CN105073097A - 纳米粒子递送组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于将生物活性剂靶向至中枢神经系统的纳米粒子递送系统，所述系统包括组合物，所述组合物包含：(a)纳米粒子，其包含：(i)含有金属和/或半导体的核；和(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包括碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和(b)待递送至CNS的至少一种药剂。本发明还公开了利用所述纳米粒子递送系统治疗和诊断CNS病症的方法以及相关筛选方法。

Description

纳米粒子递送组合物
技术领域
本发明涉及可用于递送药剂至中枢神经系统(CNS)的物质和组合物，尤其是生物活性剂跨血脑屏障(BBB)的递送。本文所公开的物质、组合物和方法用于治疗性和/或预防性治疗CNS病症，用于成像、靶向、修复和研究生物活性剂与CNS细胞的相互作用。
发明背景
制药工业的主要挑战之一是药物递送至中枢神经系统(CNS)。由于通过微血管内皮细胞和星形胶质细胞形成的血脑屏障的保护功能，超过95％的潜在有用的药物被阻止进入CNS。该屏障的要素是阻止分子扩散进脑中的内皮细胞之间的连续紧密连接，以及主动地将外源性物质泵出脑外的ABC-转运蛋白(1,2)。因此，许多药物和较大的生物分子，包括对CNS疾病的治疗具有巨大潜力的细胞因子和基因，被内皮细胞屏障排除在外(3-6)。
已作出相当多的努力以找到一种克服血脑屏障的方法，包括使用纳米粒子作为载体(7)。生物学关注的从1nm至500nm范围内的纳米和微米粒子已由诸如聚合物、脂质和金属(包括金)的材料制成。金纳米粒子具有容易生产和化学稳定的优势，并且它们最近已用于供诊断和治疗用的纳米医学中(8)。金核是惰性的，但它确实会与生物材料相互作用并可具有生物效应。为解决这个问题，已研究了影响纳米粒子的特定行为的多种尺寸和表面改性(9-11)。向细胞中的转运是可根据尺寸和表面涂层而明显变化的性质(12)。小尺寸的金纳米粒子(>30nm)能够经由胞吞途径进入细胞(13,14)，尽管并未确切知道转运的机制。据认为金纳米粒子并不进入细胞核(15)，除非细胞凋亡。相比之下，它们通常在囊泡被捕获(16-19)，其通常对靶向药物/基因递送至细胞和组织造成问题。
因此，关注于CNS和血脑屏障，仍存在对CNS基于纳米粒子的分子递送尚未满足的需求，尤其是表现出一种或多种以下特征的递送：
1.对脑内皮细胞的选择性
2.完整穿过脑内皮细胞的能力
3.在CNS内被靶细胞摄取。
本发明解决这些和其它需要。
发明概述
广义地，本发明涉及用于将生物活性剂或成像剂靶向至中枢神经系统的纳米粒子递送系统。本发明人已发现如本文所定义的纳米粒子穿过内皮细胞并进入星形胶质细胞。此外，该纳米粒子表现出对人脑内皮细胞一定的选择性，例如对比非脑内皮细胞。生物活性剂可偶联到纳米粒子，例如通过经由连接基的共价结合；或可逆地结合到纳米粒子，例如通过稳定但可逆地结合到纳米粒子冠。然后将药剂作为“货物”通过纳米粒子跨血脑屏障递送至中枢神经系统的细胞，例如用于治疗性治疗中枢神经系统(CNS)的病症或用于使CNS成像。
因此，在第一方面，本发明提用于将至少一种药剂递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的方法中的纳米粒子组合物，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至CNS的至少一种药剂。
在一些情况下，根据本发明，该组合物用于治疗受试者的CNS病症的方法。
在根据本发明的一些情况下，该组合物用于使受试者的CNS成像的诊断或预后方法。所述方法可以是在受试者身体上实施的方法(体内)。
在第二方面，本发明提供递送至少一种药剂至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的方法，所述方法包括对受试者施用组合物，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至CNS的至少一种药剂。
在根据本发明该方面的一些情况下，该方法为治疗受试者的CNS病症的方法。
在根据本发明该方面的一些情况下，该方法为使受试者的CNS成像的诊断或预后方法。所述方法可以是在受试者身体上实施的方法(体内)。
在第三方面，本发明提供组合物在制备待递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的药物中的用途，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至CNS的至少一种药剂。
在根据本发明该方面的一些情况下，该药物用于治疗哺乳动物受试者的CNS病症。
在根据本发明该方面的一些情况下，该药物用于受试者的CNS的诊断或预后成像。受试者的CNS的所述诊断或预后成像可在受试者身体上实施(体内)。
在根据本发明第一、第二和/或第三方面的一些情况下，组合物经由非中枢途经施用或用于经由非中枢途经施用，由此将所述至少一种药剂通过与所述纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至CNS。尤其是，组合物可通过除大脑内、鞘内或硬膜外途径之外的途径施用或用于施用。适当的施用途经包括肠道(例如用于吞下的固体或液体组合物)；颊面；唇下；舌下；通过吸入；经由粘膜；泌尿生殖器；直肠；皮肤；和皮内、肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射或输注。
在根据本发明第一、第二和/或第三方面的一些情况下，受试者具有受损的或“泄露的”血脑屏障。尤其是，受试者可患有病状，诸如脑肿瘤或感染，其使得血脑屏障比在不存在该病状的情况下更具通透性。
在根据本发明第一、第二和/或第三方面的一些情况下，受试者具有基本上功能性的血脑屏障(即，未渗漏或受损的)。尤其是，受试者可不具有这样的病状：其使得血脑屏障比对于该受试者种族和年龄而言将被认为是正常的血脑屏障更具通透性。不希望受任何特定理论的约束，本发明人相信本文定义的纳米粒子能够穿过健康的血脑屏障并因而递送至少一种药剂至受试者的CNS。这将与药剂至患有下述病状的受试者的CNS的挑战性相对较低的递送形成鲜明对比，所述病状使得血脑屏障比在不存在该病状的情况下更具通透性。
在根据本发明第一、第二和/或第三方面的一些情况下，受试者为人。
如技术人员将领会的是，供递送至CNS的至少一种药剂可根据对受试者而言要实现的生物(例如治疗、预防、诊断或预后)效应进行选择。尤其是，受试者可具有CNS病状并且所述至少一种药剂可在治疗上有效对抗所述CNS病状。设想将多种药剂根据本发明使用。期望递送小分子药物、核酸(例如载体、RNAi)、肽(例如胰岛素、GLP-1、IGF1、IGF2、松弛素、INSL5、INSL6、INSL7、胰多肽(PP)、肽酪氨酸酪氨酸(PTT)、神经肽Y、催产素、加压素、GnRH、TRH、CRH、GHRH/生长激素抑制素、FSH、LH、TSH、CGA、催乳素、ClIP、ACTH、MSH、内啡肽、促脂素、GH、降钙素、PTH、抑制素、松弛素、hCG、HPL、胰高血糖素、胰岛素、生长激素抑制素、褪黑素、胸腺素、thmulin、胃泌素、胃生长素、促胸腺生成素、CCK、GIP分泌素、桑黄素(motin)VIP、肠高血糖素、IGF-1、IGF-2、瘦蛋白、脂联素、抵抗素骨钙素、肾素、EPO、骨化三醇、ANP、BNP、趋化因子、细胞因子和脂肪因子及其生物活性类似物)、蛋白质(包括细胞因子和抗体)至CNS(例如至星形胶质细胞)以对范围广泛的CNS病症的治疗性治疗的治疗选择提供相当大的灵活性。如本文结合本发明的任何方面所用，CNS病症可选自：肿瘤(包括脑肿瘤，诸如胶质瘤、星形细胞瘤、原发性脑肿瘤、由于原发性肿瘤从别处转移至CNS的继发性脑肿瘤)；神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)、多发性硬化、帕金森病(Parkinson’sdisease)和亨廷顿病(Huntingdon’sdisease))；中风(缺血性和出血性)；神经失调(包括癫痫)；感染(包括病毒、细菌或寄生虫性脑炎)；CNS免疫病症(包括自身免疫病症)；精神病症(包括精神分裂症、抑郁症和焦虑症)；遗传异常(包括代谢的先天性缺陷)；外伤性脑损伤；昏迷以及发育和学习障碍。
在第四方面，本发明提供用于鉴定能够通过与纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统的药剂的体外筛选方法，所述方法包括：
提供细胞培养内皮细胞，任选地与星形胶质细胞共培养；
将内皮细胞和具有与其缔合的至少一种候选药剂的纳米粒子接触；以及
鉴定候选药剂是否通过纳米粒子跨内皮细胞递送，
其中所述纳米粒子包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；和
(ii)含有共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽。
在第五方面，本发明提供用于鉴定能够通过与纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的药剂的体内筛选方法，所述方法包括：
对非人哺乳动物试验受试者经由非中枢施用途径施用组合物，该组合物包含具有与其缔合的至少一种候选药剂的纳米粒子；以及
鉴定候选药剂是否跨血脑屏障递送至所述试验受试者的CNS，
其中所述纳米粒子包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；和
(ii)含有共价连接至核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽。
在根据本发明任一方面的一些情况下，所述至少一种药剂偶联到纳米粒子，例如通过共价结合(无论直接还是经由连接基)至纳米粒子的核。在一些情况下，至少一种药剂可逆地(例如，非共价地)结合至纳米粒子的冠。
在根据本发明任一方面的一些情况下，至少一种药剂可并入纳米粒子的结构中。例如，若药剂包含放射性核素(例如，用于靶向脑肿瘤)，则该放射性核素可存在于纳米粒子的核内。
如本文所定义的纳米粒子，虽然小，但具有显著的表面积并且在许多情况下能够容易地携带含有大量药剂和/或不同药剂的混合物的货物。因此，在根据本发明的一些情况下，纳米粒子与两个或更多个(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多个)所述药剂的实体(例如，两个或更多个特定药物的分子，两个或更多个特定核酸或肽或蛋白的分子)缔合。在根据本发明的一些情况下，至少一种药剂含有两种或更多种(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)不同种类的药剂，它们连接到组合物中的不同纳米粒子或连接到共同的纳米粒子(多功能纳米粒子)。有利地，不同种类的药剂可表现出合作行为或它们生物效应的协同作用。具体的实例是用于治疗特定CNS病症的两种药物的组合，其中这两种药物合作地发挥作用。
在根据本发明的一些情况下，纳米粒子的配体可经由连接基共价连接至纳米粒子的核，所述连接基诸如为C2-C15烷基(例如C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15，无论是直链的还是支链的)和/或C2-C15二醇(诸如C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14或C15)，例如巯乙基或巯丙基。
在根据本发明的一些情况下，纳米粒子的配体经由含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团共价连接至核。
在根据本发明的一些情况下，配体包含为单糖或二糖的碳水化合物。尤其是，所述碳水化物部分可包括葡萄糖、α半乳糖、甘露糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖胺和/或N-乙酰葡糖胺。
在根据本发明的一些情况下，所述配体包括经由硫醇硫原子共价连接至核的2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
在根据本发明的一些情况下，所述配体包括单独的谷胱甘肽或与其它种类的配体结合的谷胱甘肽，例如，本文特别设想了谷胱甘肽和碳水化合物配体和/或胰岛素(包括含葡萄糖的配体)的组合。
在根据本发明的一些情况下，纳米粒子包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少20、至少30、至少40或至少50个含碳水化合物的配体、含胰岛素的配体和/或谷胱甘肽配体。
在根据本发明的一些情况下，纳米粒子的核的直径在1nm至5nm的范围内。
在根据本发明的一些情况下，包含其配体的纳米粒子的直径在3nm至20nm，任选地4nm至15nm或4nm至5nm的范围内。
在根据本发明的一些情况下，核包含选自Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn或其任意组合的金属。
在根据本发明的一些情况下，核为磁性的。
在根据本发明的一些情况下，核包含半导体。尤其是，半导体可在一些情况下选自硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
在根据本发明的一些情况下，核能够充当量子点。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，除非其中此类组合显然是不允许的或阐明要明确避免的。这些和另外的方面以及本发明的实施方案在下文进一步详细描述，并参考随附的实施例和附图。
附图简述
图1示出a)hCMEC/D3细胞和b)在将葡萄糖-纳米粒子施加至顶面后8小时的原代人脑内皮细胞的电子显微图。纳米粒子位于基质膜与基底膜之间(箭头)。比例尺＝500nm。
图2：示出5nm葡萄糖涂覆的金纳米粒子跨a)hCMEC/D3细胞，b)人骨髓内皮细胞系(BMEC)，和c)人脑内皮细胞或d)冠状动脉内皮细胞的原代培养物的胞吞转运率的图。数值示出在施加至顶面后位于基质膜与基底膜之间的每个细胞的纳米粒子数。数值示出得自至少50个不同的细胞和两个独立的培养物的平均值±SEM。需注意，y-轴的比例对于两种非-脑内皮细胞类型是放大的。e)示出来自四种不同细胞类型的80nm切片中每微米的纳米粒子数(平均值±SEM)的条形图。
图3示出a)在将葡萄糖-NP施加至顶面后3小时hCMEC/D3细胞的电子显微图。纳米粒子穿过基质膜并且也见于胞液和囊泡。在细胞间连接点仅检测到一个纳米粒子(黑色箭头)。纳米粒子也存在于支持膜的孔中(白色箭头)。b)施加后3小时在hCMEC/D3细胞、原代脑内皮细胞(BEC)和冠状动脉内皮细胞(CoAEC)中的纳米粒子定位。Cy＝细胞质，Ves＝囊泡，BM＝基底膜。
图4示出抗生素对葡萄糖-纳米粒子跨hCMEC/D3细胞的胞吞转运的影响的代表性实验。数据以位于基底膜的纳米粒子的数量与未处理细胞(对照)进行比较而表示。数值为>50个细胞的平均值±SEM。ANOVA表明在处理之间无显著差异。
图5示出在37℃或30℃孵育再施加之后的8小时在hCMEC/D3细胞中的纳米粒子定位。U.M.＝上层膜，Cyt.＝细胞质，Ves.＝囊泡，L.M.＝下层膜。数值为得自代表性实验中的至少50个TEM图像的平均值±SEM。
图6示出30nm胶体金(Au30)、4nm葡萄糖涂覆的纳米粒子(Glu)和4nm谷胱甘肽涂覆的纳米粒子(Gln)在施加至hCMEC/D3细胞后22小时的胞吞转运率的比较。数值表示位于基质膜下方或胞液中的纳米粒子的数量的平均值±SEM，基于至少50个TEM图像。将数据通过ANOVA(对基底膜而言P<0.01)然后通过双尾t检验进行分析。*P<0.05，***P<0.001。
图7示出a)在施加纳米粒子至凝胶表面后8小时在3D胶原凝胶中原代人星形胶质细胞的TEM。在凝胶基质和星形胶质细胞中均可见纳米粒子(箭头)。b)在施加葡萄糖涂覆的纳米粒子至内皮细胞表面后8小时星形胶质细胞/内皮细胞共培养物的TEM。在内皮细胞和星形胶质细胞中均检测到纳米粒子(箭头)。因存在纳米粒子，在切片过程中有时在凝胶基质中产生小的撕裂(白色箭头)。
图8示出作为对照(命名为C2-葡萄糖-1)的百分比而为每种纳米粒子配体种类绘制的在8小时时在基底膜下方检测到的纳米粒子数量；
图9示出半乳糖胺-NP的TEM，其中可见到许多纳米粒子结合到过滤器；
图10示出通过光谱顶部(浅阴影)和底部(深阴影)分析的跨内皮细胞转移的葡萄糖-C2纳米粒子(单位μg)；
图11示出在施加纳米粒子后8小时在基底膜处测量的对照(未经酶预处理)和酶预处理(采用肝素酶、软骨素酶或神经氨酸苷酶)的每微米纳米粒子测得的纳米粒子转移；
图12示出TEM，其描绘被hCMEC/D3细胞摄取的胰岛素涂覆的纳米粒子(8个胰岛素和锌)。施加2ng/cm2的纳米粒子3小时；
图13示出囊泡、胞液和连接点针对时间而绘制的胰岛素涂覆的纳米粒子跨hCMEC/D3细胞的转移；
图14示出胰岛素涂覆的纳米粒子在A)计时起点和B)30分钟时的TEM，其中深染色指示纳米粒子；
图15示出A)在1、3和8小时时呈纳米粒子阳性的星形胶质细胞的百分比；以及B)在1、3和8小时时纳米粒子与内皮细胞的平均距离，单位为微米(最大距离以插入的数字示出)；
图16示出多种纳米粒子冠组合物(C2-葡萄糖、胰岛素或半乳糖胺涂层)在A)2D星形胶质细胞培养物和B)3D共培养星形胶质细胞中的金纳米粒子摄取。示出了胞液、囊泡和细胞核中的摄取，分别以每微米插入物和每个细胞的纳米粒子数进行测量；
图17示出对于内皮细胞和星形胶质细胞而言纳米粒子在过滤器上的定位(边缘或中间)。示出了在边缘和中间的内皮细胞和星形胶质细胞中纳米粒子的数量；
图18示出在星形胶质细胞/D3共培养中研究纳米粒子的结果。A)在1、3和8小时时呈纳米粒子阳性的星形胶质细胞的百分比。B)在1、3和8小时时发现的纳米粒子与内皮细胞的距离，单位为微米。C)在1、3和8小时时每个细胞的纳米粒子数。在1、3和8小时时在透射电子显微镜法(TEM)中观察到的细胞数在插图中示出；
图19示出研究葡萄糖-NP的摄取的时间进程的结果。A)随时间推移在上层膜中每个细胞的粒子。B)随时间推移在胞内区中每个细胞的粒子。C)随时间推移在下层膜中每个细胞的粒子。D)随时间推移在囊泡中每个细胞的粒子；
图20示出A)针对培养天数而绘制的每毫米的细胞数；B)针对培养天数而绘制的在下层膜、胞液和囊泡中每微米的纳米粒子数。
发明详述
在描述本发明时，将采用下述术语，并且这些术语旨在如下所示进行定义。
如本文所用，“纳米粒子”是指具有纳米尺度的粒子，并且不旨在传达任何特别的形状限制。尤其是，“纳米粒子”包括纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在某些实施方案中，本文设想的纳米粒子和/或纳米粒子核具有通常为多面体或球体的几何形状。
包含多个含碳水化合物的配体的纳米粒子已在例如WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704(其各自的全部内容明确地通过引用并入本文)中进行了描述，并且此类纳米粒子可以根据本发明使用。此外，包含通过有机化合物官能化(例如经由硫醇-金键)的氧化铁铁氧体(具有式XFe2O4，其中X＝Fe、Mn或Co)的磁核的金涂覆的纳米粒子在EP2305310(其全部内容明确地通过引用并入本文)中有所描述，并且特别考虑用作根据本发明的纳米粒子/纳米粒子核。
如本文所用，“冠”是指层或涂层，其可以部分地或完全地覆盖纳米粒子核的暴露表面。冠包括多个配体，该配体通常包括至少一个碳水化合物部分、一个表面活性剂部分和/或一个谷胱甘肽部分。因此，冠可以视为围绕或部分围绕金属核的有机层。在某些实施方案中，冠提供和/或参与纳米粒子核的钝化。因此，在某些情况下，冠可以包括基本上稳定半导体或含金属的核的足够完整的涂覆层。然而，本文特别设想具有核(例如，包括由贵金属涂覆的含金属氧化物的内核)的某些纳米粒子可以包括仅部分涂覆核表面的冠。在某些情况下，冠促进本发明的纳米粒子的溶解性，诸如水溶性。
纳米粒子
纳米粒子为小粒子，例如金属或半导体原子的簇，其可用作固定配体的基底。
优选地，纳米粒子具有平均直径在0.5与50nm之间，更优选地在0.5与10nm之间，更优选地在0.5与5nm之间，更优选地在0.5与3nm之间，还要更优选地在0.5与2.5nm之间的核。当除了核以外还考虑配体时，优选地，粒子的总平均直径在2.0与20nm之间，更优选地在3与10nm之间，并且最优选地在4与5nm之间。可使用本领域熟知的技术诸如透射电子显微镜法来测量平均直径。
核材料可以为金属或半导体并且可由多于一种类型的原子形成。优选地，核材料为选自Au、Fe或Cu的金属。纳米粒子核也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并可用于本发明。优选的核材料为Au和Fe，最优选的材料为Au。纳米粒子的核优选地包含约100与500个之间的原子(例如金原子)以提供纳米范围内的核直径。其它特别有用的核材料掺杂有一种或多种具有NMR活性的原子，从而使得可以使用NMR在体外和体内检测纳米粒子。NMR活性原子的实例包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3，或在本申请别处描述的量子点。
包含可作为纳米尺度半导体晶体而检测的半导体化合物的纳米粒子核能够充当量子点，即它们可吸收光线从而将材料中的电子激发至更高的能级，随后在该材料特有的频率下释放光的光子。半导体核材料的实例为硒化镉、硫化镉、碲化镉。也包括锌化合物，诸如硫化锌。
在一些实施方案中，纳米粒子的核可以为磁性的并包含磁性金属原子，任选地与惰性金属原子相结合。举例来说，惰性金属可以为金、铂、银或铜，并且磁性金属可以为铁或钆。在优选的实施方案中，惰性金属为金并且磁性金属为铁。在此情况下，适宜地，核中惰性金属原子与磁性金属原子的比率在约5:0.1与约2:5之间。更优选地，该比率在约5:0.1与约5:1之间。如本文所用，术语“惰性金属”是指不显示出磁性并且在化学上对氧化稳定的金属。惰性金属可以为反磁性的或超顺磁性的。优选地，此类纳米粒子为超顺磁性的。
具有包含顺磁性金属的核的纳米粒子的实例包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2,Cu+2、V+2,Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3的那些。
其它磁性纳米粒子可由能形成纳米粒子(磁性流体，添加或不添加如上所定义的另外的核材料)的材料诸如MnFe(尖晶石铁氧体)或CoFe(钴铁氧体)形成。用于生产此类纳米粒子的自我装配附接化学的实例在Biotechnol.Prog.,19:1095-100(2003),J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003),J.ColloidInterfaceSci.255:293-8(2002)中给出。
在一些实施方案中，纳米粒子或其配体包含可检测的标记。标记可以为纳米粒子的核或配体的元素。由于纳米粒子的该元素的固有性质或通过与可检测的另外部分连接、缀合或联合，该标记可被检测。标记的优选实例包括为荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素、若丹明或四甲基若丹明、德克萨斯红(Texas-Red)、Cy3、Cy5等并且可以通过激发荧光标记并用拉曼散射光谱(Ramanscatteringspectroscopy)检测发出的光而检测(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science2002,297:1536-1539)。
在一些实施方案中，纳米粒子可包含用于使用放射性核素发出的放射性来检测纳米粒子(例如，通过使用PET、SPECT)或用于治疗(即，用于杀死靶细胞)的放射性核素。能够容易地加以修改而用于本发明的本领域常用的放射性核素的实例包括99mTc，其以多种氧化态存在，但最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；67Cu，其通常作为Cu2+盐使用；67Ga，其通常作为Ga3+盐使用，例如柠檬酸镓；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；111In，其通常作为In3+盐使用；125I或131I，其通常作为碘化钠使用；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；201Tl，其通常作为Tl+盐使用，诸如氯化铊；39Y3+；71Lu3+和24Cr2+。作为标记和示踪剂的放射性核素的一般使用是本领域已知的并且可由本领域的技术人员容易地修改而用于本发明的多个方面。放射性核素可通过以下方式容易地使用：掺杂纳米粒子的核，或包括它们作为固定在纳米粒子上的配体的一部分而存在的标记。
除此之外或作为另外一种选择，可使用本领域已知的多种技术使用如上所述的与纳米粒子缔合的标记或通过利用它们的性质来检测本发明的纳米粒子，或它们与其它种类相互作用的结果。这些检测纳米粒子的方法的范围可从检测当纳米粒子结合到另一种类时产生的聚集体，例如，通过简单目测或通过使用光散射(含有纳米粒子的溶液的透射)，到使用复杂的技术诸如透射电子显微镜法(TEM)或原子力显微镜法(AFM)以使纳米粒子可见。另外的检测金属粒子的方法是采用等离子共振，其为通常由光辐射造成的金属表面的电子激发。表面等离子共振(SPR)现象存在于金属(诸如Ag和Au)与诸如空气或水的介电材料的界面处。当分析物结合到固定在纳米粒子表面上的配体而发生SPR的变化时，将改变界面的折射率。SPR的另外优点在于其可用于监测实时相互作用。如上文所提到的，如果纳米粒子包括或掺杂有NMR活性原子，则可利用该技术使用本领域熟知的技术在体外或体内检测粒子。也可使用基于以下方面的系统来检测纳米粒子：利用纳米粒子促进的银(I)还原的定量信号放大。当纳米粒子包括作为荧光探针的配体时，可使用荧光光谱。另外，可使用碳水化合物的同位素标记以有助于它们的检测。
递送至CNS的药剂
设计了多种药剂以供使用本发明的产品和方法递送至CNS。特别考虑的是以下两种：(i)已知将进入CNS的药剂，其可受益于由本发明的纳米粒子所提供的对BBB提高的渗透性(例如，使得可以施用更低的剂量而保持治疗或成像活性)；和(ii)迄今为止尚不清楚可以有效的程度进入CNS的药剂，其可提供用于靶向脑的新的类别的治疗剂和成像剂(例如，扩大可用的治疗模式和诊断可能性)。
本文提及“英国国家处方集(BritishNationalFormulary)”是指2012年11月可用的版本(参见www.bnf.org)。
根据本发明使用的药剂的具体实例包括：
如在英国国家处方集小节4.1(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的催眠药&镇静剂，包括但不限于：氯普唑仑(loprazolam)、氯甲西泮(lormetazepam)、替马西泮(temazepam)；扎来普隆(zaleplon)、唑吡坦(zolpidem)、唑吡酮(zopiclone)；氯美噻唑(clomethiazole)；异丙嗪(promethazine)；褪黑素(melatonin)；丁螺环酮(buspirone)；
如在英国国家处方集小节4.2(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的抗精神病药，包括但不限于：盐酸氯丙嗪(chlorpromazinehydrochloride)、氟哌啶醇(haloperidol)、奋乃静(perphenazine)、马来酸丙氯拉嗪(prochlorperazinemaleate)或甲磺酸丙氯拉嗪、盐酸普马嗪(promazinehydrochloride)、三氟吡啦嗪(trifluoperazine)；氯氮平(clozapine)、奥氮平(Olanzapine)、喹硫平(quetiapine)、利培酮(risperidone)。
如在英国国家处方集小节4.2(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的抗躁狂药，包括但不限于：卡马西平(carbamazepine)和丙戊酸钠(sodiumvalproate)。
如在英国国家处方集小节4.3(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的抗抑郁药，包括但不限于：盐酸阿米替林(amitriptylinehydrochloride)、盐酸氯丙咪嗪(clomipraminehydrochloride)、盐酸丙咪嗪(imipraminehydrochloride)；盐酸米安色林(mianserinhydrochloride)；苯乙肼(phenelzine)、吗氯贝胺(moclobemide)；西酞普兰(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、舍曲林(sertraline)；阿戈美拉汀(agomelatine)、氟哌噻吨(flupentixol)、色氨酸(tryptophan)、文拉法辛(venlafaxine)。
如在英国国家处方集小节4.4(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的治疗注意力缺陷多动障碍(ADHD)的药物，包括但不限于：阿托西汀(atomoxetine)、盐酸哌醋甲酯(methylphenidatehydrochloride)、莫达非尼(modafinil)。
如在英国国家处方集小节4.6(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗恶心和眩晕的药物，包括但不限于：盐酸赛克利嗪(cyclizinehydrochloride)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氟哌利多(droperidol)、马来酸普鲁氯嗪(prochlorperazinemaleate)、盐酸胃复安(metoclopramidehydrochloride)、昂丹司琼(ondansetron)、帕洛诺司琼(palonosetron)、福沙吡坦(fosaprepitant)、大麻隆(nabilone)、二盐酸倍他司汀(betahistinedihydrochloride)。
如在英国国家处方集小节4.7(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于止痛的药物，包括但不限于：盐酸奈福泮(nefopamhydrochloride)；丁丙诺啡(buprenorphine)；盐酸海洛因(diamorphinehydrochloride)、芬太尼(fentanyl)、美普他酚(meptazinol)、盐酸曲马多(tramadolhydrochloride)、辣椒素(capsaicin)；托芬那酸(tolfenamicacid)、佐米曲坦(zolmitriptan)、苯噻啶(pizotifen)、可乐定(clonidine)。
如在英国国家处方集小节4.8(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗癫痫的药物。
如在英国国家处方集小节4.9(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗帕金森症(Parkinsonism)的药物。
如在英国国家处方集小节4.10(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗物质依赖的药物。
如在英国国家处方集小节4.11(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗痴呆的药物。
如在英国国家处方集小节8(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗星形细胞瘤的恶性胶质瘤的药物，包括但不限于依维莫司(everolimus)、替莫唑胺(temozolomide)、卡莫司汀(carmustine)。
如在英国国家处方集小节8.2.4(其全部内容明确地通过引用并入本文)中提及的用于治疗神经病症的药物，包括但不限于醋酸格拉替雷(Glatirameracetate)、芬戈莫德(fingolimod)。
此外，根据本发明递送至CNS的药剂的类别包括：细胞因子和核酸，诸如用于基因疗法的载体。
施用和治疗
可将本发明的纳米粒子和组合物通过多种不同的途径(包括肠内或肠胃外途径)施用给患者。肠胃外施用包括通过以下途径施用：静脉内、皮肤或皮下、鼻腔、肌内、眼内、经上皮、腹膜内和局部(包括皮肤、眼、直肠、鼻腔、吸入和气溶胶)以及直肠全身途径。
可例如通过注射或使用递送枪以射弹方式加快它们透皮通过上皮外层而进行施用。也可在气溶胶中递送纳米粒子。这通过小尺寸的纳米粒子而成为可能。
本发明的异常小尺寸的纳米粒子有很大的优势递送至细胞和组织，因为它们可被细胞摄取，甚至当连接至靶向或治疗分子时。因此，纳米粒子可穿透脑内皮细胞并被诸如星形胶质细胞的细胞内化，释放它们附接或缔合的药剂“货物”，例如用于与CNS靶标相互作用，诸如胶质细胞或神经元受体、基因表达靶标。
本发明的纳米粒子可被配制成可以呈固体或液体组合物形式的药物组合物。此类组合物通常将包含某种载体，例如固体载体或液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可包括生理盐水溶液或二醇类，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此类组合物和制剂通常含有至少0.1wt％的化合物。
在一些情况下，药物组合物可包含促渗透剂。促渗透剂可在一些情况下选自烷基-D-麦芽糖苷和凝胶蛋白酸。烷基-D-麦芽糖苷可选自：己基-β-D-麦芽糖苷、辛基-β-D-麦芽糖苷、壬基-β-D-麦芽糖苷、癸基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、十三烷基-β-D-麦芽糖苷、十四烷基-β-D-麦芽糖苷和十六烷基-β-D-麦芽糖苷。在一些情况下，烷基-D-麦芽糖苷可包含十二烷基-β-D-麦芽糖苷或十四烷基-β-D-麦芽糖苷或由它们组成。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病灶部位的注射，活性成分将呈肠胃外可接受的无热源且具有合适pH、等渗性和稳定性的水溶液的形式。本领域的相关技术人员完全能够使用例如化合物或其衍生物例如在生理盐水中的溶液，用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散体来制备合适的溶液。
除了任选地与其它活性成分结合的一种或多种化合物外，组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、等渗剂(isotonicisingagent)、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它材料。此类材料应为无毒的并且不应干扰活性成分的功效。载体或其它材料的确切性质可取决于施用途径，例如经静脉内、经口或经肠胃外。
液体药物组合物通常配制成具有约3.0与9.0之间，更优选地约4.5与8.5之间并且还要更优选地约5.0与8.0之间的pH。组合物的pH可通过使用诸如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸的缓冲剂来维持，通常以约1mM至50mM的范围使用。组合物的pH另外可通过使用生理上可接受的酸或碱调节。
防腐剂通常包含在药物组合物中以延迟微生物生长、延长组合物的保存期限以及允许多用途包装。防腐剂的实例包括苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸及其酯、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。防腐剂通常以约0.1至1.0％(w/v)的范围使用。
优选地，以预防有效量或治疗有效量(根据具体情况，预防也可被认为是治疗)给予个体药物组合物，该量足以显示出对个体的益处。通常，这将产生治疗上有用的活性，从而向个体提供益处。施用的化合物的实际量以及施用的速率和时间进程将取决于所治疗的病状的性质和严重程度。治疗处方(例如剂量决定等)在全科医生和其它医生的责任范围内并通常考虑到待治疗的病症、个体患者的病状、递送部位、施用方法和执业医师已知的其它因素。上文提到的技术和方案的实例可见于HandbookofPharmaceuticalAdditives,第2版(M.Ash和I.Ash编)，2001(SynapseInformationResources,Inc.,Endicott,NewYork,USA)；Remington’sPharmaceuticalSciences,第20版,2000年出版.Lippincott,Williams&Wilkins；和HandbookofPharmaceuticalExcipients,第2版,1994。举例来说，并且将组合物优选地以每kg体重约0.01与100mg之间的活性化合物的剂量，并且更优选地以每kg体重约0.5与10mg之间的剂量施用给患者。
将理解的是，在关注肿瘤治疗的情况下，治疗包括医师采取的减轻肿瘤对患者的影响的任何措施。因此，尽管肿瘤的完全缓解是期望的目标，但有效的治疗也将包括任何能够实现肿瘤的局部缓解和减缓肿瘤(包括转移)的生长率的措施。此类措施可有效延长寿命和/或提高生活质量以及减轻疾病症状。
如本领域技术人员将领会的是，通过经由如本文所定义的纳米粒子递送合适的药剂至CNS而治疗的病状是多种多样的。此类病状包括但不限于中枢神经系统病症，其选自：肿瘤(包括脑肿瘤，诸如胶质瘤、星形细胞瘤、原发性脑肿瘤、由于原发性肿瘤从别处转移至CNS的继发性脑肿瘤)；神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病、多发性硬化、帕金森病和亨廷顿病)；中风(缺血性和出血性)；神经失调(包括癫痫)；感染(包括病毒、细菌或寄生虫性脑炎)；CNS免疫病症(包括自身免疫病症)；精神病症(包括精神分裂症、抑郁症和焦虑症)；遗传异常(包括代谢的先天性缺陷)；外伤性脑损伤；昏迷以及发育和学习障碍。
下文通过举例的方式来展示，并且不应被解释为是对权利要求范围的限制。
实施例
实施例1–纳米粒子的合成
基本上如前人所述(22)，合成具有葡萄糖配体或谷胱甘肽配体的冠的金纳米粒子，该文献的全部内容明确地通过引用并入本文。
简而言之，使用下列一般方法制备具有约1.6nm直径的金金属核的纳米粒子，注意配体冠将流体力学直径增至约5nm。
在9:1甲醇:水中溶解氧化的配体，谷胱甘肽(Fluka49741)或β-2-巯基乙氧基-葡萄糖(自制合成)，然后添加氯化金III(Sigma-Aldrich,Poole,UK)。使用相对于金四倍摩尔过量的有机配体。然后在平板振动器上将溶液轻轻混合5分钟。在剧烈涡旋下在快速添加相对于金20倍摩尔过量的新制的1M硼氢化钠(Sigma-Aldrich,Poole,UK)后通过还原制得纳米粒子。将样品涡旋总共30秒，然后在平板振动器上再轻轻混合1小时。由于纳米粒子在甲醇/水溶剂中不溶，因此通过台式离心、移除上清液并将纳米粒子小球分散在水中而进行初步纯化。通过在10kDavivaspin离心设备(GEHealthcare)中进行4次水洗而实现进一步的纯化。通过简单的比色测定法确定所有纳米粒子制剂的金浓度。简而言之，将10μl纳米粒子样品或12mg/ml金标准品(Fluka(Sigma-Aldrich,Poole,UK))和空白在ELISA板中用30μl50:50水:王水消化1分钟，之后添加150μl的2MNaBr，然后立即测量405nm吸光度，该测定法在0-10μg范围内具有优异的线性。
实施例2–跨内皮细胞血脑屏障模型将纳米粒子递送至星形胶质细胞
本发明人考虑可如何实现对CNS的选择性。由于脑内皮细胞具有大量允许营养物流入脑中的特定受体和转运蛋白，因此已尝试利用它们的配体来开发CNS特异性纳米粒子(20)。例如，涂覆有ApoE(靶向LDL受体)或OX26抗体(靶向转铁蛋白受体)的纳米粒子均已用于CNS药物递送(16,17)。另一种潜在的靶标是葡萄糖受体(Glut-1)，其在脑内皮细胞上选择性表达并且也存在于星形胶质细胞上(21)。
在本研究中，我们关注于能够穿过脑内皮细胞并进入下面的星形胶质细胞的纳米粒子。我们已使用体外模型来检查葡萄糖涂覆的金纳米粒子实现这一点的潜力。该纳米粒子具有2nm金核和5nm表面涂层(22)，该尺寸比相关研究中所用的小很多(16)。选择这些纳米粒子以增强对脑内皮细胞和星形胶质细胞的靶向并最大程度减少内涵体摄取。
为了研究金纳米粒子在体外细胞中的分布，我们已使用TEM给出关于纳米粒子在不同亚细胞区室中的定位的定量信息。我们的研究对比了脑内皮细胞与来自其它组织(骨髓和冠状动脉)的内皮细胞，以确立葡萄糖涂覆的纳米粒子是否是CNS选择性的。
我们还使用新近开发的血脑屏障模型研究了跨脑内皮细胞并进入星形胶质细胞的转运率，其中将人星形胶质细胞在3维(3D)胶原凝胶中在单层人脑内皮细胞下方培养。该模型基于在我们的实验室中开发的3D大鼠胶质细胞培养系统(23,24)，其已使用原代人星形胶质细胞和脑内皮细胞系hCMEC/D3进行了修改(25)。本研究使用的所有细胞均为人源的。
材料和方法
内皮细胞培养物
在获得患者知情同意的情况下，从治疗癫痫而接受的手术切除中获得原代人脑微血管内皮细胞。如前人所述(26)通过胶原酶/分散酶消化以及在BSA和percoll梯度上分离，在颞叶尖端从小面积的未受影响的组织分离细胞。在胶原涂覆的烧瓶或组织培养插入物(Costar)上，在补充了根据制造商配方(Lonza)的2.5％胎牛血清、皮质醇、VEGF、皮肤生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、人成纤维细胞生长因子(FGF)、抗坏血酸和硫酸庆大霉素，以及青霉素/链霉素(Invitrogen)的EBM-2MV培养基(Lonza)中培养(1代)细胞。
在EBM-2培养基中培养第24-30代人大脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3(25)和原代人冠状动脉内皮细胞(hCAEC，Lonza；目录号CC-2585)。在补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM(Sigma)中培养人骨髓内皮细胞系BMEC(27)。除非另外指明，否则所有内皮细胞均在37℃在含有5％CO2的潮湿大气中培养。
3D胶原凝胶星形胶质细胞培养物和星形胶质细胞/内皮细胞共培养物
在预热的24孔板中，以每孔450μl胶原混合物建立三维(3D)胶原凝胶。混合物含有40％的I型大鼠尾胶原(5mg/ml，溶于0.6％醋酸，FirstLink)、40％的水、10％的10倍浓缩的MEM和10％的人星形胶质细胞悬液(1.2×106/ml2-4代)。在紧接着添加细胞悬液之前，将凝胶用氢氧化钠中和。凝胶化约10分钟，然后在凝胶上方添加星形胶质细胞培养基(Sciencell)。在施加纳米粒子之前，培养凝胶3天。在一些情况下，在使用前，使用吸收剂(TAPBiosystems)压缩星形胶质细胞-凝胶至它们原体积的约10％。
对于星形胶质细胞/内皮细胞共培养物，在孵育2小时后压缩含有星形胶质细胞的凝胶15分钟，然后在星形胶质细胞培养基中培养24小时，再用hCMEC/D3细胞以50000个细胞/cm2的细胞密度覆盖。
将这些共培养物在EBM-2中孵育3天，然后将纳米粒子施加到新鲜培养基中的顶面保持1、3或8小时。
在用纳米粒子孵育后，将凝胶在PBS中洗涤3次并在2.5％的戊二醛磷酸盐缓冲液中固定至少1小时。将它们进一步处理以用于TEM，如下文针对插入物所述。
金纳米粒子迁移测定
如前人所述(22)，由MidatechLtd合成金纳米粒子(2nm核)。在本研究中，我们使用了用葡萄糖或谷胱甘肽涂覆的纳米粒子。该葡萄糖涂覆的纳米粒子具有约4nm的直径和约27kDa的平均分子质量。
对于胞吞转运测定，将12孔胶原涂覆的插入物(CorningCostar)以40000个细胞/孔接种并孵育2或3天以达到汇合。然后洗涤(HBSS)细胞，并将金纳米粒子(2ng)添加到上室中的新鲜培养基(0.5ml)中。然后将细胞在37℃孵育0-22小时。在冷的PBS中将细胞洗涤三次以去除顶面上任何松散粘附的纳米粒子，然后在2.5％的戊二醛磷酸盐缓冲液中固定至少1小时。
透射电子显微镜法(TEM)
使用银增强(45min,Aurion,UK)以有助于使纳米粒子可见。在磷酸盐缓冲液中以1％(w/v)四氧化锇进行后固定(post-fixation)1小时，然后在磷酸盐缓冲液中将过滤器洗涤10分钟。从插入物中取出过滤器并随机切成3-5mm×2mm的两段。将这些段在30-100％的乙醇中逐渐脱水并最终嵌入Epon。用Diatome金刚石刀完成超薄切片从而产生70-80nm厚的切片，然后将它们装到涂覆有聚乙烯醇缩醛(Pioloform)的铜网格上。将网格用乙酸双氧铀复染35分钟，洗涤三次，浸入柠檬酸铅中7分钟并洗涤三次。在以80kV的加速电压操作的透射电子显微镜JEM-1400上使用5000倍放大倍数观察网格。
TEM数据的采样和统计分析
为选择代表性数据，使用系统采样法。从每个切片以规定的间隔(即，每第四个显微视野)获取25张图片。如果在第四个视野中没有细胞或如果该视野含有凋亡细胞，则继续该阶段直至发现活的细胞。在此之后，通过对分成六类(上层膜、下层膜、囊泡、胞质内、细胞核、连接点)的观察到的纳米粒子计数而分别分析每张图片。在囊泡类别中，我们包括在膜相关区室中发现的除线粒体外的所有纳米粒子。使用Image-J1.43版软件测量每张图片中可见的膜长度(上层膜或下层膜)。数据点基于得自各实验处理或时间点(2个技术重复，每个重复25个图像)的至少50个细胞的测量。每个实验进行2-4次，并且附图示出了得自代表性实验的数据。数据以每微米质膜的纳米粒子数或每个细胞的纳米粒子数表示，视情况而定。应当注意，曲线图上的数字是指80nm厚的细胞切片，并且每个细胞的纳米粒子总数的估计值通过基于单层的面积和细胞数量进行的计算而得出。
为评估3D凝胶中的星形胶质细胞，获取每个切片中的所有星形胶质细胞的图片；使用Image-J测量每个细胞和细胞核的面积，并如上对纳米粒子计数且分配至各类。
对于3D凝胶中与hCMEC/D3细胞共培养的星形胶质细胞，在凝胶的每个评估切片中，以50个含有纳米粒子的细胞的最小样本量(>240个细胞)，对所有星形胶质细胞计数。还测量了每个星形胶质细胞与内皮细胞基底膜的距离。
结果
为确定葡萄糖涂覆的纳米粒子是否能够穿过人脑内皮细胞，将纳米粒子施加到内皮细胞单层的顶面。在培养0-22小时后通过银增强的TEM检测细胞。用原代人脑内皮细胞(1代)或脑内皮细胞系hCMEC/D3进行了最初的实验。结果显示在3-8小时，大量的纳米粒子位于基质膜与支持膜上的胶原蛋白基质之间(图1)。此时，纳米粒子也存在于胞液中，但在囊泡或细胞核中或在细胞间连接点中的粒子极少。纳米粒子存在于胞液中而不存在于细胞间连接点表明它们通过胞吞转运作用直接穿过细胞，而未通过细胞旁路运动到达基底膜。
为确定从不同组织到内皮细胞中的转运率，我们将两种脑内皮细胞与原代冠状动脉内皮细胞和骨髓内皮细胞系BMEC(以与hCMEC/D3细胞相似的方式永生化)进行了对比。通过对位于基质膜下方的纳米粒子数量计数确定了纳米粒子穿过内皮细胞的比率。在8小时内脑内皮细胞系和原代脑内皮细胞的胞吞转运作用近似线性(图2a)。此外，跨两种脑内皮细胞系的转移比跨两种非脑细胞系的转移快得多(图2e)。
作为另外的对照，我们使用了非内皮细胞类型，人成纤维细胞，其中使用与如上相同的实验设置在5小时内测量纳米粒子的移动率。向成纤维细胞下层膜的转移率<跨原代脑内皮细胞的转移率的3％。
为估计施加的纳米粒子穿过内皮细胞的百分比，我们对跨hCMEC/D3细胞的两个过滤器的条带中的所有细胞相关纳米粒子进行了计数(>18,000个NP)，并计算出在过滤器的整个面积中将能检测到7×109个纳米粒子。我们估计4.4×1010个纳米粒子被施加到每个过滤器(2ng)，因此这占施加的纳米粒子的约16％。应当注意到，这为最小数字，因为并未考虑到系统中的损失或无法通过TEM检测的一些纳米粒子。在这些过滤器上的hCMEC/D3细胞的汇合单层通常包含约105个细胞，因此摄取量为每个细胞>7×104个纳米粒子。
在其它在体内或在体外脑内皮细胞上使用纳米粒子的研究中，粒子主要定位于囊泡(16-18)。然而，这些研究通常使用大得多的纳米粒子。因此我们对亚细胞定位进行了更仔细的分析，以弄清纳米粒子穿过内皮细胞的机制。我们对见于胞液、囊泡(即，核内体和除线粒体之外的任何其它膜相关结构)、细胞核中的粒子以及与顶端质膜和基质膜相关的粒子的数量进行了定量。值得注意的是，纳米粒子仅偶尔见于细胞间连接点(图3a)或细胞核中。在3-8小时时在所有内皮细胞上，大部分胞内纳米粒子见于胞液中，较小的比例见于囊泡中(图3b)。在22小时时，在hCMEC/D3细胞的囊泡中我们确实观察到了纳米粒子(数据未示出)，但此时，粒子呈团块状并且在基底膜上较少。因此，在早期(3-8小时)，纳米粒子似乎通过非囊泡胞吞转运穿过内皮细胞，但在最后的时间点(22小时)它们已变为聚集然后定位于核内体中。
为进一步研究纳米粒子如何跨细胞移动，在以下干扰内吞和/或囊泡转运的抗生素存在下使用hCMEC/D3细胞进行了3小时的实验：松胞素-B(葡萄糖转运)氯丙嗪(网格蛋白有被囊泡)、诺考达唑(nocodazole)(微管)、松胞素-D(微丝)和制霉菌素(凹陷和脂质筏)。在理论上，如果纳米粒子通过特定的细胞系统转运，则抗生素处理应当阻断胞吞转运。(初步实验证实了所用的抗生素剂量在长达5小时也对细胞无毒性)。结果表明在3小时时无任何处理降低了纳米粒子胞吞转运率(图4)。因此纳米粒子跨质膜的转运的一种可能机制是通过被动扩散。如果这是正确的，则其将与这些纳米粒子经由胞液而非经由囊泡穿过的观察结果相一致。
由于顶端质膜和基质膜限制亲水性分子的自由扩散，所以我们推断改变膜流动性可能影响胞吞转运率。为确定膜流动性是否会影响胞吞转运率，我们在37℃和30℃下对比细胞，该温度能降低流动性(图5)。在30℃下胞吞转运率<在37℃的胞吞转运率的20％。然而该结果为参考性而非结论性的，因为降低的温度也会影响其它相关的代谢过程。但有趣的是，在较低的温度下在亚细胞区室之间纳米粒子的胞内分布并未改变，这表明是一个被动过程。另外值得注意的是，降低温度导致胞吞转运非常显著的降低(下层膜)，这可能是由于纳米粒子必须穿过两层质膜。
使用葡萄糖涂覆的纳米粒子的基本原理在于它们可由Glut-1转运蛋白携带。然而，无法阻断摄取松胞素-B(图4)表明未发生经由该受体的主动转运。为研究涂层的作用，我们对比了葡萄糖涂覆的和谷胱甘肽涂覆的4nm纳米粒子穿过hCMEC/D3细胞的胞吞转移率(图6)。作为针对尺寸依赖性的另外的对照，还测试了30nm胶体金纳米粒子。葡萄糖涂覆的粒子比谷胱甘肽涂覆的纳米粒子的胞吞转运更有效，并且两种4nm纳米粒子均比30nm胶体金纳米粒子更有效。该结果表明纳米粒子的特性(包括其尺寸、配体和电荷)均对转移有效性有贡献。
该项目的最终目的是确定纳米粒子是否能充当载体穿过血脑屏障和靶向胶质细胞。在最初的实验中，我们注意到纳米粒子在内皮细胞的基质膜与插入物的膜之间积聚。此外，也发现纳米粒子穿过过滤器中的孔(220nm)移动(参见图3a)，这表明它们可通过内皮细胞释放并可能进入间隙空间。
为评估纳米粒子靶向胶质细胞的潜力，我们使用新颖共培养系统，其中将人星形胶质细胞在3D胶原凝胶中培养，以脑内皮细胞(hCMEC/D3)的单层进行覆盖。初步实验(TEM)证实了纳米粒子可自由地穿过凝胶基质并进入星形胶质细胞(图7a)。然后将纳米粒子施加在共培养的内皮细胞上并在1-8小时内测量在星形胶质细胞中的积聚率。观察足够数量的细胞，以包括至少50个含有纳米粒子的星形胶质细胞(图7b)。在8小时的时间进程中，具有可检测的纳米粒子的星形胶质细胞的百分比逐渐增加(表1)。
表1.纳米粒子在共培养星形胶质细胞中的积聚
时间1 细胞2 ％阳性细胞3 距离4 粒子/细胞5
1小时 411 7.4±2.0 10.6±1.6 3.53±0.41
3小时 308 15.9±1.0 16.7±2.6 4.16±0.46
8小时 240 19.5±0.6 15.5±1.4 3.75±1.15
1.向内皮细胞的顶面施加纳米粒子后的时间。
2.观察到的星形胶质细胞的总数。
3.具有胞内纳米粒子的星形胶质细胞的百分比。
4.每个含有纳米粒子的星形胶质细胞与内皮细胞基面的距离，单位为μm。
5.在含有纳米粒子的细胞中观察到的纳米粒子的数量。
在3D凝胶基质内，将含有纳米粒子的星形胶质细胞置于距离内皮细胞单层不同的深度处，并且在1-3小时内可检测到纳米粒子扩散至更深的星形胶质细胞，但每个细胞检测到的粒子数在所有时间均相似(表1)。压缩的凝胶的厚度为40-60μm。因此，在3小时时纳米粒子与内皮细胞的中位距离为16.7μm，这一观察结果表明纳米粒子在此时可渗透整个凝胶深度。鉴于这些观察结果，基于80nm厚的切片，在8小时时平均检测到每个细胞含3.75个纳米粒子，我们推断单个星形胶质细胞(其深度可高达80μm)可含有数百个纳米粒子。因此4nm葡萄糖涂覆的纳米粒子显示出被脑内皮细胞选择性摄取和胞吞转运以及作为递送治疗剂至星形胶质细胞的载体的巨大潜力。
讨论
药物至CNS细胞的靶向递送是治疗许多疾病的主要障碍。金纳米粒子具有巨大的潜力作为治疗剂跨血脑屏障的载体，因为它们不是免疫原性的并且较小的纳米粒子(3-5nm)无细胞毒性，除非在高剂量下(27,28,29)。这里，我们证实4nm葡萄糖涂覆的金纳米粒子能够穿过脑内皮细胞，对内皮细胞无可检测的损害(33)。
在本研究中，选择了葡萄糖涂覆的纳米粒子，这是因为它们对脑内皮细胞和星形胶质细胞上的葡萄糖受体Glut-1的结合潜力。该发现，即这些纳米粒子通过脑内皮细胞选择性转运(图2)，最先支持了摄取或胞吞转运是配体依赖性的观点。然而胞吞转运并未被干扰转运的抗生素阻断(图4)，并且改变葡萄糖在培养基中的浓度也不影响胞吞转运(数据未示出)。因此，看起来胞吞转运不依赖于葡萄糖转运蛋白系统，并且葡萄糖涂层的物理构型使得其不可能占用glut-1受体。或者，可能的是，对内皮细胞的初始附着依赖于纳米粒子和细胞的生物物理性质。在这方面，已知的是，脑内皮细胞的糖萼为高度唾液酸化的，并且与其它组织中的内皮细胞大为不同(30)，这可解释被脑内皮细胞的选择性摄取。很可能纳米粒子的尺寸和组成也是重要的。我们发现，30nm纳米粒子和谷胱甘肽涂覆的4nm金纳米粒子穿过内皮细胞的效率均十分低下(图6)。
其它研究表明纳米粒子的胞吞转运是一个主动过程，因为在4℃下纳米粒子进入细胞的摄取减少(31)。实际上，在一个实验中(数据未示出)，我们还发现在4℃下无胞吞转运发生。然而，这些研究并未考虑到质膜的流动性，我们认为该流动性是控制小纳米粒子跨膜运动的关键因素。
当我们使用静置体外培养时，我们考虑了应将围绕孔边缘的扩散或沉淀考虑在内的可能性。然而，就15nm以下的小尺寸金纳米粒子而言，这些作用是可以忽略的并且不应影响转运机制(32)。纳米粒子不存在于细胞间连接点也证实它们不使用细胞旁路途径跨内皮细胞。
在共培养中，我们无法完全驳斥纳米粒子被动扩散进培养基边缘附近的凝胶中这一观点。然而，由于纳米粒子的数量在1-3小时内随着从内皮细胞单层行进的距离而大幅增加(表1)，这一点最容易通过纳米粒子从内皮细胞基底膜进入凝胶基质并因此进入星形胶质细胞的运动而得到解释。
纳米粒子的定位提供了最有趣的数据。值得注意的是，纳米粒子极少见于内皮细胞的核中，而常见于星形胶质细胞的核中，无论是在单种细胞培养物或共培养物中(图7)。可能的是，纳米粒子的表面涂层在长期共培养期间或在粒子穿过内皮细胞时发生变化，这意味着它们随后将倾向于定位到星形胶质细胞核。当前，亚细胞定位中的这种差异的原因尚不明确。不论机制如何，重要的是，如果要将纳米粒子用于递送治疗货物至CNS细胞，则它们不被捕获在内皮细胞中。
胞吞转运的纳米粒子的数量也是一个重要的考虑因素。我们的计算表明>70,000个纳米粒子穿过每个内皮细胞并且数百个在每个星形胶质细胞中积聚。因此如果该过程在体内能以相似的水平发生，则它们具有携带有效剂量的毒剂、受体激动剂或基因至靶细胞的潜力。简而言之，4nm葡萄糖涂覆的金纳米粒子对脑内皮细胞为选择性的并且它们具有将治疗剂递送至CNS中的靶细胞的巨大潜力。
实施例3–将药剂递送至CNS
药剂(包括小分子药物、标记和/或生物药剂，诸如肽或核酸)可使用基本上任何合适的技术偶联到如本文所定义的纳米粒子。药剂可共价连接至纳米粒子的核或可与纳米粒子的冠产生结合相互作用。尤其是，标记(例如MRI造影剂，诸如镧系元素)可通过作为附接到纳米粒子核的配体而存在的碳水化合物基团形成复合物(参见例如WO2004/108165的实施例3，其全部内容明确地通过引用并入本文)。可选地或另外地，可将一种或多种肽或蛋白质(包括例如细胞因子、抗体或神经肽)非共价结合至纳米粒子的冠(参见例如WO2011/154711的实施例3，其全部内容明确地通过引用并入本文)。可选地或另外地，可将核酸(诸如siRNA，或DNA或RNA的片段)在核酸链的3’或5’端经由核酸的硫醇衍生化而共价连接至纳米粒子的核(参见例如WO2005/116226，尤其是其实施例，其全部内容明确地通过引用并入本文)。
可使用如在实施例2中详细描述的血脑屏障模型来评估利用如本文所定义的纳米粒子将药剂递送至CNS。在一些情况下，对目标药剂至CNS细胞(诸如星形胶质细胞)的成功递送的评估可涉及在物理上鉴定药剂(任选地与纳米粒子一起)在靶细胞中的存在和/或执行所述药剂对靶细胞的影响的功能测定。举例来说，如果药剂包含靶向特定基因的siRNA，则合适的功能测定可包括评估所述基因在靶CNS细胞中的表达。优选地，将使一种或多种对照(诸如不存在药剂的纳米粒子和/或不存在纳米粒子的药剂)与血脑屏障模型系统接触，从而提供参考，针对该参考评估具有所选药剂的货物的纳米粒子的存在和/或影响。
实施例4–纳米粒子涂层和跨脑内皮细胞转移
本研究着手调查以下目标：
·确定具有各种表面涂层的金纳米粒子是否穿过人脑内皮细胞。
·确定对脑内皮细胞的转运是否为选择性的。
·研究转移的潜在机制并优化递送系统。
·确定纳米粒子在跨内皮细胞转移后是否能靶向胶质细胞。
为此，基本上如实施例1中所述合成了具有包含一种或多种下列配体种类的冠的纳米粒子：
·C2-葡萄糖
·C5-葡萄糖
·C11-葡萄糖
·麦芽糖
·乳糖
·半乳糖
·半乳糖胺
·谷胱甘肽
据发现，纳米粒子的转移率根据纳米粒子冠(即，涂层)的组成而变化，并且在各批次纳米粒子之间见到了变化(参见图8)。尤其是，作为命名为C2-葡萄糖-1(即，具有带C2连接基的葡萄糖配体冠的第一批纳米粒子)的对照的百分比，针对每种纳米粒子配体种类绘制了在8小时时在基底膜下方检测到的纳米粒子数。明显的是，C11-葡萄糖和第三批葡萄糖(C2-葡萄糖-3)表现出高于对照转移率。
还发现，如图9中所示，半乳糖胺-NP(即，具有半乳糖胺配体冠的纳米粒子)强力结合到过滤器。
C2-葡萄糖纳米粒子的总跨内皮细胞转移的测量在图10中示出(通过光谱法进行分析)。值在下表中示出：
然后研究糖萼对纳米粒子转运的影响。通过使内皮细胞接受用肝素酶、软骨素酶或神经氨酸苷酶进行的酶预处理而实现糖萼的去除，然后在施加纳米粒子后8小时在基底膜处测量每微米检测到的纳米粒子数(参见图11)。很明显，去除糖萼抑制纳米粒子的转运，而软骨素酶预处理的影响具有统计显著性(参见***)。
图12示出被hCMEC/D3细胞摄取的胰岛素涂覆的纳米粒子(8个胰岛素和锌)。施加2ng/cm2纳米粒子3小时。据发现，胰岛素涂覆的纳米粒子主要通过囊泡而快速跨hCMEC/D3细胞转移(参见图13和图14A及图14B)。
研究了C2-葡萄糖纳米粒子在星形胶质细胞中的定位。图15A示出在1、3和8小时时呈纳米粒子阳性的星形胶质细胞的百分比。图15B示出在1、3和8小时时纳米粒子与内皮细胞的平均距离，单位为微米(最大距离以插入的数字示出)。
在2D星形胶质细胞培养和3D共培养星形胶质细胞中研究了各种纳米粒子冠组成(C2-葡萄糖、胰岛素或半乳糖胺涂层)的金纳米粒子摄取(分别参见图16A和图16B)。示出了胞液、囊泡和细胞核中的摄取，以每个细胞的纳米粒子数测量。
图17示出对于内皮细胞和星形胶质细胞而言纳米粒子在过滤器上的定位(边缘或中间)。在内皮细胞和星形胶质细胞中的纳米粒子数在过滤器中间均比边缘多，但未发现该差异具有统计显著性(p>0.05)。
图18示出在星形胶质细胞/D3共培养中研究纳米粒子的结果。A)在1、3和8小时时呈纳米粒子阳性的星形胶质细胞的百分比。B)在1、3和8小时时纳米粒子与内皮细胞的距离，单位为微米。C)在1、3和8小时时每个细胞的纳米粒子数。在1、3和8小时时在透射电子显微镜(TEM)中观察到的细胞数示于图18的插图中。
图19示出研究葡萄糖-NP的摄取的时间进程的结果。A)随时间推移在上层膜中每个细胞的粒子数。B)随时间推移在胞内区中每个细胞的粒子数。C)随时间推移在下层膜中每个细胞的粒子数。D)随时间推移在囊泡内每细胞的粒子。
对内皮细胞密度对纳米粒子转移的可能影响进行了研究。如图20A和图20B中所示，内皮细胞密度不影响纳米粒子转移。
结论
据发现，葡萄糖涂覆的纳米粒子对脑内皮细胞具有选择性。在8小时的时间段中，多达70,000个纳米粒子穿过每个内皮细胞。纳米粒子每小时移动10–20μm，多于400个纳米粒子到达每个星形胶质细胞。
半乳糖胺和谷胱甘肽纳米粒子也有效地穿过。葡萄糖涂覆的-NP的运动主要跨过胞液。去除糖萼或降低温度减少胞液转移。
胰岛素涂覆的NP似乎使用快速的囊泡胞吞转运跨过内皮细胞。它们也可被星形胶质细胞摄取。不希望受任何特定理论的约束，本发明人认为：如本文所述，经由纳米粒子将胰岛素递送至CNS的能力将具有重大的医学潜力，因为可削弱或防止有害的低血糖(例如，由于胰岛素的外周效应)。
本文引用的所有参考文献均整体且出于所有目的通过引用并入本文，其程度与具体且单独地指出每个出版物或专利或专利申请整体通过引用并入一样。
本文所述的具体实施方案以举例的方式而非限制的方式提供。本文的任何子标题只是为了方便起见而包括在内，并且不应被解释为以任何方式限制本公开。
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Claims (51)

1.一种用于将至少一种药剂递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的方法中的纳米粒子组合物，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至所述CNS的所述至少一种药剂。
2.根据权利要求1所述的供使用的纳米粒子组合物，其中所述方法是治疗所述受试者的CNS病症的方法。
3.根据权利要求1所述的供使用的纳米粒子组合物，其中所述方法是使所述受试者的CNS成像的诊断或预后方法。
4.一种将至少一种药剂递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的方法，所述方法包括施用组合物至所述受试者，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至所述CNS的所述至少一种药剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法是治疗所述受试者的CNS病症的方法。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法是使所述受试者的CNS成像的诊断或预后方法。
7.一种组合物在制备待递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的药物中的用途，所述组合物包含：
(a)纳米粒子，其包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；
(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽；和
(b)待递送至所述CNS的至少一种药剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物用于治疗哺乳动物受试者的CNS病症。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物用于所述受试者的CNS的诊断或预后成像。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物，根据权利要求4至6中任一项所述的方法，或根据权利要求7至9中任一项所述的用途，其中组合物经由非中枢途径施用或用于经由非中枢途径施用，由此将所述至少一种药剂通过与所述纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至所述CNS。
11.根据权利要求10所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述组合物通过除大脑内、鞘内或硬膜外途径之外的途径施用或用于施用。
12.根据权利要求10所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述组合物通过选自以下的途径施用或或用于施用：
静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射或输注；
肠道；
颊面；
唇下；
舌下；
吸入；
经由粘膜；
泌尿生殖器；
直肠；
皮肤；和
皮内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子组合物至所述CNS的递送包括所述纳米粒子和所述至少一种药剂跨所述受试者的脑内皮细胞的胞吞转运作用。
14.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者的血脑屏障受损。
15.根据权利要求14所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者患有病状，所述病状使得所述血脑屏障比在不存在所述病状的情况下更具通透性。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者具有基本上功能性的血脑屏障。
17.根据权利要求16所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中受试者不具有导致血脑屏障通透性升高的病状。
18.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者为人。
19.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中用于递送至所述CNS的所述至少一种药剂根据对于所述受试者而言要实现的所需治疗、预防、诊断或预后效果进行选择。
20.根据权利要求19所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者具有CNS病状并且所述至少一种药剂表现出至少一种对抗所述CNS病状的治疗效果。
21.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂选自：小分子药物、核酸、肽和蛋白质。
22.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂选自：胰岛素、氯普唑仑、氯甲西泮、替马西泮；扎来普隆、唑吡坦、唑吡酮；氯美噻唑；异丙嗪；褪黑素；丁螺环酮；盐酸氯丙嗪、氟哌啶醇、奋乃静、马来酸丙氯拉嗪或甲磺酸丙氯拉嗪、盐酸普马嗪、三氟吡啦嗪；氯氮平、奥氮平、喹硫平、利培酮、卡马西平和丙戊酸钠；盐酸阿米替林、盐酸氯丙咪嗪、盐酸丙咪嗪；盐酸米安色林；苯乙肼、吗氯贝胺；西酞普兰、氟西汀、舍曲林；阿戈美拉汀、氟哌噻吨、色氨酸、文拉法辛；阿托西汀、盐酸哌醋甲酯、莫达非尼；盐酸赛克利嗪、氯丙嗪、氟哌利多、马来酸普鲁氯嗪、盐酸胃复安、昂丹司琼、帕洛诺司琼、福沙吡坦、大麻隆、二盐酸倍他司汀；盐酸奈福泮；丁丙诺啡；盐酸海洛因、芬太尼、美普他酚、盐酸曲马多；辣椒素；托芬那酸、佐米曲坦、苯噻啶、可乐定；依维莫司、替莫唑胺、卡莫司汀；醋酸格拉替雷和芬戈莫德。
23.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述受试者患有选自以下的CNS病症：CNS肿瘤；神经变性疾病；中风；神精病症；CNS感染；CNS免疫病症；精神病症；影响CNS的遗传异常；外伤性脑损伤；昏迷；以及发育和学习障碍。
24.一种用于鉴定能够通过与纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统的药剂的体外筛选方法，所述方法包括：
提供细胞培养内皮细胞，任选地与星形胶质细胞共培养；
将所述内皮细胞和具有与其缔合的至少一种候选药剂的纳米粒子接触；以及
鉴定所述候选药剂是否通过所述纳米粒子跨所述内皮细胞递送，
其中所述纳米粒子包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；和
(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽。
25.根据权利要求24所述的方法，其中鉴定所述候选药剂是否跨所述内皮细胞递送的所述步骤包括对跨所述内皮细胞的所述纳米粒子的胞吞转运作用进行定量。
26.一种用于鉴定能够通过与纳米粒子缔合而跨血脑屏障递送至哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)的药剂的体内筛选方法，所述方法包括：
对非人哺乳动物试验受试者经由非中枢施用途径施用组合物，所述组合物包含具有与其缔合的至少一种候选药剂的纳米粒子；以及
鉴定所述候选药剂是否跨血脑屏障递送至所述试验受试者的CNS，
其中所述纳米粒子包含：
(i)含有金属和/或半导体的核；和
(ii)含有共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述配体包含碳水化合物、胰岛素和/或谷胱甘肽。
27.根据权利要求26所述的方法，其中鉴定所述候选药剂是否跨血脑屏障递送至所述试验受试者的CNS的所述步骤包括检测所述受试者的脑中所述纳米粒子和/或所述候选药剂的存在和/或对其量或效果进行定量。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米粒子和/或所述候选药剂在所述受试者的脑的至少一个星形胶质细胞中检出。
29.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂偶联到所述纳米粒子。
30.根据权利要求29所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂直接地或经由连接基共价连接至所述纳米粒子的所述核。
31.根据权利要求1至28中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂可逆地结合至所述纳米粒子的所述冠。
32.根据权利要求31所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂非共价地结合至所述纳米粒子的所述冠。
33.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子具有与其缔合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多个所述药剂的实体。
34.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述至少一种药剂包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同种类的药剂。
35.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的配体经由连接基共价连接至所述纳米粒子的核。
36.根据权利要求35所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述连接基包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇基团。
37.根据权利要求36所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述连接基包括巯乙基或巯丙基。
38.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的配体经由含硫基团、含氨基基团、含磷酸根基团或含氧基团共价连接至所述核。
39.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述配体包含为单糖或二糖的碳水化合物。
40.根据权利要求39所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述碳水化物包括葡萄糖、α半乳糖、甘露糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖胺和/或N-乙酰葡糖胺。
41.根据权利要求39所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述配体包含经由硫醇硫原子共价连接至所述核的2′-巯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2′-巯乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
42.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述配体包括单独的或与其它种类的配体结合的谷胱甘肽。
43.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述配体包括谷胱甘肽和葡萄糖。
44.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子包含至少5、至少10、至少20、至少30、至少40或至少50个含碳水化合物的配体、胰岛素配体和/或谷胱甘肽配体。
45.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的核的直径在1nm至5nm的范围内。
46.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中包括其配体的所述纳米粒子的直径在2nm至20nm、3nm至15nm或4nm至5nm的范围内。
47.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的核包含选自Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn或其任意组合的金属。
48.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的核为磁性的。
49.根据权利要求1至46中任一项所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中核包含半导体。
50.根据权利要求49所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述半导体选自：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的供使用的纳米粒子组合物、方法或用途，其中所述纳米粒子的核能够充当量子点。
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