CN102065903B

CN102065903B - 胰岛素清蛋白缀合物

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Publication number: CN102065903B
Application number: CN200980111859.7A
Authority: CN
Inventors: T·M·塔格莫斯; P·马德森; T·B·克尔德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: WO2009121884A1; CN102065903A; US9242011B2; JP5818681B2; ES2563553T3; US20110039769A1; EP2262539A1; JP2011518779A; EP2262539B1

Abstract

由胰岛素类似物、双功能接头和清蛋白组成的胰岛素清蛋白缀合物可有效用于治疗糖尿病。

Description

胰岛素清蛋白缀合物

发明领域

本发明涉及新胰岛素清蛋白缀合物、制备这种胰岛素清蛋白缀合物的方法、含有该胰岛素清蛋白缀合物的胰岛素制剂以及使用这些胰岛素清蛋白缀合物治疗糖尿病的方法。

发明背景

糖尿病(1型和2型糖尿病)是部分或完全丧失葡萄糖利用能力的代谢病症。全人类中约5％罹患糖尿病，而该病症接近流行性比例。自从1920年代发现胰岛素以来，人们在改善糖尿病治疗上投注了持续的努力。由于糖尿病患者接收在几十年期间的长期治疗，所以主要需求安全、方便和提高生活质量的基于胰岛素的治疗法。

人类胰岛素由两个多肽链组成，称为A和B链，其含有21和30个氨基酸残基。一种胰岛素类似物是人胰岛素，其中用其他氨基酸交换一个或多个氨基酸。一些商购可得胰岛素制剂特征在于作用快速开始，而其他制剂则具有相对较慢的开始、但显示或多或少延长的作用。

1型和2型糖尿病的治疗一般包括用于餐间和夜间糖血控制的长效基础胰岛素处理和用于进餐刺激的高血糖的短效餐前推注(bolus)胰岛素处理。治疗目的是长期保持接近血糖正常控制。

治疗性肽或蛋白质例如胰岛素与人血清清蛋白或其衍生物的缀合导致该治疗性肽或蛋白质针对蛋白酶的保护。治疗剂增加的大小导致清除的降低。缀合也因此导致延长的缀合物滞留期(见WO 01/77137和WO 2006/012346)。胰岛素与清蛋白的缀合导致延长的作用概况以及由此注射频率的降低。接近血糖量正常的保持导致低血糖症风险降低(参见Diabetes 2005，54卷，251-258，以及Bioconjugate Chem.2005，16卷，1000-1008)。

WO 00/69900中权利要求7涉及针对肽酶活性保护治疗性肽的方法，包括例如形成肽-血液组分缀合物，其中血液组分根据权利要求14是清蛋白。WO 00/69900中的具体实施例无一涉及胰岛素。

WO 2005/012346中的权利要求1涉及胰岛素衍生物，其含有胰岛素分子和共价结合血液组分的反应基团。根据其中的权利要求2，将该反应基团与胰岛素分子(即，人胰岛素)的氨基酸偶联，所述氨基酸的位置选自位置Gly A1、PheB1和LysB29。

WO 2005/103087中的权利要求1涉及将清蛋白缀合物从未缀合的清蛋白分离的方法。WO 2005/103087中作为例子的胰岛素是人胰岛素以及在A1、B1或B29具有延伸的胰岛素，所有均含有A21Asn(A21N)。

WO 2007/071068中的权利要求1涉及缀合物制备方法，所述缀合物含有与化合物共价连接的清蛋白。在其中第9页16行提到胰岛素。在WO 2007/071068没有提供具体实施例。

通常，通过皮下注射施用胰岛素制剂。

发明的方面

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约6小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约12小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约18小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约24小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约36小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物皮下施用时提供至少约48小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约6小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约12小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约18小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约24小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约36小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经肺施用时提供至少约48小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经口施用时提供至少约24小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经口施用时提供至少约36小时的接近血糖量正常。

本发明的一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物经口施用时提供至少约48小时的接近血糖量正常。

本发明的另一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物每日仅施用一次以提供满意的血糖水平基础控制。

本发明的另一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物在治疗期间不引起或仅低程度地引起体重增加。

本发明的另一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物在治疗期间引起体重降低。

本发明的另一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物不引起或仅低程度地引起低血糖事件。

本发明的另一个方面涉及胰岛素衍生物的提供，所述胰岛素衍生物是肝选择性的(hepato-selective)。

本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或是提供有用的备选方案。

定义

此处，术语胰岛素包含天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，及其胰岛素类似物。

此处，术语氨基酸残基包含从其中氢原子已从氨基中去除和/或羟基已从羧基中去除和/或氢原子已从巯基中去除的氨基酸。不精确地，氨基酸残基可以叫做氨基酸。

此处，术语肽残基包含从其中氢原子已从氨基中去除和/或羟基已从羧基中去除和/或氢原子已从巯基中去除的肽。不精确地，肽残基可以叫做肽。

此处，术语胰岛素类似物(或胰岛素的类似物)包含这样的多肽，其具有在形式上可以通过缺失和/或置换(替换)在天然胰岛素中存在的一个或多个氨基酸残基，并且任选地通过给A21氨基酸残基添加一个或多个氨基酸残基，而得自天然存在的胰岛素例如人胰岛素的结构的分子结构。优选地，添加和/或置换的氨基酸残基是可编码氨基酸残基。例如，A链可以在其C末端处延伸例如1、2、3或4个氨基酸残基(与人胰岛素相比较)，其位置分别表示为A22、A23、A24和A25。即使胰岛素类似物具有在A21/A22位置处的延伸，在所述胰岛素类似物中的其他位置处也可能存在缺失。类似于在人胰岛素中，在本发明的化合物中存在的胰岛素类似物中，A21氨基酸残基连接于在20位置的Cys残基的N末端，所述Cys残基参与链间二硫键的形成。此处，术语亲本胰岛素或亲本胰岛素类似物也用于胰岛素类似物。主要地，当与携带侧链的胰岛素类似物区分时，使用术语亲本，所述侧链例如可以通过酰化而化学引入。

此处，术语突变包含氨基酸序列中的任何改变(用可编码氨基酸的置换和插入以及缺失)。

此处，术语如A1、A2、A3等分别指示在胰岛素A链中的位置1、2和3(从N末端计数)。类似地，术语如B1、B2、B3等分别指示在胰岛素B链中的位置1、2和3(从N末端计数)。使用关于氨基酸的单字母密码，术语如A21A、A21G和A21Q指定A21位置中的氨基酸分别是A、G和Q。使用关于氨基酸的三字母密码，相应表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。

此处，术语如desB29和desB30分别指示缺乏B29或B30氨基酸残基的胰岛素类似物。

胰岛素类似物以及A和B链中的位置编号如此完成，从而使得亲本化合物是具有用于其的编号的人胰岛素。

此处，表达“可编码的”与术语如氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基结合用于指示可以由核苷酸三联体(“密码子”)编码的氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基，参见基因工程。

此处，术语清蛋白包括来自多个物种的血清清蛋白，例如人(HSA，人血清清蛋白)、大鼠(RSA，大鼠血清清蛋白)、小鼠(MSA，小鼠血清清蛋白)、猪(PSA，猪血清清蛋白)、牛(BSA，牛血清清蛋白)、狗(CSA，犬血清清蛋白)和兔(RaSA，兔血清清蛋白)，重组清蛋白，例如Albagen，其是具有N末端残基(Asp)缺失的重组人血清清蛋白，以及来自基因组来源的清蛋白。

清蛋白内的位置编号如此完成，从而使得亲本化合物是人血清清蛋白。术语如Cys34指在34位置上的Cys。在缺少第一个氨基酸的重组人血清清蛋白Albagen中，将自由Cys称为Cys34。

此处，术语Michael受体包含但不限于α，β不饱和羰基部分、马来酰亚胺基团和乙烯砜基团。

此处，术语硫羟反应基团包含但不限于碘乙酰胺基团，不对称二硫化物(disulfide)，其中双功能接头(如此处所定义)提供不对称二硫化物中的巯基功能中的一个，而另一个起到离去基团的作用。这种不对称二硫化物的实例是吡啶基二硫化物、(甲氧或乙氧羰基)二硫化物、以及(邻硝基苯基)二硫化物。

具有胰岛素活性的胰岛素清蛋白缀合物指一种胰岛素清蛋白缀合物，它具有降低哺乳动物血糖的能力，或者具有胰岛素受体结合亲和力，所述降低哺乳动物血糖的能力是在适当的动物模型中(其可以是例如大鼠、兔、狗或猪模型)在适当的施用例如静脉内、皮下或经肺施用后测量得到的。

此处，术语肝选择性包含在肝上的胰岛素作用的选择性超过外周组织例如肌肉和/或脂肪上的胰岛素作用。相对于在外周组织例如肌肉和/或脂肪上的胰岛素作用，在肝上的作用优选强5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上。可以例如通过给药胰岛素清蛋白缀合物后测量各种组织中胰岛素受体磷酸化(即激活)时程而测量作用的选择性。可选的，可以使用钳技术通过测量Ra(葡萄糖出现速率，即肝葡萄糖产生)和Rd(葡萄糖处理速率，即肌肉和脂肪中的葡萄糖摄取)而测量肝选择性。

具有胰岛素受体亲和力和IGF-1受体亲和力的多肽是在合适的结合测定中能够与胰岛素受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。此种受体测定是本领域众所周知的，并且在实施例中进一步描述。本发明的胰岛素清蛋白缀合物将不与IGF-1受体结合或将与所述受体具有相当低亲和力。更确切地，本发明的胰岛素清蛋白缀合物将具有与人胰岛素的那种基本上相同量级或更少的针对IGF-1受体的亲和力。

此处所用的术语治疗和处理指出于抗击疾病、病症或状况目的针对患者的管理和护理。该术语意在包含延缓疾病、病症或状况的进展，缓和或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或状况。要治疗的患者优选哺乳动物，特别是人类。

此处所用的术语治疗疾病指针对已经发展疾病、状况或病症的患者的管理和护理。治疗的目的是抗击疾病、状况或病症。治疗包括施用活性化合物以消除或控制疾病、状况或病症，以及缓和与该疾病、状况或病症相关的症状或并发症。

此处所用的术语预防疾病定义为在疾病临床发作之前针对具有发展该疾病风险的个体的管理和护理。预防的目的是抗击疾病、状况或病症的发展，并包括施用活性化合物以预防或延缓症状和并发症的发作，并预防或延缓相关疾病、状况或病症的发展。

此处所用的术语有效量指与不治疗相比使对患者的治疗有效的足够剂量。

除非明确指出，此处提及的氨基酸是L-氨基酸。另外，除非另有说明，肽的氨基酸序列的左和右端分别是N和C末端。

为了方便起见，此处在可编码的天然氨基酸名称后在括号中为常见三字母密码和单字母密码：甘氨酸(Gly & G)、脯氨酸(Pro & P)、丙氨酸(Ala & A)、缬氨酸(Val & V)、亮氨酸(Leu & L)、异亮氨酸(Ile & I)、甲硫氨酸(Met & M)、半胱氨酸(Cys & C)、苯丙氨酸(Phe & F)、酪氨酸(Tyr & Y)、色氨酸(Trp & W)、组氨酸(His& H)、赖氨酸(Lys & K)、精氨酸(Arg & R)、谷氨酰胺(Gln & Q)、天冬酰胺(Asn & N)、谷氨酸(Glu & E)、天冬氨酸(Asp & D)、丝氨酸(Ser & S)和苏氨酸(Thr & T)。如果由于分型错误，存在与常用密码的偏离，那么应用常用密码。在本发明的胰岛素中存在的氨基酸优选是可以由核酸编码的氨基酸。

此处使用的缩写如下：h是小时，AcCN是乙腈，DCM是二氯甲烷，DIPEA是二异丙基乙胺，DMF二甲基甲酰胺，DMSO是二甲亚砜，EtOAc是乙酸乙酯，TFA是三氯乙酸，THF是四氢呋喃，且TSTU是O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲阳离子四氟硼酸盐，HOSu是N-羟基琥珀酸亚胺，HOAt是1-羟基-7-氮杂苯并三唑，HOBt是1-羟基苯并三唑，MWCO是分子量截断，CV是柱体积。

发明概述

令人惊讶的是，已发现清蛋白与胰岛素在胰岛素A链C末端赖氨酸残基处的缀合导致产生了胰岛素清蛋白缀合物，与常规的通过B29赖氨酸偶联的类似胰岛素清蛋白缀合物的相对亲和力相比，该胰岛素清蛋白缀合物对人胰岛素受体具有更高的相对亲和力。本发明要求合成双功能接头。一个功能将接头的一个末端与胰岛素分子缀合，而另一个功能将接头的另一个末端与清蛋白缀合。

附图简述

图1显示，对16周龄清醒状态喂养的ZDF大鼠皮下施用实施例1的胰岛素清蛋白缀合物(87.3nmol/kg)以及媒介物后，血糖(mmol/l)对时间(小时)的依赖性。结果是，实施例1的胰岛素清蛋白缀合物的葡萄糖清除是快速、有效而且延长的。

图2a、2b和2c显示实施例1的胰岛素清蛋白缀合物对肝(图2a)和以肌肉及脂肪为代表的外周组织(分别为图2b和2c)的胰岛素受体的磷酸化。测试结果是，该缀合物显示肝选择性，表现为肝胰岛素受体活化增加以及肌肉和脂肪组织胰岛素受体活化降低。

发明详述

形式上，本发明的胰岛素清蛋白缀合物由胰岛素类似物、接头和清蛋白组成。在一个实施方案中，胰岛素类似物是A22K，B29R，desB30人胰岛素，接头是8-[3-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基]辛酰基，且清蛋白是Albagen，见下文实施例1。

作为本发明的胰岛素清蛋白缀合物的部分的胰岛素类似物可以形式上阐明为在A链C末端具有赖氨酸残基的人胰岛素，包括A链延伸的C末端，与A21氨基酸残基相比，所述延伸由单个氨基酸残基即赖氨酸残基、或者优选由2-5个氨基酸残基组成的肽残基组成，并且，任选的，其中在胰岛素A1-A21和B1-B30位置中的一个或多个氨基酸残基已经缺失或由其他氨基酸残基置换。关于命名，连接于位置A21上的氨基酸的C末端的氨基酸残基在位置A22。类似的，连接于位置A21上的氨基酸残基的C末端的肽残基中存在的氨基酸残基在位置A22、A23、A24、A25等。该胰岛素类似物在A链C末端具有赖氨酸残基(A21K)，或者该赖氨酸残基在A链氨基酸延伸的C末端，与人胰岛素A链相比，所述A链延伸位于其C末端。

双功能接头的一个末端应当与A链中C末端赖氨酸附着。该双功能接头的另一个末端应当与清蛋白附着。

双功能接头与清蛋白的附着优选应在位置34上的自由Cys。

双功能接头可以表示为通式(I)：

M-Z_n-Y_o-W (I)

其中M含有Michael受体，其代表是马来酰亚胺(malimido)基团、乙烯砜等，硫羟反应基团，其代表是碘化物、吡啶基二硫化物、甲氧或乙氧羰基二硫化物和邻硝基苯基二硫化物；

Z是共价键，或选自下式的部分(其中其N末端与指定为Z(或是Y，如果其存在的话)的部分连接：

-NH-(CH₂-CH₂-O)_p-CH₂-CO-；

-NH-(CH₂)_q-CH₂-CO-；

-NH-(CH₂-CH₂-O)_r-CH₂-CH₂-CO-；

-HN-CH₂-CH₂-NH-CO；

-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₂-CH₂-CO-；或

-NH-C₆H₄-CO-；

p是0或1至24之间的整数；

q是0或1至24之间的整数；

r是0或1至24之间的整数；

-C₆H₄-是对-亚苯基；

n是1至10之间的整数，或更优选为1或2；

Y定义为Z或共价键；

o是0或1至10之间的整数，或更优选为0或1；以及

W是常用活性酯的离去基团。这种活性酯离去基团的非限定性实例是HOSu(N-羟基琥珀酸亚胺基)、HOAt、HOBt、苯并三唑等。

在一个实施方案中，式I的双功能接头(M-Z_n-Y_o-W)具有下列六个通式之一：

或

其中基团-Z_n-Y_o-W定义如上，而s是1至5之间的整数或零(0)，且t是1至5之间的整数。

在另一个实施方案中，双功能接头具有通式Ia：

M-(CH₂)_m-CO-Z_n-Y_o-W (Ia)

其中M含有Michael受体，其代表是马来酰亚胺基团、乙烯砜等，硫羟反应基团，其代表是碘化物、吡啶基二硫化物、甲氧或乙氧羰基二硫化物和邻硝基苯基二硫化物；

m是1至5之间的整数；

Z选自下式的部分：

-NH-(CH₂-CH₂-X)_p-CH₂-CO-；

-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；

-HN-CH₂-CH₂-NH-；

-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₂-CH₂-CO-；

-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；或

-NH-C₆H₄-CO-；

X是-O-或-CH₂-；

p是0或1至24之间的整数；

-C₆H₄-是对-亚苯基；

n是1至10之间的整数，或更优选为1或2；

Y定义为Z或共价键；

o是0或1至10之间的整数，或更优选为0或1；以及

W是常用活性酯的离去基团。这种活性酯离去基团的非限定性实例是HOSu(N-琥珀酸亚胺氧基)(N-succimidyloxy)、HOAt、HOBt、苯并三唑等。

制备此处请求保护的化合物的一个方法如下：

将式(I)的双功能接头的活性酯与胰岛素A链C末端中赖氨酸的ε氨基[N^ε]反应，以产生通式(II)的胰岛素衍生物：

M-Z_n-Y_o-Ins (II)

其中Ins表示胰岛素或胰岛素类似物，其中形式上已从A链C末端赖氨酸残基中存在的氨基中去除了氢原子；

而M、m、Z、n、Y和o如本文定义。

如果需要，可以将附着有接头的胰岛素(式II的胰岛素)与清蛋白反应。可以先体外后体内(即体外)或体内进行该反应。清蛋白中半胱氨酸残基的游离硫羟与附着于胰岛素的接头的硫羟反应官能团M反应(例如通过Michael反应或置换反应)，以形成胰岛素清蛋白缀合物，其表示为通式(III)：

Alb-M’-Z_n-Y_o-Ins (III)

其中M’是与清蛋白的硫羟基(优选Cys-34)反应之后的硫羟反应基团(M)，p、q、r、t、Z、p、-C₆H₄-、n、Y和o如此处定义，且

Alb是通过Cys残基(优选Cys-34残基)中的游离硫羟基连接的如此处定义的清蛋白。

在一个实施方案中，M’是下列四组通式之一：

其中t如上文所定义。

用符号Ins说明的基团源自通式Ins-H的化合物，其中Ins如上文所定义。通式Ins-H的化合物(其中Ins如上文所定义)是已知化合物或可以类似于制备已知化合物而制备的化合物。

通式III的根据本发明的胰岛素清蛋白缀合物的非限定性具体实例为构成本发明的一个实施方案的下述的，其中Alb和Ins各如上文所定义：

在一个实施方案中，通式-M’-Z_n-Y_o-部分选自存在于上述通式III的本发明胰岛素清蛋白缀合物的126个非限定性具体实例中的部分。

在另一个实施方案中，除位置A22中的任何赖氨酸外，和除连接于A21氨基酸残基C末端的任何肽残基外，和除B29R和/或desB30突变外，本发明化合物中存在的亲本胰岛素可以包括一个或多个下述突变。此处，首先给出在A或B链中的位置，并且其后，可能的一个或多个氨基酸残基作为单字母密码给出。在一个实施方案中，存在6个突变，在另一个实施方案中，存在5个突变，在另一个实施方案中，存在4个突变，在另一个实施方案中，存在3个突变，在另一个实施方案中，存在2个突变，在另一个实施方案中，存在1个突变，并且在另一个实施方案中，除位置A22中的任何赖氨酸外，和除连接于A21氨基酸残基C末端的任何肽残基外，和除任何B29R和/或desB30突变外，不存在突变。

A4：A或Q。

A5：L。

A8：R、N、Q、E、H、L或W。

A9：R或L。

A14：E或D。

A15：A或T。

A16：M。

A17：D或F。

A18：R、L、或V。

A21：G、A或K。

B3：A、R、H、I、L、M、F、W、Y、S或T。

B10：D或E。

B25：Y、H或desB25。

B26：Q、E、S或desB26。

B27：H、L、M、W或Y。

B28：D或E。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A4A或A4Q突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A5L突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A8L、A8N、A8Q、A8E、A8H、A8L或A8W突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A8H突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A9R或A9L突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A9L突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A14E或A14D突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A15A或A15T突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A16M突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A17D或A17F突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A18R、A18L、或A18V突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A18L或A18V突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A21G或A21A突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B3A、B3R、B3H、B3I、B3L、B3M、B3F、B3W、B3Y、B3S或B3T突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B10D或B10E突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B25Y、B25H或desB25突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B26Q、B26E、B26S或desB26突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B27H、B27L、B27M、B27W或B27Y突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B27W或B27Y突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B28D或B28E突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A21Q、B1Q、desB1、B3Q、B3S、B3T、B13Q或desB27突变。

可以在本发明的胰岛素清蛋白缀合物中存在、并且是本发明的一方面的亲本胰岛素类似物的非限制性具体例子包括下列：

A21K，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B29R，desB30人胰岛素
A14E，A22K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
	A8H，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A18L，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A5L，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A8H，A18L，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A8H，A18L，A22K，B10E，B29R，desB30人胰岛素
A5L，A8H，A17D，A18L，A22K，B10E，B29R，desB30人胰岛素
	A8H，A22K，B10E，B29R，desB30人胰岛素
A5L，A8H，A17D，A22K，B10E，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B27Y，B29R，desB30人胰岛素
A9L，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A4A，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A4Q，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A16L，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A17F，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A17D，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A18V，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B10D，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B10E，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B27W，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B27Y，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B27Y，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A8H，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，desB26，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，desB25，B29R，desB30人胰岛素

A22K，desB26，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B28D，B29R，desB30人胰岛素
	A9L，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A4A，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A4Q，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A5L，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A16L，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A17F，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A17D，A22K，B2BE，B29R，desB30人胰岛素
A18V，A22K，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B10D，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B10E，B28E，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B27W，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
	A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
	A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A21G，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
	A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A21Q，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A21Q，A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
	A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A14E，A21Q，A22K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
A14E，A21G，A22K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
	A14E，A21Q，A22G，A23K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
A14E，A21G，A22G，A23K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
	A14E，A21Q，A22G，A23G，A24K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
A14E，A21G，A22G，A23G，A24K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
	A14E，A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B25H，B29R，desB30人胰岛素
A14E，A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B25H，B29R，desB30人胰岛素

A22K，B3Q，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B3S，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B3T，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，B1Q，B29R，desB30人胰岛素
A18Q，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，desB1，B3Q，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B28D，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，desB27，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B28R，desB29，desB30人胰岛素
	A22K，B3Q，B28E，B29R，desB30人胰岛素
A22K，B13Q，B29R，desB30人胰岛素
	A22K，desB1，B29R，desB30人胰岛素
A21Q，A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
	A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A21A，A22K，B29R，desB30人胰岛素
A21A，A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
	A21G，A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素
A21A，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
	A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
	A21A，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素
A21Q，A22K，B3Q，B29R，desB30人胰岛素
	A21A，A22K，B3Q，B29R，desB30人胰岛素
A21G，A22K，B3Q，B29R，desB30人胰岛素

亲本胰岛素可以以本身已知的方式进行制备。例如，它们可以通过如例如EP 1,246,845中公开的众所周知技术，在合适的宿主细胞中表达编码所讨论的单链胰岛素的DNA序列进行生产。胰岛素在转化的宿主细胞中作为前体分子表达，所述前体分子通过酶促和化学体外过程转化成所需胰岛素分子，如例如EP 163,529和EP 214,826中公开的。前体分子可以与N末端延伸一起表达，所述N末端延伸随后如例如EP 1246,845中公开的切割。在本发明中合适类型的N末端延伸的例子例如公开于美国专利号5,395,922和EP专利号765,395中。更具体而言，可以参考WO 2006/082205，从第37页第31行到第39页第29行。

当将上述通式II的化合物施用于人时，它与人血清清蛋白缀合，形成上述通式III的化合物。因此，上述通式II的化合物和上述通式III的化合物均可在例如糖尿病治疗中用作药物。通式II的化合物和通式III的化合物可以共同用通式IV阐明：

A-Z_n-Y_o-Ins (IV)

其中A具有与M和Alb-M’-全体相同的含义，且Z、n、Y、o、Ins、M、Alb和M’各如此处定义。

药物组合物

本发明的化合物可以皮下、经鼻、经口或肺施用。

对于皮下施用，本发明的化合物与已知胰岛素制剂类似地配制。此外，对于皮下施用，本发明的化合物与已知胰岛素的施用类似地施用，并且一般地，医生熟悉这种程序。

本发明的化合物可以通过吸入以有效增加循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量进行施用。此种施用可以有效用于治疗病症例如糖尿病或高血糖症。达到胰岛素的有效剂量需要施用高于约5μg/kg至约500μg/kg的本发明化合物的吸入剂量。治疗有效量可以通过博知的从业者进行确定，所述从业者将考虑包括胰岛素水平、血糖水平、患者的身体健康状况、患者的肺状态等的因素。

本发明的化合物可以通过吸入进行递送，以达到其缓慢吸收和/或减少的全身清除。当比较相似颗粒大小和相似水平的肺沉积时，不同吸入设备一般提供类似药物代谢动力学。

本发明的化合物可以通过本领域已知用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入设备中的任何一种进行递送。这些设备包括计量剂量吸入器、喷洒器、干粉发生器、喷雾器等。优选地，化合物通过干粉吸入器或喷雾器进行递送。存在用于施用本发明的化合物的吸入设备的几种所需特征。例如，通过吸入设备的递送有利地是可靠、可重复且精确的。对于良好适合呼吸性，吸入设备应递送小颗粒或气溶胶，例如小于约10μm，例如约1-5μm。适合于实践本发明的商购可得吸入设备的一些具体例子是Turbohaler^TM(Astra)、(Glaxo)、(Glaxo)、Spiros^TM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics销售的设备、AERx^TM(Aradigm)、喷洒器(Mallinckrodt)、Acorn喷洒器(MarquestMedical Products)、计量剂量吸入器(Glaxo)、粉末吸入器(Fisons)等。

如本领域技术人员将认识到的，本发明的化合物制剂、递送的制剂量和单剂的施用持续时间依赖于采用的吸入设备类型。对于一些气溶胶递送系统，例如喷洒器，施用频率和系统激活的时间长度将主要依赖于气溶胶中的化合物浓度。例如，较短的施用时间段可以在喷洒器溶液中更高浓度的化合物下使用。设备例如计量剂量吸入器可以产生更高的气溶胶浓度，并且可以操作更短时间段，以递送所需量的化合物。设备例如粉末吸入器递送活性剂直至给定装填量的试剂从设备中排出。在这种类型的吸入器中，在给定量粉末中的本发明的化合物的量决定在单次施用中递送的剂量。

就胰岛素使其进入肺内并且优选进入下气道或肺泡内的能力而言，在通过吸入设备递送的制剂中本发明的化合物的颗粒大小是关键的。优选地，本发明的化合物如此配制，从而使得递送的至少约10％化合物沉积在肺中，优选约10至约20％或更多。已知用约2μm至约3μm的颗粒大小获得口呼吸的人的肺沉积最大效率。当颗粒大小高于约5μm时，肺沉积相当大地降低。低于约1μm的颗粒大小引起肺沉积降低，并且变得难以递送治疗上有效的足够量的颗粒。因此，通过吸入递送的化合物的颗粒具有优选小于约10μm、更优选约1μm至约5μm的颗粒大小。选择化合物的制剂，以在选择的吸入设备中产生所需颗粒大小。

对于作为干粉施用有利地，本发明的化合物以具有小于约10μm、优选约1μm至约5μm的颗粒大小的微粒形式进行制备。优选颗粒大小对于递送至患者肺的肺泡有效。优选地，干粉在很大程度上由产生的颗粒组成，从而使得大多数颗粒具有所需范围中的大小。有利地，至少约50％的干粉由具有小于约10μm直径的颗粒制成。此种制剂可以通过溶液的喷雾干燥、研磨、或临界点冷凝来达到，所述溶液包含本发明的化合物和其他所需成分。也适合于产生在本发明中有用的颗粒的其他方法是本领域已知的。

颗粒通常在容器中与干粉制剂分开，并且随后经由载体气流转运到患者的肺内。一般地，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固体的力量通过患者的吸入单独提供。在另一种类型的吸入器中，由患者的吸入产生的气流激活使颗粒解凝集的叶轮发动机。

用于从干粉吸入器施用的本发明的化合物制剂一般包括包含衍生物的精细分开的干粉，但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂等。添加剂可以包括在化合物的干粉制剂中，例如以根据需要稀释粉末用于从特定粉末吸入器递送，以促进制剂的处理，以给制剂提供有利的粉末性质，以促进粉末从吸入设备分散，以稳定制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)，以给制剂提供味道等。有利地，添加剂不会不利地影响患者的气道。化合物可以与添加剂在分子水平下混合，或固体制剂可以包括与添加剂颗粒混合或在添加剂颗粒上包被的化合物颗粒。一般的添加剂包括单糖、二糖和多糖；糖醇和其他多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、拉克替醇(lactitol)、麦芽糖醇(maltitol)、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉或其组合；表面活性剂，例如山梨糖醇、二磷脂酰胆碱或卵磷脂；等。一般地，添加剂例如填充剂以对于上述目的有效的量存在，通常为制剂的约50重量％至约90重量％。本领域已知用于配制蛋白质例如胰岛素类似物蛋白质的另外试剂也可以包括制剂中。

包括本发明的化合物的喷雾可以通过在压力下迫使化合物的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴大小和结构、应用的压力和液体进料速度，以达到所需输出和颗粒大小。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料结合的电场来产生。有利地，通过喷雾器递送的胰岛素缀合物的颗粒具有小于约10μm、优选在约1μm至约5μm范围中的颗粒大小。

适合于与喷雾器一起使用的本发明的化合物制剂一般将包括在约1mg至约500mg化合物/ml溶液的浓度下在水溶液中的化合物。依赖于选择的化合物和医学顾问已知的其他因素，上限可以更低，例如450、400、350、300、250、200、150、120、100或50mg化合物/ml溶液。制剂可以包括试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂和优选地锌。制剂还可以包括赋形剂或用于稳定化合物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质或碳水化合物。在配制胰岛素缀合物中有用的填充蛋白质包括清蛋白、鱼精蛋白等。在配制化合物中有用的一般碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、环糊精等。化合物制剂还可以包括表面活性剂，其可以减少或阻止通过溶液在形成气溶胶中的喷雾引起的表面诱导的胰岛素缀合物聚集。可以采用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类、和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。量一般将为制剂的约0.001至约4重量％范围。

包含本发明的化合物的药物组合物还可以肠胃外施用于需要此种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌内或静脉内注射，借助于注射器任选地笔样注射器来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。

本发明的化合物的可注射组合物可以使用制药工业的常规技术进行制备，所述常规技术涉及适当时使成分溶解且混合，以给出所需最终产物。因此，根据一个程序，化合物溶解于略微少于待制备的组合物的最终体积的水量中。根据需要添加锌(Zink)、等渗剂、防腐剂和/或缓冲剂，并且根据需要，若需要则使用酸例如盐酸或碱例如含水氢氧化钠调整溶液的pH值。最后，用水调整溶液的体积，以给出成分的所需浓度。

在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二[羟乙基]甘氨酸(bicine)、N-[2-羟-1，1-二羟甲基乙基]甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸、乙酸和其他有机酸或其盐、或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一种都构成本发明的可替代实施方案。

在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括药学上可接受的防腐剂，其可以选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化苄乙铵、氯苯甘油醚(3-(4-氯苯氧基)-1，2-丙二醇)或其混合物。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂中的每一种都构成本发明的可替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括等渗剂，其可以选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸或苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇或1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上文提及的糖或糖醇可以个别或组合使用。关于使用的量无固定限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的，并且不会不利地影响使用本发明的方法达到的稳定作用。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗剂中的每一种都构成本发明的可替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

一般的等渗剂是氯化钠、甘露糖醇、二甲砜和甘油，并且一般的防腐剂是苯酚、间甲酚、对羟基苯甲基甲酯和苯甲醇。

合适缓冲剂的例子是乙酸钠、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。

用于本发明的化合物的经鼻施用的组合物可以例如如欧洲专利号272,097中所述制备。

包含本发明的化合物的组合物可以在治疗对胰岛素敏感的状态中使用。因此，它们可以用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如，如有时在严重损伤的人和已经历大外科手术的人中可见。用于任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括采用的具体胰岛素衍生物的功效，患者的年龄、体重、身体活动性和饮食，与其他药物的可能组合，和待治疗状态的严重程度。推荐本发明的化合物的日剂量通过本领域技术人员以与关于已知胰岛素组合物相似的方式对于每个个别患者进行确定。

本发明的优选特征

为总结并补充此处的陈述，本发明特征如下：

1.通式(III)的化合物：

Alb-M’-Z_n-Y_o-Ins (III)

其中

Ins表示此处定义的胰岛素或胰岛素类似物，其中形式上已从A链C末端赖氨酸残基中存在的氨基中去除了氢原子；

M’表示与Alb(清蛋白)的硫羟基反应之后的指定为M的硫羟反应基团；

M表示Michael受体，其代表是马来酰亚胺基团、乙烯砜等，硫羟反应基团，其代表是碘化物、吡啶基二硫化物、甲氧或乙氧羰基二硫化物和邻硝基苯基二硫化物；

Z是共价键或表示下式之一的部分：

-NH-(CH₂-CH₂-O)_p-CH₂-CO-；

-NH-(CH₂)_q-CH₂-CO-；

-NH-(CH₂-CH₂-O)_r-CH₂-CH₂-CO-；

-HN-CH₂-CH₂-NH-CO-；

-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₂-CH₂-CO-；或

-NH-C₆H₄-CO-；

p是0(零)或1至24之间的整数；

q是0(零)或1至24之间的整数；

r是0(零)或1至24之间的整数；

-C₆H₄-是对-亚苯基；

n表示1至10之间的整数，或更优选为1或2；

Y具有给予Z的含义之一；

o是0至10，或更优选为0、1或2；以及

Alb表示此处定义的清蛋白。

2.通式(IIIa)的化合物：Alb-M’-(CH₂)_m-CO-Z_n-Y_o-CO-Ins(IIIa)，其中M’是与清蛋白的硫羟基反应之后的硫羟反应基团(M)，其中M是Michael受体，其代表是马来酰亚胺基团、乙烯砜等，硫羟反应基团，其代表是碘化物、吡啶基二硫化物、甲氧或乙氧羰基二硫化物和邻硝基苯基二硫化物；m是1至5之间的整数；Z选自下列六个部分：-NH-(CH₂-CH₂-X)_p-CH₂-CO-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；-HN-CH₂-CH₂-NH-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₂-CH₂-CO-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；和-NH-C₆H₄-CO-；X是-O-或-CH₂-；p是0或1至24之间的整数；-C₆H₄-是对-亚苯基；n是1至10之间的整数，或更优选为1或2；Y定义为Z或共价键；o是0或1至10之间的整数，或更优选为0或1；而Alb是此处定义的清蛋白，优选通过Cys残基的游离硫羟基连接。

3.通式III或IIIa的化合物，其中Z选自下式的下述部分：-NH-(CH₂-CH₂-X)_p-CH₂-CO-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；-HN-CH₂-CH₂-NH-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH-CO-CH₂-CH₂-CO-；-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；或-NH-C₆H₄-CO-；其中X是-O-或-CH2-；m是1至5的整数，而Alb、M’、n、Y、o、W和Ins各如条款1所定义。

4.根据上述条款中任一项的化合物，其中Ins是在A链C末端具有赖氨酸残基的胰岛素类似物，任选地具有在肽残基C末端的赖氨酸残基或具有连接于A21氨基酸残基C末端的赖氨酸残基。

5.根据上述条款的化合物，其中Ins是在A链C末端具有赖氨酸残基的胰岛素类似物，任选地具有在A链C末端氨基酸延伸的C末端的赖氨酸残基。

6.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中在Ins位置A22的氨基酸残基是C末端氨基酸残基且A22氨基酸残基是K(Lys)。

7.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中在Ins位置A22的氨基酸残基是C末端氨基酸残基且A22氨基酸残基是K(Lys)，且A18是L(Leu)。

8.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中在Ins位置A23的氨基酸残基是C末端氨基酸残基且A23氨基酸残基是K(Lys)。

9.根据前述可能条款任一项的化合物，其中在位置A22的氨基酸残基是G。

10.根据前述条款的化合物，其中在位置B29的氨基酸残基是R(Arg)。

11.根据前述条款的化合物，其中在位置B30的氨基酸残基缺失。

12.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Ins是A22K，B29R，desB30人胰岛素；A22G，A23K，B29R，desB30人胰岛素；A22G，A23G，A24K，B29R，desB30人胰岛素；A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30人胰岛素；或A21Q，A22-39G，A40K，B29R，desB30人胰岛素。

13.根据上述条款的化合物，其中在Ins位置A21的氨基酸残基是C末端氨基酸残基且A21氨基酸残基是K(Lys)。

14.根据上述条款的化合物，其中在位置A18的氨基酸残基是L(Leu)。

15.根据上述条款的胰岛素清蛋白缀合物，其中在Ins位置A21的氨基酸残基是C末端氨基酸残基且A21氨基酸残基是K(Lys)，且A18是L(Leu)。

16.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中在Ins位置A5的氨基酸残基是是L(Leu)。

17.根据上述条款中任一项的胰岛素清蛋白缀合物，其中M’是

18.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中m是2。

19.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中t是2。

20.根据上述可能条款中任一项的胰岛素清蛋白缀合物，其中M’是-CH₂-CO-。

21.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Z是-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-部分。

22.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Z是-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-部分。

23.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中n是1。

24.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Y是共价键。

25.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Y是NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-。

26.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中o是2。

27.根据上述可能条款中任一项的化合物，其中Alb是人血清清蛋白或Albagen(N末端残基(Asp)缺失的人血清清蛋白)。

28.通式II的化合物：

M-Z_n-Y_o-Ins (II)

其中M、Z、n、Y、o和Ins各如此处定义，尤其是如条款中所定义。

29.根据前述可能产品条款中任一项的化合物，其是本说明书具体提及的化合物中的任何一种，例如在具体实施例中、尤其是实施例1及下列实施例的任一个中。

30.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备用于糖尿病治疗的药物组合物中的用途。

31.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经皮下施用来治疗糖尿病。

32.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经皮下施用来治疗糖尿病，并提供长效作用。

33.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经肺施用来治疗糖尿病。

34.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经肺施用来治疗糖尿病，并提供长效作用。

35.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备粉末药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经肺施用来治疗糖尿病。

36.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备液体药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经肺施用来治疗糖尿病。

37.根据前述可能产品条款中任一项的化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以经口施用来治疗糖尿病。

38.治疗糖尿病的方法，该方法包括为有此需要的受试者施用治疗有效量的根据前述产品条款中任一项的化合物。

39.组合物，所述组合物含有人胰岛素以及根据前述条款中任一项的化合物。

40.组合物，所述组合物含有胰岛素aspan以及根据前述条款中任一项的化合物。

41.组合物，所述组合物含有胰岛素Lispro以及根据前述条款中任一项的化合物。

42.组合物，所述组合物含有胰岛素Glulisine以及根据前述条款中任一项的化合物。

43.药物组合物，含有生物学活性量的根据上述可能条款中与胰岛素类似物有关的任一项的胰岛素类似物以及药学上可接受的载体。

44.在受试者中治疗、预防或缓和高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖、X综合征或血脂异常的方法，包括给受试者施用根据上述条款中与胰岛素类似物有关的任一项的胰岛素类似物或根据上述条款中任一项的药物组合物。

45.治疗有效量的根据上述可能条款中与胰岛素类似物有关的任一项的胰岛素类似物在制备用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖、X综合征或血脂异常的药物制剂中的用途。

46.治疗糖尿病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据前述产品条款中任一项的胰岛素清蛋白缀合物。

使本文描述的一个或多个条款、任选地以及下文权利要求中的一项或多项组合，导致进一步的条款，并且本发明涉及所述条款和权利要求的所有可能组合。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均在此整体引入作为参考，并且其程度与每个参考文献个别且特别指出引入作为参考并且在本文中整体阐述一样(至法律允许的最大程度)。

所有标题和子标题在本文中都仅为了方便而使用，并且不应解释为以任何方式限制本发明。

本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明，并且除非另有说明，否则不对本发明的范围造成限制。说明书中的语言不应解释为将任何非请求保护的要素表示为本发明实践所必需的。

本文专利文件的引用和引入仅为了方便而完成，并且不反映此种专利文件的任何有效性、专利性和/或可实施性观点。参考文献在本文中的提及并非承认它们构成现有技术。

此处，单词“包含”应广泛地解释为意指“包括”、“含有”或“包含”(EPO指南C 4.13)。

本发明包括如由可应用法律允许的与之附着的权利要求中叙述的主题的所有修饰和等同方案。

实施例

下述实施例为了举例说明提供，而不是为了限制。

一般方法

LCMS方法

使用Waters Micromass ZQ质谱仪鉴定从Waters Alliance HT HPLC系统洗脱后的样品质量。

洗脱液：

A：在水中的0.1％三氟乙酸

B：在乙腈中的0.1％三氟乙酸

柱：Phenomenex，Jupiter C4 50 X 4.60毫米，内径(id)5μm

梯度：以1.0ml/分钟在7.5分钟期间从10％到90％B。

实施例1

A22K[N^ε8-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]，B29R，desB30人胰岛素

步骤1：

A22K(N ^ε -8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酰基)， B29R，desB30人胰岛素

将A22K，B29R，desB30人胰岛素(WO 2007096431)(1.00g)溶解于DMSO(80ml)和三乙胺(0.50ml)中。加入溶解在THF(8.35ml)中的8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(84mg)。165分钟后，加入几滴TFA，A和B缓冲液(见下文)，以得到pH 5-6的150ml。

通过制备型HPLC纯化：C18，3cm柱(Gemini)、A缓冲液在MiliQ水中的0.1％TFA，B缓冲液：在AcCN中的0.1％TFA，流速20ml/分钟，60分钟期间梯度20-40％B。

产量117mg，MALDI：6152.89

步骤2：

A22K[N ^ε -8-[3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基]辛酰基]，B29R，desB30人胰岛素

将Albagen(由New Century Pharmaceuticals，Inc.定制的200mg小瓶，重组体未经稳定，从水冰冻干燥)溶解于反应缓冲液(0.15MNa₂HPO₄ pH 6.5，2％甘露糖醇，5ml)中。在沉淀下加入溶于10％乙酸(0.50ml)的A22K-(N^ε-8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酰基)B29R，desB30人胰岛素(18.5mg)溶液。用1N NaOH调节pH到7.0以得到几乎清澈的反应混合物。将该混合物在室温下缓慢搅拌4-6小时。加入硫酸铵(1g)，并将混合物通过Millex 0.22μm过滤器过滤。在纯化器(Purifier)上使用HIC-ISO(25ml)柱实施纯化。A缓冲液，0.05M Na₂HPO₄，2M硫酸铵，pH 7，2％甘露糖醇：B缓冲液，0.05M Na₂HPO₄，pH 7，2％甘露糖醇。在20个柱体积范围的梯度0-100％B。流速10ml/分钟。合并含有缀合物的级分并使用Vivaspin20，30000 MWCO管在3000g通过离心而浓缩。使用HiPrep 26/10柱和B缓冲液将浓缩产物脱盐。使用Vivaspin20，30000 MWCO管在3000g通过超滤而将收集的级分再次浓缩。将产物于缓冲液中保存在冷冻机中。通过吸光度测量确定浓度，其中使用的消光系数为：41479。LC-MS，M/z：1960.0(M+37)，结合：72478。

8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯：

步骤1：3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯

将马来酰亚胺基丙酸(Malimidopropionic acid)(500mg)溶解于无水THF(15ml)中。加入TSTU(790mg)和DIPEA(0.62ml)。将混合物于室温在氮下搅拌过夜。浓缩黄色粘稠悬浮液。将残渣溶解于DCM中，并用0.1N HCl(2x)和盐水(1x)萃取。将有机层干燥(Na₂SO₄)并浓缩，以产生白色固体。LC-MS，M/z：267.26(M+1)。

步骤2：8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酸

将3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(787mg，粗制)溶解于DMF(15ml)中。加入8-氨基辛酸(350mg)和DIPEA(0.45ml)。将混合物于室温在氮下搅拌过夜。浓缩该混合物。将残渣溶解于EtOAc并用0.1N HCl(2x)萃取。相分离并非容易。将有机层用盐水(2x)洗涤、干燥(Na₂SO₄)并浓缩，以产生白色固体。LC-MS，M/z：311.34(M+1)。

步骤3：8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯

将TSTU(1.07mg)和DIPEA(0.65ml)加入溶于无水THF(15ml)中的8-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢吡咯-1-基)丙酰氨基]辛酸(917mg，粗制)溶液。将混合物在氮下搅拌过夜。浓缩该混合物。将EtOAc加入残渣，并过滤掉沉淀。将滤液用0.1N HCl(2x)和盐水(1x)萃取、干燥(Na₂SO₄)并浓缩，以产生灰白色固体。总得率37％(444mg)。LC-MS，M/z：408.39(M+1)。

实施例2

A22K[N^ε-12-{2-(Albagen-Cys34-基乙酰氨基)}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

步骤1：A22K(N^ε-12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰基)，B29R，desB30人胰岛素

将12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(99mg)溶于THF(0.5ml)的溶液加入A22K，B29R，desB30人胰岛素(WO2007096431)(1.00g)溶于0.1M碳酸钠(20ml)和乙醇(10ml)的溶液，pH 10.6。将反应混合物的pH保持在10.6。温和搅拌30分钟后，加入水(50ml)，并用1N HCl调节pH到5.5来形成沉淀。于3000g 10分钟将产物离心(spin down)。弃去上清液，并通过制备型HPLC纯化固体产物：C18，3厘米柱(Gemini)，A缓冲液：在MiliQ水中的0.1％TFA，B缓冲液：在AcCN中的0.1％TFA，流速25ml/分钟，45分钟期间梯度25-60％B。

产量330mg，MALDI：6228.21。

步骤2：A22K[N^ε-12{[2-Albagen-Cys34-基乙酰氨基}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

将Albagen(由New Century Pharmaceuticals，Inc.定制的200mg小瓶，重组体未经稳定，从水冰冻干燥)溶解于反应缓冲液(0.15MNa₂HPO₄ pH 7.0，2％甘露糖醇，3ml)中。加入A22K(N^ε-12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰基)，B29R，desB30人胰岛素(20mg)溶于反应缓冲液/乙腈1∶1(2.0ml)的溶液，以产生溶液。pH是7.3。将混合物在室温下于暗处缓慢搅拌过夜。加入硫酸铵(1g)，并将该混合物通过Millex0.22μm过滤器过滤。如实施例1所述实施纯化。将产物于B缓冲液中保存在冷冻机中。通过吸光度测量确定浓度，其中使用的消光系数为：41479。LC-MS，M/z：1542.29(M+47)，结合：72430。

12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯

步骤1：12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸

将碘乙酸(1.00g)溶解于二氯甲烷并保存在暗处。加入TSTU(1.62g)和DIPEA(1.03ml)。搅拌45分钟后，加入12-氨基十二烷酸(1.14g)在NMP(10ml)和DIPEA(1.03ml)中的悬浮液。搅拌4小时后，将混合物注入0.5N HCl(300ml)并用二氯甲烷萃取。将有机层用0.1NHCl洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩以给出油。将残渣溶解在二乙醚和乙酸乙酯混合物中，用水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩以给出固体。将该固体在二乙醚中粉碎并过滤，以产生粉末。产量1.05g，50％。LC-MS，M/z：384.2(M+1)。

步骤二：12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯

将TSTU(415mg)和DIPEA(0.315ml)加入12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸(460mg)溶于THF(10ml)的溶液。在室温下搅拌2小时后，将混合物注入0.5N HCl(300ml)并用乙酸乙酯(2x200ml)萃取。将结合的有机层用0.1N HCl和盐水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩。不用经过进一步纯化即可使用残渣。得率，99％(575mg)。LC-MS，M/z：481.2(M+1)。

实施例3

A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-基乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

步骤1：A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-碘乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)-乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

将(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(105mg)溶于乙腈/乙醇1∶1(10ml)的溶液加入pH10.5的A22K，B29R，desB30人胰岛素(WO 2007096431)(0.800g)溶于0.1M碳酸钠(16ml)的溶液。将反应混合物的pH保持在10.6。温和搅拌30分钟后，加入水(50ml)，并用1N HCl调节pH到5.5来形成沉淀。于3000g 10分钟将产物离心。弃去上清液，并通过制备型HPLC纯化固体产物：C18，3厘米柱(Gemini)，A缓冲液：在MiliQ水中的0.1％TFA，B缓冲液：在AcCN中的0.1％TFA，流速20ml/分钟，60分钟期间梯度5-80％B。

产量280mg，LC-MS，M/z：1630.23(M+4)。

步骤2：A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-基乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

将Albagen(由New Century Pharmaceuticals，Inc.定制的200mg小瓶，重组体未经稳定，从水冰冻干燥)溶解于反应缓冲液(0.15MNa₂HPO₄ pH7.0，2％甘露糖醇，3ml)中。加入A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-({2-碘乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]B29R，desB30人胰岛素(20mg)溶于反应缓冲液/乙腈1∶1溶液(2.0ml)的溶液，以产生溶液。pH是7.3。将混合物在室温下于暗处缓慢搅拌过夜。加入硫酸铵(1g)，并将该混合物通过Millex 0.22μm过滤器过滤。如实施例1所述实施纯化。将产物于B缓冲液中保存在冷冻机中。通过吸光度测量确定浓度，其中使用的消光系数为：41479。LC-MS，M/z：1774.71(M+31)，1732(M+32)，1548(M+47)。

(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基

步骤1：(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酸

将乙腈(5ml)加入[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酸(194mg)溶于0.1M碳酸钠的溶液，随后加入12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(260mg)溶于乙腈(6ml)的溶液。搅拌45分钟后，用1N HCl调节pH到4，并通过制备型HPLC纯化混合物：C18，3厘米柱(Gemini)，A缓冲液：在MiliQ水中的0.1％TFA，B缓冲液：在AcCN中的0.1％TFA，流速20ml/分钟，30分钟期间梯度10-80％B。合并并浓缩含有产物的级分，以49％的得率(180m)产生标题化合物。LC-MS，M/z：674.3(M+1)。

步骤2：(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基

将TSTU(24mg)和DIPEA(0.020ml)加入(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酸(50mg)溶于乙醇(1.5ml)的溶液。在室温搅拌过夜后，将该混合物直接用于胰岛素衍生物的酰化，而不需整理(work-up)和纯化。

实施例4

A18L，A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-基-乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}-乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

步骤1：A18L，A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-碘乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

将(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-碘乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(55mg)溶于乙醇(1.5ml)的溶液加入pH 10.7的A18L，A22K，B29R，desB30人胰岛素(0.300g)溶于0.1M碳酸钠(4ml)和乙醇(3ml)的溶液。将反应混合物的pH保持在10.7。温和搅拌60分钟后，加入水(40ml)，并用1N HCl调节pH到5.5来形成沉淀。于3000g 10分钟将产物离心。弃去上清液，并通过制备型HPLC纯化固体产物：C18，3厘米柱(Gemini)，A缓冲液：在MiliQ水中的0.1％TFA，B缓冲液：在AcCN中的0.1％TFA，流速20ml/分钟，45分钟期间梯度10-70％B。

产量72mg，LC-MS，M/z：1304.6(M+5)。

步骤2：A18L，A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-Albagen-Cys-34-基-乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

将Albagen(由New Century Pharmaceuticals，Inc.定制的200mg小瓶，重组体未经稳定，从水冰冻干燥)溶解于反应缓冲液(0.15MNa₂HPO₄ pH 7.0，2％甘露糖醇，3ml)中。加入A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-({2-碘乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]B29R，desB30人胰岛素(18.3mg)溶于反应缓冲液/乙腈1∶1(2.0ml)的溶液，以产生溶液。用NaOH将pH提高到7.4。将混合物在室温下于暗处缓慢搅拌过夜。加入硫酸铵(1g)，并将该混合物通过Millex 0.22μm过滤器过滤。如实施例1所述实施纯化。将产物于B缓冲液中保存在冷冻机中。通过吸光度测量确定浓度，其中使用的消光系数为：41479。LC-MS，M/z：72716.18。

下列实施例中的清蛋白-胰岛素缀合物可以类似制备。

实施例5

A18L，A22K[N^ε-12-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例6

A5L，A22K[N^ε-12-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例7

A18L，A22K[N^ε-12-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例8

A22K[N^ε-12-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例9

A5L，A22K[N^ε-12-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基乙酰氨基)}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例10

A18L，A22K[N^ε8-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例11

A5L，A22K[N^ε8-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例12

A18L，A22K[N^ε8-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例13

A22K[N^ε8-{3-(人血清清蛋白-Cys3-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例14

A5L，A22K[N^ε8-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例15

A5L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{Albagen-Cys34-基}乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例16

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例17

A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例18

A5L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[12-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)十二烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例19

A22K[N^ε-10-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例20

A18L，A22K[N^ε-10-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例21

A22K[N^ε-10-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例22

A18L，A22K[N^ε-10-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例23

A22K[N^ε-10-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例24

A18L，A22K[N^ε-10-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例25

A22K[N^ε-10-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例26

A18L，A22K[N^ε-10-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}癸酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例27

A22K[N^ε-16-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例28

A18L，A22K[N^ε-16-{2-(Albagen-Cys34-基)乙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例29

A22K[N^ε-16-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例30

A18L，A22K[N^ε-16-{2-(人血清清蛋白-Cys34-基)乙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例31

A22K[N^ε-16-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例32

A18L，A22K[N^ε-16-{3-(Albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例33

A22K[N^ε-16-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例34

A18L，A22K[N^ε-16-{3-(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}十六烷酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例35

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(2-{Albagen-Cys34-基}乙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例36

A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(2-{Albagen-Cys34-基}乙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例37

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例38

A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例39

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(2-{Albagen-Cys34-基}乙酰氨基)十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例40

A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(2-{Albagen-Cys34-基}乙酰氨基)十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例41

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例42

A18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(2-{人血清清蛋白-Cys34-基}乙酰氨基)十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例43

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(3-{(Albagen-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例44

18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(3-{(Albagen-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例45

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(3-{(人血清清蛋白-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例46

18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[10-(3-{(人血清清蛋白-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基)癸酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例47

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(3-{(Albagen-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基})十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例48

18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(3-{(Albagen-Cys34-基)2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}十六烷酰氨基)乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]B29R，desB30人胰岛素

实施例49

A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(3-{(人血清清蛋白-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基)十六烷酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例50

18L，A22K[N^ε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[16-(3-{(人血清清蛋白-Cys34)基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基}丙酰氨基]十六烷酰氨基)乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]]B29R，desB30人胰岛素

实施例51

对ZDF大鼠皮下施用(S.c administration)实施例1的胰岛素Albagen缀合物

将16只雄性16周龄喂养ZDF大鼠(约400g)分成2组。当实验开始时去除食物。对一组用媒介物给药，对另一组用实施例1的胰岛素缀合物给药，在t＝0时87.3nmol/kg。在t＝30、60、90、120、180、和240分钟和t＝5、6、7、8、9和10小时从尾静脉采取血液样品。

实施例52

正常小鼠胰岛素敏感组织中胰岛素刺激的细胞内发信号

将21只雄性未禁食NMRI小鼠(30-40g)分成7组：基础组，三组用人胰岛素(HI)处理，以及3组用实施例1的胰岛素清蛋白缀合物处理。当实验开始时去除食物。给药前从所有小鼠采取血液样品用于葡萄糖测量。然后(通过颈脱位法)处死基础组(未处理的)，并取出组织以测定基础值。对其他小鼠静脉内给药HI(6nmol/kg)或实施例1的胰岛素HSA缀合物(9.9nmol/kg)。在两组内实现相似的血糖降低。在5、15和120分钟每个时间点之后，从一个HI处理组和一个实施例1处理组采取尾尖血液样品，然后处死这些动物并取出组织。通过BioSource ELISA测量肝、下腿肌肉和附睾脂肪中的胰岛素受体磷酸化分子。

实施例53

本发明的胰岛素清蛋白缀合物的胰岛素受体结合

通过SPA测定(闪烁亲近测定法(Scintillation Proximity Assay))微量滴定板抗体捕获测定，测定本发明的胰岛素清蛋白缀合物对于人胰岛素受体的亲和力。使SPA-PVT抗体结合珠，抗小鼠试剂(AmershamBiosciences，目录号PRNQ0017)与25ml结合缓冲液(100mM HEPESpH 7.8；100mM氯化钠，10mM MgSO₄，0.025％Tween-20)混合。关于单个Packard Optiplate(Packard No.6005190)的试剂混合物由2.4μl1∶5000稀释的纯化重组人胰岛素受体(含或不含外显子11)、一些与5000cpm/100μl试剂混合物对应的A14Tyr[¹²⁵I]-人胰岛素母液、12μlF12抗体的1∶1000稀释物、3ml SPA珠和至总共12ml的结合缓冲液组成。随后向Packard Optiplate中的每个孔加入总共100μl试剂混合物，并且在Optiplate中制备来自合适样品的胰岛素衍生物稀释系列。随后使样品在轻轻振荡时温育16小时。随后通过离心1分钟分开相，并且在Topcounter中计数板。使用在GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software，San Diego，CA)中的非线性回归算法拟合结合数据。

两种已知胰岛素和四种本发明所选择的胰岛素的胰岛素受体亲和力：

序列表

在实施例中，分别将具有与人胰岛素的下列偏差的下列A链给定为ID SEQ No.1-3：A5L，A22K；A18L，A22K；以及A22K，且将具有与人胰岛素的下列偏差的下列B链给定为ID SEQ No.4：B29R，desB30。

Claims

1.通式III：Alb-M’-Z_n-Y_o-Ins的化合物；在所述式中，

Ins选自A18L，A22K，B29R，desB30人胰岛素；和

A22K，B29R，desB30人胰岛素；

从其中已从Lys(A22)氨基酸残基中存在的ε氨基去除了氢；

M’选自

和

-CH₂-CO-(即亚甲基羰基)；

Z_n选自-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-；和-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-；

Y_o不存在或代表-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；以及

Alb表示通过Cys-34残基的游离硫羟基连接的Albagen。

2.根据权利要求1的化合物，其中指定为Ins的基团是A18L，A22K，B29R，desB30人胰岛素，从其中已从Lys(A22)氨基酸残基中存在的ε氨基去除了氢。

3.根据权利要求1的化合物，其中指定为Ins的基团是A22K，B29R，desB30人胰岛素，从其中已从Lys(A22)氨基酸残基中存在的ε氨基去除了氢。

4.根据权利要求1的化合物，其中指定为M’的基团是

5.根据权利要求1的化合物，其中指定为M’的基团是-CH₂-CO-(即亚甲基羰基)。

6.根据权利要求1的化合物，其中指定为Z_n的基团是-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-。

7.根据权利要求1的化合物，其中指定为Z_n的基团是-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-。

8.根据权利要求1的化合物，其中指定为-M’-Z_n-Y_o-的部分选自：

-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-；

-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-；和

9.根据权利要求1的化合物，其选自A22K[N^ε-8-{3-(albagen-Cys34-基-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰氨基}辛酰基]，B29R，desB30人胰岛素；A22K[N^ε-12-{2-(albagen-Cys34-基乙酰氨基)}十二烷酰基]B29R，desB30人胰岛素；A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-albagen-Cys-34-基乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素；和A18L，A22K[N^ε-{2-[2-(2-{2-[2-(12-{2-albagen-Cys-34-基-乙酰氨基}十二烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基]B29R，desB30人胰岛素。

10.根据权利要求1-9中任一项的化合物，其用作药物。

11.根据权利要求1-9中任一项的化合物，其用于糖尿病治疗。

12.治疗有效量的根据权利要求1-9中任一项的化合物在制备用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖、X综合征或血脂异常的药物制剂中的用途。