CN116916965A - 具有所偶联的生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合的生物活性材料缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性材料缀合物，其中生物活性材料与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合，并且更具体地，涉及具有所偶联的生物素部分和脂肪酸部分的生物活性材料缀合物。具有与其偶联的生物素部分或脂肪酸部分，根据本发明的生物活性材料表现出优异的体内口服吸收率并且具有优异的药物动力学效果。

Description

具有所偶联的生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合的生物 活性材料缀合物
[技术领域]
本发明涉及一种生物活性材料缀合物，其中生物活性材料与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合；具体地，涉及一种表现出优异的体内口服吸收率并且具有优异的药代动力学作用的生物活性材料缀合物，其中生物活性材料与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合；更具体地，涉及一种具有所偶联的生物素部分和脂肪酸部分的生物活性材料缀合物。
[背景技术]
为了使药物有效发挥作用，必须确保高生物利用度。生物利用度是指药物施用后药物在靶位点处的利用程度，并且该程度因施用方法、靶标环境等而异。取决于施用方式，药物在从施用部位递送至靶标的过程中可能丢失或降解。
通常，包括蛋白质和多肽等在内的治疗剂的药物递送分为肠胃外施用和口服施用。肠胃外施用方法包括静脉内注射、肌内注射、皮下注射、舌下施用等，其中口服施用方法意指口服摄入药物。出于对生物利用度、靶标环境和递送过程等的考虑，大多数治疗剂，诸如蛋白质和多肽，都是通过肠胃外方法施用的，并且已知肠胃外施用方法表现出直接且快速的效果。然而，肠胃外施用可能会给患者带来疼痛或不适，并且根据途径可能会出现诸如由注射引起的感染和空气栓塞的副作用。另一方面，口服施用是方便的，因为[药物]是直接通过口施用的，并且存在可以表现出持续效果的优点。因此，许多制药公司尝试通过口服施用治疗剂，但存在的问题在于通过口服施用施用的药物通过消化道，因此需要耐酸性环境和酶促降解等。特别地，已知蛋白质和肽在口服施用时具有约0.1％的低生物利用度。
为了解决口服施用的问题，已经尝试使用表面活性剂和吸收促进剂等一起制备单独的[口服]制剂，或者通过将药物颗粒微粉化和调整施用次数来增加药物的递送。大型制药公司正在开发此类口服胰岛素和口服GLP-1类似物，并且此外，针对干扰素α等的口服施用的各种研究和开发活动正在进行中。然而，肽类和蛋白质药物是难以口服施用的材料，人们为解决这一问题进行了各种尝试，但至今仍未得到明确解决。特别地，肽和蛋白质药物的问题在于当口服施用时，口服吸收率不高，尽管正在进行各种尝试来解决这个问题，但到目前为止还没有明确的解决方案。
[具体实施方式]
[待解决的问题]
本发明的目的是提供一种生物活性材料缀合物，其中生物活性材料与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合；并且更具体地，提供一种具有所偶联的生物素部分和脂肪酸部分的生物活性材料缀合物，其表现出优异的体内口服吸收率并且具有优异的药代动力学作用。
[解决问题的方法]
本发明的一个方面提供了一种与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合的生物活性材料缀合物，以及制备所述生物活性材料缀合物的方法。
本发明的另一个方面提供了一种药物制剂，其包含与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合的生物活性材料缀合物。
本发明的又一个方面提供了一种用于口服施用的制剂，该制剂包含与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合的生物活性材料缀合物。
本发明的一个具体方面提供了一种具有所偶联的生物素部分和脂肪酸部分的生物活性材料缀合物，以及制备所述生物活性材料缀合物的方法。
本发明的又一方面提供了一种用于预防或治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝病、肠易激综合征、神经退行性疾病、骨病、骨质疏松症、人类生长激素缺乏症、癌症或非酒精性脂肪肝病的药物制剂，该制剂包含具有所偶联的生物素部分和脂肪酸部分的生物活性材料缀合物。
[发明效果]
根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合的生物活性材料缀合物具有所偶联的水溶性生物素，从而产生优异的效果。具体地，该效果包括提高口服吸收，改善药代动力学作用，防止生理活性材料被酶降解，促进生理活性材料的肠膜渗透，或通过钠依赖性多维生素转运蛋白的主动转运和吸收。
进一步地，根据本发明一个实施方案的与生物素和脂肪酸部分缀合的生物活性材料缀合物在以上效果中的每个效果方面均表现出与仅与生物素部分或与脂肪酸部分缀合的缀合物相比进一步改进的效果。
[附图说明]
图1是根据本发明一个实施方案的缀合物14至17的纯化色谱图。
图2是根据本发明一个实施方案的缀合物18至19的纯化色谱图。
图3是根据本发明一个实施方案的缀合物20和24的最终产物的色谱图。
图4是示出在施用根据本发明的一个实施方案的缀合物20和24的葡萄糖后血液葡萄糖水平的变化的图。
图5是根据本发明的一个实施方案的缀合物51至52的最终产物的色谱图。
图6是根据本发明一个实施方案的缀合物53至54的纯化色谱图。
图7是示出在施用根据本发明的一个实施方案的缀合物53和54的葡萄糖后血液葡萄糖水平的变化的图。
图8是根据本发明一个实施方案的缀合物55至59的纯化色谱图。
图9是根据本发明的一个实施方案的缀合物56的最终产物的色谱图。
图10是例示根据本发明的一个实施方案的缀合物58至59皮下注射2周后的体重变化的图。
图11是根据本发明的一个实施方案的缀合物60至64的纯化色谱图。
图12是例示根据本发明的一个实施方案的缀合物33、36、39、42、61、62、63和64口服施用后的摄食水平的图。
图13是根据本发明的一个实施方案的缀合物66的纯化色谱图。
图14是例示根据本发明的一个实施方案的缀合物65和66口服施用后的血液葡萄糖调节能力的图。
图15是根据本发明的一个实施方案的缀合物69的纯化色谱图。
图16是说明根据本发明的一个实施方案的缀合物68和69的细胞内积累的图。
[实施本发明的最佳方式]
本发明的一个方面提供了一种与生物素部分和脂肪酸部分缀合的生物活性材料缀合物，以及制备所述生物活性材料缀合物的方法。
[实施本发明的方式]
以下将对本发明的实施方案及工作实例进行详细描述，以使本发明所属领域的技术人员能够容易地实施本发明。
然而，本发明可以以许多不同的形式来体现，并且不限于本文描述的实施方案和工作实例。在本发明的整个专利说明书中，当一个部分“包含”某一组分时，除非另有说明，否则意味着还可以包含其他组分，而不是排除其他组分。
术语“大约”、“基本上”等在贯穿本发明的专利说明书使用的程度上被用于指代等于或接近所陈述的制造和材料公差所固有的数值的数值，并且被用于帮助理解本发明或防止不合情理的侵权者不公平地使用本公开。如贯穿本发明的专利说明书使用的术语“～(做)的步骤”或“的步骤”并不意指“用于～的步骤”。
贯穿本发明的专利说明书，马库什型表述(Markush type expression)中所包含的术语“其组合”是指选自包含马库什型表述中所陈述的组成元素的组的至少一种的混合物或组合，并且意味着选自包含该组成元素的组的至少一种被包含在内。贯穿本发明的专利说明书，陈述“和/或B”意指“和B，或者A或B。”
本发明的一个方面提供了一种与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合缀合的生物活性材料缀合物，以及制备所述生物活性材料缀合物的方法。本发明的一个具体方面提供了一种与生物素部分和脂肪酸部分缀合的生物活性材料缀合物，以及制备所述生物活性材料缀合物的方法。
通常，肽和蛋白质药物对应于生物制药分类系统(BCS)的第3类，具有高度水溶性并且对胃肠道的吸收位点有限制。肽和蛋白质药物具有高的亲水性和大的分子量，可被低pH的胃酸降解，并且由于受到诸如胰蛋白酶的酶的攻击而具有低的肠道吸收率。通常，肽和蛋白质药物的口服生物利用度(BA)约为0.1％，因此很难将它们用作药物制剂。为了解决这个问题，采用了使用肠溶胶囊通过胃的技术，但这种方法的局限性在于不能从根本上提高肽和蛋白质的吸收率。
相比之下，根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料缀合物能够通过增加肠膜渗透来促进肠中的吸收。
进一步地，根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料缀合物能够表现出突出的药代动力学作用。
进一步地，根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料缀合物能够防止诸如肽的生物活性材料被酶降解，并且能够最终促进生物活性材料对肠膜的渗透以及它在肠中的吸收。
进一步地，根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料缀合物通过与生物素(一种类型的水溶性维生素)键合而可以经由钠依赖性复合维生素转运体通过主动转运而被吸收。
进一步地，根据本发明的一个实施方案的生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合可以与生物活性材料的活性位点或非活性位点键合，并且因此不抑制生物活性材料的活性。
在本发明中，“未经取代的或经取代的”意指未经取代的或经取代的。“经(被)取代”意指具有一个或多个取代基，并且取代基是指与诸如亚烷基或亚杂烷基的主基团的任何原子共价键合或稠合的化学部分。
在本发明中，“卤基”意指氟、氯、溴、碘等。
在本发明中，“烷基”是指通过从脂肪族或脂环族的饱和或不饱和烃化合物的碳原子上除去一个氢原子得到的单价部分，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基等。
在本发明中，“杂烷基”为含有一个或多个杂原子的烷基，并且杂原子为位于烷基的任一碳原子上以替代C、CH、CH2或CH3的杂原子。
在本发明中，“亚烷基”意指通过从脂肪族或脂环族的饱和或不饱和烃化合物的碳原子上除去氢原子而获得的二价部分。
在本发明中，“亚烯基”意指通过从脂肪族或脂环族的饱和或不饱和烃化合物的碳原子上除去氢原子而获得的单价部分。
在本发明中，“亚杂烷基”意指含有一个或多个杂原子的亚烷基。
在本发明中，“芳基”意指通过从具有环原子的芳香族化合物的芳香环原子上除去氢原子而得到的单价部分。例如，“C5-10芳基”意指通过从具有5至10个环碳原子的芳族化合物的芳族环原子去除氢原子而获得的单价部分。芳基的实例包括衍生自苯、苊、芴、非那烯、醋菲和醋蒽的基团。
在本发明中，“杂芳基”是包含一个或多个杂原子的芳基，例如，吡啶、嘧啶、苯并噻吩、呋喃基、二氧戊环基、吡咯基、噁唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、吲嗪、吲哚啉、异吲哚啉、嘌呤、苯并二噁烷、喹啉、异喹啉、喹嗪、苯并噁嗪、苯并二嗪(benzodiazine)、吡啶并吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、萘啶、蝶啶、啶(perimidine)、吡啶并吲哚、二苯并对二噁英(oxanthrene)、吩噁噻(phenoxatiin)、吩嗪和吩噁嗪等。
在本发明中，“亚芳基”意指通过从具有环原子的芳香族化合物的芳香环原子上除去氢原子而得到的二价部分。
在本发明中，“亚杂芳基”意指含有一个或多个杂原子的亚芳基。
在本发明中，“烯基”是具有一个或多个碳-碳双键的烷基，例如乙烯基(-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CHCH3)、异丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等等。
在本发明中，“炔基”是具有一个或多个碳-碳三键的烷基，其实例包括乙炔基和2-丙炔基。
在本发明中，当将通式的一部分定义为特定化合物时，它包括该化合物与其他组分组合的形式。
根据本发明的一个实施方案，生物素部分可以由下面的通式A表示。
[通式A]
其中，在通式A中，
X是能够与生物活性材料结合的官能团；
Y是间隔基；
Z是结合单元；
B可由下面的化学式A-1表示；
[化学式A-1]
Z与化学式A-1的连接；
T是末端基团；
m为1至10的整数；
n为0或1至10的整数，其中当n＝0时，Y直接与B或T键合；以及，
p是0或1的整数。
根据本发明的一个实施方案，在通式A中，X是能够与生物活性材料结合的官能团。尽管不限于此，但该官能团为能够与硫醇基、羧基和/或胺基反应的官能团，例如马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、醛基、羧基、羧基酯、琥珀酰亚胺基酯、四氟苯基、-O-四氟苯基(TFP，2，3，5，6-四氟苯基)、四氟苯基酯、五氟苯基(PFP)、五氟苯基酯、-O-苯并三唑、苯并三唑、磺基四氟苯基(STP)、磺基二氟苯基(SDP)、硝基苯酚和硝基苯基碳酸酯(NPC)。
在本发明的一个实施方案中，官能团X在与生物活性材料结合时可以保留其结构或者可以被消除或修饰。
Y是间隔基并且可以具有在身体内具有可裂解性的结构。不限于此，例如，Y可以是直接键，或者可以包括经取代的或未经取代的亚烷基、-O-、-C(O)NR-、-C(O)O-或-C(O)-、-NR-、-NOR-等。更具体地，Y可以是直接键，或者Y的结构可以包含包括以下的组中的至少一种：经取代的或未经取代的C1-50直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50亚芳基、经取代的或未经取代的C1-50亚杂芳基、-O-、-C(O)、-C(O)NR-、-C(O)O-、-S-、-NR-或-NOR-、其中R为氢、或未经取代的C1-50烷基、经取代的或未经取代的C1-50芳基或者乙二醇重复单元(-(CH2CH2O)n-，其中n是至少1但不超过20的整数)。
Z是能够与B键合的结合单元，并且可以包括例如但不限于氨基酸、多肽、亚烷基、胺或聚酰胺基胺结构。
氨基酸的非限制性实例可包括赖氨酸、5-羟基赖氨酸、4-oxalicine、4-硫杂赖氨酸、4-硒代赖氨酸、4-硫杂高赖氨酸、5，5-二甲基赖氨酸、5，5-二氟赖氨酸、反式-4-二氢赖氨酸(反式-4-脱氢赖氨酸)、2，6-二氨基-4-已炔酸、顺式-4-二氢赖氨酸(顺式-4-脱氢赖氨酸)、6-N-甲基赖氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸、3-甲基鸟氨酸、α-甲基鸟氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。
在本发明中，当n为0时，B或T可以直接与X或Y(间隔基)键合。
在本发明中，T为末端基团，并且可以是氢或NH2，但不限于此。
在本发明中，当p为0时，B可以是末端。
在本发明中，X-Y可以一起形成生物活性材料结合位点。
根据本发明的实施方案，在通式A中，m可以为1至10的整数，具体可以为1至8、1至5，或1至4的整数。
在本发明的一个方面，X可选自由以下组成的组：马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸琥珀酰亚胺酯、戊二酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基甲酯、琥珀酰亚胺基戊酯、碳酸琥珀酰亚胺酯、碳酸对硝基苯酯、醛、胺、硫醇、羟胺、碘乙酰胺、氨基氧基(aminooxyl)、酰肼、羟基、丙酸酯、吡啶基、烷基卤、乙烯基矾、羧基、酰肼、卤乙酰胺、C2-5炔基、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、异氰酸酯、硫酯、亚氨酯以及其衍生物。
在本发明的具体方面，X是马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、碳酸琥珀酰亚胺酯、碳酸对硝基苯酯、硫醇、氨基氧基、醛或胺。
在本发明的具体方面，X是马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、醛或胺。
在本发明的一个方面，Y不存在，或者是经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚烷基、经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚杂烷基、经取代的或未经取代的C6-50亚芳基或者经取代的或未经取代的C6-50亚杂芳基，并且如果是经取代的，则包括选自包括以下的组中的至少一种：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH和-NH2。
在本发明的一个方面，Y包括-C(O)-。在本发明的一个方面，Y包括C(O)NH-。
在本发明的一个方面，Y是经取代的直链或支链C1-50亚杂烷基，并且包含至少一个-C(O)-。
在本发明的一个方面，Y是-(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-，其中q、r、s、t独立选择，q和s为0或1，r为1至20的整数，并且t为0至20的整数。
在本发明的一个方面，Y是-(CH2)rC(O)NHNH-，其中r为1至20的整数。
在本发明的一个方面，Y包括-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为1至20的整数。
在本发明的一个方面，Y包括-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为2至4的整数。
在本发明的一个方面，Y包括氨基酸作为组分。
在本发明的具体方面，Y包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸或赖氨酸作为组分，其中每个氨基酸均可以键合的形式存在。
在本发明的具体方面，Y包括谷氨酸或赖氨酸作为组分。
在本发明的方面，Y包括脂肪酸作为组分。
在本发明的具体方面，Y包括C12-24脂肪酸，并且该脂肪酸以键合的形式存在。
在本发明的一个方面，Y是直接键。
在本发明的一方面，Z是以下中的任一种，其中每一种均可以独立地选择。
a)与X一起或者与X分开形成氨基酸或其衍生物；
b)是经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚杂烷基；
其中，如果是经取代的，则包含选自包括以下的组的至少一种：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH和-NH2。
在本发明的一个方面，Z通过-NH-与B连接。
在本发明的一个方面，Z是亲水性氨基酸或其衍生物。
在本发明的具体方面，Z可选自由以下组成的组：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸以及其衍生物。
在本发明的一个方面，Z包括至少一种甘油、至少一种聚乙二醇或其组合。
在本发明的一个方面，Z包括 代表结合位点；并且至少一个/>与结合位点中的至少一个结合位点结合，其中u是1到20的整数。
在本发明的一个方面，Z包含并且-(CH2)3NH-进一步与/>键合。
在本发明的实施方案中，生物素部分选自由以下组成的组：
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根据本发明的一个实施方案，脂肪酸部分可以由下面的通式B表示：
[通式B]
X′-Y′-W
其中，在上面的式中，
X′是能够与生物活性材料结合的官能团；
Y′是间隔基；以及
W是脂肪酸。
在本专利说明书中，脂肪酸包括具有长饱和或不饱和脂肪族链的羧酸，包括例如但不限于辛酸、月桂酸(一类饱和脂肪酸)、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、蜡酸、肉豆蔻酸(一类不饱和脂肪酸)、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸等。
根据本发明的一个实施方案，在通式B中，X’是一种能够与生物活性材料结合的官能团。在这里，X’与通式A中的X相同。因此，在本发明的一个实施方案中，官能团X’在与生物活性材料结合时可保留其结构或者可被消除或修饰。
根据本发明的一个实施方案，在通式B中，W可对应于脂肪酸。在此处，脂肪酸包括所有类型的脂肪酸，包括简单脂肪酸、经修饰的脂肪酸、经添加的脂肪酸、经删除的脂肪酸等。
在本发明的一方面，Y′与通式Y中的Y相同。因此，在本发明的一个实施例中，间隔基Y′可以是直接键，或者可以包括取代或未取代的亚烷基，-O-、-C(O)、-C(O)NR-、-C(O)O-或-S-、-NR-、-NOR-等。更具体地，Y可以是直接键，或者Y的结构可以包含包括以下的组中的至少一种：经取代的或未经取代的C1-50直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50亚芳基、经取代的或未经取代的C1-50亚杂芳基、-O-、-C(O)、-C(O)NR-、-C(O)O-、-S-、-NR-或-NOR-、其中R为氢、或未经取代的C1-50烷基、经取代的或未经取代的C1-50芳基或者乙二醇重复单元(-(CH2CH2O)n-，其中n是至少1但不超过20的整数)。
在本发明的一个方面，W是经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚烷基、经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚烯基、经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚杂烷基，或者经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚杂烯基，并且如果是经取代的，可以被选自包括以下的组的至少一种取代：＝O、--C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH、-NH2和卤基。
在本发明的一个方面，W是C12-24亚烷基，其中至少一个经取代；或C36-48亚杂烷基，其中至少一个经取代，并且如果是经取代的，则可以包括＝O或-COOH。
在本发明的具体方面，其中至少一个经取代的W为经取代的或未经取代的C12-24饱和脂肪酸，并且如果是经取代的，则包括-COOH。
在本发明的一个方面，脂肪酸部分可具有下面的通式B1的化学式：
[通式B1]
X′1-Y′-C(O)-F1
其中，在上面的式中，
X′1为马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、胺、四氟苯酯或硝基苯酚；
Y′是间隔基；
F1是C6-28的经取代的或未经取代的直链或支链亚烷基，或者经取代的或未经取代的直链或支链亚杂烷基。
根据本发明的一个方面，在通式B-1中，X′1可与通式A和B中的X相同。因此，在本发明的一个方面，官能团X′1在与生物活性材料结合时可保留其结构或者可被消除或修饰。
进一步地，在通式B1中，Y′可以与通式A和B中的Y相同。
在本发明的一个方面，Y′是经取代的或未经取代的C6-50直链或支链亚杂烷基，并且如果是经取代的，则包括选自包括以下的组的至少一种：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH和-NH2。
在本发明的一个方面，Y′可以包括-(CH2CH2O)-作为重复单元。
在本发明的一个实施方案中，Y′可包括-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为1至20的整数。
在本发明的具体方面，Y′包括-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为2至4的整数。
在本发明的一个方面，Y′包括氨基酸或其衍生物作为组分。
在本发明的具体方面，Y′包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸或赖氨酸作为组分，其中每个氨基酸均可以键合的形式存在。
在本发明的具体方面，Y′包括谷氨酸或赖氨酸作为组分。
在本发明的一个方面，F1可以是经取代的或未经取代的C10-28直链或支链亚烷基。
在本发明的具体方面，其中至少一个经取代的W为经取代的或未经取代的C12-24饱和脂肪酸，并且如果是经取代的，则包括-COOH。
在本发明的具体方面，F1为-(CH2)v-COOH，其中v为10至20的整数。
在本发明的具体方面，F1是-C(O)-(CH2)v-COOH，其中v是10至20的整数。
在本发明的具体方面，脂肪酸部分可以选自由以下组成的组：
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根据本发明的一个实施方案，生物素部分和生物活性材料之间的键可以通过各种键形成。它可以通过使生物素部分的官能团与生理活性材料的官能团键合而形成，并且可以形成为例如但不限于硫醇-醚键或酰胺键。
在一个具体实例中，生物素部分和生物活性材料之间的键可以通过下面的反应式1的方法形成。在反应式1中，表示包含硫醇基的生物活性材料，并且表示根据本发明实施方案的包含马来酰亚胺的生物素部分与生物活性材料中存在的半胱氨酸残基的硫醇基(-SH)之间的反应。/>
在一个具体实例中，生物素部分和生物活性材料之间的键可以通过下面的反应式2的方法形成。在反应式2中，表示包含胺基团的生物活性材料，并且表示根据本发明实施方案的包含N-羟基琥珀酰亚胺的生物素部分与生物活性材料中存在的胺基(-NH2)之间的反应。
根据本发明的一种实施方案，对生物活性材料没有特别限制。
在本发明中，生物活性材料是指可以为特定目的而施用于身体并且可以在身体中引起生理或生化反应的材料。
根据本发明的实施方案，生物活性材料可以是用于药物制剂中的材料。例如，它可以是用于预防或治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝病、肠易激综合征、神经退行性疾病、骨病、骨质疏松症、人类生长激素缺乏症、抗癌或非酒精性脂肪肝病的材料。这些是非限制性实例，因为适应症可能因生物活性材料的类型而变化。
根据本发明的一个实施方案，生物活性材料可以是但不限于多肽或非肽聚合物。非限制性实例包括多肽、蛋白质、多糖或其衍生物。生物活性材料的非限制性实例包括胰高血糖素(Glugacon)、GLP-1(胰高血糖素样肽-1)、GLP-2(胰高血糖素样肽-2)、GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、胰岛素、甲状旁腺激素、干扰素、促红细胞生成素、降钙素、胰淀素、血清素、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、尿酸酶(uricase)、组织纤溶酶原激活剂、甲状腺球蛋白(thymoglobin)、疫苗、肝素或肝素类似物、抗凝血酶III、非格司亭、醋酸普兰林肽、艾塞那肽、依替巴肽、抗蛇毒血清、IgG、IgM、HGH、甲状腺素、凝血因子VII和VIII、用作治疗剂的糖脂，以及它们的衍生物。
根据本发明的一个实施方案，[生物活性材料]可以与生物素部分键合。
通过使生物素部分与生物活性材料键合，可以不抑制生物活性材料的生物活性，并且从而可以具有与生物活性材料相同的生物活性或提高的生物活性。
尽管不限于此，但生物活性材料可以包含暴露的-SH基团，使得生物素部分可以与-SH基团键合。此外，生物活性材料可以包含暴露的-NH3 +基团或-NH2基团，使得生物素部分可以与暴露的-NH3 +基团或-NH2基团键合。
根据本发明的一个实施方案，可以调整生物素部分与生物活性材料的结合位点以便在避开表现出活性的位点的同时键合。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，脂肪酸部分可以直接结合到生物活性材料上。进一步地，脂肪酸部分的一部分可以被生物素部分共享。例如，在以下实施方案的一个实施方案中，生物素部分B35和B36共享作为脂肪酸部分的一部分的脂肪酸部分。但这只是一个例子，本发明不限于此。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，脂肪酸部分可以在生物活性材料中的生物素部分所键合至的位点以外的位点处与生物活性材料键合。
进一步地，脂肪酸部分与生物素部分一样，可以键合到生物活性材料的活性位点或非活性位点，并且可以表现出与如上所陈述的性质相同的性质。
根据本发明的一个实施方案，生物素部分和脂肪酸部分都可以与生物活性材料键合，并且键合有生物素部分和脂肪酸部分二者的生物活性材料缀合物在与仅键合有生物素部分或仅键合有脂肪酸部分的缀合物相比时可表现出优异的口服吸收率、药代动力学、酶降解抑制、肠膜渗透等。
根据本发明的一个实施方案，生物活性材料可以是胰高血糖素、降钙素、GLP-1、GLP-2、GIP、毒蜥外泌肽-4、甲状旁腺激素、胰岛素、胰淀素、人生长激素或其衍生物。
根据本发明的实施方案，生物活性材料可以是具有SEQ ID NO 1至7的下列氨基酸序列中的任一者的多肽或其衍生物。具体地，SEQ ID NO：1至7的生物活性材料分别为胰高血糖素衍生物(SEQ ID NO：1)、GLP-1(SEQ ID NO：2)、GLP-2(SEQ ID NO：3)、GIP(SEQ IDNO：4)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：5)、甲状旁腺激素(SEQ ID NO：6)和胰高血糖素(SEQ IDNO：7)。
此外，生物活性材料可以是具有SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO：17和16的氨基酸序列的蛋白质。
此外，生物活性材料可以是具有SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的蛋白质或者具有SEQ ID NO：17和16的氨基酸序列的蛋白质，其中该蛋白质通过SEQ ID NO：15或17的第6个与第11个半胱氨酸之间的二硫键、SEQ ID NO：15或17的第7个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第7个胱氨酸之间的二硫键以及SEQ ID NO：15或17的第20个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第19个半胱氨酸之间的二硫键联接。具体地，具有SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO：17和16的氨基酸序列的生物活性材料代表胰岛素(SEQ ID NO：15(胰岛素A链衍生物)和16(胰岛素B链)/SEQ ID NO 17(胰岛素A链)和16(胰岛素B链))
根据本发明的一个实施方案，半胱氨酸可以被取代或插入到多肽中以调整与生物素部分结合的位点。
在非限制性实例中，选自由SEQ ID NO：1至7所表示的氨基酸序列组成的组的多肽的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被半胱氨酸氨基酸取代或插入。在此处，生物素部分与半胱氨酸氨基酸的-SH基团键合。
进一步地，选自由以上氨基酸序列组成的组的多肽的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被赖氨酸氨基酸取代或插入。在此处，生物素部分与赖氨酸氨基酸的-NH2基团键合。
进一步地，插入了半胱氨酸氨基酸的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：8至14的氨基酸序列中的任何一个氨基酸序列的多肽。具体地，下文SEQ ID NO：8至14的生物活性材料表示SEQ ID NO：1至7的生物活性材料，其中半胱氨酸氨基酸已被取代或插入(例如，在SEQID NO：8的生物活性材料中，SEQ ID NO：1的生物活性材料的氨基酸中的至少任何一个氨基酸已被半胱氨酸取代)
根据本发明的一个实施方案，多肽的一部分可以被取代以调整与生物素部分的结合位点。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，氨基酸赖氨酸可以被取代或插入到多肽中，以调整与生物素部分的结合位点。
在一个非限制性实例中，由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被氨基酸赖氨酸取代或插入。
在另一个非限制性实例中，由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被2-氨基异丁酸(Aib)取代、被赖氨酸氨基酸插入。在此处，生物素部分与赖氨酸氨基酸的-NH2基团键合。
进一步地，其中一部分已被取代，或者其中赖氨酸氨基酸已被取代或插入的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：18至21中任一者的氨基酸序列的多肽。具体地，下文SEQ IDNO：18至21的生物活性材料表示毒蜥外泌肽-4衍生物，其中SEQ ID NO：5的生物活性材料的氨基酸的一部分已被取代或插入。
根据本发明的一个实施方案，生物活性材料可以是具有以下SEQ ID NO：22的氨基酸序列的多肽，或其衍生物。以下SEQ ID NO 22的生物活性材料代表胰淀素。
根据本发明的一个实施方案，由SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列的一部分可以被取代或插入以调整与生物素部分结合的位点。
在非限制性实例中，具有由SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被氨基酸脯氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代。在另一个非限制性实例中，具有由SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被氨基酸赖氨酸取代。
进一步地，其中由SEQ ID NO：22表示的氨基酸的一部分已被取代或插入的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：23至31中任一者的氨基酸序列的多肽。具体地，以下SEQ ID NO：23至31的生物活性材料表示胰淀素衍生物，其中SEQ ID NO：22的生物活性材料的氨基酸的一部分已被取代或插入。
根据本发明的一个实施方案，生物活性材料可以是具有以下SEQ ID NO：32的氨基酸序列的多肽，或其衍生物。以下SEQ ID NO 32的生物活性材料表示毒蜥外泌肽-4衍生物。
根据本发明的一个实施方案，SEQ ID NO：32的氨基酸序列的一部分可以被删除、取代或插入，以调整与生物素部分的结合位点。
在非限制性实例中，由SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被氨基酸甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甘氨酸取代。在另一个非限制性实例中，由SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被删除。
进一步地，其中由SEQ ID NO：32表示的氨基酸的一部分已被删除、取代或插入的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：33至37中任一者的氨基酸序列的多肽。具体地，其中SEQID NO：32的生物活性材料的氨基酸的一部分已被删除、取代或插入的以下SEQ ID NO：33至37的生物活性材料表示毒蜥外泌肽-4衍生物。
根据本发明的一个实施方案，由SEQ ID NO 12表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被2-氨基异丁酸(Aib)取代。
根据本发明的一个实施方案，其中由SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸已用2-氨基异丁酸(Aib)取代并且任何至少一个氨基酸已用Des-氨基酸-His(h)取代的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：38至39的氨基酸序列的多肽。具体地，其中SEQ ID NO：12的生物活性材料的氨基酸已被取代的以下SEQ ID NO：38或39的生物活性材料表示毒蜥外泌肽-4衍生物。更具体地，具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的生物活性材料是其中氨基酸中的至少一个氨基酸已被Des-氨基-His(h)取代的生物活性材料。
根据本发明的一个实施方案，由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的氨基酸中的任何至少一个氨基酸可以被赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)取代。
其中由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列中的氨基酸中的任何至少一个氨基酸已被赖氨酸或精氨酸取代的多肽可以是具有以下SEQ ID NO：40至41的氨基酸序列的多肽。具体地，其中SEQ ID NO：8的生物活性材料的氨基酸已被取代的以下SEQ ID NO：40或41的生物活性材料表示胰高血糖素衍生物。
根据本发明的一个实施方案，生物活性材料可以是具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的多肽，或其衍生物。具体地，SEQ ID NO 42的生物活性材料表示人生长激素衍生物。
根据本发明的一个实施方案，键合有生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合的生物活性材料与选自包括以下的组的任何至少一种共价键合或形成包涵体(微球)：肽和非肽聚合物、脂肪酸、胆固醇、抗体、抗体片段、白蛋白及其片段、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、FcRn结合材料、糖类、弹性蛋白、肝素，以及它们的衍生物。
非肽聚合物可以选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇(PVA)、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、PLA(聚乳酸，聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸，以及其组合。
本发明的另一个方面提供了一种制备与生物素部分缀合的生物活性材料的方法，该方法包括：获得生物素部分的步骤；使生物素部分与生物活性材料反应的步骤；以及，在反应完成后分离与生物素部分缀合的生物活性材料的步骤。
本发明的又一个方面提供了一种制备与生物素部分和脂肪酸部分缀合的生物活性材料的方法，该方法包括：获得生物素部分的步骤；使生物素部分与生物活性材料反应的步骤；在生物素部分与生物活性材料反应完成后，使[产物]与脂肪酸部分反应的步骤；以及，在反应完成后分离与生物素部分和脂肪酸部分缀合的生物活性材料的步骤。
根据本发明的一个实施方案，在获得生物素部分的步骤中，生物素部分可以由下面的通式A表示。
根据本发明的一个实施方案，脂肪酸部分可以由上面的通式B表示。
根据本发明的一个实施方案，在获得混合物的步骤中，生物素部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为0.5或更大。具体地，生物素部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为0.5至30。考虑到分子结构、生物素部分的分子量或溶解度、反应混合物的pH、反应温度、反应时间等，可以适当选择上面的反应摩尔比。
根据本发明的一个实施方案，在获得混合物的步骤中，脂肪酸部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为0.5或更大。具体地，脂肪酸部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为0.5至20。考虑到分子结构、脂肪酸部分的分子量或溶解度、反应混合物的pH、反应温度、反应时间等，可以适当选择上面的反应摩尔比。
根据生物活性材料的形式，在获得混合物的步骤中生物素部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为20或更大。具体地，生物素部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为20至25。
进一步地，根据生物活性材料的形式，在获得混合物的步骤中脂肪酸部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为6或更大。具体地，脂肪酸部分与生物活性材料的反应摩尔比可以为6至12。
根据本发明的一个实施方案，可以使用缓冲溶液或有机溶剂进行反应。对缓冲溶液或有机溶剂没有特别限制，并且可以根据生物素部分和脂肪酸部分的结构适当地选择本领域通常使用的缓冲溶液。
在本发明的一个实施例中，反应步骤的温度和持续时间可以根据生物素部分、脂肪酸部分和生物活性材料的特性适当调整。然而本发明不限于此，反应可以例如在4℃下进行3小时或更长时间，或者可以在室温下进行更短的时间。这可能与所使用的生物素部分或脂肪酸部分或它们的组合的反应性程度有关。一旦经过适当的反应时间，可以通过降低反应混合物的pH来停止反应。
根据本发明的一个实施方案，反应步骤后可进行去除未反应材料的步骤。去除未反应材料的步骤可以使用本领域常用的方法进行。例如，但是本发明不限于以下，可以使用适当的缓冲液例如诸如PBS(磷酸盐缓冲盐水)的溶液利用透析等进行去除。
根据本发明的一个实施方案，在分离步骤之后可以包括纯化步骤。分离和纯化步骤可以使用尺寸排阻色谱法、反相高效液相色谱法或离子交换色谱法进行，但不限于此。
本发明的又一方面提供了一种药物制剂，其包含与上文中描述的生物素部分或脂肪酸部分键合或与它们的组合键合的生物活性材料缀合物。
本发明的另一个具体方面提供了一种药物制剂，其包含与上文中描述的生物素部分和脂肪酸部分键合的生物活性材料缀合物。
这里，药物制剂的使用可以根据生物活性材料的类型来确定。进一步地，药物制剂可以是用于口服施用的制剂。
根据本发明的一个实施方案，可以提供用于预防或治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝病、肠易激综合征、神经退行性疾病、骨病、骨质疏松症、人类生长激素缺乏症、癌症或非酒精性脂肪肝病的药物制剂。
根据本发明的一个实施方案，当生物活性材料是GLP-1、GLP-2、GIP、胰岛素、胰淀素或其衍生物时，缀合物可用于预防或治疗糖尿病。具体地，包含SEQ ID NO 12的生物活性材料的缀合物可用于预防或治疗糖尿病。然而，这个实例是说明性的并且本发明不限于此。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，当生物活性材料是甲状旁腺激素或其衍生物时，缀合物可用于预防或治疗骨病。具体地，包含SEQ ID NO 6的生物活性材料的缀合物可用于预防或治疗骨疾病。然而，这个实例是说明性的并且本发明不限于此。
根据本发明的一个实施方案，当生物活性材料为hGH或其衍生物时，缀合物可用于预防或治疗人类生长激素缺乏症。具体地，包含SEQ ID NO 42的生物活性材料的缀合物可用于预防或治疗人类生长激素缺乏症。然而，这个实例是说明性的并且本发明不限于此。
本发明的另一个方面提供了一种用于口服施用的制剂，该制剂包含与上文中描述的生物素部分或脂肪酸部分键合或与它们的组合键合的生物活性材料缀合物。
本发明的另一个具体方面提供了一种用于口服施用的制剂，该制剂包含与上文中描述的生物素部分和脂肪酸部分键合的生物活性材料缀合物。
根据本发明的一个实施方案的与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料缀合物通过与生物素(一种类型的水溶性维生素)键合而可以经由钠依赖性复合维生素转运体通过主动转运而被吸收，从而改善通过肠膜在肠中的吸收。更具体地，通过与生物素部分和脂肪酸部分两者的键合展现出优异的效果。
根据本发明的一个实施方案，包含与生物素部分键合的生物活性材料的药物制剂可以通过配制为用于口服或非口服施用的多种形式来施用，但本发明不限于此。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，包含与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合键合的生物活性材料的药物制剂可以通过配制为用于口服或非口服施用的多种形式来施用，但本发明不限于此。
当配制时，制剂可通过使用常用的稀释剂或赋形剂如填料、助溶剂、增量剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂和吸收促进剂来配制。
用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等，并且此类固体制剂可以通过将至少一种赋形剂与化合物例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合来制备。
进一步地，除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括混悬剂、内溶液剂(internal solution)、乳剂、糖浆剂等，并且除了包含常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外，还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、香料、防腐剂等。用于非口服施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制品和栓剂。非水性溶剂和悬浮液可包括丙二醇(Propylene glycol)、聚乙二醇(PEG)、植物油如橄榄油，以及可注射的酯类如油酸乙酯。
另外，可以添加钙或维生素D3以增强作为增殖性疾病或自身免疫性疾病的治疗剂的功效。
根据本发明实施方案的药物制剂的剂量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病的严重程度而变化。然而，一般而言，它可以在每日有效剂量范围内每天施用一次或分成数次剂量。另外，甚至通过在1至2周内数次施用，也可以施用有效剂量。
在下文中，通过实施方案和实验实施例对本发明进行详细描述。前提是，以下实施方案和实验实施例旨在举例说明本发明，并且本发明不限于此。
[工作实施例]
<生物素部分的制备>
缩写列表
HBTU：3-[双(二甲基氨基)甲基鎓]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐
DIEA：乙基二异丙胺
HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓-3氧化物六氟磷酸盐
DIC：二异丙基碳化二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
MBHA：4-甲基二苯甲胺盐酸盐
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
DMF：二甲基甲酰胺
SPPS：固相肽合成
HPLC：高效液相色谱
LCMS：液相色谱质谱
典型的SPPS方法
在一些情况下，可以通过使用具有在酸性条件下可以裂解的基团(例如，2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基，或2，4，6-三甲氧基苄基)的从二肽酰胺键进行保护的二肽来改进肽的固相合成。所使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物是推荐的标准品，例如：由Anaspec、Bachem、Iris Biotech或Novabiochem供应的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH或Fmoc-Val-OH等。N-末端氨基酸在α氨基处被Boc保护。例如：使用由Anaspec、Bachem、Iris Biotech或Novabiochem供应的Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸、Fmoc-氨甲环酸、Fmoc-异哌啶酸、Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。
使用SPPS进行的肽合成
可以使用HBTU/DIEA、HATU/DIEA或DIC/HOBt作为偶联试剂，在连接酰胺MBHA树脂中使用一般Fmoc化学反应合成肽。合成中使用的反应物和偶联试剂的组合包括以下。
[表1]
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使用SPPS的肽合成过程的示例性方案包括以下：1)将DMF添加到含有连接酰胺MBHA树脂的容器中并且膨胀2小时(sub：0.68mmol/g，1.0mmol，1.47g或5mmol，7.35g，sub：0.68mmol/g)。2)添加20％哌啶/DMF后，混合30分钟。3)除去1)-2)的溶剂后，使用DMF洗涤(30秒×5次)。4)添加反应物(反应物#1～#5之一)并且混合30秒，然后添加与反应物对应的偶联试剂(偶联试剂#1～#5之一)，并且进行氮气鼓泡，持续1小时。5)添加20％哌啶/DMF后，混合30分钟。在以上1)至5)的示例性方案中，可以超过一次地使用反应物和偶联反应物#1至#5的组合进行迭代合成。为了去除Fmoc，使用20％哌啶/DMF溶液处理30分钟。
用于肽纯化和分析的典型程序
将未纯化的肽溶解在水、TFA和ACN的适当混合物中，使用制备型HPLC进行纯化，干燥并定量。使用制备型HPLC进行纯化的条件包括下表2中所示的条件。
[表2]
使用制备型HPLC纯化后，使用分析型HPLC或LCMS对最终产物进行表征。作为分析的结果，获得下表3的生物素部分。
[表3]
B1：
B2：
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B3：
B4：
B5：
进一步地，使用SPPS通过方案1)至5)进行肽合成，进行纯化和分析，获得了以下生物素部分B6至B7。在下表4中，X、Y、Z和B包括在本专利说明书的通式A的定义中。
[表4]
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B35：
B36：
B37：
/>
B38：
<脂肪酸部分>
可以使用本领域已知的方法制备脂肪酸部分，或者可以使用商业上获得的材料。
作为脂肪酸部分，使用下表5的脂肪酸部分。
[表5]
脂肪酸部分 命名
F1 C16-NHS
F2 C16-MAL
F3 C18-NHS
F4 C18-MAL
F5 C16-Glu-NHS
F6 C16-Glu-MAL
F7 C18-Glu-NHS
F8 C18-Glu-MAL
F9 C18-Glu-EG2-NHS
F10 C18-Glu-EG2-MAL
F11 C18-Glu-EG2-EG2-NHS
F12 C18-Glu-EG2-EG2-MAL
F13 C20-Glu-EG2-EG2-NHS
F14 C20-Glu-EG2-EG2-MAL
F15 C18-Glu-EG2-EG2-TFP
F16 C18-Glu-EG2-EG2-NPC
F1：
F2：
F3：
F4：
F5：
F6：
F7：
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F8：
F9：
F10：
F11：
F12：
F13：
F14：
F15：
F16：
<多肽>
可以使用本领域已知的方法制备多肽，或者可以使用商业上获得的材料。在本发明中，与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合结合的生物活性材料的序列示于下表6中。
[表6]
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<实施方案：与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合组合的生物活性材料的制备>
[制备实施例]
使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，使表6的多肽与表3至4的生物素部分之间的1∶X摩尔比的混合物各自在室温下反应至少30分钟。然后，制备该多肽-生物素部分混合物与表5的脂肪酸部分之间的1∶Y(1∶0.5～20)摩尔比的混合物，并且使该混合物各自在室温下反应至少90分钟。通过添加与每种混合物的体积相同的体积的1％三氟乙酸溶液终止反应。
[分离、纯化和确认]
使用反相高效液相色谱分离和纯化反应产物。作为柱，使用SUPERSIL ODS-1柱(10x250mm，5um，LB Science，South Korea)。
在用30-50％溶剂B(添加了0.1％TFA的乙腈)和溶剂A(添加了0.1％TFA的蒸馏水)保持4.7ml/min的流速的同时使流动相条件发生直链变化。用UV吸收光谱仪在280nm处监测，收集在10分钟和20分钟之间检测到的峰。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化材料的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在接近室温的恒定温度下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(处于变化的混合比下)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
[确认分子量]
测量反应产物的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法测量分子量。作为基质溶液，使用含有0.1％TFA并用CHCA(α-氰基-4-氢肉桂酸)饱和的50％乙腈溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。由此证实，分离出的材料的分子量与理论分子量一致。
<实施方案：与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合组合的多肽>。
上面陈述的材料用作生物素部分、脂肪酸部分和多肽。本领域已知的方法或以上实施方案的方法用于将多肽结合至生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合。
与生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合结合的多肽如下表7所示。(在此处，分子量表示实测分子量或理论分子量)。
[表7]
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(在上表中，B代表天然生物素。)
缀合物14至17
1)制备实施例
使用以下方法制备下表8的缀合物。
使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将上表6的SEQID NO：12的多肽和上表3和表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶2的混合物，并且在室温下反应至少30分钟。然后，制备摩尔比为1∶1至1∶2的多肽-生物素部分混合物和上表5的脂肪酸部分的混合物，并且将其在室温下反应至少90分钟。通过添加与混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液来停止反应。
[表8]
2)分离、纯化和纯度检查使用反相高效液相色谱法(下文简称HPLC)分离和纯化缀合物14至17的反应产物。
使用SUPERSIL ODS-1柱(10x250mm，5um，LB Science，South Korea)。维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min，使流动相条件如下线性地变化：缀合物14：30％-80％，缀合物15：40％-70％，缀合物16：30％-60％，缀合物17：40％-60％。然后，用紫外分光光度计在280nm处监测，收集在10与17分钟之间检测到的峰(缀合物14：15分钟，缀合物15：16分钟，缀合物16：16分钟，缀合物17：11分钟)。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化物质的纯度。使用Gemini C18柱(4.6x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在接近室温的恒定温度下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为70∶30并且在20分钟后为20∶80)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
缀合物14至17的测得的纯化色谱图在图1中示出。进一步地，用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物14至17的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物14到17获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析结果如上表8所示。
缀合物18到19
1)制备实施例
使用以下方法制备下表9的缀合物。
使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将上表6的SEQID NO：12的多肽和上表3和表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶2的混合物，并且在室温下反应至少30分钟。通过添加与混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液来停止反应。
[表9]
2)分离、纯化和纯度检查
使用反相高效液相色谱法(下文简称HPLC)分离和纯化缀合物18至19的反应产物。
使用SUPERSIL ODS-1柱(10 x 250mm，5um，LB Science，韩国)，并且使流动相条件从30％线性地变化到80％，同时维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min。然后，用紫外分光器在280nm处监测，收集在12到13分钟之间检测到的峰。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化物质的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在接近室温的恒定温度下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为70∶30并且在20分钟后为20∶80)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
缀合物18至19的测得的纯化色谱图在图2中示出。进一步地，用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物18至19的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物18到19获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如上表9所示。
缀合物20和24
1)制备实施例
对于缀合物20和24，上述典型的SPPS方法用于合成下表10的缀合物。
[表10]
2)使用HPLC分析方法确认纯化的缀合物20和24的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在接近室温的恒定温度下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为70∶30并且在20分钟后为50∶50)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
缀合物20和24的测得的纯化色谱图在图3中示出。进一步地，用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物20和24的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物20到24获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如上表10所示。
缀合物51到54
1)制备实施例
-对于缀合物51至54，使用标准Fmoc制备方法合成下表12的缀合物。
标准Fmoc制备方法意指如下进行的方法：
将DMF添加到含有Fmoc Rink amid AM树脂的容器中，并使其溶胀2小时。用DMF洗涤后，加入20％哌啶/DMF并混合30分钟。用DMF洗涤后，混合Fmoc-氨基酸溶液30分钟，然后加入活化缓冲液，并且施加氮气1小时。重复以上过程，直至完成目标肽序列。这里，Fmoc-氨基酸试剂包括下表11的材料。
[表11]
-缀合物53至54使用以下方法制备：使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将上表6的SEQ ID NO：39至40的多肽和上表3和表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶2的混合物，并且在室温下反应至少10分钟。然后，制备摩尔比为1∶3的多肽-生物素部分混合物和上表5的脂肪酸部分的混合物，并且将其在室温下反应至少90分钟。通过添加与该混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液终止反应。
[表12]
2)分离、纯化和纯度检查
使用反相高效液相色谱分离和纯化缀合物51至54的反应产物。
使用Gemini C18柱(10 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)。维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min，使流动相条件从40％线性地变化到60％。然后，用紫外分光光度计在280nm处监测，收集在11和13分钟之间检测到的峰(缀合物53：12分钟，缀合物54：13分钟)。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化材料的纯度。在接近室温的恒定温度下使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为70∶30并且在20分钟后为20∶80)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
来自缀合物51至52的最终产物的测得的纯化色谱图如图5所示，并且缀合物53至54的纯化色谱图如图6所示。进一步地，用UV检测器分析，没有观察到除了与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰之外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物51至54的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物51到54获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如表12所示。
缀合物55至59
-使用用于以上缀合物51至54的标准Fmoc制备方法合成缀合物56。
-使用以下方法制备缀合物55和缀合物57至59。使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将上表6的SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的多肽和上表3和表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶2的混合物，并且在室温下反应至少10分钟。然后，制备摩尔比为1∶1或1∶2的多肽-生物素部分混合物和上表5的脂肪酸部分的混合物，并且将其在室温下反应至少90分钟。通过添加与混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液来停止反应。
[表13]
2)分离、纯化和纯度检查
使用反相高效液相色谱分离和纯化缀合物55至59的反应产物。
使用Gemini C18柱(10 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)。维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min，使流动相条件如下线性地变化：缀合物55和57：40％-60％，缀合物58至59：40％-70％。然后，用紫外分光光度计在280nm处监测，收集在10与15分钟之间检测到的峰(缀合物55：13分钟，缀合物57：10分钟，缀合物58：13分钟，缀合物59：15分钟)。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化材料的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在恒定温度(35℃)下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为60∶40并且在20分钟后为30∶70)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
来自缀合物55和缀合物57至59的最终产物的测得的纯化色谱图如图8所示，并且缀合物56的纯化色谱图如图9所示。进一步地，用UV检测器分析，没有观察到除了与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰之外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物55至59的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物55到59获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如表13所示。
缀合物60到64
1)制备实施例
下表14的缀合物使用以下方法制备：使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将上表6的SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30的多肽和上表3和表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶1的混合物，并且在室温下反应至少30分钟。然后，制备摩尔比为1∶2的多肽-生物素部分混合物和上表5的脂肪酸部分的混合物，并且将其在室温下反应至少120分钟。通过添加与混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液来停止反应。
[表14]
2)分离、纯化和纯度检查使用反相高效液相色谱分离和纯化缀合物60至64的反应产物。
使用Gemini C18柱(10 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)。维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min，使流动相条件如下线性地变化：实施方案18至20：30％-60％，实施方案21至22：25％-50％。然后，用紫外分光仪在280nm处监测，收集在5与18分钟之间检测到的峰(实施方案18：20分钟，实施方案19：15分钟，实施方案20：13分钟，实施方案21：17分钟)。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化材料的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在恒定温度(35℃)下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为75∶25并且在20分钟后为50∶50)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
来自缀合物60至64的最终产物的测得的纯化色谱图如图11所示。
用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物60至64的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物60到64获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如表14所示。
缀合物66
1)制备实施例
下表15的缀合物使用以下方法制备：使用添加有0.3％三甲胺(TEA，Sigma)的DMSO溶液作为反应溶剂，将来自上表6的其中蛋白质通过SEQ ID NO 15的第6个与第11个半胱氨酸之间的二硫键、SEQ ID NO 15的第7个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第7个半胱氨酸之间的二硫键以及SEQ ID NO 15的第20个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第19个半胱氨酸之间的二硫键联接的多肽，以及上表3和上表4的生物素部分混合成摩尔比为1∶1的混合物，并且在室温下反应至少30分钟。然后，制备摩尔比为1∶2的多肽-生物素部分混合物和上表5的脂肪酸部分的混合物，并且将其在室温下反应至少120分钟。通过添加与混合物体积相同的1％三氟乙酸溶液来停止反应。
[表15]
2)分离、纯化和纯度检查
使用反相高效液相色谱分离和纯化缀合物66的反应产物。使用Gemini C18柱(10x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)。维持溶剂A(添加有0.1％TFA的蒸馏水)和溶剂B(添加有0.1％TFA的乙腈)的流速为4.7ml/min，使流动相条件从35％线性地变化到45％。然后，用紫外分光器在280nm处监测，收集在13到14分钟之间检测到的峰。在使有机溶剂和TFA在真空下挥发后，使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器浓缩和纯化所收集的峰。使用HPLC分析方法确认所纯化材料的纯度。使用Gemini C18柱(4.6 x 250mm，5um；Phenomenex，CA，USA)在恒定温度(35℃)下进行分析。使用由三氟乙酸溶液∶乙腈混合物(混合比为70∶30并且在20分钟后为40∶60)组成的流动相以1mL/min的流速使用梯度洗脱法进行分析。在280nm处观察UV吸光度。
缀合物66的测得的纯化色谱图如图13所示。进一步地，用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物66的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物66获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。分析的结果如表15所示。
缀合物69
1)制备实施例
使用以下方法制备下表16的缀合物：
在将来自上表6的SEQ ID NO：42的多肽溶解在pH 7.8磷酸盐缓冲溶液中后，通过溶解在DMSO中制备生物素部分，并且使材料以90∶10的体积比反应。使它们在室温下以1∶22的摩尔比反应至少60分钟。然后，以1∶9的摩尔比制备多肽-生物素部分混合物和来自上表5的脂肪酸部分的混合物，并在室温下反应至少60分钟。通过将反应产物的储存温度降低至4度来减慢反应，然后立即进行纯化。
[表16]
2)分离、纯化和纯度检查
采用反相高效液相色谱法确认反应已经进行，并且已经生成了用于缀合物69的适用材料。使用具有适当分子量截止值的超离心过滤器进行纯化。
缀合物69的测得的纯化色谱图如图15所示。进一步地，用UV检测器分析时，未观察到除与生物素部分和脂肪酸部分键合的多肽的峰以外的峰。以百分比表示各色谱图中的峰面积，确认缀合物69的纯度为至少95％。
3)确认分子量
测量了从缀合物69获得的最终材料的分子量。
使用MALDI-TOF质谱法确认分子量。作为基质溶液，使用在含有0.1％TFA的50％乙腈中饱和的CHCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液。以线性和正模式确认质谱，并且通过将最终材料的浓度设置为0.1mg/mL来确认分子量。使用反应前后的平均分子量，求出生物素部分的平均键数。发现缀合物69的生物素键平均数目为10至20个。分析的结果如表16所示。
实验实施例.体外活性测试
确认对抗GLP-1受体的效力
缀合物3和14到20
测量了缀合物3和14到20的体外活性。
首先，为了确认对抗GLP-1受体的效力，从Eurofins购买并且使用表达人GLP-1受体的CHO-K1细胞。将7×103个细胞分布在96孔板的每个孔中，然后在37℃的温度条件下在CO2培养箱中培养。在至少24小时后，从每个孔中取出培养液并且将其用30μl 0.5mM IBMX处理15分钟。然后，将每个实施方案用0.001～1000nM和毒蜥外泌肽-4处理，然后在37℃的温度条件下在CO2培养箱中培养30分钟。然后，使用cAMP测定试剂盒测量产生的cAMP(荧光素酶活性)的量，以计算对抗GLP-1受体的EC50值。测量结果如表17所示。
[表17]
项目 活性(nM)
毒蜥外泌肽-4 1.991
缀合物3 0.301
缀合物14 1.155
缀合物15 0.307
缀合物16 0.882
缀合物17 1.109
缀合物18 0.347
缀合物19 0.237
缀合物20 NA
测量吸收率
缀合物3和14到20
为了确认药物的吸收率，比较了药代动力学行为。
将样本分别以100和500ug/kg的量施用到体重约200g的实验大鼠(SD大鼠)的十二指肠中，然后采集血液样品。将该施用剂量的每个样本溶解于含0.02％聚山梨酯80的10mMPBS(pH 7.4)中，然后分别加入68mg/kg和34mg/kg的NaCDC和PG，然后以1000rpm混合20分钟，之后进行施用。使用酶联免疫测定(ELISA)方法测量血液中药物浓度随时间推移的变化。血液样品是从颈静脉采集的。结果以平均值计算，并且结果如表18所示。
[表18]
将缀合物15至17静脉内施用到实验大鼠(SD大鼠)中，并观察药代动力学行为。实验结果如下表19所示。
[表19]
测量血液葡萄糖调节能力
缀合物3、17和20
为了观察葡萄糖耐量，给小鼠口服施用GLP-1激动剂的口服制剂，并且进行腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)以测量血液葡萄糖调节功效。
为了测量动物模型中的腹膜内葡萄糖耐量，在-60分钟对9周龄的雄性小鼠(C57BL/6)口服施用100μl样本(对于SEQ ID NO 1为10ug/小鼠)，随后腹膜内注射200μl葡萄糖(2g/kg)。观察在-60、0、20、40、60、90和120分钟时从尾静脉采集的血液样品中的血液葡萄糖的变化。给对照组1皮下施用具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的多肽，并且给对照组2口服施用相同的多肽。
[表20]
缀合物20和24给小鼠口服施用缀合物20和24，并且进行葡萄糖耐量测试以测量血液葡萄糖调节功效。
测量结果如图4所示。证实施用缀合物20和24的组中的血液葡萄糖与未处理组相比显著降低。
缀合物53到54
通过葡萄糖耐量测试测量缀合物53至54的血液葡萄糖调节功效。给小鼠口服施用缀合物，然后在6小时后腹膜内施用葡萄糖，之后测量血液葡萄糖的变化。
测量结果如表7所示。证实施用缀合物53和54的组中的血液葡萄糖与未处理组相比显著降低。
缀合物65和66
给小鼠口服施用缀合物65和66，然后通过葡萄糖耐量试验测量它们的血液葡萄糖调节功效。
为了测量动物模型中的腹膜内葡萄糖耐量，在-20分钟时将样品口服施用给8周龄的雄性小鼠(C57BL/6)，然后腹膜内注射葡萄糖(2g/kg)。观察在-20、0、20、40、60、90和120分钟时从尾静脉采集的血液样品中的血液葡萄糖变化。施用其中蛋白质通过SEQ ID NO 15的第6个与第11个半胱氨酸之间的二硫键、SEQ ID NO 15的第7个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第7个半胱氨酸之间的二硫键以及SEQ ID NO 15的第20个半胱氨酸与SEQ ID NO 16的第19个半胱氨酸之间的二硫键联接的多肽作为对照。
测量结果如图14所示。如图14所示，施用缀合物的组中的血液葡萄糖与未处理组相比显著降低。
测量Caco-2细胞膜渗透性
缀合物17、51、72和73
将缀合物51溶解在汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中，并测量Caco-2细胞膜渗透性。首先，为了形成Caco-2细胞单层，将1.5×105个细胞分配到12-transwell板中的每个孔中，并且在37℃ CO2条件下培养3至4周。对于第一周，每2天更换一次培养基，此后以3天的间隔更换培养基进行培养。将接种后3周与4周之间的细胞用于实验。为了验证细胞单层的形成，仅使用TEER值为300Ω·cm2或更高并且荧光黄渗透性的测得值在3％以内的细胞单层测量TEER值和荧光黄值。将待用于实验的transwell用转运培养基(HBSS)洗涤，然后在37℃ CO2培养箱中培养1小时，之后将包含所制备的剂和赋形剂的制剂各200μL添加到顶端侧，用1mL不含该剂的转运培养基处理基底外侧。随后在37℃ CO2的培养箱中温育2小时。2小时后，从基底外侧各取1mL样品，并且使用酶联免疫测定法(ELISA)测量渗透性系数(Papp值)。渗透性系数(Papp值)如下计算，分析结果如表21所示。(这里，各缀合物是使用与以上制备实施例相同的方法制备的)
[Papp(10-6，cm/s)＝(dCr/dt)x Vr/(A x C0)]
(*dCr-渗透的样品的浓度，dt-用剂处理的时间，Vr-基底外侧体积，A-transwell面积，C0-最初添加的剂的浓度)
[表21]
/>
缀合物68和69
将缀合物68和69溶解在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中，并测量在Caco-2细胞中的积累。首先，为了测量细胞内积累，将Caco-2细胞以每孔7×104个分配在96孔板中，然后在37℃的温度条件下在CO2培养箱中培养。24小时后，将培养液从每个孔移出并且用HBSS洗涤，随后加入配制好的药物各100μl，并且置于37℃ CO2培养箱中培养。8分钟后，将每个孔用PBS洗涤，并且每孔用100μl 10％福尔马林处理，随后在室温下进行反应。10分钟后，将每个孔用PBS洗涤，然后用100μl 0.1％TRITON X-100处理，并在室温下反应。10分钟后，将每个孔用PBS洗涤并用1％BSA封闭1小时，然后用HRP抗生长激素抗体(1∶1000)处理。1小时后，将每个孔用PBST洗涤，并且加入Ultra TMB底物溶液。10分钟后，将每个孔用2N HCL终止溶液处理，并且在450nM处测量吸光度，以测量每种材料的细胞内积累。结果是相对于100％的hGH而言的，并且测量结果如表22和图16所示。(这里，各缀合物是使用与以上制备实施例相同的方法制备的)
[表22]
测量体重变化和撮食量
缀合物58和59
将缀合物58和59皮下施用到肥胖小鼠模型中2周，然后测量体重变化。
如图10所示，证实在施用缀合物58和59后体重与未处理组相比显著降低。
缀合物33、36、39、42和61至64
在给小鼠口服施用多肽、缀合物61至64和缀合物33、36、39和42后，在24小时内测量体重减轻和摄食量(这里，各缀合物是使用与以上制备实施例相同的方法制备的)。
体重减轻的结果如下表23所示，并且摄食量的结果如图12所示。尽管施用单一多肽的组的体重和摄食量与未处理组相比减少，但施用缀合物的组与施用单一多肽的组相比表现出突出的体重减轻和摄食量。
[表23]
项目 与未处理组相比的体重减轻(％)
多肽SEQ ID NO 24 -2.63±1.06
多肽SEQ ID NO 26 -3.13±1.05
多肽SEQ ID NO 28 -1.11±0.84
多肽SEQ ID NO 30 -1.17±0.76
缀合物33 -4.07±1.30
缀合物36 -4.53±0.86
缀合物39 -1.99±0.94
缀合物42 -2.60±0.62
缀合物61 -2.96±4.22
缀合物62 -3.32±1.31
缀合物63 -2.41±0.78
缀合物64 -3.38±1.26
本领域技术人员通过常规实验将能够获知或确认本专利说明书中陈述的本发明的具体实例的各种等同方案。此类等同方案意图包含在所附权利要求内。本申请的前述描述意在是示例性的，本领域的技术人员应当理解，在不改变技术思想或本质特征的情况下，本申请可以很容易地修改为其他具体形式。因此，前述中描述的所有实施方案应当理解为在所有方面都是示例性的而非限制性的。例如，被描述为单个要素的组成要素可以以分布式方式执行，并且同样地，被描述成分布式的组成要素也可以以组合方式执行。从所附权利要求及其等同方案的含义和范围推导出的所有改变或修改的形式可以被解释为包括在本发明的范围内。
[商业适用性]
本发明改善了口服吸收，可有效用于制药领域。
<110> D&D制药技术股份有限公司(D&D Pharmatech)
<120> 具有与生物素部分、脂肪酸部分或其组合偶联的生物活性材料缀合物的口服制剂
<130> PN21073-DNDP-PCT
<150> KR 10-2020-0163362
<151> 2020-11-27
<160> 42
<170> KoPatentIn 3.0
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
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His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
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Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
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<223>毒蜥外泌肽-4
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His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
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Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
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Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
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Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
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Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
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Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
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Asn Phe Cys
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Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
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Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
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Glu Asn Tyr Cys Asn
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<223> 胰岛素链B
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 胰岛素链A
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Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
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Glu Asn Tyr Cys Asn
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
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His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
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His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
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Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys Lys Lys
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<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
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<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
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His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
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Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu
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Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val
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<223> 胰淀素衍生物
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Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu
1 5 10 15
Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val
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Gly Ser Asn Thr Tyr Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 胰淀素衍生物
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Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu
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Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu
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<223> 胰淀素衍生物
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Arg His Ser Ser Pro Asn Phe Gly Ala Ile Pro Ser Ser Thr Asn Val
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<223> 胰淀素衍生物
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Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asp Phe Leu
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Arg His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Pro Ser Ser Thr Asn Val
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<223> 胰淀素衍生物
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<223> 胰淀素衍生物
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<223> 胰淀素衍生物
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<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
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35
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<400> 36
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Trp Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Gly Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 37
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<400> 37
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Trp Leu Asp Lys
1 5 10 15
Ile Ala Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Ile Gly Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<400> 38
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys
35 40
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>毒蜥外泌肽-4衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<220>
<221> 变体
<222> (1)
<223> H1 is Des-amino-His
<400> 39
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys
35 40
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<400> 40
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys
20 25 30
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胰高血糖素衍生物
<220>
<221> 变体
<222> (2)
<223> Xaa是2-氨基异丁酸
<400> 41
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 42
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人生长激素衍生物
<400> 42
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Ile Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190

Claims (23)

1.一种生物活性材料缀合物，其中生物素部分、脂肪酸部分或它们的组合与生物活性材料键合。
2.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述生物活性材料选自由以下组成的组：胰高血糖素(Glugacon)、GLP-1(胰高血糖素样肽-1)、GLP-2(胰高血糖素样肽-2)、GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)、毒蜥外泌肽-4、胰岛素、甲状旁腺激素、干扰素、促红细胞生成素、降钙素、胰淀素、血清素、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、尿酸酶、组织纤溶酶原激活剂、甲状腺球蛋白、疫苗、肝素或肝素类似物、抗凝血酶III、非格司亭、醋酸普兰林肽、艾塞那肽、依替巴肽、抗蛇毒血清、IgG、IgM、HGH、甲状腺素、凝血因子VII和VIII、用作治疗剂的糖脂，以及它们的衍生物。
3.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述生物活性材料选自由以下组成的组：包含由SEQ ID NO：1至14和SEQ ID NO：18至42表示的氨基酸序列的多肽及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述生物活性材料是由SEQ IDNO：15和16表示的氨基酸序列组成的多肽或其衍生物；或由SEQ ID NO：17和16表示的氨基酸序列组成的多肽或其衍生物。
5.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述生物素部分由以下通式A表示：
[通式A]
其中，在通式A中
X是能够与生物活性材料结合的官能团；
Y是间隔基；
Z是结合单元；
B由下面的化学式A-1表示；
[化学式A-1]
Z与化学式A-1的连接；
T是末端基团；
m为1至10的整数；
n为0或1至10的整数，其中当n＝0时，Y直接与B或T键合；以及，
p是0或1的整数。
6.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述X选自由以下组成的组：马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸琥珀酰亚胺酯、戊二酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基甲酯、琥珀酰亚胺基戊酯、碳酸琥珀酰亚胺酯、碳酸对硝基苯酯、醛、胺、硫醇、羟胺、碘乙酰胺、氨基氧基、酰肼、羟基、丙酸酯、吡啶基、烷基卤、乙烯基砜、羧基、酰肼、卤乙酰胺、C2-5炔基、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、异氰酸酯、硫酯、亚氨酯以及它们的衍生物。
7.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y不存在，或者是经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚烷基、经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚杂烷基、经取代的或未经取代的C6-50亚芳基或者经取代的或未经取代的C6-50亚杂芳基，如果是经取代的，则包括选自包括以下的组中的至少一种：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH和-NH2。
8.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y包含-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为1至20的整数。
9.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸或赖氨酸作为组分。
10.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述Z为以下中的任一者，其中的每一者均可独立地选择：
A)与X一起或者与X分开形成氨基酸或其衍生物；
B)是经取代的或未经取代的直链或支链C1-50亚杂烷基；
其中，如果是经取代的，则包含选自由以下组成的组的至少一种：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH和-NH2。
11.根据权利要求5所述的生物活性材料缀合物，其中所述T选自由以下组成的组：胺、C1-8烷基、C1-8烯基、卤基、羟基、硫醇、磺酸、羧基、苯基、苄基、醛、叠氮化物、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、腈和膦酸。
12.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述生物素部分选自由以下组成的组：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
13.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述脂肪酸部分与所述生物活性材料键合，并且与所述生物活性材料的与所述生物素部分键合的位点不同的位点键合。
14.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述脂肪酸部分由以下通式B表示：
[通式B]
X′-Y′-W
其中，在上面的式中，
X′是能够与生物活性材料结合的官能团；
Y′是间隔基；以及
W是脂肪酸。
15.根据权利要求14所述的生物活性材料缀合物，其中所述X′选自由以下组成的组：马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸琥珀酰亚胺酯、戊二酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基甲酯、琥珀酰亚胺基戊酯、碳酸琥珀酰亚胺酯、碳酸对硝基苯酯、醛、胺、硫醇、羟胺、碘乙酰胺、氨基氧基、酰肼、羟基、丙酸酯、吡啶基、烷基卤、乙烯基砜、羧基、酰肼、卤乙酰胺、C2-5炔基、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、异氰酸酯、硫酯、亚氨酯、四氟苯基酯、碳酸硝基苯基酯、硝基苯基以及它们的衍生物。
16.根据权利要求14所述的生物活性材料缀合物，其中所述W是经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚烷基、经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚烯基、经取代的或者未经取代的直链或支链C1-60亚杂烷基，或者经取代的或未经取代的直链或支链C1-60亚杂烯基，
并且，如果是经取代的，则被选自由以下组成的组的至少一种取代：＝O、-C(O)NH2、-OH、-COOH、-SH、＝NH、-NH2和卤基。
17.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述脂肪酸部分由以下通式B1表示：
[通式B1]
X′1-Y′-C(O)-F1
其中，在上面的式中，
X′1为马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、胺、四氟苯酯或硝基苯酚；
Y′是间隔基；以及
F1是C6-28的经取代的或未经取代的直链或支链亚烷基，或者经取代的或未经取代的直链或支链亚杂烷基。
18.根据权利要求14或权利要求17所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y′是直接键，或者Y的结构包括包括以下的组中的至少一种：经取代的或未经取代的C1-50直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚烷基、经取代的或未经取代的C1-50直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50非直链亚杂烷基、经取代的或未经取代的C1-50亚芳基、经取代的或未经取代的C1-50亚杂芳基、-O-、-C(O)、-C(O)NR-、-C(O)O-、-S-、-NR-或-NOR-、其中R为氢、或经取代的或未经取代的C1-50烷基、经取代的或未经取代的C1-50芳基或者乙二醇重复单元(-(CH2CH2O)n-，其中n是至少1但不超过20的整数)。
19.根据权利要求14或权利要求17所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y′包含-C(O)-(OCH2CH2)u-NH-作为重复单元，其中u为1至20的整数。
20.根据权利要求14或权利要求17所述的生物活性材料缀合物，其中所述Y′包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸或赖氨酸作为组分。
21.根据权利要求1所述的生物活性材料缀合物，其中所述脂肪酸部分选自由以下组成的组：
/>
/>
/>
22.一种用于预防或治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝病、肠易激综合征、神经退行性疾病、骨病、骨质疏松症、人类生长激素缺乏症、癌症或非酒精性脂肪肝病的药物制剂，所述制剂包含权利要求1至权利要求21中任一项所述的生物活性材料缀合物。
23.一种用于口服施用的制剂，其包含权利要求1至权利要求21中任一项所述的生物活性材料缀合物。
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