耐性を測定するために、試料を－２０分の時点で８週齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に経口投与し、続いて、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。－２０、０、２０、４０、６０、９０及び１２０分の時点で尾静脈から採取された血液試料で血中グルコースの変化を観察した。対照群には、タンパク質が配列番号１５の第６及び第１１システイン間、配列番号１５の第７システインと配列番号１６の第７システインとの間、ならびに配列番号１５の第２０システインと配列番号１６の第１９システインとの間でジスルフィド結合によって連結されたものであるポリペプチドを経口投与した。

測定の結果は図１４に示すとおりであった。図１４に示されるとおり、結合体を投与された群では未処置群と比較して血中グルコースが実質的に低減された。

Ｃａｃｏ－２細胞膜透過性の測定

結合体１７、５１、７２及び７３

結合体５１をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に溶解させ、Ｃａｃｏ－２細胞膜透過性を測定した。まず、Ｃａｃｏ－２細胞単層を形成するために、１２－ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートにウェル１つあたり１．５×１０^５細胞を分注し、３７℃のＣＯ_２条件の下で３～４週間培養した。第１週目は培養培地を２日ごとに１回替え、その後、３日間隔で培養培地を替えながら培養を実施した。播種後３～４週目の間の細胞を実験のために使用した。細胞単層の形成を確認するために、ＴＥＥＲ値及びルシファーイエロー値を測定し、ＴＥＥＲ値が３００Ω・ｃｍ^２以上でありルシファーイエロー透過性の測定値が３％以内であった細胞単層のみを使用した。実験に使用するｔｒａｎｓｗｅｌｌを輸送用培地（ＨＢＳＳ）で洗浄してから、３７℃、ＣＯ_２のインキュベータ内で１時間培養し、その後、各々２００μＬの、調製された薬剤及び賦形剤を含む製剤を頂端側に添加し、側底側を１ｍＬの、薬剤を含有しない輸送用培地で処理した。この後、３７℃、ＣＯ_２のインキュベータ内で２時間インキュベートした。２時間後に側底側から各々１ｍＬの試料を採取し、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて透過係数（Ｐａｐｐ値）を測定した。透過係数（Ｐａｐｐ値）を以下のとおりに計算し、分析の結果は表２１に示すとおりである。（ここで、各結合体は、上記調製例と同じ方法を用いて調製された）
［Ｐａｐｐ（１０^－６、ｃｍ／ｓ）＝（ｄＣｒ／ｄｔ）×Ｖｒ／（Ａ×Ｃ_０）］
（^＊ｄＣｒ－透過した試料の濃度、ｄｔ－薬物による処理の継続時間、Ｖｒ－側底側の量、Ａ－ｔｒａｎｓｗｅｌｌ面積、Ｃ_０－添加した薬剤の初期濃度）

結合体６８及び６９

結合体６８及び６９をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に溶解させ、Ｃａｃｏ－２細胞での蓄積量を測定した。まず、細胞内蓄積量を測定するために、Ｃａｃｏ－２細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり７×１０^４で分注し、その後、３７℃の温度条件下、ＣＯ_２インキュベータ内で培養した。２４時間後、各ウェルから培養流体を除去し、ＨＢＳＳで洗浄し、続いて各々１００μｌの調製薬物を添加し、３７℃でＣＯ_２インキュベータ内で培養した。８分後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、各１００μｌの１０％のホルマリンで処理し、続いて室温で反応させた。１０分後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、その後、１００μｌの０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ－１００で処理して室温で反応させた。１０分後、各ウェルをＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡを使用して１時間にわたってブロッキングし、その後、ＨＲＰ抗成長ホルモン抗体（１：１０００）で処理した。１時間後、各ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質溶液を添加した。１０分後、各ウェルを２ＮのＨＣＬ停止溶液で処理し、４５０ｎＭで吸光度を測定して各材料の細胞内蓄積量を測定した。結果はｈＧＨを１００％として比較したものであり、測定の結果は表２２及び図１６に示すとおりである。（ここで、各結合体は、上記調製例と同じ方法を用いて調製された）

体重変化及び食餌摂取量の測定

結合体５８及び５９

結合体５８及び５９を２週間にわたって肥満マウスモデルに皮下投与し、その後、体重変化を測定した。

図１０に示すように、結合体５８及び５９を投与した後には未処置群と比較して体重が実質的に減少したことが確認された。

結合体３３、３６、３９、４２及び６１～６４

ポリペプチド、結合体６１～６４、ならびに結合体３３、３６、３９及び４２をマウスに経口投与した後、体重減少及び食餌摂取量を２４時間にわたって測定した（ここで、各結合体は、上記調製例と同じ方法を用いて調製された）。

体重減少の結果は以下の表２３に示すとおりであり、食餌摂取量の結果は図１２に示すとおりであった。単独のポリペプチドを投与した群では未処置群と比較して体重及び食餌摂取量が減少したが、結合体を投与した群は、単独のポリペプチドを投与した群と比較して傑出した体重減少及び食餌摂取量を呈した。

当業者であれば、慣例的な実験によって、本明細書中に記されている本発明の特定の例に対する様々な均等物に気付くこと及びそれを確認することができるであろう。そのような均等物を別記の特許請求の範囲に含めることを意図する。本出願の上記説明は例示を意図したものであり、当業者であれば、本出願が、技術的着想または本質的特徴を変更することなく容易に他の特定の形態に改変され得ることを理解する。したがって、上記に説明されるすべての実施形態があらゆる側面において例示的かつ非限定的なものであることは理解されるべきである。例えば、単一の要素として記載されている構成要素が、分けて行われてもよく、同様に、分かれたものとして記載されている構成要素が、合わせて行われてもよい。別記の請求項の趣意及び範囲から演繹されるあらゆる変形形態または改変形態、ならびにその均等物は、本発明の範囲に含まれるものとみなされ得る。

［産業上の利用可能性］

経口吸収が改善された本発明は、医薬分野において有用に使用され得る。

Claims (23)

1. 生物学的活性材料結合体であって、ビオチン部分、脂肪酸部分またはその組合せが生物学的活性材料に結合している、前記生物学的活性材料結合体。
2. 前記生物学的活性材料が、
   グルカゴン（グルガコン）、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）、ＧＬＰ－２（グルカゴン様ペプチド－２）、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド））、エキセンジン－４、インスリン、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、エリスロポエチン、カルシトニン、アミリン、セロトニン、リツキシマブ、トラスツズマブ、ウリカーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、サイモグロビン、ワクチン、ヘパリンまたはヘパリン類似体、アンチトロンビンＩＩＩ、フィルグラスチム、酢酸プラムリンチド、エキセナチド、エプチフィバチド、アンチベニン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＨＧＨ、サイロキシン、第ＶＩＩ及び第ＶＩＩＩ血液凝固因子、治療剤として作用する糖脂質、ならびにその誘導体
   からなる群から選択される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
3. 前記生物学的活性材料が、
   配列番号１～１４及び配列番号１８～４２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびにその誘導体
   からなる群から選択される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
4. 前記生物学的活性材料が、
   配列番号１５及び１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその誘導体、または配列番号１７及び１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその誘導体
   である、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
5. 前記ビオチン部分が、以下の一般式Ａ：
   〔上記一般式Ａ中、
   Ｘは、生物学的活性材料に結合することができる官能基であり、
   Ｙはスペーサーであり、
   Ｚは結合単位であり、
   Ｂは、以下の化学式Ａ－１；
   で表され、
   Ｚは、化学式Ａ－１の
   に連結されており、
   Ｔは末端基であり、
   ｍは１～１０の整数であり、
   ｎは０または１～１０の整数であり、ｎ＝０である場合にはＹはＢまたはＴに直接結合しており、
   ｐは０または１の整数である〕
   で表される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
6. Ｘが、
   マレイミド、スクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、スクシンイミジル メチルエステル、スクシンイミジル ペンチルエステル、炭酸スクシンイミジル、炭酸ｐ－ニトロフェニル、アルデヒド、アミン、チオール、オキシアミン、ヨードアセトアミド、アミノオキシル、ヒドラジド、ヒドロキシ、プロピオネート、ピリジル、アルキルハライド、ビニルスルホン、カルボキシル、ヒドラジド、ハロゲンアセトアミド、Ｃ_２－５アルキニル、Ｃ_６－２０アリールジスルフィド、Ｃ_５－２０ヘテロアリールジスルフィド、イソシアネート、チオエステル、イミノエステル、及びその誘導体
   からなる群から選択される、請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
7. Ｙが、
   存在していないか、あるいは
   置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－５０アルキレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－５０ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_６－５０アリーレン、または置換もしくは非置換Ｃ_６－５０ヘテロアリーレンであり、
   置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ及び－ＮＨ_２を含む群から選択される少なくとも１つを含む、
   請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
8. Ｙが、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み、式中、ｕが１～２０の整数である、請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
9. Ｙが、成分としてグルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシンまたはリジンを含む、請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
10. Ｚが、各々独立して選択され得る以下：
    Ａ）Ｘと一緒に、またはＸとは別個に、アミノ酸またはその誘導体を形成している；
    Ｂ）置換または非置換直鎖状または分岐状Ｃ_１－５０ヘテロアルキレン（ｈｅｔｅｒｏａｌｋｙｅｎｅ）であり、
    置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ及び－ＮＨ_２から構成される群から選択される少なくとも１つを含む、
    のいずれか１つである、請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
11. Ｔが、
    アミン、Ｃ_１－８アルキル、Ｃ_１－８アルケニル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、スルホン酸、カルボキシル、フェニル、ベンジル、アルデヒド、アジド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、ニトリル及びホスホン酸
    から構成される群から選択される、請求項５に記載の生物学的活性材料結合体。
12. 前記ビオチン部分が、
    
    
    から構成される群から選択される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
13. 前記脂肪酸部分が、
    前記生物学的活性材料に結合しており、かつ、
    前記ビオチン部分が結合している部位以外の前記生物学的活性材料の部位に結合している、
    請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
14. 前記脂肪酸部分が、以下の一般式Ｂ：
    ［一般式Ｂ］
    Ｘ’－Ｙ’－Ｗ
    〔上記式中、
    Ｘ’は、前記生物学的活性材料に結合することができる官能基であり、
    Ｙ’はスペーサーであり、
    Ｗは脂肪酸である〕
    で表される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
15. Ｘ’が、
    マレイミド、スクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、スクシンイミジル メチルエステル、スクシンイミジル ペンチルエステル、炭酸スクシンイミジル、炭酸ｐ－ニトロフェニル、アルデヒド、アミン、チオール、オキシアミン、ヨードアセトアミド、アミノオキシル、ヒドラジド、ヒドロキシ、プロピオネート、ピリジル、アルキルハライド、ビニルスルホン、カルボキシル、ヒドラジド、ハロゲンアセトアミド、Ｃ_２－５アルキニル、Ｃ_６－２０アリールジスルフィド、Ｃ_５－２０ヘテロアリールジスルフィド、イソシアネート、チオエステル、イミノエステル、テトラフルオロフェニルエステル、炭酸ニトロフェニル、ニトロフェニル、及びその誘導体
    からなる群から選択される、請求項１４に記載の生物学的活性材料結合体。
16. Ｗが、
    置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０アルキレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０アルケニレン、置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０ヘテロアルキレン、または置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状Ｃ_１－６０ヘテロアルケニレン
    であり、
    置換されている場合には、＝Ｏ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ、＝ＮＨ、－ＮＨ_２及びハロを含む群から選択される少なくとも１つで置換されている、
    請求項１４に記載の生物学的活性材料結合体。
17. 前記脂肪酸部分が、以下の一般式Ｂ１：
    ［一般式Ｂ１］
    Ｘ’_１－Ｙ’－Ｃ（Ｏ）－Ｆ_１
    〔上記式中、
    Ｘ’_１は、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、アミン、テトラフルオロフェニルエステルまたはニトロフェノールであり、
    Ｙ’はスペーサーであり、
    Ｆ_１は、Ｃ_６－２８置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状アルキレン、または置換もしくは非置換直鎖状もしくは分岐状ヘテロアルキレンである〕
    で表される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
18. Ｙ’が直接結合であるか、あるいは
    Ｙの構造が、
    置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状アルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０非直鎖状ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリーレン、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０ヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－または－ＮＯＲ－
    を含む群の少なくとも１つを含み、Ｒが、水素、または非置換Ｃ_１－５０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ_１－５０アリール、またはエチレングリコール繰り返し単位（－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－、式中、ｎは、少なくとも１であるが２０を上回らない整数である）である、
    請求項１４または請求項１７に記載の生物学的活性材料結合体。
19. Ｙ’が、繰り返し単位として－Ｃ（Ｏ）－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｕ－ＮＨ－を含み、式中、ｕが１～２０の整数である、請求項１４または請求項１７に記載の生物学的活性材料結合体。
20. Ｙ’が、成分としてグルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシンまたはリジンを含む、請求項１４または請求項１７に記載の生物学的活性材料結合体。
21. 前記脂肪酸部分が、
    
    
    から構成される群から選択される、請求項１に記載の生物学的活性材料結合体。
22. 糖尿病、肥満、脂肪性肝疾患、過敏性腸症候群、神経変性疾患、骨疾患、骨粗鬆症、ヒト成長ホルモン欠乏症、がんまたは非アルコール性脂肪性肝疾患を予防または治療するための医薬製剤であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の生物学的活性材料結合体を含む、前記製剤。
23. 経口投与のための製剤であって、請求項１～２１のいずれか１項に記載の生物学的活性材料結合体を含む、前記製剤。