ES2563553T3

ES2563553T3 - Conjugados de insulina-albúmina

Info

Publication number: ES2563553T3
Application number: ES09727247.0T
Authority: ES
Inventors: Tina Møller TAGMOSE; Peter Madsen; Thomas Børglum KJELDSEN
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2016-03-15
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: JP2011518779A; EP2262539B1; US9242011B2; WO2009121884A1; CN102065903A; US20110039769A1; CN102065903B; EP2262539A1; JP5818681B2

Abstract

Un compuesto de fórmula II: M-Zn-Yo-Ins, o de fórmula III: Alb-M'-Zn-Yo-Ins; en dichas fórmulas Ins representa un análogo de la insulina, donde dicho análogo de la insulina tiene un residuo de lisina en el extremo C-terminal de la cadena A, incluido el extremo C-terminal de una extensión de la cadena A, donde dicha extensión, comparada con el residuo de aminoácido A21, consta de un único residuo de aminoácido que es lisina; o un residuo de lisina en el extremo C-terminal de una extensión de aminoácidos en la cadena A que consta de 2-5 residuos de aminoácidos; y, opcionalmente, donde en dicho análogo de la insulina hasta seis residuos de aminoácidos en las posiciones A1-A21 y B1-B30 de la insulina humana han sido eliminados o sustituidos por otro residuo de aminoácido; y M' representa el grupo reactivo tiol denominado M después de la reacción con un grupo tiol de Alb (albúmina); M representa un aceptor de Michael representado por un grupo malimido, una vinilsulfona, un grupo reactivo tiol representado por yoduro, piridildisulfuro, metoxi o etoxicarbonil disulfuro y o-nitrofenildisulfuro; donde M y M' están unidos, a través del conector Zn-Yo, al grupo épsilon-amino del residuo de lisina C-terminal de la cadena A, donde de dicho grupo épsilon-amino se ha eliminado un átomo de hidrógeno; Z es un enlace covalente, o representa una porción de una de las seis fórmulas siguientes: -NH-(CH2-CH2-O)p-CH2- CO-; -NH-(CH2)q-CH2-CO-; -NH-(CH2-CH2-O)r-CH2-CH2-CO-; -HN-CH2-CH2-NH-CO-; -NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NHCO- CH2-CH2-CO-; y -NH-C6H4-CO-; en las que p es 0 (cero) o un número entero en el intervalo entre 1 y 24; q es 0 (cero) o un número entero en el intervalo entre 1 y 24; r es 0 (cero) o un número entero en el intervalo entre 1 y 24; y -C6H4- es para-fenileno; n representa un número entero en el intervalo entre 1 y 10; Y tiene uno de los significados indicados para Z; o es 0 a 10; y Alb se elige del grupo que consiste en Albagen y seroalbúmina humana.

Description

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La insulina con el conector unido (insulina de fórmula II) puede después, si se desea, hacerse reaccionar con albúmina. Esta reacción se puede realizar ex-vivo (es decir, in vitro) o in vivo. El tiol libre de un residuo de cisteína de la albúmina reacciona con el grupo funcional reactivo tiol M del conector unido a la insulina (por ej. en una reacción de Michael o en una reacción de sustitución) para formar el conjugado de insulina-albúmina representado por la fórmula general (III).

Alb es albúmina según se definió en este documento, y está unida a través de un grupo tiol libre de un residuo de Cys, preferentemente el residuo Cys-34.

En una realización, M' es uno de los cuatro grupos de las fórmulas generales siguientes:

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o

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donde t es el definido antes. 15 En otra realización, M' se elige del grupo que consiste en

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y -CH2-CO-(es decir metilcarbonilo).

El grupo ilustrado por el símbolo Ins se origina a partir de un compuesto de fórmula general Ins-H en el que Ins es la definida antes. Los compuestos de fórmula general Ins-H en los que Ins es la definida antes, son o bien compuestos

20 conocidos o bien compuesto que se pueden preparar análogamente a la preparación de compuestos conocidos.

En otra realización, la insulina original presente en los compuestos de esta invención puede, aparte de cualquier lisina en la posición A22 y aparte de cualquier residuo peptídico unido C terminalmente al residuo de aminoácido A21 y aparte de las mutaciones B29R y/o desB30, comprender una o más de las mutaciones siguientes. En este documento, se indica primero la posición en la cadena A o B, y después, se indican el posible o los posibles residuos

25 de aminoácidos como códigos de una letra. En una realización, hay 6 mutaciones, en otra realización, hay 5 mutaciones, en otra realización, hay 4 mutaciones, en otra realización, hay 3 mutaciones, en otra realización, hay 2 mutaciones, en otra realización, hay 1 mutación y en otra realización, no hay ninguna mutación, aparte de cualquier lisina en la posición A22 y aparte de cualquier residuo peptídico unido C terminalmente al residuo de aminoácido A21 y aparte de las mutaciones B29R y/o desB30:

30 A4: A o Q.

A5: L.

A8: R, N, Q, E, H, L o W.

A9: R o L.

A14: E o D.

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A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 insulina humana

A8H, A22K, B29R, desB30 insulina humana

A18L, A22K, B29R, desB30 insulina humana

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A8H, A18L, A22K, B10E, B29R, desB30 insulina humana

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A22K, B27Y, B29R, desB30 insulina humana

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A22K, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B27Y, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A8H, A22K, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB26, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB25, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB26, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B28D, B29R, desB30 insulina humana

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A9L, A22K, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A4A, A22K, B28E, B29R, desB30 insulina humana

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A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A22G, A23G, A24K, B29R, desB30 insulina humana

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A21G, A22K, B29R, desB30 insulina humana

A21G, A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22K, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22G, A23G, A24K, B29R, desB30 insulina humana

A14E, A21Q, A22K, B25H, B29R, desB30 insulina humana

A14E, A21G, A22K, B25H, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B3Q, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B3S, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B3T, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B1Q, B29R, desB30 insulina humana

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A18Q, A22K, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB1, B3Q, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B28D, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB27, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B28R, desB29, desB30 insulina humana

A22K, B3Q, B28E, B29R, desB30 insulina humana

A22K, B13Q, B29R, desB30 insulina humana

A22K, desB1, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22G, A23G, A24K, B29R, desB30 insulina humana

A21A, A22K, B29R, desB30 insulina humana

A21A, A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A21G, A22G, A23K, B29R, desB30 insulina humana

A21A, A22G, A23G, A24K, B29R, desB30 insulina humana

A21G, A22G, A23G, A24K, B29R, desB30 insulina humana

A21Q, A22K, B3Q, B29R, desB30 insulina humana

A21A, A22K, B3Q, B29R, desB30 insulina humana

A21G, A22K, B3Q, B29R, desB30 insulina humana

Las insulinas originales se pueden preparar de manera conocida per se. Por ejemplo, se pueden producir expresando una secuencia de ADN que codifique la insulina de cadena única en cuestión, en una célula huésped adecuada, por técnicas bien conocidas como la dada a conocer, por ej., en EP 1,246,845. La insulina se expresa en

5 una célula huésped transformada como una molécula precursora que es convertida en la molécula de insulina deseada por procesos enzimáticos y químicos in vitro como los dados a conocer, por ej., en EP 163,529 y EP 214,826. La molécula precursora se puede expresar con una extensión N-terminal que posteriormente es escindida como se da a conocer, por ej., en EP 1246,845. Los ejemplos de extensiones N-terminales del tipo adecuado en la presente invención son, por ej., los dados a conocer en la patente de Estados Unidos Nº 5,395,922 y en la patente

10 EP Nº 765,395. Más específicamente, se puede hacer referencia a WO 2006/082205, desde la página 37, línea 31, hasta la página 39, línea 29.

Cuando se administra un compuesto de la fórmula general II anterior a un ser humano, se conjuga con la seroalbúmina humana formando un compuesto de la fórmula general III anterior. Por consiguiente, tanto los compuestos de la fórmula general II anterior como los compuestos de la fórmula general III anterior se pueden usar

15 como un medicamento, por ejemplo en el tratamiento de la diabetes. Los compuestos de fórmula general II y los compuestos de la fórmula general III pueden, colectivamente, ser ilustrado por la fórmula general IV:

A-Zn-Yo-Ins (IV)

en la que A tiene el mismo significado que M y Alb-M'-colectivamente, y Z, n, Y, o, Ins, M, Alb y M' son, cada uno, los definidos en este documento.

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menos aproximadamente 50% del polvo seco consiste en partículas que tienen un diámetro menor de aproximadamente 10 µm. Dichas formulaciones se pueden lograr mediante secado por aspersión, molienda o punto de condensación crítico de una solución que contenga el compuesto de esta invención y otros ingredientes deseados. Se conocen otros métodos también adecuados para generar partículas útiles para la invención actual.

Generalmente las partículas se separan de una formulación en polvo seco en un recipiente y después son transportadas al interior del pulmón de un paciente a través de un sistema portador de corriente de aire. Habitualmente, en los inhaladores de polvo seco actuales, la fuerza para desintegrar el sólido es proporcionada únicamente por la inhalación del paciente. En otro tipo de inhalador, el flujo de aire generado por la inhalación del paciente activa un motor impulsor que desaglomera las partículas.

Las formulaciones de los compuestos de esta invención para administración desde un inhalador de polvo seco incluyen generalmente un polvo seco finamente dividido que contiene el derivado, pero el polvo también puede incluir un incrementador de volumen, un portador, un excipiente, otro aditivo o análogos. Se pueden incluir aditivos en una formulación en polvo seco de un compuesto, por ej., para diluir el polvo según sea necesario para el suministro desde el inhalador de polvo particular, para facilitar el procesamiento de la formulación, para proporcionar propiedades del polvo ventajosas para la formulación, para facilitar la dispersión del polvo desde el dispositivo de inhalación, para estabilizar la formulación (por ejemplo, antioxidantes o tampones), para proporcionar sabor a la formulación, o similares. Convenientemente, el aditivo no afecta adversamente a las vías respiratorias del paciente. El compuesto se puede mezclar con un aditivo a nivel molecular o la formulación sólida puede incluir partículas del compuesto mezcladas con, o depositadas sobre, partículas del aditivo. Los aditivos típicos incluyen mono, di y polisacáridos; alcoholes de azúcares y otros polioles, por ej. lactosa, glucosa, rafinosa, melezitosa, lactitol, maltitol, trehalosa, sacarosa, manitol, almidón o sus combinaciones; surfactantes como sorbitoles, difosfatidilcolina o lecitina,

o similares. Habitualmente un aditivo, como un incrementador de volumen, está presente en una cantidad eficaz para uno de los propósitos descritos antes, a menudo entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90% en peso de la formulación. También se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína como una proteína análoga a la insulina.

Se puede producir un aerosol que contenga los compuestos de esta invención forzando a presión una suspensión o solución del compuesto a través de una boquilla. El tamaño y la configuración de la boquilla, la presión aplicada y la velocidad de alimentación del líquido se pueden elegir para lograr la salida y el tamaño de partícula deseados. Se puede producir una electronebulización, por ej., mediante un campo eléctrico conectado a una alimentación capilar o por boquilla. Convenientemente, las partículas del conjugado de la insulina suministradas por un pulverizador tienen un tamaño de partícula menor de aproximadamente 10 µm, preferentemente en el intervalo entre aproximadamente 1 µm y aproximadamente 5 µm.

Las formulaciones de los compuestos de esta invención, adecuadas para utilizar con un pulverizador, contendrán generalmente los compuestos en una solución acuosa a una concentración entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg del compuesto por ml de solución. Dependiendo del compuesto elegido y de otros factores conocidos por el asesor médico, el límite superior puede ser menor de, por ej., 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100 o 50 mg del compuesto por ml de solución. La formulación puede contener agentes como un excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante, y preferentemente, zinc. La formulación también puede contener un excipiente o un estabilizante del compuesto, como un tampón, un reductor, una proteína incrementadora del volumen o un carbohidrato. Las proteínas incrementadoras del volumen útiles en la formulación de conjugados de la insulina incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos típicos útiles en la formulación del compuesto incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, ciclodextrina o análogos. La formulación de los compuestos también puede contener un surfactante, que puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie del conjugado de la insulina, causada por la atomización de la solución al formar un aerosol. Se pueden emplear diversos surfactantes convencionales, como ésteres de polioxietileno de ácidos grasos y alcoholes, y ésteres de polioxietilensorbitol de ácidos grasos. Las cantidades variarán generalmente entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 4% en peso de la formulación.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de esta invención también se pueden administrar por vía parenteral a los pacientes que necesitan un tratamiento de ese tipo. La administración parenteral se puede realizar por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa en forma de lapicera. Alternativamente, la administración parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusión.

Las composiciones inyectables de los compuestos de esta invención se pueden preparar usando las técnicas convencionales de la industria farmacéutica que implican disolver y mezclar los ingredientes según sea apropiado para dar el producto final deseado. Por lo tanto, según un procedimiento, un compuesto se disuelve en una cantidad de agua que sea algo menor que el volumen final de la composición que se va preparar. Se agregan zinc, un agente isotónico, un conservante y/o un tampón, según sea necesario, y el valor del pH de la solución se ajusta, si fuera necesario, utilizando un ácido, por ej., ácido clorhídrico, o una base, por ej., hidróxido de sodio acuoso, según sea necesario. Finalmente, el volumen de la solución se ajusta con agua para dar la concentración deseada de los ingredientes.

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Paso 2: A22K[Nε-12{[2-Albagen-Cys34-ilacetilamino}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

Se disolvió Albagen (vial de 200 mg hecho por encargo por New Century Pharmaceuticals, Inc. recombinante no estabilizada, deshidratada por congelación) en tampón de reacción (Na2HPO4 0.15 M pH 7.0, manitol al 2%, 3 ml). Se le agregó una solución de A22K(Nε-12-(2-yodoacetilamino)dodecanoil), B29R, desB30 insulina humana (20 mg) en tampón de reacción/acetonitrilo 1:1 (2.0 ml) para dar una solución. El pH fue de 7.3. La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente en oscuridad toda la noche. Se le agregó sulfato de amonio (1 g) y la mezcla se filtró a través de un filtro Millex de 0.22 µm. La purificación se realizó como se describe en el ejemplo 1. El producto se almacenó en tampón B en el congelador. La concentración se determinó por medición de la absorbancia usando el coeficiente de extinción: 41479. LC-MS, M/z: 1542.29 (M+47), combinado: 72430.

Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido 12-(2-yodoacetilamino)dodecanoicoPaso 1: Ácido 12-(2yodoacetilamino)dodecanoico

Se disolvió ácido yodoacético (1.00 g) en diclorometano y se mantuvo en la oscuridad. Se le agregaron TSTU (1.62 g) y DIPEA (1.03 ml). Después de agitar durante 45 min se le agregó una suspensión de ácido 12aminododecanoico (1.14 g) en NMP (10 ml) y DIPEA (1.03 ml). Después de agitar durante 4 h la mezcla se vertió en HCl 0.5 N (300 ml) y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con HCl 0.1 N, se secó con sulfato de magnesio y se concentró para dar un aceite. El residuo se disolvió en una mezcla de éter dietílico y acetato de etilo, se lavó con agua, se secó con sulfato de magnesio y se concentró para dar un sólido. Este sólido se trituró en éter dietílico y se filtró para dar un polvo. Rendimiento 1.05 g, 50%. LC-MS, M/z: 384.2 (M+1).

Paso 2: Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido 12-(2-yodoacetilamino)dodecanoico

A una solución de ácido 12-(2-yodoacetilamino)dodecanoico (460 mg) en THF (10 ml) se le agregaron TSTU (415 mg) y DIPEA (0.315 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla se vertió en HCl 0.5 N (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 × 200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con HCl 0.1 N y solución saturada de cloruro de sodio, se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron. El residuo se usó sin purificación adicional. Rendimiento 99% (575 mg). LC-MS, M/z: 481.2 (M+1).

Ejemplo 3

A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34ilacetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil] B29R, desB30 insulina humana

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Paso 1: A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Yodoacetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)-etoxi]etoxi}acetil] B29R, desB30 insulina humana

A una solución de A22K, B29R, desB30 insulina humana (WO 2007096431) (0.800 g) en carbonato de sodio 0.1 M (16 ml) a pH 10.5, se le agregó una solución de éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2yodoacetilamino)-dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acético (105 mg) en acetonitrilo/etanol 1:1 (10 ml). El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 10.6. Después de agitar suavemente durante 30 min, se agregó agua (50 ml) y el pH se ajustó a 5.5 con HCl 1 N para producir la precipitación. El producto se centrifugó a 3000 g durante 10 min. El sobrenadante se descartó y el producto sólido se purificó por HPLC preparativa: columna C18, 3 cm (Gemini), tampón A: 0.1 % de TFA en agua MiliQ, tampón B: 0.1 % de TFA en AcCN, flujo 20 ml/min, gradiente 5-80% de B en 60 min. Rendimiento 280 mg, LC-MS, M/z: 1630.23 (M+4).

Paso 2: A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-ilacetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil] B29R, desB30 insulina humana

Se disolvió Albagen (vial de 200 mg hecho por encargo por New Century Pharmaceuticals, Inc. recombinante no estabilizada, deshidratada por congelación) en tampón de reacción (Na2HPO4 0.15 M pH 7.0, manitol al 2%, 3 ml). Se le agregó una solución de A22K[Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-({2-yodoacetilamino}dodecanoilamino)etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] B29R, desB30 insulina humana (20 mg) en tampón de reacción/acetonitrilo 1:1 (2.0 ml) para dar una solución. El pH fue de 7.3. La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente en oscuridad toda la noche. Se le agregó sulfato de amonio (1 g) y la mezcla se filtró a través de un filtro Millex de 0.22 µm. La purificación se realizó como se describe en el ejemplo 1. El producto se almacenó

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en tampón B en el congelador. La concentración se determinó por medición de la absorbancia usando el coeficiente de extinción: 41479. LC-MS, M/z: 1774.71 (M+31), 1732 (M+32), 1548 (M+47).

Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2yodoacetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)-acético

Paso 1: Ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-yodoacetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acético

A una solución de ácido [2-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilamino]etoxi)etoxi]acético (194 mg) en carbonato de sodio 0.1 M se le agregó acetonitrilo (5 ml) seguido de una solución de éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido 12(2-yodoacetilamino)dodecanoico (260 mg) en acetonitrilo (6 ml). Después de agitar durante 45 min, se ajustó el pH a 4 con HCl 1 N y la mezcla se purificó por HPLC preparativa: columna C18, 3 cm (Gemini), tampón A: 0.1% de TFA en agua MiliQ, tampón B: 0.1% de TFA en AcCN, flujo 20 ml/min, gradiente 10-80% de B en 30 min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se concentraron para dar el compuesto del título con un rendimiento de 49% (180 m). LC-MS, M/z: 674.3 (M+1).

Paso 2: Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2yodoacetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}-etoxi)acético

A una solución de ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-yodoacetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acético (50 mg) en etanol (1.5 ml) se le agregaron TSTU (24 mg) y DIPEA (0.020 ml). Después de agitar a temperatura ambiente toda la noche, la mezcla se usó directamente para acilación de los derivados de la insulina, sin procesamiento ni purificación.

Ejemplo 4

A18L, A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-il-acetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil] B29R, desB30 insulina humana

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Paso 1: A18L, A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2yodoacetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil] B29R, desB30 insulina humana

A una solución de A18L, A22K, B29R, desB30 insulina humana (0.300 g) en carbonato de sodio 0.1 M (4 ml) y etanol (3 ml) a pH 10.7, se le agregó una solución de éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido (2-{2-[2-(2-{2-[12-(2yodoacetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acético (55 mg) en etanol (1.5 ml). El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 10.7. Después de agitar suavemente durante 60 min, se agregó agua (40 ml) y el pH se ajustó a 5.5 con HCl 1 N para producir la precipitación. El producto se centrifugó a 3000 g durante 10 min. El sobrenadante se descartó y el producto sólido se purificó por HPLC preparativa: columna C18, 3 cm (Gemini), tampón A: 0.1% de TFA en agua MiliQ, tampón B: 0.1% de TFA en AcCN, flujo 20 ml/min, gradiente 10-70% de B en 45 min. Rendimiento 72 mg, LC-MS, M/z: 1304.6 (M+5).

Paso 2: A18L, A22K[Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-il-acetilamino}dodecanoilamino)etoxi]etoxi]acetilamino)etoxi}etoxi]acetil] B29R, desB30 insulina humana

Se disolvió Albagen (vial de 200 mg hecho por encargo por New Century Pharmaceuticals, Inc. recombinante no estabilizada, deshidratada por congelación) en tampón de reacción (Na2HPO4 0.15 M pH 7.0, manitol al 2%, 3 ml). Se agregó una solución de A18L, A22K[Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-({2yodoacetilamino}dodecanoilamino)etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] B29R, desB30 insulina humana (18.3 mg) en tampón de reacción/acetonitrilo 1:1 (2.0 ml) para dar una solución. El pH se elevó a 7.4 con NaOH 1 N. La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente en oscuridad toda la noche. Se le agregó sulfato de amonio (1 g) y la mezcla se filtró a través de un filtro Millex de 0.22 µm. La purificación se realizó como se describe en el ejemplo 1. El producto se almacenó en tampón B en el congelador. La concentración se determinó por medición de la absorbancia usando el coeficiente de extinción: 41479. LC-MS, M/z: 72716.18

El conjugado de albúmina-insulina de la invención de los ejemplos siguientes se puede preparar de manera similar.

Ejemplo 5

A18L, A22K[Nε-12-{2-(Albagen-Cys34-il)acetilamino}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 6

A5L, A22K[Nε-12-{2-(Albagen-Cys34-il)acetilamino}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 7

A18L, A22K[Nε-12-{2-(seroalbúmina humana-Cys34-il)acetilamino}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 8

A22K[Nε-12-{2-(seroalbúmina humana-Cys34-il)acetilamino}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 9

A5L, A22K[Nε-12-{2-(seroalbúmina humana-Cys34-ilacetilamino)}dodecanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 17

A18L, A22K[Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{seroalbúmina humana-Cys34il}acetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil]] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 18

A5L, A22K[Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{seroalbúmina humana-Cys34il}acetilamino)dodecanoilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil]] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 19

10 A22K[Nε-10-{2-(Albagen-Cys34-il)acetilamino}decanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Ejemplo 20

A18L, A22K[Nε-10-{2-(Albagen-Cys34-il)acetilamino}decanoil] B29R, desB30 insulina humana

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15 Ejemplo 21 A22K[Nε-10-{2-(seroalbúmina humana-Cys34-il)acetilamino}decanoil] B29R, desB30 insulina humana

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Claims

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