KR20210141748A - 신규한 인슐린 유사체 및 이의 용도 - Google Patents

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헬레 버크 올센
페터 마드센
토마스 보글럼 키옐드센
예페 스투리스
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Abstract

본 발명은 당뇨병과 관련된 의학적 병태에 대한 약물 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 인슐린의 인슐린 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물 및, 당뇨병과 관련된 의약적 병태의 치료 또는 예방을 위한 이러한 유사체의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 인슐린 유사체 및 이의 용도
기술분야
본 발명은 인간 인슐린의 신규한 유사체, 이러한 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물, 및 당뇨병과 관련된 의학적 병태의 치료 또는 예방을 위한 이러한 유사체의 용도에 관한 것이다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
당뇨병 치료를 위한 인슐린 요법은 수십 년 동안 사용되어 왔다. 인슐린 요법의 주요 개선점 중 하나는 속효성 인슐린 유사체의 도입이었다.
인슐린은 자체 결합 특성을 가지며, 그 농도는 자체 결합의 주요 인자를 나타낸다. 특히 약학적 조성물에서, 고농도인 인슐린은 이량체, 육량체, 도데카머, 또는 더 높은 분자 구조로 자체 결합하게 된다. 그러나, 인슐린의 생리학적 활성 형태는 인슐린 수용체와 결합하여 생물학적 반응을 유발하는 단량체이다. 특히 약학적 조성물에서 고농도인 인슐린 유사체의 자체 결합을 감소시키는 것은 어렵다.
인슐린 작용의 급속성은 인슐린이 피하 조직으로부터 얼마나 빨리 흡수되는지에 따라 달라진다. 일반적으로, 상업적으로 이용 가능한 인슐린 조성물이 피하 주입될 때, 조성물은 주로 2개의 아연 이온을 함유하는 육량체로 구성된다. 비록 육량체 내에 위치한 이들 2개의 아연 이온이 조성물 중에서 분자의 크기로 인한 화학적 및 물리적 분해에 대해 분자를 안정화시키지만, 육량체 인슐린은 확산 속도가 더 낮아서, 결과적으로 흡수 속도가 더 작은 종의 경우보다 느리다.
WO2017/032795 및 WO2017/032798은 저 아연 또는 무아연 조성물 중의 아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이다.
무아연 인슐린 조성물은 보다 빠른 피하 흡수를 가능하게 하지만, 무아연 조성물의 화학적 및 물리적 안정성, 특히 고농도일 때의 안정성 문제를 해결해야 한다.
속효성이면서, 동시에 고농도의 무아연 조성물일 때에도 물리적 및 화학적으로 충분히 안정한 인슐린 유사체가 매우 필요하다.
가장 넓은 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 속효성 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, 위치 A9에서 아미노산 변형을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 5 내지 10개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하는 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고/하거나 B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고/하거나 B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하고 A21Ala 치환을 추가로 포함하는 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 무아연 약학적 조성물에서 단량체인 인슐린 유사체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 무아연 약학적 조성물에서 물리적으로 및/또는 화학적으로 안정한 인슐린 유사체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 무아연 약학적 조성물에서 고농도에서도 화학적 및 물리적으로 안정한 단량체이다.
일 양태에서, 본 발명은 피하 투여 후 보다 신속하게 흡수되어, 속효성 인슐린(볼루스 또는 식사 인슐린으로도 불림)으로서의 강력한 임상적 유용성을 나타내는 인슐린 유사체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유사체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 무아연 약학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인슐린 전달 시스템과 호환 가능하다.
추가 양태에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 폐쇄 루프(closed loop) 인슐린 전달 시스템과 호환 가능하다.
추가 양태에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 인슐린 펌프에 사용하기에 적합하다.
본 발명은 예시적인 구현예의 개시로부터 명백해지는 추가적인 문제를 해결할 수도 있다.
도 1은 LYD 돼지에게 투여한 본 발명의 약학적 조성물 C 중 실시예 1 및 실시예 2의 인슐린 유사체의 PD 프로파일을 Fiasp®(인슐린 아스파르트)와 비교해 보여준다.
도 2는 LYD 돼지에게 투여한 본 발명의 약학적 조성물 C 중 실시예 1 및 실시예 2의 인슐린 유사체의 PK 프로파일을 Fiasp®(인슐린 아스파르트)와 비교해 보여준다.
본 발명은 단량체인 속효성 인슐린 유사체에 관한 것으로서, 상기 유사체는 무아연 약학적 조성물에서 허용 가능한 화학적 및 물리적 안정성을 제공하고, 상업적으로 이용 가능한 Fiasp®(인슐린 아스파르트)보다 피하 투여 후 더 빨리 흡수된다.
정의
본 명세서에 달리 언급되지 않는 한, 단수 형태로 제시된 용어는 복수인 형태도 포함한다.
용어 "발명" 및 "본 발명"은 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "약"은 본원에서 ±10%, 예컨대 ±5%를 의미하도록 의도된다. 따라서, 용어 "약 100 U"는 90 U 내지 110 U이다.
다음 표는 인간 인슐린의 농도(mM 단위) 및 인간 인슐린과 동등한 상응하는 농도(U 단위)를 제공한다:
Figure pct00001
용어 "아미노산"은 단백질생성(또는 천연) 아미노산(그 20개 표준 아미노산 중에서) 뿐만 아니라, 비단백질생성(또는 비천연) 아미노산을 포함한다. 단백질생성 아미노산은 자연적으로 단백질에 통합되는 것이다. 표준 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것이다. 비단백질생성 아미노산은 단백질에서는 발견되지 않거나, 표준 세포 기구에 의해 생성되지 않는다(즉, 번역 후 변형의 대상이 될 수 있다).
일반적으로, 본원에서 사용된 것과 같은 아미노산 잔기(펩티드/단백질 서열)는 이들의 완전한 명칭, 이들의 1자 코드 및/또는 3자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이들 세 가지 방법은 완전히 동등하며 상호교환적으로 사용 가능하다. 예를 들어: 아스파르트산은 Asp 또는 D로 표시되고; 글루탐산은 Glu 또는 E로 표시되며; 알라닌은 Ala 또는 A로 표시된다.
다음으로, 광학 이성질체가 언급되지 않은 본 발명의 펩티드의 각 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 아미노산은 아미노기 및 카복실산기를 함유하는 분자이며, 종종 측쇄로서 지칭되는 하나 이상의 추가적인 기를 임의로 함유한다. 본원에서, 용어 "아미노산 잔기"는 형식적으로 히드록시기가 카복시기로부터 제거되었고/되었거나, 형식적으로 수소 원자가 아미노기로부터 제거된 아미노산이다.
용어 "화합물"은 분자 엔티티를 지칭하도록 본원에서 사용되며, 따라서 "화합물"은 화합물 군의 각 화합물에 대해 정의된 최소 성분 이외에 상이한 구조적 성분을 가질 수 있다. 용어 "화합물"은 또한 이의 약학적으로 관련된 형태를 포함하도록 의도되며, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 인슐린"은 구조 및 특성이 잘 알려져 있는 인간 인슐린 호르몬을 의미한다. 인간 인슐린은 A-사슬과 B-사슬로 명명된 2개의 폴리펩티드 사슬을 갖는다. A-사슬은 21개 아미노산 펩티드이고, B-사슬은 30개 아미노산 펩티드이며, 2개의 사슬은 다음의 이황화 브리지에 의해 연결된다: A-사슬의 위치 7에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 7에 있는 시스테인 사이의 제1 브리지; 및 A-사슬의 위치 20에 있는 시스테인과 B-사슬의 위치 19에 있는 시스테인 사이의 제2 브리지. 제3 브리지는 A-사슬의 위치 6에 있는 시스테인과 11에 있는 시스테인 사이에 존재한다.
인간 인슐린 A-사슬은 다음 서열: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(서열번호 1)을 갖는 반면, B-사슬은 다음 서열을 갖는다: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(서열번호 2).
인간 신체에서, 호르몬은 24개의 아미노산으로 이루어진 단쇄 전구체 프로인슐린(인슐린전구물질)으로서 합성되고, 86개의 아미노산을 포함하는 프로인슐린이 이 구성(프리펩티드-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A)에 이어지며, 여기서 C는 31개 아미노산의 연결 펩티드이다. Arg-Arg 및 Lys-Arg는 A 및 B 사슬로부터 연결 펩티드를 절단하기 위한 절단 부위이다.
본 발명에 따른 "인슐린"은 본원에서 인간 인슐린, 또는 돼지 또는 소 인슐린과 같이 다른 종에서 유래된 인슐린으로서 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "속효성 인슐린(rapid-acting insulin)"은, 주사 후 약 15분 시점에 작용하기 시작하고, 약 1시간 내에 피크에 도달하며, 2 내지 4시간 동안 지속되는 본 발명에 따른 인슐린 유사체를 의미한다. 유형: 인슐린 글루리신(Apidra), 인슐린 리스프로(Admelog, Humalog), 및 인슐린 아스파르트(Fiasp, NovoLog).
본원에서 사용되는 "인슐린 펩티드", "인슐린 화합물", 또는 "인슐린"은 인슐린 활성을 갖는, 즉 인슐린 수용체를 활성화시키는 인간 인슐린 또는 이의 유사체를 의미한다.
명명법
본 발명의 인슐린 유사체의 명명은 다음 원리에 따라 수행된다:
예를 들어, 인슐린 유사체 B3E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린이란: 위치 B3에 있는 아미노산인 아스파라긴(N)이 글루탐산(E)으로 치환되었고; 인간 인슐린의 위치 B27에 있는 아미노산인 트레오닌(T)이 글루탐산(E)으로 치환되었고; 인간 인슐린의 위치 B28에 있는 아미노산인 프롤린(P)이 글루탐산(E)으로 치환되었고; 인간 인슐린의 위치 B30에 있는 아미노산인 트레오닌(T)이 결실되었음을 나타낸다.
인슐린 유사체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린으로부터 결실되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린에 추가 및/또는 삽입된, 변형된 인간 인슐린을 의미한다. 용어 "인슐린 유사체" 또는 "인간 인슐린의 유사체"는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 변형"은 인간 인슐린 대비 아미노산의 치환, 결실, 첨가, 또는 삽입 및 이들의 임의의 조합을 의미한다.
인슐린 분자에서의 변형은 사슬(A 또는 B), 위치, 및 천연 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 대한 1자 또는 3자 코드를 나타내는 것으로 표시된다.
일 구현예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린에 대해 최대 10개의 아미노산 변형(치환, 결실, 추가(삽입 포함) 및 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 대안적으로는 인간 인슐린에 대해 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변형을 포함한다.
특정한 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는 인간 인슐린 사슬 A(서열번호 1) 및/또는 사슬 B(서열번호 2)와 비교했을 때 추가의 변화를 포함할 수 있다.
"연결 펩티드" 또는 "C-펩티드"는 단쇄 프로인슐린 분자의 B-C-A 폴리펩티드 서열 중 연결 모이어티 "C"를 의미한다. 인간 인슐린 사슬에서, C-펩티드는 B 사슬의 위치 30과 A 사슬의 위치 1을 연결하고, 35개 아미노산 잔기 길이이다. 연결 펩티드는 2개의 말단 이염기 아미노산 서열, 예를 들어 Arg-Arg 및 Lys-Arg를 포함하는데, 이들은 A 및 B 사슬로부터 연결 펩티드를 절단해 2쇄 인슐린 분자를 형성하기 위한 절단 부위의 역할을 한다.
"desB30" 또는 "B(1-29)"는 B30 아미노산이 결여된 천연 인슐린 B 사슬 또는 이의 유사체를 의미하고, "A(1-21)"은 천연 인슐린 A 사슬을 의미한다. 따라서, 예를 들어, desB30 인간 인슐린은 B 사슬의 위치 30에 있는 아미노산이 결실된 인간 인슐린의 유사체이다.
예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은, 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호 연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호 연결된 아미노산으로 구성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 제제의 "화학적 안정성"이란 용어는 천연 단백질 구조와 비교하여 감소된 생물학적 효능을 가질 수 있고/있거나 증가된 면역원성 특성을 가질 수 있는 화학적 분해 산물의 형성으로 이어지는 공유 단백질 구조의 변화를 지칭한다. 천연 단백질의 유형과 성질 및 이러한 단백질이 노출되는 환경에 따라 다양한 화학적 분해 산물이 형성될 수 있다. 단백질 제제를 보관하고 사용하는 동안에 화학적 분해 산물의 양 증가가 흔히 관찰된다. 대부분의 단백질은 탈아미드화되기 쉬운데, 탈아미드화는 글루타미닐 잔기 또는 아스파라기닐 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 유리 카르복시산 또는 아스파라기닐 잔기를 형성하여 isoAsp 유도체를 형성하는 공정이다. 다른 분해 경로는 고 분자량 생성물(HMWP)의 형성을 수반하는데, 이 경우 2개 이상의 단백질 분자는, 예를 들어, 트랜스아미드화 및/또는 이황화 상호작용을 통해 서로 공유 결합되어 공유 결합된 이량체, 올리고머, 및 중합체 분해 생성물을 형성한다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern TJ & Manning MG, Plenum Press, New York 1992). 산화는 화학적 분해의 다른 변이체로서 언급될 수 있다. 단백질 제제의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출시킨 후 다양한 시점에 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다(분해 산물의 형성은 종종 예를 들어 온도 증가에 의해 가속될 수 있다). 각각의 개별 분해 산물의 양은 종종 다양한 크로마토그래피 기술(예: SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 사용해 분자 크기, 소수성, 및/또는 전하에 따라 분해 산물을 분리함으로써 결정된다. HMWP 산물은 잠재적으로 면역원성이고 생물학적으로 활성이 아니므로, 낮은 수준의 HMWP가 유리하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인슐린 제제의 "물리적 안정성"이란 용어는, 열-기계적 응력에 단백질을 노출시키고/시키거나 소수성 표면 및 계면과 같은 불안정한 계면 및 표면과 단백질을 상호작용시킨 결과로서 생물학적으로 비활성이고/이거나 불용성인 단백질 응집체를 형성하는 단백질의 경향을 지칭한다. 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은, 적합한 용기(예: 카트리지 또는 바이알)에 채워진 제제를 다양한 기간 동안 상이한 온도에서 기계적/물리적 응력(예: 교반)에 노출시킨 후, 육안 검사 및/또는 혼탁도 측정에 의해 평가한다. 제제의 육안 검사는 어두운 배경 하에 선명한 초점 조명에서 수행된다. 제제가 낮에 시각적 혼탁도를 나타낼 때, 제제는 단백질 응집에 대해 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다. 대안적으로, 제제의 혼탁도는 당업자에게 잘 알려진 간단한 혼탁도 측정에 의해 평가할 수 있다. 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은 단백질의 입체 구조 상태에 대한 분광 시약 또는 프로브를 사용하여 평가할 수도 있다. 프로브는 바람직하게는 단백질의 비천연 컨포머(conformer)에 우선적으로 결합하는 저분자이다. 단백질 구조의 저분자 분광 프로브의 일례는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 원섬유의 검출에 널리 사용되는 형광 염료이다. 원섬유가 존재하고, 다른 단백질 형태도 존재할 수 있다면, 티오플라빈 T는 약 450 nm에서 새로운 최대 여기를 나타내고, 섬유소 단백질 형태에 결합될 때 약 482 nm에서 방출을 강화시킨다. 결합되지 않은 티오플라빈 T는 상기 파장에서 본질적으로 비형광이다.
본원에서 사용되는 인슐린 제제의 "고농도"라는 용어는 200 U 이상; 1.2 mM 이상인 인슐린의 농도를 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, 위치 A9에서 아미노산 변형을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 1 내지 10개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, 인간 인슐린에 비해 위치 A9에서 아미노산 변형을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 위치 B3에서의 아미노산 변형 및/또는 desB30을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 1 내지 10개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인슐린 유사체로서, 인간 인슐린에 비해 A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 위치 B3에서의 아미노산 변형 및/또는 desB30을 추가로 포함하는 인슐린 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp 또는 A9Gln을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 또는 B3Gln 및/또는 desB30을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 5 내지 10개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 10개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 8개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 6개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 4개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 3개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, 인간 인슐린에 비해 최대 2개의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp 또는 A9Gln을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 또는 B3Glu, 및/또는 desB30을 추가로 포함하고, B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu 및/또는 desB30을 추가로 포함하고/하거나, B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하고/하거나 A21A 치환을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 인슐린의 유사체로서, A9Glu 또는 A9Asp 또는 A9Gln을 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3Glu, 또는 B3Gln, 및/또는 desB30을 추가로 포함하고/하거나, B26Glu, B27Glu, 및/또는 B28Glu 중 적어도 하나를 추가로 포함하고/하거나 A21A 치환을 추가로 포함하는 인간 인슐린의 유사체에 관한 것이다.
약학적 징후
당뇨병
용어 "당뇨병" 또는 "진성 당뇨병"은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병(임신 중) 및 고혈당증을 유발하는 다른 상태를 포함한다. 이 용어는 췌장이 인슐린을 불충분하게 생산하거나, 신체의 세포가 인슐린에 적절히 반응하지 않는, 세포가 포도당을 흡수하지 못하는 대사 장애에 사용된다. 그 결과, 포도당이 혈액 내에 축적된다.
인슐린-의존성 당뇨병(IDDM) 및 청소년-발병성 당뇨병이라고도 불리는 1형 당뇨병은 B-세포 파괴에 의해 야기되어, 일반적으로 절대적인 인슐린 결핍을 초래한다.
비-인슐린-의존성 당뇨병(NIDDM) 및 성인-발병성 당뇨병으로도 알려진 2형 당뇨병은 우세한 인슐린 저항성 및 이에 따른 상대적인 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성을 동반한 우세한 인슐린 분비 결함과 관련이 있다.
합성 방법
본 발명의 인슐린 유사체는 인슐린 유사체의 제조를 위한 종래의 방법, 특히 작업 실시예에 기술된 방법에 의해 수득될 수 있다.
생물학적 활성
본 발명의 인슐린 유사체는 속효성이다.
본 발명의 인슐린 유사체 모두는 필요한 혈당 반응을 제공하기 위해, 즉 동물 및 인간에서 혈당을 낮출 수 있도록 인슐린 수용체를 활성화하기에 적합한 인슐린 수용체 친화도를 갖는다. 본 발명의 인슐린의 기능적(작용적) 활성의 척도로서, 랫트 지방세포에서의 지방 생성 활성이 입증된다.
본 발명의 인슐린 유사체는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R)에 대한 인슐린 수용체(IR)의 균형잡힌 친화도 비율(IR / IGF-1R)을 갖는 것으로 밝혀졌다.
일 양태에서, 본 발명의 인슐린은 1 초과; 1.5 초과; 또는 2 초과의 IR / IGF-1R 비율을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 혈당 수준을 감소시키는 능력을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 인슐린 수용체를 활성화시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 혈당을 낮춘다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 자가 결합 특성을 감소시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 단량체이다.
일 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 또는 의약 또는 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 신규한 인슐린 유사체를 제공한다. 본 발명의 인슐린 유사체는 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병을 포함하는 대사 장애의 치료를 위한 의약으로서 특히 유용할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 의약으로서 유용하거나, 약학적 조성물/의약의 제조에 유용한 인슐린 유사체에 관한 것이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 포함하는 신규한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물에 흔히 사용되는 다른 부형체, 예를 들어, 보존제, 킬레이트제, 등장화제, 흡수 증강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 수성 제제, 즉 물을 포함하는 제제이다. 이러한 제제는 일반적으로 용액이다. 본 발명의 추가 구현예에서, 약학적 조성물은 수용액이다.
용어 "수성 제제"는 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 제제로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의된다.
본 발명의 일 구현예에서, 인슐린 제제는 본 발명의 인슐린 유사체의 수용액을 포함하되, 상기 인슐린 유사체는 약 0.1 mM 내지 약 20.0 mM; 보다 구체적으로 약 0.2 mM 내지 약 6.0 mM; 약 0.3 mM 내지 약 4.0 mM; 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 0.6 mM 내지 약 3.0 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 0.6 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 1.2 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 1.8 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 2.4 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 3 mM의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 3.6 mM의 농도이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 100 U 내지 약 600 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 100 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 200 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 300 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 400 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 500 U의 농도이다. 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 약 600 U의 농도이다.
본 발명의 약학적 조성물은 완충액 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 완충액의 농도는 약 0.1 mM 내지 20 mM의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 상기 완충액의 농도는 0.1 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 0.1 mM 내지 약 8 mM, 약 1 mM 내지 약 8 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 8 mM, 또는 3 mM 내지 7 mM의 범위이다. 본 발명의 일 구현예에서, 완충액은 인산염 완충액이다. 본 발명의 일 구현예에서, 인산염 완충액의 농도는 3mM이다. 본 발명의 일 구현예에서, 완충액은 트리스(Tris)이다. 본 발명의 일 구현예에서, 트리스 완충액의 농도는 7 mM이다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 완충액을 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 주사식 약학적 조성물의 pH는 3 내지 8.5의 범위이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 주사식 약학적 조성물은 약 7.0 내지 약 8.0 범위의 pH를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 7.4 내지 7.6의 범위이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 7.0이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 7.2이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 7.4이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 7.6이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 7.8이다. 본 발명의 일 구현예에서, pH는 8.0이다.
본 발명의 인슐린 제제는 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 등장화제는 글리세롤 및/또는 프로필렌 글리콜 및/또는 염화나트륨이고, 0 내지 약 250 mM, 0 내지 약 200 mM, 또는 0 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 230 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 233 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 230 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 200 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 200 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 195 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 195 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 185 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 185 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 165 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 163 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 130 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 등장화제는 103 mM의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 인슐린 제제는 약학적으로 허용 가능한 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 보존제는 보존 효과를 얻기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 중 보존제의 양은, 예를 들어, 당업계에서 문헌으로부터 및/또는 예를 들어, 상업적 제품 중 보존제의 알려진 양(들)으로부터 결정될 수 있다. 이들 특정 보존제 각각 또는 이들의 혼합물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다. 약학적 제제에서 보존제의 용도는, 예를 들어 Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]에 기술되어 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 주사식 약학적 조성물은 보존제로서 적어도 하나의 페놀 화합물을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 페놀 화합물은 최종 주사식 약학적 조성물의 최대 약 6 mg/mL, 특히 최종 주사식 약학적 조성물의 최대 약 4 mg/mL으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 페놀 화합물은 최종 주사식 약학적 조성물의 최대 약 4.0 mg/mL; 특히 약 0.5 mg/mL 내지 약 4.0 mg/mL; 또는 약 0.6 mg/mL 내지 약 4.0 mg/mL의 양으로 존재할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 보존제는 페놀이다. 본 발명의 일 구현예에서, 주사식 약학적 조성물은 보존제로서 페놀과 m-크레졸의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 주사식 약학적 조성물은 약 16 mM 페놀(1.5 mg/ml) 및 약 16 mM m-크레졸(1.72 mg/ml)을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 주사식 약학적 조성물은 약 19 mM 페놀(1.79 mg/ml) 및 약 19 mM m-크레졸(2.05 mg/ml)을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 킬레이트제를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 킬레이트제를 포함하지 않을 수 있다. 약학적 제제에 킬레이트제를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]를 참조한다.
본 발명의 약학적 조성물은 흡수 강화제를 추가로 포함할 수 있다. 흡수 강화제의 기는 니코틴성 화합물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 니코틴 화합물을 포함하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 니코틴 화합물은 니코틴아미드, 및/또는 니코틴산, 및/또는 이의 염이다. 또 다른 구현예에서, 니코틴 화합물은 니코틴아미드이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 니코틴 화합물은 약 0 mM 내지 약 200 mM의 양으로; 특히 약 10 mM 내지 약 200 mM의 양으로, 예컨대 약 10 mM, 약 20 mM, 약 40 mM, 약 170 mM의 양으로 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 니코틴 화합물을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 구연산염을 1 mM 내지 50 mM의 농도로 포함한다. 구연산염이란 용어는 구연산염뿐만 아니라 구연산도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 구연산염을 5 mM 내지 20 mM의 농도로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 구연산염은 5 mM의 농도로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, 구연산염은 10 mM의 농도로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, 구연산염은 15 mM의 농도로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, 구연산염은 20 mM의 농도로 존재한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 니코틴아미드 및 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 니코틴아미드와 시트르산염의 조합을 포함하되, 니코틴아미드는 약 5 mM 내지 약 200mM의 양으로, 특히 약 20 mM 내지 약 200 mM의 양으로, 예컨대 약 10 mM, 약 20 mM, 약 40 mM, 약 170 mM의 양으로 존재하고; 구연산염은 5 mM 내지 20 mM의 농도로, 특히 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM의 농도로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 5 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 10 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 20 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 40 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 60 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 140 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 160 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 170 mM 니코틴아미드 및 5 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 5 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 10 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 20 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 40 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 60 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 100 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 120 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 140 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 160 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 170 mM 니코틴아미드 및 10 mM 구연산염을 포함한다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 약 0.6 내지 약 3.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30 또는 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30을 포함하고, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 페놀, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 m-크레졸, 약 0 내지 약 250 mM의 글리세롤, 약 0.1 mM 내지 20 mM 트리스 또는 인산염, 약 0 mM 니코틴아미드를 추가로 포함하고, 약 7.0 내지 약 8.0의 pH 값을 갖는다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 약 0.6 내지 약 3.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30 또는 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30을 포함하고, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 페놀, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 m-크레졸, 약 0 내지 약 250 mM의 글리세롤, 약 0.1 mM 내지 20 mM 트리스 또는 인산염, 약 40 mM 니코틴아미드를 추가로 포함하고, 약 7.0 내지 약 8.0의 pH 값을 갖는다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 약 0.6 내지 약 3.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30 또는 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30을 포함하고, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 페놀, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 m-크레졸, 약 0 내지 약 250 mM의 글리세롤, 약 0.1 mM 내지 20 mM 트리스 또는 인산염, 약 20 mM 니코틴아미드, 약 10 mM의 구연산염을 추가로 포함하고, 약 7.0 내지 약 8.0의 pH 값을 갖는다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 저장 중에 폴리펩티드 또는 단백질에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 지칭하며, 여기서 임의의 주어진 아미노산은 이의 유리 염기 형태 또는 이의 염 형태로 존재한다.
추가로, 본 발명은 이러한 인슐린 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인슐린 제제는 다수의 인식된 방법 중 어느 하나를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 제제는 부형제의 수용액을 인슐린 유사체의 수용액과 혼합하여 제조할 수 있는데, 이 후 pH를 원하는 수준으로 조절하고, 혼합물을 물과 함께 최종 부피로 만든 다음, 멸균 여과한다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 단량체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물에서 자가 결합 특성이 감소된다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 화학적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 단량체이고 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 단량체이고 화학적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 단량체이고 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 약학적 조성물 중에서 단량체이고 고농도에서도 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체에 대한 흡수율은 Fiasp®와 비교했을 때 더 빠르다.
본 발명의 일 구현예에서, 이러한 차이는 폐쇄 루프 시스템에 대한 인슐린 투여 알고리즘을 더욱 개선하여 범위 내 시간(즉, 환자의 혈당이 건강한 범위 내에 있는 시간)을 증가시킬 수 있게 할 것이다.
무아연 약학적 조성물
인슐린 제제는 통상적으로 약학적 제제의 허용 가능한 안정성을 얻기 위해 예를 들어, 염화물 또는 아세트산염으로서 첨가된 아연을 포함한다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명의 인슐린 유사체는 감소된 자가 결합 및 충분한 화학적 및 물리적 안정성을 유지하면서 높은 인슐린 농도를 갖지만 아연이 첨가되지 않은 약학적 조성물로 제형화되어, 충분한 화학적 및 물리적 안정성을 유지하기 위해 Zn2+ 이온을 필요로 하는 유사한 인슐린 유사체보다 더 빨리 작용을 개시할 수 있다는 밝혀졌다. 무아연 조성물은 피하 조직으로부터 더 빠르게 흡수되어, 식사 인슐린으로서 사용될 수 있다.
그러나, 무아연 부형제가 제공될 수 있다면, 본 발명의 인슐린 유사체는 무아연 약학적 조성물의 제조를 사실상 가능하게 한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유사체, 및 임의의 아연이 없거나 아연 이온이 첨가되지 않은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 "무아연 약학적 조성물"을 제공한다.
본 발명의 인슐린 유사체는 아연 이온이 첨가되지 않고 첨가된 계면활성제가 없이 제형화된 약학적 조성물의 화학적 및 물리적 안정성 둘 다를 추가한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 무아연이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물은 무아연이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 단량체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 화학적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 단량체이고 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 인슐린의 유사체는 무아연 약학적 조성물 중에서 단량체이고 고농도에서도 화학적으로 및 물리적으로 안정하다.
투여 방법
본 발명의 약학적 조성물은 종래의 방법에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여는 주사기, 임의로 펜형 주사기에 의해 피하, 근육 내, 복강 내, 또는 정맥 내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가 옵션으로서, 본 발명의 인슐린 화합물을 함유하는 인슐린 제제는 예를 들어, 무바늘 주사에 의하거나, 현미침 패치, 임의로 이온삼투 패치(iontophoretic patch)에 의한 경피 투여, 또는 경점막(예: 구강) 투여에 맞게 구성될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 여러 부위에, 예를 들어 국소 부위에(예를 들어, 피부 및 점막 부위에), 흡수를 우회하는 부위에(예를 들어, 동맥 내, 정맥 내, 심장 내 투여), 및 흡수를 포함하는 부위에(예를 들어, 피내, 피하, 근육 내, 또는 복부 내 투여) 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여에 의한 당뇨병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 실제 복용량은 치료될 질환의 성질 및 심각성에 달려있고, 내과의사의 재량이고, 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 본 발명의 특별한 상황에 대한 복용량의 적정에 의해 가변될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 인슐린을 투여하는 데 일반적으로 사용되는 다양한 의료 장치에 사용하도록 제조될 수 있으며, 상기 장치는 주사에 의한 인슐린 요법에 사용되는 펜형 장치, 펌프 사용에 의한 연속 피하 인슐린 주입 요법을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 주사에 의한 인슐린 요법에 사용하기 위한 펜형 장치로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 인슐린 투여를 위한 외부 펌프로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 인슐린 투여를 위한 인슐린 펌프로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 인슐린 투여를 위한 인슐린 펌프에 적합하다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 인간 인슐린의 100 내지 600 U와 동등한 인슐린 유사체를 담을 수 있는 인슐린 펌프에 적합하다.
치료 방법
본 발명은 치료용 약물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 당뇨병과 관련된 의학적 병태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간을 포함하여 살아있는 동물 신체의 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 또는 완화 방법을 제공하며, 상기 질환, 장애, 또는 병태는 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만증, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애와 관련된 관련된 질환, 장애, 또는 병태로부터 선택될 수 있고, 상기 방법은 본 발명의 인간 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간을 포함하여 살아있는 동물 신체의 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 또는 완화 방법을 제공하며, 상기 질환, 장애, 또는 병태는 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만증, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군)과 관련된 질환, 장애, 또는 병태로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간을 포함하여 살아있는 동물 신체의 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 또는 완화 방법을 제공하며, 상기 질환, 장애, 또는 병태는 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 관련된 질환, 장애, 또는 병태로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 인슐린 유사체의 의학적 용도, 특히 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 고혈당증, 이상지질혈증, 비만증, 대사 증후군(대사 증후군 X, 인슐린 저항성 증후군), 고혈압, 인지 장애와 관련된 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위한 이러한 인슐린 유사체의 용도에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 인간 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 당뇨병, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 또는 내당능 장애와 관련된 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 또는 완화를 위한 이러한 인슐린 유사체의 용도에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 당뇨병과 관련된 질환, 장애, 또는 병태, 특히 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병의 치료, 예방, 또는 완화를 위한 이러한 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다.
구현예:
본 발명은 다음의 비제한적 구현예에 의해 추가로 기술된다:
1. 인슐린 유사체로서, 유사체는 A9E 또는 A9D를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3E 및/또는 desB30을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
2. 구현예 1에 있어서, 유사체는 A9E 또는 A9D를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
3. 구현예 1에 있어서, 유사체는 A9E 또는 A9D를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 desB30을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
4. 구현예 1에 있어서, 유사체는 A9E 또는 A9D를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3E 및 desB30을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
5. 구현예 2 내지 4에 있어서, 유사체는 B26E, B27E, 및/또는 B28E 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
6. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B26E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
7. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B27E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
8. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B28E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
9. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B26E 및 B27E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
10. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B26E 및 B28E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
11. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B27E 및 B28E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
12. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 B26E, B27E, 및 B28E를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
13. 구현예 5 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유사체는 A21A를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 유사체는
A9D, B3E;
A9E, B3E;
A9D, desB30;
A9E, desB30;
A9D, B3E, desB30;
A9E, B3E, desB30;
A9D, B3E, B26E;
A9E, B3E, B26E;
A9D, B26E, desB30;
A9E, B26E, desB30;
A9D, B3E, B26E, desB30;
A9E, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E;
A9E, A21A, B3E, B26E;
A9D, A21A, B26E, desB30;
A9E, A21A, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9D, B3E, B27E;
A9E, B3E, B27E;
A9D, B27E, desB30;
A9E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B27E;
A9D, A21A, B27E, desB30;
A9E, A21A, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B28E;
A9E, B3E, B28E;
A9D, B28E, desB30;
A9E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B28E;
A9D, A21A, B28E, desB30;
A9E, A21A, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E;
A9E, B3E, B26E, B27E;
A9D, B26E, B27E, desB30;
A9E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9D, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B27E, B28E;
A9D, B27E, B28E, desB30;
A9E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B28E;
A9D, B26E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30; 또는
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
15. 구현예 14에 있어서, 유사체는
A9D, B3E, B26E;
A9E, B3E, B26E;
A9D, B26E, desB30;
A9E, B26E, desB30;
A9D, B3E, B26E, desB30;
A9E, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E;
A9E, A21A, B3E, B26E;
A9D, A21A, B26E, desB30;
A9E, A21A, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9D, B3E, B27E;
A9E, B3E, B27E;
A9D, B27E, desB30;
A9E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B27E;
A9D, A21A, B27E, desB30;
A9E, A21A, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B28E;
A9E, B3E, B28E;
A9D, B28E, desB30;
A9E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B28E;
A9D, A21A, B28E, desB30;
A9E, A21A, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E;
A9E, B3E, B26E, B27E;
A9D, B26E, B27E, desB30;
A9E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9D, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B27E, B28E;
A9D, B27E, B28E, desB30;
A9E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B28E;
A9D, B26E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30; 또는
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
16. 구현예 15에 있어서, 유사체는
A9D, B3E, B26E;
A9E, B3E, B26E;
A9D, B26E, desB30;
A9E, B26E, desB30;
A9D, B3E, B26E, desB30;
A9E, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E;
A9E, A21A, B3E, B26E;
A9D, A21A, B26E, desB30;
A9E, A21A, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E;
A9E, B3E, B26E, B27E;
A9D, B26E, B27E, desB30;
A9E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9D, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B27E, B28E;
A9D, B27E, B28E, desB30;
A9E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B28E;
A9D, B26E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30; 또는
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
17. 구현예 16에 있어서, 유사체는
A9D, B3E, B26E;
A9E, B3E, B26E;
A9D, B3E, B26E, desB30;
A9E, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E;
A9E, A21A, B3E, B26E;
A9D, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E;
A9E, B3E, B26E, B27E;
A9D, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
A9D, B3E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B27E, B28E;
A9D, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B28E;
A9D, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E;
A9D, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9E, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9E, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30; 또는
A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
18. 구현예 17에 있어서, 유사체는
A9E, B3E, B26E;
A9E, B3E, B27E, B28E;
A9E, B3E, B26E, desB30;
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
A9D, B3E, B26E, desB30; 또는
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
19. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9E, B3E, B26E인, 인슐린 유사체.
20. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9E, B3E, B27E, B28E인, 인슐린 유사체.
21. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9E, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
22. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
23. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9D, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
24. 구현예 18에 있어서, 유사체는 A9E, A21A, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 인슐린 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
26. 구현예 25에 있어서, A9E, B3E, B26E, desB30인 인슐린 유사체를 포함하는, 약학적 조성물.
27. 구현예 25에 있어서, A9E, B3E, B27E, B28E, desB30인 인슐린 유사체를 포함하는, 약학적 조성물.
28. 구현예 25에 있어서, A9D, B3E, B26E, desB30인 인슐린 유사체를 포함하는, 약학적 조성물.
29. 구현예 25에 있어서, A9E, A21A, B3E, B26E, desB30인 인슐린 유사체를 포함하는, 약학적 조성물.
30. 구현예 25 내지 29에 있어서, 인슐린 유사체는 약 0.1 mM 내지 약 20.0 mM의 농도인, 약학적 조성물.
31. 구현예 25 내지 30에 있어서, 인슐린 유사체는 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM의 농도인, 약학적 조성물.
32. 구현예 31에 있어서, 인슐린 유사체는 약 0.6 mM의 농도인, 약학적 조성물.
33. 구현예 31에 있어서, 인슐린 유사체는 약 1.2 mM의 농도인, 약학적 조성물.
34. 구현예 31에 있어서, 인슐린 유사체는 약 1.8 mM의 농도인, 약학적 조성물.
35. 구현예 31에 있어서, 인슐린 유사체는 약 2.4 mM의 농도인, 약학적 조성물.
36. 구현예 31에 있어서, 인슐린 유사체는 약 3.0 mM의 농도인, 약학적 조성물.
37. 구현예 25 내지 29에 있어서, 인슐린 유사체는 약 100 내지 600 U의 농도인, 약학적 조성물.
38. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 100 U의 농도인, 약학적 조성물.
39. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 200 U의 농도인, 약학적 조성물.
40. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 300 U의 농도인, 약학적 조성물.
41. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 400 U의 농도인, 약학적 조성물.
42. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 500 U의 농도인, 약학적 조성물.
43. 구현예 37에 있어서, 인슐린 유사체는 약 600 U의 농도인, 약학적 조성물.
44. 구현예 25 내지 43에 있어서, 조성물은 아연을 포함하지 않는, 약학적 조성물.
45. 구현예 25 내지 44에 있어서, 니코틴 화합물, 및 특히 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
46. 구현예 25 내지 45에 있어서, 니코틴아미드를 약 0 mM 내지 약 200 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
47. 구현예 46에 있어서, 10 mM의 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
48. 구현예 46에 있어서, 20 mM의 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
49. 구현예 46에 있어서, 40 mM의 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
50. 구현예 46에 있어서, 170 mM의 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
51. 구현예 25 내지 50에 있어서, 약 0.6 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함하는, 약학적 조성물.
52. 구현예 51에 있어서, 약 1.5 mg/ml의 페놀 및 약 1.72 mg/ml의 m-크레졸을 포함하는, 약학적 조성물.
53. 구현예 51에 있어서, 약 1.79 mg/ml의 페놀 및 약 2.05 mg/ml의 m-크레졸을 포함하는, 약학적 조성물.
54. 구현예 25 내지 53에 있어서, 글리세롤을 0 내지 약 250 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
55. 구현예 54에 있어서, 약 103 mM, 130mM, 163mM, 185mM, 195mM, 200mM, 230mM, 또는 233 mM 글리세롤을 포함하는, 약학적 조성물.
56. 구현예 25 내지 55에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜을 약 0 내지 약 2%의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
57. 구현예 56에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜을 약 1.5 %의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
58. 구현예 25 내지 57에 있어서, 완충액을 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
59. 구현예 58에 있어서, 인산염 완충액을 약 3 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
60. 구현예 58에 있어서, 트리스 완충액을 약 7 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
61. 구현예 25 내지 60에 있어서, 약 7.0 내지 약 8.0 범위의 pH 값을 갖는, 약학적 조성물.
62. 구현예 61에 있어서, 약 7.2 내지 약 7.8 범위의 pH 값을 갖는, 약학적 조성물.
63. 구현예 62에 있어서, 약 7.4 내지 약 7.6 범위의 pH 값을 갖는, 약학적 조성물.
64. 구현예 25 내지 63에 있어서, 구연산염을 포함하는, 약학적 조성물.
65. 구현예 64에 있어서, 구연산염을 1 mM 내지 50 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
66. 구현예 65에 있어서, 구연산염을 5 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
67. 구현예 65에 있어서, 구연산염을 10 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
68. 구현예 65에 있어서, 구연산염을 15 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
69. 구현예 65에 있어서, 구연산염을 20 mM의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
70. 구현예 25 내지 69에 있어서, 10 mM의 니코틴아미드 및 10 mM의 구연산염을 포함하는, 약학적 조성물.
71. 구현예 25 내지 70에 있어서, 20 mM의 니코틴아미드 및 10 mM의 구연산염을 포함하는, 약학적 조성물.
72. 구현예 25 내지 71에 있어서, 40 mM의 니코틴아미드 및 10 mM의 구연산염을 포함하는, 약학적 조성물.
73. 구현예 25 내지 72에 있어서, 0.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
74. 구현예 25 내지 73에 있어서, 1.2 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
75. 구현예 25 내지 74에 있어서, 1.8 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
76. 구현예 25 내지 75에 있어서, 2.4 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
77. 구현예 25 내지 76에 있어서, 3.0 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
78. 구현예 25 내지 77에 있어서, 0.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
79. 구현예 25 내지 78에 있어서, 1.2 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
80. 구현예 25 내지 79에 있어서, 1.8 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
81. 구현예 25 내지 80에 있어서, 2.4 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
82. 구현예 25 내지 81에 있어서, 3.0 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
83. 구현예 25 내지 82에 있어서, 0.6 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
84. 구현예 25 내지 83에 있어서, 1.2 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
85. 구현예 25 내지 84에 있어서, 1.8 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
86. 구현예 25 내지 85에 있어서, 2.4 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
87. 구현예 25 내지 86에 있어서, 3.0 mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B26E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
88. 구현예 25 내지 87에 있어서, 0.6 mM, 1.2mM, 1.8mM, 2.4mM, 또는 3.0mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
233 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
0 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
89. 구현예 25 내지 88에 있어서, 0.6 mM, 1.2mM, 1.8mM, 2.4mM, 또는 3.0mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
200 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
40 mM의 니코틴아미드; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
90. 구현예 25 내지 89에 있어서, 0.6 mM, 1.2mM, 1.8mM, 2.4mM, 또는 3.0mM의 인슐린 유사체 A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
1.5 mg/ml의 페놀;
1.72 mg/ml의 m-크레졸;
185 mM의 글리세롤;
3 mM의 인산염;
20 mM의 니코틴아미드;
10 mM의 구연산염; 및
7.4의 pH를 포함하는, 약학적 조성물.
91. 의약으로서 사용하기 위한 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 인슐린 유사체 또는 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 구현예 25 내지 90 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물.
92. 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 연관된 인간 신체의 질환 또는 장애 또는 병태를 예방 또는 완화 또는 치료하는 데 사용하기 위한 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 인슐린 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 구현예 25 내지 90 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물.
93. 인간 신체의 질환 또는 장애 또는 병태를 치료, 예방, 또는 완화하는 방법으로서, 질환, 장애, 또는 병태는 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 연관되고, 상기 방법은 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 따른 인슐린 유사체 또는 구현예 25 내지 90 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 살아 있는 동물 신체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예
물질 및 방법
약어 목록
ACN - 아세토니트릴
ALP - 아크로모박터 리티쿠스 프로테아제
AUC - 곡선 아래 면적
C-펩티드 - 연결 펩티드
DCM - 디클로로메탄
DIC - 디이소프로필카르보디이미드
DIPEA = DIEA - N,N-디이소프로필에틸아민
DMFN - N,N-디메틸포름아미드
DMSO - 디메틸 설폭시드
Fmoc - 플루오레닐메틸옥시카르보닐
Glu (gGlu) - 감마 L-글루타밀
HFIP - 헥사플루오로-2-프로판올
HPLC - 고성능 액상 크로마토그래피
IR - 인슐린 수용체
IGF-1R 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체
LC - 액체 크로마토그래피
MALDI-TOF - 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간
MS - 질량 분석
NMP - N-메틸피롤리돈
PAL - 펩티드 아미드 링커
PCR - 중합효소 연쇄 반응
PD - 약력학(혈액/혈장 포도당 저하 효과)
PK - 약동학(혈액/혈장 인슐린 농도 대 시간 프로파일)
RT - 실온
tBu - 터트-부틸
TFA - 트리플루오로아세트산; 및
TRIS - 트리스(하이드록시 메틸) 아미노메탄.
일반적인 제조 방법
일반 절차 (A)
본 발명의 유사체의 고상 합성 및 정제
본 발명의 인슐린 유사체의 고상 합성 및 정제를 위한 일반적인 절차는 아래에 상술되어 있고, 아래에 표시된 바와 같은 추가 화합물의 합성에 적용되어 왔다.
인슐린 A 및 B 사슬을 일반적인 Fmoc 기반 고상 펩티드 결합 방법을 사용하여 프렐루드 펩티드 합성기(Prelude peptide synthesiser) 상에서 제조하였다.
사용된 수지:
Fmoc-Thr(OtBu)-Wang; 및 PAL 수지에 결합된 Fmoc-Asp-OtBu.
아미노산(아래에 열거됨) 및 옥시마를 0.3 M의 농도로 DMF에 용해시켰다:
Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; 및 Fmoc-Val-OH.
특수/비천연 아미노산: Boc-Phe-OH; Boc-Gly-OH; 및 Fmoc-Cys(Acm)-OH.
절차
스케일: 0.25 mmol.
수지에 사용된 표준 결합 조건은: 1시간 동안 NMP 중 8당량 아미노산, DIC, 콜리딘, 및 옥시마 (에틸(하이드록시이미노)시아노아세테이트)였으며, Fmoc-Arg(Pbf)-OH의 경우, 이중 결합 프로토콜(2x1시간)을 사용하였다.
사용된 표준 탈보호 조건은: NMP 중 20% 피페리딘(2x 7.5분 또는 2x 10분 동안 2x 5.5 ml)에 이어서 NMP 및 DCM에 의한 세척이었다.
A6C-A11C 이황화물 형성
수지를 DCM/HFIP(30 mL의 1:1 혼합물) 중 0.5% 요오드 용액으로 15분 동안 처리하였다. 여과에 의해 용매를 제거한 후, DCM(3x20 ml)으로 수지를 세척하고 질소 스트림을 이용해 건조시켰다.
수지로부터 A-사슬 절단 및 A20-Cys를 S-S-피리딜로서 활성화하기
수지를 TFA(30 mL), 트리이소프로필실란(1 ml), 물(0.75 ml), 및 디티오디피리딘(0.75 g)의 용액으로 3시간 동안 처리한 다음, 여액을 수집하고 150 ml 에테르(6개의 플라스틱 NUNC 튜브로 나눔)에 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 튜브를 3500 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 에테르 층을 디캔팅하고, 이 에테르 단계를 추가로 3회 반복하였다. 미정제 물질을 합치고 실온에서 밤새 건조시켜 원하는 펩티드 A-사슬을 수득하였다.
수지로부터 B-사슬 절단하기
수지를 TFA(30 mL), 트리이소프로필실란(1 ml), 물(0.75 ml), 및 디티오트레이톨(0.5 g)의 용액으로 3시간 동안 처리한 다음, 여액을 수집하고 에테르(150 ml, 6개의 플라스틱 NUNC 튜브로 나눔)에 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 튜브를 3500 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 에테르 층을 디캔팅하고, 이 에테르 단계를 추가로 3회 반복하였다. 미정제 물질을 실온에서 밤새 건조시켜 원하는 펩티드 B-사슬을 수득하였다.
A20C-B19C 이황화물 형성
A-사슬(0.33 g) 및 B-사슬(0.33 g)의 혼합물에 DMSO(8 mL) 및 DIPEA(1 mL)를 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반한 다음, 140 ml의 중성 완충액(물, TRIS(10 mM), 황산암모늄(15 mM), 20% 아세토니트릴)을 교반하면서 적가하여 약 150 ml의 총 부피를 만들었다.
그런 다음, 다음 설정을 사용하여 역상 크로마토그래피로 혼합물을 정제하였다:
- Phenomenex Gemini 5 μM 5 μ C18 110Å 30x250 mm 컬럼, 20 mL/분의 속도로 40분에 걸쳐 10% B에서 60% B까지의 구배
- 용리액 A=milliQ 물 중 10 mM TRIS, 15 mM 황산암모늄, pH =7.3, 20% ACN
- 용리액 B=아세토니트릴 중 20% milliQ 물.
순수 분획을 풀링하고, 급속 냉동시키고, 동결 건조시켰다.
A7C-B7C 이황화물 형성
이전 단계에서 동결 건조된 중간체를 5 mL DMSO에 재용해시켰다. 아세트산(20 mL) 및 물(4 mL)을 첨가하고, 이어서 AcOH 중 요오드(3 mL의 40 mM)를 첨가하였다.
총 20분 동안 반응시킨 후, 1 M 아스코르브산나트륨으로 반응을 퀀칭시킨 다음, 교반된 수용액(90 mL)에 첨가하였다.
그런 다음, 다음 설정을 사용하여 역상 크로마토그래피로 혼합물을 정제하였다:
- Phenomenex Gemini 5 μM 5 μ C18 110Å 30x250 mm 컬럼, 20 mL/분의 속도로 40분에 걸쳐 10% B에서 45% B까지의 구배
- 용리액 A=milliQ 물 중 0.1% TFA
- 용리액 B=아세토니트릴 중 0.1% TFA
순수 분획을 풀링하고, 급속 냉동시키고, 동결 건조시켜 원하는 생성물을 수득하였다.
일반 절차 (B)
인슐린 유사체 발현 및 정제
S. 세레비시에에서의 인슐린 유사체 발현
본 발명에 따른 용도를 위한 인슐린 유사체, 즉 2쇄 비-아실화 인슐린 유사체는 예를 들어 US 6500645에 개시된 바와 같이 잘 알려진 기술에 의해 적절한 숙주 세포에서 해당 인슐린 유사체를 DNA 서열을 발현함으로써 재조합적으로 생산된다. 인슐린 유사체는 직접 발현되거나, B사슬 상에 N-말단 연장부를 갖고/갖거나 B-사슬과 A-사슬 사이에 연결 펩티드(C-펩티드)를 가질 수 있는 전구체 분자로서 발현된다. 이러한 N-말단 연장부 및 C-펩티드는 적절한 프로테아제, 예를 들어, 아크로모백터 리티쿠스 프로테아제(ALP) 또는 트립신에 의해 시험관 내에서 절단되고, 따라서 위치 B1 및 A1 다음에 각각 절단 부위를 갖게 된다. 본 발명에 따른 용도에 적합한 유형의 N-말단 연장부 및 C-펩티드는 예를 들어 US 5395922, EP 765395 및 WO 9828429에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 확립된 방법, 예를 들어, Beaucage 등의 문헌[(1981) Tetrahedron Letters 22 1859-1869]에 기술된 포스포라미디트법(phosphoamidite method), 또는 Matthes 등의 문헌[(1984) EMBO Journal 3 801-805]에 기술된 방법에 의해 합성하여 제조할 수 있다. 포스포라미디트법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 이중화되고, 결합되어 합성 DNA 작제물을 형성한다. 현재, DNA 작제물을 제조하는 바람직한 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 것이다.
재조합 방법은, 선택된 미생물 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 벡터를 일반적으로 활용하게 된다. 재조합 벡터는 자가 복제 벡터, 즉, 염색체 외 독립체로서 존재하고, 이의 복제는 염색체 복제, 예를 들어, 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니 염색체, 또는 인공 염색체와 독립적인 벡터일 수 있다. 벡터는 확실한 자가 복제를 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 숙주 세포 내로 도입될 때 게놈에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 총 DNA를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용되거나, 트랜스포존(transposon)이 사용될 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있고, 바람직하게는, 숙주 세포의 게놈 내로 벡터의 안정한 통합을 가능하게 하거나, 세포 내에서 게놈과 무관하게 자율적인 복제를 가능하게 하는 요소(들)를 함유하게 된다.
재조합 발현 벡터는 효모에서 복제가 가능한 것일 수 있다. 효모에서 벡터의 복제를 가능하게 하는 서열의 예는 효모 플라스미드 2 μm 복제 유전자 REP 1-3 및 복제 기원이다.
벡터는 트랜스-형성 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는, 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양 요구성에 대한 독립 영양성 등을 가능하게 하는 유전자 산물이다. 세균 선택성 표지의 예로는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리케니포르미스에서 유래된 dal 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커 등이 있다. 사상 진균류 숙주 세포에서 사용하기 위한 선택성 마커는 amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카르바모일전이효소), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제) 및 trpC(안트라닐산염 신타아제)를 포함한다. 효모 숙주 세포에 적절한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 효모에 잘 맞는 선택성 마커는 스키조사카로마이세스 폼페(Schizosaccharomyces pompe) TPI 유전자이다(Russell의 문헌[(1985) Gene 40 125-130] 참조).
벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 돌연변이체 프로모터, 절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 상동이거나 이종인 세포 외 또는 세포 내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다.
세균 숙주 세포에서 전사를 유도하기에 적절한 프로모터의 예는, 대장균 락토스 오페론(E. coli lac operon), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 아가라제 유전자(Streptomyces coelicolor agarase gene, dagA), 바실러스 서브틸러스 레반슈크라제 유전자(Bacillus subtilis levansucrase gene, sacB), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene, amyL), 바실러스 스테아로테르모필루스 말토게닉 아밀라제 유전자(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, amyM), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene, amyQ), 및 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(Bacillus licheniformis penicillinase gene, penP)로부터 수득된 프로모터이다. 사상 진균류 숙주 세포에서 전사를 유도하기에 적절한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리지에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 메이헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트 프로테이나제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 및 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 산성 안정한 알파-아밀라제에 대한 유전자로부터 수득된 프로모터이다. 효모 숙주에서 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) Ma1, TPI, ADH, TDH3 또는 PGK 프로모터이다.
본 발명에 따른 용돌르 위해 인슐린 펩티드 백본을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열도 일반적으로 적절한 종결자에 작동 가능하게 연결될 것이다. 효모에서, 적절한 종결자는 TPI 종결자이다(Alber 등의 문헌[(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 419-434] 참조).
본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 프로모터, 및 종결자를 각각 조합하고, 선택된 숙주에서 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내에 이들을 삽입하기 위해 사용된 절차는, 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터는, 먼저 본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 백본을 암호화하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 작제물을 제조하고, 후속하여 적절한 발현 벡터 내에 이러한 단편을 삽입함으로써 작제되거나; 개별 요소(예컨대, 신호 및 프로-펩티드(B-사슬의 N-말단 연장부), C-펩티드, A- 및 B-사슬에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 단편을 순차적으로 삽입한 후, 결합시킴으로써 작제될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 용도를 위해 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 염색체 통합 벡터로서, 또는 자가-복제성 염색체 외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 도중에 발생하는 돌연변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않은 부모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대 원핵생물, 또는 비-단세포성 미생물, 예컨대 진핵생물일 수 있다. 유용한 단세포는 그람 양성 박테리아와 같은 박테리아 세포로서, 바실러스 세포, 스트렙토마이세스 세포, 또는 그람 음성 박테리아, 예컨대 대장균 및 슈도모나스 종을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 진핵생물 세포는 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포일 수 있다.
숙주 세포는 특히 효모 세포일 수 있다. 효모 유기체는 배양 시, 인슐린 펩티드 백본 또는 이의 전구체를 배양 배지 내로 분비하는 임의의 적절한 효모 유기체일 수 있다. 적절한 효모 유기체의 예는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카리마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 유바룸(Sacchoromyces uvarum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 종(Candida sp.), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 게오트리쿰 종(Geotrichum sp.), 및 게오트리쿰 페르멘탄스(Geotrichum fermentans)로부터 선택된 균주를 포함한다.
효모 세포의 형질변환은 예를 들어 원형질체 형성에 이어 알려진 방법에 의한 형질변환에 의해 영향을 받을 수 있다. 세포를 배양하는데 사용된 배지는 효모 유기체를 성장시키기에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
인슐린 유사체 정제
분비된 인슐린 유사체 또는 이의 전구체는 다음을 포함하는 종래 절차에 의해 배지로부터 회수할 수 있다: 인슐린 유사체 또는 이의 전구체를 원심분리하거나, 여과하여 효모 세포를 매질로부터 분리하거나, 이온 교환 기질 또는 역상 흡착 매트릭스 상에 인슐린 유사체 또는 이의 전구체를 포획하거나 흡착시켜 효모 세포를 매질로부터 분리하는 단계; 상청액의 단백질 성분을 침전시키거나 황산암모늄과 같은 염에 의해 이를 여과한 다음, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 절차에 의해 이를 정제하는 단계.
본 발명의 인슐린 펩티드 백본의 정제 및 분해는 다음과 같이 수행된다:
B-사슬의 N-말단 연장부 및 B-사슬과 A-사슬 사이의 변형된 C-펩티드를 함유할 수 있는 단쇄 인슐린 유사체 전구체를 양이온 교환에 의해 효모 배양 상청액으로부터 정제하고 농축시킨다(Kjeldsen 등의 문헌[(1998) Prot. Expr. Pur. 14 309-316] 참조).
단쇄 인슐린 유사체 전구체를 리신-특이적 고정된 ALP와 함께 분해하거나(Kristensen 등의 문헌[(1997) J. Biol. Chem. 20 12978-12983] 참조), 트립토판을 사용해 B-사슬의 N-말단 연장부(존재하는 경우) 및 C-펩티드를 절단함으로써 단쇄 인슐린 펩티드 백본 전구체를 이중쇄(two-chain) 인슐린 펩티드 백본으로 성숙시킨다.
ALP 분해
인슐린 펩티드 백본 전구체를 함유하는, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 유래된 용리액을 15~20%의 에탄올 농도가 되도록 물로 희석한다. 글루탐산나트륨을 15 mM의 농도로 첨가하고, NaOH로 pH를 9.7까지 조절한다. 고정된 ALP(4 gram/L)를 1:100(부피:부피)의 비율로 첨가하고, 실온에서 가볍게 교반하면서 밤새 분해시킨다.
C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 분석 LC에 의해 분해 반응을 분석하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광계(MS)(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)에 의해 분자량을 확인한다.
고정된 ALP는 0.2 μm 필터를 사용해 여과로 제거한다. 아세토니트릴 구배를 사용하는 C18 칼럼을 이용해 역상 HPLC(Waters 600 시스템)에 의해 이중쇄 인슐린 펩티드 백본을 정제한다. 원하는 인슐린를 동결건조에 의해 회수한다.
C18 컬럼을 사용하는 Waters Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 분석 LC에 의해 순도를 결정되고, MALDI-TOF MS에 의해 분자량을 확인한다.
실시예 1
일반 절차 (B)에 의해 제조됨
A9E, B3E, B26E, desB30 인간 인슐린 (서열번호 3 및 4)
실시예 2
일반 절차 (B)에 의해 제조됨
A9E, B3E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린 (서열번호 3 및 5)
실시예 3
일반 절차 (A)에 의해 제조됨
A9E, B3E, B26E 인간 인슐린; (서열번호 3 및 6)
실시예 4
일반 절차 (A)에 의해 제조됨
A9E, B3E, B27E, B28E 인간 인슐린; (서열번호 3 및 7)
실시예 5
일반 절차 (B)에 의해 제조됨
A9D, B3E, B26E, desB30 (서열번호 8 및 4)
실시예 6
일반 절차 (B)에 의해 제조됨
A9E, A21A, B3E, B26E, desB30 (서열번호 9 및 4)
비교자 화합물 1
B3E, B26E, desB30 인간 인슐린;
비교자 화합물 2
B3E, B27E, B28E, desB30 인간 인슐린;
비교자 화합물 3
B28D 인간 인슐린(인슐린 아스파르트)
비교자 화합물 4
A21A, B3E, B26E, desB30 인간 인슐린
실시예 7
가용화된 수용체 상에서 측정된, 본 발명의 선택된 인슐린 유도체의 인슐린 수용체 친화도
인간 인슐린 수용체(IR)에 대한 본 발명의 인슐린 유사체의 상대 결합 친화도는 섬광 근접 측정법(SPA)에서의 경쟁 결합에 의해 결정한다(Glendorf T 등의 문헌[(2008) Biochemistry 47 4743-4751]에 따름).
요약하자면, 시험할 인간 인슐린 표준체 및 인슐린 유사체의 연속 희석을 96-웰 Optiplate(Perkin-Elmer Life Sciences)에서 수행한 다음, 100 mM HEPES (pH 7.8), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 및 0.025% (v/v) Tween 20으로 이루어진 결합 완충액 중에서 [125I-A14Y]-인간 인슐린, 항-IR 마우스 항체 83-7, 가용화된 인간 IR-A(IR-A 홀로수용체(holoreceptor)를 과발현하는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포로부터의 소맥배아 응집소 크로마토그래피에 의해 반정제함), 및 SPA 비드(항-마우스 폴리비닐톨루엔 SPA 비드)를 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 진탕하면서 22℃에서 22~24시간 동안 인큐베이션하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)를 이용해 계수하였다.
4-파라미터 로지스틱 모델(Vølund A의 문헌[(1978) Biometrics 34 357-365])에 따라 SPA의 데이터를 분석하고, 유사체의 결합 친화도를 동일한 플레이트 내에서 측정한 인간 인슐린 표준체의 결합 친화도에 대해 계산하였다.
본 발명의 선택된 인슐린 유사체의 인슐린 수용체 친화도 및 기타 시험관 내 데이터는 아래 표 1에 제시되어 있다.
본 발명의 인슐린의 인슐린 수용체 친화도, IGF-1 수용체 친화도, 및 기능적 지방생성 효능
실시예 번호 hIRA
(HI에 대한 rel(%))
실시예 7 		hIRA mem
(HI에 대한 rel(%))
실시예 8 		hIGF1R mem
(HI에 대한 rel(%))
실시예 8 		지질 합성
(HI에 대한 rel(%))
실시예 9
1 83.2 55.8 10.2 68.2
2 59.5 35.4 16.5 46.5
5 75.5 ND ND ND
6 35.3 ND ND ND
결론적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 인슐린 수용체에 대해 높은 친화도를 가지며, 이들은 수용체를 활성화시키고 기능적 반응을 유도할 수 있다. 또한, IGF-1 수용체에 대한 본 발명의 인슐린 유사체의 상대 친화도는 인슐린 수용체에 대한 친화도에 비해 더 낮다. 이는 유사분열 촉진 반응이 대사 반응에 비해 더 낮을 것이므로, 임상 진료에서 본 발명의 유사체의 안전성과 관련하여 잠재적 이점을 나타낸다.
실시예 8:
막 관련 수용체 상에서 측정된, 본 발명의 선택된 인슐린 유도체의 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 친화도
인간 IR-A, IR-B, 또는 IGF-1R-IR 삽입체를 함유하는 pZem219B 벡터로 안정적으로 형질감염시킨 BHK 세포로부터 막-관련 인간 IR 및 IGF-1R을 정제한다. BHK 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 완충액(25 mM HEPES pH 7.4, 25 mM CaCl2, 및 1 mM MgCl2, 250 mg/L 바시트라신(bacitracin), 0.1 mM Pefablock) 중에서 균질화시킨다. 균질물을 41% (w/v) 수크로오스 쿠션 상에 적층시키고, 4℃에서 95000 g로 75분 동안 원심분리한다. 혈장 막을 수집하고, 완충액(상기와 같음)과 1:5로 희석하고, 4℃에서 40000 g로 45분 동안 다시 원심분리한다. 펠릿을 최소 부피의 완충액에 재현탁시키고, 바늘(크기 23)을 통해 3회 흡인한 후, 사용 시까지 -80℃에서 보관한다.
막 관련 인간 IR-A, IR-B, 또는 IGF-1R 중 어느 하나에 대한 상대 결합 친화도는 SPA 설정에서의 경쟁 결합에 의해 결정한다. IR 검정은 96-웰 OptiPlates(Perkin-Elmer Life Sciences)에서 2회 수행한다. 막 단백질을 총 부피 200 μL의 검정 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 0.01% Triton X-100, 0.1% (w/v) HSA (Sigma A1887), 완전 EDTA-무함유 프로테아제 억제제) 중 50 pM[125I-A14Y]-인간 인슐린, 50 μg의 소맥 배아 응집소(WGA)로 코팅한 PVT 미소구체(GE Healthcare), 및 증가하는 농도의 리간드와 함께 25℃에서 부드럽게 교반하면서 150분 동안 인큐베이션하였다. 2000 rpm으로 2분 동안 플레이트를 원심분리하여 검정을 종료하고, TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)를 이용해 계수하여 결합된 방사능을 정량화한다.
IGF-1R 검정은, 막 관련 IGF-1R 및 50 pM[125I-Tyr31]-인간 IGF-1을 사용하였다는 것을 제외하고는, 본질적으로 IR 결합 검정에 대해 수행된다. 4-파라미터 로지스틱 모델(Vølund A의 문헌[(1978) Biometrics 34 357-365])에 따라 SPA의 데이터를 분석하고, 시험할 유사체의 결합 친화도를 동일한 플레이트 내에서 측정한 인간 인슐린 표준체의 결합 친화도에 대해 계산하였다.
본 발명의 선택된 인슐린 유사체의 IR(A 이소형) 및 IGF-1R 결합 데이터는 위의 표 1에 나타나 있다.
실시예 9
랫트 지방세포에서의 지방 생성
본 발명의 인슐린 유사체의 시험관 내 효능의 척도로서, 지방 생성이 사용될 수 있다.
일차 랫트 지방세포를 부고환 지방 패드로부터 단리하고, 예를 들어, 0.1% 무지방 HSA 및 본 표준체(인간 인슐린, HI) 또는 본 발명의 인슐린 중 하나를 함유하는 완충액 중에서 3H-포도당과 함께 인큐베이션한다. 표지된 포도당은 투여량 의존적 방식으로 추출 가능한 지질로 변환되어, 완전한 투여량 반응 곡선을 생성한다. 결과는 표준체(HI)과 비교하여 본 발명의 인슐린의 상대 효능(%)으로서 표현된다(95% 신뢰 구간).
데이터는 상기 표 1에 나타나 있다.
실시예 10
인슐린 조성물의 제조
본 발명의 인슐린 조성물은 수용액으로서 제조될 수 있다. 수용액은, 예를 들어 염화나트륨 및/또는 글리세롤을 사용해 등장성으로 만들어진다. 또한, 수성 매질은 완충액 및 보존제를 함유할 수 있다. 제제의 pH 값은 원하는 값으로 조정되며, 해당 인슐린 유사체의 등전점(pI)에 따라 약 3 내지 약 8.5, 약 3 내지 약 5, 또는 약 6.5, 또는 약 7.4, 또는 약 7.5일 수 있다.
무아연 인슐린 조성물의 제조
무아연 인슐린 유사체를 수용액에 용해시켰는데, 최종 조성물은 0.1 mM 내지 10 mM의 인슐린 유사체, 16 mM의 m-크레졸, 16 mM의 페놀, 및 적당량의 니코틴아미드와 글리세롤을 함유하였고, 1 N 염산/1 N NaOH를 사용하여 pH를 원하는 값(실온에서 측정했을 때 7.0~8.0 사이)으로 조정하였다. 물을 최종 부피에 첨가하고, 용액을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다. 조성물을 바이알에 충진하였다(2 ml 바이알은 크림프 캡을 사용하여 시일하고, 펜필(penfill)은 크림프 캡을 사용하여 시일하고, HPLC 바이알은 스크류 탑으로 시일함).
인슐린 제제의 예시적인 조성물
조성물 인슐린 (mM) 페놀
(mM) 		m-크레졸
(mM) 		니코틴아미드
(mM) 		글리세롤
(%, mM) 		프로필렌 글리콜
(%) 		인산염
(mM) 		트리스
(mM) 		pH 구연산염
(mM)
A 0.6 16 16 0 2.15 233 0 3 7.4
B 0.6 16 16 40 1.85 200 0 3 7.4
B1 0.6 16 16 40 1.5 163 0 3 7.4 5
B2 0.6 16 16 40 1.5 163 0 3 7.4 10
B3 0.6 16 16 40 1.2 130 0 3 7.4 15
B4 0.6 16 16 40 1.2 130 0 3 7.4 20
C 0.6 16 16 170 0.95 103 0 3 7.4
I 0.6 16 16 40 1.7 185 0 3 7.2
I1 0.6 16 16 20 1.7 185 0 3 7.4 10
L 0.6 16 16 40 0 0 1.5 7 7.4
M 0.6 16 16 40 1.8 195 0 7 7.4
M1 0.6 16 16 10 1.8 195 0 3 7.4 10
D 1.2 16 16 40 1.85 200 0 3 7.4
D1 1.2 16 16 40 1.5 163 0 3 7.4 10
E 1.8 16 16 40 1.85 200 0 3 7.4
F 2.4 16 16 40 1.85 200 0 3 7.4
G 3.0 16 16 40 1.85 200 0 3 7.4
H 3.0 16 16 40 1.85 200 0 3 7.0
J 3.0 16 16 0 1.8 195 0 3 7.0
K 3.0 16 16 0 2.1 230 0 3 7.4
K1 3.0 16 16 0 2.1 230 0 3 7.4 20
O 3.0 19 19 40 1.7 185 0 3 7.2
P 3.0 19 19 40 1.7 185 0 3 7.6
Q 3.0 19 19 40 1.7 185 0 3 8.0
실시예 11:
소각 X-선 산란(Small Angle X-ray Scattering, SAXS)에 의해 측정된 인슐린 조성물의 자가 결합
SAXS 데이터를 사용하여 상이한 조건 하에 본 발명의 인슐린 유사체의 자가 결합 상태를 추정하였다.
각 실험의 산란 곡선은 평균 회전반경(Rg) 및 최대 치수(Dmax)로 기술하였다.
또한, 산란 곡선에서 단량체, 이량체, 및 더 큰 종의 상대량은 SAXS 산란 프로파일이 다중 성분 혼합물 내의 모든 개별 성분로부터 강도 기여도를 갖는다는 사실을 사용해 추정하였다. 각 성분으로부터 강도(형태 인자)를 사용함으로써, 혼합물 중 각 성분의 부피 분율 기여도를 추정할 수 있다. 음이 아닌 최소 제곱 또는 비제한 최소 제곱의 알고리즘을 사용하는 선형 방정식의 시스템을 사용해 실험 산란 곡선과 계산된 산란 곡선 간의 불일치를 최소화한다. 형태 인자는 단량체, 이량체, 육량체 등의 결정 구조로부터 계산된다. 부피 분율은 백분율(%)로 표현된다.
본 발명의 유도체 및 종래 기술의 유도체로부터 수득된 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
본 발명의 유도체 및 비교자 인슐린 유사체의 SAXS 데이터
실시예 번호 조성물 실시예 10에 기술된 것과 같은 SAXS* 제형
M D+>D
1 A 100 0
1 B 100 0
1 C 100 0
1 I 99 1
1 I1 100 0
1 L 98 2
1 M 100 0
1 M1 100 0
1 D 100 0
1 D1 97 3
1 E 100 0
1 F 100 0
1 G 100 0
1 H 79 21
1 O 90 10
1 P 100 0
1 Q 100 0
1 B1 100 0
1 B2 100 0
1 B3 100 0
1 B4 100 0
2 A 100 0
2 I 100 0
2 B 100 0
2 L 100 0
2 M 100 0
2 O 100 0
2 P 100 0
2 Q 100 0
5 B 98 2
5 G 95 5
6 B 91 9
비교자 1 B 97 3
비교자 1 B4 95 5
비교자 1 G 77 23
비교자 1 H 4 96
비교자 2 A 100 0
비교자 2 J 0 100
비교자 2 K 87 13
비교자 2 K1 0 100
비교자 3 A# 35 65
비교자 3 B# 0 100
비교자 3 A+Zn 0 100
비교자 4 A 86 14
비교자 4 K 42 58
비교자 4 B4 87 13
비교자 4 K1 0 100
*) M: 조성물 중 단량체 종의 백분율; D: 조성물 중 단량체 종의 백분율; >D: 조성물 중 단량체보다 더 큰 종의 백분율;
#) 3 mM 대신 7 mM의 인산염 농도
결론적으로, SAXS 결과에 따르면 본 발명의 인슐린 유사체는 비교자 화합물보다 덜 자기 결합된다. 이러한 차이는 본 발명의 인슐린 유사체의 농도가 높을수록 더 두드러진다. 따라서, 본 발명의 인슐린 유사체는 특히 높은 농도의 조성물를 피하 주사한 후 더 신속하게 흡수될 것으로 예상된다.
실시예 12
인슐린 조성물에 대한 물리적 안정성 분석
실시예 10에 기술된 바와 같은 본 발명의 인슐린 유사체의 조성물(1 ml)을 2 ml 바이알에 옮기고 크림프 캡을 사용하여 시일하였다. 바이알을 눕힌 상태로 30℃에서 인큐베이션하였다. 2일마다, 바이알을 로봇 팔로 집고, 10000 lux의 배경 광을 조사하면서 바이알을 세운 상태로 사진을 촬영하였다. 생성된 이미지를 픽셀 분석 알고리즘을 사용하여 입자의 존재에 대해 분석하였다. 입자가 검출된 첫날이 아래 표에 나타나 있다.
임상적으로 관련된 조성물 중 본 발명의 인슐린 유사체의 물리적 및 화학적 안정성
실시예 번호 조성물 물리적 안정성 지연 시간 (일) HMWP 형성 (37℃에서 4주)
1 A >35 0.1
1 B >35 0.2
1 C >35 0.2
1 I >35 0.1
1 L ND 0.2
1 M ND 0.4
1 D >35 0.3
1 E >35 0.8
1 F >35 1.3
1 G >35 1.9
1 H 30 1.6
1 O >35 1.6
1 P >35 3.8
1 Q >35 8.6
1 B1 >35 0.1
1 B2 >35 0.8
1 B3 >35 0.6
1 B4 >35 0.1
2 A >35 0.1
2 I >36 0.1
2 B >40 0.1
2 L >40 0.1
2 M >40 0.1
2 O >36 0.7
2 P >36 0.6
2 Q >36 1.1
5 B >35 0.4
6 B >35 -0.1
6 G 15 2.1*
비교자 1 B 12 1.9
비교자 1 B4 2 1.7*
비교자 1 G 2 3.5*
비교자 1 H 4 3.2*
비교자 2 A >36 0.8
비교자 2 J 24 2.4*
비교자 2 K 13 3.9*
비교자 2 K1 5 1.1*
비교자 3 A# 5.3 1.6*
비교자 3 B# 3.3 1.8*
비교자 3 A+Zn >43 0.5
비교자 4 A 14 1.6*
비교자 4 B4 4 2.9*
#) 3 mM 대신 7 mM의 인산염 농도
ND: 미결정
*) 상청액 중에서 입자를 함유하는 샘플에 대한 HMWP를 결정하였고; 입자는 용해되지 않았다.
결론적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 임상적으로 관련된 무-Zn 조성물에서, 특히 높은 인슐린 농도에서 더 높은 물리적 안정성을 갖는다.
실시예 13
인슐린 조성물에 대한 화학적 안정성 분석
HMWP 함량
Waters 인슐린 HMWP 컬럼(125Å, 10 μm, WAT 201549, 7.8 x 300 mm)을 사용해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체 형태로부터 고분자량 단백질(HMWP)을 분리하였으며, 50%(v/v) 이소프로판올, 600 mM NaCl, 20 mM NaH2PO4가 함유된 용리액의 유속은 0.5 ml/분이었고, UV 검출은 215 nm에서 수행하였다.
일반적인 주입 부피는 5 μl의 600 μM 인슐린 조성물이었다.
결과는 위의 표 4에 나타나 있다.
실시예 14
LYD 돼지에서의 피하 PK/PD 프로파일
본 발명의 인슐린 유사체는 돼지에게 피하 투여하여, 예를 들어, 임상 조성물(FIASP®) 중 인슐린 아스파르트와 비교하거나, 본 프로토콜에 따른 종래 기술의 유사한 인슐린 유사체와 비교함으로써 시험할 수 있다. 유사체는 약동학 및/또는 약력학 파라미터에 대해 시험될 수 있다.
사용된 일반적인 방법
영구 정맥내 카테터를 삽입하기 위해 마취되어 있는 동안, Esaote 초음파 스캐너 모델 "MyLabFive" 및 선형 프로브 유형 "LA435 6-18 MHz"를 이용해 초음파로 돼지를 검사한다.
위의 귀와 견갑골 사이 중간 목의 좌측 및 우측에서, 하부 근육이 없고 피하 주사에 적합한 2 x 2 cm의 면적을 확인하고 문신으로 표시된다.
급식 일정
실험에 앞서 돼지를 금식시킨다(아침 급식을 하지 않음).
전체 실험 동안, 돼지를 정상적인 우리에 두고, 마취하지 않는다. 5시간 혈액 샘플을 채취할 때까지 돼지를 금식시키되, 물은 자유롭게 마실 수 있게 한다. 5시간 혈액 샘플을 채취한 후, 돼지에게 먹이와 사과를 먹인다.
피하 투여
5 mm 깊이의 니들 리듀서(needle reducer)를 사용하는 Novofine 30G 8 mm 바늘이 구비된 NovoPen Echo®에 Penfill을 장착하고, 이를 각 돼지에게 사용한다. 각 돼지에게 600 nmol/ml 인슐린 유사체를 함유하는 10 U(=60 μL)의 조성물을 투여한다.
돼지 목의 우측 또는 좌측(카테터의 반대쪽)에 측방향으로 피하 투여하고, 화합물이 안전하게 자리잡도록 주사 후 최소 10초 동안 피하에 바늘을 유지한다.
저혈당증의 치료
피하 투여 후, 저혈당증을 예방하기 위해 포도당 용액을 i.v. 주사할 준비가 되어 있어야 한다(즉, 4~5개의 주사기(20 mL)에 멸균된 20% 포도당을 채워서 사용할 준비가 되어 있어야 함). 저혈당증의 진단은 임상 증상 및 혈당 측정기(Glucocard X-meter)를 이용한 혈당 측정을 기반으로 한다.
치료는 50~100 ml의 20% 포도당(10~20 g 포도당)을 서서히 i.v. 주사하는 것으로 구성된다. 포도당은 효과가 나타날 때까지 5~10분에 걸쳐 분획으로 투여된다.
혈액 샘플링
실험에 앞서, 10 IU/mL 헤파린이 첨가하지 않은 멸균 0.9% NaCl로 경정맥 카테터의 개통성을 확인한다.
투여 전과 후에, 혈액 샘플은 다음 시점에 안정한 중심 정맥 카테터로부터 채취하게 된다:
투여 전 (-15, -5), 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 240, 300분.
샘플을 flowswitch로 채취한다. 샘플을 채취하기 전에 4~5 ml의 폐 혈액을 뽑아서 버린다.
포도당 및 인슐린 분석을 위해 EDTA로 코팅된 튜브에 0.8 ml의 혈액 샘플을 수집한다.
각각의 혈액 샘플을 채취한 후, 10 IU/mL 헤파린이 첨가되지 않은 5 ml의 멸균 0.9% NaCl로 카테터를 세척한다.
튜브를 최소 10회 부드럽게 기울여 혈액과 항응혈제(EDTA)가 충분히 섞이도록 한 다음, 1분 후 젖은 얼음 위에 놓는다. 혈액 샘플을 채취한 후 1시간 이내에, 튜브를 4℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 회전시킨다. 샘플은 피펫팅 전까지 젖은 얼음 위에 보관한다.
응고 위험이 높은 카테터에서 박테리아 성장을 피하기 위해 무균 기술이 요구된다.
실험 후 카테터의 폐쇄
투여 당일에 마지막 샘플을 채취한 후, 혈액 채취에 사용된 카테터를 통해 10 kg당 1 ml의 Pentrexyl®(10 ml 0.9% NaCl에 용해된 1 g의 암피실린)을 서서히 i.v. 투여하여 1회 정맥내 치료하였다. 이러한 치료 후, 카테터를 10 ml 0.9% NaCl로 세척한다.
카테터의 뚜껑으로서 0.5 ml의 TauroLockHep500을 막을 통해 주입하여 카테터를 폐쇄한다.
혈액 샘플 분석
혈장 포도당: BIOSEN 자가분석기를 이용해 혈장 내 포도당 농도를 측정하기 위해, 500 ul의 완충액에 10 ul의 혈장을 피펫팅한다.
혈장 인슐린: 분석을 위해 1 x 50 μl의 혈장을 0.65 ml Micronic® 튜브(ELISA/LOCI/SPA 설정)에 피펫팅한다.
혈장은 -20℃에서 냉동 보관한다.
PK 계산: 무한대에 대한 곡선 아래 면적(AUC) 및 부분 AUC인 AUC0-5, AUC0-10, AUC0-15, AUC0-20, 및 AUC0-30은 Phoenix 64(Certara, US)를 이용해 선형 업 로그업 계산 방법을 적용한 비구획 분석에 의해 계산하였다. LYD 돼지에서 인슐린 유사체에 대한 유사한 iv 특성에 기초하여, 부분 AUC/AUCinf 사이의 비율을 흡수율에 대한 척도로서 사용하였다.
도 1 및 도 2는, 본 발명의 유사체가 FIASP®에 비해 더 빨리 작용을 개시하고; 본 발명의 인슐린 유사체에 대한 최소 포도당 수준이 FIASP®에 비해 더 낮으므로, 본 발명의 유사체가 FIASP®보다 인슐린 펌프에 사용하기에 더 적합하다는 것을 보여준다. 또한, FIASP®와 비교했을 때, 본 발명의 인슐린 유사체의 경우 작용 오프셋이 더 빠르며, 작용 오프셋이 더 빠르다는 것은 인슐린 펌프에 유익하다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> NOVEL INSULIN ANALOGUES AND USES THEREOF <130> 190084WO01 <150> EP19215315.3 <151> 2019-12-11 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of analogue [A9E] of human insulin of Example 1, 2, 3 and 4 <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Glu Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-chain analogue [B3E, B26E, desB30] of human insulin of example 1 <400> 4 Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Glu Thr Pro Lys 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-chain analogue [B3E, B27E, B28E, desB30] of human insulin of example 2 <400> 5 Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Glu Glu Lys 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-chain analogue [B3E, B26E] of human insulin of example 3 <400> 6 Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Glu Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B-chain analogue [B3E, B27E, B28E] of human insulin of example 4 <400> 7 Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Glu Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of analogue [A9D] of human insulin of Example 5 <400> 8 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Asp Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of analogue [A9E, A21A] of human insulin of Example 6 <400> 9 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Glu Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Ala 20

Claims (15)

  1. 인슐린 유사체로서, 유사체는 A9E 또는 A9D를 포함하고, 인간 인슐린에 비해 B3E 및/또는 desB30을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
  2. 제1항에 있어서, 유사체는 B26E, B27E, 및/또는 B28E 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
  3. 제2항에 있어서, 유사체는 A21A 치환을 추가로 포함하는, 인슐린 유사체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체는
    A9D, B3E;
    A9E, B3E;
    A9D, desB30;
    A9E, desB30;
    A9D, B3E, desB30;
    A9E, B3E, desB30;
    A9D, B3E, B26E;
    A9E, B3E, B26E;
    A9D, B26E, desB30;
    A9E, B26E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, desB30;
    A9E, B3E, B26E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E;
    A9E, A21A, B3E, B26E;
    A9D, A21A, B26E, desB30;
    A9E, A21A, B26E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B26E, desB30;
    A9D, B3E, B27E;
    A9E, B3E, B27E;
    A9D, B27E, desB30;
    A9E, B27E, desB30;
    A9D, B3E, B27E, desB30;
    A9E, B3E, B27E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B27E;
    A9E, A21A, B3E, B27E;
    A9D, A21A, B27E, desB30;
    A9E, A21A, B27E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B27E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B27E, desB30;
    A9D, B3E, B28E;
    A9E, B3E, B28E;
    A9D, B28E, desB30;
    A9E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B28E, desB30;
    A9E, B3E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B28E;
    A9E, A21A, B3E, B28E;
    A9D, A21A, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B27E;
    A9E, B3E, B26E, B27E;
    A9D, B26E, B27E, desB30;
    A9E, B26E, B27E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B27E, desB30;
    A9E, B3E, B26E, B27E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B27E;
    A9E, A21A, B3E, B26E, B27E;
    A9D, A21A, B26E, B27E, desB30;
    A9E, A21A, B26E, B27E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, desB30;
    A9D, B3E, B27E, B28E;
    A9E, B3E, B27E, B28E;
    A9D, B27E, B28E, desB30;
    A9E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B27E, B28E, desB30;
    A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B27E, B28E;
    A9E, A21A, B3E, B27E, B28E;
    A9D, A21A, B27E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B27E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B28E;
    A9E, B3E, B26E, B28E;
    A9D, B26E, B28E, desB30;
    A9E, B26E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B28E, desB30;
    A9E, B3E, B26E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B28E;
    A9E, A21A, B3E, B26E, B28E;
    A9D, A21A, B26E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B26E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B3E, B26E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B27E, B28E;
    A9E, B3E, B26E, B27E, B28E;
    A9D, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9E, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9E, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
    A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E;
    A9D, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9E, A21A, B26E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30; 또는
    A9E, A21A, B3E, B26E, B27E, B28E, desB30인, 인슐린 유사체.
  5. 제4항에 있어서, 유사체는
    A9E, B3E, B26E;
    A9E, B3E, B27E, B28E;
    A9E, B3E, B26E, desB30;
    A9E, B3E, B27E, B28E, desB30;
    A9D, B3E, B26E, desB30; 또는
    A9E, A21A, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
  6. 제5항에 있어서, 유사체는 A9E, B3E, B26E, desB30인, 인슐린 유사체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유도체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 인슐린 유사체는 0.6 mM 내지 3 mM의 농도인, 약학적 조성물.
  9. 제7항 내지 제8항에 있어서, 조성물은 아연을 포함하지 않는, 약학적 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항에 있어서, 니코틴 화합물, 및 특히 니코틴아미드를 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 제7항 내지 제9항에 있어서, 조성물은 니코틴 화합물, 및 특히 니코틴아미드를 포함하지 않는, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아연을 포함하지 않는 약학적 조성물 중의 단량체인, 인슐린 유사체.
  13. 제7항에 있어서, 화학적 및/또는 물리적으로 안정한 인슐린 유사체.
  14. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체 또는 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물.
  15. 인간 신체의 질환 또는 장애 또는 병태를 치료, 예방, 또는 완화하는 방법으로서, 질환, 장애, 또는 병태는 당뇨병, 특히 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 연관되고, 상기 방법은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체 또는 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 살아 있는 동물 신체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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