KR102480393B1 - 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비오틴 모이어티가 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 비오틴 모이어티가 결합된 생리활성 물질은 체내 경구 흡수율이 우수한 효과를 가진다.

Description

비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물{Physiological active materials linked biotin moiety and composition for oral administration comprising the same}
본 발명은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 체내 경구 흡수율이 우수한 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물에 관한 것이다.
최근 경제 발전과 함께 과학기술의 고도성장을 통하여 식생활이 서구화되고, 고열량-고지방 식품 섭취가 증가하고 있다. 이에 따라 다양한 대사질환으로 인한 당뇨, 비만 등의 성인병 인구가 급격히 증가하고 있다.
당뇨병은 다양한 합병증은 물론 절제된 식생활로 인해 환자의 삶의 질이 크게 저하됨으로 인해 치료와 관리에 대한 인식이 증가하고 있으며, 당뇨병의 개선 또는 치유를 위한 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
당뇨병은 인슐린 분비 저하로 발생되는 '제1형 당뇨병'과 인슐린의 생성은 정상이나 인슐린 저항성으로 인한 대사조절 능력의 저하로 발생되는 '제2형 당뇨병'으로 구분된다. 제2형 당뇨병과 비만은 상호 간의 발병원인이며, 대사질환 발병의 원인일 뿐만 아니라 당뇨병 환자의 주요 사망 원인인 죽상동맥경화증 (atherosclerosis)의 위험성을 증가시키기 때문에 매우 위험한 질병이다.
최근에는 글루카곤 유도체에 관심이 집중되고 있다. 글루카곤은 약물치료 또는 질병, 호르몬이나 효소 결핍 등의 원인으로 혈당이 떨어지기 시작하면 췌장에서 생산된다. 글루카곤은 간에 글리코겐을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 혈당 수준을 정상 수준까지 높이는 역할을 한다. 뿐만 아니라, 글루카곤은 혈당 상승효과 이외에 식욕억제 및 지방세포의 호르몬 민감성 리파아제(hormone sensitive lipase)를 활성화시켜 지방 분해를 촉진하여 항비만 효과를 나타냄이 보고되었다. 이러한 글루카곤의 유도체 중의 하나인 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)은 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 치료제로 개발 중인 물질로서, 인슐린 합성과 분비 촉진, 글루카곤의 분비 저해, 위공복 억제, 글루코오스 사용 증진과 더불어 음식물 섭취를 저해하는 기능을 가진다.
GLP-1과 대략 50 % 아미노산 상동성을 가지는 도마뱀 독액(lizard venom)으로부터 만들어지는 엑센딘-4(exendin-4) 또한 GLP-1 수용체를 활성화시켜 당뇨 환자의 고 혈당증을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
그러나 펩티드 및 단백질 약물은 경구 투여되는 경우 효소의 공격으로 인하여 분해되고, 장관막 투과율이 높지 않은 문제점을 가지고 있다.
본 발명의 목적은 체내 경구 흡수율이 우수한 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이를 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 과민성 장 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 수용성 비오틴이 결합되어 우수한 경구 흡수율을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 효소로부터 펩티드 등의 생리활성 물질이 분해되는 것을 방어할 수 있고, 궁극적으로 생리활성 물질이 장관 막을 투과하여 장내에서 흡수가 촉진될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 수용성 비타민 B7의 한 종류인 비오틴과 결합됨으로써 나트륨 의존성 멀티비타민 수송체를 통해 능동 수송으로 흡수될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티는 생리활성 물질의 비활성 부위에 결합될 수 있고, 이에 따라 생리활성 물질의 활성을 저해시키지 않을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 3의 정제 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 1 내지 실시예 3의 최종 물질에 대한 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 1 내지 실시예 3의 MALDI-TOF 질량분석 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 1 내지 실시예 3의 렛트에 대한 경구 투여 후 시간별 혈중 농도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 각 시료에 대하여 글루코오스(glucose)를 투여한 후 혈당 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 각 시료에 대하여 글루코오스를 투여한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 7은 각 시료에 대하여 글루코오스를 투여한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 8은 각 시료에 대하여 글루코오스를 투여한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 10에 대한 정제 크로마토그램이다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 10의 정제 후의 크로마토그램이다.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 11의 역상 크로마토그램이다.
도 12는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 10 및 실시예 11의 MALDI-TOF 질량분석스펙트럼이다.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 12 및 13에 대한 정제 크로마토그램이다.
도 14는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 12의 정제 후의 크로마토그램이다.
도 15는 본 발명의 일 실시형태에 따른 실시예 13의 정제 후의 크로마토그램이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 본 발명을 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “하는) 단계” 또는 “의 단계”는 “를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서, “및/또는 B”의 기재는, “및 B, 또는 A 또는 B"를 의미한다.
본 발명의 일 측면은 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 측면에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 우수한 체내 경구 흡수율을 가질 수 있다.
일반적으로 펩티드 및 단백질 약물은 고수용성으로 위장관 흡수 부위에 제약이 있는 BCS(Biopharmaceutical Classification System) 클래스 3에 해당한다. 펩티드 및 단백질 약물은 높은 친수성과 큰 분자량을 가지며, 낮은 pH의 위산에 의해 분해될 수 있고, 트립신과 같은 효소의 공격을 받아 장내 흡수율이 낮은 특성을 가진다. 일반적으로 펩티드 및 단백질 약물의 경구 흡수율(oral bioavailability, BA)이 0.1 % 내외로 약제학적 조성물로 사용되기 어려운 점이 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 장용 캡슐을 이용하여 위를 통과하는 기술이 사용되고 있으나, 펩티드 및 단백질의 흡수율을 근본적으로 개선하지 못하는 한계가 있다.
이에 반하여 본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 장관막 투과를 증가시켜 장내에서 흡수가 촉진될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 수용성 비타민의 한 종류인 비타민 B7, 비오틴과 결합됨으로써, 나트륨 의존성 멀티비타민 수송체를 통해 능동 수송으로 흡수될 수 있다.
본 발명에서 "비치환되거나 치환된"은 비치환될 수 있거나 또는 치환될 수 있는 것을 의미하며, "치환된"은 1 이상의 치환기를 가지고, 치환기는 알킬렌, 헤테로알킬렌 등의 주 그룹의 임의원자와 공유결합되거나 융합된 화학적 부분을 의미한다.
본 발명에서 "할로"는 플루오린, 클로린, 브로민, 요오드 등을 의미한다.
본 발명에서 "알킬"은 지방족 또는 지환족, 포화 또는 불포화 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 등이 있다.
본 발명에서 “헤테로알킬”은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 알킬로서, 헤테로 원자는 알킬의 임의의 탄소 원자 하나의 위치에 헤테로 원자가 위치하여, C, CH, CH2 또는 CH3를 대체한 것을 의미한다.
본 발명에서 "알킬렌"은 지방족 또는 지환족, 포화 또는 불포화 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 2가 부분을 의미한다.
본 발명에서 “헤테로알킬렌”은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 알킬렌을 의미한다.
본 발명에서 "아릴"은 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분을 의미한다. 예를 들어 "C5-10아릴"은 탄소가 5 내지 10 개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 1 가 부분을 의미한다. 아릴의 예로서, 벤젠, 아세나프텐, 플루오렌, 페날렌, 아세페난트렌 및 아세안트렌으로부터 유도된 기가 있다.
본 발명에서 "헤테로아릴"은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 아릴로서, 예를 들면, 피리딘, 피리미딘, 벤조티오펜, 푸릴, 디옥살라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 인돌리진, 인돌린, 이소인돌린, 푸린, 벤조디옥산, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴놀리진, 벤족사진, 벤조디아진, 피리도피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 프테리딘, 페리미딘, 피리도인돌, 옥산트렌, 페녹사티인, 페나진, 페녹사진, 등이 있다.
본 발명에서 “아릴렌”은 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 2가 부분을 의미한다.
본 발명에서 “헤테로아릴렌”은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 아릴렌을 의미한다.
본 발명에서 "알케닐"은 1 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬로서, 예를 들면, 바이닐(-CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CHCH3), 이소프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등이 있다.
본 발명에서 "알키닐"은 1 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기로서, 예를 들면 에티닐 및 2-프로피닐 등이 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티는 하기 일반식 A로 표시될 수 있다.
[일반식 A]
Figure 112020055220583-pat00001
상기 일반식 A에서,
X는 생리활성 물질과 결합할 수 있는 작용기이고,
Y는 스페이서이며,
Z는 바인딩 유닛이고,
B는 하기 화학식 A-1로 표시될 수 있으며,
[화학식 A-1]
Figure 112020055220583-pat00002
Z는 화학식 A-1의
Figure 112020055220583-pat00003
와 연결되고,
T는 말단기이며,
m은 1 내지 10의 정수이고,
n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, n=0인 경우 Y는 B 또는 T에 직접결합하고,
p는 0 또는 1의 정수이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 일반식 A에서, X는 생리활성 물질과 결합할 수 있는 작용기이다. 이에 제한되지 않으나, 상기 작용기는 티올기, 카복실기 및/또는 아민기와 반응할 수 있는 작용기, 예를 들면 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 알데하이드 또는 카복실기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 작용기 X는 생리활성 물질과 결합할 때 구조가 유지되거나 탈락 또는 변형될 수 있다.
상기 Y는 스페이서로 체내에서 절단성을 가지는 구조일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 Y는 직접결합에 해당하거나, 치환 또는 비치환된 알킬렌, -O-, -C(O)NR-, -C(O)O-또는 -C(O)-, -NR-, -NOR- 등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 Y는 직접결합에 해당하거나, Y의 구조 내에 치환 또는 비치환된 C1-50 선형 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50 비선형 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50 선형 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50 비선형 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50 아릴렌, 치환 또는 비치환된 C1-50 헤테로아릴렌, -O-, -C(O), -C(O)NR-, -C(O)O-, -S-, -NR- 또는 -NOR-로 구성된 그룹으로부터 하나 이상을 포함할 수 있고, 여기에서 R은 수소, 치환 또는 비치환된 C1-50 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-50 아릴, 또는 에틸렌글리콜 반복단위(-(CH2CH2O)n-, n은 1 이상 20이하의 정수)일 수 있다.
상기 Z는 B와 결합될 수 있는 바인딩 유닛으로, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 아미노산, 폴리펩티드, 알킬렌, 아민, 또는 폴리아미도아민 구조를 포함할 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 아미노산은 라이신, 5-하이드록시라이신, 4-옥살라이신, 4-티아라이신, 4-셀레나라이신, 4-티아호모라이신, 5,5-디메틸라이신, 5,5-디플루오로라이신, 트랜스-4-디하이드로라이신(trans-4-dehydrolysine), 2,6-디아미노-4-헥시노산, 시스-4-디하이드로라이신(cis-4-dehydrolysine), 6-N-메틸라이신, 다이미노피멜산, 오르니틴, 3-메틸오르니틴, α-메틸오르니틴, 시트룰린, 호모시트룰린, 아르기닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 오르니틴, 프롤린, 세린, 또는 트레오닌을 포함할 수 있다.
상기 n이 0인 경우 B 또는 T는 Y(스페이서)와 직접 결합할 수 있다.
상기 T는 말단기로 이에 제한되지 않으나, 예를 들면 수소, 또는 NH2일 수 있다.
상기 p가 0인 경우 상기 B가 말단일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 일반식 A에서 m은 1 내지 10의 정수일 수 있으며, 구체적으로 1 내지 8, 1 내지 5, 1 내지 4의 정수일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 X는 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트, 석신이미딜 메틸에스터, 석신이미딜 펜틸에스터, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 알데하이드, 아민, 티올, 옥시아민, 아이오도아세트아마이드, 아미녹실, 하이드라지드, 하이드록시, 프로피오네이트, 피리딜, 알킬할라이드, 비닐술폰, 카복실, 하이드라지드, 할로겐 아세트아마이드, C2-5 알키닐, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 이소시아네이트, 티오에스테르, 이미노에스테르, 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
구체적인 본 발명이 일 양태에서, X는 말레이미드, N-하이드록시석신이미드, 알데하이드 또는 아민이다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 부재하거나 치환되거나 비치환된 선형 또는 분지형 C1-50 알킬렌, 치환거나 비치환된 선형 또는 분지형 C1-50 헤테로알킬렌, 치환되거나 비치환된 C6-50 아릴렌, 또는 치환되거나 비치환된 C6-50 헤테로아릴렌이며, 치환된 경우 =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 치환된 선형 또는 분지형 C1-50 헤테로알킬렌이고, 최소 하나 이상의 -C(O)-를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고, 여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며, q, s는 0 또는 1이고, r은 1 내지 20의 정수이며, t는 0 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 -(CH2)rC(O)NHNH-이고, 여기에서 r은 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 -C(O)-를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Y는 -C(O)NH-를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 하기 중 어느 하나이고 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
A) X와 함께 또는 X와 별도로, 아미노산 또는 이의 유도체를 형성하거나;
B) 치환되거나 비치환된 선형 또는 분지형 C1-50 헤테로알킬렌이며,
여기에서 치환된 경우, =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 B와 -NH-를 통해 연결되는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 친수성 아미노산 또는 이의 유도체이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, Z는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 시스테인, 세린 및 이의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, Z는 하나 이상의 글리세롤, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 결합을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, Z는
Figure 112020055220583-pat00004
를 포함하고,
Figure 112020055220583-pat00005
는 결합부위를 나타내며, 상기 결합부위의 하나 이상에
Figure 112020055220583-pat00006
가 하나 이상 결합되고, 여기에서 u는 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일 양태에서, Z는
Figure 112020055220583-pat00007
을 포함하고,
Figure 112020055220583-pat00008
에 -(CH2)3NH-가 더 결합된다.
본 발명의 일 양태에서, T는 아민, C1-8 알킬, C1-8 알케닐, 할로, 하이드록시, 티올, 설폰산, 카르복실, 페닐, 벤질, 알데하이드, 아자이드, 사이아네이트, 아이소사이아네이트, 티오사이아네이트, 아이소티오사이아네이트, 나이트릴 및 포스폰산으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, T는 아민이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 비오틴 모이어티는
Figure 112020055220583-pat00009
,
Figure 112020055220583-pat00010
,
Figure 112020055220583-pat00011
,
Figure 112020055220583-pat00012
,
Figure 112020055220583-pat00013
,
Figure 112020055220583-pat00014
,
Figure 112020055220583-pat00015
,
Figure 112020055220583-pat00016
,
Figure 112020055220583-pat00017
,
Figure 112020055220583-pat00018
,
Figure 112020055220583-pat00019
,
Figure 112020055220583-pat00020
및
Figure 112020055220583-pat00021
로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 생리활성 물질은 다양한 결합으로 형성될 수 있다. 비오틴 모이어티의 작용기와 생리활성 물질의 작용기가 결합하여 형성될 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 티올-에테르 결합 또는 아미드 결합으로 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 비오틴 모이어티와 생리활성 물질의 결합은 하기 반응식 1과 같은 방식에 의해 결합될 수 있다. 하기 반응식 1에서,
Figure 112020055220583-pat00022
는 티올기를 포함하는 생리활성 물질을 나타내고, 본 발명의 일 실시형태에 따른 말레이미드를 포함하는 비오틴 모이어티와 생리활성 물질에 존재하는 시스테인 잔기의 티올기(-SH)와의 반응을 나타낸다.
Figure 112020055220583-pat00023
[반응식 1]
일 구체예에서, 비오틴 모이어티와 생리활성 물질의 결합은 하기 반응식 2와 같은 방식에 의해 결합될 수 있다. 하기 반응식 2에서,
Figure 112020055220583-pat00024
는 아민기를 포함하는 생리활성 물질을 나타내고, 본 발명의 일 실시형태에 따른 N-하이드록시석신이미드를 포함하는 비오틴 모이어티와 생리활성 물질에 존재하는 아민기(-NH2)와의 반응을 나타낸다.
Figure 112020055220583-pat00025
[반응식 2]
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 생리활성 물질은 특별히 제한되지 않을 수 있다.
본 발명에서 생리활성 물질은 특정 목적을 위하여 체내에 투여될 수 있는 고분자 물질을 의미한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 생리활성 물질은 약제학적 조성물에 사용되는 물질일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 당뇨병 예방 또는 치료, 비만 예방 또는 치료, 골다공증 예방 또는 치료, 지방간 질환 예방 또는 치료, 과민성 장 증후군 예방 또는 치료, 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료에 사용되는 물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 생리활성 물질은 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 폴리펩티드, 또는 비펩티드성 중합체일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 폴리펩티드, 단백질, 다당류(polysaccharide) 또는 이들의 유도체일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 글루카곤(Glugacon), GLP-1(Glucagon-like peptide-1), GLP-2(Glucagon-like peptide-2), GIP(glucose-dependent insulinotropic polypeptide), 엑센딘-4(exendin-4), 인슐린, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 에리트로포이에틴, 칼시토닌, 세로토닌, 리툭시맙, 트라스트주맙, 우리카제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 티모글로빈, 백신, 헤파린 또는 헤파린 유사체, 안티트롬빈 III, 필그라스팀, 프라믈린티드(pramlintide) 아세테이트, 엑세나티드, 에프티피바티드(eptifibatide), 안티베닌(antivenin), IgG, IgM, HGH, 티록신, 혈액 응고 인자 VII 및 VIII, 단클론성 항체, 치료제로서 작용하는 당지질, 및 이들의 유도체일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티는 생리활성 물질의 비활성 부위에 결합될 수 있다.
비오틴 모이어티가 생리활성 물질의 비활성 부위에 결합하여 생리활성 물질의 생물학적 활성을 저해시키지 않을 수 있고, 이에 따라 생리활성 물질과 동일한 생물학적 활성 또는 향상된 생물학적 활성을 가질 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 비활성 부위에 노출된 -SH기를 함유하여 상기 -SH기에 비오틴 모이어티가 결합될 수 있다. 또한, 상기 생리활성 물질은 비활성 부위에 노출된 -NH3 +기 또는 -NH2기를 함유하여, 상기 노출된 -NH3 +기 또는 -NH2기에 비오틴 모이어티가 결합될 수 있다. 또한, 상기 생리활성 물질은 비활성 부위에 노출된 N-말단을 포함하고, 상기 노출된 N-말단에 비오틴 모이어티가 결합될 수 있다. 폴리펩티드의 경우 상기 생리활성 물질은 비활성 부위 리신 아미노산의 -NH3 +기, -NH2기 또는 폴리펩티드의 N-말단이 비활성 부위인 경우 N-말단에 결합되어 폴리펩티드의 활성을 저해하지 않을 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티는 생리활성 물질과의 결합 위치가 조절되어 활성을 나타내는 위치를 피하여 결합될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 생리활성 물질은 하기 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 유도체일 수 있다.
서열번호 1: H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFVQWLMNT
서열번호 2: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
서열번호 3 : HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
서열번호 4: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ
서열번호 5: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
서열번호 6: SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF
서열번호 7: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMN
또한, 상기 생리활성 물질은 하기 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있고, 여기서 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
서열번호 15 GIVEQCCTSICSLEQLENYCN
서열번호 16: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
서열번호 17: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와의 결합 위치를 조절하기 위하여 폴리펩티드에 시스테인을 치환 또는 삽입할 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 서열번호 1 내지 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 비활성 부위의 아미노산 중 어느 하나 이상이 시스테인 아미노산으로 치환 또는 삽입될 수 있다. 이때 상기 시스테인 아미노산의 -SH기에 비오틴 모이어티가 결합된다. 또한, 상기 시스테인 아미노산이 삽입된 폴리펩티드는 하기 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
서열번호 8: H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFVQWLMNTC
서열번호 9: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC
서열번호 10: HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC
서열번호 11:
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQC
서열번호 12: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC
서열번호 13: SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC
서열번호 14: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTC
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티를 가지는 생리활성 물질은 펩티드 및 비펩티드성 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 항체, 항체 단편, 알부민 및 이의 단편, 뉴클레오티드, 피브로넥틴(fibronectin), 트렌스페린, FcRn 결합물질, 사카라이드(saccharide), 엘라스틴, 헤파린 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상과 공유결합하거나 봉입체(microsphere)를 형성할 수 있다.
상기 비펩티드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜(PVA), 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid), PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid), 지질 중합체, 키틴, 히알루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 비오틴 모이어티를 얻는 단계; 상기 비오틴 모이어티와 생리활성 물질을 반응시키는 단계; 및 상기 반응 완료 후 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 분리하는 단계를 포함하는 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 비오틴 모이어티를 얻는 단계에서, 비오틴 모이어티는 상기 일반식 A로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 혼합물을 얻는 단계에서 생리활성 물질에 대한 비오틴 모이어티의 반응 몰비는 0.5 이상으로 하여 반응시킬 수 있다. 구체적으로 생리활성 물질에 대한 비오틴 모이어티의 반응 몰비는 0.5 내지 5일 수 있다. 적절한 상기 반응 몰비는 비오틴 모이어티의 분자 구조, 분자량, 용해도, 반응액의 pH, 반응 온도, 반응 시간 등을 고려하여 선택할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 반응은 완충용액 또는 유기 용매를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 완충용액 또는 유기용매는 특별한 제한이 없으며, 비오틴 모이어티의 구조에 따라 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 완충용액을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 반응 단계의 온도 및 시간은 사용되는 비오틴 모이어티 및 생리활성 물질의 특성에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면 4 ℃에서 3시간 이상 수행될 수도 있으며, 상온에서 더 짧은 시간 동안 수행할 수도 있다. 이는 사용되는 비오틴 모이어티의 반응성 정도와 관계될 수 있다. 적당한 반응 시간의 경과되면 반응액의 pH를 낮춤으로써 반응을 멈추게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 반응 단계 이후에 미반응물을 제거하는 단계를 수행할 수 있다. 상기 미반응물을 제거하는 방법은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 적당한 완충용액, 예를 들면, PBS (phosphate buffered saline)와 같은 용액을 사용하여 투석법 (dialysis) 등에 의해 제거될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 분리 단계 후에 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 및 정제 단계는 크기 배제 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 상기에서 서술한 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질은 수용성 비타민 B7의 한 종류인 비오틴과 결합됨으로써 나트륨 의존성 멀티비타민 수송체를 통해 능동 수송으로 흡수될 수 있어 장관막을 투과하여 장내에서 흡수가 촉진될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 서술한 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 약학적 조성물의 용도는 생리활성 물질의 종류에 따라 결정될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 생리활성 물질은 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 이의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 생리활성 물질은 비만의 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 이의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 생리활성 물질은 지방간 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 이의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 과민성 장 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 생리활성 물질은 과민성 장 증후군 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 이의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 생리활성 물질은 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료에 사용되는 것일 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 생리활성 물질은 서열번호 1 내지 14의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질 서열번호 17 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 이의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 용해 보조제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로오스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한 증식성 질환 또는 자가면역질환의 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1일 유효 투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 여러 번에 나누어 투여될 수 있다. 또한 1 내지 2주에 수회 투여로도 유효 투여량의 투여가 가능할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예: 비오틴 모이어티 제조>
약어 목록
HBTU: 3-[비스(디메틸아미노)메틸륨일]-3H-벤코트리아졸-1-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(: 3-[Bis(dimethylamino)methyliumyl]-3H-benzotriazol-1-oxide hexafluorophosphate)
DIEA: 에틸디이소프로필아민 (Ethyldiisopropylamine)
HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아콜로[4,5-b]피리디늄-3옥사이드 헥사플루오로포스페이트 (1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate)
DIC: 디이소프로필카보디이미드 (Diisopropylcarbodiimide)
HOBt:: 1-하이드록시벤조트리아졸 (1-Hydroxybenzotriazole)
MBHA: 4-메틸벤즈히드릴아민 히드로클로라이드 (4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride)
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
DMF: 디메틸포름아미드 (dimethylformamide)
SPPS: 고체상 펩티드 합성
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량분석
일반적인 SPPS 방법
일부 경우에서 펩티드의 고체상 합성은 산성 조건 하에서 절단될 수 있는 기, 예를 들어, 2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질, 또는 2,4,6-트라이메톡시벤질을 가진 디-펩티드 아미드 결합에서 보호된 디-펩티드의 사용에 의해 개선될 수 있다. 사용된 Fmoc-보호된 아미노산 유도체가 권장된 표준이었다: 예를 들어 Anaspec, Bachem, Iris Biotech, 또는 Novabiochem으로부터 공급된 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 또는, Fmoc-Val-OH 등. N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 보호된 Boc였다. 예를 들어, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, 또는 Novabiochem으로부터 공급된 Fmoc-8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산, Fmoc-트라넥사민산, Fmoc-아이소니페코트산, Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH를 사용하였다.
SPPS를 이용한 펩타이드 합성
펩타이드는 HBTU/DIEA, HATU/DIEA, 혹은 DIC/HOBt를 커플링 시약으로서 이용하여, 링크 아마이드 MBHA 수지에서 일반적인 Fmoc 화학을 이용하여 합성될 수 있다. 합성에 이용되는 반응물과 커플링 시약은 다음의 조합들을 포함한다.
# 반응물 커플링 시약
1 Fmoc-Lys (Biotin)-OH (1.5 eq) HBTU (1.42 eq) and DIEA (3.0 eq)
2 Fmoc-Lys (Biotin)-OH (2.0 eq) HBTU (1.9 eq) and DIEA (4.0 eq)
3 3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanoic acid (3.0 eq) DIC (3.0 eq) and HOBt (6.0 eq)
4 2,2-dimethyl-4-oxo-3,7,10,13,16,19,22-heptaoxapentacosan-25-oic acid (2.0 eq) HATU (1.9 eq) and DIEA (4.0 eq)
5 Fmoc-21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxaheneicosanoic acid (2.0 eq) HATU (1.9 eq) and DIEA (4.0 eq)
SPPS를 이용한 펩타이드 합성 과정의 예시적인 프로토콜은 하기 내용을 포함한다.
1) 링크 아마이드 MBHA 수지를 포함하는 용기에 DMF를 첨가하여 2시간동안 팽창한다 (sub: 0.68 mmol/g, 1.0 mmol, 1.47 g 혹은 5 mmol, 7.35 g, sub: 0.68 mmol/g). 2) 20% piperidine/DMF를 첨가한 후, 30분간 섞는다. 3) 1)-2)의 용매를 제거 후 DMF을 이용하여 (30초 x 5번) 세척한다. 4) 반응물(#1~#5의 반응물 중 1가지)을 첨가하여 30초간 섞어준 뒤, 반응물에 해당하는 커플링 시약(#1~#5의 커플링 시약 중 1가지)을 첨가하여 1시간 동안 질소 버블링을 진행한다. 5) 20% piperidine/DMF를 첨가한 후, 30분간 섞는다.
상기 1)~5)의 예시적인 프로토콜은 #1~#5의 반응물과 커플링 시약의 조합을 한 번 이상 사용하여 반복적인 합성을 진행할 수 있다. Fmoc 제거를 위하여 20% piperidine/DMF 용액을 30분간 처리하였다.
펩타이드 정제 및 분석을 위한 일반적인 과정
미정제 펩타이드를 물과 TFA, ACN의 적당한 혼합물에 녹인 뒤, 분취 HPLC를 이용하여 정제한 후, 건조하여 정량하였다. 분취 HPLC를 이용한 정제 조건은 하기 표 2에 나타난 것을 포함한다.
정제 조건
용매 ACN/H2O
장비 SHIMADZU LC-8A, 혹은 Gilson GX-281
Mobile Phase A: H2O (0.075% TFA in H2O)
B: CH3CN
Gradient 15-35%-60 min. Retention time: 42min, 혹은
20-50%-60 min. Retention time: 45min, 혹은
5-35%-60 min. Retention time: 50 min
Column Luna25*200mm, C18, 10um, 110A+Gemin150*30mm, C18, 5um, 110A, 혹은
Luna50*25mm, C18, 10um, 100Å+Gemini®250*50mm, C8, 5um, 110Å
Flow Rate 80mL/Min 혹은 20 mL/Min
Wavelength 220/254 nm
Oven Tem. Room temperature
분취 HPLC를 이용한 정제 후에는 분석 HPLC, 또는 LCMS를 이용하여 최종 산물의 특성을 분석하였다.
분석결과, 하기 표 3에 따른 비오틴 모이어티를 수득하였다.
비오틴
모이어티		 명칭
B1 N-Biotinoyl-N′-(6-maleimidohexanoyl)hydrazide
B2 3-Maleimidopropionate-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-CONH2
B3 3-Maleimidopropionate-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-CONH2
B4 propionate-N-hydroxysuccinimide ester- PEG-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-CONH2
B5 3-Maleimidopropionate-PEG-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-Lys(Biotin)-CONH2
B1:
Figure 112020055220583-pat00026
,
B2:
Figure 112020055220583-pat00027
,
B3:
Figure 112020055220583-pat00028
,
B4:
Figure 112020055220583-pat00029
,
B5:
Figure 112020055220583-pat00030
또한, 상기 SPPS를 이용한 펩타이드 합성1)~5)의 프로토콜, 정제 및 분석을 통해 하기의 비오틴 모이어티를 수득하였다. 하기 표 4에서 X, Y, Z 및 B는 본 명세서 일반식 A의 정의에 포함된다.
비오틴 모이어티 X Y Z B(Biotin) 개수
B6 Aldehyde propane Lysine 2
B7 Maleimide butyrate Glycerol and PEG 2
B8 Maleimide butyrate Glycerol and PEG 2
B9 N-hydroxysuccinimide butyrate Lysine 2
B10 N-hydroxysuccinimide glutarate Glycerol and PEG 2
B11 Maleimide PEG12 Lysine 3
B12 N-hydroxysuccinimide PEG12 Lysine 3
B13 amine - Lysine 3
B14 Aldehyde pentane Lysine 2
B15 Maleimide adipate Glycerol and PEG 2
B16 Maleimide suberate Glycerol and PEG 2
B17 Maleimide sebacate Glycerol and PEG 2
B18 N-hydroxysuccinimide adipate Glycerol and PEG 2
B19 N-hydroxysuccinimide suberate Lysine 4
B20 N-hydroxysuccinimide sebacate Lysine 4
B21 N-hydroxysuccinimide PEG6 Glycerol and PEG 2
B22 Succinimidyl carbonate PEG6 Lysine 2
B23 Succinimidyl carbonate PEG12 Lysine 3
B24 Succinimidyl carbonate pentane Lysine 3
B25 Succinimidyl carbonate hexane Lysine 3
B26 p-nitrophenyl carbonate PEG6 Lysine 3
B27 p-nitrophenyl carbonate PEG12 Lysine 4
B28 p-nitrophenyl carbonate propane Glycerol and PEG 2
B29 p-nitrophenyl carbonate pentane Glycerol and PEG 2
B30 amine - Glycerol and PEG 2
B31 thiol butyrate Lysine 2
B32 thiol glutarate Lysine 3
B33 aminoxy PEG6 Lysine 3
B34 iodoacetamide PEG6 Lysine 3
<실시예: 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질 제조>
<실시예 1 내지 3>
1) 제조예
반응 용매를 0.3 % 트리에틸아민 (TEA, Sigma사)이 첨가된 DMSO용액으로 하여, 하기 표 5에 기재된 폴리펩티드-비오틴 모이어티는 서열번호 12의 폴리펩티드 및 상기 표 3에 기재된 비오틴 모이어티(B1, B2, B3를 각각 사용)를 몰 비율 1:2 (서열번호 12의 폴리펩티드: B1, B2, 또는 B3)로 하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 실온에서 30분 이상 반응시켰고, 반응은 혼합물의 부피와 같은 부피의 1 % 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid) 용액을 가하여 멈추게 하였다.
구분 폴리펩티드 비오틴
모이어티		 비오틴
모이어티의
결합위치
실시예1 서열번호 12 : HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC B1 C40
실시예2 서열번호 12 : HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC B2 C40
실시예3 서열번호 12 : HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC B3 C40
2) 분리 정제 및 확인
상기 실시예 1 내지 3의 반응 생성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, 이하 "HPLC")로 분리 및 정제하였다.
칼럼은 SUPERSIL ODS-1 column (10x250 mm, 5 μm, LB Science, South Korea)을 사용하였으며, 이동상 조건은 30-50 % 용매 B (0.1 % TFA가 첨가된 아세토나이트릴)과 용매 A(0.1 % TFA가 첨가된 증류수)로 4.7 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. UV흡광계 280 nm에서 모니터링하여 12분에서 14분 사이에 검출되는 피크를 수거하였다. 수거된 피크는 유기용매 및 TFA를 진공하에서 휘발시킨 후 적절한 분자량 컷오프를 가진 ultracentrifugal filter를 사용하여 농축, 정제하였다. 정제된 물질의 순도는 HPLC 분석법을 통해 확인하였다. 실온 부근의 일정 온도에서 Gemini C18 칼럼(4.6x250 mm, 5 μm; Phenomenex, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 분석은 트리플루오로아세트산시액: 아세토니트릴혼합액(혼합비를 70:30에서 20분 후 50:50가 되도록 한다)으로 이루어진 이동상을 사용하여 1 mL/min의 유속에서 gradient elution 방법에 의해 수행되었다. UV 흡광도는 280 nm에서 관찰하였다.
도 1은 실시예 3의 정제 크로마토그램이다.
도 2는 실시예 1 내지 3의 최종 물질에 대한 크로마토그램이다.
UV 검출기로 분석한 결과, 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드 이외의 다른 피크는 관찰되지 않았으며, 각각의 크로마토그램으로부터 발생한 피크의 면적을 백분율로 나타냈을 때, 실시예 1 내지 3의 순도가 99 % 이상인 것을 확인하였다.
분자량 확인
상기 실시예 1 내지 3에서 얻어진 최종 물질의 분자량을 측정하였다.
분자량은 MALDI-TOF 질량분석법을 통해 확인하였다. 매트릭스 용액으로는 CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 0.1 % TFA를 함유한 50 % 아세토니트릴에 포화시킨 용액을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 선형 및 양성 모드에서 확인하였으며, 최종 물질의 농도를 0.1 mg/mL로 하여 분자량을 확인하였다.
도 3은 실시예 1 내지 실시예 3의 MALDI-TOF 질량분석 스펙트럼이다. 도 3을 참조하면, MALDI-TOF 질량분석을 통하여 분리한 물질들의 분자량이 이론상의 분자량과 일치함을 확인하였다.
<실시예 4 내지 9>
상기 실시예 1 내지 3과 같은 방법으로 하기 표 6에 기재된 바와 같이 서열번호 8 및 13의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 비오틴 모이어티를 결합하여 폴리펩티드-비오틴 모이어티를 제조하였다.
구분 폴리펩티드 비오틴
모이어티		 비오틴
모이어티의
결합위치
실시예4 서열번호 8 : H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFVQWLMNTC B1 C30
실시예5 서열번호 8 : H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFVQWLMNTC B2 C30
실시예6 서열번호 8 : H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFVQWLMNTC B3 C30
실시예7 서열번호 13 : SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC B1 C35
실시예8 서열번호 13 : SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC B2 C35
실시예9 서열번호 13 : SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC B3 C35
[평가]
반응률 및 수율
반응률은 처음 혼합물을 얻는 단계에서 가한 폴리펩티드의 양을 기준으로 하여 비오틴 모이어티와 섞은 혼합물을 HPLC로 분석하였을 때, 실시예 1 내지 3의 HPLC 피크 면적을 비교하여 반응율을 정하였다.
본 발명의 수율은 처음 혼합물을 얻는 단계에서 가한 폴리펩티드의 양을 기준으로 하여 최종적으로 얻어진 정제된 최종 물질의 양을 정량하여 수율로 정하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같다.
실시예 1 내지 3
결합위치 C40
반응률 >99%
수율 80%
실시예 1 내지 3의 경구 흡수율 측정
경구 흡수율을 확인하기 위하여 약학적 거동을 비교하였다.
체중이 200 g 정도인 실험용 쥐(SD rat)에 시료를 100 및 500 ㎍/kg의 양으로 각각 정맥 및 경구 투여한 후 혈청을 채취하여 시간에 따른 혈중 약물농도의 변화를 효소결합 면역흡착검사 방법으로 측정하였다. 혈액 샘플은 경정맥으로부터 채취하였다. 결과는 평균 값으로 계산하였고 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 대조군으로 하였다. 실험 결과, 대조군에 비하여 실시예 1의 경우 약 257배, 실시예 2의 경우 270배, 실시예 3의 경우 약 557배 경구흡수율이 향상되는 것으로 나타났다.
도 4는 실시예 1 내지 3의 랫트에 대한 경구 투여 후 시간별 혈중 농도를 나타내는 그래프이다. 도 4와 같이, 실시예 1 내지 3은 대조군에 비하여 뛰어난 경구 흡수를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 1 내지 3의 혈당 조절능 측정
내당능을 확인하기 위해 경구용 GLP-1 작용제 제형의 실시예 1 내지 3을 마우스에 경구 투여 후 복강 내 당부하 검사(Intraperitoneal Glucose tolerance test :IPGTT)를 통해 혈당조절 효능을 측정하였다.
동물모델에서의 복강 내당력을 측정하기 위해 9주령 된 수컷 마우스 (C57BL/6)에 시료 100 ㎕(10 ug/mouse, 서열번호 1 기준)를 -60분에 경구 투여한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (2 g/kg)를 복강주사 하고 -60, 0, 20, 40, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 피하 투여한 것을 대조군 1로 하고, 경구 투여한 것은 대조군 2로 하였다.
도 5는 각 시료에 대하여 글루코오스(glucose)를 투여한 후 혈당 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5와 같이, 실시예 1 내지 3은 글루코오스 조절 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 5 및 실시예 6의 혈당 조절능 측정
내당능을 확인하기 위해 상기 실시예 5 및 6을 마우스에 경구 투여 후 복강 내 당부하 검사를 통한 혈당조절 효능을 측정하였다.
동물모델에서의 복강 내당력을 측정하기 위해 9주령 된 수컷 마우스 (C57BL/6)에 시료 100 ㎕(500 ug/kg, 서열번호 2 기준)를 -20분에 경구 투여한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (2 g/kg)를 복강주사 하고 -20, 0, 20, 40, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다.
도 6은 각 시료에 대하여 글루코오스를 투여한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다. 도 6과 같이, 실시예 5 및 6은 글루코오스 조절 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 8 및 실시예 9의 경구 흡수율 측정
상기 실시예 8 및 9의 경구 흡수율을 측정하였다. 체중이 200 g 정도인 실험용 쥐(SD rat)에 시료를 20 ㎍/kg의 양으로 피하주사와 경구 투여한 후, 시간에 따른 혈중 약물농도의 변화를 혈장을 분리한 후 효소 결합 면역 흡착 검사 방법으로 측정하였다. 혈액 샘플은 경정맥으로부터 채취하였다. 측정결과는 하기 표 8과 같다. 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 대조군으로 하였다.
　
　		 피하투여 대비 생체이용률 (%)　
대조군, 20 ug/kg, 피하 주사 　-
실시예 8, 20 ug/kg, 경구 투여 7.8
실시예 9, 20 ug/kg, 경구 투여 4.9
상기와 같이 본 발명의 일 실시형태에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드는 장내에서 흡수율이 높은 것을 확인하였다.
<실시예 10>
상기 표 3에 기재된 비오틴 모이어티 B4 및 하기 표 9에 기재된 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 사용하여 비오틴 모이어티가 결합된 폴리펩티드를 제조하였다.
구분 폴리펩티드 비오틴
모이어티		 비오틴
모이어티의
결합위치
실시예10 서열번호 5 :
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS		 B4 K27
1) 제조예
반응 용매는 0.3 % 트리에틸아민 (TEA, Sigma사)이 첨가된 DMSO 용액으로 하여, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 상기 표 3의 B4를 몰비 1:4로 하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 실온에서 2시간동안 반응시킨 후 혼합물의 부피와 같은 부피의 1 % 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid)이 함유된 30% 아세토니크릴/증류수 용액을 가하여 멈추게 하였다.
2) 분리 정제 및 확인
상기 실시예 10 반응 생성물을 역상 HPLC로 분리 및 정제하였다.
칼럼은 SUPERSIL ODS-1 column (10x250 mm, 5 μm, LB Science,South Korea)을 사용하였으며, 이동상 조건은 30-50 % 용매 B(0.1 % TFA가 첨가된 아세토나이트릴)과 용매 A(0.1 % TFA가 첨가된 증류수)로 4.7 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. UV흡광계 280 nm에서 모니터링하며 12.7분에 검출되는 피크를 수거하였다. 수거된 피크는 유기용매 및 TFA를 진공하에서 휘발시킨 후 적절한 분자량 컷오프를 가진 ultracentrifugal filter를 사용하여 농축, 정제하였다. 정제된 물질의 순도는 HPLC 분석법을 통해 확인하였다. 실온 부근의 일정 온도에서 Gemini C18 칼럼(4.6x250 mm, 5 μm; Phenomenex, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 분석은 트리플루오로아세트산 시액: 아세토니트릴 혼합액(혼합비를 70:30에서 20분 후 50:50가 되도록 한다)으로 이루어진 이동상을 사용하여 1 mL/min의 유속을 사용하였으며 UV 검출기는 280 nm에서 관찰하였다.
도 9는 실시예 10에 대한 정제 크로마토그램이다. 반응하지 않은 서열번호1의 폴리펩티드가 11.7분에 검출되었고, 비오틴 모이어티가 결합된 실시예 10의 물질이 12.7분에 검출되었다.
도 10은 실시예 10의 정제 후의 크로마토그램이다. 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드의 단일 피크로 확인되었으며, 이외의 다른 피크는 관찰되지 않았다. 크로마토그램으로부터 발생한 피크의 면적을 백분율로 나타냈을 때, 순도가 95% 이상인 것을 확인하였다.
3) 분자량 확인
상기 실시예 10에서 얻어진 최종 물질의 분자량을 측정하였다.
분자량은 MALDI-TOF 질량분석법을 통해 확인하였다. 매트릭스 용액으로는 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 0.1 % TFA를 함유한 50 % 아세토니트릴에 포화시킨 용액을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 선형 및 양성 모드에서 확인하였다.
<실시예 11>
상기 표 3에 기재된 비오틴 모이어티 B5 및 하기 표 10에 기재된 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 사용하여 비오틴모이어티가 결합된 폴리펩티드를 제조하였다.
구분 폴리펩티드 비오틴
모이어티		 비오틴
모이어티의
결합위치
실시예11 서열번호 12:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC		 B5 C40
1) 제조예
반응 용매는 0.3 % 트리에틸아민 (TEA, Sigma사)이 첨가된 DMSO 용액으로 하여, 서열번호 12의 폴리펩티드와 상기 표 3의 B5를 몰비 1:2로 하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 혼합물의 부피와 같은 부피의 1 % 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid)이 함유된 30% 아세토니크릴/증류수 용액을 가하여 멈추게 하였다.
2) 분리 정제 및 확인
상기 실시예 11 반응 생성물을 역상 HPLC로 분리 및 정제하였다.
칼럼은 SUPERSIL ODS-1 column (10x250 mm, 5 μm, LB Science,South Korea)을 사용하였으며, 이동상 조건은 30-50 % 용매 B(0.1 % TFA가 첨가된 아세토나이트릴)과 용매 A(0.1 % TFA가 첨가된 증류수)로 4.7 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. UV흡광계 280 nm에서 모니터링하며 11분에서 13분 사이에 검출되는 피크를 수거하였다. 수거된 피크는 유기용매 및 TFA를 진공하에서 휘발시킨 후 적절한 분자량 컷오프를 가진 ultracentrifugal filter를 사용하여 농축, 정제하였다. 정제된 물질의 순도는 HPLC 분석법을 통해 확인하였다. Gemini C18 컬럼 (4.6x250 mm, 5 μm; Phenomenex, CA, USA)을 컬럼오븐 50도 조건에서 분석하였다. 분석은 트리플루오로아세트산시액: 아세토니트릴혼합액(혼합비를 70:30에서 20분 후 50:50가 되도록 한다)으로 이루어진 이동상을 사용하여 1 mL/min의 유속을 사용하였으며 UV 검출기는 280 nm에서 관찰하였다.
도 11은 실시예 11의 역상 크로마토그램이다. 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드의 단일 피크로 확인되었으며, 이외의 다른 피크는 관찰되지 않았다. 크로마토그램으로부터 발생한 피크의 면적을 백분율로 나타냈을 때, 순도가 90% 이상인 것을 확인하였다.
3) 분자량 확인
상기 실시예 11에서 얻어진 최종 물질의 분자량을 측정하였다.
분자량은 MALDI-TOF 질량분석법을 통해 확인하였다. 매트릭스 용액으로는 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 0.1 % TFA를 함유한 50 % 아세토니트릴에 포화시킨 용액을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 선형 및 양성 모드에서 확인하였다.
도 12는 실시예 10 및 실시예 11의 MALDI-TOF 질량분석스펙트럼이다. 도 12를 참조하면, MALDI-TOF 질량분석을 통하여 분리한 물질들의 분자량이 이론상의 분자량과 일치함을 확인하였다.
<실시예 12 및 13>
상기 표 3에 기재된 비오틴 모이어티 B4와 하기 표 11에 기재된 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용하여 비오틴모이어티가 결합된 폴리펩티드를 제조하였다.
구분 단백질 비오틴
모이어티		 비오틴
모이어티의
결합위치
실시예12 서열번호 15:
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN(A쇄)
서열번호 16
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(B쇄)
A쇄의 C6-A쇄의 C11, A쇄의 C7-B쇄의 C7, A쇄의 C20-B쇄의 C19 사이에 이황화결합이 존재하는 단백질		 B4 B쇄의 K29
실시예13 서열번호 15:
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN(A쇄)
서열번호 16
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(B쇄)
A쇄의 C6-A쇄의 C11, A쇄의 C7-B쇄의 C7, A쇄의 C20-B쇄의 C19 사이에 이황화결합이 존재하는 단백질		 B4 B쇄의 F1과 B쇄의 K29
1) 제조예
반응 용매는 0.3 % 트리에틸아민 (TEA, Sigma사)이 첨가된 DMSO 용액으로 하여, 서열번호 15 및 16의 아미노산 서열을 가지는 단백질과 상기 표 3의 B4를 몰비 1:16로 하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 실온에서 2시간동안 반응시킨 후 혼합물의 부피와 같은 부피의 1 % 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid)이 함유된 30% 아세토니크릴/증류수 용액을 가하여 멈추게 하였다.
2) 분리 정제 및 확인
상기 실시예 12 및 13 반응 생성물을 역상 HPLC로 분리 및 정제하였다.
칼럼은 SUPERSIL ODS-1 column (10x250 mm, 5 μm, LB Science, South Korea)을 사용하였으며, 이동상 조건은 30-40 % 용매 B(0.1 % TFA가 첨가된 아세토나이트릴)과 용매 A(0.1 % TFA가 첨가된 증류수)로 4.7 ml/min 유속을 유지하면서 선형적으로 변화시켰다. UV흡광계 280 nm에서 모니터링하며 12.7분에 검출되는 피크를 수거하였다. 수거된 피크는 유기용매 및 TFA를 진공하에서 휘발시킨 후 적절한 분자량 컷오프를 가진 ultracentrifugal filter를 사용하여 농축, 정제하였다. 정제된 물질의 순도는 HPLC 분석법을 통해 확인하였다. 실온 부근의 일정 온도에서 Gemini C18 칼럼(4.6x250 mm, 5 μm; Phenomenex, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 분석은 트리플루오로아세트산 시액: 아세토니트릴 혼합액(혼합비를 70:30에서 20분 후 50:50가 되도록 한다)으로 이루어진 이동상을 사용하여 1 mL/min의 유속을 사용하였으며 UV 검출기는 280 nm에서 관찰하였다.
도 13은 실시예 12 및 13에 대한 정제 크로마토그램이다. 반응하지 않은 서열번호 7의 폴리펩티드가 12.1분에 검출되었고, 비오틴 모이어티가 결합된 실시예 12의 물질이 12.3분, 실시예 13의 물질이 12.5분에 검출되었다.
도 14는 실시예 12의 정제 후의 크로마토그램이다. 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드의 단일 피크로 확인되었으며, 이외의 다른 피크는 관찰되지 않았다. 크로마토그램으로부터 발생한 피크의 면적을 백분율로 나타냈을 때, 순도가 95% 이상인 것을 확인하였다.
도 15은 실시예 13의 정제 후의 크로마토그램이다. 비오틴 모이어티와 결합된 폴리펩티드의 단일 피크로 확인되었으며, 이외의 다른 피크는 관찰되지 않았다. 크로마토그램으로부터 발생한 피크의 면적을 백분율로 나타냈을 때, 순도가 95% 이상인 것을 확인하였다.
3) 분자량 확인
상기 실시예 12 및 13에서 얻어진 최종 물질의 분자량을 측정하였다.
분자량은 MALDI-TOF 질량분석법을 통해 확인하였다. 매트릭스 용액으로는 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 0.1 % TFA를 함유한 50 % 아세토니트릴에 포화시킨 용액을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 선형 및 양성 모드에서 확인하였다.
[평가]
실시예 10과 11의 혈당 조절능 측정
내당능을 확인하기 위해 경구용 GLP-1 작용제 제형의 실시예 10과 11을 마우스에 경구 투여 후 복강 내 당부하 검사를 통해 혈당조절 효능을 측정하였다.
동물모델에서의 복강 내당력을 측정하기 위해 9주령 된 수컷 마우스(C57BL/6)에 상기 실시예 10 과 11에서 제조된, 비오틴 모이어티가 결합된 폴리펩티드를 100 ㎕ (10 ug/mouse)를 -20분에 경구 투여한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (2g/kg)를 복강주사 하고 -20, 0, 20, 40, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다. 한편, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엑센딘-4를 경구 투여한 것을 대조군으로 하였다.
도 7은 각 시료에 대하여 글루코오스(glucose)를 투여한 후 혈당 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7과 같이, 실시예 10 내지 11은 글루코오스 조절 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 12와 13의 생물학적 활성 측정
비오틴 모이어티의 결합 전후 폴리펩티드의 생물학적 활성을 비교하였다. 또한, 비오틴 모이어티의 결합 부위에 따른 생물학적 활성을 비교하였다.
구체적으로, PathHunter® Insulin Bioassay Kit(DiscoverX, #93-0466Y3-00007)를 사용하여 생물학적 활성을 측정하였다.
PathHunter U2OS INSRb Bioassay 세포를 96-well plate에 세포를 분주한 후 AssayComplete™Cell Plating Reagent 5(CP5)에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음 각각의 약물을 300, 60, 20, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.05, 0.01의 농도로 well 당 20 ㎕씩 첨가하였다. 3시간의 배양 시간이 지난 후 검출시약1을 10 ㎕ 첨가하여 15분간 반응한 뒤 검출시약2를 40 ㎕ 첨가하여 60분간 반응시켰다. 그 다음 96-well microplate reader로 발광 (luminescence)을 측정하였다. 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 A쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 B쇄로 구성된 단백질을 대조군으로 하였다. 여기서 단백질은 A쇄의 C6-A쇄의 C11, A쇄의 C7-B쇄의 C7, A쇄의 C20-B쇄의 C19 사이에 이황화결합이 존재한다.
　
　		 EC50 (ng/mL)
대조군 4.06
실시예 12 19.58
실시예 13 55.31
실시예 12와 13의 혈당 조절능 측정
내당능을 확인하기 위해 경구용 단백질 제형의 실시예 12와 13을 마우스에 경구 투여 후 복강 내 당부하 검사를 통해 혈당조절 효능을 측정하였다.
동물모델에서의 복강 내당력을 측정하기 위해 9주령된 수컷 마우스(C57BL/6)에 상기 실시예 12와 13에서 제조된, 비오틴 모이어티가 결합된 폴리펩티드를 100 ㎕ (10 ug/mouse)를 -20분에 경구 투여한 후, 200 ㎕의 글루코오스 (2g/kg)를 복강주사 하고 -20, 0, 20, 40, 60, 90, 120분에 꼬리 정맥에서 채취한 혈액에서의 혈당 변화를 관찰하였다. 한편, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 A쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 B쇄로 구성된 단백질을 경구 투여한 것을 대조군으로 하였다.
도 8은 각 시료에 대하여 글루코오스(glucose)를 투여한 후 혈당 변화를 나타내는 그래프이다. 도 8과 같이, 실시예 12 내지 13은 글루코오스 조절 능력이 있음을 확인하였다.
당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등물에 대해, 단지 일상적 실험을 사용하여 이를 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명된 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명된 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석될 수 있다.
<110> D&D Pharmatech Inc. <120> Physiological active materials linked biotin moiety and composition for oral administration comprising the same <130> PB2020-128 <150> KR 10-2019-0064370 <151> 2019-05-31 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is aminoisobutyric acid (Aib) <400> 1 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 3 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 4 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 6 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 7 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn 20 25 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is aminoisobutyric acid (Aib) <400> 8 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 9 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys 20 25 30 <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 10 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Cys <210> 11 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 11 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln Cys 35 40 <210> 12 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 13 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 13 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Cys 35 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 14 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 15 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Physiological acitve materials <400> 17 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20

Claims (52)

  1. 비오틴 모이어티(moiety)와 결합된 생리활성 물질이고,
    여기에서 비오틴 모이어티는 생리활성 물질의 비활성 부위에 결합되며,
    상기 생리활성 물질은 노출된 -SH기, 노출된 -NH3 +기 또는 -NH2기를 함유하는 폴리펩티드(polypeptide) 또는 비펩티드성 중합체이고,
    상기 비오틴 모이어티는 하기 일반식 A로 표시되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질:
    [일반식 A]
    Figure 112022071960528-pat00086

    X는 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트, 석신이미딜 메틸에스터, 석신이미딜 펜틸에스터, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 알데하이드, 아민, 티올, 옥시아민, 아이오도아세트아마이드, 아미녹실, 하이드라지드, 하이드록시, 프로피오네이트, 피리딜, 알킬할라이드, 비닐술폰, 카복실, 하이드라지드, 할로겐 아세트아마이드, C2-5알키닐, C6-20아릴디설파이드, C5-20헤테로아릴디설파이드, 이소시아네이트, 티오에스테르, 및 이미노에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    Y는 부재하거나; 치환되거나 비치환된 선형 또는 분지형 C1-50 알킬렌; 또는 치환된 선형 또는 분지형 C1-50헤테로알킬렌이고,
    여기에서, 치환된 경우 =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고;
    Z는 하기 A) 또는 B) 중 어느 하나인 바인딩 유닛이며;
    A) X와 함께 또는 X와 별도로, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민, 아스파라긴, 아스파트산, 트레오닌, 시스테인 또는 세린을 형성하거나,
    B)
    Figure 112022071960528-pat00087
    를 포함하고, 상기 결합부위의 하나 이상에
    Figure 112022071960528-pat00088
    가 하나 이상 결합되고, 여기에서 u는 1 내지 20의 정수이고;
    B는 하기 화학식 A-1로 표시되며,
    [화학식 A-1]
    Figure 112022071960528-pat00089

    Z는 화학식 A-1의
    Figure 112022071960528-pat00090
    와 연결되고,
    T는 아민, C1-8알킬, C1-8알케닐, 할로, 하이드록시, 티올, 설폰산, 카르복실, 페닐, 벤질, 알데하이드, 아자이드, 사이아네이트, 아이소사이아네이트, 티오사이아네이트, 아이소티오사이아네이트, 나이트릴 및 포스폰산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 말단기이며,
    m은 1 내지 10의 정수이고,
    n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, n=0인 경우 Y는 B 또는 T에 직접결합하고,
    p는 0 또는 1의 정수이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 N-말단을 포함하고, 상기 N-말단에 비오틴 모이어티가 결합하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은, 글루카곤(Glugacon), GLP-1(Glucagon-like peptide-1), GLP-2(Glucagon-like peptide-2), GIP(glucose-dependent insulinotropic polypeptide), 엑센딘-4(exendin-4), 인슐린, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 에리트로포이에틴, 칼시토닌, 세로토닌, 리툭시맙, 트라스트주맙, 우리카제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 티모글로빈, 백신, 헤파린 또는 헤파린 유사체, 안티트롬빈 III, 필그라스팀, 프라믈린티드(pramlintide) 아세테이트, 엑세나티드, 에프티피바티드(eptifibatide), 안티베닌(antivenin), IgG, IgM, HGH, 티록신, 혈액 응고 인자 VII 및 VIII, 단클론성 항체, 및 치료제로서 작용하는 당지질로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은, 서열번호 1 내지 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 또는 서열번호 17 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서열번호 15 및 서열번호 16, 또는 서열번호 17 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 15 또는 17의 6번째 및 11번째 시스테인, 서열번호 15 또는 17의 7번째 및 서열번호 16의 7번째 시스테인, 및 서열번호 15 또는 17의 20번째 및 서열번호 16의 19번째 시스테인 간 이황화결합으로 결합된 단백질인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 리신 아미노산의 -NH3 +기, -NH2기 또는 N-말단에 비오틴 모이어티가 결합하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 물질은,
    서열번호 1 내지 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드의 비활성 부위의 아미노산 중 어느 하나 이상이 시스테인 아미노산으로 치환 또는 삽입된 폴리펩티드이고,
    상기 시스테인 아미노산의 -SH기에 비오틴 모이어티가 결합하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은,
    서열번호 8 내지 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 X는 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트, 석신이미딜 메틸에스터, 석신이미딜 펜틸에스터, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 알데하이드, 아민, 티올, 옥시아민, 아이오도아세트아마이드, 아미녹실, 하이드라지드, 하이드록시, 프로피오네이트, 피리딜, 알킬할라이드, 비닐술폰, 카복실, 하이드라지드, 할로겐 아세트아마이드, C2-5 알키닐, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 이소시아네이트, 티오에스테르, 및 이미노에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 X는 말레이미드, N-하이드록시석신이미드, 알데하이드 또는 아민인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서,
    상기 Y는 치환된 선형 또는 분지형 C1-50 헤테로알킬렌이고,
    여기에서, 치환된 경우 =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며, 최소 하나 이상의 -C(O)-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 Y는 -(CH2)rC(O)NHNH-이고, 여기에서 r은 1 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수이고, -C(O)-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수이고, -C(O)NH-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  21. 삭제
  22. 제1항에 있어서,
    상기 Z는 B와 -NH-를 통해 연결되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 Z는 친수성 아미노산인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 Z는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 시스테인 및 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 Z는 하나 이상의 글리세롤, 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 결합을 포함하는, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 Z는
    Figure 112022071960528-pat00091
    를 포함하고,
    Figure 112022071960528-pat00092
    는 결합부위를 나타내며,
    상기 결합부위의 하나 이상에
    Figure 112022071960528-pat00093
    가 하나 이상 결합되고, 여기에서 u는 1 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  27. 제1항에 있어서,
    상기
    Figure 112022071960528-pat00094
    에 -(CH2)3NH-가 더 결합되는 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  28. 삭제
  29. 제1항에 있어서,
    상기 T는 아민인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  30. 제1항에 있어서,
    상기 비오틴 모이어티는
    Figure 112022071960528-pat00095
    ,
    Figure 112022071960528-pat00096
    ,
    Figure 112022071960528-pat00097
    ,
    Figure 112022071960528-pat00098
    ,
    Figure 112022071960528-pat00099
    ,
    Figure 112022071960528-pat00100
    ,
    Figure 112022071960528-pat00101
    ,
    Figure 112022071960528-pat00102
    ,
    Figure 112022071960528-pat00103
    ,
    Figure 112022071960528-pat00104
    ,
    Figure 112022071960528-pat00105
    ,
    Figure 112022071960528-pat00106
    및
    Figure 112022071960528-pat00107
    로 구성된 그룹으로부터 선택된 것인, 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질.
  31. 제1항에 따른 생리활성 물질을 포함하는, 경구용 조성물.
  32. a. 제1항에 따른 비오틴 모이어티와 결합된 생리활성 물질; 및
    b. 상기 생리활성 물질을 인간에 투여하기 위한 지시 자료를 포함하는, 키트.
  33. 하기 일반식 A로 표시되는, 비오틴 모이어티;
    [일반식 A]
    Figure 112022071960528-pat00108

    X는 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트, 석신이미딜 메틸에스터, 석신이미딜 펜틸에스터, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 알데하이드, 아민, 티올, 옥시아민, 아이오도아세트아마이드, 아미녹실, 하이드라지드, 하이드록시, 프로피오네이트, 피리딜, 알킬할라이드, 비닐술폰, 카복실, 하이드라지드, 할로겐 아세트아마이드, C2-5알키닐, C6-20아릴디설파이드, C5-20헤테로아릴디설파이드, 이소시아네이트, 티오에스테르, 및 이미노에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    Y는 부재하거나; 치환되거나 비치환된 선형 또는 분지형 C1-50 알킬렌; 또는 치환된 선형 또는 분지형 C1-50헤테로알킬렌이고,
    여기에서, 치환된 경우 =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고;
    Z는 하기 A) 또는 B) 중 어느 하나인 바인딩 유닛이며;
    A) X와 함께 또는 X와 별도로, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민, 아스파라긴, 아스파트산, 트레오닌, 시스테인 또는 세린을 형성하거나,
    B)
    Figure 112022071960528-pat00109
    를 포함하고, 상기 결합부위의 하나 이상에
    Figure 112022071960528-pat00110
    가 하나 이상 결합되고, 여기에서 u는 1 내지 20의 정수이고;
    B는 하기 화학식 A-1로 표시되며,
    [화학식 A-1]
    Figure 112022071960528-pat00111

    Z는 화학식 A-1의
    Figure 112022071960528-pat00112
    와 연결되고,
    T는 아민, C1-8알킬, C1-8알케닐, 할로, 하이드록시, 티올, 설폰산, 카르복실, 페닐, 벤질, 알데하이드, 아자이드, 사이아네이트, 아이소사이아네이트, 티오사이아네이트, 아이소티오사이아네이트, 나이트릴 및 포스폰산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 말단기이며,
    m은 1 내지 10의 정수이고,
    n은 0 또는 1 내지 10의 정수이며, n=0인 경우 Y는 B 또는 T에 직접결합하고,
    p는 0 또는 1의 정수이다.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 X는 말레이미드, 석신이미드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 석시네이트, 석신이미딜 글루타레이트, 석신이미딜 메틸에스터, 석신이미딜 펜틸에스터, 석신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 알데하이드, 아민, 티올, 옥시아민, 아이오도아세트아마이드, 아미녹실, 하이드라지드, 하이드록시, 프로피오네이트, 피리딜, 알킬할라이드, 비닐술폰, 카복실, 하이드라지드, 할로겐 아세트아마이드, C2-5 알키닐, C6-20 아릴디설파이드, C5-20 헤테로아릴디설파이드, 이소시아네이트, 티오에스테르 및 이미노에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 비오틴 모이어티.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 X는 말레이미드, N-하이드록시석신이미드, 알데하이드 또는 아민인, 비오틴 모이어티.
  36. 삭제
  37. 제33항에 있어서,
    상기 Y는 치환된 선형 또는 분지형 C1-50 헤테로알킬렌이고,
    여기에서, 치환된 경우 =O, -C(O)NH2, -OH, -COOH, -SH, =NH 및 -NH2로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며, 최소 하나 이상의 -C(O)-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티.
  38. 제33항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티.
  39. 제33항에 있어서,
    상기 Y는 -(CH2)rC(O)NHNH-이고, 여기에서 r은 1 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티.
  40. 제33항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수이고, -C(O)-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티.
  41. 제33항에 있어서,
    상기 Y는 -(C(O))q-(CH2)r-(C(O)NH)s-(CH2)r-(OCH2CH2)t-(C(O))q-이고,
    여기에서 q, r, s, t는 독립적으로 선택되며,
    q, s는 0 또는 1이고,
    r은 1 내지 20의 정수이며,
    t는 0 내지 20의 정수이고, -C(O)NH-를 포함하는 것인, 비오틴 모이어티.
  42. 삭제
  43. 제33항에 있어서,
    상기 Z는 B와 -NH-를 통해 연결되는 것인, 비오틴 모이어티.
  44. 제33항에 있어서,
    상기 Z는 친수성 아미노산인, 비오틴 모이어티.
  45. 제33항에 있어서,
    상기 Z는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 시스테인 및 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 비오틴 모이어티.
  46. 제33항에 있어서,
    상기 Z는 하나 이상의 글리세롤, 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 결합을 포함하는, 비오틴 모이어티.
  47. 제33항에 있어서,
    상기 Z는
    Figure 112022071960528-pat00113
    를 포함하고,
    Figure 112022071960528-pat00114
    는 결합부위를 나타내며,
    상기 결합부위의 하나 이상에
    Figure 112022071960528-pat00115
    가 하나 이상 결합되고, 여기에서 u는 1 내지 20의 정수인, 비오틴 모이어티.
  48. 제33항에 있어서,
    상기
    Figure 112022071960528-pat00116
    에 -(CH2)3NH-가 더 결합되는 것인, 비오틴 모이어티.
  49. 삭제
  50. 제33항에 있어서,
    상기 T는 아민인, 비오틴 모이어티.
  51. 제33항에 있어서,
    다음 화학식:
    Figure 112022071960528-pat00117
    ,
    Figure 112022071960528-pat00118
    ,
    Figure 112022071960528-pat00119
    ,
    Figure 112022071960528-pat00120
    ,
    Figure 112022071960528-pat00121
    ,
    Figure 112022071960528-pat00122
    ,
    Figure 112022071960528-pat00123
    ,
    Figure 112022071960528-pat00124
    ,
    Figure 112022071960528-pat00125
    ,
    Figure 112022071960528-pat00126
    ,
    Figure 112022071960528-pat00127
    ,
    Figure 112022071960528-pat00128
    및
    Figure 112022071960528-pat00129
    로 구성된 그룹으로부터 선택된 것인, 비오틴 모이어티.
  52. 삭제
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