CN103002922B - 携带肽的纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
纳米颗粒，其包含：（i）包括金属的核；（ii）包括共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体中的至少一种包括碳水化合物部分；和（iii）与所述冠结合的至少一种肽。
Description
发明领域
本发明涉及特别用于在医学中使用的携带肽的纳米颗粒，并且包括用于治疗病症例如血糖调节的方法。
发明背景
本发明涉及包括用于治疗哺乳动物且特别是人的组合物和产品，以及制备且施用此类组合物和产品的方法。
生物活性试剂例如肽通常具有弱稳定性，特别是热稳定性，这可能限制在制备、加工、贮存和/或递送过程中可以对所述试剂实施的条件。例如，胰岛素广泛用于例如1型和2型糖尿病的控制和治疗中。用于人使用的胰岛素的医学制剂一般用一种或多种防腐剂和/或稳定剂配制。此外，有限的胃肠道稳定性一般呈现对于生物活性肽例如胰岛素的有效经口施用的障碍。
仍存在对于能够携带和/或稳定化生物活性肽包括胰岛素的组合物和用于将此类活性肽递送给受试者的方法的未满足的需要。
发明概述
本发明通过提供用于稳定化和递送活性试剂例如肽的合适活性剂携带组分，即与活性剂连接、结合、缔合或以其他方式偶联的组分来解决上述困难。
本发明提供了纳米颗粒，其如本文所述包含金属核、配体的冠（corona）和与一个或多个配体结合的活性剂。以这种方式，本发明的纳米颗粒提供了用于生物活性肽例如胰岛素的载体或递送组分，所述肽从而可以得到稳定化。
在本发明的一个方面，提供了包含下述的纳米颗粒：
（i）包括金属的核；和
（ii）包括共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体中的至少一种包括碳水化合物部分；和
（iii）其中至少一种肽与冠非共价结合。在一些情况下，肽可以与冠可逆和/或非共价结合。
肽可以这样与冠结合，从而使得在使纳米颗粒与生理溶液例如盐水溶液接触后，至少部分或更多的结合肽从纳米颗粒中释放。例如通过允许肽与其受体相互作用，释放可以促进活性肽的生物学效应。一般地，肽将是生物活性肽，即能够刺激哺乳动物受试者中的生理学应答。在依照本发明的一些情况下，肽可以选自：胰岛素、GLP-1、IGF1、IGF2、松弛素、INSL5、INSL6、INSL7、胰腺多肽（PP）、肽酪氨酸酪氨酸（PTT）、神经肽Y、催产素、加压素、GnRH、TRH、CRH、GHRH/生长抑素、FSH、LH、TSH、CGA、催乳素、ClIP、ACTH、MSH、内啡肽、促脂解素、GH、降钙素、PTH、抑制素、松弛素、hCG、HPL、胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、褪黑激素、胸腺素、thmulin、胃泌素、胃生长素（ghrelin）、促胸腺生成素、CCK、GIP分泌素、桑黄素（motin）VIP、肠高血糖素、IGF-1、IGF-2、瘦蛋白、脂连蛋白、抵抗素骨钙素、肾素、EPO、骨化三醇、ANP、BNP、趋化因子、细胞因子、脂肪因子及其所有生物学活性类似物。因此，在特定情况下，肽可以能够刺激哺乳动物受试者中血糖水平的减少。例如，肽可以包含单体和/或二聚体人胰岛素或由单体和/或二聚体人胰岛素组成。此外，肽可以包含GLP-1或其类似物或由GLP-1或其类似物组成。此外，至少一种肽可以包含上文指定的两种或更多种肽的组合，例如胰岛素和GLP-1、或胰岛素和GLP-1类似物。
在依照本发明的一些情况下，所述碳水化合物部分可以包含单糖和/或二糖。碳水化合物部分可以如本文进一步定义的，包括碳水化合物模拟物。碳水化合物部分可以经由选自下述的接头共价连接至核：含硫接头、含氨基接头、含磷酸酯接头和含氧接头。在一些情况下，接头包含至少两个碳的烷基链。
依照本发明，包含碳水化合物部分的所述至少一种配体在一些情况下可以选自：2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷、2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷和2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，其中包含碳水化合物部分的所述至少一种配体经由其硫原子共价连接至核。
本文特别考虑共价连接至核的所述多个配体可以包含至少第一配体和第二配体，其中所述第一个和第二配体是不同的。例如，第一个和第二配体可以如下：
（a）所述第一配体包含2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；
（b）所述第一配体包含2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷；
（c）所述第一配体包含2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；或
（d）所述第一配体包含2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇，
并且其中所述第一个和第二配体经由其各自的硫原子共价连接至核。
在一些情况下，第一配体可以包含碳水化合物部分，并且所述第二配体是非碳水化合物配体。配体中的一个或多个可以包含氨基。特别地，第二配体可以包含经由其硫原子共价连接至核的1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇。
如本文进一步描述的，当不同配体存在于纳米颗粒上时，它们可以以例如特定限定的比例或比例范围存在。例如，第一配体和所述第二配体可以以范围为1:40-40:1、1:10-10:1或甚至1:2-2:1的比例存在于纳米颗粒上。
已发现依照本发明的纳米颗粒可以提供以许多种形成冠的配体。例如，在一些情况下，冠包含至少5个配体/核，例如约10–约1000个配体/核或44-106个配体/核。
结合的肽分子数目/核并无特别限制。对于特定应用，可能希望采用少至1、2、3或4种肽/核，而在其他情况下，本发明的纳米颗粒可以包含至少5种或更多种结合的肽分子/核。
依照本发明，纳米颗粒核在一些情况下可以包含选自下述的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Cd、Gd、Zn或其任何组合。特定金属组合和特定核组成在本文中进一步描述。
依照本发明的纳米颗粒核在一些情况下可以具有在约0.5nm-约50nm，例如约1nm-约10nm或约1.5nm-约2nm的范围中的直径。
依照本发明，所述至少一种肽可以包含至少两个、三个、四个、五个或更多个不同种类的肽。特别地，纳米颗粒可以包含与相同纳米颗粒的冠结合的胰岛素和GLP-1。与单个种类的肽的结合相比较，与纳米颗粒结合的超过一个种类的肽的存在在特定情况（例如特定临床情况）中可以是优选的。特别地，肽的组合可以这样在纳米颗粒上携带，从而使得肽执行互相有利或互补的功能和/或协作例如以协同方式作用。超过一个种类的存在可以用于治疗一种或多种病状和用于一种或多种治疗适应症的目的。
依照本发明，本发明的纳米颗粒可以包含具有二价状态的组分，例如具有二价状态的金属或化合物，或其氧化物或盐。例如，具有以二价状态存在的能力的金属或金属络合物是特别有用的。此类组分可以在加入时处于二价状态，或可以在加入后转化成二价状态。二价组分的氧化物和盐也是有用的且可以直接加入或在加入后原位形成。在二价组分的有用的盐中包括卤盐，例如氯化物、碘化物、溴化物和氟化物。此类二价组分可以包括例如锌、镁、铜、镍、钴、镉或钙，及其氧化物和盐。组分希望地以足以产生稳定化效应的量和/或这样的量存在，其足以增强肽与冠的结合至大于在不存在具有二价状态的组分的情况下肽与冠的结合水平的水平。在一些情况下，具有二价状态的组分希望地以对于核金属（例如金）约0.5-2.0当量，或任选对于核金属（例如金）约0.75-1.5当量的量存在。在本发明的背景中，“当量”可以是摩尔当量，例如1.0当量的锌可以视为意指与纳米颗粒的核中的金原子数目相同数目的锌原子或Zn2+阳离子。
二价组分在一些情况下可以存在于纳米颗粒的冠中。本文特别考虑由于在纳米颗粒合成的过程中包括二价组分，二价组分可以包括在纳米颗粒中，包括在纳米颗粒的冠中。另外地或备选地，二价组分可以在纳米颗粒合成后加入。在依照本发明的一些情况下，二价组分例如锌可以选自：Zn2+和ZnO。例如，锌可以以ZnCl2的形式。
在进一步方面，本发明提供了本发明的多个纳米颗粒。例如，多个可以是100、1000、100000个或更多个。多个可以作为结合形式，悬液或一起包含在单个包装、容器或载体中。在特定情况下，多个可以采取一个或多个剂量（例如限定数量的肽或肽活性单位）的形式，例如以治疗剂量或限定数目的剂量的形式。
在进一步方面，本发明提供了包含下述的纳米颗粒：
（i）包括金属的核；
（ii）包含共价连接至核的多个配体的冠，其中所述多个配体包含至少第一配体和第二配体，其中：
（a）所述第一配体包含2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；
（b）所述第一配体包含2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷；
（c）所述第一配体包含2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；或
（d）所述第一配体包含2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体包含1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇，
并且其中所述第一个和第二配体经由其各自的硫原子共价连接至核。
依照本发明的这个方面的纳米颗粒可以包含二价组分，例如金属或金属络合物。一种特别有用的组分是锌。二价组分在一些情况下可以存在于纳米颗粒的冠中。本文特别考虑由于在纳米颗粒合成的过程中包括二价组分，二价组分可以包括在纳米颗粒中，包括在纳米颗粒的冠中。另外地或备选地，二价组分可以在纳米颗粒合成后加入。在依照本发明的一些情况下，二价组分例如锌可以选自：Zn2+和ZnO。例如，锌可以以ZnCl2的形式。其他二价材料、其盐和氧化物可以如本文公开的使用。组分希望地以足以产生稳定化效应的量和/或这样的量存在，其足以增强肽与冠的结合至大于在不存在具有二价状态的组分的情况下肽与冠的结合水平的水平。在一些情况下，具有二价状态的组分希望地以对于核金属（例如金）约0.5-2.0当量，或任选对于核金属（例如金）约0.75-1.5当量的量存在。在本发明的背景中，“当量”可以是摩尔当量，例如1.0当量的锌可以视为意指与纳米颗粒的核中的金原子数目相同数目的锌原子或Zn2+阳离子。
在进一步方面，本发明提供了包含本发明的多个纳米颗粒和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一些情况下，药物组合物可以配制用于通过静脉内（i.v.）、肌内（i.m.）、皮内（i.d.）或皮下（s.c）途径施用于哺乳动物受试者。
在进一步方面，本发明提供了稳定化至少一种肽的方法，其包括在允许至少一种肽与纳米颗粒的冠结合的条件下，使至少一种肽与如本文定义的本发明的纳米颗粒接触。
在进一步方面，本发明提供了降低有此需要的哺乳动物受试者中的血糖的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的纳米颗粒，例如具有与冠结合的胰岛素和/或GLP-1的纳米颗粒。
在进一步方面，本发明提供了治疗有此需要的哺乳动物受试者中的糖尿病的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的纳米颗粒，例如具有与冠结合的胰岛素和/或GLP-1的纳米颗粒。本发明的纳米颗粒或包含纳米颗粒的药物组合物可以通过任何合适的施用途径施用于受试者。在特定情况下，本发明的纳米颗粒或包含所述纳米颗粒的药物组合物可以静脉内（i.v.）、肌内（i.m.）、皮内（i.d.）或皮下（s.c）施用。
在进一步方面，本发明提供了用于在医学治疗的方法中使用的本发明的纳米颗粒。例如通过将本发明的一个或一个多种纳米颗粒与一种或多种药学可接受的赋形剂或载体组合，纳米颗粒可以配制用于药学用途。本发明的纳米颗粒或包含所述纳米颗粒的药物组合物可以配制用于通过用于递送给受试者的任何合适途径施用。特别地，本发明的纳米颗粒或包含所述纳米颗粒的药物组合物可以配制用于静脉内（i.v.）、肌内（i.m.）、皮内（i.d.）或皮下（s.c）施用。
在进一步方面，本发明提供了用于在降低有此需要的哺乳动物受试者中的血糖和/或治疗有此需要的哺乳动物受试者中的糖尿病的方法中使用的本发明的纳米颗粒（例如具有与冠结合的胰岛素和/或GLP-1的纳米颗粒）。
在进一步方面，本发明提供了本发明的纳米颗粒（例如具有与冠结合的胰岛素和/或GLP-1的纳米颗粒）在制备用于在降低有此需要的哺乳动物受试者中的血糖和/或治疗糖尿病的方法中使用的药物中的用途。
在进一步方面，本发明提供了包含下述的制品：
本发明的至少一种纳米颗粒；
用于容纳至少一种纳米颗粒的容器；和
插页和/或标签。
在进一步方面，本发明提供了用于形成中观（mesoscopic）多肽或蛋白质簇的方法，所述簇具有本发明的一种或多种纳米颗粒包埋在其中，所述方法包括在环境温度使所述多肽或蛋白质与所述一种或多种纳米颗粒接触。在一些情况下，环境温度可以是15℃-30℃，例如20℃-25℃。
在进一步方面，本发明提供了用于解离一个或多个簇的方法，所述一个或多个簇包含具有本发明的一种或多种纳米颗粒包埋在其中的中观肽或蛋白质簇，所述方法包括对所述簇实施35℃-肽或蛋白质的解链温度（Tm）的温度，从而促使所述一个或多个簇解离成个别纳米颗粒-肽絮凝剂。
在进一步方面，本发明提供了用于从溶液中的一种或多种纳米颗粒-肽絮凝剂中释放单体肽的方法，所述方法包括增加溶剂的离子强度，其中所述纳米颗粒-肽絮凝剂包含本发明的一种或多种纳米颗粒。在一些情况下，该方法包括所述一种或多种纳米颗粒-肽絮凝剂在生物学流体例如血浆、间质液或唾液中的溶解。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，除了其中此类组合明显不允许或陈述为特别避免之外。本发明的这些和进一步方面和实施方案在下文且就伴随实施例和附图而言进一步详细描述。
附图简述
图1显示了具有以9:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（9）GlcNAc（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图2显示了具有以4:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（4）GlcNAc（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图3显示了具有以1:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（1）GlcNAc（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图4显示了具有以1:9比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（1）GlcNAc（9）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图5显示了具有以1:1比例的GlcC2:α-Gal“NP-GlcC2（1）α-Gal（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图6显示了具有以1:1比例的βGlcC2:EG6NH2“NP-βGlcC2(1）EG6NH2（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图7显示了具有以1:1比例的GlcNHAc:EG6NH2“NP-GlcNHAc（1）EG6NH2（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图8显示了具有以1:1比例的α-Glc:EG6NH2“NP-α-Glc（1）EG6NH2（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图9显示了具有α-Glc“NP-α-Glc”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图10显示了具有以1:1比例的GlcC2:GlcNH_IAA“NP-GlcC2(1）GlcNH_IAA（1）”的多个配体的纳米颗粒的图示；
图11显示了具有以1:1比例的α-Gal:EG6NH2“NP-α-Gal（1）EG6NH2（1)”的多个配体的纳米颗粒的图示。在特定例子中，NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）纳米颗粒在本文中称为分批NP10；
图12显示了对于11种不同的纳米颗粒冠组合物，结合的人胰岛素（以纳摩尔表示）/金量（以纳摩尔表示）的胰岛素结合曲线；
图13显示了NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）纳米颗粒{分批#NP10}的透射电子显微镜检查（TEM）图像；
图14显示了通过A）数目和B）体积，通过对于MI-NP-10胺-gal（即NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）纳米颗粒）的动态光散射（DLS）测定的粒度分布曲线图；
图15显示了通过A）数目和B）体积，通过对于胰岛素结合的MI-NP-10胺-gal（即NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）纳米颗粒的动态光散射（DLS）测定的粒度分布曲线图；
图16显示了对于具有所示温度峰的α-半乳糖-EG-胺-Au纳米颗粒{分批#NP10}的实验热重量分析（TGA）数据；
图17显示了与金纳米颗粒结合的胰岛素的曲线图，其中菱形指示在不存在锌的情况下的纳米颗粒，三角形指示在1.33当量的锌的存在下合成的纳米颗粒，并且圆形指示在不存在锌的情况下合成的纳米颗粒，在合成后已向其中加入1.33当量的锌；
图18显示了在不同量的金纳米颗粒下，GLP-1与金纳米颗粒的结合；
图19显示了显示来自包含GLP-1和胰岛素的纳米颗粒制剂的GLP-1和胰岛素的MALDI踪迹；
图20显示了显示来自包含GLP-1和胰岛素的纳米颗粒制剂的GLP-1和胰岛素的HPLC踪迹。
发明详述
在描述本发明中，将采用下述术语并且意于如下所示定义。
如本文使用的，“纳米颗粒”指具有纳米级别的颗粒，并且不意于传达任何特别形状限制。特别地，“纳米颗粒”包含纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在特定实施方案中，本文考虑的纳米颗粒和/或纳米颗粒核一般具有多面体或球体几何学。
包含多个含碳水化合物配体的纳米颗粒已在例如WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704（其各自的完整内容特别通过引用合并入本文）中描述，并且此类纳米颗粒可以依照本发明使用。此外，包含由有机化合物官能化（例如经由硫醇-金键）的氧化铁铁氧体（具有式XFe2O4，其中X=Fe、Mn或Co）的磁核的金涂布纳米颗粒在于2009年9月25日提交的未公开的欧洲专利申请号EP09382185.8（其完整内容特别通过引用合并入本文）中描述，并且特别考虑用于作为依照本发明的纳米颗粒/纳米颗粒核使用。
如本文使用的，“冠”指层或涂层，其可以部分或完全覆盖纳米颗粒核的暴露表面。冠包括多个配体，其包括至少一个碳水化合物部分。因此，冠可以视为围绕或部分围绕金属性核的有机层。在特定实施方案中，冠提供和/或参与纳米颗粒核的钝化。因此，在一些情况下，冠可以包括基本上稳定化含金属核的足够完全的涂布层。然而，本文特别考虑具有核的特定纳米颗粒，例如包括由贵金属涂布的含金属氧化物的内核，可以包括仅部分涂布核表面的冠。
如本文使用的，“肽”意于包含氨基酸的任何序列，且特别包括肽、多肽、蛋白质（包括具有二级、三级和/或四级结构的蛋白质）及其片段。表达“与……结合的肽”特别意于包含肽的部分（但可以包括整个）氨基酸序列，其与纳米颗粒的多个配体中的一个或多个的一个或多个部分（例如化学基团或部分）形成键合相互作用。在特定实施方案中，肽可以具有<500kDa、<100kDa、<50kDa，例如高达20kDa的分子量。
相应地，在一个方面，本发明提供了包含下述的纳米颗粒：
（i）包括金属的核；
（ii）包括共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体中的至少一种包括碳水化合物部分；和
（iii）与冠结合的至少一种肽。
术语“结合的”意于包括在两个组分之间的物理和/或化学结合。该术语包括任何形式的化学连接，例如共价、离子、氢键合或分子间力，例如范德华力或静电力。该术语包括物理偶联或连接。这个物理和或化学结合可以意于是可逆的，即组分可以是彼此分离或解离的，例如以从载体组分中释放活性组分。
肽可以与冠可逆结合。特别地，特别考虑肽可以与纳米颗粒的部分非共价结合。不希望受任何理论束缚，目前认为肽可以参与与一个或多个配体的一种或多种可逆结合相互作用，所述一个或多个配体提供纳米颗粒的冠。特别地，氨基酸序列的部分可以参与与一个或多个配体的氢键合、范德华力和/或静电作用（例如与暴露配体的一个或多个官能团相互作用）。肽结合可以涉及与纳米颗粒的一个或多个配体的吸附、吸收或其他直接或间接相互作用。
如本文就本发明的特定实施方案而言描述的，肽可以这样结合，从而使得在使纳米颗粒与生理溶液接触后，结合肽的至少一部分或部分从纳米颗粒中释放。如本文描述的，肽可以以这样的方式与纳米颗粒结合，从而使得肽在结合的同时是稳定化的（例如热稳定化的），但可以以生物学活性的形式释放且获得（例如，可释放的，从而使得肽可通过ELISA检测和/或能够在体外或体内系统中发挥至少一种生物作用，其为游离肽的特征）。特别地，当肽包括（人）胰岛素时，肽可以这样与纳米颗粒结合，从而使得胰岛素结合的纳米颗粒的悬液在用于（人）胰岛素的ELISA中给出阳性结果和/或在对其施用后对哺乳动物受试者中的血糖水平发挥作用。
考虑多种释放动力学用于从纳米颗粒中解离结合肽分子，包括二或多相释放（例如起始快速释放随后为更缓慢的后续释放相）。例如，释放可以包括在数秒或数分钟内结合肽分子从纳米颗粒中快速溶解，随后为经过至少2、4、6、8或更多小时的时期的进一步持续释放。与例如游离肽的注射相比较，此类释放动力学在特定情况下可以是有利的，例如当需要持续作用时。
肽（包括但不限于多肽、蛋白质或其片段）可以选自：胰岛素、GLP-1、IGF1、IGF2、松弛素、INSL5、INSL6、INSL7、胰腺多肽（PP）、肽酪氨酸酪氨酸（PTT）、神经肽Y、催产素、加压素、GnRH、TRH、CRH、GHRH/生长抑素、FSH、LH、TSH、CGA、催乳素、ClIP、ACTH、MSH、内啡肽、促脂解素、GH、降钙素、PTH、抑制素、松弛素、hCG、HPL、胰高血糖素、生长抑素、褪黑激素、胸腺素、thmulin、胃泌素、胃生长素、促胸腺生成素、CCK、GIP分泌素、桑黄素VIP、肠高血糖素、瘦蛋白、脂连蛋白、抵抗素骨钙素、肾素、EPO、骨化三醇、ANP、BNP、趋化因子、细胞因子、脂肪因子及其生物学活性类似物。在特定实施方案中，肽能够刺激哺乳动物受试者中血糖水平的减少。因此，在依照本发明的一些情况下，肽可以包括单体和/或二聚体人胰岛素。
在依照本发明的特定情况下，平均起来可以存在至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10个或更多个结合的肽分子/核。可以存在单个类型的肽或两种或更多种不同的肽。当两种不同肽的组合与纳米颗粒结合时，不同的肽在一些情况下可以以1:10-10:1例如1:2-2:1的比存在。因此，特别考虑了有利地共施用的肽的互补组合。
如本文使用的，术语“碳水化合物”意于包括通式Cn（H2O）m的化合物，其中n=m，并且n大于3。此外，在碳水化合物的定义内包括的是碳水化合物类似物/模拟物，其不包括在通式Cn（H2O）m中。碳水化合物类似物/模拟物包括但不限于假糖（碳环糖）、氨基糖、亚氨基糖和肌醇。氨基糖包括多羟基化哌啶、吡咯烷、吡咯双烷和吲哚里西啶（indolizidines）。
如本文使用的，依照本发明的纳米颗粒包括共价连接至含金属核的多个配体。配体可以是相同或不同的。在特定实施方案中，多个配体可以包括包含至少一个碳水化合物部分的第一类配体和非碳水化合物配体的第二类。如本文使用的，包括碳水化合物部分的至少一种配体一般包括一个或多个糖基团，例如单糖、二糖和/或多糖和/或一个或多个假糖基团（例如选自下述的假糖：碳环糖、氨基糖、亚氨基糖、肌醇、多羟基化哌啶、吡咯烷、吡咯双烷和吲哚里西啶）。配体共价连接至纳米颗粒的核。因此，术语“碳水化合物部分”应理解为包括碳水化合物的化学衍生物，例如糖苷，其中配体包括附着至非糖原子或分子的糖基团或假糖基团（例如选自下述的假糖：碳环糖、氨基糖、亚氨基糖、肌醇、多羟基化哌啶、吡咯烷、吡咯双烷和吲哚里西啶）。在特定情况下，依照本发明包括碳水化合物部分的配体可以包括半乳糖、葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、岩藻糖和/或乳糖的糖苷，例如碳水化合物部分可以包括吡喃半乳糖苷和/或吡喃葡萄糖苷。含碳水化合物配体可以经由选自下述的接头共价连接至核：含硫接头、含氨基接头和含磷酸酯接头。还可以使用核的接头组合。接头在一些情况下可以包括至少两个碳的烷基链。
连接至核的配体包括一个或多个碳水化合物（糖）基团，例如包括多糖、寡糖或单个糖基团。配体还可以是糖缀合物，例如糖脂或糖蛋白。除了碳水化合物基团外，配体可以另外包括肽基团、蛋白质结构域、核酸分子（例如DNA/RNA区段）和/或荧光探针中的一种或多种。
在特定情况下，颗粒可以具有在其上固定的超过一个种类的配体，例如2、3、4、5、10、20或100种不同配体。备选地或另外地，多个不同类型的颗粒可以一起采用。
在特定情况下，连接至颗粒的个别金属性核的配体的平均数目是至少5、至少10或至少20个配体。数目可以在范围10-10,000中，例如10-1,000，更特别地20-500或44-106个配体/核。
优选地，基本上所有配体都共价附着至颗粒的核。用于执行这点的方案是本领域已知的（参见例如，WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704）。这可以通过在还原条件下使配体与具有贵金属例如金的还原末端基团反应执行。产生颗粒的示例性方法采用硫醇衍生的碳水化合物部分，以将配体偶联至颗粒。因此，配体衍生为受保护的二硫化物。方便地，溶于甲醇中的二硫化物保护的配体可以加入四氯金酸的水溶液中。优选的还原剂是硼氢化钠。在特定实施方案中，纳米颗粒在有机溶剂中以及在水和生理溶液中是可溶的。本发明人已发现如本文描述的纳米颗粒适合于治疗应用，并且可以是无毒、可溶和/或在尿中排泄的。
在依照本发明的特定情况下，包含碳水化合物部分的至少一种配体选自：2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷、2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷、5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷和2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且其中包含碳水化合物部分的所述至少一种配体经由硫醇硫共价连接至核。
另外地或备选地，多个配体可以包括氨基。因此，包含碳水化合物基团的配体可以包括氨基（例如作为碳水化合物的部分，例如葡糖胺，和/或作为配体的非碳水化合物部分的组成成分基团。此外，当多个配体包括至少一种非碳水化合物配体时，非碳水化合物基团可以包括氨基。至少一种非碳水化合物配体可以包括经由硫醇硫共价连接至核的1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇。
依照本发明的特定实施方案，多个配体可以包括包含碳水化合物部分的所述至少一种配体和所述至少一种非碳水化合物配体，其中所述配体是不同的且以1:40-40:1的比例，例如1:10-10:1的比例，更特别1:2-2:1的比例存在于纳米颗粒上。
纳米颗粒“核”包括金属。合适的核在例如WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704（其各自的完整内容特别通过引用合并入本文）中描述，并且此类纳米颗粒核可以依照本发明使用。此外，包括氧化铁铁氧体（具有式XFe2O4，其中X=Fe、Mn或Co）的磁核的金涂布的纳米颗粒在于2009年9月25日提交的未公开的欧洲专利申请号EP09382185.8（其完整内容特别通过引用合并入本文）中描述，并且可以依照本发明使用。
在依照本发明的一些情况下，纳米颗粒核包括选自下述的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何组合。核可以包括选自下述的钝态金属：Au、Ag、Pt、Pd和Cu或其任何组合。在特定实施方案中，可以采用金属的特定组合，例如选自下述的金属组合：Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd、Au/Fe/Cu/Gd。
在依照本发明的一些情况下，纳米颗粒核可以是磁性的。核可以包括NMR活化原子，例如选自下述的金属：Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和镧系元素3+。
在依照本发明的一些情况下，纳米颗粒核可以包括半导体，例如选自下述的那种：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
在依照本发明的一些情况下，纳米颗粒核可以包括由选自下述的金属涂布的金属氧化物：Au、Ag、Cu、Pt、Pd和Zn或其任何组合。金属氧化物可以有利地具有式XFe2O4，其中X是选自下述的金属：Fe、Mn和Co。
在依照本发明的一些情况下，纳米颗粒核可以具有在约0.5nm-约50nm、例如约1nm-约10nm、更特别地约1.5nm-约2nm的范围中的平均直径。
下文作为例子呈现且不应解释为对于权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1–配体的制备
2-巯乙基-α-D-半乳糖苷（α-半乳糖C2SH）的制备
向在2-溴乙醇（30ml）中的半乳糖（3g，16.65mmol）悬液中加入酸性树脂Amberlite120-H，以达到pH2。将反应在50-60℃搅拌16小时。将反应混合物过滤且用MeOH洗涤。加入三乙胺，以达到pH8。将反应的粗制品浓缩且与甲苯共蒸发3次。将反应混合物溶解于吡啶（75mL）和Ac2O（35mL）中，并且在0℃加入催化量的DMAP且在室温搅拌3小时。将混合物用AcOEt稀释且用1.H2O；2.HCl（10%）3.NaHCO3dis4.H2O洗涤。收集有机层且经无水Na2SO4干燥。TLC（己烷：AcOEt3:1，2次洗脱）显示主要产物（所需的）和更低的Rf少数。使用混合物己烷：乙酸乙酯6:1作为洗脱剂通过快速色谱法纯化产物，并且获得2-溴乙基-α-半乳糖苷（2）。
将先前反应的产物2溶解于27ml2-丁酮中。向这种溶液中，加入催化量的四丁基碘化铵和4当量的硫代乙酸钾。将所得到的悬液在室温搅拌2小时。在这个时期自始至终，通过TLC（己烷-AcOEt2:1，2次洗脱）就原材料的消失测试反应。将混合物用20mlAcOEt稀释且用饱和NaCl溶液洗涤。使有机相干燥，过滤且在真空下蒸发。将产物在己烷/AcOEt2:1→1:1中纯化，以获得乙酰硫基-α-半乳糖苷3。
将反应的新产物3溶解于混合物二氯甲烷-甲醇2:1中。向这种混合物中，加入1N甲醇钠（1当量）并且在室温搅拌1小时。加入AmberliteIR-120H树脂，以达到pH5-6。随后将所得到的混合物过滤且浓缩至干燥，以获得最终产物（α-半乳糖C2SH）。
氨基-硫醇接头的制备。
向溶于20ml干THF中的PPh3（3g，11.4mmol）溶液中，加入DIAC（2.3g，11.4mmol）。允许混合物在0℃搅拌15分钟，直至白色产物出现。向这种混合物中，逐滴加入（加料漏斗）溶于干THF（20mL）中的六乙二醇（1.45mL，5.7mmol）和HSAc（610μl，8.55mmol）溶液。在15分钟后，产物开始在Rf0.2处在TLC上出现。将溶液在蒸发器中浓缩。将反应的粗制品溶解于50ml二氯甲烷中，并且用K2CO310%的溶液洗涤。将有机相经无水Na2SO4干燥，过滤且在真空下浓缩。粗制品使用AcOEt：己烷1:1、AcOEt和最终DCM:MeOH4:1作为洗脱剂的快速色谱法给出乙酰硫基-六乙二醇衍生物。
将反应产物溶解于5mlDMF和PPh3（2.25g，8.55mmol）中，加入NaN3（0.741g，11.4mmol）和BrCl3C（0,845ml，8.55mmol），并且随后将溶液在室温搅拌40分钟。当执行TLC（DCM:MeOH25:1）时，所得到的产物具有高于起始产物的Rf。将反应混合物用100ml二乙醚稀释且用H2O洗涤三次。将有机相经无水Na2SO4干燥，过滤且在真空下蒸发。使用洗脱剂DMC/MeOH200:1和DCM/MeOH40:1的混合物通过快速色谱法纯化产物，以获得叠氮基-乙酰硫基-六乙二醇衍生物。
为了去除三苯基氧化膦，将反应产物溶解于10mlTHF中，并且将0.5gMgCl2加入该溶液中。将反应在80℃搅拌2小时直至出现白色沉淀物，且随后通过硅藻土过滤。将产物溶解于乙醇:H2O3:1的混合物中，并且加入Zn粉（0.45g，6.84mmol）和NH4Cl（0.6g，11.4mmol）。将反应在回流下搅拌1小时，直至原材料的存在通过TLC（DCM/MeOH25:1）不再可检测。将反应通过硅藻土过滤且使溶剂蒸发。将反应粗制品用AcOEt稀释且用5mlH2O提取。将水相蒸发至干燥，以获得氨基-硫醇-六乙二醇产物。
实施例2–混合的金纳米颗粒的制备
β-葡萄糖C2衍生物1、N-乙酰葡糖胺C2衍生物2、α-半乳糖C2衍生物3、α-葡萄糖C2衍生物4、葡糖胺C5衍生物5和六乙二醇胺接头6得自MidatechBiogune原液。N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、HAuCl4、NaBH4购自Sigma-AldrichChemicalCompany。咪唑-4-乙酸单盐酸盐购自AlfaAesarCompany。高品质的MeOH和纳米纯的水（18.1mΩ）用于所有实验和溶液。
配体的命名法
GlcC2
2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷（β）
GlcNHAcC2
2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（β）
GlcNH2-IAA-C5
5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷（同分异构体的α，β混合物）
α-GalC2（α）
2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷（α）
α-GlcC2（α）
2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷
EG6NH2
1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇或
1-氨基-6-巯基-六乙二醇（普通名称）
具有多个配体的纳米颗粒（NP）的制备
NP-GlcC2（9）GlcNAc（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（21.6mg，90μmmol）和2（2.8mg，10μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.8mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以9:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（9）GlcNAc（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图1中。
NP-GlcC2（4）GlcNAc（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（19.2mg，80μmmol）和2（5.6mg，20μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.8mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以4:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（4）GlcNAc（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图2中。
NP-GlcC2（1）GlcNAc（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（12mg，50μmmol）和2（14mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.9mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（1）GlcNAc（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图3中。
NP-GlcC2（1）GlcNAc（9）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（2.4mg，10μmmol）和2（25.3mg，90μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.8mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:9比例的GlcC2:GlcNAc“NP-GlcC2（1）GlcNAc（9）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图4中。
NP-GlcC2（1）α-Gal（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（12mg，50μmmol）和3（12mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.7mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的GlcC2:α-Gal“NP-GlcC2（1）α-Gal（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图5中。
NP-βGlcC2（1）EG6NH2（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（12mg，50μmmol）和6（14.85mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于7mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.9mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的βGlcC2:EG6NH2“NP-βGlcC2（1）EG6NH2（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图6中。
NP-GlcNHAc（1）EG6NH2（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的2（14mg，50μmmol）和6（14.85mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于6mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.6mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的GlcNHAc:EG6NH2“NP-GlcNHAc（1）EG6NH2（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图7中。
NP-α-Glc（1）EG6NH2（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的4（12mg，50μmmol）和6（14.85mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于4mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]＝0.8mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的α-Glc:EG6NH2“NP-α-Glc（1）EG6NH2（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图8中。
NP-α-Glc
向溶于MeOH（8.3mL）中的4（24mg，100μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于5mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]=1.0mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有多个α-Glc“NP-α-Glc”配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图9中。
NP-GlcC2（1）GlcNH_IAA（1）
向溶于MeOH（8.3mL）中的1（12mg，50μmmol）和5（12mg，50μmmol）溶液中，加入0.025MHAuCl4（1.33mL，33μmmol）水溶液。将溶液在30秒过程中振荡且随后以几份（134μLx5）加入NaBH41N（0.67mL，0.67mmol）的水溶液。将黑色悬液在100分钟过程中振荡。去除甲醇层且将团块溶解于10mL水中，且通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于8mL100mMMES中，且用EDC（153mg，0.8mmol）和咪唑-4-乙酸单盐酸盐（81mg，0.5mmol）处理14小时。将混合物通过离心过滤（10KDaAMICON4mL，4500g，15分钟，15℃）进行纯化。将该过程重复三次，用2mL水洗涤。将残渣溶解于4mL水中。将等分试样冷冻干燥用于定量。[NP]=0.9mg/mL。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的GlcC2:GlcNH_IAA“NP-GlcC2（1）GlcNH_IAA（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图10中。
NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）
胺α-gal金纳米颗粒分批MI-NP-10-AMINE-GAL的制备：向在MeOH（49mL）中以1:1比例（0.58mmol，3当量）的胺-巯基六乙二醇接头6和α-半乳糖配体3的混合物中，加入金盐的水溶液（7.86mL，0.19mmol，0.025M）。将反应在30秒过程中搅拌且随后以几份（4.32mL，4.32mmol）加入NaBH4（1N）的水溶液。将反应以900rpm振荡100分钟。在这个时间后，将悬液以14000rpm离心1分钟。去除上清液且将沉淀物溶解于2mL水中。随后，将2mL悬液引入两个滤器（AMICON，10KDa，4mL）中，且以4500g离心5分钟。将滤器中的残渣再用水洗涤两次。将最后的残渣溶解于80mL水中。
不希望受任何理论束缚，具有以1:1比例的α-Gal:EG6NH2“NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）”的多个配体的所得到的纳米颗粒的图示显示于图11中。
对于金NP的制备，制造在层流柜下进行。所有玻璃和塑料材料（例如eppendorf、小瓶和瓶）和溶剂（水、HAc）首先在高压灭菌器中灭菌。所有其他可处理物（例如尖端和滤器）是预灭菌来的。
实施例3–与纳米颗粒的胰岛素结合
下述方法详述了如何执行胰岛素与αGal（1）EG6NH2（1）NP的结合。该方法使用固定的胰岛素和可变的NP水平，更低/不同水平的NP用于测试的其他NP样品，但这个除外，该方法对于测试的所有NP都是相同的。
胰岛素储备溶液的制备；将20mg人胰岛素称重到干净的玻璃小瓶内，并且加入8.7ml10mMHCl，轻轻混合，胰岛素将完全溶解，随后通过加入1.3ml100mMTris碱使pH回到7.5，当胰岛素通过其等电点时，溶液将变得短暂混浊，检查pH是7.5，并且盖帽贮存于4℃，这是2mg/ml胰岛素储备溶液。
将可变量的αGal（1）EG6NH2（1）NP加入eppendorf或合适大小的容器中，例如；NP的15、30、60、120、240和480纳摩尔金含量，用水补充到200μl的总体积，随后加入50μl人胰岛素（溶于trisHClpH7.5中2mg/ml–关于胰岛素储备溶液的制备参见上文）。轻轻混合且在室温静置2小时，随后为2分钟台式旋转（2000rpm）以降低聚集。应执行具有正好200μl水和50μl胰岛素的标准管，以给出最大限度上清液值，如空白对照即50μlTrisHClpH7.5+200μl水一样。如果需要高准确度，那么含有已知量的αGal（1）EG6NH2（1）NP的样品，即10μg金含量用水补充到200μl，并且加入50μl胰岛素缓冲液（TrisHClpH7.5），这可以用于校正αGal（1）EG6NH2（1）NP在BCA测定法中给出的轻微的阳性结果，参见下文*。
通过标准显微BCA测定法（Pierce试剂盒23235）一式三份测定上清液，20μl，这将给出显示多少胰岛素保留在上清液中的数据。通过从关于仅胰岛素标准的值中扣除这个值计算NP结合的胰岛素的量，需要时它还可以表示为百分比。此处获得的数据显示αGal（1）EG6NH2（1）-NP的量，如果需要最大限度结合使用的100μg胰岛素，那么这些条件可以按比例扩大，以产生所需αGal（1）EG6NH2（1）-NP-胰岛素量。
*数据可以校正BCA测定法中游离αGal（1）EG6NH2（1）-NP的轻微干扰。为了实现这点，对于所有最终样品执行金分析，且计算多少金保留在各种上清液中，更高水平在具有对胰岛素而言过量的NP的样品中可见。使用关于10μg金含量NP的BCA值，以相对于可见金含量进行校正，如通过下述实施例证实的：
如果不含胰岛素的10μg金含量NP通过BCA给出0.5，并且40μgAu测试NP上清液给出1.25的BCA，并且还显示5μg的金含量，那么这意味着0.25的BCA值（0.5的50%）实际上是由于游离NP，因此关于40μg金测试NP上清液的校正值应是1.00而不是1.25。这是简化的举例说明性实例，校正因子将是最低限度的，其中上清液中的金含量很低。
结合的人胰岛素量（以纳摩尔表示）/金量（以纳摩尔表示）显示于图12中，其中：
Glc=2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷；
GlcNAc=2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；
Glc胺IAA=5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷（同分异构体的α，β混合物）；
AGal=2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷；
EG6NH2=1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；
AGlc=2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷；和
图例中的数目参考配体化学计量学。
如参考图12可见的，使用具有以约1:1比例的AGal和EG6NH2的冠的纳米颗粒获得相对高程度的胰岛素结合。胰岛素结合还通过具有任何下述冠组成的纳米颗粒显示：
AGal：EG6NH21:1（踪迹11图12）
Glc:Glc胺IAA1:1（踪迹10图12）
AGlc：EG6NH21:1（踪迹8图12）
BGlc：EG6NH21:1（踪迹6图12）
GlcNAc：EG6NH21:1（踪迹7图12）。
发现与如本文描述的纳米颗粒结合的胰岛素在与生理溶液（例如盐水溶液）接触后是可释放的，并且发现是可检测的，从而使得阳性结果在关于（人）胰岛素的ELISA中达到。这些结果指出本发明的胰岛素结合的纳米颗粒提供以这样形式的胰岛素，所述形式可用于与生物学系统和/或组分的相互作用。因此，纳米颗粒能够充当胰岛素的载体/稳定剂（例如用于贮存和/或加工用于掺入例如药物产品内），同时还维持呈现或制备可用胰岛素（例如单体胰岛素）的能力，以例如在递送给受试者、其器官或细胞后，发挥其生物学效应。
实施例4–纳米颗粒的表征
I）胰岛素金纳米颗粒分批MI-NP-10-Ins（NP-α-Gal（1）EG6NH2（1））的表征
a）金含量：在完全氧化至Au（III）后，使用基于在爱普杷嗪和金之间的有色复合物形成的方法测定金含量。样品的吸光度在513nm处测量，并且与具有已知量的金的相似溶液定量比较。
金含量测定为（分批#NP10）：262.5±56.3mg/L。
TEM：纳米颗粒悬液的透射电子显微镜检查（TEM）图像显示于图13中。
样品测定为对于金核具有下述大小特征：
计数=783
平均值（直径）=2.323nm±0.716nm
最小值=1.002nm
最大值=4.859nm
模式=2.104nm
d）通过动态光散射的粒度分布：通过对于MI-NP-10胺-gal（即NP-α-Gal（1）EG6NH2（1）纳米颗粒）的动态光散射（DLS）测定的数目和体积分布分别显示于图14A和B中。
关于图14A中所示的峰的峰值如下：
峰14.875nm
关于图14B中所示的峰的峰值如下：
峰15.289nm
III）胰岛素金纳米颗粒分批MI-NP-10-INS的最终制备。
将金纳米颗粒MI-NP-10（13.041mg金）的溶液用水补充到49.68mL。向最终溶液中加入乙酸，以获得pH=4.6。随后，加入溶于27.85mLTris.HClpH7.5中的55.7mg人胰岛素。将悬液静置24小时，且在这个时间后，以4500g离心1分钟。取出上清液且贮存用于进一步的胰岛素和金含量分析。将沉淀物重悬浮于3.220mL水中，以获得500单位胰岛素/mL的最终胰岛素浓度。
胰岛素-金纳米颗粒的粒度分布通过DLS分析进行测定。胰岛素含量通过BCA标准测定法进行测定。
＊＊胰岛素金NP的最终制备在层流柜下制造。使用的所有玻璃和塑料材料（例如eppendorf和瓶）和溶剂（例如水、TrisHCl和HAc）在高压灭菌器中灭菌。所有其他可处理物（例如尖端和滤器）是预灭菌来的。
表征
a）通过动态光散射的粒度分布对于MI-NP-10-INS（胺-gal-胰岛素纳米颗粒）通过数目和体积分别显示于图15A和B中。
关于图15A中所示的峰的峰值如下：
峰168.46nm
关于图15B中所示的峰的峰值如下：
峰188.38nm
b）胰岛素含量：
与纳米颗粒结合的胰岛素%通过下式进行测定：
表2–胰岛素含量
在NP-胰岛素纳米颗粒中的胰岛素和金浓度：
胰岛素：55.7mg胰岛素
金：13.041mg金
总体积：3.23mL水
最终胰岛素浓度：17.25mg胰岛素/mL=500单位/mL
最终金浓度：4.037mgAu/mL。
不希望受任何理论束缚，本发明人考虑下述：
102Au原子/NP，对于其数学结果是14个胰岛素分子附着至1个NP。因为几何考虑允许在纳米颗粒的表面上关于约7个胰岛素分子的间隔，所以这些结果暗示每个NP含有7个胰岛素二聚体单位。
胰岛素金纳米颗粒分批MI-NP-10-INS的进一步表征获得下述结果。
最终胰岛素浓度：17.25mg胰岛素/mL=500U/mL，在针对已知浓度的胰岛素标准化溶液校正后，通过比色二辛可宁酸（bicinchonicicacid）测定法测定。
最终金浓度：4.037mgAu/mL，在针对已知浓度的金标准化溶液校正后，通过用比色测定法与爱普杷嗪测定法测定。
总体积：在MilliQ水中3.23mL。
在几何考虑后，一个α-半乳糖-EG-胺-Au纳米颗粒含有具有102个原子的金核。随后：
4.037mg=2.049e-5摩尔=1.234e19原子=1.21e17纳米颗粒
17.25mg=2.97e-6摩尔=1.789e18分子
因此，一个α-半乳糖-EG6NH2-Au纳米颗粒与约14–15个胰岛素分子结合，以产生最终纳米颗粒。
来自热重量分析的结果：
不希望受任何理论束缚，本发明人考虑对于胰岛素-NP，我们具有其中410ug已分解的500ug干重。因此，有机物百分比是82%。考虑在一个α-半乳糖-EG6NH2-Au纳米颗粒中102个金原子，金重量是20091（18%）和有机冠是12122。因此，为了具有其为82%有机物的颗粒，它必须具有111616的重量，其为91525有机物。因为12122的有机物是冠，这留下约79403的有机物是胰岛素。因为胰岛素具有MW5808，那么我们必须具有14摩尔胰岛素/颗粒。
图16显示了实验热重量分析（TGA）数据。
实施例5–胰岛素结合的Zn最佳化
金纳米颗粒（NP），αGal（1）EG6NH2（1）NP如上文实施例2中所述制备。为了评估Zn对于与NP的胰岛素结合的影响，NP的第一个分批在不存在Zn的情况下合成。NP的第二个分批在1.33当量的Zn的存在下合成。NP的第三个分批在不存在Zn的情况下合成，但具有加入合成后的NP中的1.33当量ZnCl2。随后测量人胰岛素与金NP的三个分批的结合。
结果显示于图17中。图17展示了显示与不同的金NP浓度结合的固定的17.2纳摩尔胰岛素的量。不含Zn合成的NP、用1.33当量合成的NP和具有1.33当量ZnCl2的无ZnNP的比较。
图17中的曲线图显示不存在锌，胰岛素结合处于极低水平。当锌存在时，胰岛素结合显著更高直到定量。无论在NP合成过程中是否存在锌或它是否在合成后加入，发生等价胰岛素结合。
不希望受任何理论束缚，本发明人认为Zn2+阳离子提供了与金NP改善的胰岛素结合。其他形式的Zn例如ZnO还可以介导改善的胰岛素结合。特别地，在已贮存数月时期的金NP样品中ZnO的存在指出ZnO可以形成，且可以另外地或备选地Zn2+阳离子介导或促进与NP改善的胰岛素结合。
在胰岛素结晶、形成和功能中Zn2+的重要性先前已得到报道。然而，本文描述的数据指出包括在Zn2+的存在下，与NP结合的胰岛素是单体或二聚体形式，而不是在Zn2+的存在下更通常与人胰岛素结合的六聚体形式（即胰岛素不与NP结合）。这可以呈现与本发明有关的相当大的优点，因为与六聚体胰岛素相比较，单体或二聚体胰岛素在许多情况（例如临床情况）中是优选的。
本发明人已发现GLP-1与金NP（本文描述的）的结合在Zn（包括但不限于Zn2+和/或ZnO）的存在下发生。与本文描述的金NP结合的GLP-1是在Zn的存在下合成的NP。本文特别考虑Zn可以存在于GLP-1结合的金纳米颗粒组合物中。
实施例6–与金纳米颗粒的GLP-1结合
金纳米颗粒（NP），αGal（1）EG6NH2（1）NP如上文实施例2中所述制备。代替加入胰岛素，加入GLP-1。发现GLP-1与NP结合。固定的29.8纳摩尔GLP-1与不同金NP浓度的结合显示于图18中。这些结果证实除胰岛素外的肽与本发明的纳米颗粒结合。
实施例7–纳米颗粒共结合超过一种蛋白质：混合的胰岛素/GLP-1纳米颗粒
金纳米颗粒（NP），αGal（1）EG6NH2（1）NP如上文实施例2中所述制备。将胰岛素和GLP-1都加入NP中。对GLP-1/胰岛素NP的水溶液实施通过MALDI的分析，并且结果显示于图19中。对GLP-1/胰岛素NP实施HPLC，并且踪迹显示于图20中。HPLC数据显示测量19.8mg的胰岛素和1.33mg的GLP-1。
使用26.2mg胰岛素和1.8mgGLP-1的混合物执行结合反应。HPLC数据显示胰岛素:GLP-1的近似比在与纳米颗粒结合后得到维持。
MALDI和HPLC数据证实GLP-1和胰岛素与金纳米颗粒的混合结合。不希望受任何理论束缚，本发明人认为与单个种类的肽的结合相比较，两个或更多个不同种类的肽与本发明的纳米颗粒的共结合在特定情况（例如特定临床情况）中可以是优选的。特别地，肽的组合可以这样在纳米颗粒上携带，从而使得肽执行互相有利的功能和/或协作例如以协同方式作用。
本文引用的所有参考文献整体且为了所有目的通过引用合并入本文，其程度与每个个别出版物或专利或专利申请特别且个别指出通过引用整体合并一样。
本文描述的具体实施方案提供作为例子而不是限制。本文的任何子标题仅为了方便起见而包括，并且不应解释为以任何方式限制公开内容。
Claims (69)
1.一种纳米颗粒，其包含：
(i)包括金属的核，所述金属选自：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何组合；
(ii)包括共价连接至所述核的多个配体的冠；和
(iii)与所述冠非共价结合的至少一种肽，所述肽选自：胰岛素、GLP-1、以及胰岛素和GLP-1的组合，
其中共价连接至所述核的所述多个配体包含至少第一配体和第二配体，其中：
(a)所述第一配体是2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；
(b)所述第一配体是2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷；
(c)所述第一配体是2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；或
(d)所述第一配体是2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇，
并且其中所述第一个和第二配体经由其各自的硫原子共价连接至所述核。
2.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述肽与所述冠可逆结合。
3.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述肽这样与所述冠结合，从而使得在使所述纳米颗粒与生理溶液接触后，至少部分的结合肽从所述纳米颗粒中释放。
4.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述肽能够刺激哺乳动物受试者中的生理学应答。
5.根据权利要求4的纳米颗粒，其中所述肽能够刺激哺乳动物受试者中血糖水平的减少。
6.根据权利要求5的纳米颗粒，其中所述肽是单体和/或二聚体人胰岛素。
7.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述第一配体和所述第二配体以1:40-40:1的比例存在于所述纳米颗粒上。
8.根据权利要求7的纳米颗粒，其中所述比例是1:10-10:1。
9.根据权利要求8的纳米颗粒，其中所述比例是1:2-2:1。
10.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述冠包含至少5个配体/核。
11.根据权利要求10的纳米颗粒，其中所述冠包含10–1000个配体/核。
12.根据权利要求11的纳米颗粒，其中所述冠包含44-106个配体/核。
13.根据权利要求1的纳米颗粒，其中每个核结合至少5个肽分子。
14.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述核包含选自下述的钝态金属：Au、Ag、Pt、Pd和Cu或其任何组合。
15.根据权利要求14的纳米颗粒，其中所述核包含选自下述的金属组合：Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd、Au/Fe/Cu/Gd。
16.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述核是磁性的。
17.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述核进一步包含选自下述的NMR活化原子：Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和镧系元素3+。
18.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述核进一步包含半导体。
19.根据权利要求18的纳米颗粒，其中所述半导体选自：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
20.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述核包含由选自下述的金属涂布的金属氧化物：Au、Ag、Cu、Pt、Pd和Zn或其任何组合。
21.根据权利要求20的纳米颗粒，其中所述金属氧化物具有式XFe2O4，其中X是选自下述的金属：Fe、Mn和Co。
22.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒核具有在0.5nm-50nm的范围中的直径。
23.根据权利要求22的纳米颗粒，其中所述直径在1nm-10nm的范围中。
24.根据权利要求23的纳米颗粒，其中所述直径在1.5nm-2nm的范围中。
25.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含二价组分。
26.根据权利要求25的纳米颗粒，其中所述二价组分存在于所述纳米颗粒的所述冠中。
27.根据权利要求25的纳米颗粒，其中所述二价组分选自二价金属、二价金属化合物或具有二价状态的其他组分。
28.根据权利要求27的纳米颗粒，其中所述二价组分选自锌、镁、铜、镍、钴、镉或钙，及其氧化物和盐。
29.根据权利要求25的纳米颗粒，其中所述二价组分以足以产生稳定化效应的量和/或这样的量存在，相对于在不存在所述二价组分的情况下所述肽与所述冠的结合水平，其足以增强所述肽与所述冠的结合。
30.根据权利要求29的纳米颗粒，其中所述二价组分以对于所述核中的所述金属0.5–2.0当量的量存在。
31.根据权利要求30的纳米颗粒，其中所述二价组分以对于所述核中的所述金属0.75–1.5当量的量存在。
32.根据权利要求28的纳米颗粒，其中所述锌选自：Zn2+和ZnO。
33.根据权利要求32的纳米颗粒，其中所述锌是ZnCl2。
34.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述至少一种肽是GLP-1。
35.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述至少一种肽是两个种类的肽，是胰岛素和GLP-1。
36.一种纳米颗粒，其包含：
(i)包括金属的核，所述金属选自Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何组合；
(ii)包含共价连接至所述核的多个配体的冠，所述多个配体包含至少第一配体和第二配体，其中：
(a)所述第一配体是2′-巯乙基-α-D-吡喃半乳糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；
(b)所述第一配体是2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是5′-巯戊基-2-脱氧-2-咪唑乙酰胺-α,β-D-吡喃葡萄糖苷；
(c)所述第一配体是2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇；或
(d)所述第一配体是2′-巯乙基-2-乙酰胺-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，并且所述第二配体是1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15,-五氧杂-十七烷醇，
并且其中所述第一个和第二配体经由其各自的硫原子共价连接至所述核。
37.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述第一配体和所述第二配体以1:40-40:1的比例存在于所述纳米颗粒上。
38.根据权利要求37的纳米颗粒，其中所述比例是1:10-10:1。
39.根据权利要求38的纳米颗粒，其中所述比例是1:2-2:1。
40.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述冠包含至少5个配体/核。
41.根据权利要求40的纳米颗粒，其中所述冠包含10–1000个配体/核。
42.根据权利要求41的纳米颗粒，其中所述冠包含44-106个配体/核。
43.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述核包含选自下述的钝态金属：Au、Ag、Pt、Pd和Cu或其任何组合。
44.根据权利要求43的纳米颗粒，其中所述核包含选自下述的金属组合：Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd、Au/Fe/Cu/Gd。
45.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述核是磁性的。
46.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述核进一步包含选自下述的NMR活化原子：Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和镧系元素3+。
47.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述核进一步包含半导体。
48.根据权利要求47的纳米颗粒，其中所述半导体选自：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
49.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述核包含由选自下述的金属涂布的金属氧化物：Au、Ag、Cu、Pt、Pd和Zn或其任何组合。
50.根据权利要求49的纳米颗粒，其中所述金属氧化物具有式XFe2O4，其中X是选自下述的金属：Fe、Mn和Co。
51.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒核具有在0.5nm-50nm的范围中的直径。
52.根据权利要求51的纳米颗粒，其中所述直径在1nm-10nm的范围中。
53.根据权利要求52的纳米颗粒，其中所述直径在1.5nm-2nm的范围中。
54.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒核包含二价组分。
55.根据权利要求54的纳米颗粒，其中所述二价组分存在于所述纳米颗粒的所述冠中。
56.根据权利要求54的纳米颗粒，其中所述二价组分选自二价金属、二价金属化合物或具有二价状态的其他组分。
57.根据权利要求56的纳米颗粒，其中所述二价组分选自锌、镁、铜、镍、钴、镉或钙，及其氧化物和盐。
58.根据权利要求57的纳米颗粒，其中所述锌选自：Zn2+和ZnO。
59.根据权利要求58的纳米颗粒，其中所述锌是ZnCl2。
60.一种药物组合物，其包含根据权利要求1的纳米颗粒和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
61.根据权利要求60的药物组合物，其中所述组合物配制用于静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、皮内(i.d.)或皮下(s.c)途径施用于哺乳动物受试者。
62.一种稳定化选自胰岛素和GLP-1的至少一种肽的方法，其包括在允许所述至少一种肽与所述纳米颗粒的所述冠结合的条件下，使所述至少一种肽与如权利要求36中定义的纳米颗粒接触。
63.根据权利要求62的方法，其中所述肽是单体和/或二聚体人胰岛素。
64.根据权利要求62的方法，其中所述肽是GLP-1。
65.根据权利要求62的方法，其中所述至少一种肽是两个种类的肽，其是胰岛素和GLP-1。
66.一种如权利要求1–35中任一项中定义的纳米颗粒，其用于在医学治疗的方法中使用。
67.如权利要求1–35中任一项中定义的纳米颗粒，用于如下方法中，其中所述方法用于治疗哺乳动物受试者中的糖尿病。
68.如权利要求1–35中任一项中定义的纳米颗粒在制备用于治疗哺乳动物受试者中的糖尿病的药物中的用途。
69.一种制品，其包含：
如权利要求1–35中任一项中定义的至少一种纳米颗粒；
用于容纳所述至少一种纳米颗粒的容器；和
插页和/或标签。
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