JP2016507549A - ナノ粒子送達組成物 - Google Patents

Abstract

生物活性剤を中枢神経系に標的させるのに使用するためのナノ粒子送達系は、（ａ）下記を含むナノ粒子：（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；ならびに（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ；ならびに（ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質を含む組成物を含む。ナノ粒子送達系を利用する、ＣＮＳ障害を治療および診断する方法ならびに関連するスクリーニング法もまた開示される。【選択図】なし

Description

本発明は、作用物質の中枢神経系（ＣＮＳ）への送達、特に生物活性剤の血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る送達に有用な物質および組成物に関する。本明細書で開示される物質、組成物および方法は、ＣＮＳの障害の治療的および／または予防的処置において、生物活性剤の、ＣＮＳの細胞との相互作用をイメージングする、標的にする、修復する、および研究するために、用途が見出される。

医薬品業界にとっての大きな挑戦の１つは、中枢神経系（ＣＮＳ）中への薬物送達である。潜在的に有用な薬物の９５％超が、微小血管内皮およびアストロサイトにより形成される血液脳関門の保護機能のためにＣＮＳに入らないように防止される。関門の主要素は、内皮細胞間の連続タイトジャンクション（分子が脳中に拡散するのを防止する）、および生体異物を脳から能動的に汲み出すＡＢＣトランスポーターである（１，２）。その結果、多くの薬物およびより大きな生体分子、例えばＣＮＳ疾患の治療に対してかなりの可能性を有するサイトカインおよび遺伝子は内皮バリアにより排除される（３−６）。

血液脳関門を克服する方法、例えば担体としてのナノ粒子の使用を見出すためにかなりの努力がなされてきた（７）。１ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の生物学的に興味深いナノおよびミクロ粒子は、ポリマ、脂質および金属、例えば金などの材料から製造されている。金ナノ粒子は、製造の容易さおよび化学安定性という利点を有し、これらは近年、診断および療法の両方のためにナノ医療において使用されている（８）。金コアは不活性であるが、生物学的材料と相互作用し、生物学的効果を有することができる。これに対処するために、ナノ粒子の特異的挙動に影響する様々なサイズおよび表面修飾が研究されてきた（９−１１）。細胞中への輸送はサイズおよび表面コーティングに著しく依存して変動し得る特性である（１２）。小さなサイズの金ナノ粒子（＞３０ｎｍ）は、細胞にエンドサイトーシス経路を介して入ることができる（１３，１４）が、輸送のメカニズムは定かではない。金ナノ粒子は、細胞がアポトーシス性でない限り、核に入らないと考えられる（１５）。対照的に、それらはしばしば小胞にトラップされ（１６−１９）、これにより、一般に、細胞および組織中への標的薬物／遺伝子送達に対する問題が引き起こされ得る。

よって、ＣＮＳおよび血液脳関門に焦点を合わせて、特に下記特徴の１つ以上を示す、ＣＮＳのナノ粒子に基づく分子送達に対する満たされていない要求がある：
１．脳内皮に対する選択性
２．脳内皮を無傷で通過する能力
３．ＣＮＳ内の標的細胞による取り込み。

本発明は、これらのおよび他の要求に対処する。

広く、本発明は、生物活性またはイメージング剤を中枢神経系に標的させるのに使用するためのナノ粒子送達系に関する。本発明者らは、本明細書で規定されるナノ粒子は、内皮を通過し、アストロサイトに入ることを見出した。その上、ナノ粒子は、例えば、脳ではない内皮に対比して、ヒト脳内皮に対しいくらかの選択性を示す。生物活性剤は、ナノ粒子に、例えばリンカーを介する共有結合により結合させることができ、または、例えば、安定に、しかし可逆的にナノ粒子コロナに結合することにより、可逆的にナノ粒子に結合させることができる。作用物質はその後、ナノ粒子により「カーゴ」として、血液脳関門を横切って、中枢神経系の細胞に、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）の障害の治療的処置のために、またはＣＮＳをイメージングするために、送達される。

したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの作用物質を哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法において使用するためのナノ粒子組成物を提供し、前記組成物は、下記を含む：
（ａ）下記を含むナノ粒子：
（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ；ならびに
（ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質。

場合によっては、本発明によると、組成物は、被験体のＣＮＳ障害の治療の方法において使用するためのものである。

場合によっては、本発明によると、組成物は、被験体のＣＮＳのイメージングの診断または予後方法において使用するためのものである。前記方法は被験体の身体に対して実施される方法であってもよい（インビボ）。

第２の態様では、本発明は少なくとも１つの作用物質を、哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための方法を提供し、前記方法は組成物を被験体に投与することを含み、前記組成物は、下記を含む：
（ａ）下記を含むナノ粒子：
（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ；ならびに
（ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質。

場合によっては、本発明のこの態様によると、方法は被験体のＣＮＳ障害の治療の方法である。

場合によっては、本発明のこの態様によると、方法は、被験体のＣＮＳのイメージングの診断または予後方法である。前記方法は被験体の身体に対して実施される方法であってもよい（インビボ）。

第３の態様では、本発明は哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される薬剤の調製における組成物の使用を提供し、前記組成物は、下記を含む：
（ａ）下記を含むナノ粒子：
（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ；ならびに
（ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質。

場合によっては、本発明のこの態様によると、薬剤は哺乳類被験体のＣＮＳ障害の治療のためのものである。

場合によっては、本発明のこの態様によると、薬剤は被験体のＣＮＳの診断または予後イメージングのためのものである。被験体のＣＮＳの前記診断または予後イメージングは、被験体の身体に対して実施され得る（インビボ）。

場合によっては、本発明の第１、第２および／または第３の態様によると、組成物は、非中枢経路により投与され、または、投与のためのものであり、よって、前記少なくとも１つの作用物質は、前記ナノ粒子との会合により、血液脳関門を横切ってＣＮＳに送達される。特に、組成物は、脳内、くも膜下腔内または硬膜外経路以外により、投与することができ、または投与のためのものとすることができる。好適な投与経路としては、経腸（例えば、摂取のための固体または液体組成物）；頬側；口唇下；舌下；吸入；粘膜；泌尿生殖器；直腸；皮膚；ならびに皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下注射または注入が挙げられる。

場合によっては、本発明の第１、第２および／または第３の態様によると、被験体は障害性または「漏出性」血液脳関門を有する。特に、被験体は病状がない場合に比べ、血液脳関門をより透過性とする病状、例えば、脳腫瘍または感染を患っている可能性がある。

場合によっては、本発明の第１、第２および／または第３の態様によると、被験体は、実質的に機能的血液脳関門（すなわち、漏出性または障害性ではない）を有する。特に、被験体は、被験体の種および年齢で正常と考えられるものに比べ、血液脳関門をより透過性とする病状を有さない可能性がある。任意の特定の理論に縛られることは望まないが、本発明者らは、本明細書で規定されるナノ粒子は、健康な血液脳関門を通過し、よって、少なくとも１つの作用物質を被験体のＣＮＳに送達することができると考えている。これは、作用物質の病状がない場合に比べ、血液脳関門をより透過性とする病状を患う被験体のＣＮＳへのかなり挑戦的ではない送達と対比されるべきである。

場合によっては、本発明の第１、第２および／または第３の態様によると、被験体はヒトである。

当業者により認識されるように、ＣＮＳへの送達のための少なくとも１つの作用物質は、被験体に対して達成されるべき望ましい生物学的（例えば治療的、予防的、診断または予後）効果に従い選択することができる。特に、被験体はＣＮＳ病状を有する可能性があり、少なくとも１つの作用物質は、前記ＣＮＳ病状に対して治療的に有効であり得る。多種多様の作用物質が、本発明による使用のために企図される。小分子薬物、核酸（例えばベクター、ＲＮＡｉ）、ペプチド（例えばインスリン、ＧＬＰ−１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、リラキシン、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６、ＩＮＳＬ７、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ペプチドチロシンチロシン（ＰＴＴ）、ニューロペプチドＹ、オキシトシン、バソプレシン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、ＣＲＨ、ＧＨＲＨ／ソマトスタチン、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＣＧＡ、プロラクチン、ＣｌＩＰ、ＡＣＴＨ、ＭＳＨ、エンドルフィン（ｅｎｏｒｐｈｉｎ）、リポトロピン、ＧＨ、カルシトニン、ＰＴＨ、インヒビン、リラキシン、ｈＣＧ、ＨＰＬ、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、メラトニン、チモシン、チムリン（ｔｈｍｕｌｉｎ）、ガストリン、グレリン、サイモポエチン、ＣＣＫ、ＧＩＰセクレチン、モチン（ｍｏｔｉｎ）ＶＩＰ、エンテログルカゴン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、オステオカルシン、レニン、ＥＰＯ、カルシトロール（ｃａｌｉｃｉｔｒｏｌ）、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ケモカイン、サイトカイン、およびアディポカイン、およびそれらの生物活性類似体）、タンパク質（サイトカインおよび抗体を含む）のＣＮＳ（例えば、アストロサイト）への送達は、幅広いＣＮＳ障害の治療的処置に対して治療選択肢のかなりの柔軟性を提供することが予想されている。本発明の任意の態様に関連して本明細書で使用されるように、ＣＮＳ障害は下記からなる群より選択され得る：新生物（脳腫瘍、例えば、神経膠腫、星状細胞腫、原発性脳腫瘍、原発性腫瘍の他の場所からＣＮＳへの転移の結果としての二次性脳腫瘍を含む）；神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病およびハンチントン病を含む）；脳卒中（虚血性および出血性）；神経障害（てんかんを含む）；感染（ウイルス、細菌または寄生虫脳炎を含む）；ＣＮＳの免疫障害（自己免疫障害を含む）；精神障害（統合失調症、うつ病および不安を含む）；遺伝子異常（先天性代謝異常を含む）；外傷性脳損傷；昏睡；ならびに発達および学習障害。

第４の態様では、本発明は、ナノ粒子との会合により、血液脳関門を横切って、哺乳類被験体の中枢神経系に送達され得る作用物質を同定するためのインビトロスクリーニング法を提供し、前記方法は下記を含み：
任意でアストロサイトと共培養させた、細胞培養内皮を提供すること；
内皮を、少なくとも１つの候補作用物質を会合させたナノ粒子と接触させること；ならびに
候補作用物質が、ナノ粒子により内皮を横切って送達されるかどうかを同定すること、
ここで前記ナノ粒子は、下記を含む：
（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；ならびに
（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ。

第５の態様では、本発明は、ナノ粒子との会合により、血液脳関門を横切って、哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達され得る作用物質を同定するためのインビボスクリーニング法を提供し、前記方法は下記を含み：
非ヒト哺乳類試験被験体に非中枢投与経路により、少なくとも１つの候補作用物質を会合させたナノ粒子を含む組成物を投与すること；ならびに
候補作用物質が、血液脳関門を横切って前記試験被験体のＣＮＳに送達されるかどうかを同定すること、
ここで前記ナノ粒子は、下記を含む：
（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；ならびに
（ｉｉ）共有結合によりコアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ。

場合によっては、本発明の態様のいずれか１つによると、少なくとも１つの作用物質は例えば、ナノ粒子のコアへの共有結合により（直接か、リンカーを介するかに関係なく）、ナノ粒子に結合される。場合によっては、少なくとも１つの作用物質は、可逆的に（例えば非共有結合により）ナノ粒子のコロナに結合される。

場合によっては、本発明の態様のいずれか１つによると、少なくとも１つの作用物質は、ナノ粒子の構造中に組み入れることができる。例えば、作用物質が放射性核種を含む場合（例えば、脳腫瘍を標的にするため）、放射性核種はナノ粒子のコア内に存在することができる。

本明細書で規定されるナノ粒子は、小さいが、著しい表面積を有し、多くの場合、容易に、多数の作用物質および／または異なる作用物質の混合物を含むカーゴを運搬することができる。したがって、場合によっては、本発明によると、ナノ粒子は、前記作用物質の２またはそれ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００またはそれ以上）の実体（例えば、特定の薬物の２またはそれ以上の分子、特定の核酸またはペプチドまたはタンパク質の２またはそれ以上分子）を会合させている。場合によっては、本発明によると、少なくとも１つの作用物質は、組成物中の異なるナノ粒子に付着された、または共通のナノ粒子（多官能性ナノ粒子）に付着された、２またはそれ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の異なる種の作用物質を含む。便宜的に、異なる種の作用物質は、それらの生物学的効果において、協同的な挙動、または相乗作用を示し得る。特定例は、２つの薬物が協同的に作用する特異ＣＮＳ障害の治療のための２つの薬物の組み合わせである。

場合によっては、本発明によると、ナノ粒子のリガンドは、共有結合によりナノ粒子のコアにリンカー、例えばＣ２−Ｃ１５アルキル（例えばＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４またはＣ１５、直鎖か分枝鎖かに関係なく）および／またはＣ２−Ｃ１５グリコール（例えばＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４またはＣ１５）、例えば、チオエチル基またはチオプロピル基を介して結合され得る。

場合によっては、本発明によると、ナノ粒子のリガンドは、硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸塩含有基または酸素含有基を介して、共有結合によりコアに結合される。

場合によっては、本発明によると、リガンドは炭水化物を含み、これは、単糖または二糖である。特に、前記炭水化物部分はグルコース、αガラクトース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含み得る。

場合によっては、本発明によると、前記リガンドはチオール硫黄原子を介してコアに共有結合により付着された、２’−チオエチル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたは２’−チオエチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む。

場合によっては、本発明によると、前記リガンドは、グルタチオンを単独で、または他の種のリガンドと共にを含み、例えば、グルタチオンおよび炭水化物リガンドおよび／またはインスリン（グルコース含有リガンドを含む）の組み合わせは特定的に、本明細書で企図される。

場合によっては、本発明によると、ナノ粒子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０の炭水化物含有リガンド、インスリン含有リガンドおよび／またはグルタチオンリガンドを含む。

場合によっては、本発明によると、ナノ粒子のコアの直径は、１ｎｍ〜５ｎｍの範囲である。

場合によっては、本発明によると、そのリガンドを含むナノ粒子の直径は、３ｎｍ〜２０ｎｍ、任意で４ｎｍ〜１５ｎｍまたは４ｎｍ〜５ｎｍの範囲である。

場合によっては、本発明によるとコアは、下記からなる群より選択される金属を含む：Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、ＧｄおよびＺｎ、またはそれらの任意の組み合わせ。

場合によっては、本発明によると、コアは磁性である。

場合によっては、本発明によると、コアは半導体を含む。特に、半導体は、場合によっては、下記からなる群より選択され得る：セレン化カドミウム、硫化カドミウム、カドミウムテルルおよび硫化亜鉛。

場合によっては、本発明によると、コアは量子ドットとして機能することができる。

本発明は、記載される態様および好ましい特徴の組み合わせを、そのような組み合わせが明確に許容できない、または明確に回避されるべきと述べられている場合を除き、含む。発明のこれらのおよびさらなる態様および実施形態は、さらに詳細に、以下で、添付の実施例および図を参照して記載される。

グルコース−ナノ粒子を頂端表面に適用後８時間のａ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞およびｂ）初代ヒト脳内皮の電子顕微鏡写真を示す。ナノ粒子は基底細胞膜と基底層（矢印）の間に配置される。スケールバー＝５００ｎｍ。 ａ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞、ｂ）ヒト骨髄内皮細胞系（ＢＭＥＣ）、ならびにｃ）ヒト脳内皮またはｄ）冠動脈内皮の初代培養物を横切る５ｎｍグルコースコート金ナノ粒子の経細胞輸送速度を示すグラフである。値は、頂端表面への適用後の、基底細胞膜と基底層の間に配置された、ナノ粒子の数／細胞を示す。値は、少なくとも５０の異なる細胞、および２つの別個の培養物からの平均±ＳＥＭを示す。ｙ軸のスケールは、２つの脳ではない内皮細胞型に対しては、拡大されていることに注意されたい。ｅ）は、４つの異なる細胞型由来の８０ｎｍ切片における、ナノ粒子の数／ミクロン（平均±ＳＥＭ）のバーチャートを示す。 ａ）頂端表面へのグルコース−ＮＰ適用後３時間での、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の電子顕微鏡写真を示す。ナノ粒子は、基底細胞膜まで通過し、サイトゾルおよび小胞においても見られる。１つのナノ粒子のみが、細胞間結合（黒矢印）において検出される。ナノ粒子はまた、支持膜中の細孔内にも存在する（白矢印）。ｂ）適用後３時間での、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞、初代脳内皮（ＢＥＣ）および冠動脈内皮（ＣｏＡＥＣ）中の、ナノ粒子の局在化。Ｃｙ＝細胞質、Ｖｅｓ＝小胞、ＢＭ＝基底膜。 グルコース−ナノ粒子のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を横切る経細胞輸送に対する、抗生物質の効果の代表的な実験を示す。データは、未処理細胞（対照）と比較した、基底膜に位置するナノ粒子の数として表される。値は＞５０細胞の平均±ＳＥＭである。ＡＮＯＶＡは、処理間で著しい差がないことを示す。 適用後８時間での、３７℃または３０℃でのインキュベーション後のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞内のナノ粒子の位置を示す。Ｕ．Ｍ．＝上部膜、Ｃｙｔ．＝細胞質、Ｖｅｓ．＝小胞、Ｌ．Ｍ．＝下部膜。値は、代表的な実験からの少なくとも５０のＴＥＭ画像の平均±ＳＥＭである。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への適用後２２時間での、３０ｎｍコロイド金（Ａｕ３０）、４ｎｍグルコースコートナノ粒子（Ｇｌｕ）および４ｎｍグルタチオンコートナノ粒子（Ｇｌｎ）の経細胞輸送速度の比較を示す。値は、少なくとも５０のＴＥＭ画像に基づいて、基底細胞膜の真下またはサイトゾル内に位置するナノ粒子の数の平均±ＳＥＭを表す。データをＡＮＯＶＡにより解析し（基底膜に対してＰ＜０．０１）、続いて、両側ｔ検定を実施した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ａ）ナノ粒子のゲル表面への適用後８時間での、３Ｄコラーゲンゲル中の初代ヒトアストロサイトのＴＥＭを示す。ナノ粒子はゲルマトリクスおよびアストロサイトの両方において視認可能である（矢印）。ｂ）グルコースコートナノ粒子の内皮表面への適用後８時間でのアストロサイト／内皮共培養物のＴＥＭ。内皮およびアストロサイトの両方においてナノ粒子が検出される（矢印）。ゲルマトリクス中の小さな裂け目が時として、切片作製中に、ナノ粒子の存在により生成される（白矢印）。 Ｃ２−グルコース−１に指定される対照のパーセンテージとして、各ナノ粒子リガンド種についてプロットされた、８時間での基底膜下で検出されるナノ粒子の数を示す。 多くのナノ粒子がフィルタに結合されていることがわかるガラクトサミン−ＮＰのＴＥＭを示す。 分光法により分析された経内皮移動に対するμｇで表されたグルコース−Ｃ２ナノ粒子を示す、上部（薄い陰影）および底部（濃い陰影）。 ナノ粒子の適用後８時間に、基底膜で測定された、対照（酵素前処理なし）およびヘパリナーゼ（ｈｅｐａｒｉｎｉｓｅ）、コンドロイチナーゼまたはノイラミニダーゼによる酵素前処理に対して、ナノ粒子／ミクロンで測定されたナノ粒子の移動を示す。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞により取り込まれたインスリンコートナノ粒子（８インスリンおよび亜鉛）を表すＴＥＭを示す。２ｎｇ／ｃｍ２のナノ粒子が３時間適用された。 小胞、サイトゾルおよび結合部について、時間に対してプロットされたｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を横切るインスリンコートナノ粒子移動を示す。 ナノ粒子を示す暗染色を有する、Ａ）ゼロ時間およびＢ）３０分でのインスリンコートナノ粒子のＴＥＭを示す。 Ａ）１、３および８時間での、ナノ粒子陽性のアストロサイトのパーセンテージ；ならびにＢ）１、３および８時間での、ミクロンで表される内皮からのナノ粒子の平均距離（最大距離は、挿入図で示される）を示す。 Ａ）２Ｄアストロサイト培養物およびＢ）３Ｄ共培養アストロサイトにおける、様々なナノ粒子コロナ組成物（Ｃ２−グルコース、インスリンまたはガラクトサミンコーティング）に対する金ナノ粒子取り込みを示す。サイトゾル、小胞および核中への取り込みが、それぞれ、ナノ粒子／ミクロンのインサートおよび／細胞で示され、測定される。 内皮およびアストロサイトに対するフィルタ（縁または中央）上のナノ粒子の位置を示す。内皮およびアストロサイトの両方におけるナノ粒子の数を縁および中央に対して示す。 アストロサイト／Ｄ３共培養物においてナノ粒子を研究した結果を示す。Ａ）１、３および８時間での、ナノ粒子に対して陽性のアストロサイトのパーセンテージ。Ｂ）１、３および８時間で、内皮からミクロンで表される、見出されたナノ粒子距離。Ｃ）１、３および８時間でのナノ粒子の数／細胞。１、３および８時間での、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）において観察される細胞の数を挿入図で示す。 グルコース−ＮＰの取り込みの時間経過を研究した結果を示す。Ａ）時間に伴う上部膜内の粒子／細胞。Ｂ）時間に伴う細胞内領域内の粒子／細胞。Ｃ）時間に伴う下部膜内の粒子／細胞。Ｄ）時間に伴う小胞内の粒子／細胞。 Ａ）培養物下の日にちに対してプロットされた細胞の数／ｍｍ；ならびにＢ）培養物下の日にちに対してプロットされた、下部膜、サイトゾルおよび小胞でのナノ粒子の数／ミクロンを示す。

本発明を説明する際、下記用語を使用し、これらは、以下で示されるように規定されることが意図される。

本明細書では、「ナノ粒子」は、ナノメートルスケールを有する粒子を示し、任意の特定の形状制限を有することは意図されない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスタ、ナノロッドなどを包含する。ある一定の実施形態では、本明細書で企図されるナノ粒子および／またはナノ粒子コアは、一般に多面体または球面幾何学を有する。

複数の炭水化物含有リガンドを含むナノ粒子は、例えば、ＷＯ２００２／０３２４０４号、ＷＯ２００４／１０８１６５号、ＷＯ２００５／１１６２２６号、ＷＯ２００６／０３７９７９号、ＷＯ２００７／０１５１０５号、ＷＯ２００７／１２２３８８号、ＷＯ２００５／０９１７０４号（その各々の全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において記載されており、そのようなナノ粒子は本発明により、用途が見出され得る。その上、有機化合物で官能化された（例えば、チオール−金結合を介して）、酸化鉄フェライト（式ＸＦｅ_２Ｏ_４を有する、式中、Ｘ＝Ｆｅ、ＭｎまたはＣｏ）の磁性コアを含む金コートナノ粒子はＥＰ２３０５３１０号（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、本発明によるナノ粒子／ナノ粒子コアとして使用するために特定的に企図される。

本明細書では、「コロナ」は、部分的に、または完全にナノ粒子コアの露出表面を被覆することができる層またはコーティングを示す。コロナは、複数のリガンドを含み、これは、一般に、少なくとも１つの炭水化物部分、１つの界面活性剤部分および／または１つのグルタチオン部分を含む。よって、コロナは、金属のコアを取り囲む、または部分的に取り囲む有機層であると考えることができる。ある一定の実施形態では、コロナはナノ粒子のコアの不動態化を提供し、および／またはこれに関与する。よって、ある一定の場合には、コロナは、実質的に半導体または金属含有コアを安定化させるのに十分完全なコーティング層を含み得る。しかしながら、例えば、貴金属でコートされた金属酸化物含有内部コアを含むコアを有する、ある一定のナノ粒子は、コア表面の一部のみをコートするコロナを含み得ることが、本明細書で特定的に企図される。ある一定の場合には、コロナは、本発明のナノ粒子の溶解性、例えば水溶性を促進する。

ナノ粒子
ナノ粒子は小さな粒子、例えば、金属または半導体原子のクラスタであり、リガンドを固定するための基材として使用することができる。

好ましくは、ナノ粒子は０．５〜５０ｎｍ、より好ましくは０．５〜１０ｎｍ、より好ましくは０．５〜５ｎｍ、より好ましくは０．５〜３ｎｍ、さらにより好ましくは０．５〜２．５ｎｍの平均直径を有するコアを有する。リガンドがコアに加えて考えられる場合、好ましくは、粒子の全体平均直径は２．０〜２０ｎｍ、より好ましくは３〜１０ｎｍ、最も好ましくは４〜５ｎｍである。平均直径は、当技術分野でよく知られた技術、例えば透過型電子顕微鏡法を用いて測定することができる。

コア材料は金属または半導体とすることができ、１を超える型の原子から形成させることができる。好ましくは、コア材料は、Ａｕ、ＦｅまたはＣｕから選択される金属である。ナノ粒子コアはまた、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄおよびＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金から形成させることができ、発明において使用することができる。好ましいコア材料はＡｕおよびＦｅであり、最も好ましい材料はＡｕである。ナノ粒子のコアは好ましくは約１００〜５００の原子（例えば金原子）を含み、ナノメートル範囲のコア直径が提供される。他の特に有用なコア材料にはＮＭＲ活性である１つ以上の原子がドープされ、これにより、ナノ粒子は、ＮＭＲを使用して、インビトロおよびインビボの両方で検出することができる。ＮＭＲ活性原子の例としては、Ｍｎ^＋２、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｖ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｎｉ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｆｅ^＋３およびランタニド^＋３、または本出願の他のどこかで記載される量子ドットが挙げられる。

半導体化合物を含むナノ粒子コアは、ナノメートルスケール半導体結晶として検出することができ、量子ドットとして機能することができ、すなわち、これらは、光を吸収し、よって、材料中の電子を励起して、より高いエネルギーレベルとし、その後、材料に特徴的な周波数で光の光子が放出される。半導体コア材料の一例はセレン化カドミウム、硫化カドミウム、カドミウムテルルである。硫化亜鉛などの亜鉛化合物もまた、含まれる。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子のコアは磁性とすることができ、磁性金属原子を、任意で不動態化金属原子と組み合わせて含むことができる。例として、不動態化金属は金、白金、銀または銅とすることができ、磁性金属は、鉄またはガドリニウムとすることができる。好ましい実施形態では、不動態化金属は金であり、磁性金属は鉄である。この場合、便宜上、コア中の不動態化金属原子の磁性金属原子に対する比は約５：０．１〜約２：５である。より好ましくは、比は約５：０．１〜約５：１である。本明細書では、「不動態化金属」という用語は、磁気特性を示さず、酸化に対して化学的に安定な金属を示す。不動態化金属は反磁性または超常磁性であってもよい。好ましくは、そのようなナノ粒子は超常磁性である。

常磁性金属を含むコアを有するナノ粒子の例としては、Ｍｎ^＋２、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｖ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｎｉ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｆｅ^＋３およびランタニド^＋３を含むものが挙げられる。

他の磁性ナノ粒子は、ＭｎＦｅ（スピネルフェライト）またはＣｏＦｅ（コバルトフェライト）などの材料から形成させることができ、以上で規定されるさらなるコア材料の添加を用いて、またはなしで、ナノ粒子（磁性流体に形成することができる。そのようなナノ粒子を生成させるための自己組織化付着化学の例は、下記で与えられる：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １９：１０９５−１００ （２００３）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２５：９８２８−３３ （２００３）、Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ． ２５５：２９３−８ （２００２）。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはそのリガンドは検出可能な標識を含む。標識は、ナノ粒子のコアまたはリガンドの要素とすることができる。標識は、ナノ粒子のその要素の固有特性のために、または、検出可能なさらなる部分と結合、コンジュゲート、または会合されることにより、検出可能とすることができる。標識の好ましい例としては、蛍光基、放射性核種、磁性標識または染料である標識が挙げられる。蛍光基としては、フルオレセイン、ローダミンまたはテトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５，などが挙げられ、蛍光標識の励起および放射光のラマン散乱分光法を用いた検出により検出することができる（Ｙ．Ｃ． Ｃａｏ， Ｒ． Ｊｉｎ， Ｃ． Ａ． Ｍｉｒｋｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９７： １５３６−１５３９）。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、放射性核種により放出される放射能を使用して、例えばＰＥＴ、ＳＰＥＣＴを使用してナノ粒子を検出する際に使用するために、または療法のために、すなわち標的細胞を死滅させるために、放射性核種を含むことができる。当技術分野において普通に使用される放射性核種の例は、本発明において使用するために容易に適合させることができ、下記が挙げられる：^９９ｍＴｃ（様々な酸化状態で存在するが、最も安定なのもは、ＴｃＯ^４−である）；^３２Ｐまたは^３３Ｐ；^５７Ｃｏ；^５９Ｆｅ；^６７Ｃｕ（しばしば、Ｃｕ^２＋塩として使用される）；^６７Ｇａ（普通、Ｇａ^３＋塩、例えばクエン酸ガリウムとして使用される）；^６８Ｇｅ；^８２Ｓｒ；^９９Ｍｏ；^１０３Ｐｄ；^１１１Ｉｎ（一般にＩｎ^３＋塩として使用される）；^１２５Ｉまたは^１３１Ｉ（一般に、ヨウ化ナトリウムとして使用される）；^１３７Ｃｓ；^１５３Ｇｄ；^１５３Ｓｍ；^１５８Ａｕ；^１８６Ｒｅ；^２０１Ｔｌ（一般に、Ｔｌ^＋塩例えば塩化タリウムとして使用される）；^３９Ｙ^３＋；^７１Ｌｕ^３＋；ならびに^２４Ｃｒ^２＋。放射性核種の標識およびトレーサーとしての一般的使用は、当技術分野でよく知られており、本発明の態様において使用するために当業者により容易に適合され得る。放射性核種は、ナノ粒子のコアにドープすること、またはそれらを、ナノ粒子上に固定されたリガンドの一部として存在する標識として含ませることにより、最も容易に使用され得る。

加えてまたはその代わりに、本発明のナノ粒子、またはそれらの他の種との相互作用の結果は、以上で示されるナノ粒子と会合された標識を用いる、当技術分野でよく知られている多くの技術を用いて、またはそれらの特性を使用することにより、検出することができる。ナノ粒子を検出するこれらの方法は、ナノ粒子が別の種に結合した場合に得られる凝集を、例えば単純な目視検査により、または光散乱（ナノ粒子を含む溶液の透過率）を使用することにより検出することから、ナノ粒子を可視化するための透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などの高度な技術を使用することまで及んでいる。金属粒子を検出するさらなる方法は、通常、光学的放射により引き起こされる、金属の表面での電子の励起であるプラズモン共鳴を使用するものである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象は、金属（例えばＡｇまたはＡｕ）と誘電材料例えば空気または水の界面に存在する。ＳＰＲの変化は分析物がナノ粒子の表面上に固定されたリガンドに結合し、界面の屈折率が変化すると起こる。ＳＰＲのさらなる利点は、実時間相互作用をモニタするために使用することができることである。上記のように、ナノ粒子がＮＭＲ活性である原子を含む、またはこれがドープされている場合、そうすると、この技術は粒子を、インビトロまたはインビボの両方で、当技術分野でよく知られている技術を使用して検出するために使用することができる。ナノ粒子はまた、銀（Ｉ）のナノ粒子により促進される還元を使用する量的信号増幅に基づく系を使用して検出することができる。ナノ粒子がリガンドを蛍光プローブとして含む場合、蛍光分光法を使用することができる。また、炭水化物の同位体標識は、それらの検出を促進するために使用することができる。

ＣＮＳへの送達のための作用物質
多種多様の作用物質が本発明の生成物および方法を使用するＣＮＳへの送達のために想定される。下記両方が特定的に企図される：（ｉ）ＣＮＳに入ることが知られており、本発明のナノ粒子により提供されるＢＢＢの透過の増強により利益が得られ得る作用物質（例えば、よって、より低い用量が、治療的またはイメージング活性を保持しながら投与され得る）；ならびに（ｉｉ）これまで、有効な程度までＣＮＳに入ることが知られておらず、脳を標的にするための新しいクラスの治療的およびイメージング剤を提供することができる（例えば、有効な治療様式および診断可能性を拡大する）作用物質。

本明細書における「英国国民医薬品集」への言及は、２０１２年１１月に入手可能なそのバージョンを示す（ｗｗｗ．ｂｎｆ．ｏｒｇを参照されたい）。

本発明により、用途が見出される作用物質の特定例としては下記が挙げられる：

英国国民医薬品集サブセクション４．１（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される睡眠薬＆抗不安薬、例えば、限定はされないが下記：ロプラゾラム、ロルメタゼパム，テマゼパム；ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロン；クロメチアゾール；プロメタジン；メラトニン；ブスピロン。

英国国民医薬品集サブセクション４．２（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される抗精神病薬、例えば、限定はされないが、下記：クロルプロマジン塩酸塩、ハロペリドール、ペルフェナジン、プロクロルペラジンマレイン酸塩またはメシル酸塩、プロマジン塩酸塩、トリフロペラジン；クロザピン、オランザピン、クエチアピン、リスペリドン。

英国国民医薬品集サブセクション４．２（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される抗躁薬、例えば、限定はされないが、下記：カルバマゼピンおよびバルプロ酸ナトリウム。

英国国民医薬品集サブセクション４．３（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される抗うつ薬、例えば、限定はされないが、下記：アミトリプチリン塩酸塩、クロミプラミン塩酸塩、イミプラミン塩酸塩；ミアンセリン塩酸塩；フェネルジン、モクロベミド；シタロプラム、フルオキセチン、セルトラリン；アゴメラチン、フルペンチキソール、トリプトファン、ベンラファキシン。

英国国民医薬品集サブセクション４．４（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を治療するための医薬、例えば、限定はされないが、下記：アトモキセチン、メチルフェニデート塩酸塩、モダフィニル。

英国国民医薬品集サブセクション４．６（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される、悪心および回転性めまいの治療において使用される医薬、例えば、限定はされないが、下記：シクリジン塩酸塩、クロルプロマジン、ドロペリドール、プロクロルペラジンマレイン酸塩、メトクロプラミド塩酸塩、オンダンセトロン、パロノセトロン、ホスアプレピタント、ナビロン、ベタヒスチン二塩酸塩。

英国国民医薬品集サブセクション４．７（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される鎮痛のために使用される医薬、例えば、限定はされないが、下記：ネホパム塩酸塩；ブプレノルフィン；ジアモルヒネ塩酸塩、フェンタニル、メプタジノール、トラマドール塩酸塩；カプサイシン；トルフェナム酸、ゾルミトリプタン、ピゾチフェン、クロニジン。

英国国民医薬品集サブセクション４．８（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及されるてんかんを治療するために使用される医薬。

英国国民医薬品集サブセクション４．９（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及されるパーキンソニズムおよび関連障害を治療するために使用される医薬。

英国国民医薬品集サブセクション４．１０（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される物質依存症を治療するために使用される医薬物質。

英国国民医薬品集サブセクション４．１１（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される認知症を治療するために使用される医薬。

英国国民医薬品集サブセクション８（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される星状細胞腫の神経膠芽腫の治療において使用される医薬、例えば、限定はされないが、エベロリムス、テモゾロミド、カルムスチン。

英国国民医薬品集サブセクション８．２．４（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）において言及される神経障害の治療において使用される医薬、例えば、限定はされないが、グラチラマー酢酸塩、フィンゴリモド。

さらに、本発明によるＣＮＳへの送達のための作用物質のクラスは下記を含む：サイトカインおよび核酸、例えば遺伝子治療のためのベクター。

投与および治療
本発明のナノ粒子および組成物は、あらゆる経路、例えば、経腸または非経口経路により、患者に投与され得る。非経口投与は、下記経路による投与を含む：静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内および局所（皮膚、眼内、直腸、経鼻、吸入およびエアロゾルを含む）、および直腸全身経路。

投与は、例えば注射により、または弾道的に送達銃を使用して、実施され、表皮の外層を通るそれらの経皮通過が促進される。ナノ粒子はまた、エアロゾルで送達され得る。これは、小さなサイズのナノ粒子により可能とされる。

本発明のナノ粒子のことのほか小さなサイズは、細胞および組織への送達に対して、大きな利点となる。というのも、それらは、標的および治療的分子に結合された場合であっても細胞により取り込まれ得るからである。よって、ナノ粒子は脳内皮を透過し、アストロサイトなどの細胞により内部移行され得、付着または会合された作用物質（複数可）のそれらの「カーゴ」が、例えば、ＣＮＳ標的、例えばグリアまたはニューロン受容体、遺伝子発現標的との相互作用に対して、放出される。

発明のナノ粒子は、固体または液体組成物の形態とすることができる医薬組成物として製剤化することができる。そのような組成物は一般に、ある種の担体、例えば固体担体または液体担体、例えば水、石油、動物または植物油、鉱物油または合成油を含む。生理食塩水溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは含めることができる。そのような組成物および調製物は、一般に、少なくとも０．１ｗｔ％の化合物を含む。

場合によっては、医薬組成物は透過エンハンサーを含み得る。透過エンハンサーは、場合によっては、アルキル−Ｄ−マルトシドおよびリザルビン酸から選択され得る。アルキル−Ｄ−マルトシドは、下記からなる群より選択され得る：ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ノニル−β−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、トリデシル−β−Ｄ−マルトシド、テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド。ある一定の場合には、前記アルキル−Ｄ−マルトシドは、ドデシル−β−Ｄ−マルトシドまたはテトラデシル−β−Ｄ−マルトシドを含むことができ、またはこれから構成され得る。

静脈内、皮膚または皮下注射、または苦痛部位での注射では、活性成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当技術分野における関連技術者は、例えば、化合物またはその誘導体の、例えば、生理食塩水中の溶液、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたは油を用いて調製した分散物を使用して、好適な溶液をうまく調製することができる。

１つ以上の化合物に加えて、任意で他の活性成分と組み合わせて、組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、等張化剤、保存剤または抗酸化剤または当業者によく知られている他の材料の１つ以上を含むことができる。そのような材料は無毒であるべきであり、活性成分の効力を妨害すべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば静脈内、経口または非経口に依存し得る。

液体医薬組成物は、典型的には、約３．０〜９．０、より好ましくは、約４．５〜８．５、さらにより好ましくは約５．０〜８．０のｐＨを有するように製剤化される。組成物のｐＨは、典型的には約１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で使用される、緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、トリスまたはヒスチジンの使用により維持することができる。組成物のｐＨはそうでなければ、生理的に許容される酸または塩基を使用することにより調節することができる。

保存剤は、一般に、微生物増殖を遅らせるために医薬組成物中に含められ、組成物の有効期間が拡張され、複数の使用パッケージングが可能になる。保存剤の例としては、フェノール、メタ−クレゾール、ベンジルアルコール、パラ−ヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｃｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。保存剤は典型的には、約０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で使用される。

好ましくは、医薬組成物は予防的有効量または治療的有効量で個体に与えられ（場合によって、予防は治療と考えられる場合があるが）、これは個体に利益を示すのに十分である。典型的には、これは、個体に利益を提供する治療的に有用な活性を引き起こすことになるであろう。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される病状の性質および重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば用量などについての決定は一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療される障害、個々の患者の病状、送達部位、投与方法および実行者に知られている他の因子が考慮される。以上で言及される技術およびプロトコルの例は、下記において見出され得る：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （ｅｄｓ． Ｍ． Ａｓｈ ａｎｄ Ｉ． Ａｓｈ）， ２００１ （Ｓｙｎａｐｓｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｎｄｉｃｏｔｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ）； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， ｐｕｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９４。例として、組成物は好ましくは患者に、約０．０１〜１００ｍｇの活性化合物／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。

腫瘍の治療に関連する場合、治療は患者に対する腫瘍の効果を軽減するために医師がとる全ての方策を含むことが理解されるであろう。よって、腫瘍の完全な緩解が望ましい目標であるが、有効な治療はまた、腫瘍の部分的な緩解ならびに転移を含む腫瘍の成長速度における減速を達成することができる任意の方策を含む。そのような方策は、生活の質を延長するおよび／または高める、および疾患症状を軽減するのに有効なものとすることができる。

当業者により認識されるように、本明細書で規定されるナノ粒子を介する、好適な作用物質のＣＮＳへの送達による治療のための病状は多く、様々である。そのような病状としては、限定はされないが、下記からなる群より選択される中枢神経系障害が挙げられる：新生物（脳腫瘍、例えば神経膠腫、星状細胞腫、原発性脳腫瘍、原発性腫瘍のＣＮＳへの転移の結果としての二次性脳腫瘍を含む）；神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病およびハンチントン病を含む）；脳卒中（虚血性および出血性）；神経（てんかんを含む）；感染（ウイルス、細菌または寄生虫脳炎を含む）；ＣＮＳの免疫障害（自己免疫障害を含む）；精神障害（統合失調症、うつ病および不安を含む）；遺伝子異常（先天性代謝異常を含む）；外傷性脳損傷；昏睡；ならびに発達および学習障害。

下記は例として提供され、特許請求の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

実施例
実施例１−ナノ粒子の合成
グルコースリガンドまたはグルタチオンリガンドのコロナを有する金ナノ粒子を、本質的に前に記載されるように（２２）（その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）合成した。

簡単に言うと、下記一般的方法を使用して、およそ１．６ｎｍ直径の金金属コアを有するナノ粒子を生成させた。リガンドコロナは、流体力学直径をおよそ５ｎｍまで増加させることに注意されたい。

酸化リガンド、グルタチオン（Ｆｌｕｋａ ４９７４１）またはβ−２−メルカプトエトキシ−グルコース（室内合成）のいずれかを、９：１メタノール：水に溶解し、塩化金ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を添加した。有機リガンドを金に対して４倍モル過剰で使用した。溶液をその後、５分間静かに平台振盪機上で混合させた。ナノ粒子を、金に対して２０倍モル過剰の新たに生成した１Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を激しくボルテックスしながら、急速に添加した後の還元により生成させた。試料を合計３０秒間ボルテックスし、続いてさらに１時間、平台振盪機上で静かに混合した。ナノ粒子はメタノール／水溶媒中で可溶性ではないので、初期精製はベンチ遠心分離、上清除去およびナノ粒子ペレットの水中での分散によるものとした。さらなる精製を、１０ｋＤａ ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離装置（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）における４回の水洗浄により達成した。全てのナノ粒子調製物の金濃度を、単純比色分析アッセイにより決定した。簡単に言うと、１０μｌのナノ粒子試料または１２ｍｇ／ｍｌ金標準（Ｆｌｕｋａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ））およびブランクを、３０μｌの５０：５０水：王水と共に、ＥＬＩＳＡプレートにおいて１分間温浸し、この後、１５０μｌの２Ｍ ＮａＢｒを添加し、その後、４０５ｎｍ吸光度を直ちに測定し、アッセイは、０−１０μｇ範囲にわたって優れた直線性を有した。

実施例２−ナノ粒子の内皮血液脳関門モデルを横切ってアストロサイトへの送達
本発明者らは、ＣＮＳに対する選択性はどのよう達成され得るのかを考えた。脳内皮は多くの特異受容体およびトランスポーターを有し、これにより栄養分の脳内への流入が可能になり、それらのリガンドは、ＣＮＳ特異ナノ粒子を開発しようとして利用されてきた（２０）。例えば、ＡｐｏＥ（ＬＤＬ受容体を標的にする）またはＯＸ２６抗体（トランスフェリン受容体を標的にする）でコートされたナノ粒子はどちらも、ＣＮＳ薬物送達において使用されてきた（１６、１７）。別の可能性のある標的はグルコース受容体（Ｇｌｕｔ−１）であり、これは脳内皮上で選択的に発現され、アストロサイト上にも存在する（２１）。

この研究では、我々は脳内皮を通過し、その下のアストロサイトに入ることができるナノ粒子に焦点を置いた。我々は、グルコースコート金ナノ粒子がそうする可能性を調査するためにインビトロモデルを使用してきた。ナノ粒子は２ｎｍ金コアおよび５ｎｍ表面コーティング（２２）を有し、サイズは関連する研究で使用されるものよりかなり小さい（１６）。これらのナノ粒子を、脳内皮およびアストロサイトへの標的を増強し、エンドソーム取り込みを最小に抑えるために選択した。

細胞中での金ナノ粒子の分布をインビトロで研究するために、我々は、異なる細胞内コンパートメント内のナノ粒子の局在化についての量的情報を提供するためにＴＥＭを使用した。我々の研究は、グルコースコートナノ粒子がＣＮＳ選択性であるかどうかを確立するために、脳内皮を他の組織（骨髄および冠動脈）由来の内皮と比較する。

我々はまた、脳内皮を横切り、アストロサイトに入る輸送速度を、血液脳関門の最近開発されたモデルを使用して研究した。この場合、ヒトアストロサイトが３次元（３Ｄ）コラーゲンゲル内、ヒト脳内皮の単層の真下で培養される。モデルは我々の研究室で開発された３Ｄラットグリア細胞培養系に基づき（２３、２４）、それは初代ヒトアストロサイトおよび脳内皮細胞系ｈＣＭＥＣ／Ｄ３を用いて改変されている（２５）。この研究で使用される全ての細胞はヒト起源である。

材料および方法
内皮細胞培養物
初代ヒト脳微小血管内皮は、てんかんを治療するために行われた外科的切除から、患者のインフォームドコンセントを得て入手した。前に記載されるように、細胞を側頭葉の先端の無影響組織の小さな領域から、コラゲナーゼ／ディスパーゼ消化およびＢＳＡおよびパーコール勾配上での単離により、単離した（２６）。細胞を、コラーゲンコートフラスコまたは組織培養インサート（Ｃｏｓｔａｒ）上、ＥＢＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ）（２．５％胎児ウシ血清、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、製造者の製剤によるアスコルビン酸およびゲンタマイシン硫酸塩（Ｌｏｎｚａ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されている）中で培養した（継代−１）。

継代２４−３０でのヒト脳微小血管内皮細胞系ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（２５）および初代ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ、Ｌｏｎｚａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ−２５８５）をＥＢＭ−２培地中で培養した。ヒト骨髄内皮細胞系ＢＭＥＣ（２７）を、１０％胎児ウシ血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。内皮細胞は全て、別記されない限り、３７℃で、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中にて培養した。

３Ｄコラーゲンゲルアストロサイト培養物およびアストロサイト／内皮共培養物
３次元（３Ｄ）コラーゲンゲルを予め温めた２４ウェルプレートに、４５０μｌのコラーゲン混合物／ウェルで設定した。混合物は４０％のラット尾部コラーゲンＩ型（５ｍｇ／ｍｌ、０．６％酢酸に溶解、Ｆｉｒｓｔ Ｌｉｎｋ）、４０％水、１０％の１０倍濃縮ＭＥＭおよび１０％ヒトアストロサイトの懸濁液（１．２×１０^６／ｍｌ継代２−４）を含んだ。ゲルを、細胞懸濁液を添加する直前に、水酸化ナトリウムで中和した。ゲル化には約１０分かかり、その後、アストロサイト培地（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）をゲル上に添加した。ゲルを３日間培養し、その後、ナノ粒子を適用した。場合によっては、アストロサイト−ゲルは、使用前に、吸収体（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、その元の体積のおよそ１０％まで圧縮させた。

アストロサイト／内皮細胞共培養物では、アストロサイト含有ゲルを２時間のインキュベーション後１５分間圧縮し、その後、２４時間、アストロサイト培地中で培養し、その後、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を上に、５００００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で置いた。

これらの共培養物を、３日間ＥＢＭ−２中でインキュベートし、その後、ナノ粒子を頂端表面に新鮮培地中で１、３または８時間適用した。

ナノ粒子とのインキュベーション後、ゲルを３回ＰＢＳ中で洗浄し、２．５％グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝液中で、少なくとも１時間固定した。これらをさらに、下記でインサートに対して記載されるように、ＴＥＭのために処理した。

金ナノ粒子移動アッセイ
金ナノ粒子（２ｎｍコア）を前に記載したようにＭｉｄａｔｅｃｈ Ｌｔｄにより合成した（２２）。この研究では我々は、グルコースまたはグルタチオンでコートしたナノ粒子を使用した。グルコースコートナノ粒子は約４ｎｍの直径および約２７ｋＤａの平均分子質量を有する。

経細胞輸送アッセイでは、１２ウェルコラーゲンコートインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に、４００００細胞／ウェルを播種し、２または３日間、培養密度に到達するまでインキュベートした。細胞をその後、洗浄し（ＨＢＳＳ）、金ナノ粒子（２ｎｇ）を上部チャンバ内の新鮮培地（０．５ｍｌ）に添加した。細胞をその後、０−２２時間３７℃でインキュベートした。細胞を３回、冷ＰＢＳ中で洗浄し、頂端表面上の全てのゆるく付着されたナノ粒子を除去し、その後、２．５％グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝液中で、少なくとも１時間固定した。

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
銀増感（４５分、Ａｕｒｉｏｎ、ＵＫ）を使用して、ナノ粒子を可視化するのを助けた。後固定を１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウムを含むリン酸緩衝液を用いて１時間実施し、フィルタをその後、リン酸緩衝液中で１０分洗浄した。フィルタを、インサートから取り出し、ランダムに３−５ｍｍｘ２ｍｍの２つのセグメントに切断した。これらのセグメントを、漸進的に３０−１００％エタノール中で脱水し、最終的にＥｐｏｎに埋め込んだ。極薄切片作製を、Ｄｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフを用いて実施し、７０−８０ｎｍの厚さの切片を生成させ、これをその後、Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍでコートされた銅グリッド上にロードした。グリッドを、酢酸ウラニルで３５分対比染色し、３回洗浄し、クエン酸鉛に７分間浸漬し、３回洗浄した。グリッドを、８０ｋＶの加速電圧で動作される透過型電子顕微鏡ＪＥＭ−１４００上で、×５０００の拡大率を使用して観察した。

ＴＥＭデータのサンプリングおよび統計解析
代表的なデータを選択するために、系統的なサンプリング方法を使用した。２５の写真を各切片から、一定の間隔で、すなわち４つの顕微鏡視野ごとにとった。第４の視野に細胞がなかった場合、または視野がアポトーシス細胞を含んだ場合、生細胞が見出されるまで、ステージを進めた。この後、全ての写真を、６つのカテゴリに割り当てられた（上部膜、下部膜、小胞、細胞質内、核、結合部）、観察されたナノ粒子をカウントすることにより別々に解析した。小胞カテゴリでは、我々は、ミトコンドリアを除く膜結合コンパートメントで見出された全てのナノ粒子を含んだ。各写真において視認可能な膜の長さ（上部または下部膜）を、ソフトウェアＩｍａｇｅ−Ｊ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４３を使用して測定した。データ点は、各実験処理または時間点（２５の画像／反復を有する２つの技術的反復）からの少なくとも５０の細胞の測定に基づいた。各実験を２−４回実施し、図は、代表的な実験からのデータを示す。データは、必要に応じて、ナノ粒子／ミクロンの細胞膜またはナノ粒子／細胞のいずれかとして表される。グラフ上の数字は、細胞の８０ｎｍの厚さの切片を示し、ナノ粒子の総数／細胞の推定が、単層の面積および細胞の数に基づく計算によりなされることに注意されたい。

３Ｄゲル中のアストロサイトを評価するために、各切片中の全てのアストロサイトの写真を撮り；各細胞および核の面積をＩｍａｇｅ−Ｊを用いて測定し、および上記のように、ナノ粒子をカウントし、カテゴリに割り当てた。

ゲルの各評価済み切片における、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞との３Ｄゲル中の共培養下のアストロサイトでは、全てのアストロサイトがカウントされ、５０細胞の最小試料サイズがナノ粒子を含んだ（＞２４０細胞）。各アストロサイトの、内皮の基底膜からの距離も測定した。

結果
グルコースコートナノ粒子がヒト脳内皮を通過することができるかどうかを決定するために、ナノ粒子を内皮細胞単層の頂端表面に適用した。細胞を、０−２２時間の培養後に銀増感ＴＥＭにより調査した。初期実験を、一次ヒト脳内皮（継代−１）または脳内皮細胞系ｈＣＭＥＣ／Ｄ３を用いて実施した。結果から、３−８時間では、多数のナノ粒子が、基底細胞膜と支持膜上のコラーゲンマトリクスの間に存在したことが示された（図１）。この時点では、ナノ粒子はまたサイトゾル内に存在したが、小胞または核内、または細胞間結合内にはほとんど粒子はなかった。ナノ粒子のサイトゾル内での存在および細胞間結合からなくなることは、それらが直接、経細胞輸送により細胞を通過し、傍細胞移動により基底膜に到達したのではないことを示唆した。

内皮内での異なる組織からの輸送速度を決定するために、我々は２つの脳内皮を初代冠動脈内皮および骨髄内皮細胞系ＢＭＥＣ（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞と同様に不死化させた）と比較した。ナノ粒子が内皮を通過する速度を、基底細胞膜の真下に存在するナノ粒子の数をカウントすることにより決定した。脳内皮細胞系および初代脳内皮の経細胞輸送は、８時間にわたりおよそ直線であった（図２ａ）。その上、２つの脳内皮系を横切る移動は、脳ではない細胞系を横切るよりもかなり速かった（図２ｅ）。

追加の対照として、我々は、非内皮細胞型、ヒト線維芽細胞を使用し、これらにおいては、５時間にわたって、上記と同じ実験設定を使用して、ナノ粒子の移動速度を測定した。線維芽細胞の下部膜への移動速度は、初代脳内皮を横切る移動速度の＜３％であった。

内皮を通過する適用したナノ粒子のパーセンテージを推定するために、我々はｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の２つのフィルタを横切るストリップ中の細胞結合ナノ粒子の全てをカウントし（＞１８，０００ＮＰ）、計算すると、７×１０^９ナノ粒子がフィルタの全領域において検出可能である。我々は、４．４×１０^１０ナノ粒子を各フィルタに適用しており（２ｎｇ）、よって、これは、適用したナノ粒子の約１６％を表すと推定した。これは最小数字であることに注意すべきである。というのも、システム内での損失、またはナノ粒子のいくらかがＴＥＭにより検出されなかったことを考慮していないからである。これらのフィルタ上のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞のコンフルエント単層は、典型的には約１０^５の細胞を含み、そのため、取り込みは＞７×１０^４ナノ粒子／細胞となる。

ナノ粒子をインビボで、または脳内皮上でインビトロで使用した他の研究では、粒子は主に小胞に限局された（１６−１８）。しかしながら、これらの研究は一般にずっと大きなナノ粒子を使用した。そのため、我々は、ナノ粒子が内皮を通過するメカニズムを理解するために、細胞内局在化のより注意深い分析に取り組んだ。我々は、サイトゾル、小胞（すなわちエンドソームおよびミトコンドリアを除く任意の他の膜結合構造）、核内で見られる粒子および、頂端および基底細胞膜と結合した粒子の数を定量化した。ナノ粒子は時折しか、細胞間結合（図３ａ）または細胞核内で見られなかったことが注目すべきであった。３−８時間には、全ての内皮細胞上で、細胞内ナノ粒子の大半はサイトゾル内で見られ、より少ない割合が小胞内で見られた（図３ｂ）。我々は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の小胞内で、２２時間にナノ粒子を観察した（データ示さず）が、この時点では、粒子は凝集塊であり、基底膜にはほとんどなかった。よって、初期段階では（３−８時間）、ナノ粒子は非小胞経細胞輸送により内皮を通過すると考えられたが、最後の時間点（２２時間）では、これらは凝集し、その後、エンドソーム内に存在した。

ナノ粒子がどのように細胞を横切って移動するかをさらに研究するため、実験を３時間、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を使用して、エンドサイトーシスおよび／または小胞輸送を妨害する抗生物質−サイトカラシン−Ｂ（グルコース輸送）、クロルプロマジン（クラスリンコート小胞）、ノコダゾール（微小管）、サイトカラシン−Ｄ（マイクロフィラメント）およびナイスタチン（カベオラおよび脂質ラフト）の存在下で実施した。理論的には、ナノ粒子が特定の細胞系により輸送される場合、そうすると、抗生物質処理は経細胞輸送をブロックするはずである。（予備実験により、使用された抗生物質用量は、５時間までは細胞に毒性はなかったことが確認された）。結果から、３時間では、処理のいずれも、ナノ粒子経細胞輸送の速度を低減させなかったことが示された（図４）。よって、ナノ粒子の細胞膜を横切る輸送に対する１つの可能なメカニズムは受動的拡散によるものである。これが正しければ、これらのナノ粒子は、小胞によってではなく、サイトゾルを介して透過するという観察と一致するであろう。

頂端および基底細胞膜は親水性分子の自由拡散を制限するので、我々は、膜流動性の変化は、経細胞輸送速度に影響すると判断した。膜流動性が経細胞輸送速度に影響するかどうかを決定するために、我々は細胞を３７℃および３０℃、流動性を低減させる温度で比較した（図５）。３０℃では、経細胞輸送は、３７℃の速度の＜２０％であった。この結果は、確定的ではないことを示す。というのも、低減された温度もまた、他の関連する代謝過程に影響する可能性があるからである。興味深いことに、細胞内コンパートメント間でのナノ粒子の細胞内分布はより低い温度では不変であったが、これは、受動的プロセスを示唆する。また、温度を低減させると、経細胞輸送（下部膜）において非常に実質的な減少が引き起こされることが顕著であり、これはおそらく、ナノ粒子が２つの細胞膜を透過しなければならないからである。

グルコースコートナノ粒子の使用のための元の理論的根拠は、これらがＧｌｕｔ−１トランスポーターに運搬され得るということであった。しかしながら、サイトカラシン−Ｂによる取り込みのブロックの失敗により（図４）、この受容体を介する能動輸送が起こっていなかったことが示唆された。コーティングの役割を研究するために、我々は、グルコースコート、およびグルタチオンコート４ｎｍナノ粒子のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を横切る経細胞輸送速度を比較した（図６）。サイズ依存に対する追加の対照として、３０ｎｍコロイド金ナノ粒子もまた試験した。グルコースコート粒子はグルタチオンコートナノ粒子よりも効果的に経細胞輸送され、４ｎｍナノ粒子はどちらも、３０ｎｍコロイドナノ粒子よりも有効であった。この結果により、そのサイズ、リガンドおよび電荷を含むナノ粒子の特性は全て、移動の有効性に寄与することが示唆される。

プロジェクトの究極の目的は、ナノ粒子が血液脳関門を通過する担体として機能し、グリア細胞を標的にすることができるかどうかを決定することであった。初期実験では、我々は、ナノ粒子が内皮の基底細胞膜とインサートの膜の間に蓄積したことに注目した。その上、ナノ粒子はまた、フィルタ中の細孔（２２０ｎｍ）を移動することが観察され（図３ａを参照されたい）、これにより、それらは内皮により放出させることができ、潜在的に間質腔に入ることができることが示された。

ナノ粒子の、グリア細胞を標的にする可能性を評価するために、我々は新規共培養系を使用し、この場合、ヒトアストロサイトを３Ｄコラーゲンゲル中で培養し、脳内皮の単層を上に置いた（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）。予備実験（ＴＥＭ）により、ナノ粒子はゲルマトリクスを自由に通過し、アストロサイトに入ることができることが確認された（図７ａ）。ナノ粒子をその後、共培養下の内皮に適用し、アストロサイトにおける蓄積速度を、１−８時間にわたって測定した。ナノ粒子を含む少なくとも５０のアストロサイトを含むように十分な数の細胞から観察を実施した（図７ｂ）。８時間の時間経過にわたって、検出可能なナノ粒子を有するアストロサイトのパーセンテージが漸進的に増加した（表１）。

３Ｄゲルマトリクス内では、ナノ粒子を含むアストロサイトは内皮単層から異なる深さで配置され、１−３時間にわたる、より深くのアストロサイトまでのナノ粒子の拡散を検出することができたが、検出された粒子の数／細胞は常に同様であった（表１）。圧縮されたゲルの厚さは４０−６０μｍである。よって、３時間での内皮からのナノ粒子の中央距離は１６．７μｍであったという観察により、ナノ粒子は、この時間までに、全ゲル深さを透過することができることが示唆される。これらの観察は、８０ｎｍの厚さの切片に基づき、平均３．７５のナノ粒子／細胞を８時間で検出したので、我々は、８０μｍまでの深さまでに存在し得る単一のアストロサイトは、数百のナノ粒子を含むことができるであろうことを推論する。よって、４ｎｍグルコースコートナノ粒子は、脳内皮による選択的取り込みおよび経細胞輸送に対し、治療薬のアストロサイトへの送達のための担体としての大きな可能性を示す。

考察
薬物のＣＮＳの細胞への標的送達は、多くの疾患の治療における主な障害である。金ナノ粒子は血液脳関門を横切る治療薬の担体としてかなりの可能性を有する。というのも、それらは、免疫原性ではなく、より小さなナノ粒子（３−５ｎｍ）は高い用量を除き細胞傷害性ではないからである（２７、２８、２９）。ここで、我々は、４ｎｍグルコースコート金ナノ粒子は、内皮細胞に対して検出可能なダメージなしで脳内皮を通過することができることを示す（３３）。

この研究では、グルコースコートナノ粒子を、それらの、脳内皮およびアストロサイト上のグルコース受容体、Ｇｌｕｔ−１に結合する能力のために、選択した。これらのナノ粒子が選択的に脳内皮により輸送されたという所見（図２）は、最初、取り込みまたは経細胞輸送はリガンド依存性であったという見解を支持した。しかしながら、経細胞輸送は、輸送を妨害する抗生物質によブロックされず（図４）、培地中のグルコースの濃度を変化させても、経細胞輸送に影響しなかった（データ示さず）。よって、経細胞輸送は、グルコーストランスポーター系に依存せず、グルコースコーティングの物理的配置により、ｇｌｕｔ−１受容体に係合することができる可能性が少なくなると考えられる。代案として、内皮への初期付着はナノ粒子および細胞の生物物理的性質に依存することもあり得る。この点において、脳内皮の多糖外被は高シアル酸付加されており、他の組織中の内皮とはかなり異なり（３０）、これにより、脳内皮による選択的取り込みが説明され得ることが知られている。ナノ粒子のサイズおよび組成もまた重要である可能性がある。我々は、３０ｎｍナノ粒子およびグルタチオンコート４ｎｍ金ナノ粒子はどちらも内皮を通過するのに著しく効率的ではないことを見出した（図６）。

他の研究により、ナノ粒子の経細胞輸送は、４℃での細胞中へのナノ粒子の取り込みの減少のために、能動プロセスであることが示された（３１）。実際、１つの実験では（データ示さず）、我々はまた、４℃では経細胞輸送は起こらなかったことを見出した。しかしながら、これらの研究は、我々が提案する細胞膜の流動性を考慮に入れておらず、これは、小さなナノ粒子の膜貫通移動を制御する重量な因子であり得る。

我々は静置インビトロ培養を使用していたので、我々は、ウェルの縁周りの拡散または沈降が考慮されるべきである可能性を考えた。しかしながら、１５ｎｍ未満の小さなサイズの金ナノ粒子の場合、これらの効果は無視でき、輸送メカニズムに影響を有さないはずである（３２）。細胞間結合中にナノ粒子がないことはまた、それらが内皮を通過する傍細胞経路を使用しないことを確認する。

共培養物においては、我々は、培養物の縁を取り巻くゲル中へのナノ粒子の受動的拡散のアイデアを完全に否定することができない。しかしながら、ナノ粒子の数は実質的に、内皮単層から１−３時間にわたって移動される距離と共に増加する（表１）ので、これは、内皮の基底層からゲルマトリクス中へ、そこからアストロサイト中へのナノ粒子の移動により、最も容易に説明される。

ナノ粒子の局在化は最も興味深いデータを提供した。ナノ粒子は内皮の核内では滅多に見られなかったが、単一細胞培養物または共培養物のいずれかおいて、アストロサイトの核内で一般的であったことが顕著であった（図７）。ナノ粒子の表面コーティングの変化が長期間の共培養中に起こることが可能であり、または粒子が内皮を通過するので、これは、それらがその後、アストロサイト核に局在する傾向があることを意味する。現在のところ、細胞内局在化におけるこの差の理由ははっきりしていない。メカニズムに関係なく、治療カーゴをＣＮＳの細胞に送達するために使用されるべきである場合、ナノ粒子が内皮にトラップされないことが重要である。

経細胞輸送されたナノ粒子の数はまた、重要な留意事項である。我々の計算により、＞７０，０００のナノ粒子が各内皮細胞を通過し、数百が各アストロサイト内に蓄積することが示唆される。よって、それらは、プロセスが、同様のレベルでインビボにおいて起こるようにすることができる場合、有効な用量の毒物、受容体アゴニストまたは遺伝子を標的細胞まで運搬する可能性がある。要するに、４ｎｍグルコースコート金ナノ粒子は脳内皮に選択的であり、ＣＮＳ中の細胞を標的にする治療薬の送達の大きな可能性を有する。

実施例３−ＣＮＳへの作用物質の送達
作用物質（小分子薬物、標識および／または生物学的作用物質、例えばペプチドまたは核酸を含む）は、本明細書で規定されるナノ粒子に、本質的に任意の好適な技術を使用して結合させることができる。作用物質はナノ粒子のコアに共有結合により結合させることができ、またはナノ粒子のコロナと結合相互作用を形成することができる。特に、標識、例えばＭＲＩ造影剤、例えばランタニドは、ナノ粒子コアに付着されたリガンドとして存在する炭水化物基により複合体化され得る（例えば、ＷＯ２００４／１０８１６５号の実施例３を参照されたい、その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）。その代わりに、または加えて、１つ以上のペプチドまたはタンパク質（例えば、サイトカイン、抗体またはニューロペプチドを含む）は、非共有結合により、ナノ粒子のコロナに結合させることができる（例えば、ＷＯ２０１１／１５４７１１号の実施例３を参照されたい、その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）。その代わりに、または加えて、核酸、例えばｓｉＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメントは、ナノ粒子のコアに、核酸ストランドの３’または５’末端での核酸のチオール誘導体化により、共有結合により結合され得る（例えば、ＷＯ２００５／１１６２２６号、特にその実施例を参照されたい、その全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で規定されるナノ粒子を使用する作用物質のＣＮＳへの送達は、実施例２で詳細に記載される血液脳関門のモデルを使用して評価することができる。場合によっては、対象となる作用物質のＣＮＳ細胞、例えばアストロサイトへの成功した送達の評価は、標的細胞中の作用物質（任意で、ナノ粒子と一緒）の存在を物理的に同定すること、および／または、前記作用物質の標的細胞に対する効果の機能アッセイを実施することを含み得る。例として、作用物質が特定の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡを含む場合、好適な機能アッセイは、標的ＣＮＳ細胞における前記遺伝子の発現の評価を含み得る。好ましくは、１つ以上の対照、例えば作用物質がない場合のナノ粒子および／またはナノ粒子がない場合の作用物質は、血液脳関門モデル系に接触させられ、これにより、選択した作用物質のカーゴを有するナノ粒子の存在および／または効果が評価される基準が提供される。

実施例４−ナノ粒子コーティングおよび脳内皮を横切る移動
本研究は下記目的を研究するために設定された：
・様々な表面コーティングを有する金ナノ粒子がヒト脳内皮を透過するかどうかを決定するため。
・輸送が脳内皮に対して選択的となることができるかどうかを決定するため。
・移動の可能なメカニズムを研究し、送達系を最適化するため。
・ナノ粒子が、内皮を横切る移動後にグリア細胞を標的することができるかどうかを決定するため。

この目的を達成するために、下記リガンド種の１つ以上を含むコロナを有するナノ粒子を、本質的に実施例１で記載されるように合成した：
・Ｃ２−グルコース
・Ｃ５−グルコース
・Ｃ１１−グルコース
・マルトース
・ラクトース
・ガラクトース
・ガラクトサミン
・グルタチオン
ナノ粒子の移動速度は、ナノ粒子コロナ（すなわち、コーティング）の組成によって変動することが見出され、変動は、ナノ粒子のバッチ間で見られた（図８を参照されたい）。特に基底膜下で、８時間に検出されるナノ粒子の数を、各ナノ粒子リガンド種に対して、対照に指定されるＣ２−グルコース−１のパーセンテージとして（すなわち、Ｃ２リンカーと共にグルコースリガンドコロナを有するナノ粒子の最初のバッチ）プロットする。Ｃ１１−グルコースおよび第３のバッチのグルコース（Ｃ２−グルコース−３）は対照移動速度よりも大きいことが明らかである。

ガラクトサミン−ＮＰ（すなわち、ガラクトサミンリガンドのコロナを有するナノ粒子）は、図９に示されるように、フィルタに強く結合することもまた、見出された。

Ｃ２−グルコースナノ粒子の総経内皮移動の測定を図１０に示す（分光法により分析される）。値を下記表に示す：

ナノ粒子輸送に対する多糖外被の効果を、その後研究した。多糖外被の除去は、内皮（ｅｎｔｈｏｔｈｅｌｉｕｍ）細胞を、ヘパリナーゼ（ｈｅｐａｒｉｎｉｓｅ）、コンドロイチナーゼまたはノイラミニダーゼによる酵素前処理に供することにより達成し、その後、基底膜にてナノ粒子の適用後８時間で１ミクロンにつき検出されたナノ粒子の数を測定した（図１１を参照されたい）。多糖外被の除去は、ナノ粒子の輸送を阻害し、コンドロイチナーゼ前処理は統計的に有意であることが明らかである（^＊＊＊を参照されたい）。

図１２は、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞により取り込まれたインスリンコートナノ粒子（８つのインスリンおよび亜鉛）を示す。２ｎｇ／ｃｍ^２のナノ粒子を３時間適用した。インスリンコートナノ粒子は、主として小胞により、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を横切って迅速に移動することが見出された（図１３および１４Ａおよび１４Ｂを参照されたい）。

アストロサイト内でのＣ２−グルコースナノ粒子の局在化を研究した。図１５Ａは１、３および８時間での、ナノ粒子陽性のアストロサイトのパーセンテージを示す。図１５Ｂは、１、３および８時間での、ナノ粒子の、内皮からの、ミクロンで表した平均距離を示す（最大距離を挿入図に示す）。

様々なナノ粒子コロナ組成物（Ｃ２−グルコース、インスリンまたはガラクトサミンコーティング）に対する金ナノ粒子取り込みを、２Ｄアストロサイト培養物および３Ｄ共培養アストロサイト中で研究した（それぞれ、図１６Ａおよび１６Ｂを参照されたい）。サイトゾル、小胞および核中への取り込みが示され、ナノ粒子／細胞で測定した。

図１７は内皮およびアストロサイトに対するフィルタ上のナノ粒子の位置（縁または中央）を示す。内皮およびアストロサイトの両方におけるナノ粒子の数は、縁よりもフィルタの中央で高かったが、この差は、統計的に有意であるとは見られなかった（ｐ＞０．０５）。

図１８はアストロサイト／Ｄ３共培養におけるナノ粒子を研究した結果を示す。Ａ）１、３および８時間での、ナノ粒子に対して陽性のアストロサイトのパーセンテージ。Ｂ）１、３および８時間での、ミクロンで表された、内皮からの見出されたナノ粒子の距離。Ｃ）１、３および８時間でのナノ粒子の数／細胞。１、３および８時間での、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で観察された細胞の数を、図１８への挿入図で示す。

図１９はグルコース−ＮＰの取り込みの時間経過を研究した結果を示す。Ａ）時間に伴う上部膜中の粒子／細胞。Ｂ）時間に伴う細胞内領域中の粒子／細胞。Ｃ）時間に伴う下部膜中の粒子／細胞。Ｄ）時間に伴う小胞中の粒子／細胞。

内皮密度のナノ粒子移動に対する影響の可能性に対する研究を実施した。図２０Ａおよび２０Ｂに示されるように、内皮密度は、ナノ粒子移動に影響しない。

結論
グルコースコートナノ粒子は、脳内皮に対して選択的であることが見出された。７０，０００までのナノ粒子が各内皮細胞を８時間の期間で通過する。ナノ粒子は１０−２０μｍ／時間で移動し、４００を超えるナノ粒子がアストロサイトに到達する。

ガラクトサミンおよびグルタチオンナノ粒子もまた効率的に通過する。グルコースコート−ＮＰの移動は主としてサイトゾルを横切る。多糖外被の除去または温度の低減により、サイトゾル移動が低減する。

インスリンコートＮＰは、内皮を通過する迅速な小胞経細胞輸送を使用すると考えられる。これらはまた、アストロサイトにより取り込まれ得る。任意の特定の理論に縛られることは望まないが、本発明者らは、インスリンをＣＮＳに本明細書で記載されるナノ粒子を介して送達させる能力は、著しい医学的な可能性を有することを企図する。というのも、望まれない低血糖（例えば、インスリンの末梢効果による）の回避は減少され、または防止され得るからである。

本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体が、あらゆる目的のために、各々、個々の刊行物または特許または特許出願が特定的におよび個々にその全体が参照により組み込まれるように示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で記載される特定の実施形態は例として提供され、決して限定するものではない。本明細書におけるいずれのサブタイトルも便宜上含まれるにすぎず、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (51)

1. （ａ）（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
   （ｉｉ）共有結合により前記コアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ
   を含むナノ粒子；ならびに
   （ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質
   を含む、少なくとも１つの作用物質を哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法において使用するためのナノ粒子組成物。
2. 前記方法は前記被験体のＣＮＳ障害の治療方法である、請求項１に記載される使用のためのナノ粒子組成物。
3. 前記方法は前記被験体のＣＮＳのイメージングの診断または予後方法である、請求項１に記載される使用のためのナノ粒子組成物。
4. 組成物を被験体に投与することを含む、少なくとも１つの作用物質を哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための方法であって、前記組成物は、
   （ａ）（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
   （ｉｉ）共有結合により前記コアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ
   を含むナノ粒子；ならびに
   （ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質
   を含む、方法。
5. 前記被験体のＣＮＳ障害の治療方法である、請求項４に記載の方法。
6. 前記被験体のＣＮＳのイメージングの診断または予後方法である、請求項４に記載の方法。
7. 哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される薬剤の調製における組成物の使用であって、前記組成物は
   （ａ）（ｉ）金属および／または半導体を含むコア；
   （ｉｉ）共有結合により前記コアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ；
   を含むナノ粒子；ならびに
   （ｂ）ＣＮＳに送達される少なくとも１つの作用物質
   を含む、使用。
8. 前記薬剤は哺乳類被験体のＣＮＳ障害の治療のためのものである、請求項７に記載の使用。
9. 前記薬剤は前記被験体のＣＮＳの診断または予後イメージングのためのものである、請求項７に記載の使用。
10. 組成物は、非中枢経路により投与され、または、非中枢経路による投与のためのものであり、よって前記少なくとも１つの作用物質は、前記ナノ粒子との会合により血液脳関門を横切ってＣＮＳに送達される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法、または請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記組成物は、脳内、くも膜下腔内または硬膜外経路以外により投与されるか、またはこれらによる投与のためのものである、請求項１０に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
12. 前記組成物は下記からなる群より選択される経路により投与され、または下記からなる群による投与のためのものである、請求項１０に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用：
    静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射もしくは注入；
    経腸；
    頬側；
    口唇下；
    舌下；
    吸入；
    粘膜；
    泌尿生殖器；
    直腸；
    皮膚；ならびに
    皮内。
13. 前記ナノ粒子組成物のＣＮＳへの送達は、前記ナノ粒子および前記少なくとも１つの作用物質の前記被験体の脳内皮を横切る経細胞輸送を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
14. 前記被験体は障害性血液脳関門を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
15. 前記被験体は、病状がない場合に比べ、血液脳関門をより透過性とする病状を患う、請求項１４に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
16. 前記被験体は実質的に機能的血液脳関門を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
17. 前記被験体は血液脳関門の透過性の上昇を引き起こす病状を有さない、請求項１６に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
18. 前記被験体はヒトである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
19. 前記ＣＮＳへの送達のための少なくとも１つの作用物質は、前記被験体に対して達成されるべき望ましい治療、予防、診断または予後効果に従い選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
20. 前記被験体はＣＮＳ病状を有し、前記少なくとも１つの作用物質は前記ＣＮＳ病状に対して少なくとも１つの治療効果を示す、請求項１９に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
21. 前記少なくとも１つの作用物質は、小分子薬物、核酸、ペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
22. 前記少なくとも１つの作用物質は、下記からなる群より選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用：インスリン、ロプラゾラム、ロルメタゼパム，テマゼパム；ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロン；クロメチアゾール；プロメタジン；メラトニン；ブスピロン；クロルプロマジン塩酸塩、ハロペリドール、ペルフェナジン、プロクロルペラジンマレイン酸塩またはメシル酸塩、プロマジン塩酸塩、トリフロペラジン；クロザピン、オランザピン、クエチアピン、リスペリドン、カルバマゼピンおよびバルプロ酸ナトリウム；アミトリプチリン塩酸塩、クロミプラミン塩酸塩、イミプラミン塩酸塩；ミアンセリン塩酸塩；フェネルジン、モクロベミド；シタロプラム、フルオキセチン、セルトラリン；アゴメラチン、フルペンチキソール、トリプトファン、ベンラファキシン；アトモキセチン、メチルフェニデート塩酸塩、モダフィニル；シクリジン塩酸塩、クロルプロマジン、ドロペリドール、プロクロルペラジンマレイン酸塩、メトクロプラミド塩酸塩、オンダンセトロン、パロノセトロン、ホスアプレピタント、ナビロン、ベタヒスチン二塩酸塩；ネホパム塩酸塩；ブプレノルフィン；ジアモルヒネ塩酸塩、フェンタニル、メプタジノール、トラマドール塩酸塩；カプサイシン；トルフェナム酸，ゾルミトリプタン、ピゾチフェン、クロニジン；エベロリムス、テモゾロミド、カルムスチン；グラチラマー酢酸塩およびフィンゴリモド。
23. 前記被験体は下記からなる群より選択されるＣＮＳ障害を患う請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用：ＣＮＳの腫瘍；神経変性疾患；脳卒中；神経障害；ＣＮＳの感染；ＣＮＳの免疫障害；精神障害；ＣＮＳに影響する遺伝子異常；外傷性脳損傷；昏睡；ならびに発達または学習障害。
24. ナノ粒子との会合により、血液脳関門を横切って、哺乳類被験体の中枢神経系に送達され得る作用物質を同定するためのインビトロスクリーニング法であって、
    任意でアストロサイトと共培養させた、細胞培養内皮を提供すること；
    前記内皮を、少なくとも１つの候補作用物質を会合させたナノ粒子と接触させること；ならびに
    前記候補作用物質が、前記ナノ粒子により前記内皮を横切って送達されるかどうかを同定すること
    を含み、
    前記ナノ粒子は、
    （ｉ）金属および／または半導体を含むコア；ならびに
    （ｉｉ）共有結合により前記コアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ
    を含む、方法。
25. 前記候補作用物質が内皮を横切って送達されるかどうかを同定する工程は、前記ナノ粒子の前記内皮を横切る経細胞輸送を定量することを含む、請求項２４に記載の方法。
26. ナノ粒子との会合により、血液脳関門を横切って、哺乳類被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達され得る作用物質を同定するためのインビボスクリーニング法であって、
    非ヒト哺乳類試験被験体に非中枢投与経路により少なくとも１つの候補作用物質を会合させたナノ粒子を含む組成物を投与すること；ならびに
    前記候補作用物質が、血液脳関門を横切って前記試験被験体のＣＮＳに送達されるかどうかを同定すること
    を含み、
    前記ナノ粒子は、
    （ｉ）金属および／または半導体を含むコア；ならびに
    （ｉｉ）共有結合により前記コアに結合された複数のリガンドを含むコロナであって、前記リガンドは炭水化物、インスリンおよび／またはグルタチオンを含む、コロナ
    を含む、方法。
27. 前記候補作用物質が、血液脳関門を横切って前記試験被験体のＣＮＳに送達されるかどうかを同定する工程は、前記被験体の脳における前記ナノ粒子および／または前記候補作用物質の存在を検出すること、および／または、その量または効果を定量することを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ナノ粒子および／または前記候補作用物質は、前記被験体の脳の少なくとも１つのアストロサイトにおいて検出される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記少なくとも１つの作用物質は前記ナノ粒子に結合される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
30. 前記少なくとも１つの作用物質は、前記ナノ粒子のコアに直接、またはリンカーを介して共有結合により付着される、請求項２９に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
31. 前記少なくとも１つの作用物質は、前記ナノ粒子のコロナに可逆的に結合される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
32. 前記少なくとも１つの作用物質は、前記ナノ粒子のコロナに非共有結合により結合される、請求項３１に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
33. 前記ナノ粒子は前記作用物質の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００またはそれ以上の実体と会合されている、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
34. 前記少なくとも１つの作用物質は２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる種の作用物質を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
35. 前記ナノ粒子の前記リガンドは、前記ナノ粒子のコアにリンカーを介して共有結合により結合される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
36. 前記リンカーはＣ２−Ｃ１５アルキルおよび／またはＣ２−Ｃ１５グリコール基を含む、請求項３５に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
37. 前記リンカーはチオエチル基またはチオプロピル基を含む、請求項３６に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
38. 前記ナノ粒子のリガンドは、硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸塩含有基または酸素含有基を介して、前記コアに共有結合により結合される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
39. 前記リガンドは、単糖または二糖である炭水化物を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
40. 前記炭水化物はグルコース、αガラクトース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含む、請求項３９に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
41. 前記リガンドは共有結合によりチオール硫黄原子を介して前記コアに付着された、２’−チオエチル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたは２’−チオエチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む、請求項３９に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
42. 前記リガンドは、グルタチオンを単独で、または他の種のリガンドと共に含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
43. 前記リガンドはグルタチオンおよびグルコースを含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
44. 前記ナノ粒子は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０または少なくとも５０の炭水化物含有リガンド、インスリンリガンドおよび／またはグルタチオンリガンドを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
45. 前記ナノ粒子のコアの直径は、１ｎｍ〜５ｎｍの範囲である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
46. そのリガンドを含む前記ナノ粒子の直径は、２ｎｍ〜２０ｎｍ、３ｎｍ〜１５ｎｍまたは４ｎｍ〜５ｎｍの範囲である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
47. 前記ナノ粒子のコアは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、ＧｄおよびＺｎ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される金属を含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
48. 前記ナノ粒子のコアは磁性である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
49. 前記コアは半導体を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
50. 前記半導体は、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、カドミウムテルルおよび硫化亜鉛からなる群より選択される、請求項４９に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。
51. 前記ナノ粒子のコアは量子ドットとして機能することができる、請求項４９または請求項５０に記載の使用のためのナノ粒子組成物、方法または使用。

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