CN105339011A - 纳米颗粒肽组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特别地用于药物的携带胰淀素肽的纳米颗粒，并且包括用于治疗例如血糖调节的病症的方法。纳米颗粒组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含含有金属和/或半导体的核；和包含多个共价地连接于所述核的配体的冠，其中所述配体包含谷胱甘肽；以及至少一个非共价地结合于所述冠的胰淀素肽。

Description

纳米颗粒肽组合物
发明领域
本发明涉及特别地用于药物的携带肽的纳米颗粒，并且包括用于治疗例如血糖调节的病症的方法。
发明背景
本发明涉及包括用于治疗哺乳动物，特别地人的组合物和制品以及制备和施用此类组合物和制品的方法。
生物活性剂诸如肽通常遭受差的稳定性(特别地热稳定性)差，这可限制所述试剂在制备、加工、贮存和/或递送过程中所经受的条件。例如，胰淀素、GLP-1和胰岛素用于1型及2型糖尿病的控制和治疗。通常用一种或多种防腐剂和/或稳定剂配制用于人用的医药肽制剂。此外，有限的胃肠稳定性通常给生物活性肽的有效口服施用造成障碍。
WO2011/154711描述了具有被糖冠包围的金核并且用作肽诸如胰岛素的载体的葡萄糖纳米颗粒。
仍然对能够携带和/或稳定生物活性肽(包括胰淀素)的其他纳米颗粒组合物、以及向受试者递送此类生物活性肽的方法存在未满足的需求。
本发明解决这些和其它需要。
发明概述
本发明广泛地涉及携带胰淀素肽的纳米颗粒组合物。本发明人已发现具有谷胱甘肽配体的冠的纳米颗粒结合胰淀素肽(在一些情况下具有每纳米颗粒约50个胰淀素肽分子的结合能力)。如本文中定义的纳米颗粒从而提供用于配制胰淀素以及将其递送至需要胰淀素治疗性治疗的受试者的载体。
因此，在第一方面，本发明提供了纳米颗粒组合物，其包含：
(a)纳米颗粒，其包含：
(i)包含金属和/或半导体的核；
(ii)包含多个共价地连接于所述核的配体的冠，其中所述配体包含谷胱甘肽；和
(b)至少一个非共价地结合于所述冠的胰淀素肽。
根据本发明的方面的任一方面，胰淀素肽可包含天然胰淀素肽，诸如人胰淀素或大鼠胰淀素，或胰淀素类似物。在一些情况下，胰淀素肽与如SEQIDNO:2所示的全长氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性。在一些情况下，胰淀素肽包含全长氨基酸序列KCNTATCATQRLANFLPHSSNNFGAILSSTN(SEQIDNO:2)或由所述氨基酸序列组成。
在一些情况下，胰淀素肽与如下面SEQIDNO:4所示的人胰淀素的全长氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性。SEQIDNO:4是如下面SEQIDNO:3中所示的和在UniProt登录号P10997(131版，日期为2012年10月3日)下公开的人胰岛淀粉样多肽的完全89个氨基酸序列的残基34-70的序列。
>sp|P10997|IAPP_HUMAN胰岛淀粉样多肽OS＝智人GN＝IAPPPE＝1SV＝1
MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQ RLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(SEQIDNO:3，SEQIDNO:4加以下划线显示)。
>sp|P10997|34-70
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQIDNO:4)。
在根据本发明的某些情况下，胰淀素肽可选自由以下组成的组：
(i)包含与SEQIDNO:2或4中所示的全长序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的肽；
(ii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的肽；
(iii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列的变体序列或由所述变体序列组成的肽，其中所述变体与SEQIDNO:2或4中所示的所述全长氨基酸序列相异在于不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9个或不超过10个氨基酸的添加、缺失、取代或修饰；
(iv)包含(i)-(iii)中任一项的片段或由所述片段组成的肽，所述片段具有至少15、20、25个或30个氨基酸的序列长度。
优选地，胰淀素肽展现胰淀素的生物活性。具体地，(i)-(iv)中任一项的所述胰淀素肽可在胰淀素活性的体外或体内生物测定中展现至少50％的SEQIDNO:2的胰淀素肽的活性或至少50％的SEQIDNO:4的胰淀素肽的活性。在某些情况下，胰淀素活性可包含餐后血糖漂移的减少、胃分泌的抑制(例如胃酸、胰酶和胆汁排出物中一种或多种的分泌)、胃排空的抑制和/或餐后胰高血糖素分泌的抑制。
已发现，根据本发明的纳米颗粒可被提供有多个数量的形成冠的配体。例如，在一些情况下，冠包含每核至少5、10、20或至少50个配体，例如每核约10至1000个配体。具体地，根据本发明的任何方面的纳米颗粒组合物可包含每核至少5、10、20个或至少50个谷胱甘肽配体。
每核结合的胰淀素肽分子的数目不受特别限制。对于某些应用，可期望使用少至每核1、2、3或4个胰淀素肽，然而在其它情况下，本发明的纳米颗粒可包含每核结合的至少5、10、20个或至少50个或更多个胰淀素肽分子。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，可将至少一个胰淀素肽以可逆的方式结合于纳米颗粒的冠。具体地，可将胰淀素肽结合于冠，以便至少一部分结合的胰淀素肽在将纳米颗粒与生理溶液接触后从纳米颗粒释放。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，所述配体包含单独的或与其它种类的配体结合的谷胱甘肽，例如本文中特别地设想谷胱甘肽与糖配体(包括含葡萄糖配体)的组合。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，纳米颗粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50个配体，所述配体为(i)谷胱甘肽配体；或(ii)谷胱甘肽配体和除谷胱甘肽之外的配体，诸如含糖配体。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，纳米颗粒的核的直径在1nm至5nm的范围内。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，包括其配体的纳米颗粒的直径在2nm至50nm，任选地3nm至30nm，或4nm至20nm或5nm至15nm的范围内。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，核包含选自由以下组成的组的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn，或其任意组合。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，核具有磁性。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，核包含半导体。半导体可包含金属原子，诸如镉。或者或另外地，半导体可包含非金属原子。本文中特别地设想有机半导体。根据本发明的优选半导体可选自由以下组成的组：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，核能够用作量子点。
优选地，根据本发明的第一方面的组合物包含多个，例如100、1000、100000个或更多个所述纳米颗粒，其中所述组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的纳米颗粒具有至少一个结合的胰淀素肽。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，纳米颗粒组合物包含载体，诸如溶液、聚合物、粉剂或乳膏，其中悬浮纳米颗粒和结合的胰淀素肽。组合物可呈缔合形式、悬浮液或被包含在单个包装、容器或载体中。在某些情况下，组合物可呈一个或多个剂量(例如确定量的胰淀素肽或胰淀素肽活性单位)，诸如以治疗剂量或确定数目的剂量的形式。
在一些情况下，根据本发明的方面的任一方面，纳米颗粒组合物还包含至少一种非共价或共价地结合于所述核和/或所述冠的渗透促进剂。如在2013年2月5日提交的共同未决的GB专利申请第1301991.4号(其全部内容出于所有目的通过引用明确地并入本文)，和2014年2月4日提交的共同未决的国际申请PCT/GB2014/050301(其全部内容出于所有目的通过引用明确地并入本文)描述的，某些渗透促进剂可有利地结合于纳米颗粒而不替换任何显著的活性肽，诸如如本文中定义的胰淀素肽。在某些情况下，所述渗透促进剂选自烷基-D-麦芽糖苷(例如十四烷基-D-麦芽糖苷、月桂基-β-D-麦芽糖苷、己基-β-D-麦芽糖苷、辛基-β-D-麦芽糖苷、壬基-β-D-麦芽糖苷、癸基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、十三烷基-β-D-麦芽糖苷或十六烷基-β-D-麦芽糖苷)和凝胶蛋白酸。在某些情况下，所述渗透促进剂，例如十四烷基-D-麦芽糖苷、月桂基-β-D-麦芽糖苷和/或凝胶蛋白酸非共价地结合于所述冠。
在第二方面，本发明提供了根据第一方面定义的纳米颗粒组合物，其用于药物。
在第三方面，本发明提供根据第一方面定义的纳米颗粒组合物，其用于治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的方法。
在第四方面，本发明提供根据第一方面定义的纳米颗粒组合物在制备用于治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的药物中的用途。
在第五方面，本发明提供了治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面定义的纳米颗粒组合物。
在第六方面，本发明提供降低哺乳动物受试者的血糖水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据第一方面定义的纳米颗粒组合物。
根据本发明的第二至第六方面的任一方面，受试者可以是人、伴侣动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类动物)、家养或农场动物(例如猪、牛、马或绵羊)。优选地，受试者是人。
根据本发明的第二至第六方面的任一方面，受试者可具有导致血糖水平的不适当控制的病症。具体地，本文中特别地设想患有糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病或前驱糖尿病)的受试者。受试者可以先前被诊断为患有糖尿病或可以先前未被诊断为患有糖尿病。例如，受试者可已被鉴定为处于发生糖尿病的风险中。受试者在一些情况下可接着进行糖尿病的治疗过程。具体地，受试者可服用或被建议服用胰岛素。
根据本发明的第二至第六方面的任一方面，可将纳米颗粒组合物与或用于与一种或多种用于控制血糖的治疗剂一起施用(即同时、单独地或相继地)。具体地，可将纳米颗粒组合物与或用于与一种或多种治疗剂一起施用，所述治疗剂选自由以下组成的组：胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、胃抑肽(GIP)或其类似物、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂、磺酰脲、二甲双胍、α-葡苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类。联合治疗具有相当大的增强本发明的纳米颗粒组合物的治疗效果的潜力。本文中设想的具体组合包括：(i)胰岛素或其类似物以及本发明的纳米颗粒组合物；(ii)GLP-1或其类似物以及本发明的纳米颗粒组合物；(iii)WO2011/154711中公开的携带胰岛素的纳米颗粒以及本发明的纳米颗粒组合物，(iv)WO2011/154711中公开的携带GLP-1的纳米颗粒以及本发明的纳米颗粒组合物；和(v)胰岛素和WO2011/154711(参见，例如，其权利要求48)中公开的携带GLP-1的纳米颗粒以及本发明的纳米颗粒组合物。
根据本发明的第二至第六方面的任一方面，纳米颗粒组合物通过任何适当的途径施用或用于通过所述途径施用。在具体情况下，纳米颗粒组合物通过选自由以下组成的组的途径施用或用于通过所述途径施用：静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、真皮内(i.d.)、腹膜内或皮下(s.c.)注射或输注；经颊；唇下；舌下；通过吸入；经由一种或多种粘膜；泌尿生殖器；直肠；和皮肤。
在第七方面，本发明提供制品，其包括：
根据本发明的第一方面定义的纳米颗粒组合物；
用于容纳纳米颗粒组合物的容器；和
插页和/或标签。优选地，插页和/或标签提供与纳米颗粒组合物在治疗葡萄糖调节紊乱的方法中的用途相关的说明书、剂量和/或施用信息。具体地，所述病症可以是I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病。
在第八方面，本发明提供用于产生根据本发明的第一方面定义的纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：
提供包含含有金属和/或半导体的核和包含多个共价地连接于核的配体的冠的纳米颗粒，其中所述配体包含谷胱甘肽；和
将纳米颗粒在允许至少一个胰淀素肽结合于纳米颗粒的冠的条件下与至少一个胰淀素肽接触。
在一些情况下，根据本发明的第一方面，所述方法包括产生纳米颗粒的早期步骤，所述早期步骤包括：将包含谷胱甘肽的溶液与包含成核材料(例如氯化金(III))的溶液以及与还原剂(例如硼氢化钠)组合，从而引起纳米颗粒自组装。
本发明包括描述的方面和优选特征的组合，除其中此类组合是明确不允许的或被声明要明确避免的之外。下面参考所附实施例和附图，更详细地描述本发明的这些和其它方面以及实施方案。
附图简述
图1显示Val(8)GLP-1肽对具有α-半乳糖配体和氨基接头配体的冠的纳米颗粒(“ToxNP”–三角形)和对具有谷胱甘肽配体的冠的纳米颗粒(“GSHNP”–正方形)的结合。GLP-1肽展现与GSHNP相比较更大的对ToxNP的结合。
图2显示Val(8)GLP-1肽对具有α-半乳糖配体和氨基接头配体的冠的纳米颗粒(“ToxNP”–三角形)和对具有谷胱甘肽配体的冠的纳米颗粒(“GSHNP”–正方形)的结合能力(每纳米颗粒核的肽的分子)。GLP-1肽展现相较于GSHNP(每NP约10个)更大的对ToxNP的结合能力(每NP约80个)。
图3显示胰淀素肽对具有α-半乳糖配体和氨基接头配体的冠的纳米颗粒(“ToxNP”–三角形)和对具有谷胱甘肽配体的冠的纳米颗粒(“GSHNP”–正方形)的结合。胰淀素肽展现相较于ToxNP更大的对GSHNP的结合。
图4显示胰淀素肽对具有α-甘露糖苷配体和氨基接头配体的冠的纳米颗粒(“ToxNP”–三角形)和对具有谷胱甘肽配体的冠的纳米颗粒(“GSHNP”–正方形)的结合能力(每纳米颗粒核的肽的分子)。胰淀素肽展现相较于ToxNP(基本上零结合)更大的对GSHNP的结合能力(每NP约50-55个)。
发明详述
在描述本发明中，将使用下列术语，所述术语旨在如下文中指定的所定义。
如本文中使用的，“纳米颗粒”是指具有纳米级的颗粒，并且无意传达任何特定形状限制。具体地，“纳米颗粒”包括纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在某些实施方案中，本文中设想的纳米颗粒和/或纳米颗粒核具有通常多面体或球体的几何形状。
包含多个含糖配体的纳米颗粒已描述于例如，WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704(其每一个的完整内容通过引用明确地并入本文)中，并且此类纳米颗粒可用于根据本发明。此外，利用有机化合物(例如通过巯基-金键)官能化的包含氧化铁铁氧体(具有式XFe2O4，其中X＝Fe、Mn或Co)的磁性核的涂覆有金的纳米颗粒描述于EP2305310(其完整内容通过引用明确地并入本文)中，并且被明确地考虑用作根据本发明的纳米颗粒/纳米颗粒核。
如本文中使用的，“冠”是指可部分或完全地覆盖纳米颗粒核的暴露表面的层或涂层。冠包括通常包含至少一个糖部分、一个表面活性剂部分和/或一个谷胱甘肽部分的多个配体。因此，冠可被认为是包围或部分包围金属核的有机层。在某些实施方案中，冠提供和/或参与钝化纳米颗粒的核。因此，在某些情况下，冠可包括大体上稳定含有半导体或金属的核的充分完整的涂层。然而，在本文中特别地设想，某些具有核的纳米颗粒，例如包括涂覆有贵金属的含金属氧化物的内核的纳米颗粒可包括仅部分涂覆核表面的冠。在某些情况下，冠促进本发明的纳米颗粒的溶解度，诸如水溶性。
纳米颗粒
纳米颗粒是可用作用于固定配体的基底的小颗粒，例如金属或半导体原子簇。
优选地，纳米颗粒具有拥有0.5至50nm，更优选地0.5至10nm，更优选地0.5至5nm，更优选地0.5至3nm，以及更优选地0.5至2.5nm的平均直径的核。当除了核以外还考虑配体时，优选地颗粒的总体平均直径为2.0至20nm，更优选3至10nm，最优选4至5nm。可使用本领域中公知的技术诸如透射电子显微镜检查来测量。
核材料可以是金属或半导体(所述半导体任选地包含金属原子或为有机半导体)并且可由不止一种类型的原子形成。优选地，核材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核还可由合金(包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd)形成，并且可用于本发明。优选的核材料是Au和Fe，最优选的材料是Au。纳米颗粒的核优选地包含约100至500个原子(例如金原子)来提供在纳米范围内的核直径。其它特别有用的核材料掺杂有一种或多种具有NMR活性的原子，从而允许在体外和体内使用NMR来检测纳米颗粒。NMR活性原子的实例包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3，或本申请中其它地方描述的量子点。
包含半导体化合物的纳米颗粒核可被检测，因为纳米级半导体晶体能够用作量子点，即它们可吸收光，从而激发材料中的电子至更高的能级，随后以材料的特征频率释放光子。半导体核材料的实例是硒化镉、硫化镉、碲化镉。还包括的是锌化合物诸如硫化锌。
在一些实施方案中，纳米颗粒的核可具有磁性并且包含磁性金属原子，任选地与惰性金属原子组合的。例如，惰性金属可以是金、铂、银或铜，并且磁性金属可以是铁或钆。在优选实施方案中，惰性金属是金并且磁性金属是铁。在该情况下，方便地核中的惰性金属原子对磁性金属原子的比例为约5:0.1至约2:5。更优选地，所述比例为约5:0.1至约5:1。如本文中使用的，术语"惰性金属"是指不显示磁性并且对于氧化是化学上稳定的金属。惰性金属可以是反磁性的或超顺磁性的。优选地，此类纳米颗粒是超顺磁性的。
具有包含顺磁性金属的核的纳米颗粒的实例包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3的那些纳米颗粒。
其它磁性纳米颗粒可从材料诸如MnFe(尖晶石型铁氧体)或CoFe(钴铁氧体)形成，可将所述材料形成到纳米颗粒(磁性流体，添加或不添加上文中定义的其它核材料)中。用于产生此类纳米颗粒的自组装附着化学物质的实例于Biotechnol.Prog.,19:1095-100(2003),J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003),J.ColloidInterfaceSci.255:293-8(2002)中给出。
在一些实施方案中，纳米颗粒或其配体包含可检测的标记。所述标记可以是纳米颗粒的核或配体的元件。所述标记由于纳米颗粒的该元件的固有性质或通过与可检测的其它部分连接、缀合或缔合而可以是可检测的。标记的优选实例包括为荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素、罗丹明或四甲基罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5等，并且可通过激发荧光标记和使用拉曼散射光谱(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science2002,297:1536-1539)检测发射光来进行检测。
在一些实施方案中，纳米颗粒可包含用于使用由放射性核素发射的放射性检测(例如通过使用PET、SPECT)纳米颗粒，或用于治疗，即用于杀伤靶细胞的放射性核素。通常用于本领域的可被容易地改造来适用于本发明的放射性核素的实例包括99mTc，其以多种氧化状态存在，尽管最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；通常作为Cu2+盐使用的67Cu；通常作为Ga3+盐例如柠檬酸镓使用的67Ga；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；通常作为In3+盐使用的111In；通常作为碘化钠使用的125I或131I；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；通常作为Tl+盐诸如氯化铊使用的201Tl；39Y3+；71Lu3+；和24Cr2+。放射性核素作为标记和示踪剂的一般用途在本领域中是公知的，并且可被本领域技术人员容易地改造来用于本发明的方面。可通过掺入纳米颗粒的核或将它们包括作为标记(作为固定在纳米颗粒上的配体的部分存在)来最容易地使用放射性核素。
另外地或可选地，可使用如上指定的与纳米颗粒结合的标记或通过使用它们的性质，使用本领域中公知的许多技术来检测本发明的纳米颗粒或它们与其它种类的相互作用的结果。这些检测纳米颗粒的方法可包括例如通过简单的目测观察或通过使用光散射(含有纳米颗粒的溶液的透射率)检测当纳米颗粒结合于另一种类时产生的聚集，使用尖端技术诸如透射电子显微镜检查(TEM)或原子力显微镜检查(AFM)来使纳米颗粒可视化。检测金属颗粒的其它方法是使用为通常由光学辐射引起的金属表面上的电子激发的等离子体共振。表面等离子体共振(SPR)的现象存在于金属(诸如Ag或Au)与介电材料诸如空气或水的界面。当分析物结合于固定在纳主颗粒表面上的配体时，SPR的变化发生，从而改变界面的折射率。SPR的其它有利方面可用于监测实时相互作用。如上文中提及的，如果纳米颗粒包括具有NMR活性的原子或掺杂有所述原子，则该技术可用于使用本领域中公知的技术在体外或体内检测颗粒。纳米颗粒还可使用基于定量信号放大的系统(使用纳米颗粒促进的银(I)的还原)来检测。如果纳米颗粒包括配体作为荧光探针，则使用荧光显微镜检查。同样地，糖类的同位素标记可用于促进它们的检测。
胰淀素肽
在根据本发明的某些情况下，“胰淀素肽”可选自由以下组成的组：
(i)包含与SEQIDNO:2或4中所示的全长序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的肽；
(ii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的肽；
(iii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列的变体序列或由所述变体序列组成的肽，其中所述变体与SEQIDNO:2或4中所示的所述全长氨基酸序列相异在于不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或不超过10个氨基酸的添加、缺失、取代或修饰；
(iv)包含(i)-(iii)中任一项的片段或由所述片段组成的肽，所述片段具有至少15、20、25或30个氨基酸的序列长度。
优选地，(i)-(iv)中任一项的所述胰淀素肽展现胰淀素的生物活性。具体地，(i)-(iv)中任一项的所述胰淀素肽可在胰淀素活性的体外或体内生物测定中展现至少50％SEQIDNO:2的胰淀素肽的活性或至少50％SEQIDNO:4的胰淀素肽的活性。在某些情况下，胰淀素活性可包含餐后血糖漂移的减少、胃分泌的抑制(例如胃酸、胰酶和胆汁排出物中一种或多种的分泌)、胃排空的抑制和/或餐后胰高血糖素分泌的抑制。
胰淀素肽结合于纳米颗粒的冠。不希望受任何理论束缚，目前据信，胰淀素肽可参与一种或多种与一个或多个配体的可逆结合相互作用，所述配体提供纳米颗粒的冠。具体地，一部分氨基酸序列可参与氢键、范德华力和/或与一个或多个配体的静电相互作用(例如与一个或多个谷胱甘肽配体的相互作用)。肽结合可包括与纳米颗粒的一个或多个配体的吸附或其他直接或间接相互作用。
如本文中参考本发明的某些实施方案所描述的，胰淀素肽可被结合，以使至少一部分或部份结合的胰淀素肽在纳米颗粒与生理溶液接触后从纳米颗粒释放。如本文所述，胰淀素肽可以以这样的方式结合于纳米颗粒，以便使胰淀素肽在结合时稳定(例如热稳定)，但是是可释放的并且可以以具有生物活性的形式获得的(例如，可释放的，以便胰淀素肽可通过ELISA检测和/或能够在体外或体内测定系统中产生至少一种生物作用，这是游离胰淀素肽的特征)。具体地，可将胰淀素肽结合于纳米颗粒，以便胰淀素-结合的纳米颗粒的悬浮液在例如(人)胰淀素的ELISA中产生阳性结果和/或在哺乳动物受试者中对餐后葡萄糖漂移产生作用。
施用和治疗
可通过许多不同的途径(包括经肠或胃肠外途径)向患者施用本发明的纳米颗粒和组合物。胃肠外施用包括通过下列途径的施用：静脉内、经皮肤或皮下、经鼻、肌内、眼内、经上皮、腹膜内和局部(包括表皮、眼、直肠、鼻、吸入和气溶胶)和直肠系统途径。
施用可以例如通过注射，或使用递送枪来轰击性进行施用，以加速经皮肤通过表皮的外层。还可在气溶胶中递送纳米颗粒。这可能通过小尺寸的纳米颗粒来进行。
本发明的纳米颗粒可被配制为可以以固体或液体组合物形式存在的药物组合物。此类组合物通常包含一些种类的载体，例如固体载体或液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液或二醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此类组合物和制剂通常含有至少0.1wt％的化合物。
对于静脉、皮肤或皮下注射或在病灶部位的注射，活性成分将是以胃肠外可接受的水溶液的形式存在，其是无热原的并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够很好地使用例如化合物或其衍生物例如在生理盐水中的溶液，利用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散体来制备合适的溶液。
除了任选地与其它活性成分组合的一种或多种化合物以外，组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域普通技术人员公知的其它材料。此类材料应当为无毒的并且不应当干扰活性成分的功效。载体或其它材料的精确性质可取决于施用途径(例如静脉内、口服或胃肠外)。
液体药物组合物通常被配制来具有约3.0至9.0，更优选约4.5至8.5，更优选约5.0至8.0的pH。组合物的pH可通过使用缓冲剂诸如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸(通常在约1mM至50mM的范围内使用的)来维持。组合物的pH可另外地通过使用生理上可接受的酸或碱来调节。
通常将防腐剂包含在药物组合物中来延缓微生物生长，延长组合物的半衰期，并允许多个使用包装。防腐剂的实例包括苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸及其酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。通常在约0.1至1.0％(w/v)的范围内使用防腐剂。
优选地，以预防有效量或治疗有效量(视情况而定，虽然预防可被认为是治疗)向个体提供药物组合物，这足以显示对个体的益处。通常地，这将引起治疗上有用的活性，从而向个体提供益处。施用的化合物的实际量以及施用的速度和时间过程将取决于待治疗的病况的性质和严重度。全科医生或其他医生的职责是开具治疗的处方，例如剂量的判定，并且通常会考虑待治疗的病症、单个患者的病况、递送部位、施用方法和医师已知的其它因素。技术和方案的实例可在HandbookofPharmaceuticalAdditives，第2版(编辑M.Ash和I.Ash),2001(SynapseInformationResources,Inc.,Endicott,NewYork,USA)；Remington’sPharmaceuticalSciences，第20版，2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins；和HandbookofPharmaceuticalExcipients，第2版，1994中找到。例如，优选以约0.01至100mg的活性化合物/kg的体重，更优选约0.5至10mg/kg的体重的剂量向患者施用组合物。
以下内容通过实施例来呈现并且将不被解释为对权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1–纳米颗粒的合成
基本上如先前所述(WO2011/154711；和Lund等，2011,Biomaterials第32卷第9776-9784页，其完整内容通过引用明确地并入本文)，合成具有糖配体或谷胱甘肽配体的冠的金纳米颗粒。
AL/α-GalNP(Tox批次)
2-硫代-乙基-α-D-半乳糖苷(α-半乳糖苷C2SH)的制备
向半乳糖(3g,16.65mmol)于2-溴乙醇(30ml)中的悬浮液添加酸性树脂Amberlite120-H以达到pH2。在50-60℃下搅拌反应物16小时。过滤反应混合物并用MeOH洗涤。添加三乙胺以达到pH8。浓缩反应的粗制物，将其与甲苯共蒸发3次。将反应混合物溶解于吡啶(75mL)和Ac2O(35mL)中，在0℃添加催化量的DMAP，并在室温下搅拌3小时。用AcOEt稀释混合物，并用1.H2O；2.HCl(10％)3.NaHCO3和4.H2O进行洗涤。收集有机层，经无水Na2SO4干燥。TLC(己烷：AcOEt3:1，2次洗脱)显示主要产物(所需的)和较低Rf的次要组分。使用己烷:乙酸乙酯6:1的混合物作为洗脱剂，通过快速色谱纯化所述产物，并获得2-溴乙基-α-半乳糖苷(2)。
将先前反应的产物2溶解于27ml的2-丁酮中。向该溶液中添加催化量的碘化四丁基铵和4当量的硫代乙酸钾。将所得的悬浮液在室温搅拌2小时。在整个该时期中，通过TLC(己烷-AcOEt2:1，2次洗脱)测试反应物的起始材料的消失。用20ml的AcOEt稀释混合物，用饱和NaCl溶液洗涤混合物。将有机相进行干燥、过滤并在真空下进行蒸发。将产物在己烷/AcOEt2:1→1:1中进行纯化以获得乙酰基硫代-α-半乳糖苷3。
将新的反应产物3溶解于二氯甲烷-甲醇2:1的混合物中。向该混合物中添加1N甲醇钠(1当量)的溶液，并在室温下搅拌1小时。添加AmberliteIR-120H树脂以达到pH5-6。随后过滤所得的混合物，将其浓缩至干燥以获得终产物(α-半乳糖C2SH)。
氨基-巯基接头的制备。
向20ml干燥THF中的PPh3(3g,11.4mmol)溶液添加DIAC(2.3g,11.4mmol)。将混合物在0℃搅拌15分钟直至白色产物出现。向该混合物中逐滴添加(滴液漏斗)六甘醇(1.45mL,5.7mmol)和HSAc(610μl,8.55mmol)在干燥THF(20mL)中的溶液。15分钟后，在Rf0.2于TLC上开始出现产物。将溶液在蒸发器中进行浓缩。将反应粗制物溶解于50ml二氯甲烷中，并于10％K2CO3溶液中进行洗涤。将有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。使用AcOEt:己烷1:1、AcOEt和最终DCM:MeOH4:1作为洗脱剂对粗制物进行快速色谱，产生乙酰基-硫代-六甘醇衍生物。
将反应产物溶解于5ml的DMF和PPh3(2.25g,8.55mmol)中，添加NaN3(0.741g,11.4mmol)和BrCl3C(0,845ml,8.55mmol)，随后在室温下搅拌溶液40分钟。当进行TLC(DCM:MeOH25:1)时，所得的产物具有比起始产物高的Rf。用100ml二乙醚稀释反应混合物，随后用H20洗涤3次。将有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发。使用洗脱剂DMC/MeOH200:1和DCM/MeOH40:1的混合物通过快速色谱纯化产物以获得叠氮基-乙酰基硫代-六甘醇衍生物。
为了除去三苯基氧化膦，将反应产物溶解于10ml的THF中，随后向该溶液中添加0.5g的MgCl2。在80℃下搅拌反应2小时直至沉淀出现，随后通过硅藻土过滤。将产物溶解于乙醇:H203:1的混合物中，添加锌粉(0.45g,6.84mmol)和NH4Cl(0.6g,11.4mmol)。在回流下搅拌反应物1小时直至通过TLC(DCM/MeOH25:1)不再检测出起始材料的存在。将反应物通过硅藻土过滤，随后蒸发溶剂。用AcOEt稀释粗制反应物，用5mlH20提取。将水相蒸发至干燥以获得氨基-巯基-六甘醇产物。
从MidatechBiogune原液获取α-半乳糖C2衍生物3和六甘醇胺接头6。N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、HAuCl4、NaBH4购自Sigma-Aldrich化学公司。咪唑-4-乙酸单盐酸盐购自AlfaAesar。将公司高质量MeOH和Nanopure水(18.1mΩ)用于所有实验和溶液。
α-GalC2(α)
2′-巯乙基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(α)
EG6NH2
1-氨基-17-巯基-3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷醇或
1-氨基-6-巯基-六甘醇(俗名)
AL/α-GalNP(Tox批次)的制备：向MeOH(49mL)中的比率为1:1的胺-巯基六甘醇接头6与α-半乳糖配体3的混合物(0.58mmol，3当量)中添加金盐的水溶液(7.86mL,0.19mmol,0.025M)。将反应物搅拌30秒，随后，分批添加NaBH4(1N)水溶液(4.32mL,4.32mmol)。将反应物以900rpm振荡100分钟。在该时间后，将悬浮液以14000rpm离心1分钟。除去上清液，随后将沉淀溶解于2mL水中。随后，将2mL的悬浮液引入2个过滤器(AMICON,10KDa,4mL)，并以4500g离心5分钟。用水将过滤器中的残留物再洗涤2次。将最终的残留物溶解于80mL水中。
对于金NP的制备，制造在层流柜下进行。首先在高压灭菌器中对所有玻璃和塑料材料(诸如eppendorf、小瓶和瓶子)和溶剂(水，HAc)进行灭菌。将所有其它一次性用品(诸如枪头和过滤器)预先灭菌。
GSHNP
将氧化的配体谷胱甘肽(Fluka49741)溶解于9:1甲醇:水中，并添加氯化金(III)(Sigma-Aldrich,Poole,UK)。以相对于金的4倍摩尔过量添加有机配体。随后在平板床振荡器上温和地混合溶液5分钟。通过在剧烈涡旋下快速添加相对于金的20倍摩尔过量的新鲜制备的1M硼氢化钠(Sigma-Aldrich,Poole,UK)后进行还原来产生纳米颗粒。将样品涡旋总共30秒，随后在平板床振荡器上温和地混合1小时。由于纳米颗粒不溶于甲醇/水溶剂中，因此通过台式离心进行初步纯化，除去上清液并将纳米颗粒沉淀分散在水中。通过在10kDavivaspin离心设备(GEHealthcare)中进行4次水洗涤来实现进一步纯化。所有纳米颗粒制剂的金浓度通过简单的比色测定来测定。简言之，在ELISA板中用30μl的50:50水:王水消化10μl的纳米颗粒样品或12mg/ml金标准(Fluka(Sigma-Aldrich,Poole,UK))和空白对照1分钟，之后添加150μl的2MNaBr，随后立即测量405nm的吸光度，测定在0-10μg范围内具有优良的线性。
实施例2–结合于纳米颗粒的肽
本发明已研究了下列两种肽对如本文所述的纳米颗粒的能力：
1.长效GLP-1类似物Val(8)GLP-1：
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQIDNO:1)；和
2.胰淀素类似物V17至P17：
KCNTATCATQRLANFLPHSSNNFGAILSSTN(SEQIDNO:2)。
在用于胰岛素结合的程序(参见WO2011/154711(其内容通过引用明确地并入本文)的实施例3)后，将GLP-1成功地结合于AL/αGalNP(参见图1和2)。对所述方法的唯一预防改变是将GLP-1直接溶解于20mMpH8.0Tris/HCl中而非最初的HCl中，以避免对肽的潜在损伤。
可能部分归因于Val(8)GLP-1(3384g/mol)相较于胰岛素的更低分子量，Val(8)GLP-1似乎以更大的能力结合于AL/αGalNP。结合能力>80个Val(8)GLP-1/纳米颗粒(参见图2)。
在用于胰岛素结合的标准程序(参见WO2011/154711(其内容通过引用明确地并入本文)的实施例3)后，将胰淀素成功地结合于GSHNP(参见图3和4)。如先前一样，也将胰淀素直接溶解于Tris/HCl缓冲液中。
AL/αGalNP(Tox批次)几乎未显示或未显示结合胰淀素的能力(参见图3和4)。不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信胰淀素对AL/αGalNP的结合的不存在可归因于静电引力的缺乏。
GSHNP似乎达到>50个胰淀素肽/纳米颗粒的结合能力(参见图4)。当与胰岛素结合结果相比较时这相对较高，但与Val(8)GLP-1一样，这被认为至少部分归因于胰淀素对比胰岛素的略微更低的分子量(3904g/mol)。
本文中引用的所有参考资料通过引用整体且为了所有目的并入本文，其程度如同明确且单独地指出每个单独出版物或专利或专利申请通过引用整体并入。
本文中所述的具体实施方案通过举例但非限制的方式提供。本文中的任何副标题仅为方便而被包括，并且不被解释为以任何方式限制本公开内容。

Claims (43)

1.一种纳米颗粒组合物，其包含：
(a)纳米颗粒，其包含：
(i)包含金属和/或半导体的核；
(ii)包含多个共价地连接于所述核的配体的冠，其中所述配体包含谷胱甘肽；和
(b)至少一个非共价地结合于所述冠的胰淀素肽。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述胰淀素肽包含如下序列或由如下序列组成：
(i)具有与SEQIDNO:2或4中所示的全长序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；
(ii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列或由所述全长氨基酸序列组成的肽；
(iii)包含SEQIDNO:2或4中所示的全长氨基酸序列的变体序列或由所述变体序列组成的肽，其中所述变体与SEQIDNO:2或4中所示的所述全长氨基酸序列相异在于不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9个或不超过10个氨基酸的添加、缺失、取代或修饰；
(iv)包含(i)-(iii)中任一项的片段或由所述片段组成的肽，所述片段具有至少15、20、25个或30个氨基酸的序列长度。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米颗粒组合物，其中所述胰淀素肽在胰淀素活性的体外或体内生物测定中展现至少50％的SEQIDNO:4的所述胰淀素肽的活性或至少50％的SEQIDNO:2的所述胰淀素肽的活性。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒组合物，其中所述胰淀素活性选自由以下组成的组：餐后血糖漂移的减少；胃分泌的抑制；胃排空的抑制和餐后胰高血糖素分泌的抑制。
5.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述冠包含每核至少5、10、20或至少50个配体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述冠包含每核至少5、10、20或至少50个谷胱甘肽配体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中结合于所述纳米颗粒的胰淀素肽分子的数目选自：每核1、2、3、4、5、10、20或至少50个。
8.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述至少一个胰淀素肽以可逆的方式结合于所述纳米颗粒的冠。
9.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中可将所述胰淀素肽结合于所述冠，以便至少一部分结合的胰淀素肽在将所述纳米颗粒组合物与生理溶液接触后从所述纳米颗粒释放。
10.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述配体包含单独的或与其它种类的配体结合的谷胱甘肽。
11.根据权利要求10所述的纳米颗粒组合物，其中所述配体包含谷胱甘肽与糖配体的组合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的核的直径在1nm至5nm的范围内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中包括其配体的所述纳米颗粒的直径在2nm至50nm，或3nm至30nm，或4nm至20nm，或5nm至15nm的范围内。
14.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核包含选自由以下组成的组的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn或其任意组合。
15.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核具有磁性。
16.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核包含半导体。
17.根据权利要求16所述的纳米颗粒组合物，其中所述半导体包含金属原子。
18.根据权利要求16所述的纳米颗粒组合物，其中所述半导体选自由以下组成的组：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
19.根据权利要求16所述的纳米颗粒组合物，其中：
所述核能够用作量子点；和/或
所述半导体包含非金属原子。
20.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含多个所述纳米颗粒，其中所述组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的纳米颗粒具有至少一个结合的胰淀素肽。
21.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含其中悬浮所述纳米颗粒和结合的胰淀素肽的载体。
22.根据权利要求21所述的纳米颗粒组合物，其中所述组合物呈缔合形式、悬浮液或被包含在单个包装或容器中。
23.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述组合物呈一个或多个剂量的确定量的胰淀素肽的形式或确定水平的胰淀素肽活性单位的形式。
24.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述组合物还包含至少一种非共价或共价地结合于所述核和/或所述冠的渗透促进剂。
25.根据权利要求24所述的纳米颗粒组合物，其中所述渗透促进剂选自由以下组成的组：烷基-D-麦芽糖苷、十四烷基-D-麦芽糖苷、月桂基-β-D-麦芽糖苷、己基-β-D-麦芽糖苷、辛基-β-D-麦芽糖苷、壬基-β-D-麦芽糖苷、癸基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、十三烷基-β-D-麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷和凝胶蛋白酸。
26.根据权利要求25所述的纳米颗粒组合物，其中所述渗透促进剂非共价地结合于所述冠。
27.如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物，其用于药物。
28.如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物，其用于治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的方法。
29.如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物的用途，其用于制备用于治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的药物。
30.一种治疗哺乳动物受试者的葡萄糖调节紊乱的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的如权利要求1至26的任一项中所定义的纳米颗粒组合物。
31.一种降低哺乳动物受试者的血糖水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述血糖水平是基线、禁食或餐后的水平。
33.根据权利要求28所述的纳米颗粒组合物，根据权利要求29所述的用途，或根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
34.根据权利要求28所述的纳米颗粒组合物，根据权利要求29所述的用途，或根据权利要求30至32中任一项所述的方法，或根据权利要求33所述的组合物、用途或方法，其中所述受试者具有导致不适当的血糖水平控制的病症。
35.根据权利要求28所述的纳米颗粒组合物，根据权利要求29所述的用途，或根据权利要求30至32中任一项所述的方法，或根据权利要求33或权利要求34所述的组合物、用途或方法，其中所述受试者具有1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病或前驱糖尿病。
36.根据权利要求28所述的纳米颗粒组合物，根据权利要求29所述的用途，或根据权利要求30至32中任一项所述的方法，或根据权利要求33至35中任一项所述的组合物、用途或方法，其中将所述纳米颗粒组合物与或用于与一种或多种用于控制血糖的治疗剂同时、单独地或相继地施用。
37.根据权利要求36所述的组合物、用途或方法，其中所述一种或多种治疗剂选自由以下组成的组：胰岛素或其类似物、GLP-1或其类似物、胃抑肽(GIP)或其类似物、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂、磺酰脲、二甲双胍、α-葡苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类。
38.根据权利要求28所述的纳米颗粒组合物，根据权利要求29所述的用途，或根据权利要求30至32中任一项所述的方法，或根据权利要求33至37中任一项所述的组合物、用途或方法，其中所述纳米颗粒组合物通过选自由以下组成的组的途径施用或用于通过所述途径施用：静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、真皮内(i.d.)、腹膜内或皮下(s.c.)注射或输注；经颊；唇下；舌下；通过吸入；经由一种或多种粘膜；泌尿生殖器；直肠；和皮肤。
39.一种制品，其包括：
如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物；
容纳所述纳米颗粒组合物的容器；和
插页和/或标签。
40.根据权利要求39所述的制品，其中所述插页和/或标签提供与所述纳米颗粒组合物在治疗葡萄糖调节紊乱的方法中的用途相关的说明书、剂量和/或施用信息。
41.一种用于产生如权利要求1至26中任一项所定义的纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：
提供包含含有金属和/或半导体的核和包含多个共价地连接于所述核的配体的冠的纳米颗粒，其中所述配体包含谷胱甘肽；和
将所述纳米颗粒在允许至少一个胰淀素肽结合于所述纳米颗粒的冠的条件下与至少一个胰淀素肽接触。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括产生所述纳米颗粒的早期步骤，所述早期步骤包括：将包含谷胱甘肽的溶液与包含成核材料的溶液以及与还原剂组合，从而引起所述纳米颗粒自组装。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述成核材料包含金盐的溶液。
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