CN108348581B - 胰岛素免疫球蛋白融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文公开了免疫球蛋白融合蛋白，其包含胰岛素治疗性肽以及将所述胰岛素治疗性肽靶向有需要的个体的肝脏的免疫球蛋白区。本文进一步公开了包含所述免疫球蛋白融合蛋白的组合物以及使用该免疫球蛋白融合蛋白治疗或预防受试者的疾病或病况，例如，糖尿病和糖尿病相关病况的方法。
Description
优先权
本申请要求2015年9月4日提交的美国临时专利申请系列号62/214,605的权益，该临时专利申请的全部内容并入本文。
背景技术
目前的胰岛素疗法在1型糖尿病(T1D)患者中的药理学限制在于在T1D患者中不存在确保肝脏比外周组织暴露于更高浓度的胰岛素的门-体静脉(portal-systemic)胰岛素浓度梯度。皮下注射胰岛素导致外周高胰岛素血症，其与动脉粥样硬化、癌症、低血糖症及其他不利的代谢影响相关。相比之下，在T1D患者中的门静脉内胰岛素输注或适当的肝脏胰岛素疗法需要较低剂量的胰岛素，并且与血浆葡萄糖和血红蛋白A1c水平的较快显著降低，以及循环皮质醇、生长激素、胰高血糖素和三碳前体如乳酸盐、丙酮酸盐和丙氨酸的正常化相关。
发明内容
本文公开了胰岛素组合物和使用该组合物的方法，其克服了目前具有肝偏倚组织分布特征的胰岛素疗法的局限性，从而使胰岛素的降低葡萄糖作用集中于肝脏。一种这样的组合物是胰岛素融合蛋白，其包含与免疫球蛋白融合的胰岛素分子，该免疫球蛋白具有对肝细胞的抗原具有特异性的抗原结合域。例如，该抗原结合域对脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，即一种在肝细胞上选择性表达的分子具有特异性。融合蛋白的抗-ASGPR部分可被设计为缺乏或具有降低的内化率，以允许胰岛素分子与胰岛素受体相互作用。在许多情况下，胰岛素融合蛋白相比于施用的没有融合免疫球蛋白区的胰岛素分子具有改善的功效。因此，胰岛素融合蛋白的给药需求可低于目前胰岛素疗法的给药需求。此外，在一些情况下，与包含缺乏对ASGPR的结合特异性的抗-ASGPR结构域的融合蛋白的胰岛素分子(对照)或单独的胰岛素分子相比，包含抗-ASGPR结构域的融合蛋白的胰岛素分子可至少2倍地分布于肝脏。
在本公开内容的一个方面，本文提供了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的一个或多个部分的第一免疫球蛋白区，其中所述抗原结合域对肝细胞的抗原具有特异性。在一些实施方案中，所述抗原由肝细胞表达。在一些实施方案中，所述抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，所述抗原结合域与具有SEQ ID NO：162的ASGPR的表位的一个或多个氨基酸结合，其中所述一个或多个氨基酸选自R10、G11、F19、G35、N36、Q47、S56、L83、W134、E135、K138、V140、H142和K173。在一些实施方案中，所述表位的一个或多个氨基酸包括W134、E135、K138、V140、H142和K173的任何组合。
在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：46有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：55有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：47有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白进一步包含第二免疫球蛋白区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含抗原结合域的一个或多个部分。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48-50中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：49有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：50有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48-50中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：49有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：50有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和SEQ：44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和SEQ：44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含与选自SEQID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白进一步包含第二免疫球蛋白区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含抗原结合域的一个或多个部分。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：46有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：55有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与SEQID NO：47有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽与第一免疫球蛋白区的氨基末端连接。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含SEQ ID NO：155(QVQLX1QX2GAE)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为Q或V。在一些实施方案中，X2为P或S。在一些实施方案中，X1为V，并且X2为S。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白区包含SEQ ID NO：156(EX1VLTQSPX2T)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为T或I。在一些实施方案中，X2为T或G。在一些实施方案中，X1为I，并且X2为G。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽通过接头肽与第一免疫球蛋白区连接。在一些实施方案中，接头肽包含3至50个氨基酸，并且接头肽包含选自以下序列的氨基酸序列：(a)具有至少50％的甘氨酸、丝氨酸、或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的氨基酸序列；和(b)具有至少50％的甘氨酸、丙氨酸、或甘氨酸和丙氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头肽包含与SEQ ID NO：141-147中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含具有式B-C-A或A-C-B的单个氨基酸链；其中B包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；A包含SEQ ID NO158：GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN；并且C包含具有3至50个氨基酸的连接肽；并且其中XA、XB、XC和XD独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XA为D或H。在一些实施方案中，XB为D或P。在一些实施方案中，XC为P或K。在一些实施方案中，XD为H或T。在一些实施方案中，连接肽包含含有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为P、G或S。在一些实施方案中，X2为R、S、G或K。在一些实施方案中，C包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含选自SEQ ID NO：111、113、116、118、119-140的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：111、113、116、118、119-140中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含具有式B-C-A或A-C-B的单个氨基酸链；其中B包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列；A包含与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列；并且C包含具有3至50个氨基酸的连接肽。在一些实施方案中，B包含SEQ IDNO：160。在一些实施方案中，A包含SEQ ID NO：161。在一些实施方案中，连接肽包含具有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为P、G或S。在一些实施方案中，X2为R、S、G或K。在一些实施方案中，C包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，胰岛素治疗性肽包含含有SEQ ID NO：158(GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN)的A肽，并且XD为天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XD选自H和T。在一些实施方案中，A肽的一个或多个半胱氨酸氨基酸与B肽的半胱氨酸氨基酸以二硫键存在。在一些实施方案中，B肽包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XA为D或H。在一些实施方案中，XB为D或P。在一些实施方案中，XC为P或K。在一些实施方案中，B肽包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，B包含SEQ ID NO：160。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含含有与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的A肽。在一些实施方案中，A肽包含SEQ ID NO：161。在一些实施方案中，A肽的一个或多个半胱氨酸氨基酸与B肽的半胱氨酸氨基酸以二硫键存在。在一些实施方案中，B肽包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XA为D或H。在一些实施方案中，XB为D或P。在一些实施方案中，XC为P或K。在一些实施方案中，B肽包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，B包含SEQ ID NO：160。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个具有至少85％的序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含与SEQ ID NO：78、79、81-85、87-92、95-98中的任一个有不超过5个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含与SEQ ID NO：78、79、81-85、87-92、95-98中的任一个具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含与SEQ ID NO：78、79、81-85、87-92、95-98中的任一个具有至少85％的序列同源性的氨基酸序列。
本文进一步提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用附加治疗剂。在一些实施方案中，所述附加治疗剂为胰岛素或含胰岛素的分子，该胰岛素或含胰岛素的分子缺乏将所述附加治疗剂靶向肝脏和/或肝细胞的部分。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包括胰岛素B肽、胰岛素A肽、胰岛素C肽或其组合。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包含与选自SEQ ID NO：138-140、157和158的序列有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包含选自SEQ ID NO：138-140的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述附加治疗剂在具有胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的组合物中施用。在一些实施方案中，所述附加治疗剂在与胰岛素免疫球蛋白融合蛋白分离的组合物中施用。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。在一些实施方案中，所述附加治疗剂经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。在一些实施方案中，所述疾病或病况为糖尿病。在一些实施方案中，所述疾病或病况为肥胖症。
本文进一步提供了一种包含编码胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的氨基酸序列的核酸序列的基因构建体。本文进一步提供了包含第一基因构建体的第一表达载体。本文进一步提供了包含第一表达载体的哺乳动物表达宿主。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了包含式XVII的分子的组合物：
I-L-G (式XVII)
其中：
I具有式B-A、A-B、B-C-A或A-C-B；其中B包含胰岛素B链；A包含胰岛素A链；如果C存在，则C包含连接B和A的连接体；并且B-A、A-B、或B-A和A-B二者通过部分或二硫键连接；
L包含接头；并且
G包含免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、肽或其他具有与由肝细胞表达或展示的抗原的结合特异性的配体。
在一些实施方案中，I具有式B-A或A-B，并且B-A或A-B通过二硫键连接。在一些实施方案中，I具有式B-A或A-B，并且B-A或A-B通过部分化学连接。在一些实施方案中，I具有式B-C-A或A-C-B，并且连接体为包含2至50个氨基酸的连接肽。在一些实施方案中，连接肽包含具有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ IDNO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为P、G或S。在一些实施方案中，X2为R、S、G或K。在一些实施方案中，C包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，I具有式B-C-A或A-C-B，并且连接体为将B和A化学缀合的接头。
在一些实施方案中，胰岛素B链包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)的序列；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XA为D或H。在一些实施方案中，XB为D或P。在一些实施方案中，XC为P或K。在一些实施方案中，胰岛素B链包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过1、2、3或4个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素B链包含SEQ ID NO：160。在一些实施方案中，胰岛素B链包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个中的胰岛素B链至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，胰岛素B链选自人胰岛素B链、猪胰岛素B链和牛胰岛素B链。在一些实施方案中，胰岛素A链包含SEQ ID NO：158(GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN)的序列，并且XD为天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XD选自H和T。
在一些实施方案中，胰岛素A链包含与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过1、2、3或4个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素A链包含SEQ IDNO：161。在一些实施方案中，胰岛素A链包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个中的胰岛素A链至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，胰岛素A链选自人胰岛素A链、猪胰岛素A链和牛胰岛素A链。
在一些实施方案中，所述接头包含接头肽。在一些实施方案中，该接头肽包含3至100个氨基酸。在一些实施方案中，该接头肽包含选自以下序列的氨基酸序列：(a)具有至少50％的甘氨酸、丝氨酸、或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的氨基酸序列；和(b)具有至少50％的甘氨酸、丙氨酸、或甘氨酸和丙氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，该接头肽包含与SEQ ID NO：141-147中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述抗原为ASGPR。在一些实施方案中，G包含免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含：(a)包含SEQ IDNO：45的重链可变区序列；(b)包含SEQ ID NO：46的重链可变区序列；(c)包含SEQ ID NO：55的重链可变区序列；(d)包含SEQ ID NO：47的重链可变区序列；(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区序列；(f)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区序列；(g)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区序列；(h)(a)、(b)和(d)的组合；(i)(a)、(c)和(d)的组合；(j)(e)、(f)和(g)的组合；(k)(h)和(j)的组合；或(l)(i)和(j)的组合。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含含有SEQ ID NO：45、46和47的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含含有SEQ ID NO：45、55和47的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：43有不超过2个氨基酸不同的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：43至少约75％相同的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：43至少约85％同源的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ IDNO：29、34、36-40和43的序列有不超过2个氨基酸不同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的序列至少约85％同源的序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含CH1结构域。在一些实施方案中，该CH1结构域包含与SEQ ID NO：40至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含人Fc区。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含含有SEQ ID NO：48-50的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44有不超过2个氨基酸不同的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：41或SEQID NO：44至少约75％相同的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44至少约85％同源的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的序列有不超过2个氨基酸不同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的序列至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是人源化的。
在一些实施方案中，G与具有SEQ ID NO：162的ASGPR的表位的一个或多个氨基酸结合，其中所述一个或多个氨基酸选自R10、G11、F19、G35、N36、Q47、S56、L83、W134、E135、K138、V140、H142和K173。在一些实施方案中，所述表位的一个或多个氨基酸包括W134、E135、K138、V140、H142和K173的任何组合。
在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与SEQ ID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含与选自SEQID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与SEQ ID NO：48-50中的一个或多个有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列的可变区。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，G为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，其包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
本文进一步提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的具有式XVII的组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用附加治疗剂。在一些实施方案中，该附加治疗剂为胰岛素或含胰岛素的分子，该胰岛素或含胰岛素的分子缺乏将附加治疗剂靶向肝脏和/或肝细胞的部分。在一些实施方案中，该附加治疗剂包括胰岛素B肽、胰岛素A肽、胰岛素C肽或其组合。在一些实施方案中，该附加治疗剂包含与选自SEQ ID NO：138-140、157和158的序列有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该附加治疗剂包含选自SEQ ID NO：138-140的氨基酸序列。在一些实施方案中，该附加治疗剂与具有式XVII的组合物一起施用。在一些实施方案中，该附加治疗剂在与具有式XVII的组合物分离的组合物中施用。在一些实施方案中，具有式XVII的组合物经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。在一些实施方案中，该附加治疗剂经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。在一些实施方案中，所述疾病或病况为糖尿病。在一些实施方案中，所述疾病或病况为肥胖症。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性结合的免疫球蛋白，该免疫球蛋白包含：(a)包含SEQ ID NO：45的重链可变区序列；(b)包含SEQ ID NO：46的重链可变区序列；(c)包含SEQ ID NO：55的重链可变区序列；(d)包含SEQID NO：47的重链可变区序列；(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区序列；(f)包含SEQ IDNO：49的轻链可变区序列；(g)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区序列；(h)(a)、(b)和(d)的组合；(i)(a)、(c)和(d)的组合；(j)(e)、(f)和(g)的组合；(k)(h)和(j)的组合；或(l)(i)和(j)的组合。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：45、46和47的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO：45、55和47的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：43有不超过2个氨基酸不同的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQ ID NO：39或SEQID NO：43至少约75％相同的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQID NO：39或SEQ ID NO：43至少约85％同源的重链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的序列有不超过2个氨基酸不同的序列。
在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的序列至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含CH1结构域。在一些实施方案中，该CH1结构域包含与SEQ ID NO：40至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含人Fc区。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含含有SEQID NO：48-50中的任一个的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44有不超过2个氨基酸不同的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44至少约75％相同的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44至少约85％同源的轻链可变区序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的序列有不超过2个氨基酸不同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白包含与选自SEQ IDNO：30、33、35、41、42和44的序列至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白是人源化的。
本文进一步提供了与本文所述的免疫球蛋白竞争结合ASGPR的免疫球蛋白。
本文进一步提供了一种将分子靶向有需要的受试者的肝细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含所述分子和所述免疫球蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述分子与所述免疫球蛋白融合或连接。在一些实施方案中，所述分子包含人胰岛素B链、人胰岛素A链，或其衍生物或组合。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了治疗有需要的受试者的与葡萄糖代谢相关的疾病或病况的方法，所述方法包括施用有效量的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的免疫球蛋白区，其中所述抗原结合域靶向肝细胞受体。在一些实施方案中，所述肝细胞受体为ASGPR。在一些实施方案中，所述疾病或病况为糖尿病。在一些实施方案中，所述疾病或病况为肥胖症。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用附加治疗剂。在一些实施方案中，所述附加治疗剂为胰岛素或含胰岛素的分子，该胰岛素或含胰岛素的分子缺乏将附加治疗剂靶向肝脏和/或肝细胞的部分。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包括胰岛素B肽、胰岛素A肽、胰岛素C肽或其组合。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包含与选自SEQ ID NO：138-140、157和158的序列有不超过2个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述附加治疗剂包含选自SEQ ID NO：138-140的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述附加治疗剂在具有胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的组合物中施用。在一些实施方案中，所述附加治疗剂在与胰岛素免疫球蛋白融合蛋白分离的组合物中施用。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。在一些实施方案中，所述附加治疗剂经由皮下、静脉内、肌内、输注(例如，泵)、经皮、口服或经鼻途径施用。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽具有式B-A、A-B、B-C-A或A-C-B；其中B包含胰岛素B链；A包含胰岛素A链；如果C存在，则C包含连接B和A的连接体；并且B-A、A-B、或B-A和A-B二者通过部分或二硫键连接。在一些实施方案中，B-A或A-B以及B-A或A-B通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述连接体为包含2至50个氨基酸的连接肽。在一些实施方案中，所述连接肽包含具有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接肽包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X1为P、G或S。在一些实施方案中，X2为R、S、G或K。在一些实施方案中，C包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，胰岛素B链包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)的序列；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XA为D或H。在一些实施方案中，XB为D或P。在一些实施方案中，XC为P或K。
在一些实施方案中，所述胰岛素B链包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过1、2、3或4个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素B链包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个中的胰岛素B链至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，胰岛素B链选自人胰岛素B链、猪胰岛素B链和牛胰岛素B链。在一些实施方案中，所述胰岛素A链包含SEQ ID NO：158(GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN)的序列，并且XD为天然或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，XD选自H和T。在一些实施方案中，所述胰岛素A链包含与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过1、2、3或4个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素A链包含与SEQ ID NO：109-140中的任一个中的胰岛素A链至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述胰岛素A链选自人胰岛素A链、猪胰岛素A链和牛胰岛素A链。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区包含：(a)包含SEQ ID NO：45的重链可变区序列；(b)包含SEQ ID NO：46的重链可变区序列；(c)包含SEQ ID NO：55的重链可变区序列；(d)包含SEQ ID NO：47的重链可变区序列；(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区序列；(f)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区序列；(g)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区序列；(h)(a)、(b)和(d)的组合；(i)(a)、(c)和(d)的组合；(j)(e)、(f)和(g)的组合；(k)(h)和(j)的组合；或(l)(i)和(j)的组合。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、30和33-44的序列至少约75％相同的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、30和33-44的序列至少约85％同源的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区是人源化的。在一些实施方案中，所述抗原结合域与具有SEQ ID NO：162的ASGPR的表位的一个或多个氨基酸结合，其中所述一个或多个氨基酸选自R10、G11、F19、G35、N36、Q47、S56、L83、W134、E135、K138、V140、H142和K173。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的氨基酸序列的第一免疫球蛋白区；其中所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白靶向肝脏。通过抗原结合域与由肝细胞表达的抗原的结合，可将胰岛素免疫球蛋白融合蛋白靶向肝脏。在一些实施方案中，所述抗原包含脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区包含与来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区包含与SEQ ID NO：29、30、33-56、16或其组合中的任一个的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白被配置为经由抗原结合域的氨基酸序列与抗原结合。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白以一定的亲和力与抗原结合，该亲和力为天然免疫球蛋白内的抗原结合域的亲和力的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。天然免疫球蛋白可包括但不限于抗体或其区域(例如，Fab)，其包含被配置为结合由肝细胞表达的抗原的抗原结合域，其中所述抗体不包含非抗体部分(例如，治疗性肽/蛋白质、小分子)并且/或者不与非抗体部分(例如，治疗性肽/蛋白质、小分子)连接。
在一些实施方案中，所述抗原结合域的氨基酸序列包含来源于可变轻链、可变重链或可变轻链和可变重链二者的可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白进一步包含含有抗原结合域的第二氨基酸序列的第二免疫球蛋白区。在一些情况下，所述抗原结合域的第二氨基酸序列包含来源于可变轻链、可变重链或可变轻链和可变重链二者的可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区是人源化的。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区为小鼠免疫球蛋白区。
在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白中的胰岛素治疗性肽的活性与参考胰岛素治疗性肽的活性相当。参考治疗性肽可包括胰岛素治疗性肽的天然制剂，其中所述天然制剂包含不与免疫球蛋白或其区域连接的胰岛素治疗性肽。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白中的胰岛素治疗性肽的活性是参考胰岛素治疗性肽的活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的胰岛素治疗性肽在肝细胞活性测定中具有比参考胰岛素治疗性肽的EC50小至少约10％、20％、50％或100％的EC50。在一些情况下，参考胰岛素治疗性肽包含与SEQ IDNO：109-140、157、158、160、161或其组合中的任一个的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些情况下，参考胰岛素治疗性肽包含来源于人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素或其组合的氨基酸序列。在一些情况下，参考胰岛素治疗性肽包含来源于人胰岛素B链、人胰岛素A链或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考胰岛素肽包含胰岛素类似物或其部分。胰岛素类似物的非限制性实例包括甘精胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列与所述第一免疫球蛋白区的氨基末端或羧基末端连接。在一些情况下，所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列与第一免疫球蛋白区的氨基末端连接。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列通过接头与第一免疫球蛋白区连接。在一些情况下，所述接头包含氨基酸序列。在一些情况下，所述接头包含约3至约40个氨基酸。在一些情况下，所述接头包含一个或多个甘氨酸残基；其中所述一个或多个甘氨酸残基构成至少约30％、40％或50％的接头氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头包含蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述蛋白酶切割位点位于氨基末端、羧基末端或位于接头肽氨基酸序列内。在一些情况下，由蛋白原转换酶识别所述蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列、来源于胰岛素A链的氨基酸序列或其组合。在一些实施方案中，所述胰岛素B链包含与人胰岛素B链约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素A链包含与人胰岛素A链约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列和来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，来源于胰岛素B链的氨基酸序列与来源于胰岛素A链的氨基酸序列连接。在一些情况下，所述连接经由连接肽实现。在一些情况下，所述连接肽包含约3至约25个氨基酸。在一些情况下，所述连接肽包含一个或多个甘氨酸残基，并且其中所述一个或多个甘氨酸残基构成至少约30％、40％或50％的连接肽氨基酸序列。在一些情况下，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述连接肽的蛋白酶切割位点位于氨基末端、羧基末端或位于连接肽氨基酸序列内。在一些情况下，由蛋白原转换酶识别所述连接肽的蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽从氨基到羧基末端包含：来源于胰岛素B链的氨基酸序列、连接肽和来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽从氨基到羧基末端包含：来源于胰岛素A链的氨基酸序列、连接肽和来源于胰岛素B链的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含含有胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列的第一链；和含有与第一免疫球蛋白区连接的胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列的第二链。在一些实施方案中，胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列，并且胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列包含来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列包含来源于胰岛素A链的氨基酸序列，并且胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列。在一些实施方式中，胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列与胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列连接。在一些情况下，所述连接经由一个或多个二硫键实现。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其包含胰岛素治疗性肽；和含有抗原结合域的氨基酸序列的第一免疫球蛋白区；其中所述胰岛素治疗性肽或其区域的氨基酸序列与所述第一免疫球蛋白区的氨基末端或羧基末端连接；并且其中所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白被配置为经由所述抗原结合域的氨基酸序列与抗原结合。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白以一定的亲和力与抗原结合，该亲和力为天然免疫球蛋白内的抗原结合域的亲和力的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白中的胰岛素治疗性肽的活性与参考胰岛素治疗性肽的活性相当。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白中的胰岛素治疗性肽的活性为参考胰岛素治疗性肽的活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些情况下，参考胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161或其组合中的任一个的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合域被配置为与由肝细胞表达的抗原结合。在一些实施方案中，所述抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区包含与来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一免疫球蛋白区包含与SEQ ID NO：29、30、33-56、167或其组合中的任一个的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合域的氨基酸序列包含来源于可变轻链、可变重链或可变轻链和可变重链二者的可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白进一步包含含有抗原结合域的第二氨基酸序列的第二免疫球蛋白区。在一些情况下，所述抗原结合域的第二氨基酸序列包含来源于可变轻链、可变重链或可变轻链和可变重链二者的可变区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列与所述第一免疫球蛋白区的氨基末端连接。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列通过接头与第一免疫球蛋白区连接。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列。在一些情况下，所述接头包含约3至约40个氨基酸。在一些情况下，所述接头包含一个或多个甘氨酸残基；并且其中所述一个或多个甘氨酸残基构成至少约30％、40％或50％的接头氨基酸序列。在一些情况下，所述接头包含蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述蛋白酶切割位点位于氨基末端、羧基末端或位于接头肽氨基酸序列内。在一些情况下，由蛋白原转换酶识别所述蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列、来源于胰岛素A链的氨基酸序列或其组合。在一些实施方案中，所述胰岛素B链包含与人胰岛素B链约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素A链包含与人胰岛素A链约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列和来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，来源于胰岛素B链的氨基酸序列与来源于胰岛素A链的氨基酸序列连接。在一些实施方案中，所述连接经由连接肽实现。在一些情况下，所述连接肽包含约3至约25个氨基酸。在一些情况下，所述连接肽包含一个或多个甘氨酸残基，并且其中所述一个或多个甘氨酸残基构成至少约30％、40％或50％的连接肽氨基酸序列。在一些情况下，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述连接肽的蛋白酶切割位点位于氨基末端、羧基末端或位于连接肽氨基酸序列内。在一些情况下，由蛋白原转换酶识别所述连接肽的蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽从氨基到羧基末端包含：来源于胰岛素B链的氨基酸序列、连接肽和来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽从氨基到羧基末端包含：来源于胰岛素A链的氨基酸序列、连接肽和来源于胰岛素B链的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含：含有胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列的第一链；和含有与第一免疫球蛋白区连接的胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列的第二链。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列，并且所述胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列包含来源于胰岛素A链的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列包含来源于胰岛素A链的氨基酸序列，并且所述胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列包含来源于胰岛素B链的氨基酸序列。在一些情况下，所述胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列与所述胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列连接。在一些情况下，所述连接经由一个或多个二硫键实现。
在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161的氨基酸序列约或至少约80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在本公开内容的另一个方面，提供了包含本文所述的任何胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的药物组合物。在各个实施方案中，本文进一步提供了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。在一些情况下，所述疾病为糖尿病。在一些情况下，所述疾病为肥胖症。
在本公开内容的另一个方面，提供了第一基因构建体，其包含编码本文所述的任一种胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的氨基酸序列的核酸序列。在各个实施方案中，本文提供了包含所述第一基因构建体的第一表达载体。在各个实施方案中，本文提供了包含所述第一表达载体的哺乳动物表达宿主。在一些情况下，所述哺乳动物表达宿主进一步包含一种或多种附加表达载体。在一些情况下，所述一种或多种附加表达载体中的一种包含第二基因构建体，该第二基因构建体包含编码附加免疫球蛋白结构域的氨基酸序列的核酸序列。在一些情况下，所述一种或多种附加表达载体中的一种包含第三基因构建体，该第三基因构建体包含编码蛋白酶的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一表达载体进一步包含含有编码附加免疫球蛋白结构域的氨基酸序列的核酸序列的基因构建体。在一些实施方案中，所述第一表达载体进一步包含含有编码蛋白酶的氨基酸序列的核酸序列的基因构建体。
在各个实施方案中，本文进一步提供了产生免疫球蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：在哺乳动物细胞培养物中瞬时转染所述第一表达载体；使所述细胞培养物在受控的温度和CO2百分比下在表达培养基中生长；以及收获分泌的免疫球蛋白融合蛋白。在一些情况下，所述方法进一步包括共转染一种或多种附加表达载体。在一些情况下，所述一种或多种附加表达载体中的一种包含第二基因构建体，该第二基因构建体包含编码附加免疫球蛋白结构域的氨基酸序列的核酸序列。在一些情况下，所述一种或多种附加表达载体中的一种包含第三基因构建体，该第三基因构建体包含编码蛋白酶的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括纯化收获的免疫球蛋白融合蛋白。
附图说明
当结合附图阅读时，将会更好地理解前述发明内容以及本公开内容的以下具体实施方式。然而，应当理解，本公开内容不限于所示出的确切示例。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征不是按比例绘制的。相反，为了清楚起见，各个特征的尺寸被任意地扩大或缩小。附图中包含以下图。
图1A描绘了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的示意图，其包含：具有可变域(VH)和恒定区(CH1)的免疫球蛋白重链，以及与具有可变域(VL)和恒定区(CH1)的免疫球蛋白轻链的氨基末端连接的胰岛素治疗性肽。
图1B描绘了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的示意图，其包含：免疫球蛋白轻链和与免疫球蛋白重链的氨基末端连接的胰岛素治疗性肽。
图2示出了采用DTT还原(+)或未还原(-)的纯化的胰岛素融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。A图显示了包含Ab1H(SEQ ID NO：29)和Ins1-L1-Ab1L(SEQ ID NO：79)的纯化的胰岛素融合蛋白Ins1-L1-Ab1L IgG。B图显示了包含Ab1L(SEQ ID NO：30)和Ins1-L1-Ab1H(SEQ IDNO：78)的纯化的胰岛素融合蛋白Ins1-L1-Ab1H IgG。
图3为显示如图2中所示的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白(Ins1-L1-Ab1L IgG；Ins1-L1-Ab1H IgG)在体外测定中与人ASGPR结合的图。
图4为显示如图2中所示的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白(Ins1-L1-Ab1L IgG；Ins1-L1-Ab1H IgG)与大鼠ASGPR结合的图。
图5为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins1-L1-Ab1L IgG；Ins1-L1-Ab1H IgG)对HepG2细胞的活性的图。
图6为显示如图2所示的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白(Ins1-L1-Ab1L IgG(A图)；Ins1-L1-Ab1H IgG(B图))与HepG2细胞结合的流式细胞术直方图。
图7为对应于图6的直方图的曲线图。
图8示出了纯化的Ins1-L1-Ab2L IgG(SEQ ID NO：80、31)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图9示出了在通过和不通过酶PC2进行蛋白水解切割的情况下纯化的Ins2-L2-Ab3L(SEQ ID NO：81)和Ab3H(SEQ ID NO：167)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图10示出了纯化的Ins3-L2-Ab3L IgG融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图11为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins1-L1-Ab2L IgG；Ins3-L2-Ab1L IgG；经PC2切割的Ins3-L2-Ab1L IgG；Ins2-L2-Ab1L IgG；经PC2切割的Ins2-L2-Ab1L IgG)对HepG2细胞的活性的图。
图12示出了纯化的Ins1-L3-Ab4L IgG融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图13示出了纯化的Ins1-L3-Ab5L IgG融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图14示出了纯化的Ins1-L3-Ab4L(Fab)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图15为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins1-L3-Ab4L IgG；Ins1-L3-Ab4L(Fab))对HepG2细胞的活性的图。
图16，A-C图为显示胰岛素免疫球蛋白融合蛋白(Ins1-L3-Ab4L和Ab4H；Ins1-L3-Ab4L和Ab4H(Fab))与人、大鼠或食蟹猴ASGPR的胞外域结合的图。
图17示出了纯化的Ins4-L3-Ab4L IgG融合蛋白和Ins4-L3-Ab2L IgG融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图18为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins4-L3-Ab4L和Ab4H；Ins4-L3-Ab2L和Ab42)对HepG2细胞的活性的图。
图19示出了纯化的Ins4-L6-Ab4L IgG融合蛋白、Ins4-L6-Ab4L(Fab)融合蛋白和Ins5-L7-Ab4L IgG融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图20为显示胰岛素免疫球蛋白Ins4-L6-Ab4L IgG对HepG2细胞的活性的图。
图21为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins4-L6-Ab4L(Fab)和Ins5-L7-Ab4L IgG)对HepG2细胞的活性的图。
图22为显示胰岛素免疫球蛋白(Ins1-L3-Ab4L IgG；Ins1-L4-Ab4L IgG；Ins1-L5-Ab4L IgG)对HepG2细胞的活性的图。
图23示出了纯化的Ins1-L3-Ab4 Fab融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图24示出了纯化的Ins1-L3-Ab5 Fab融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图25示出了纯化的Ins7-L3-Ab4 Fab融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图26示出了纯化的Ins7-L3-Ab5 Fab融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
图27示出了显示Ins1-L3-Ab4 Fab融合蛋白的尺寸排阻纯化的图。
图28示出了显示Ins1-L3-Ab5 Fab融合蛋白的尺寸排阻纯化的图。
图29示出了显示Ins7-L3-A5Fab融合蛋白的尺寸排阻纯化的图。
图30示出了Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab融合蛋白的质谱表征图。
图31，A-C图为A4Fab、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab4 Fab凝胶过滤主峰收集的热稳定性图。
图32为显示野生型胰岛素、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab在HepG2细胞上的胰岛素结合活性的图。
图33为显示野生型胰岛素、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins7-L3-Ab4 Fab在HepG2细胞上的胰岛素结合活性的图。
图34为显示野生型胰岛素、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab在A673细胞上的胰岛素结合活性的图。
图35为显示野生型胰岛素、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab在SGBS细胞上的胰岛素结合活性的图。
图36为通过流式细胞术测定的Ins1-L3-Ab4 Fab、Ins1-L3-Ab5 Fab、Ab4和Ab5在HepG2细胞上结合的图。
图37为Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与人ASGPR的胞外域结合的图。
图38为Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与大鼠ASGPR的胞外域结合的图。
图39为Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与食蟹猴ASGPR的胞外域结合的图。
图40为在1mg/kg静脉内剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5Fab的药理学动力学图。
图41为与媒介物、Levimir(6U/kg，皮下)和幼稚
对照相比，在0.1mg/kg或1mg/kg静脉内剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的血糖浓度随时间变化的图。
图42为在20mg/kg静脉内剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的药理学动力学图。
图43为与媒介物、Levimir(6U/kg，皮下)和幼稚对照相比，在20mg/kg静脉内剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的血糖浓度随时间变化的图。
图44为在10mg/kg皮下剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的药理学动力学图。
图45为与媒介物、Levimir(6U/kg，皮下)和幼稚对照相比，在10mg/kg皮下剂量下Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的血糖浓度随时间变化的图。
图46，A-C图为在正常大鼠中在肝脏、肌肉或脂肪组织中测量的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的生物分布图。
图47示出了人、食蟹猴、大鼠和小鼠ASGPR的比对。
具体实施方式
在本公开内容的一个方面，本文提供了包含与免疫球蛋白或其部分连接的胰岛素治疗性肽的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可用于治疗与胰岛素和葡萄糖代谢相关的各种疾病和病况，如糖尿病。在各个实施方案中，所述融合蛋白的免疫球蛋白部分包含抗原结合域或是抗原结合域的一部分，该抗原结合域通过与由肝细胞表达或展示的抗原结合将所述融合蛋白靶向肝脏。示例性抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
根据本文所述主题的一个特征，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含第一免疫球蛋白区和胰岛素治疗性肽；其中所述胰岛素治疗性肽或其区域的氨基酸序列与免疫球蛋白区的氨基末端连接。在本文所述主题的另一个特征中，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含第一免疫球蛋白区和胰岛素治疗性肽；其中所述胰岛素治疗性肽或其区域的氨基酸序列与免疫球蛋白区的羧基末端连接。所述胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列可以通过接头与免疫球蛋白区连接。所述第一免疫球蛋白区可包含单个免疫球蛋白结构域或其部分，例如轻链结构域、重链结构域或其组合。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列。在一些情况下，所述连接通过化学键实现。在一些情况下，所述连接通过二硫键实现。在一些情况下，所述连接通过连接肽实现。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白进一步包含一个或多个蛋白酶切割位点。在胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含接头的一些情况下，所述接头包含蛋白酶切割位点。在胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含连接肽的一些情况下，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。
本文所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的胰岛素治疗性肽可包含来自胰岛素B链、胰岛素A链或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素B链、胰岛素A链或两条链均包含来源于人胰岛素的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素B链、胰岛素A链或两条链均包含来源于非人胰岛素的氨基酸序列。一个非限制性实例为猪胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素B链、胰岛素A链或两条链均包含来源于胰岛素类似物的氨基酸序列。
在一些实施方案中，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的胰岛素治疗性肽包含单链氨基酸序列。该单链氨基酸序列可包含来自胰岛素B链、胰岛素A链或其组合的氨基酸序列。在一些情况下，胰岛素治疗性肽的单链氨基酸序列包含来自胰岛素B链的氨基酸序列，该胰岛素B链通过连接肽与来自胰岛素A链的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的胰岛素治疗性肽包含含有治疗性肽的第一氨基酸序列的第一链和含有治疗性肽的第二氨基酸序列的第二链。在一些情况下，胰岛素治疗性蛋白的第一氨基酸序列与第一免疫球蛋白区连接。在一些情况下，治疗性蛋白的第二氨基酸序列与第一免疫球蛋白区连接。在一些实施方案中，第一链和第二链连接。作为非限制性实例，第一链和第二链通过一个或多个二硫键连接。第一链氨基酸序列可包含来自胰岛素B链、胰岛素A链或其组合的氨基酸序列。在一些情况下，胰岛素治疗性肽的第一链氨基酸序列包含来自胰岛素B链的氨基酸序列，并且第二链氨基酸序列包含来自胰岛素A链的氨基酸序列。在一些情况下，胰岛素治疗性肽的第一链氨基酸序列包含来自胰岛素A链的氨基酸序列，并且第二链氨基酸序列包含来自胰岛素B链的氨基酸序列。
式I-式XVI中描述了胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的示例性实施方案，其中T为胰岛素治疗性肽或治疗性肽的一部分，L为接头，并且A为免疫球蛋白区。治疗性肽、接头、连接肽或其任何组合可包含蛋白酶切割位点。不通过肽键连接的氨基酸，例如独立的链，用分号隔开。在一些实施方案中，一个或多个独立的链通过非共价键连接。作为非限制性实例，一个或多个独立的链通过一个或多个二硫键连接。
胰岛素治疗性肽Tn(n＝1或2)表示包含来源于胰岛素肽的一个或多个氨基酸序列的治疗性肽。胰岛素治疗性肽Tn可进一步包含一个或多个连接肽。在一些实施方案中，Tn包含来源于胰岛素肽的第一氨基酸序列、连接肽和来源于胰岛素肽的第二氨基酸序列。例如，第一氨基酸序列来源于胰岛素B链氨基酸序列，而第二氨基酸序列来源于胰岛素A链氨基酸序列，反之亦然。在一些实施方案中，Tn包含来源于胰岛素肽的第一氨基酸序列和连接肽。在一些实施方案中，Tn包含来源于胰岛素B链氨基酸序列的氨基酸。在一些实施方案中，Tn包含来源于胰岛素A链氨基酸序列的氨基酸。在一些情况下，T1包含来源于胰岛素B链氨基酸序列的氨基酸序列，并且T2包含来源于胰岛素A链氨基酸序列的氨基酸序列，其中T1、T2或T1和T2二者进一步包含一个或多个连接肽。在一些情况下，T1包含来源于胰岛素A链氨基酸序列的氨基酸序列，并且T2包含来源于胰岛素B链氨基酸序列的氨基酸序列，其中T1、T2或T1和T2二者进一步包含一个或多个连接肽。在一些实施方案中，连接肽包含蛋白酶切割位点。
免疫球蛋白区An(n＝1或2)表示第一免疫球蛋白区A1和第二免疫球蛋白区A2。在一些实施方案中，A1包含免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一些实施方案中，A2包含免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含免疫球蛋白重链的氨基酸序列。在一些实施方案中，A2包含免疫球蛋白重链的氨基酸序列。在一些实施方案中，对于包含A1和A2的胰岛素融合蛋白，这两个免疫球蛋白区进行连接。在一些情况下，这两个区域通过一个或多个二硫键连接。A1的氨基酸序列可包含来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列。A2的氨基酸序列可包含来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列。
在本公开内容的另一个方面，本文提供了包含本文公开的免疫球蛋白融合蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
在各个方面，本文进一步公开了治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法。通常，该方法包括向受试者施用包含胰岛素治疗性肽的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。在一些情况下，该疾病为糖尿病和/或其并发症。在一些实施方案中，将具有式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI，或其任何修饰、部分或添加的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白施用于受试者。
在各个方面，本文进一步公开了改善胰岛素治疗性肽的递送的方法。该方法可包括从基因构建体产生胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白由编码胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的基因构建体重组产生。在一些实施方案中，使用标准哺乳动物细胞培养技术在体外表达该构建体。在一些实施方案中，编码与第一免疫球蛋白区的氨基或羧基末端连接的胰岛素治疗性肽的一种构建体与包含第二免疫球蛋白区的第二构建体共表达，以产生重组胰岛素免疫球蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，编码蛋白酶的构建体与免疫球蛋白融合蛋白共表达。该方法可进一步包括生成包含接头、连接肽、蛋白水解切割位点或其组合的免疫球蛋白基因融合构建体。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解的是，本公开内容不限于所描述的具体方法或组合物，并且因此可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，而并非意在限制。提出实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本文提供的免疫球蛋白融合蛋白的公开内容和描述，而并非旨在限制发明人视为其发明的发明范围，也并非旨在表示所提供的实验涵盖了所有进行的实验。已经努力确保关于所用数字的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。
当提供数值范围时，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确说明)也得到具体公开。在所述范围中的任何所述值或中间值与在所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的各个较小范围也包含在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在该范围内或排除在该范围之外，并且其中任一、无一或两个界限均包含在较小范围内的每个范围也包含在本发明内，服从于所述范围中任何具体排除在外的界限。当所述范围包含一个或两个界限时，除去任一或两个那些包含在内的界限的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物在此通过引用并入，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。可以理解，在存在矛盾的情况下，本公开内容取代所并入的出版物的任何公开内容。
本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明了，本文描述并说明的每个单独的实施方案具有分立的组件和特征，其可与任何其他若干实施方案的特征容易地分离或组合，而不脱离本发明的范围或实质。可以按所列举事件的顺序或按任何其他在逻辑上可能的顺序实施任何列举的方法。任何列举的氨基酸序列的组合可以具有所列举的顺序或任何其他在逻辑上可能的顺序。作为非限制性实例，包含胰岛素治疗性肽T和免疫球蛋白区A的免疫球蛋白融合蛋白包括，例如但不限于：T-A、A-T、T-A-T和A-T-A。
必须指出，如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“该肽”包括提及一种或多种本领域技术人员已知的肽及其等价物，例如多肽，等等。
当本文中用于相对于参考序列描述氨基酸序列或核酸序列时，术语“同源的”、“同源性”或“百分同源性”可使用由Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中修改)描述的公式来确定。这样的公式被并入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对检索工具(BLAST)程序中。序列的百分同源性可以使用到本申请的申请日为止最新版本的BLAST来确定。
胰岛素免疫球蛋白融合蛋白
本文公开的各种胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含第一免疫球蛋白区和胰岛素治疗性肽，其中该胰岛素治疗性肽或其氨基酸序列与第一免疫球蛋白区的氨基或羧基末端连接。在各种情况下，该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白进一步包含第二免疫球蛋白区。该免疫球蛋白区(第一和/或第二)可以是免疫球蛋白的任何部分(部分或全部)。
所述免疫球蛋白区可包含整个免疫球蛋白分子或任何包含免疫球蛋白片段的多肽，该片段包括但不限于重链、轻链、可变域、恒定域、互补决定区(CDR)、构架区、片段抗原(Fab)结合区、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fab’、片段可结晶(Fc)区、单链可变片段(scFV)、di-scFv、单域免疫球蛋白、三功能免疫球蛋白、化学连接的F(ab’)2，及其任何部分或组合。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链可包含整个重链或重链的一部分。例如，来源于重链的可变域或其区域可被称为重链或重链的区域。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链可包含整个轻链或轻链的一部分。例如，来源于轻链的可变域或其区域可被称为轻链或轻链的区域。该免疫球蛋白区可以是双特异性的或三特异性的。单域免疫球蛋白包括但不限于单个单体可变免疫球蛋白域。该单域免疫球蛋白可以是鲨鱼可变新抗原受体免疫球蛋白片段(VNAR)。该免疫球蛋白可来源于本领域技术人员已知的任何类型，包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY、IgW。该免疫球蛋白区可以是糖蛋白。该免疫球蛋白区可包含一个或多个功能单元，包括但不限于1、2、3、4和5个单元。该免疫球蛋白区可包含通过一个或多个二硫键连接的一个或多个单元。该免疫球蛋白区可包含通过肽接头连接的一个或多个单元，例如scFv免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以是重组免疫球蛋白，包括具有氨基酸突变、置换和/或缺失的免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以是包含化学修饰的重组免疫球蛋白。该免疫球蛋白可包含免疫球蛋白-药物缀合物的整体或部分。该免疫球蛋白可包含小分子。该免疫球蛋白可包含含有小分子的免疫球蛋白-药物缀合物的整体或部分。该免疫球蛋白可以来自哺乳动物来源。该免疫球蛋白可以是嵌合免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可全部或部分来源于工程化的免疫球蛋白或重组免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以来自人源化的、人工程化的或完全的人免疫球蛋白。该哺乳动物免疫球蛋白可以是牛免疫球蛋白。该哺乳动物免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。该哺乳动物免疫球蛋白可以是鼠免疫球蛋白。该哺乳动物免疫球蛋白可以是非人灵长类动物免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以是禽类免疫球蛋白。该免疫球蛋白可以是鲨鱼免疫球蛋白。
本文所述的融合蛋白可以通过本领域已知的任何方式进行修饰，并因此可以偏离所述的实施方案。作为非限制性实例，对免疫球蛋白区的提及不限于抗体并且包括可与抗原结合的任何分子。
在本公开内容的一个方面，提供了包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的一个或多个部分的第一免疫球蛋白区的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其中该抗原结合域对肝细胞的抗原具有特异性。图1A和图1B中分别示出了显示轻链融合物和重链融合物的示例性示意图。被抗原结合域靶向的抗原可由肝细胞表达。作为非限制性实例，该抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。该抗原结合域可结合具有选自SEQ ID NO：162-165的序列的ASGPR的表位。相对于小鼠ASGPR，该抗原结合域可对人ASGPR具有特异性。在图47的序列比对中示出了表位的非限制性实例。例如，该抗原结合域可与具有SEQ ID NO：162的人ASGPR的表位的一个或多个氨基酸结合，其中所述一个或多个氨基酸选自R10、G11、F19、G35、N36、Q47、S56、L83、W134、E135、K138、V140、H142和K173。在一些情况下，所述表位的一个或多个氨基酸包含W134、E135、K138、V140、H142和K173的任何组合。
所述免疫球蛋白融合蛋白可包含基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约80％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约50％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约70％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个至少约80％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的125、150、175、200、225、250个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78-98中的任一个的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。这些氨基酸可以是连续的。备选地或附加地，这些氨基酸是不连续的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含来源于SEQ ID NO：78-98中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个的氨基酸。
所述免疫球蛋白融合蛋白可由基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约50％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约70％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约80％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约50％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约70％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约80％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个100％相同的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由与SEQ ID NO：57-77中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由与SEQ ID NO：57-77中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。
所述免疫球蛋白融合蛋白可由基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的含有125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、450、500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的含有100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的含有500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。这些核苷酸可以是连续的。备选地或附加地，这些核苷酸是不连续的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由来源于SEQ ID NO：57-77中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个的核酸序列编码。
本文进一步公开了包含基于或来源于SEQ ID NO：57-77中的任一个的核酸序列的核苷酸构建体。所述核苷酸构建体可以是用于在宿主细胞中表达的质粒。例如，哺乳动物或细菌表达质粒。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约50％同源的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约70％同源的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约80％同源的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约50％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约70％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约80％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO：57-77中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列。
胰岛素免疫球蛋白轻链融合物
在本公开内容的一个特征中，本文提供了包含胰岛素治疗性肽的免疫球蛋白融合蛋白，所述胰岛素治疗性肽包含与免疫球蛋白轻链的区域的氨基或羧基末端连接的一个或多个区域，其中所述免疫球蛋白融合物在本文中称为免疫球蛋白轻链融合物。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白进一步包含免疫球蛋白重链的一个或多个区域。在一些情况下，所述免疫球蛋白轻链融合物通过二硫键或接头与免疫球蛋白重链的一个或多个区域连接。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含治疗性肽的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含通过连接肽连接的治疗性肽的两个区域。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链融合物包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。
在本公开内容的一个方面，提供了包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的一个或多个部分的第一免疫球蛋白区的轻链胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其中所述抗原结合域对肝细胞的抗原具有特异性。被抗原结合域靶向的抗原可以由肝细胞表达。作为非限制性实例，所述抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：48-50中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：48有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：49有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：50有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：41和SEQ：44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：41和SEQ：44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。所述第一免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。所述第一免疫球蛋白区可包含与选自SEQID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含第二免疫球蛋白区。所述第二免疫球蛋白区可包含抗原结合域的一个或多个部分。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：45有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：46有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：55有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：47有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。所述第二免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。所述第二免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白轻链融合物可包含基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约80％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ IDNO：79-92、94-98中的任一个至少约50％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约70％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约80％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个100％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约80％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约50％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约70％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个至少约80％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链可包含与SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个100％相同的氨基酸序列。
所述胰岛素免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的125、150、175、200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的任一个的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。这些氨基酸可以是连续的。备选地或附加地，这些氨基酸是不连续的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链融合物包含来源于SEQ ID NO：79-92、94-98中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个的氨基酸。
所述免疫球蛋白轻链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约50％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约70％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约80％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约50％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个至少约70％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQID NO：58-71、73-77中的任一个至少约80％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由与SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个100％相同的核酸序列编码。
所述免疫球蛋白轻链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个的包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个的包含125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、450、500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个的包含100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白轻链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的任一个的包含500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。这些核苷酸可以是连续的。备选地或附加地，这些核苷酸是不连续的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链融合物由来源于SEQ ID NO：58-71、73-77中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个的核酸序列编码。
胰岛素免疫球蛋白重链融合物
在本公开内容的一个特征中，本文提供了包含胰岛素治疗性肽的免疫球蛋白融合蛋白，该胰岛素治疗性肽包含与免疫球蛋白重链的区域的氨基或羧基末端连接的一个或多个区域，其中所述免疫球蛋白融合物在本文中被称为免疫球蛋白重链融合物。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白进一步包含免疫球蛋白轻链的一个或多个区域。在一些情况下，所述免疫球蛋白重链融合物通过二硫键或接头与免疫球蛋白轻链的一个或多个区域连接。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含治疗性肽的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含通过连接肽连接的治疗性肽的两个区域。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链融合物包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。
在本公开内容的一个方面，提供了包含胰岛素治疗性肽和含有抗原结合域的一个或多个部分的第一免疫球蛋白区的重链胰岛素免疫球蛋白融合蛋白，其中所述抗原结合域对肝细胞的抗原具有特异性。被抗原结合域靶向的抗原可以由肝细胞表达。作为非限制性实例，所述抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：45有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：46有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：55有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：47有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。所述第一免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。所述第一免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。所述第一免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含第二免疫球蛋白区。所述第二免疫球蛋白区可包含抗原结合域的一个或多个部分。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：48-50中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：48有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第一CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQID NO：49有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第二CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与SEQ ID NO：50有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的第三CDR。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。所述第二免疫球蛋白区可包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。所述第二免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。所述第二免疫球蛋白区可包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白重链融合物可包含基于或来源于SEQ ID NO：78或93的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ ID NO：78或93至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ ID NO：78或93至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQID NO：78或93至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ IDNO：78或93至少约80％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ IDNO：78或93至少约50％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ IDNO：78或93至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ ID NO：78或93至少约70％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ ID NO：78或93至少约80％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含与SEQ ID NO：78或93 100％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含基于或来源于SEQ ID NO：78或93的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQID NO：78或93至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约80％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约50％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约70％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93至少约80％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白轻链可包含与SEQ ID NO：78或93 100％相同的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78或93的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78或93的125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、450、500个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78或93的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78或93的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ IDNO：78或93的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白重链融合物可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：78或93的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。这些氨基酸可以是连续的。备选地或附加地，这些氨基酸是不连续的。
所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ ID NO：57或72至少约50％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ ID NO：57或72至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQID NO：57或72至少约70％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ IDNO：57或72至少约80％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ IDNO：57或72至少约50％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ IDNO：57或72至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ ID NO：57或72至少约70％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ ID NO：57或72至少约80％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由与SEQ ID NO：57或72 100％相同的核酸序列编码。
所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72的包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72的包含125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、450、500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72中任一个的包含600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72的包含100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白重链融合物可由基于或来源于SEQ ID NO：57或72的包含500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。这些核苷酸可以是连续的。备选地或附加地，这些核苷酸是不连续的。
胰岛素免疫球蛋白融合蛋白
在本公开内容的一个特征中，本文提供了免疫球蛋白融合蛋白，其包含(a)胰岛素免疫球蛋白轻链融合物，和(b)来源于免疫球蛋白重链的第二免疫球蛋白区。在一些情况下，所述免疫球蛋白轻链融合物通过一个或多个二硫键和/或接头与第二免疫球蛋白区连接。所述胰岛素免疫球蛋白轻链融合物包含胰岛素治疗性肽，所述胰岛素治疗性肽包含与免疫球蛋白轻链的区域的氨基或羧基末端连接的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含治疗性肽的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含通过连接肽连接的治疗性肽的两个区域。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含第一链和第二链，其中第一链包含胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列，而第二链包含胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链融合物包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白被配置用于治疗代谢疾病如肥胖症和/或糖尿病，和/或其并发症或病况。
在本公开内容的另一个特征中，本文提供了免疫球蛋白融合蛋白，其包含(a)胰岛素免疫球蛋白重链融合物，和(b)来源于免疫球蛋白轻链的第二免疫球蛋白区。在一些情况下，所述免疫球蛋白重链融合物通过一个或多个二硫键和/或接头与第二免疫球蛋白区连接。所述胰岛素免疫球蛋白重链融合物包含胰岛素治疗性肽，所述胰岛素治疗性肽包含与免疫球蛋白重链的区域的氨基或羧基末端连接的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含治疗性肽的一个或多个区域。在一些实施方案中，所述胰岛素治疗性肽包含通过连接肽连接的治疗性肽的两个区域。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述连接肽包含蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述治疗性肽包含第一链和第二链，其中第一链包含胰岛素治疗性肽的第一氨基酸序列，而第二链包含胰岛素治疗性肽的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链融合物包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链包含含有或来源于抗-ASGPR抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。
在本公开内容的另一个特征中，本文提供了免疫球蛋白融合蛋白，其包含(a)胰岛素免疫球蛋白轻链融合物，和(b)胰岛素免疫球蛋白重链融合物。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：78的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：30的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：78 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：57的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：2的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：2至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：2 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：79的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：29的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：79至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：29至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：79 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：29100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：58的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：1的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：58至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：1至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：58 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：1 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：80的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：31的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：80至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：31至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：80 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：31100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：59的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：3的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：59至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：3至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：59 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：3 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：81的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：167的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：81至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：81 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：60的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：166的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：60至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：166至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：60 100％相同的核酸序列和与SEQ IDNO：166 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：82的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：167的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：82至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：82 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：61的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：166的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：61至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：166至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：61 100％相同的核酸序列和与SEQ IDNO：166 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：83的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：167的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：83至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：83 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：167100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：62的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：166的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：62至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：166至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：62 100％相同的核酸序列和与SEQ IDNO：166 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：84的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：84至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：84100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：63的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：63至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：63 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：85的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：85至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：85100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：64的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：64至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：64 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：86的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：31的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：86至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：31至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：86 100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：31100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：65的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：3的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：65至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：3至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：65 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：3 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：87的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：87至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：87100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：66的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：66至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：66 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：88的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：88至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：88100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：67的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：67至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：67 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：89的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：89至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：89100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：68的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：68至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：68 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：90的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：90至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：90100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：69的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：69至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：69 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：91的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：91至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：91100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：70的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：70至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：70 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：92的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：92至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：92100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：71的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：71至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：71 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：95的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：95至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：95100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：74的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：74至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：74 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：96的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：96至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：37或38至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：96100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：37或38 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：75的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：9或10的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：75至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：9或10至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：75 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：9或10 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：97的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：34或36的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：97至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：97100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：34或36 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：76的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：6或8的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：76至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：76 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：6或8 100％相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白包含基于或来源于SEQ ID NO：98的氨基酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：98至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：37或38至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。所述免疫球蛋白融合蛋白可包含与SEQ ID NO：98100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO：37或38 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合蛋白由基于或来源于SEQ ID NO：77的核酸序列和基于或来源于SEQ ID NO：9或10的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：77至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：9或10至少约60％、70％、75％、80％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：77 100％相同的核酸序列和与SEQ ID NO：9或10 100％相同的核酸序列编码。
免疫球蛋白区
本文公开的免疫球蛋白融合蛋白包含一个或多个免疫球蛋白区。对于肝脏靶向融合物，所述免疫球蛋白区包含抗原结合域的一个或多个部分，其中所述抗原结合域对肝细胞的抗原具有特异性。在一些情况下，所述抗原由肝细胞表达。在一些情况下，所述抗原为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。所述抗原结合域可与具有SEQ ID NO：162的ASGPR的表位的一个或多个氨基酸结合，其中所述一个或多个氨基酸选自R10、G11、F19、G35、N36、Q47、S56、L83、W134、E135、K138、V140、H142和K173。所述表位的一个或多个氨基酸可包含W134、E135、K138、V140、H142和K173的任何组合。
胰岛素融合蛋白的免疫球蛋白区可包含：(a)包含SEQ ID NO：45的重链可变区序列；(b)包含SEQ ID NO：46的重链可变区序列；(c)包含SEQ ID NO：55的重链可变区序列；(d)包含SEQ ID NO：47的重链可变区序列；(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区序列；(f)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区序列；(g)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区序列；(h)(a)、(b)和(d)的组合；(i)(a)、(c)和(d)的组合；(j)(e)、(f)和(g)的组合；(k)(h)和(j)的组合；或(l)(i)和(j)的组合。用于本文所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的对ASGPR具有特异性的免疫球蛋白包括在以下任一文献中描述的那些免疫球蛋白：US 2015/0299324、US 2013/0078216、WO 2011/086143、US 2016/0060354和US 2016/0015821。还想到的用于胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的免疫球蛋白为市售的抗-ASGPR免疫球蛋白和与本文描述的任何抗-ASGPR相竞争的免疫球蛋白。
在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45-47和55中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：45有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：46有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：55有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：47有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。
在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：39和SEQ：43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：29、34、36-40和43的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。
在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48-50中的一个或多个有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：48有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：49有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与SEQ ID NO：50有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。
在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列的可变区。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含具有与选自SEQ ID NO：41和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列的可变区。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ IDNO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在一些情况下，所述免疫球蛋白区包含与选自SEQ ID NO：30、33、35、41、42和44的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％或95％同源的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白区可包含可变域的至少一部分。所述免疫球蛋白区可包含一个或多个可变域或其部分。所述免疫球蛋白区可包含2、3、4、5个或更多个可变域或其部分。所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于一个或多个可变域的氨基酸序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述氨基酸可以是连续的。所述氨基酸可以是不连续的。
所述免疫球蛋白区可包含恒定域的至少一部分。所述免疫球蛋白区可包含一个或多个恒定域或其部分。所述免疫球蛋白区可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个恒定域或其部分。所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于一个或多个恒定域的氨基酸序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述氨基酸可以是连续的。所述氨基酸可以是不连续的。
所述免疫球蛋白区可包含互补决定区(CDR)的至少一部分。所述免疫球蛋白区可包含一个或多个互补决定区(CDR)或其部分。所述免疫球蛋白区可包含2、3、4、5个或更多个互补决定区(CDR)或其部分。所述免疫球蛋白区可包含6、7、8个或更多个互补决定区(CDR)或其部分。所述免疫球蛋白区可包含四个或更多个互补决定区(CDR)或其部分。所述免疫球蛋白区可包含9、10、11个或更多个互补决定区(CDR)或其部分。所述一个或多个CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3或其组合。所述一个或多个CDR可以是CDR1。所述一个或多个CDR可以是CDR2。所述一个或多个CDR可以是CDR3。所述CDR可以是重链CDR。所述一个或多个CDR可以是轻链CDR。
所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于CDR的氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于CDR的氨基酸序列的3个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于CDR的氨基酸序列的5个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于CDR的氨基酸序列的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述氨基酸可以是连续的。所述氨基酸可以是不连续的。
所述免疫球蛋白区可基于或来源于抗-T细胞受体免疫球蛋白的至少一部分。所述免疫球蛋白区可基于或来源于抗-B细胞受体免疫球蛋白的至少一部分。
所述免疫球蛋白区可基于或来源于与细胞上受体的至少一部分结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。所述免疫球蛋白区可基于或来源于与细胞上共同受体的至少一部分结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。所述免疫球蛋白区可基于或来源于与抗原的至少一部分或细胞上的细胞表面标志物结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。所述细胞可以是造血细胞。所述造血细胞可以是髓系细胞。所述髓系细胞可以是红细胞、凝血细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或肥大细胞。所述造血细胞可以是淋巴样细胞。所述淋巴样细胞可以是B细胞、T细胞或NK细胞。所述造血细胞可以是白细胞。所述造血细胞可以是淋巴细胞。
所述免疫球蛋白区可基于或来源于与肝细胞上受体的至少一部分结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。所述受体可以是ASPGR。
所述免疫球蛋白区可基于或来源于抗-ASGPR免疫球蛋白。所述免疫球蛋白区可包含抗-ASGPR免疫球蛋白的至少一部分。所述免疫球蛋白区可包含与抗-ASGPR免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含与抗-ASGPR免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更多同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含与抗-ASGPR免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含与抗-ASGPR免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
所述免疫球蛋白区可包含含有抗-ASGPR免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有抗-ASGPR免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有抗-ASGPR免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有抗-ASGPR免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。所述免疫球蛋白区可包含含有抗-ASGPR免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于与淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或NK细胞上受体的至少一部分结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。该受体可以是Fc受体。该Fc受体可以是Fc-γ受体、Fc-α受体和/或Fc-ε受体。Fc-γ受体包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。Fc-α受体包括但不限于FcαRI。Fc-ε受体包括但不限于FcεRI和FcεRII。该受体可以是CD89(IgA受体的Fc片段或FCAR)。
该免疫球蛋白区可基于或来源于与T细胞上共同受体的至少一部分结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。该共同受体可以是CD3、CD4和/或CD8。该免疫球蛋白区可基于或来源于与CD3共同受体结合的免疫球蛋白片段。该CD3共同受体可包括CD3-γ、CD3-δ和/或CD3-ε。CD8可包含CD8-α和/或CD8-β链。
在一些实施方案中，该免疫球蛋白区对于哺乳动物靶标不是特异性的。在一些实施方案中，该免疫球蛋白是抗病毒免疫球蛋白。在一些实施方案中，该免疫球蛋白是抗细菌免疫球蛋白。在一些实施方案中，该免疫球蛋白是抗寄生虫免疫球蛋白。在一些实施方案中，该免疫球蛋白是抗真菌免疫球蛋白。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区来源于免疫球蛋白疫苗。
在一些实施方案中，该免疫球蛋白区基于或来源于包括但不限于actoxumab、bezlotoxumab、CR6261、埃巴单抗、依芬古单抗(efungumab)、艾韦单抗、泛维珠单抗、福拉韦单抗、伊巴珠单抗(TMB-355、TNX-355)、利韦单抗、莫维珠单抗、奈巴库单抗、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕诺库单抗、雷韦单抗、雷昔库单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗(MSL-109)、suvizumab、替非珠单抗、妥韦单抗和乌珠单抗的免疫球蛋白。
在一些实施方案中，该免疫球蛋白区基于或来源于针对艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、正粘病毒(Orthomyxoviruses)(甲型流感病毒(Influenzavirus A)、乙型流感病毒(Influenzavirus B)、丙型流感病毒(Influenzavirus C)、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)、索哥托病毒(Thogotovirus))、大肠杆菌(Escherichia coli)、假丝酵母(Candida)、狂犬病病毒(Rabies)、人免疫缺陷病毒、肝炎病毒(Hepatitis)、葡萄球菌(Staphylococcus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫球蛋白。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗病毒免疫球蛋白。该抗病毒免疫球蛋白可针对病毒蛋白质的表位。抗细菌免疫球蛋白可靶向一种或多种病毒，包括但不限于腺病毒(Adenoviruses)、疱疹病毒(Herpesviruses)、痘病毒(Poxviruses)、细小病毒(Parvoviruses)、呼肠孤病毒(Reoviruses)、小核糖核酸病毒(Picornaviruses)、披膜病毒(Togaviruses)、正粘病毒、棒状病毒(Rhabdoviruses)、逆转录病毒(Retroviruses)和肝脱氧核糖核酸病毒(Hepadnaviruses)。该病毒蛋白质可以来自呼吸道合胞病毒。该病毒蛋白质可以是呼吸道合胞病毒的F蛋白。该表位可以在F蛋白的A抗原位点中。该抗病毒免疫球蛋白可基于或来源于帕利珠单抗。该免疫球蛋白可基于或来源于抗病毒疫苗。该抗病毒免疫球蛋白可基于或来源于艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗病毒免疫球蛋白G。该免疫球蛋白区可包含抗病毒免疫球蛋白G的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗病毒免疫球蛋白G的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗病毒免疫球蛋白G的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗病毒免疫球蛋白G的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗病毒免疫球蛋白G的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含基于或来源于抗病毒免疫球蛋白M的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗病毒免疫球蛋白G序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗病毒免疫球蛋白G序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗病毒免疫球蛋白G序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗病毒免疫球蛋白G序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗病毒免疫球蛋白G序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于帕利珠单抗免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含帕利珠单抗免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与帕利珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与帕利珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与帕利珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与帕利珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有帕利珠单抗免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有帕利珠单抗免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有帕利珠单抗免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有帕利珠单抗免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有帕利珠单抗免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有艾韦单抗、福拉韦单抗、利韦单抗、雷韦单抗、瑞加韦单抗、司韦单抗、妥韦单抗、泛维珠单抗、莫维珠单抗、帕利珠单抗和/或suvizumab免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗细菌免疫球蛋白。该抗细菌免疫球蛋白可针对细菌蛋白质的表位。该抗细菌免疫球蛋白可靶向细菌，包括但不限于橙黄弗拉托菌(Acetobacter aurantius)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、炭疽芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈红棕色单胞菌(Bacteroides gingivalis)、产黑素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Campylobacter pylori)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、(Enterococcus faecalis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、Enterococcus maloratus、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳巴尔通氏体(Haemophilus pertussis)、阴道加德纳氏菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、生殖道枝原体(Mycoplasma genitalium)、人型枝原体(Mycoplasma hominis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonie)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、土拉热弗朗西丝氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、产黑素拟杆菌(Prevotella melaninogenica)、铜绿假单胞菌、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、龋齿罗氏菌(Rothiadentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、彻白密螺旋体(Treponemapallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibrio comma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。该免疫球蛋白可基于或来源于细菌疫苗。该抗病毒免疫球蛋白可基于或来源于奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗细菌免疫球蛋白G。该免疫球蛋白区可包含抗细菌免疫球蛋白G的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗细菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗细菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗细菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗细菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含基于或来源于抗病毒免疫球蛋白M的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗细菌免疫球蛋白G序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗细菌免疫球蛋白G序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗细菌免疫球蛋白G序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗细菌免疫球蛋白G序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗细菌免疫球蛋白G序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有奈巴库单抗、帕诺库单抗、雷昔库单抗、埃巴单抗、帕昔单抗和/或替非珠单抗免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗寄生虫免疫球蛋白。抗寄生虫免疫球蛋白可针对寄生虫蛋白质的表位。该抗寄生虫免疫球蛋白可靶向寄生虫或寄生虫蛋白质，包括但不限于寄生虫棘阿米巴属(Acanthamoeba)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthiamandrillaris)、巴贝虫属(Babesia)(分歧巴贝虫(B.divergens)、双芽巴贝虫(B.bigemina)、马巴贝虫(B.equi)、果氏巴贝虫(B.microfti)、B.duncani、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、芽囊原虫属(Blastocystis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、贝氏等孢子球虫(Isospora belli)、利什曼原虫属(Leishmania)、福氏耐格里变形虫(Naegleria fowleri)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、Plasmodium ovale curtisi、Plasmodiumovale wallikeri、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)、西伯鼻孢子虫(Rhinosporidium seeberi)、牛-人肉孢子虫(Sarcocystisbovihominis)、猪-人肉孢子虫(Sarcocystis suihominis)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、多节绦虫亚纲(Cestoda)、多头绦虫(Taenia multiceps)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、沃氏棘球绦虫(Echinococcus vogeli)、少节棘球绦虫(Echinococcus oligarthrus)、短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、猪肉绦虫(Taenia solium)、古巴伯特绦虫(Bertiella mucronata)、萨氏伯特绦虫(Bertiella studeri)、刺猬绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)；(Clonorchisviverrini)、分支双腔吸虫(Dicrocoelium dendriticum)、肝片吸虫(Fasciolahepatica)、大片吸虫(Fasciola gigantica)、布氏姜片虫(Fasciolopsis buski)、棘颚口线虫(Gnathostoma spinigerum)、刚棘颚口线虫(Gnathostoma hispidum)、横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)、麝后睾吸虫(Opisthorchis viverrini)、猫后睾吸虫(Opisthorchis felineus)、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)；非洲并殖吸虫(Paragonimus africanus)；卡里并殖吸虫(Paragonimus caliensis)；猫肺并殖吸虫(Paragonimus kellicotti)；斯氏并殖吸虫(Paragonimus skrjabini)；双侧宫并殖吸虫(Paragonimus uterobilateralis)、血吸虫属的种(Schistosoma sp.)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、湄公河血吸虫(Schistosoma mekongi)、Echinostomaechinatum、Trichobilharzia regenti、裂体科(Schistosomatidae)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、美洲板口线虫(Necator americanus)、脊形管圆线虫(Angiostrongylus costaricensis)、异尖线虫(Anisakis)、蛔虫属的种人蛔虫(Ascarissp.Ascaris lumbricoides)、浣熊拜林蛔线虫(Baylisascaris procyonis)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、帝汶布鲁线虫(Brugia timori)、肾膨结线虫(Dioctophyme renale)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinensis)、蠕形住肠蛲虫(Enterobius vermicularis)、Enterobius gregorii、Halicephalobus gingivalis、罗阿丝虫(Loa filaria)、链尾曼森线虫(Mansonella streptocerca)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、加利福尼亚吸吮线虫(Thelazia californiensis)、结膜吸吮线虫(Thelazia callipaeda)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)、猫弓蛔虫(Toxocaracati)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、布氏旋毛虫(Trichinella britovi)、纳氏旋毛虫(Trichinella nelsoni)、Trichinella nativa、毛首鞭形线虫(Trichuris trichiura)、犬鞭虫(Trichuris vulpis)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、原棘头虫目(Archiacanthocephala)、念珠棘虫(Moniliformis moniliformis)、锯齿状舌形虫(Linguatula serrata)、狂蝇总科(Oestroidea)、丽蝇科(Calliphoridae)、麻蝇科(Sarcophagidae)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、硬蜱科(Ixodidae)、隐喙蜱科(Argasidae)、温带臭虫(Cimex lectularius)、人虱(Pediculushumanus)、人体虱(Pediculus humanus corporis)、耻阴虱(Pthirus pubis)、毛囊蠕形螨/皮脂蠕形螨/犬蠕形螨(Demodex folliculorum/brevis/canis)、疥螨(Sarcoptesscabiei)、嗜人锥蝇(Cochliomyia hominivorax)和人蚤(Pulex irritans)。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗寄生虫免疫球蛋白G。该免疫球蛋白区可包含抗寄生虫免疫球蛋白G的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗寄生虫免疫球蛋白G的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗寄生虫免疫球蛋白G的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗寄生虫免疫球蛋白G的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗寄生虫免疫球蛋白G的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含基于或来源于抗寄生虫免疫球蛋白M的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗寄生虫免疫球蛋白G序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗寄生虫免疫球蛋白G序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗寄生虫免疫球蛋白G序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗寄生虫免疫球蛋白G序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗寄生虫免疫球蛋白G序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗真菌免疫球蛋白。该抗细菌免疫球蛋白可针对真菌蛋白质的表位。该抗真菌免疫球蛋白可靶向真菌或真菌蛋白质，包括但不限于新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)、白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、星形假丝酵母(Candidastellatoidea)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。该抗真菌免疫球蛋白可基于或来源于依芬古单抗。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗真菌免疫球蛋白G。该免疫球蛋白区可包含抗真菌免疫球蛋白G的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗真菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗真菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗真菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗真菌免疫球蛋白G的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含基于或来源于抗真菌免疫球蛋白M的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗真菌免疫球蛋白G序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗真菌免疫球蛋白G序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗真菌免疫球蛋白G序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗真菌免疫球蛋白G序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗真菌免疫球蛋白G序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于依芬古单抗免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含依芬古单抗免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与依芬古单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与依芬古单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与依芬古单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与依芬古单抗免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有依芬古单抗免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有依芬古单抗免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有依芬古单抗免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有依芬古单抗免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有依芬古单抗免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有曲妥珠单抗免疫球蛋白G免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗-Her2免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含抗-Her2免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗-Her2免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-Her2免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-Her2免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-Her2免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗-Her2免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-Her2免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-Her2免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-Her2免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-Her2免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗-CD47免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含抗-CD47免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含与抗-CD47免疫球蛋白的至少一部分至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-CD47免疫球蛋白的至少一部分至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或97％或更高同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-CD47免疫球蛋白的至少一部分至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与抗-CD47免疫球蛋白的至少一部分至少约80％同源的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可包含含有抗-CD47免疫球蛋白序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-CD47免疫球蛋白序列的100、200、300、400、500、600、700、800、900个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-CD47免疫球蛋白序列的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-CD47免疫球蛋白序列的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有抗-CD47免疫球蛋白序列的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。
该免疫球蛋白区可基于或来源于抗癌免疫球蛋白。抗癌免疫球蛋白的实例包括但不限于阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、brentuximab、卡那奴单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、地舒单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、伊匹木单抗、莫罗单抗-cd3、那他珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗。
该免疫球蛋白区可包含人免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含人源化免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可包含嵌合免疫球蛋白的至少一部分。该免疫球蛋白区可基于或来源于人单抗免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可基于或来源于人源化单抗免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可基于或来源于嵌合免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可基于或来源于单克隆免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可基于或来源于多克隆免疫球蛋白。该免疫球蛋白区可包含来自哺乳动物、禽类、爬行动物、两栖动物或其组合的免疫球蛋白的至少一部分。该哺乳动物可以是人。该哺乳动物可以是非人灵长类动物。该哺乳动物可以是狗、猫、绵羊、山羊、牛、兔或小鼠。
该免疫球蛋白区可包含基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段序列的序列。该免疫球蛋白区可包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同源的序列。该免疫球蛋白区可包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的序列至少约70％同源的序列。该免疫球蛋白区可包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的序列至少约80％同源的序列。该免疫球蛋白区可包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的序列至少约90％同源的序列。该免疫球蛋白区可包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的序列至少约95％同源的序列。该序列可以是肽序列。该序列可以是核酸序列。
该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于或等于约200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、17、15、12、10、8、6、5、4个或更少的氨基酸不同的肽序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于或等于约4个或更少的氨基酸不同的肽序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于或等于约3个或更少的氨基酸不同的肽序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于或等于约2个或更少的氨基酸不同的肽序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于或等于约1个或更少的氨基酸不同的肽序列。该氨基酸可以是连续的、不连续的或其组合。例如，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于约3个连续氨基酸不同的肽序列。备选地或附加地，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于约2个不连续氨基酸不同的肽序列。在另一个实例中，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的肽序列有少于约5个氨基酸不同的肽序列，其中2个氨基酸是连续的而2个氨基酸是不连续的。
该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个抗体和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约15个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约12个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约9个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约6个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约4个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约3个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约2个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于或等于约1个或更少的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。该核苷酸或碱基对可以是连续的、不连续的或其组合。例如，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于约3个连续的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。备选地或附加地，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于约2个不连续的核苷酸或碱基对不同的核酸序列。在另一个实例中，该免疫球蛋白区可以包含与基于或来源于一个或多个免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的核酸序列有少于约5个核苷酸或碱基对不同的核酸序列，其中2个核苷酸或碱基对是连续的而2个核苷酸或碱基对是不连续的。
该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有一个或多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有两个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有三个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有四个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有五个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有六个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、20、25个或更多个氨基酸置换不同。该免疫球蛋白区的肽序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的肽序列有约20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300个或更多个氨基酸置换不同。
该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有一个或多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有两个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有三个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有四个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有五个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有六个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有九个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有12个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有15个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有18个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有20、22、24、25、27、30个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。该免疫球蛋白区的核酸序列可以与它所基于和/或来源于的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的核酸序列有约30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-400个或更多个核苷酸和/或碱基对置换不同。
该免疫球蛋白区可包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700个或更多个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约100个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约200个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约400个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约500个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含至少约600个氨基酸。
该免疫球蛋白区可包含少于约2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200或1100个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含少于约1000、950、900、850、800、750或700个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含少于约1500个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含少于约1000个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含少于约800个氨基酸。该免疫球蛋白区可包含少于约700个氨基酸。
所述免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含含有互补决定区3(CDR3)的30个或更少的连续氨基酸的免疫球蛋白区。该免疫球蛋白区可包含CDR3的30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的15个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的14个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的13个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的12个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的11个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的10个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的9个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的8个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的7个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的6个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的5个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的4个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的3个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的2个或更少的连续氨基酸。该免疫球蛋白区可包含CDR3的1个或更少的连续氨基酸。在一些情况下，该免疫球蛋白区不含CDR3。
该免疫球蛋白区可包含基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约50％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约70％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约80％同源的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约50％相同的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约70％相同的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约80％相同的氨基酸序列。该免疫球蛋白轻链融合蛋白可包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。该免疫球蛋白区包括基于或来源于来自SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的序列的Fab区。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含来源于与SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个至少约70％、80％、80％、90％、95％或100％的序列的氨基酸Fab序列。
该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的125、150、175、200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ IDNO：29-56、155、156、167中的任一个的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的100个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该免疫球蛋白区可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的任一个的200个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该氨基酸可以是连续的。备选地或附加地，该氨基酸是不连续的。在一些实施方案中，该免疫球蛋白区包含来源于SEQ ID NO：29-56、155、156、167中的1、2、3或4个的氨基酸。
所述免疫球蛋白区可由基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约50％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约70％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约80％同源的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约50％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约70％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个至少约80％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由与SEQ ID NO：1-28、166中的任一个100％相同的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区包括基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的序列的Fab区。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区包含来源于与SEQID NO：1-28、166中的任一个至少约70％、80％、80％、90％、95％或100％的序列的氨基酸Fab序列。
所述免疫球蛋白区可由基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的包含125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、450、500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的包含100个或更多个核苷酸的核酸序列编码。所述免疫球蛋白区可由基于或来源于SEQ ID NO：1-28、166中的任一个的包含500个或更多个核苷酸的核酸序列编码。这些核苷酸可以是连续的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白区由来源于SEQ ID NO：1-28、166中的1、2、3或4个的核酸序列编码。
治疗性肽
在本公开内容的一个方面，本文提供了包含胰岛素治疗性肽和免疫球蛋白区的免疫球蛋白融合蛋白。该免疫球蛋白融合蛋白可包含两个或更多个治疗性肽。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可包含3、4、5个或更多个治疗性肽。该治疗性肽可通过接头附接至免疫球蛋白区。在一些实施方案中，一个或多个附加治疗性肽附接至第一或第二免疫球蛋白区。所述一个或多个治疗性肽可附接至一个或多个免疫球蛋白区。所述两个或更多个治疗性肽可附接至两个或更多个免疫球蛋白区。所述两个或更多个治疗性肽可附接至一个或多个免疫球蛋白链。所述两个或更多个治疗性肽可附接至两个或更多个免疫球蛋白链。所述两个或更多个治疗性肽可附接至一个或多个免疫球蛋白区内的一个或多个单元。所述两个或更多个治疗性肽可附接至一个或多个免疫球蛋白区内的两个或更多个单元。在一些实施方案中，该治疗性肽在没有接头帮助的情况下与免疫球蛋白区连接。
在一个实施方案中，所述接头包含约0至约50个氨基酸。在一个实施方案中，所述接头包含约1至约50个氨基酸。在一个实施方案中，所述接头包含约1至约20个氨基酸，或约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一个实施方案中，所述接头的氨基酸不形成规则的二级结构。在一个实施方案中，所述接头包含与SEQ IDNO：63-69中的任一个的氨基酸序列约或至少约50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头包含1、2、3、4个或更多个甘氨酸残基。
本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可包含一个或多个治疗剂。该治疗剂可以是肽。该治疗剂可以是小分子。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可包含两个或更多个治疗剂。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可包含3、4、5、6个或更多个治疗剂。所述两个或更多个治疗性肽可以相同。所述两个或更多个治疗性肽可以不同。
所述治疗性肽可包含任何二级结构，例如α螺旋或β链，或不包含规则的二级结构。该治疗性肽可包含具有一个或多个修饰的氨基酸，该修饰包括但不限于豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化、酰化、乙酰化、烷基化、甲基化、糖基化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸添加、氧化、磷酸化、腺苷酰化、丙酰化、琥珀酰化、硫酸化、硒化、生物素化、聚乙二醇化、脱亚胺化、脱酰胺化、eliminylation和氨甲酰化。该治疗性肽可包含与一个或多个小分子(例如，药物)缀合的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，该治疗性肽包含一个或多个非天然氨基酸。在一些实施方案中，该治疗性肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50个或更多个非天然氨基酸。在一些实施方案中，该治疗性肽包含一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，该治疗性肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50个或更多个氨基酸置换。
该治疗性肽可插入免疫球蛋白区内。治疗性肽向免疫球蛋白区内的插入可包括该免疫球蛋白所基于或来源于的免疫球蛋白一部分的去除或缺失。该治疗性肽可替换重链的至少一部分。该治疗性肽可替换轻链的至少一部分。该治疗性肽可替换可变域的至少一部分。该治疗性肽可替换恒定域的至少一部分。该治疗性肽可替换互补决定区(CDR)的至少一部分。该治疗性肽可替换CDR1的至少一部分。该治疗性肽可替换CDR2的至少一部分。该治疗性肽可替换CDR3的至少一部分。该治疗性肽可替换免疫球蛋白或其部分的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。例如，该治疗性肽可替换可变域的至少约50％。该治疗性肽可替换可变域的至少约70％。该治疗性肽可替换可变域的至少约80％。该治疗性肽可替换可变域的至少约90％。该治疗性肽可替换可变域的至少约95％。例如，该治疗性肽可替换免疫球蛋白区的氨基末端的至少约50％。该治疗性肽可替换免疫球蛋白区的氨基末端的至少约70％。该治疗性肽可替换免疫球蛋白区的氨基末端的至少约80％。该治疗性肽可替换免疫球蛋白区的氨基末端的至少约90％。该治疗性肽可替换免疫球蛋白区的氨基末端的至少约95％。该治疗性肽可替换CDR的至少约50％。该治疗性肽可替换CDR的至少约70％。该治疗性肽可替换CDR的至少约80％。该治疗性肽可替换CDR的至少约90％。该治疗性肽可替换CDR的至少约95％。
在一些实施方案中，胰岛素治疗性肽的一个或多个区被配置为治疗糖尿病和/或糖尿病相关病况。在一些实施方案中，治疗性肽的2、3、4、5个或更多个区被配置为治疗糖尿病和/或糖尿病相关病况。糖尿病可包括I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和前驱糖尿病。在一些实施方案中，治疗性肽的一个或多个区被配置为治疗肥胖症和/或肥胖症相关病况。在一些实施方案中，治疗性肽的2、3、4、5个或更多个区被配置为治疗肥胖症和/或肥胖症相关病况。病况可以包括并发症和疾病。糖尿病相关病况的实例包括但不限于糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病心脏病、糖尿病足病、糖尿病神经病变、大血管病变、糖尿病心肌病、感染和糖尿病酮症酸中毒。糖尿病神经病变可包括但不限于对称性多神经病、自主神经病变、神经根病、颅神经病和单神经病。肥胖症相关病况包括但不限于心脏病、卒中、高血压、糖尿病、骨关节炎、痛风、睡眠呼吸暂停、哮喘、胆囊疾病、胆结石、血脂异常(例如，LDL和HDL胆固醇水平异常)、肥胖性低通气综合征、生殖问题、肝脂肪变性和心理健康状况。
本文所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含胰岛素治疗性肽。在一些情况下，该胰岛素治疗性肽包含具有式B-C-A或A-C-B的单个氨基酸链；其中B包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；A包含SEQ ID NO 158：GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN；并且C包含具有3至50个氨基酸的连接肽；并且其中XA、XB、XC和XD独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，XA为D或H。在一些情况下，XA为D。在一些情况下，XA为H。在一些情况下，XB为D或P。在一些情况下，XB为D。在一些情况下，XB为P。在一些情况下，XC为P或K。在一些情况下，XC为P。在一些情况下，XC为K。在一些情况下，XD为H或T。在一些情况下，XD为H。在一些情况下，XD为T。所述连接肽可包含含有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。所述连接肽可包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，X1为P、G或S。在一些情况下，X1为P。在一些情况下，X1为G。在一些情况下，X1为S。在一些情况下，X2为R、S、G或K。在一些情况下，X2为R。在一些情况下，X2为S。在一些情况下，X2为G。在一些情况下，X2为K。C可包含蛋白酶切割位点。一个非限制性实例为RKKR。所述胰岛素治疗性肽可包含选自SEQ ID NO：111、113、116、118、119-140的氨基酸序列。所述胰岛素治疗性肽可包含与SEQ ID NO：111、113、116、118、119-140中的任一个至少90％相同的氨基酸序列。
所述胰岛素治疗性肽可包含具有式B-C-A或A-C-B的单个氨基酸链；其中B包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列；A包含与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列；并且C包含具有3至50个氨基酸的连接肽。在一些情况下，B包含SEQ IDNO：160。在一些情况下，A包含SEQ ID NO：161。在一些情况下，所述连接肽包含具有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些情况下，所述连接肽包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，X1为P、G或S。在一些情况下，X1为P。在一些情况下，X1为G。在一些情况下，X1为S。在一些情况下，X2为R、S、G或K。在一些情况下，X2为R。在一些情况下，X2为S。在一些情况下，X2为G。在一些情况下，X2为K。C可包含蛋白酶切割位点。一个非限制性实例为RKKR。
所述胰岛素治疗性肽可包含含有SEQ ID NO：158(GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN)的A肽，其中XD为天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，XD选自H和T。在一些情况下，XD为H。在一些情况下，XD为T。在一些情况下，A肽的一个或多个半胱氨酸氨基酸与B肽的半胱氨酸氨基酸以二硫键存在。在一些情况下，B肽包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，XA为D或H。在一些情况下，XA为D。在一些情况下，XA为H。在一些情况下，XB为D或P。在一些情况下，XB为D。在一些情况下，XB为P。在一些情况下，XC为P或K。在一些情况下，XC为P。在一些情况下，XC为K。在一些情况下，B肽包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列。在一些情况下，B包含SEQ ID NO：160。在一些情况下，所述胰岛素治疗性肽包含含有与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的A肽。在一些情况下，A肽包含SEQ ID NO：161。在一些情况下，A肽的一个或多个半胱氨酸氨基酸与B肽的半胱氨酸氨基酸以二硫键存在。
所述胰岛素治疗性肽可包含含有与SEQ ID NO：161(GIVEQCCTSICSLYQLENYC)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列的A肽。在一些情况下，该A肽包含SEQ ID NO：161。在一些情况下，该A肽的一个或多个半胱氨酸氨基酸与B肽的半胱氨酸氨基酸以二硫键存在。在一些情况下，B肽包含SEQ ID NO：157(FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT)；并且XA、XB和XC独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，XA为D或H。在一些情况下，XA为D。在一些情况下，XA为H。在一些情况下，XB为D或P。在一些情况下，XB为D。在一些情况下，XB为P。在一些情况下，XC为P或K。在一些情况下，XC为P。在一些情况下，XC为K。在一些情况下，B肽包含与SEQ ID NO：160(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)有不超过5、4、3、2或1个氨基酸不同的氨基酸序列。在权利要求93所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的一些情况下，其中B包含SEQ ID NO：160。
在一些实施方案中，治疗性肽的氨基酸全部或部分地基于或来源于SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约50％同源的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约70％同源的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约80％同源的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ IDNO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约50％相同的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约70％相同的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个至少约80％相同的氨基酸序列。该治疗性肽可包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，该治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。
所述治疗性肽可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的10、20、30、40、50、60个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该治疗性肽可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的10个或更多个氨基酸的氨基酸序列。该治疗性肽可包含含有基于或来源于SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个的50个或更多个氨基酸的氨基酸序列。这些氨基酸可以是连续的。备选地或附加地，这些氨基酸是不连续的。例如，一个或多个氨基酸序列通过连接肽和/或二硫键连接。在一些实施方案中，该治疗性肽包含来源于SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的1、2、3或4个的氨基酸。
所述治疗性肽可以包含蛋白酶切割位点。该蛋白酶切割位点可以插入治疗性肽内。在一些实施方案中，该治疗性肽包含第一治疗性肽区和第二治疗性肽区。在一些实施方案中，该治疗性肽包含设置在第一治疗性肽区与第二治疗性肽区之间的蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，第一治疗性肽区和第二治疗性肽区来源于相同蛋白质或同组氨基酸序列。在一些实施方案中，第一治疗性肽区和第二治疗性肽区来源于不同蛋白质或不同组氨基酸序列。所述一个或多个蛋白酶切割位点可附接至治疗性肽区的N-末端、C-末端或同时附接至N-末端和C-末端。
所述治疗性肽可包含一个或多个连接肽。该治疗性肽可包含两个或更多个连接肽。该治疗性肽可包含3、4、5、6、7个或更多个连接肽。这些连接肽可以不同。这些连接肽可以相同。该一个或多个连接肽可附接至治疗性肽的区域的N-末端、C-末端或N-末端和C-末端两端。该连接肽可以插入到治疗性肽内。在一些实施方案中，该治疗性肽包含第一治疗性肽区和第二治疗性肽区。在一些实施方案中，该治疗性肽包含设置在第一治疗性肽区与第二治疗性肽区之间的连接肽。在一些实施方案中，第一治疗性肽区和第二治疗性肽区来源于相同蛋白质或同组氨基酸序列。在一些实施方案中，第一治疗性肽区和第二治疗性肽区来源于不同蛋白质或不同组氨基酸序列。在一些实施方案中，该连接肽来源于并且/或者包含SEQ ID NO：148-154中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该连接肽包含具有重复序列的氨基酸。在一些实施方案中，该连接肽具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个重复序列。在一些实施方案中，该连接肽是低免疫原性的。在一些实施方案中，该连接肽是可生物降解的。在一些情况下，该连接肽包含至少3、4、5个或更多个甘氨酸残基。在一些情况下，所述至少3、4、5个或更多个甘氨酸残基在连接肽序列中重复。在一些实施方案中，该连接肽包含GGGS。
在一些实施方案中，胰岛素治疗性肽包含连接肽，该连接肽包含含有至少50％的甘氨酸氨基酸的氨基酸序列。在一些情况下，该连接肽包含SEQ ID NO：159(GGGX1X2)，其中X1和X2独立地选自天然或非天然存在的氨基酸。在一些情况下，X1为P、G或S。在一些情况下，X1为P。在一些情况下，X1为G。在一些情况下，X1为S。在一些情况下，X2为R、S、G或K。在一些情况下，X2为R。在一些情况下，X2为S。在一些情况下，X2为G。在一些情况下，X2为K。在一些情况下，该连接肽包含蛋白酶切割位点。一个非限制性实例为RKKR切割位点。
蛋白水解切割位点
本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含一个或多个蛋白水解切割位点。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含2个或更多个蛋白水解切割位点。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含3个或更多个蛋白水解切割位点。本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可进一步包含4、5、6、7个或更多个蛋白水解切割位点。本文公开的治疗性肽可进一步包含一个或多个蛋白水解切割位点。
所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至治疗性肽的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端两端。所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至延伸肽的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端两端。所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至接头的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端两端。所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至连接肽的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端两端。所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至接头的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端两端。所述一个或多个蛋白水解切割位点可附接至治疗性肽、连接肽、接头、免疫球蛋白区或其组合。
在一些实施方案中，蛋白水解切割位点位于治疗性肽、连接肽、接头、免疫球蛋白区或其组合的氨基酸序列内。治疗性肽可在其氨基酸序列内包含一个或多个蛋白水解切割位点。
两个或更多个蛋白水解切割位点可围绕治疗性肽、连接肽、接头、免疫球蛋白区或其组合。蛋白水解切割位点的消化可导致位于所述两个或更多个蛋白水解切割位点之间的肽片段的释放。例如，蛋白水解切割位点可以在治疗性肽-接头肽的侧翼。该蛋白水解切割位点的消化可导致该治疗性肽-接头的释放。
蛋白水解切割位点可以被一种或多种蛋白酶识别。所述一种或多种蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、外肽酶、内肽酶或其组合。该蛋白酶可以选自因子VII或因子Xa。该蛋白酶的其他实例包括但不限于氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶。该蛋白酶可以是蛋白原转换酶(PC)。在一些情况下，该蛋白酶为PC2。在一些实施方案，该蛋白酶识别氨基酸序列KR。在一些实施方案，该蛋白酶识别氨基酸序列RKKR。
在一些实施方案中，编码免疫球蛋白融合蛋白的基因构建体包含编码蛋白酶切割位点的核酸序列。在一些情况下，该蛋白酶切割位点在体内表达后被切割，其中内源性蛋白酶和/或与融合蛋白共表达的蛋白酶在切割位点切割融合蛋白。在一些情况下，该蛋白酶切割位点为RKKR，并且与融合蛋白共表达的蛋白酶在该位点的羧基末端切割。在一些情况下，该蛋白酶切割位点为RKKR，并且内源性蛋白酶在该位点的氨基末端切割。
载体、宿主细胞和重组方法
如本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可通过已知的重组方法和蛋白质纯化方法表达和纯化。在一些情况下，免疫球蛋白融合蛋白的活性受到表达和/或纯化方法的影响。例如，经配置用作治疗剂的免疫球蛋白融合蛋白的活性基于以下方面得到增强或减弱：表达载体的种类(identity)、重组宿主的种类、细胞系的种类、表达反应条件、纯化方法、蛋白质加工，或其任意组合。表达反应条件包括但不限于温度、％CO2、培养基、表达时间、辅因子和伴侣蛋白(chaperones)。纯化方法包括但不限于纯化温度、层析树脂、蛋白酶抑制剂和缓冲液组成。
如本文公开的免疫球蛋白融合蛋白可通过重组方法表达。通常，可将编码免疫球蛋白融合蛋白的核酸分离并插入到可复制的载体中，以供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。编码免疫球蛋白融合蛋白的DNA可通过PCR扩增制备，并采用常规程序(例如，通过采用能够与编码免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸特异性结合的寡核苷酸探针)进行测序。在示例性的实施方案中，对编码免疫球蛋白融合蛋白的核酸进行PCR扩增、限制酶消化并凝胶纯化。可将消化的核酸插入到可复制的载体中。含有消化的免疫球蛋白融合蛋白插入的可复制载体可以转化或转导到宿主细胞中，以供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。宿主细胞可以是原核或真核细胞。
编码免疫球蛋白融合蛋白的多肽组分(例如，免疫球蛋白区、延伸肽、治疗性肽)的多核酸序列可以通过PCR扩增获得。可以从含有编码多肽组分的核酸的细胞中分离多核酸序列，并对其进行测序。备选地或附加地，可采用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就可以将编码多肽组分的序列插入到能够在原核和/或真核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。
此外，与宿主微生物相容的含有复制子和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主相关联的转化载体。例如，噬菌体如λGEMTM-11可以在制备可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392的重组载体中使用。
免疫球蛋白融合蛋白可以在细胞内(例如，细胞质)或在细胞外(例如，分泌)表达。对于细胞外表达，载体可包含能够使免疫球蛋白融合蛋白转移到细胞外的分泌信号。
用于克隆或表达编码免疫球蛋白融合蛋白的载体的合适的宿主细胞包括原核或真核细胞。该宿主细胞可以是真核细胞。真核细胞的实例包括但不限于人胚肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、真菌、酵母、无脊椎动物细胞(例如，植物细胞和昆虫细胞)、淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。合适的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TR1细胞；MRC5细胞；以及FS4细胞。该宿主细胞可以是原核细胞(例如，大肠杆菌)。
可以用含有编码免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸的载体转化宿主细胞。经转化的宿主细胞可以在培养基中培养。该培养基可补充有一种或多种用于诱导启动子、选择转化体或扩增或表达编码所需序列的基因的试剂。用于转化宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可包括电穿孔、氯化钙或聚乙二醇/DMSO。
或者，可以用含有编码免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸的载体转染或转导宿主细胞。经转染或转导的宿主细胞可以在培养基中培养。该培养基可补充有一种或多种用于诱导启动子、选择经转染或转导的细胞或表达编码所需序列的基因的试剂。
所表达的免疫球蛋白融合蛋白可以被分泌到宿主细胞的周质中并且从其中回收，或者转运到培养基中。从周质中回收蛋白质可包括使宿主细胞破裂。使宿主细胞破裂可包括渗压振扰、超声处理或裂解。可利用离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。例如，免疫球蛋白融合蛋白可通过亲和树脂层析进一步纯化。
或者，可以在培养基中分离分泌到该培养基中的免疫球蛋白融合蛋白。可从培养物中去除细胞，并将培养上清液过滤和浓缩，以用于产生的蛋白质的进一步纯化。可采用公知的方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹试验来进一步分离和鉴定所表达的多核苷酸。
可通过发酵工艺大量进行免疫球蛋白融合蛋白的生产。不同的大规模分批补料发酵程序可用于重组蛋白的生产。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物，尤其是葡萄糖(一种优选的碳源/能源)。小规模发酵通常是指在容积容量不大于约100升，并且范围可为约1升至约100升的发酵罐中的发酵。
在发酵工艺中，通常在细胞已经在合适的条件下生长至所需密度例如约180-220的OD550(在该阶段细胞处于早期的稳定期)后启动对蛋白质表达的诱导。根据采用的载体构建体，可以使用多种诱导物，如本领域已知的以及本文描述的。诱导之前细胞可生长较短的时间段。通常诱导细胞约12-50个小时，尽管可以使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本文公开的免疫球蛋白融合蛋白的生产产率和质量，可以对多个发酵条件进行改进。例如，为了改善所分泌的免疫球蛋白融合蛋白多肽的正确装配和折叠，可以使用额外的过表达伴侣蛋白如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺，反-异构酶)的载体来共转化宿主原核细胞。已经证明，这些伴侣蛋白有利于在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解性。
为了使表达的异源蛋白质(特别是对蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解最小化，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本发明。例如，可对宿主细胞菌株进行修饰以在编码已知细菌蛋白酶如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中产生基因突变。一些缺乏大肠杆菌蛋白酶的菌株是可用的。
可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析以及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
可采用可商购的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore 
超滤单元来浓缩免疫球蛋白融合蛋白。
可在前述任何步骤中包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物，以抑制免疫球蛋白融合蛋白的蛋白水解。
在一些情况下，免疫球蛋白融合蛋白在分离后可能不具有生物活性。用于将多肽“重折叠”或转化成其三级结构并产生二硫键的多种方法，可以用来恢复生物活性。这样的方法包括将溶解的多肽暴露于通常在7以上的pH并且存在特定浓度的离液剂。离液剂的选择非常类似于用于包涵体溶解的选择，但通常离液剂在较低浓度下使用，而不必与用于溶解的离液剂相同。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将含有还原剂或特定比例的还原剂加上其氧化形式以生成特定的氧化还原电位，从而允许在蛋白质的半胱氨酸桥的形成中发生二硫键改组(disulfide shuffling)。一些常用的氧化还原电对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。在许多情况下，可使用共溶剂来提高重折叠的效率，并且用于该目的的常见试剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
组合物及组合
本文公开了包含免疫球蛋白融合蛋白和/或免疫球蛋白融合蛋白的组分的组合物。在一些情况下，组合物包含免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂。组合物可包含1、2、3、4、5种或更多种免疫球蛋白融合蛋白和/或附加治疗剂。该组合物的免疫球蛋白融合蛋白可包含不同的免疫球蛋白区、接头、治疗性肽或其组合。本文进一步公开了免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂的组合，其中所述附加治疗剂与胰岛素免疫球蛋白融合蛋白分开配制。在这些情况下，该免疫球蛋白融合蛋白可与附加治疗剂一起或分开施用。在非限制性实例中，该附加治疗剂为胰岛素，例如与选自SEQ ID NO：109-140、157、158、160和161中的任一个的胰岛素具有至少约80％、85％、90％、95％或100％的同一性的胰岛素。该附加胰岛素可以不是将胰岛素靶向肝脏的分子的一部分。
所述组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可包含一种或多种药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物。用于本发明药物组合物中的药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递送媒介物、张度剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。
中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水是示例性的合适的载体。药物组合物可以包含抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如吐温(Tween)、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。还举例来说，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可以用作防腐剂。合适的共溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括失水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等。缓冲液可以是常规缓冲液，如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液可以为约pH 4-5.5，并且Tris缓冲液可以为约pH 7-8.5。另外的药剂在Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990中阐述。
非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏(Ringers’)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。总体上参见Remington's Pharmaceutical Science,16th Ed.,Mack Eds.,1980。
所述组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可以是液体形式或是冻干或冷冻干燥形式，并可以包含一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂(参见，例如，美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在一个实施方案中，包含冻干保护剂，其为非还原糖，如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得经重建后，所得制剂将是等渗的，尽管高渗或略微低渗的制剂也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量应足以防止蛋白质在冻干时不可接受的程度的降解和/或聚集。预冻干制剂中的糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM。在另一个实施方案中，包含表面活性剂，例如，非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(例如，Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠(sodium octylglycoside)；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基(cocamidopropyl)-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油酰基(ofeyl)牛磺酸二钠；MONAQUATTM系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇，和乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普朗尼克(Pluronics)、PF68等)。可以存在于预冻干制剂中的表面活性剂的示例量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填充剂、粘合剂)可包括，例如，阿拉伯胶、白蛋白、藻酸、磷酸钙(二碱式)、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、侵填体(tylose)、预胶化淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨糖醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、黄蓍胶、微晶纤维素、淀粉和玉米醇溶蛋白。高分子量结构添加剂的示例浓度为0.1重量％至10重量％。在其他实施方案中，可以包含膨胀剂(例如，甘露糖醇、甘氨酸)。
本文所述的组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可以以提供产品的局部浓度(例如，团注、贮库型(depot)效果)和/或提高在特定局部环境中的稳定性或半衰期的方式配制用于控制递送或持续递送。所述组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可以与聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂，以及试剂如可生物降解基质、可注射微球、微囊颗粒、微囊剂、生物可蚀解的颗粒珠、脂质体，和提供活性剂的控制或持续释放的可植入递送装置一起配制，其随后可以作为贮库型注射剂递送。用于配制此类持续或控制递送装置的技术是已知的，并且已经开发和使用了多种聚合物用于药物的控制释放和递送。这类聚合物一般是可生物降解的和生物相容的。聚合物水凝胶，包括通过对映体聚合物或多肽片段的复合而形成的聚合物水凝胶，以及具有温度或pH敏感性质的水凝胶，由于参与捕获生物活性蛋白剂的温和和水性条件，可以是提供药物贮库型效果所期望的。参见，例如，WO93/15722中用于递送药物组合物的控制释放多孔聚合物微粒的描述。
用于此目的的合适的材料包括聚交酯(参见，例如美国专利3,773,919)，聚-(a-羟基羧酸)的聚合物，如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988A)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22:547-556(1983))，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)，和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯，或聚-D(-)-3-羟基丁酸。其他生物可降解的聚合物包括聚(内酯)、聚(缩醛)、聚(原酸酯)和聚(原碳酸酯)。持续释放组合物还可以包含脂质体，其可以通过本领域已知的若干种方法中的任一种来制备(参见，例如，Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92(1985))。载体本身或其降解产物在靶组织内应是无毒的并且不应进一步加剧病情。这可以在目标病症的动物模型中，或者如果此类模型无法获得，则在正常动物中，通过常规筛查来确定。
可对组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂进行微囊化。
组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可适合于肠胃外施用。示例性的组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂适合通过技术人员可用的任何途径，例如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、病灶内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部、局部、口服或经鼻途径注射或输注到动物体内。肠胃外制剂通常将会是无菌、无热原的等渗水溶液，其任选含有药学上可接受的防腐剂。
适合于肌内、皮下、瘤周或静脉内注射的制剂可包括生理上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重建为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛等)，它们的合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣如卵磷脂、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。适合于皮下注射的制剂还含有任选的添加剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
对于静脉内注射，融合蛋白或附加药剂可任选地在水性溶液中配制，优选地在生理上相容的缓冲液如Hanks溶液、林格液或生理盐水缓冲液中配制。
肠胃外注射任选包括团注注射或连续输注。用于注射的制剂任选地以单位剂型例如在安瓿中或在添加有防腐剂的多剂量容器中提供。本文所述的药物组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可以是作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液适合于肠胃外注射的形式，并且含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性剂的水性溶液。此外，悬浮液任选地制备为合适的油性注射悬浮液。
备选地或附加地，组合物、免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂可以通过向患区中植入本文公开的免疫球蛋白融合蛋白已经吸附或包封于其上的膜、海绵或其他合适的物质而局部施用。当使用植入装置时，该装置可以植入到任何合适的组织或器官中，并且本文公开的免疫球蛋白融合蛋白、核酸或载体的递送可以经由团注或经由连续施用或经由采用连续输注的导管通过该装置直接进行。
包含本文公开的免疫球蛋白融合蛋白和/或附加治疗剂的组合物可以配制用于吸入，例如作为干粉。也可以在液化推进剂中配制吸入溶液以供气雾剂递送。在又一种制剂中，溶液可以雾化。用于肺给药的其他药物组合物包括例如在WO 94/20069中描述的那些，该申请公开了化学修饰的蛋白质的肺递送。对于肺递送，颗粒大小应适于递送至肺远侧。例如，颗粒大小可以是1μm至5μm；但是，可以使用更大的颗粒，例如，如果每个颗粒是相当多孔的话。
免疫球蛋白融合蛋白或附加治疗剂如胰岛素可使用胰岛素泵进行递送，由此装置根据针对胰岛素需求量而设定的预编程曲线定期分配少量治疗剂。例如，在进餐期间或之后，该泵可以分配团注量的治疗剂。该泵还可以根据对所测定的葡萄糖水平的响应来分配治疗剂。示例性的泵包括由Medtronic(MiniMed)、Animas Corporation、Disetronic和Dana出售的那些泵。
免疫球蛋白融合蛋白或附加治疗剂如胰岛素可使用经皮贴剂进行递送。在一些情况下，治疗剂被配制为溶于和/或分散于聚合物或粘合剂中的亲脂性乳液或缓冲水溶液。此类贴剂被设计用于治疗剂的连续、脉冲或按需递送。在一些情况下，经皮递送借助于离子电渗贴剂等来实现。在一些情况下，经皮贴剂提供控制递送。可通过使用速率控制膜或通过将治疗剂捕获在聚合物基质或凝胶内来减慢吸收速率。相反，吸收增强剂可用于增强吸收。吸收增强剂或载体包括用于帮助穿过皮肤的可吸收的药学上可接受的溶剂。在一些情况下，经皮装置为绷带的形式，该绷带包含支撑元件，含有活性剂和任选的载体的储库，用于将药剂以受控的预定速率经延长的时间段递送至受试者的皮肤的速率控制屏障以及用于将该装置固定至皮肤的粘合剂。
可口服施用包含本文公开的免疫球蛋白融合蛋白和/或附加治疗剂的某些制剂。以这种方式施用的制剂可以采用在固体剂型如片剂和胶囊的复合中惯常使用的载体或不采用这类载体来配制。例如，可以将胶囊设计成在胃肠道中的某点释放制剂的活性部分，这时生物利用度得到最大化且系统前降解得到最小化。可以包含另外的试剂以促进选择性结合剂的吸收。还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种制剂可包含在具有适合于制备片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的免疫球蛋白融合蛋白和/或附加治疗剂。通过将片剂溶解在无菌水中，或另外的合适媒介物中，可以以单位剂量的形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
基于本公开内容和配制技术的常识，根据拟定的给药途径、递送形式和所需剂量，可以确定合适的和/或优选的药物制剂。无论给药方式如何，可以根据患者体重、体表面积或器官大小来计算有效剂量。
对于涉及本文描述的各制剂的治疗，用于确定其适当剂量的计算的进一步细化在本领域中常规进行，并且处于本领域中常规实施的任务的范围内。适当的剂量可以通过使用合适的剂量-响应数据来确定。
“药学上可接受的”可指由联邦管理机构或州政府批准或可由其批准，或在美国药典或其他公认的药典中列出用于包括人类在内的动物。
“药学上可接受的盐”可指药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的化合物盐。
“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”可指可以与本公开内容的至少一种免疫球蛋白一起施用于受试者，并且在足以递送治疗量的化合物的剂量下施用时不会破坏其药理学活性且无毒的赋形剂、载体或佐剂。
“药学上可接受的媒介物”可指与本公开内容的至少一种免疫球蛋白一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
治疗用途
本文进一步公开了用于治疗、减轻、抑制和/或预防一种或多种疾病、病症和/或病况的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白和方法。所述方法可包括向有需要的受试者施用包含本文公开的一种或多种胰岛素免疫球蛋白融合蛋白的组合物。该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可用于调节或改善与葡萄糖相关的代谢缺陷和胰岛素代谢病症，如糖尿病。在一些情况下，受试者需要减少以下代谢指标中的至少一种：胰岛素分泌、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、高血糖症和体脂肪储存。受试者可以是人或动物，包括但不限于灵长类动物、牛、猪、绵羊、山羊、兔、马、鸡、猫、狗、小鼠等。
在一些实施方案中，向受试者施用免疫球蛋白融合蛋白，该免疫球蛋白融合蛋白包含含有对肝细胞上呈递的或由肝细胞表达的抗原具有特异性的抗原结合域的氨基酸序列，从而将该免疫球蛋白融合蛋白靶向肝脏。该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可包含胰岛素治疗性肽，该胰岛素治疗性肽包含与SEQ ID NO：109-140、157、158、160、161中的任一个具有约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可包含免疫球蛋白区，该免疫球蛋白区包含与SEQID NO：29、30、33-56、167中的任一个具有约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白序列可包含与SEQ ID NO：78-98中的任一个约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高的氨基酸序列同一性。该胰岛素免疫球蛋白融合蛋白可由与SEQ ID NO：57-77中的任一个至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本文所述的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白与附加治疗剂组合施用和/或配制。这两种治疗剂可同时施用或在不同的时间施用，和/或按时间表施用。例如，融合蛋白可以每天、每周、每月、每季度等等，施用一次，而附加治疗剂可以独立地每天、每周、每月、每季度等等施用一次。可以通过不同方式或相同方式施用这两种治疗剂。作为非限制性实例，每种治疗剂独立地或联合地经口服、经皮、静脉内、经鼻、皮下或如本文其他地方所述的任何方法来施用。
药理学性质
本文还公开了改善治疗性肽的一种或多种药理学性质的方法。该方法可以包括制备本文公开的免疫球蛋白融合蛋白。药理学性质的实例包括但不限于半衰期、稳定性、溶解度、免疫原性、毒性、生物利用度、吸收、释放、分布、代谢和排泄。释放可指治疗性肽从药物制剂中释放的过程。吸收可指物质进入血液循环的过程。分布可指物质遍布身体的体液和组织的分散或散布。代谢(或生物转化，或失活)可指被存在外来物质的生物体的识别以及母体化合物向子代谢物的不可逆转化。排泄可指物质从身体的去除。
治疗性肽的半衰期可以大于非偶联治疗性肽的半衰期。当施用于受试者时，治疗性肽的半衰期可以大于4小时、大于6小时、大于12小时、大于24小时、大于36小时、大于2天、大于3天、大于4天、大于5天、大于6天、大于7天、大于8天、大于9天、大于10天、大于11天、大于12天、大于13天或大于14天。当施用于受试者时，治疗性肽的半衰期可以大于4小时。当施用于受试者时，治疗性肽的半衰期可以大于6小时。
治疗性肽的半衰期可以增加至少大约2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多小时。治疗性肽的半衰期可以增加至少大约2小时。治疗性肽的半衰期可以增加至少大约4小时。治疗性肽的半衰期可以增加至少大约6小时。治疗性肽的半衰期可以增加至少大约8小时。
治疗性肽的半衰期可以是非缀合治疗性肽半衰期的至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以是非缀合治疗性肽半衰期的至少约15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50倍。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以是非缀合治疗性肽半衰期的至少约2倍。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以是非缀合治疗性肽半衰期的至少约5倍。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以是非缀合治疗性肽半衰期的至少约10倍。
本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约10％。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约20％。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约30％。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约40％。本文所述的免疫球蛋白的治疗性肽的半衰期可以比非缀合治疗性肽的半衰期长至少约50％。
药剂盒
本文还公开了包含一种或多种免疫球蛋白融合蛋白或其组分的药剂盒。免疫球蛋白融合蛋白可以以一种促进其应用以实施本公开内容的方法的方式包装。例如，药剂盒包含包装在容器中的本文所述的免疫球蛋白融合蛋白，该容器贴有标签或具有包装插页，其描述该免疫球蛋白融合蛋白在实施该方法中的应用。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。药剂盒可包含其中容纳有免疫球蛋白融合蛋白的容器。药剂盒可包含具有以下物质的容器：(a)如本文所述的免疫球蛋白融合蛋白和附加治疗剂。附加治疗剂可以是缺乏肝脏靶向部分的胰岛素分子。药剂盒可进一步包含指明第一和第二组合物可以用来治疗特定病况的包装插页。备选地或附加地，药剂盒可进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液(例如，抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格液和右旋糖溶液)。其可进一步包含从商业和用户角度出发为期望的其他物质，包括但不限于其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。免疫球蛋白融合蛋白可以以单位剂量形式包装。药剂盒可进一步包含适用于根据具体给药途径施用免疫球蛋白融合蛋白，或适用于实施筛选试验的装置。药剂盒可含有描述免疫球蛋白融合蛋白组合物的使用的标签。
可依照常规程序将包含免疫球蛋白融合蛋白的组合物配制成适合于向哺乳动物如人、牛、猫、犬和鼠静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物包含在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包含增溶剂和/或局部麻醉剂如利多卡因以减轻在注射部位的疼痛。通常，成分可以以单位剂量形式单独地或混合在一起地提供。例如，免疫球蛋白融合蛋白可以作为冻干的干粉或无水浓缩物在指示免疫球蛋白融合蛋白的量的密闭容器如安瓿或药囊中提供。当组合物将要通过输注施用时，其可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供具有无菌注射用水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用前混合。
将在与治疗性肽的异常表达和/或活性相关的疾病或病症治疗、抑制或预防中有效的本文所述组合物的量可通过标准的临床技术确定。此外，可任选地采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。将在制剂中使用的确切剂量还将取决于给药途径以及疾病或病症的严重程度，并应根据医师的判断和每个患者的情况来确定。有效剂量可以从由体外、动物模型测试系统或临床试验获得的剂量-响应曲线来外推。
实施例
以下实施例中提供的活性数据通常使用在实施例中定义的并由所提供的SEQ ID例证的免疫球蛋白融合蛋白而获得。应当理解，本文公开的任何免疫球蛋白融合蛋白的活性均可增强或减弱，这取决于与免疫球蛋白融合蛋白序列无关的条件，例如表达和纯化条件。
实施例1：用于在哺乳动物细胞中表达的Ins-L1-Ab1L和Ins-L1-Ab1H融合蛋白的构建
通过用人ASGPR胞外域对小鼠进行免疫获得小鼠抗-人ASGPR抗体5G3(称为抗-ASGPR(5G3)或Ab1)杂交瘤。通过对Ab1杂交瘤cDNA进行测序获得Ab1重链(Ab1 VH，SEQ IDNO：11)可变区或Ab1轻链(Ab1 VL，SEQ ID NO：13)可变区序列。通过将扩增的Ab1 VH(SEQID NO：11)和人IgG1 CH1(SEQ ID NO：12)与pFuse-hIgG1-Fc骨架载体(InvivoGen,CA)框内连接来生成编码Ab1H(SEQ ID NO：1)的哺乳动物表达载体。对编码抗体Ab1 VL(SEQ ID NO：13)和人IgκCL(SEQ ID NO：14)的基因进行扩增。将Ab1 VL和人Igκ的重叠PCR产物克隆至不含hIgG1 Fc片段的pFuse载体中，以生成编码Ab1L(SEQ ID NO：2)的哺乳动物表达载体。由Integrated DNA Technologies,Inc.(IA,USA)来合成编码具有四点突变和GGGPRR连接肽的单链胰岛素(Ins1，SEQ ID NO：99)的基因序列，并通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。将编码接头GGGGS(L1，SEQ ID NO：141)的核酸克隆在Ins1与Ab1H的N-末端之间，以生成Ins1-L1-Ab1H(SEQ ID NO：57)。将编码接头GGGGS(L1，SEQ ID NO：141)的核酸克隆在Ins1与Ab1L的N-末端之间，以生成Ins1-L1-Ab1L(SEQ ID NO：58)。通过DNA测序来证实得到的哺乳动物表达载体。
实施例2：Ins-L1-Ab1L IgG和Ins-L1-Ab1H融合蛋白的表达和纯化
根据制造商的方案，通过用Ab1H(SEQ ID NO：1)和Ins1-L1-Ab1L(SEQ ID NO：58)的表达载体瞬时转染FreeStyle HEK 293细胞来表达Ins1-L1-Ab1L(SEQ ID NO：79)和Ab1H(SEQ ID NO：29)(统称为Ins1-L1-Ab1L IgG)。简而言之，将28mL含有3×107个细胞的FreeStyle HEK 293细胞接种在125mL摇瓶中。向1mL含有60μL293fectin(Invitrogen,Inc)的Opti-MEM中添加在1mL Opti-MEM培养基中稀释的15μg编码Ins1-L1-Ab1L的质粒和15μg编码Ab1H的质粒。将质粒与293fectin一起温育30min后，向细胞悬浮液中添加lipoplex混合物。随后在37℃下，5％CO2环境中以125rpm摇动细胞。在转染后每48小时收获含有分泌性蛋白质(Ins1-L1-Ab1L IgG)的培养基两次。通过G蛋白色谱法(Thermo FisherScientific,IL)纯化Ins1-L1-Ab1L IgG。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，如图2所示。如针对Ins1-L1-Ab1L IgG所述，对Ins1-L1-Ab1H(SEQ ID NO：78)和Ab1L(SEQ ID NO：30)(统称为Ins1-L1-Ab1H IgG)进行表达和纯化，并在图2的SDS-PAGE凝胶中示出了纯化的融合蛋白。
实施例3：针对人ASGPR的Ins1-L1-Ab1L IgG和Ins-L1-Ab1H IgG融合蛋白结合测定
通过ELISA测定来检测Ins1-L1-Ab1L IgG(SEQ ID NO：79、29)和Ins1-L1-Ab1HIgG(SEQ ID NO：78、30)融合蛋白内的抗-ASGPR对于人ASGPR的活性。简而言之，在4℃下将100ng/孔的ASGPR抗原(人、大鼠和食蟹猴)在PBS中包被在96孔板上过夜；在室温下用2％乳剂/PBST(在PBS中的0.5％吐温-20)将孔封闭1hr；在室温下以在2％乳剂/PBST中10nM、1nM和0.1nM的浓度添加抗体2hr；将孔用PBST洗涤4-5次；添加在2％乳剂/PBST中的抗-轻链κ(sigma A7164)并将板在室温下温育1hr；将孔用PBST洗涤4-5次；并且用QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(Life technologies,15169)使反应物显影，并采用325nm处的激发和420nm处的发射使用Spectramax荧光读板器进行定量。图3显示了Ab1(不含融合治疗性肽的抗-ASGPR抗体(SEQ ID NO：29、30))、Ins1-L1-Ab1L IgG和Ins1-L1-Ab1H IgG与人ASGPR结合的浓度依赖性中值荧光强度。图4显示了Ab1、Ins1-L1-Ab1L IgG和Ins1-L1-Ab1H IgG与大鼠ASGPR结合的浓度依赖性荧光强度。这些图说明与胰岛素治疗性肽融合的抗-ASGPR抗体保持对于其抗原ASGPR的活性。
实施例4：采用HepG2细胞的胰岛素融合蛋白活性测定(磷酸化AKT(Ser473)测定)
使HepG2——人肝癌细胞——在含有10％胎牛血清(FBS)、100mM丙酮酸钠和抗生素(M1)的基本必需培养基(MEM)/F12(1:1)中生长。随后将这些细胞接种到384孔板(15K细胞/孔)中的含有HEPES和L-谷氨酰胺(Life Technologies)FBS和酚红(M2)的8μL Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(1:1)中。在37℃下，在5％CO2气体的存在下使细胞生长过夜(约16h)。第二天，在每个孔中与M2培养基中不同浓度的胰岛素或胰岛素融合蛋白一起温育(在37℃下，在5％CO2气体的存在下温育10min)后评估磷酸化AKT(Ser473)的活化。根据制造商的方案，利用磷酸化AKT(Ser473)细胞测定试剂盒(Cisbio Assay，目录号：64AKSPEG)检测磷酸化AKT(Ser473)。简而言之，直接在测定板中通过添加4μL裂解缓冲液裂解细胞。随后向每个孔补充4μL的含两种单克隆抗体的抗体溶液，这两种抗体识别磷酸化AKT并发出与在320nm处激发时磷酸化AKT的程度成比例的时间分辨荧光共振能量转移(FRET)信号。使用Envision读板器在665nm和615nm处测量发射。图5显示了胰岛素融合蛋白对HepG2细胞的活性，其中将HTRF(均相时间分辨荧光)比作为胰岛素(SEQ ID NO：138)、与赫赛汀抗体的氨基末端融合的Ins1(包含SEQ ID NO：94的Ins1-赫赛汀)、抗-ASGPR(SEQ ID NO：29、30)、Ins1-L1-Ab1H IgG和Ins-L1-Ab1L IgG的浓度的函数作图。图5说明Ins1融合蛋白对HepG2细胞具有相当或增强的胰岛素活性。测试化合物的EC50值计算如下：Ins1-L1-Ab1H IgG(SEQ IDNO：78、30)为103nm，Ins1-L1-Ab1L IgG(SEQ ID NO：79、29)为20nm，Ins1-赫赛汀IgG(SEQID NO：94)为118nm，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为401nm。图11、15、18、20-22说明Ins1、Ins2、Ins3和Ins4融合蛋白对HepG2细胞具有相当或增强的胰岛素活性。测试化合物的EC50值计算如下：Ins1-L1-Ab2IgG(SEQ ID NO：80、31)为46nm，Ins3-L2-Ab3 IgG(SEQ IDNO：83、33)+PC2为3.8nm，Ins3-L2-Ab3 IgG(SEQ ID NO：82、33)为4.4nm，Ins2-L2-Ab3 IgG(SEQ ID NO：81、167)+PC2为5.4nm，Ins2-L2-Ab3 IgG(SEQ ID NO：81、167)为21，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为209nm；图11。测试化合物的EC50值计算如下：Ins1-L3-Ab4 IgG(SEQ ID NO：84、34)为23nm，Ins1-L3-Ab4(Fab)(SEQ ID NO：84、36)为187nm，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为345nm；图15。测试化合物的EC50值计算如下：Ins4-L3-Ab4 IgG(SEQID NO：85、34)为53nm，Ins4-L3-Ab2 IgG(SEQ ID NO：86、31)为175nm，而野生型胰岛素(SEQID NO：138)为569nm；图18。测试化合物的EC50值计算如下：Ins4-L6-Ab4 IgG(SEQ ID NO：91、34)为40nm，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为345nm；图20。测试化合物的EC50值计算如下：Ins4-L6-Ab4(Fab)(SEQ ID NO：95、36)IgG为223nm，Ins5-L7-Ab4 IgG(SEQ ID NO：90、34)为>1580nm，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为426nm；图21。测试化合物的EC50值计算如下：Ins1-L3-Ab4 IgG(SEQ ID NO：84、34)为8nm，Ins1-L4-Ab4 IgG(SEQ ID NO：87、34)为13nm，Ins1-L5-Ab4 IgG(SEQ ID NO：88、34)为6nm，而野生型胰岛素(SEQ ID NO：138)为282nm；图22。
实施例5：胰岛素融合蛋白与HepG2细胞的结合亲和力的流式细胞术分析
收获HepG2细胞，将其洗涤并以5×106个细胞/mL的密度重悬于PBS/1％BSA溶液中。将细胞悬浮液在4℃下温育1小时。向细胞中添加各种浓度(40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0nM)的抗体(Ab1 IgG(SEQ ID NO：29、30)、Ins1-L1-Ab1L IgG(SEQ ID NO：79、29)、Ins1-L1-Ab1H IgG(SEQ ID NO：78、30)和Ins1-赫赛汀(SEQ ID NO：94))，在4℃、搅拌下温育2小时。随后用PBS/1％BSA洗涤细胞3次。用PBS/1％BSA将FITC-抗-人κ抗体(LifeTechnologies,Inc.)稀释500倍，并随后添加到细胞中，在4℃下再温育2小时。温育后，用PBS/1％BSA洗涤细胞两次并将细胞重悬于PBS/1％BSA溶液中。进行流式细胞术以分析结合抗体的量。图6显示了Ins1-L1-Ab1L IgG(A图)和Ins1-L1-Ab1H IgG(B图)在HepG2细胞上的结合。使用平均细胞荧光(FITC通道)对结合亲和力进行定量。图7显示了平均荧光强度(MFI)与每种测试抗体的浓度的图。
实施例6：用于在哺乳动物细胞中表达的胰岛素IgG融合蛋白的构建
将编码帕利珠单抗(Ab2H，SEQ ID NO：3)的重链的基因克隆至pFuse载体中。编码Ins1(SEQ ID NO：99)的核酸(如实施例1所述)由Integrated DNA Technologies,Inc.来合成，并通过PCR进行扩增。通过将编码Ins1(SEQ ID NO：99)和帕利珠单抗的轻链(Ab2L，SEQID NO：4)的基因与编码接头GGGGS(L1，SEQ ID NO：141)的核苷酸一起克隆至pFuse载体中来生成编码Ins1-L1-Ab2L(SEQ ID NO：59)的哺乳动物表达载体。通过DNA测序来证实得到的哺乳动物表达载体。
为了生成胰岛素抗-ASGPR融合蛋白，将编码抗-ASGPR的重链(SEQ ID NO：1、6、8、9、10、11或15)或轻链(SEQ ID NO：2、5、7、13或16)的核酸序列的基因克隆至pFuse载体中。编码选自SEQ ID NO：109-140的胰岛素的核酸由Integrated DNA Technologies,Inc.来合成，并通过PCR进行扩增。通过将编码胰岛素和接头的核酸克隆至pFuse载体中来生成编码胰岛素和抗-ASGPR融合蛋白的哺乳动物表达载体。通过DNA测序来证实得到的哺乳动物表达载体。
实施例7：胰岛素IgG融合蛋白的表达和纯化
根据制造商的方案，通过用Ab2H(SEQ ID NO：3)和Ins1-L1-Ab2L(SEQ ID NO：59)的表达载体瞬时转染FreeStyle HEK 293细胞来表达Ins1-L1-Ab2L(SEQ ID NO：59)和Ab2H(SEQ ID NO：3)(统称为Ins1-L1-Ab2L IgG)。简而言之，将28mL含有3×107个细胞的FreeStyle HEK 293细胞接种在125mL摇瓶中。向1mL含有60μL293fectin(Invitrogen,Inc)的Opti-MEM中添加在1mL Opti-MEM培养基中稀释的15μg编码Ins1-L1-Ab1L的质粒和15μg编码Ab1H的质粒。将质粒与293fectin一起温育30min后，向细胞悬浮液中添加lipoplex混合物。随后在37℃下，5％CO2环境中以125rpm摇动细胞。在转染后每48小时收获含有分泌性蛋白质Ins1-L1-Ab2L IgG(SEQ ID NO：80、31)的培养基两次。通过G蛋白色谱法(ThermoFisher Scientific,IL)纯化Ins1-L1-Ab2L IgG。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，如图8所示。
为了纯化胰岛素融合蛋白，首先用编码胰岛素融合蛋白的哺乳动物表达载体瞬时转染FreeStyle HEK 293细胞。任选地，将细胞与编码蛋白酶如PC2的哺乳动物表达载体共转染，以切割胰岛素抗-ASGPR融合蛋白的连接肽内的蛋白酶切割位点。简而言之，将28mL含有3×107个细胞的FreeStyle HEK 293细胞接种在125mL摇瓶中。向1mL含有60μL293fectin(Invitrogen,Inc)的Opti-MEM中添加在1mL Opti-MEM培养基中稀释的15μg编码胰岛素融合蛋白的质粒。将质粒与293fectin一起温育30min后，向细胞悬浮液中添加lipoplex混合物。随后在37℃下，5％CO2环境中以125rpm摇动细胞。在转染后每48小时收获含有分泌性胰岛素融合蛋白的培养基两次。通过G蛋白色谱法(Thermo Fisher Scientific,IL)纯化胰岛素融合蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，如图9、10、12-14、17和19所示。图9显示了在通过和不通过酶PC2进行蛋白水解切割的情况下，纯化的Ins2-L2-Ab3L IgG(SEQ ID NO：81)和Ab3H(SEQ ID NO：167)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图10显示了纯化的Ins3-L2-Ab3LIgG(Ins3-L2-Ab3L，SEQ ID NO：82；Ab3H，SEQ ID NO：167)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图12显示了纯化的Ins1-L3-Ab4L IgG(Ins1-L3-Ab4L，SEQ ID NO：84；Ab4H，SEQ ID NO：34)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图13显示了纯化的Ins1-L3-Ab5L IgG(Ins1-L3-Ab5L，SEQ ID NO：96；Ab5H，SEQ ID NO：37)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图14显示了纯化的Ins1-L3-Ab4L IgG(Ins1-L3-Ab4L，SEQ ID NO：84；Ab4H(Fab)，SEQ ID NO：36)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图17显示了纯化的Ins4-L3-Ab4L IgG(Ins4-L3-Ab4L，SEQ ID NO：85；Ab4H，SEQ ID NO：34)融合蛋白和Ins4-L3-Ab2L IgG(Ins4-L3-Ab2L，SEQ ID NO：86；Ab2H，SEQ ID NO：31)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。图19显示了纯化的Ins4-L6-Ab4L IgG(Ins4-L6-Ab4L，SEQ ID NO：91；Ab4H，SEQ ID NO：34)融合蛋白；Ins4-L6-Ab4L(Fab)(Ins4-L6-Ab4L，SEQ ID NO：91；Ab4H(Fab)，SEQ ID NO：36)融合蛋白；和Ins5-L7-Ab4L IgG(Ins5-L7-Ab4L，SEQ ID NO：90；Ab4H，SEQID NO：34)融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。
实施例8：用于在哺乳动物细胞中表达的Ins1-L3-Ab4 Fab、Ins1-L3-Ab5 Fab、Ins7-L3-Ab4 Fab和Ins7-L3-Ab5 Fab融合蛋白的构建、表达和纯化
将小鼠抗-人ASGPR抗体5G3(称为抗-ASGPR(5G3)或Ab1)人源化以获得人源化的抗-ASGPR或Ab4。为了生成Ab5H，使Ab4H突变以在氨基酸位置50处用精氨酸置换酪氨酸。编码Ins1(SEQ ID NO：99)或Ins7(SEQ ID NO：108)的基因序列由Integrated DNATechnologies,Inc.(IA,USA)来合成，并通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。将编码接头L3(SEQ ID NO：143)的核酸克隆在Ins1或Ins7与Ab4L或Ab5L的N-末端之间，以生成Ins1-L3-Ab4L(SEQ ID NO：63)、Ins1-L3-Ab5L(SEQ ID NO：75)、Ins7-L3-Ab4L(SEQ ID NO：76)或Ins7-L3-Ab5L(SEQ ID NO：77)。通过DNA测序来证实得到的哺乳动物表达载体。
如实施例2中一般性地描述，对融合蛋白进行表达和纯化。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，如图23-26所示。在图23的SDS-PAGE凝胶中显示了纯化的Ins1-L3-Ab4L(SEQ IDNO：84)和Ab4H(SEQ ID NO：36)(统称为Ins1-L3-Ab4 Fab)。在图24的SDS-PAGE凝胶中显示了纯化的Ins1-L3-Ab5L(SEQ ID NO：96)和Ab5H(SEQ ID NO：38)(统称为Ins1-L3-Ab5Fab)。在图25的SDS-PAGE凝胶中显示了纯化的Ins7-L3-Ab4L(SEQ ID NO：97)和Ab4H(SEQID NO：36)(统称为Ins7-L3-Ab4 Fab)。在图26的SDS-PAGE凝胶中显示了纯化的Ins7-L3-Ab5L(SEQ ID NO：98)和Ab5H(SEQ ID NO：38)(统称为Ins7-L3-Ab5 Fab)。
在蛋白质纯化和SDS-PAGE分析后，通过Superdex 200增加尺寸排阻凝胶过滤(GEHealthCare LifeSciences)进一步纯化Ins1-L3-Ab4 Fab、Ins1-L3-Ab5 Fab和Ins7-L3-Ab5 Fab融合蛋白，如图27-29中所示。如图27所示，在80-100min时收集纯化的Ins1-L3-Ab4L(SEQ ID NO：84)和Ab4H(SEQ ID NO：36)(统称为Ins1-L3-Ab4 Fab)的主峰。如图28所示，在80-100min时收集纯化的Ins1-L3-Ab5L(SEQ ID NO：96)和Ab5H(SEQ ID NO：38)(统称为Ins1-L3-Ab5 Fab)的主峰。如图29所示，在75-85min时收集纯化的Ins7-L3-Ab5L(SEQ IDNO：98)和Ab5H(SEQ ID NO：38)(统称为Ins7-L3-Ab5 Fab)的主峰。
使用ESI-MS表征通过G蛋白色谱法(Thermo Fisher Scientific,IL)和凝胶过滤纯化的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab，如图30所示。Ins1-L3-Ab4 Fab的观测结果为56209，而Ins1-L3-Ab5 Fab的观测结果为56239。
测定A4Fab、Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab4 Fab凝胶过滤主峰收集的热稳定性，如图31的A-C图所示。将在12.5μL的DPBS(pH 7.5)中的6.25μg融合蛋白与2.5μL的新鲜稀释的热转移染料(thermal shift dye)和5.0μL的shift缓冲液(Protein Thermal ShiftTMDye Kit，ThermoFisher Scientific，目录号4461146)混合。使用ViiATM 7实时PCR系统将荧光的检测与在加热速率0.05℃/s下从25℃至99℃的热扫描耦合。通过GraphPad Prism7中的分析模型“曲线下面积”计算解链温度(Tm)。将测定重复2次以确保再现性。如在图31的A图中所看到的，A4Fab的Tm为76℃。如在图31的B图中所看到的，Ins1-L3-Ab4 Fab的Tm为74.67℃。Ins1-L3-Ab4 Fab凝胶过滤主峰收集的Tm为74.8℃。
实施例9：采用HepG2、A673和SGBS细胞的胰岛素融合蛋白活性测定(磷酸化AKT(Ser473)测定)
实施例4中一般性地描述了胰岛素融合蛋白对AKT的活性。图32和图33说明Ins1融合蛋白对HepG2细胞具有相当或增强的胰岛素活性。如在图32和图33中所看到的，融合蛋白的EC50值计算如下：Ins1-L3-Ab4 Fab为30nM，Ins1-L3-Ab5 Fab为140nM，Ins7-L3-Ab4 Fab为73nM，而野生型胰岛素为231nM。
如在图34中所看到的，还测量了胰岛素融合蛋白对A673细胞上的AKT的活性。EC50值计算如下：Ins1-L3-Ab4 Fab为581nM，Ins1-L3-Ab5 Fab为351nM，而野生型胰岛素为362nM。如在图34中所看到的，胰岛素融合蛋白对A673细胞具有相当或增强的胰岛素活性。
如在图35中所看到的，还测量了胰岛素融合蛋白对SGBS细胞上的AKT的活性。EC50值计算如下：Ins1-L3-Ab4 Fab为94nM，Ins1-L3-Ab5 Fab为206nM，而野生型胰岛素为176nM。如在图35中所看到的，胰岛素融合蛋白对SGBS细胞具有相当或增强的胰岛素活性。
实施例10：胰岛素融合蛋白与HepG2、A673和SGBS细胞的结合亲和力的流式细胞术分析
在实施例5中一般性地描述了胰岛素融合蛋白与HepG2的结合亲和力的流式细胞术分析。简而言之，在4℃下将2×105个HepG2细胞用2％FBS、0.1％NaN3/PBS封闭，并在4℃下与200nM的抗体或融合蛋白混合1hr。用封闭缓冲液洗涤细胞三次之后，将HepG2细胞与抗-人FAB-FITC(1:1000，109-095-006，Immuno JacksonResearch)在4℃下一起温育30min。用封闭缓冲液洗涤三次之后，通过BD AccuriTM 6流式细胞仪获得FITC信号。对单细胞悬浮液施加门控并将平均荧光强度(MFI)对浓度作图以进行比较。Ins1-L3-Ab4 Fab的MFI计算为21570，且Ins1-L3-Ab5 Fab的MFI为8523。
还进行了流式细胞术以测定胰岛素融合蛋白与A673细胞的结合亲和力。Ins1-L3-Ab4 Fab的MFI计算为731，且Ins1-L3-Ab5 Fab的MFI为630。
采用SGBS细胞对胰岛素融合蛋白进行流式细胞术。Ins1-L3-Ab4Fab的MFI计算为1411，且Ins1-L3-Ab5 Fab的MFI为1047。
图36示出了Ins1-L3-Ab4、Ins1-L3-Ab5、Ab4和Ab5与HepG2的结合。将2×105个HepG2细胞在4℃下用2％FBS、0.1％NaN3/PBS封闭，并在4℃下与30pM至10nM的抗体或融合蛋白混合1hr。用封闭缓冲液洗涤细胞三次之后，将HepG2细胞与抗-人Fc-FITC(1:1000，02-10-20，KPL)在4℃下一起温育30min。用封闭缓冲液洗涤三次之后，通过BD AccuriTM 6流式细胞仪获得FITC信号。对单细胞悬浮液施加门控并将平均荧光强度(MFI)对浓度作图以进行比较。图36显示了平均荧光强度(MFI)与每个测试的抗体或融合蛋白的浓度的图。
实施例11：针对人、大鼠和猴ASGPR的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab融合蛋白结合测定
如实施例3中一般性地描述的，通过ELISA测定来检测Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab融合蛋白内的抗-ASGPR对于人、大鼠和食蟹猴ASGPR的活性，如图37-39中所示。在4℃下将100ng/孔ASGPR抗原(人、大鼠和食蟹猴)在PBS中包被在96孔板上过夜，在室温下用2％乳剂/PBST(PBS中的0.5％吐温-20)封闭1hr，并在室温下与在2％乳剂/PBST中4nM、20nM、100nM和500nm的融合蛋白一起温育2hr。随后用PBST洗涤孔4-5次，在室温下与在2％乳剂/PBST中的小鼠抗-胰岛素(MA5-12037,ThermoFisher Scientific)一起温育2hr，用PBST洗涤4-5次，与山羊抗-小鼠IgG-HRP(115-035-008,Jackson ImmunoResearch)一起温育30min，并用PBST洗涤4-5次。采用QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(Life technologies，15169)使板显影，并采用325nm处的激发和420nm处的发射使用Spectramax荧光读板器进行定量。
图37显示了Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与人ASPGR结合的浓度依赖性中值荧光强度。图38显示了Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与大鼠ASGPR结合的浓度依赖性中值荧光强度。图39显示了Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab与食蟹猴ASPGR结合的浓度依赖性中值荧光强度。这些图说明与胰岛素治疗性肽融合的抗-ASGPR抗体保持对于其抗原ASGPR的活性，如通过ELISA测定所测定的。
图16的A-C图为显示如通过ELISA测定所测的胰岛素免疫球蛋白融合蛋白(Ins1-L3-Ab4L和Ab4H；Ins1-L3-Ab4L和Ab4H(Fab))与人、大鼠或食蟹猴ASGPR的胞外域的结合的图。
实施例12：在链脲菌素(STZ)诱导的大鼠中Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的药理学动力学和血糖
如在图40、42和44中所看到的，在STZ诱导的大鼠中测定Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的药理学动力学。
图40示出了静脉内(IV)施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后在STZ诱导的大鼠中的药理学动力学。使用9周龄雄性Wistar大鼠。用65mg/kg静脉内进行STZ诱导，并通过采集空腹血糖来监测动物2周以确认糖尿病。在测定当天，在胰岛素和融合蛋白1mg/kg静脉内给药之前使动物禁食4hr。给药前，在胰岛素给药前测定动物的基线血糖和体重并进行分类(基于体重和血糖)。8hr后(禁食12hr)，提供食物。用标准饲料喂养大鼠。将抗-人IgG抗体(ab98616,Abcam)包被在96孔ELISA板上，用2％乳剂封闭，与血浆一起温育，并随后与小鼠抗-胰岛素(MA5-12037,ThermoFisher Scientific)一起温育。通过山羊抗-小鼠IgG-HRP抗体(115-035-008,Jackson ImmunoResearch)检测信号。如图40所示，将血浆中的融合蛋白的浓度对时间作图。如在图40中所看到的，Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab导致血浆中胰岛素浓度的时间依赖性降低。
图41示出了静脉内施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后对STZ诱导的大鼠的血糖浓度的影响。以0.1mg/kg或1mg/kg剂量静脉内施用Ins1-L3-Ab4 Fab。以0.1mg/kg或1mg/kg剂量静脉内施用Ins1-L3-Ab5 Fab。以6U/kg皮下施用Levimir。图41示出了Ins1-L3-Ab4Fab、Ins1-L3-Ab5 Fab、Levimir、媒介物和幼稚对照随时间对血糖浓度的影响。
图42示出了静脉内施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后在STZ诱导的大鼠中的药理学动力学。使用9周龄雄性Wistar大鼠。用65mg/kg静脉内进行STZ诱导，并通过采集空腹血糖来监测动物2周以确认糖尿病。在测定当天，在胰岛素和融合蛋白20mg/kg静脉内给药之前使动物禁食4hr。给药前，在胰岛素给药前测定动物的基线血糖和体重并进行分类(基于体重和血糖)。8hr后(禁食12hr)，提供食物。用标准饲料喂养大鼠。将抗-人Fab抗体(109-005-097,Jackson ImmunoResearch)包被在96孔ELISA板上，用2％乳剂封闭，与血浆一起温育，并随后与小鼠抗-胰岛素(MA5-12037,ThermoFisher Scientific)一起温育。通过山羊抗-小鼠IgG-HRP抗体(115-035-008,Jackson ImmunoResearch)检测信号。如图42所示，将血浆中的融合蛋白的浓度对时间作图，并通过Winnolin分析药代动力学参数。Ins1-L3-Ab4 Fab的T1/2测定为4.8hr，且Ins1-L3-Ab5 Fab的T1/2测定为4.2hr。Ins1-L3-Ab4 Fab的Cmax测定为2541nM，且Ins1-L3-Ab5 Fab的Cmax测定为5917nM。Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab的Tmax为0.5hr。Ins1-L3-Ab4 Fab的曲线下面积(AUC)计算为5145hr·nM，且Ins1-L3-Ab5 Fab的曲线下面积计算为11886hr·nM。
图43示出了静脉内施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后对STZ诱导的大鼠的血糖浓度的影响。将20mg/kg剂量的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab静脉内施用于STD诱导的大鼠。以6U/kg皮下施用Levimir。图43示出了Ins1-L3-Ab4 Fab、Ins1-L3-Ab5Fab、Levimir、媒介物(HBSS)和幼稚对照随时间对血糖浓度的影响。
图44示出了皮下(SC)施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后在STZ诱导的大鼠中的药理学动力学。类似于该实施例中所述的方法，向大鼠皮下施用10mg/kg的Ins1-L3-Ab4 Fab或Ins1-L3-Ab5 Fab。如图44所示，将血浆中的融合蛋白的浓度对时间作图。如在图44中所看到的，Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab导致30hr后血浆中胰岛素浓度的时间依赖性降低。
图45示出了皮下施用Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab后对STZ诱导的大鼠的血糖浓度的影响。将10mg/kg剂量的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab皮下施用于STD诱导的大鼠。以6U/kg皮下施用Levimir。图45示出了Ins1-L3-Ab4 Fab、Ins1-L3-Ab5 Fab、Levimir、媒介物(HBSS)和幼稚对照随时间对血糖浓度的影响。
实施例13：Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab在正常大鼠中的生物分布
图46A-46C示出了Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab在正常大鼠中的生物分布。在融合蛋白给药(5mg/kg，IV)前使9周龄雄性Wistar大鼠禁食4hr。给药前，在胰岛素给药前测定动物的基线血糖和体重并进行分类(基于体重和血糖)。给药后1hr后，处死大鼠，并提取肝脏、肌肉(股四头肌)和脂肪(附睾白色脂肪)组织。将提取的组织在具有1x蛋白酶抑制剂、1mM EDTA和0.5％Triton-100的PBS中均质化为300mg/mL。将抗-人Fab抗体(109-005-097,Jackson ImmunoResearch)包被在96孔ELISA板上，用2％乳剂封闭，与血浆一起温育，并随后与小鼠抗-胰岛素(MA5-12037,ThermoFisher Scientific)一起温育。通过山羊抗-小鼠IgG-HRP抗体(115-035-008,Jackson ImmunoResearch)检测信号。
如在图46A中所看到的，对于肝脏中的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab，Ins1-L3-Ab4 Fab的量为7.98且Ins1-L3-Ab5 Fab的量为3.12。如在图46B中所看到的，对于脂肪中的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab，Ins1-L3-Ab4 Fab的量为0.08且Ins1-L3-Ab5 Fab的量为0.23。如在图46C中所看到的，对于肌肉中的Ins1-L3-Ab4 Fab和Ins1-L3-Ab5 Fab蛋白，Ins1-L3-Ab4 Fab的量为0.08且Ins1-L3-Ab5 Fab的量为0.27。
前面仅说明了本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计多种布置，这些布置尽管没有在本文中明确地描述或显示，但其体现了本发明的原理并包括在其精神和范围内。此外，本文描述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由发明人贡献的概念以促进本领域发展，并应解释为不限于这些具体描述的实例和条件。而且，本文描述本发明的原理、方面和实施方案的所有声明以及其具体实例，旨在涵盖其结构和功能上的等同物。另外，这样的等同物旨在包括目前已知的等同物和将来研发的等同物，即，无论结构如何，研发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围并非旨在限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求书来体现。
尽管本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会明白，这些实施方案仅通过举例提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变换、改变和替代。应理解，本文描述的本发明实施方案的多种替代方案可以用于实施本发明。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
本文引用的所有参考文献均为所有目的通过引用而全文并入，其程度如同特别地和单独地指出各单独的出版物或专利或专利申请均为所有目的通过引用而全文并入。
Claims (44)
1.一种与脱唾液酸糖蛋白受体特异性结合的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含：
a)包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区序列，其中所述CDR1的序列如SEQ ID NO：45所示，所述CDR2的序列如SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：46所示，并且所述CDR3的序列如SEQ IDNO：47所示；以及
b)包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区序列，其中所述CDR1的序列如SEQ ID NO：48所示，所述CDR2的序列如SEQ ID NO：49所示，并且所述CDR3的序列如SEQ ID NO：50所示。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其中所述重链可变区序列包括SEQ ID NO:45、55和47。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其中所述重链可变区序列包括SEQ ID NO:45-47。
4.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:43至少95％同源的序列。
5.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:43具有不多于两个氨基酸的区别的序列。
6.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:43的序列。
7.根据权利要求6所述的免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:36的序列。
8.根据权利要求7所述的免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:34的序列。
9.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:39至少95％同源的序列。
10.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:39具有不多于两个氨基酸的区别的序列。
11.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其中所述重链序列包含SEQ ID NO:39。
12.根据权利要求11所述的免疫球蛋白，其中所述重链序列包含SEQ ID NO:167。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:41至少95％同源的序列。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:41具有不多于两个氨基酸的区别的序列。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:41的序列。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:44至少95％同源的序列。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含与SEQ ID NO:44具有不多于两个氨基酸的区别的序列。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其包含SEQ ID NO:44的序列。
19.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其中所述重链可变区序列包括SEQ ID NO:43，且所述轻链可变区序列包括SEQ ID NO:44。
20.根据权利要求1所述的免疫球蛋白，其中所述重链可变区序列包括SEQ ID NO:39，且所述轻链可变区序列包括SEQ ID NO:41。
21.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是人源化的。
22.一种组合物，其包含胰岛素和根据权利要求1-21中任一项所述的免疫球蛋白。
23.根据权利要求22所述的组合物在制备用于将所述胰岛素靶向有需要的受试者的肝细胞的药物中的应用。
24.根据权利要求22所述的组合物或者权利要求23所述的应用，其中所述胰岛素与所述免疫球蛋白融合或连接。
25.根据权利要求22所述的组合物或者权利要求23所述的应用，其中所述胰岛素包含人胰岛素B链、人胰岛素A链或其组合。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的应用，其中所述受试者患有糖尿病。
27.一种包含下式的分子的组合物：
I-L-G
其中：
I具有式B-A、A-B、B-C-A或A-C-B；其中B包含胰岛素B链；A包含胰岛素A链；如果C存在，则C包含连接B和A的连接体；并且B-A、A-B、或B-A和A-B二者通过二硫键连接；
L包含接头；并且
G包含根据权利要求1-21中任一项所述的免疫球蛋白。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中I具有式B-C-A或A-C-B，且所述连接体是连接肽。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中C包含蛋白酶切割位点。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物，其中胰岛素B链选自人胰岛素B链、猪胰岛素B链和牛胰岛素B链。
31.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物，其中胰岛素A链选自人胰岛素A链、猪胰岛素A链和牛胰岛素A链。
32.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物，其中所述连接体包含连接肽。
33.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
34.根据权利要求27所述的组合物，其中I与所述免疫球蛋白的氨基末端连接。
35.胰岛素免疫球蛋白融合蛋白在制备用于治疗有需要的受试者的与糖尿病的药物中的应用，其中所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白包含胰岛素治疗性肽和根据权利要求1-21中任一项所述的免疫球蛋白。
36.根据权利要求35所述的应用，其中所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白经由皮下、静脉内、肌内、经皮、口服或经鼻途径施用。
37.根据权利要求35所述的应用，其中所述胰岛素免疫球蛋白融合蛋白经由输注途径施用。
38.根据权利要求35所述的应用，其中所述胰岛素治疗性肽具有式B-A、A-B、B-C-A或A-C-B；其中B包含胰岛素B链；A包含胰岛素A链；如果C存在，则C包含连接B和A的连接体；并且B-A、A-B、或B-A和A-B二者通过二硫键连接。
39.根据权利要求38所述的应用，其中所述连接体为连接肽。
40.根据权利要求38所述的应用，其中C包含蛋白酶切割位点。
41.根据权利要求38所述的应用，其中所述胰岛素B链的序列为FVNQHLCGSXALVEALYLVCGERGFFYTXBXCT；其中XA为D或H，XB为D或P，并且XC为P或K。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的应用，其中胰岛素B链选自人胰岛素B链、猪胰岛素B链和牛胰岛素B链。
43.根据权利要求38-41中任一项所述的应用，其中所述胰岛素A链的序列为GIVEQCCXDSICSLYQLENYCN，并且XD选自H和T。
44.根据权利要求38-41中任一项所述的应用，其中胰岛素A链选自人胰岛素A链、猪胰岛素A链和牛胰岛素A链。
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Effective date of registration: 20200414 Address after: California, USA Applicant after: THE SCRIPPS Research Institute Address before: California, USA Applicant before: THE CALIFORNIA INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Feng Inventor after: Matthew S. Tremble Inventor after: Travis young Inventor after: Nichol Alvarez Inventor after: Yan .liu Inventor after: Du Juanjuan Inventor after: Peter G. Schultz Inventor before: Feng .wang Inventor before: Matthew S. Tremble Inventor before: Travis young Inventor before: Nichol Alvarez Inventor before: Yan .liu Inventor before: Du Juanjuan Inventor before: Peter G. Schultz |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |