KR20160011618A - 나노입자 펩타이드 조성물 - Google Patents

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미다테크 리미티드
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Abstract

본 발명은, 특히 약물에서 이용하기 위한 아밀린 펩타이드-보유 나노입자에 관한 것으로, 예컨대, 혈당 조절 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 나노입자 조성물은 금속 및/또는 반도체를 포함하는 코어와; 코어에 공유 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나(여기서 상기 리간드는 글루타티온을 포함함)를 포함하는 나노입자; 및 코로나에 비공유 결합되는 적어도 하나의 아밀린 펩타이드를 포함한다.

Description

나노입자 펩타이드 조성물{NANOPARTICLE PEPTIDE COMPOSITIONS}
본 발명은, 특히 약물에서 이용하기 위한 펩타이드-보유 나노입자에 관한 것으로, 예컨대, 혈당 조절 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 조성물 및 생성물, 그리고 포유동물, 특히 인간의 치료를 위한 것을 포함하는 이러한 조성물 및 생성물을 제조하는 방법 및 투여하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드 등과 같은 생활성 제제는 빈번하게 불량한 안정성, 특히 열안정성에 시달려, 제제가 제조, 가공처리, 보존 및/또는 전달 동안 겪게 되는 조건을 제한할 수 있다. 예를 들어, 아밀린, GLP-1 및 인슐린은, 예컨대, 제1형 및 제2형 당뇨병의 조절 및 치료에서의 용도를 발견하고 있다. 인간 이용을 위한 펩타이드의 의학 제제는 일반적으로 1종 이상의 보존제 및/또는 안정제와 함께 제형화된다. 게다가 제한된 위장 안정성은 전형적으로 생활성 펩타이드의 유효한 경구 투여에 대한 장벽을 제공한다.
WO 2011/154711은 탄수화물 코로나에 의해 둘러싸인 금 코어를 갖고 인슐린 등과 같은 펩타이드용의 담체로서 작용하는 당나노입자를 기술한다.
아밀린을 비롯한 생활성 펩타이드를 보유 및/또는 안정화시킬 수 있는 추가의 나노입자 조성물, 그리고 이러한 생활성 펩타이드를 대상체에게 전달하는 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 남아 있다.
본 발명은 이들 및 기타 요구를 해소하는 것이다.
넓게는, 본 발명은 아밀린 펩타이드-보유 나노입자 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 나노입자가 아밀린 펩타이드에 결합하는 것(몇몇 경우에 그 결합능력은 나노입자 당 대략 50개의 아밀린 펩타이드 분자임)을 발견하였다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 나노입자는 아밀린 치료적 처치를 필요로 하는 대상체에 대한 아밀린의 전달 및 제형용의 담체를 제공한다.
따라서, 제1 양상에 있어서, 본 발명은, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 나노입자 조성물을 제공한다:
(a) 나노입자로서,
(i) 금속 및/또는 반도체를 포함하는 코어;
(ii) 상기 코어에 공유 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나(여기서 상기 리간드는 글루타티온을 포함함)를 포함하는, 상기 나노입자; 및
(b) 상기 코로나에 비공유 결합되는 적어도 하나의 아밀린 펩타이드.
본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 아밀린 펩타이드는 천연 아밀린 펩타이드, 예컨대, 인간 아밀린 혹은 래트 아밀린, 또는 아밀린 유사체를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 아밀린 펩타이드는 서열번호 2로서 기재된 전장 아미노산 서열에 대해서 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 경우에, 아밀린 펩타이드는 전장 아미노산 서열 KCNTATCATQRLANFLPHSSNNFGAILSSTN(서열번호 2)을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 경우에, 아밀린 펩타이드는 서열번호 4로서 이하에 기재된 인간 아밀린의 전장 아미노산 서열에 대해서 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 4는, 서열번호 3으로서 이하에 기재되고 유닛프롯(UniProt) 등록번호 P10997(버전 131, 2012년 10월 3일자) 하에 개시된 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드의 완전한 89 아미노산 서열 중 잔기 34 내지 70의 서열이다.
>sp|P10997|IAPP_HUMAN Islet amyloid polypeptide OS=Homo sapiens GN=IAPP PE=1 SV=1
MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(밑줄로 표시된 서열번호 4를 가진 서열번호 3).
>sp|P10997|34-70
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(서열번호 4).
본 발명에 따른 소정의 경우에, 아밀린 펩타이드는 하기 (i) 내지 (vi)를 포함할 수 있거나 또는 하기 (i) 내지 (vi)로 이루어질 수 있다:
(i) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 서열에 대해서 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 해당 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(ii) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열을 포함하거나 해당 전장 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(iii) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열의 변이체 서열을 포함하거나 해당 변이체 서열로 이루어진 펩타이드(여기서 상기 변이체는 상기 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 상이함);
(iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 단편을 포함하거나 해당 단편으로 이루어진 펩타이드(여기서 상기 단편은 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산의 서열 길이를 가짐).
바람직하게는, 아밀린 펩타이드는 아밀린의 생물학적 활성을 발휘한다. 특히, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나의 상기 아밀린 펩타이드는 아밀린 활성의 시험관내 또는 생체내 생물학적 검정에서 서열번호 2의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50% 또는 서열번호 4의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50%를 발휘할 수 있다. 소정 경우에, 아밀린 활성은 식후 혈당 변동폭의 저감, 위 분비(예컨대, 위산, 췌장 효소 및 담즙 방출 중 적어도 하나의 분비)의 저해, 위 배출의 저해 및/또는 식후글루카곤 분비의 억제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자에는 코로나를 형성하는 다수의 리간드가 제공될 수 있는 것으로 판명되었다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 코로나는 코어당 적어도 5, 10, 20 또는 적어도 50개의 리간드, 예컨대, 코어당 약 10 내지 약 1000개의 리간드를 포함한다. 특히, 본 발명의 임의의 양상에 따른 나노입자 조성물은 코어당 적어도 5, 10, 20개 또는 적어도 50개의 글루타티온 리간드를 포함할 수 있다.
코어당 결합된 아밀린 펩타이드 분자의 개수는 특별히 제한되지 않는다. 소정의 적용분야를 위하여, 코어당 단지 1, 2, 3 또는 4개의 아밀린 펩타이드를 이용하는 것이 바람직할 수 있는 한편, 다른 경우에는 본 발명의 나노입자는 코어당 적어도 5, 10, 20개 또는 적어도 50개 이상의 결합된 아밀린 펩타이드 분자를 포함할 수도 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 적어도 하나의 아밀린 펩타이드는 가역적 방식으로 나노입자의 코로나에 결합될 수 있다. 특히, 아밀린 펩타이드는, 결합된 아밀린 펩타이드의 적어도 일분획이 나노입자를 생리적 용액과 접촉 시 나노입자로부터 방출되도록 코로나에 결합될 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 상기 리간드는 글루타티온을 단독으로 또는 다른 종의 리간드와 함께 포함하며, 예를 들어, 글루타티온과 탄수화물 리간드(글루코스-함유 리간드를 포함함)의 조합이 본 명세서에서 구체적으로 상정된다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 나노입자는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40 또는 적어도 50개의 리간드를 포함하되, 해당 리간드는 (i) 글루타티온 리간드; 또는 (ii) 글루타티온 리간드와 글루타티온 이외의 리간드, 예컨대, 탄수화물-함유 리간드 둘 다이다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 나노입자의 코어의 직경은 1㎚ 내지 5㎚ 범위 내이다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 나노입자의 리간드를 포함하는 해당 나노입자의 직경이 2㎚ 내지 50㎚, 선택적으로 3㎚ 내지 30㎚, 또는 4㎚ 내지 20㎚, 또는 5㎚ 내지 15㎚의 범위 내이다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 코어는 Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd 및 Zn, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함한다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 코어는 자성이다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 코어는 반도체를 포함한다. 반도체는 카드뮴 등과 같은 금속 원자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 반도체는 비금속 원자를 포함할 수 있다. 유기 반도체가 본 명세서에서 구체적으로 상정된다. 본 발명에 따른 바람직한 반도체는, 셀렌화카드뮴, 황화카드뮴, 카드뮴 텔루륨 및 황화아연으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 코어는 양자점으로서 작용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 양상에 따른 조성물은, 복수개, 예를 들어, 100, 1000, 100000개 이상의 상기 나노입자를 포함하되, 여기서 상기 조성물 중 나노입자의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 적어도 하나의 결합된 아밀린 펩타이드를 갖는다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 나노입자 조성물은 용액, 중합체, 분말 또는 크림 등과 같은 담체를 포함하되, 해당 담체에 나노입자 및 결합된 아밀린 펩타이드가 현탁된다. 조성물은 회합된 형태일 수 있거나 현탁액일 수 있거나 또는 단일의 패키지, 용기 또는 담체에 함께 수용될 수 있다. 소정 경우에, 조성물은 1회 이상의 용량의 형태(예컨대, 규정된 양의 아밀린 펩타이드 또는 아밀린 펩타이드 활성 단위), 예컨대, 치료 용량 또는 규정된 횟수의 용량의 형태를 취할 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 양상들 중 어느 하나에 따르면, 나노입자 조성물은 상기 코어 및/또는 상기 코로나에 비공유 또는 공유 결합되는 적어도 1종의 침투 촉진제를 더 포함한다. 2013년 2월 5일자로 출원된 공계류 중인 영국 특허 출원 제1301991.4호(그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 모든 목적을 위하여 명백히 편입됨), 및 2014년 2월 4일자로 출원된 공계류 중인 국제 출원 제PCT/GB2014/050301호(그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 모든 목적을 위하여 명백히 편입됨)에 기술된 바와 같이, 소정의 침투 촉진제는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아밀린 펩타이드 등과 같은 임의의 유의한 활성 펩타이드를 변위시키는 일 없이 나노입자에 유리하게 결합할 수 있다. 소정 경우에, 상기 침투 촉진제는 알킬-D-말토사이드 (예컨대, 테트라데실-D-말토사이드, 도데실-β-D-말토사이드, 헥실-β-D-말토사이드, 옥틸-β-D-말토사이드, 노닐-β-D-말토사이드, 데실-β-D-말토사이드, 운데실-β-D-말토사이드, 트라이데실-β-D-말토사이드 또는 헥사데실-β-D-말토사이드) 및 리살비산으로부터 선택된다. 소정 경우에, 상기 침투 촉진제, 예컨대, 테트라데실-D-말토사이드, 도데실-β-D-말토사이드 및/또는 리살비산은 상기 코로나에 비공유 결합된다.
제2 양상에 있어서, 본 발명은, 약물에서 이용하기 위한, 제1 양상에 따라 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 제공한다.
제3 양상에 있어서, 본 발명은, 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료 방법에 이용하기 위한, 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 제공한다.
제4 양상에 있어서, 본 발명은, 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료용의 의약의 제조에서의 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 제공한다.
제5 양상에 있어서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제6 양상에 있어서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 유효량의 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 내지 제6 양상 중 어느 하나의 양상에 따르면, 대상체는 인간, 반려 동물(예컨대, 개 또는 고양이), 실험실 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 비-인간 영장류), 가축 또는 농장 동물(예컨대, 돼지, 소, 말 또는 양)일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 발명의 제2 내지 제6 양상 중 어느 하나의 양상에 따르면, 대상체는 혈당 수준의 부적절한 조절을 유발하는 장애를 가질 수 있다. 특히, 당뇨병(제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 전당뇨병(prediabetes))을 가진 대상체가 본 명세서에서 구체적으로 상정된다. 대상체는 당뇨병으로 이미 진단받았거나 받지 않았을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 당뇨병을 발병할 위험이 있는 것으로 확인되었을 수 있다. 대상체는, 몇몇 경우에, 당뇨병의 치료 과정을 따르고 있을 수 있다. 특히, 대상체는 인슐린을 취하거나 또는 인슐린을 취하도록 권고받았을 수 있다.
본 발명의 제2 내지 제6 양상 중 어느 하나의 양상에 따르면, 나노입자 조성물은 혈당 조절을 위하여 1종 이상의 치료제와 함께(즉, 동시에, 개별적으로 또는 순차로) 투여될 수 있거나 또는 투여하기 위한 것일 수 있다. 특히, 나노입자 조성물은 인슐린 또는 그의 유사체, GLP-1 또는 그의 유사체, 위 저해 펩타이드(GIP) 또는 그의 유사체, 다이펩티딜 펩티다제-4(DPP-4) 저해제, 설포닐유레아, 메트포민, 알파-글루코시다제 저해제 및 티아졸리딘다이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 치료제와 함께 투여될 수 있거나 또는 투여하기 위한 것일 수 있다. 병용 요법은 본 발명의 나노입자 조성물의 치료 효과를 증대시키기 위하여 상당한 잠재성을 갖는다. 본 명세서에서 상정되는 구체적인 병용은, (i) 본 발명의 나노입자 조성물과 함께 인슐린 또는 그의 유사체; (ii) 본 발명의 나노입자 조성물과 함께 GLP-1 또는 그의 유사체; (iii) 본 발명의 나노입자 조성물과 함께 WO 2011/154711에 개시된 바와 같은 인슐린-보유 나노입자, (iv) 본 발명의 나노입자 조성물과 함께 WO 2011/154711에 개시된 바와 같은 GLP-1-보유 나노입자; 및 (v) 본 발명의 나노입자 조성물과 함께 인슐린 및 WO 2011/154711(예컨대, 그의 청구항 제48항 참조)에 개시된 바와 같은 GLP-1-보유 나노입자를 포함한다.
본 발명의 제2 내지 제6 양상 중 어느 하나의 양상에 따르면, 나노입자 조성물은 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있거나 투여하기 위한 것일 수 있다. 특별한 경우, 나노입자 조성물은 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 피부내(i.d.), 복강내 또는 피하(s.c.) 주사 또는 주입; 협측; 입술밑; 설하; 흡입에 의해; 하나 이상의 점막을 통해; 비뇨생식기; 직장; 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해서 투여될 수 있거나, 투여하기 위한 것일 수 있다.
제7 양상에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 제조 물품을 제공한다:
본 발명의 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물;
나노입자 조성물을 수용하는 용기; 및
삽입물 및/또는 라벨. 바람직하게는, 삽입물 및/또는 라벨은 포도당 조절 장애의 치료 방법에서 나노입자 조성물의 이용에 관한 설명서, 용량 및/또는 정보를 제공한다. 특히, 장애는 제I형 또는 제II형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병일 수 있다.
제8 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 양상에 따라서 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 제조하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
금속 및/또는 반도체를 포함하는 코어 및 코어에 공유 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나를 포함하는 나노입자를 제공하는 단계(여기서 상기 리간드는 글루타티온을 포함함); 및
적어도 1종의 아밀린 펩타이드를 나노입자의 상기 코로나에 결합시킬 수 있는 조건 하에서 나노입자를 적어도 1종의 아밀린 펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 경우에, 본 발명의 이 양상에 따르면, 상기 방법은 나노입자를 제조하는 초기 단계를 포함하되, 상기 초기 단계는, 글루타티온을 포함하는 용액을, 코어-형성 물질(예컨대, 염화금(III))을 포함하는 용액과 그리고 환원제(예컨대, 수소화붕소나트륨)와 배합시킴으로써 나노입자를 자기조립시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 조합이 명백히 허용될 수 없거나 분명히 회피되도록 명시된 곳을 제외하고 기술된 양상과 바람직한 특성의 조합을 포함한다. 이들 및 추가적인 양상과 본 발명의 실시형태는 이하에 더욱 상세히 그리고 수반되는 실시예 및 도면을 참조하여 기술된다.
도 1은 알파-갈락토스 리간드 및 아미노링커 리간드의 코로나를 가진 나노입자("Tox NP" - 삼각형)에 대한 그리고 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 나노입자("GSH NP" - 사각형)에 대한 Val(8)GLP-1 펩타이드의 결합을 도시하고 있다. GLP-1 펩타이드는 GSH NP에 비해서 Tox NP에 대해서 더 큰 결합을 나타낸다.
도 2는 알파-갈락토스 리간드 및 아미노링커 리간드의 코로나를 가진 나노입자("Tox NP" - 삼각형)에 대한 그리고 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 나노입자("GSH NP" - 사각형)에 대한 Val(8)GLP-1 펩타이드의 결합능력(나노입자 코어당 펩타이드의 분자)을 도시한다. GLP-1 펩타이드는 GSH NP(대략 10/NP)에 비해서 Tox NP에 대해서 더 큰 결합능력(대략 80/NP)을 나타낸다.
도 3은 알파-갈락토스 리간드 및 아미노링커 리간드의 코로나를 가진 나노입자("Tox NP" - 삼각형)에 대한 그리고 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 나노입자("GSH NP" - 사각형)에 대한 아밀린 펩타이드의 결합을 나타낸다. 아밀린 펩타이드는 Tox NP에 비해서 GSH NP에 대해서 더 큰 결합을 나타낸다.
도 4는 알파-갈락토스 리간드 및 아미노링커 리간드의 코로나를 가진 나노입자("Tox NP" - 삼각형)에 대한 그리고 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 나노입자("GSH NP" - 사각형)에 대한 아밀린 펩타이드의 결합능력(나노입자 코어당 펩타이드의 분자)을 도시한다. 아밀린 펩타이드는 Tox NP(본질적으로 제로 결합)에 비해서 GSH NP에 대해서 더 큰 결합능력(대략 50 내지 55/NP)을 나타낸다.
본 발명을 기술함에 있어서, 하기의 용어들이 사용될 것이며, 이하에 나타낸 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "나노입자"는 나노머 규모를 갖는 입자를 나타내며, 임의의 특정 형태의 제한을 수반하지 않는 것으로 의도된다. 특히, "나노입자"는 나노구, 나노튜브, 나노박스, 나노클러스터, 나노막대 등을 포함한다. 소정 실시형태에서 본 명세서에서 상정된 나노입자 및/또는 나노입자 코어는 대체로 다면체 또는 구형 기하학적 구조를 갖는다.
복수의 탄수화물-함유 리간드를 포함하는 나노입자는, 예를 들어, WO 2002/032404, WO 2004/108165, WO 2005/116226, WO 2006/037979, WO 2007/015105, WO 2007/122388, WO 2005/091704(각각의 전체 내용이 참고로 본 명세서에 명백히 편입됨)에 기술되어 있으며, 이러한 나노입자는 본 발명에 따라 용도를 발견할 수 있다. 게다가, 유기 화합물(예컨대, 티올-금 결합)과 함께 기능화된 산화철 페라이트(화학식 XFe2O4를 가짐, 식 중, X = Fe, Mn 또는 Co임)의 자성 코어를 포함하는 금-코팅된 나노입자는 EP2305310(전체 내용이 참고로 본 명세서에 명백히 편입됨)에 기술되어 있으며 본 명세서에 따른 나노입자들/나노입자 코어로서 사용하기 위해 구체적으로 상정된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "코로나"는 나노입자 코어의 노출된 표면을 부분적으로 또는 완전히 덮을 수 있는 층 또는 코팅을 지칭한다. 코로나는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티, 하나의 계면활성제 모이어티 및/또는 하나의 글루타티온 모이어티를 포함하는 복수의 리간드를 포함한다. 따라서, 코로나는 금속 코어를 둘러싸거나 부분적으로 둘러싸는 유기층인 것으로 고려될 수 있다. 소정 실시형태에서, 코로나는 나노입자의 코어를 부동태화시키는 것을 제공하고/하거나 이에 관여한다. 따라서, 소정 경우에, 코로나는 반도체 또는 금속-함유 코어를 실질적으로 안정화시키기 위해 충분히 완전한 코팅층을 포함할 수 있다. 그러나, 예컨대, 코어 표면을 단지 부분적으로 코팅하는 코로나를 포함할 수 있는 귀금속으로 코팅된 금속 산화물-함유 내부 코어를 포함하는 코어를 가진 소정 나노입자가 본 명세서에서 구체적으로 상정된다. 소정 경우에, 코로나는 본 발명의 나노입자의 수용성과 같은 가용성을 촉진한다.
나노입자
나노입자는 작은 입자, 예컨대, 리간드를 고정시키기 위한 기질로서 사용될 수 있는 금속 또는 반도체 원자의 클러스터이다.
바람직하게는, 나노입자는 평균 직경 0.5 내지 50㎚, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10㎚, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5㎚, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3㎚, 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 2.5㎚를 갖는 코어를 가진다. 코어 외에도 리간드가 고려되는 경우, 바람직하게는 입자의 전체 평균 직경은 2.0 내지 20㎚, 더욱 바람직하게는 3 내지 10㎚, 가장 바람직하게는 4 내지 5㎚이다. 평균 직경은 투과 전자 현미경과 같은 당해 분야에 잘 알려진 기술을 사용해서 측정될 수 있다.
코어 물질은 금속 또는 반도체(상기 반도체는 선택적으로 금속 원자를 포함하거나 유기 반도체임)일 수 있으며 하나보다 많은 유형의 원자로 형성될 수 있다. 바람직하게는, 코어 물질은 Au, Fe 또는 Cu로부터 선택된 금속이다. 나노입자 코어는 또한 Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd 및 Au/Fe/Cu/Gd를 포함하는 합금으로 형성될 수 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 코어 물질은 Au 및 Fe이고, 가장 바람직한 물질은 Au이다. 나노입자의 코어는 나노미터 범위에 코어 직경을 제공하기 위하여 약 100 내지 500개의 원자(예컨대, 금 원자)를 포함한다. 다른 특히 유용한 코어 물질은 NMR 활성인 하나 이상의 원자로 도핑(dope)되어, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 NMR을 사용해서 나노입자의 검출을 가능하게 한다. NMR 활성 원자의 예는 Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 및 란탄족 원소+3, 또는 본 명세서의 어느 부분에선가 기술된 양자점을 포함한다.
반도체 화합물을 포함하는 나노입자 코어는 양자점으로서 작용할 수 있는 나노미터 규모 반도체 결정으로서 검출될 수 있는데, 즉, 나노입자 코어는 광을 흡수하고, 이에 따라 물질 내의 전자를 더 높은 에너지 수준으로 여기시키며, 이후에 물질의 주파수 특징에서 광의 광자를 방출한다. 반도체 코어 물질의 예는 셀렌화카드뮴, 황화카드뮴, 카드뮴 텔루륨이다. 또한 황화아연과 같은 아연 화합물이 포함된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자의 코어는 자성일 수 있으며, 선택적으로 부동태 금속 원자(passive metal atom)와 함께 조합되는 자성 금속 원자를 포함할 수 있다. 예로써, 부동태 금속은 금, 백금, 은 또는 구리일 수 있으며, 자성 금속은 철 또는 가돌리늄일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 부동태 금속은 금이며 자성 금속은 철이다. 이 경우에, 코어 내의 부동태 금속 원자 대 자성 금속 원자의 비율은 약 5:0.1 내지 2:5이다. 더욱 바람직하게는 이 비율은 약 5:0.1 내지 약 5:1이다. 본 명세서에 이용되는 바와 같이, 용어 "부동태 금속"은 자성 특성을 보이지 않고 산화에 대해 화학적으로 안정적인 금속을 지칭한다. 부동태 금속은 반자성(diamagnetic) 또는 초상자성(superparamagnetic)일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 나노입자는 초상자성이다.
상자성(paramagnetic) 금속을 포함하는 코어를 가지는 나노입자의 예는, Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 및 란탄족 원소+3을 포함하는 것들을 포함한다.
MnFe(스피넬 페라이트) 또는 CoFe(코발트 페라이트)와 같은 물질로부터 형성될 수 있는 기타 자성 나노입자는 상기 정의된 바와 같은 추가의 코어 물질의 첨가 없이 또는 이의 첨가와 함께 나노입자(자성 유액)로 형성될 수 있다. 이러한 나노입자를 생성하기 위한 자기조립(self-assembly) 부착 화학의 예는 문헌 [Biotechnol. Prog., 19:1095-100 (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:9828-33 (2003), J. Colloid Interface Sci. 255:293-8 (2002)]에 부여되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노 입자 또는 그의 리간드는 검출가능한 표지를 포함한다. 이 표지는 나노입자 또는 리간드의 코어의 요소일 수 있다. 표지는 나노입자의 그 요소의 고유 특성 때문에 또는 검출가능한 추가의 모이어티에 결합, 접합 또는 연관되는 것에 의해 검출가능할 수 있다. 표지의 바람직한 예는 형광성 그룹, 방사성핵종, 자성 표지 또는 염료인 표지를 포함한다. 형광성 그룹은 플루오레세인, 로다민 또는 테트라메틸 로다민, 텍사스-레드(Texas-Red), Cy3, Cy5 등을 포함하며, 형광성 표지의 여기 및 라만 분산 분광법을 사용한 방출된 광의 검출에 의해서 검출될 수 있다(Y.C. Cao, R. Jin, C. A. Mirkin, Science 2002, 297: 1536-1539).
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 방사성핵종에 의해, 예컨대, PET, SPECT를 사용함으로써, 방출된 방사성활성을 사용하는 나노입자를 검출하는데 사용하기 위해, 또는 요법을 위해, 즉, 표적 세포를 사멸하기 위해, 방사성핵종을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 용이하게 조정될 수 있는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 방사성핵종의 예는, TcO4-가 가장 안정적이라고 하더라도 다양한 산화 상태에서 존재하는 99mTc; 32P 또는 33P; 57Co; 59Fe; Cu2+ 염으로서 흔히 사용되는 67Cu; Ga3+ 염, 예컨대, 시트르산 갈륨으로서 흔히 사용되는 67Ga; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; In3+ 염으로서 일반적으로 사용되는 111In; 요오드화 나트륨으로서 일반적으로 사용되는 125I 또는 131I; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 염화 탈륨과 같은 Tl+ 염으로서 일반적으로 사용되는 201Tl; 39Y3+; 71Lu3+; 및 24Cr2+를 포함한다. 표지 또는 추적자로서 방사성핵종의 일반적인 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 측면 내에서 사용하기 위해 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다. 방사성핵종은 나노입자의 코어를 도핑시킴으로써 또는 나노입자 상에 고정된 리간드의 일부로서 존재하는 표지로서 코어를 포함함으로써 가장 쉽게 사용될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 나노입자, 또는 다른 종과 이들의 상호작용의 결과물은 위에서 나타낸 바와 같은 나노입자와 연관된 표지를 이용하거나 그들의 특성을 사용함으로써 당해 분야의 잘 알려진 많은 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 나노입자를 검출하는 이들 방법은, 예컨대, 단순한 육안 검사에 의해 또는 광 산란(나노입자를 함유하는 용액의 투과율)을 사용함으로써, 나노입자가 다른 종에 결합하는 경우 발생하는 응집을 검출하는 것부터, 나노입자를 시각화하기 위한 투과형 전자 현미경(TEM) 또는 원자력 현미경(AFM)과 같은 복잡한 기술을 사용하는 것까지 다양할 수 있다. 금속 입자를 검출하기 위한 추가적인 방법은 보통 광학 방사선에 의해 야기된, 금속의 표면에서 전자의 여기인 플라즈몬 공명을 사용하는 것이다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상은 금속(예컨대, Ag 또는 Au)과 공기 또는 물과 같은 유전체 물질의 인터페이스에 존재한다. SPR의 변화에 따라 분석물이 인터페이스의 굴절률을 변화시키는 나노입자의 표면 상에 고정된 리간드에 결합하는 것이 발생한다. SPR의 추가적인 장점은 실시간 상호작용을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다는 점이다. 위에서 언급된 바와 같이, 나노입자가 NMR 활성인 원자를 포함하거나 이로 도핑되면, 이 기술은 당해 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용해서, 시험관내 또는 생체내 둘 다에서 입자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 나노입자는 또한 은(I)의 나노입자-촉진된 환원을 사용하는 정량적 신호 증폭에 기반한 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 형광 분광법은 나노입자가 형광 프로브로서 리간드를 포함하는 경우 이용될 수 있다. 또한, 탄수화물을 동위원소 표지시키는 것은 이의 검출을 촉진하기 위해 이용될 수 있다.
아밀린 펩타이드
본 발명에 따른 소정의 경우에, "아밀린 펩타이드"는 하기 (i) 내지 (vi)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 서열에 대해서 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 해당 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(ii) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열을 포함하거나 해당 전장 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(iii) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열의 변이체 서열을 포함하거나 해당 변이체 서열로 이루어진 펩타이드(여기서 상기 변이체는 상기 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 상이함);
(iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 단편을 포함하거나 해당 단편으로 이루어진 펩타이드(여기서 상기 단편은 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산의 서열 길이를 가짐).
바람직하게는, (i) 내지 (iv) 중 어느 하나의 상기 아밀린 펩타이드는 아밀린의 생물학적 활성을 발휘한다. (i) 내지 (iv) 중 어느 하나의 상기 아밀린 펩타이드는 아밀린 활성의 시험관내 또는 생체내 생물학적 검정에서 서열번호 2의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50% 또는 서열번호 4의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50%를 발휘할 수 있다. 소정 경우에, 아밀린 활성은 식후 혈당 변동폭의 저감, 위 분비(예컨대, 위산, 췌장 효소 및 담즙 방출 중 적어도 하나의 분비)의 저해, 위 배출의 저해 및/또는 식후글루카곤 분비의 억제를 포함할 수 있다.
아밀린 펩타이드는 나노입자의 코로나에 결합된다. 어떠한 이론에도 구속되는 것을 원치 않지만, 현재 아밀린 펩타이드는 나노입자의 코어를 제공하는 하나 이상의 리간드와 하나 이상의 가역적 결합 상호작용에 관여할 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 특히, 아미노산의 서열의 일부는 수소 결합, 반데르발스 힘 및/또는 다른 리간드와의 정전기 상호작용(예컨대, 하나 이상의 글루타티온 리간드와의 상호작용)에 관여할 수 있다. 펩타이드 결합은 흡착, 흡수 또는 나노입자의 하나 이상의 리간드와의 직접 혹은 간접적 상호작용을 수반할 수 있다.
본 발명의 소정의 실시형태를 참조하여 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 아밀린 펩타이드는 결합된 아밀린 펩타이드의 적어도 일분획 혹은 부분이 나노입자를 생리적 용액과 접촉시킬 때 나노입자로부터 방출되도록 결합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 아밀린 펩타이드는, 해당 아밀린 펩타이드가 결합하면서 안정화(예컨대, 열안정화)되지만, 생물학적으로 활성인 형태로 가역적이면서 이용가능하게 되도록(예를 들어, 아밀린 펩타이드가 ELISA에 의해 검출 가능하고/하거나 유리 아밀린 펩타이드의 특징인 시험관내 또는 생체내 검정 시스템에서 적어도 하나의 생물학적 작용을 발휘할 수 있도록 가역적이 되도록) 하는 방식으로 나노입자에 결합될 수 있다. 특히, 아밀린 펩타이드는, 아밀린-결합된 나노입자의 현탁액이, 예컨대, (인간) 아밀린에 대해서 ELISA에서 양성 결과를 부여하고/하거나 포유동물 대상체에서 식후 혈당 변동폭의 효과를 발휘하도록 나노입자에 결합할 수 있다.
투여 및 치료
본 발명의 나노입자 및 조성물은 장관 또는 비경구 경로를 비롯한 임의의 많은 상이한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여는 다음의 경로, 즉, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 근육내, 안구내, 경상피, 복강내 및 국부(피부, 안구, 직장, 비강, 흡입 및 에어로솔을 포함함), 및 직장 전신적 경로에 의한 투여를 포함한다.
투여는, 예컨대, 주사에 의해, 또는 표피의 외층을 통해 그의 경피 통과를 가속화시키는 전달 건(gun)을 사용하여 탄도학적으로 수행될 수 있다. 나노입자는 또한 에어로졸로 전달될 수 있다. 이것은 작은 크기의 나노입자에 의해 가능해진다.
본 발명의 나노입자는 고체 또는 액체 조성물의 형태일 수 있는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 일부 종류의 담체, 예를 들어, 고체 담체 또는 액체 담체, 예컨대, 물, 석유, 동물성 오일 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 또는 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜 등과 같은 글라이콜이 포함될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 일반적으로 적어도 0.1중량%의 화합물을 함유한다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 통증 부위에서의 주사의 경우, 유효 성분은 발열원 비함유이며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태로 존재할 것이다. 당업자라면, 예를 들어, 화합물 또는 그의 유도체의 용액, 예컨대, 생리 식염수, 글라이세롤, 액체 폴리에틸렌 글라이콜 또는 오일로 제조된 분산액을 이용해서 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다.
하나 이상의 화합물에 부가해서, 선택적으로 다른 유효 성분과 조합하여, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 등장화제, 보존제 또는 항산화제 또는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하고 유효 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 명확한 특성은 투여 경로, 예컨대, 경구 또는 비경구에 따라 좌우될 것이다.
액체 약제학적 조성물은 전형적으로 약 3.0 내지 9.0, 더욱 바람직하게는 약 4.5 내지 8.5, 더욱더 바람직하게는 약 5.0 내지 8.0의 pH를 갖도록 제형화된다. 조성물의 pH는 아세트산염, 시트르산염, 인산염, 숙신산염, 트리스(Tris) 또는 히스티딘과 같은 완충제의 이용에 의해 유지될 수 있으며, 전형적으로 약 1mM 내지 50mM의 범위 내에서 사용될 수 있다. 조성물의 pH는 다르게는 생리학적으로 허용가능한 산 또는 염기를 사용함으로써 조정될 수 있다.
보존제는 일반적으로 미생물 성장을 지연시키기 위해 약제학적 조성물에 포함되어, 조성물의 저장 수명을 연장시키고, 다수회 사용 포장을 가능하게 한다. 보존제의 예는 페놀, 메타-크레솔, 벤질 알코올, 파라-하이드록시벤조산 및 그의 에스터, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 보존제는 전형적으로 약 0.1 내지 1.0 %(w/v) 범위 내에서 사용된다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 예방적 유효량 또는 치료적 유효량으로(경우에 따라, 예방이 요법인 것으로 고려될 수 있다고 하더라도) 개체에게 부여되며, 이는 개체에게 이점을 나타내기에 충분한 양이다. 전형적으로, 이것은 개체에게 이점을 제공하는 치료적으로 유용한 활성을 야기하게 될 것이다. 투여되는 화합물의 실제량, 및 투여 속도 및 투여의 시간경과는 치료 중인 병태의 성질 및 중증도에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대, 용량에 대한 결정 등은 일반의사 및 다른 의학 박사의 책임 범위 내이며, 전형적으로 치료될 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜은 문헌[Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA); Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾을 수 있다. 예로써, 조성물은 바람직하게는 체중 ㎏ 당 약 0.01 내지 100㎎의 활성 화합물, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 10 ㎎/㎏(체중)의 용량으로 환자에게 투여된다.
하기 내용은 예로써 제시되며 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1 - 나노입자의 합성
탄수화물 리간드 또는 글루타티온 리간드의 코로나를 가진 금 나노입자는, 이미 기재된 바와 같이(문헌[WO 2011/154711; 및 Lund et al., 2011, Biomaterials Vol. 32 pp. 9776-9784], 이들의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 명백히 편입됨) 본질적으로 합성되었다.
AL/α-Gal NP(Tox 배취)
2-티오-에틸-α-D-갈락토시다제(α-갈락토스 C2SH)의 제조
Figure pct00001
2-브로모에탄올(30㎖) 중 갈락토스(3g, 16.65 m㏖)의 현탁액에, 산 수지 앰버라이트(Amberlite) 120-H를 첨가하여 pH 2에 이르게 한다. 이 반응물을 50 내지 60℃에서 16시간 동안 교반한다. 이 반응 혼합물을 여과하고, MeOH로 세척한다. 트라이에틸아민을 첨가하여 pH 8에 이르게 한다. 이 반응의 조질물을 농축시키고 톨루엔과 함께 3회 공증발시킨다. 이 반응 혼합물을 피리딘(75㎖) 및 Ac2O(35㎖)에 용해시키고, 촉매량의 DMAP를 0℃에서 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반한다. 이 혼합물을 AcOEt로 희석시키고, 1. H2O; 2. HCl(10%); 3. NaHCO3; 및 4. H2O로 세척한다. 유기 층을 수집하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨다. TLC(헥산: AcOEt 3:1, 2 용리액)는 주생성물(목적으로 함) 및 더 낮은 Rf 이동도를 나타낸다. 생성물은 용리액으로서 헥산:아세트산 에틸 6:1 혼합물을 이용하는 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 2-브로모에틸-알파-갈락토시다제 (2)를 얻는다.
앞서의 반응 생성물 2를 2-부탄온 27㎖에 용해시킨다. 이 용액에, 촉매량의 테트라뷰틸암모늄 아이오다이드 및 4당량의 티오아세트산 칼륨을 첨가한다. 얻어진 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 이 기간 전체를 통해서 반응은 출발 물질의 소멸을 위하여 TLC(헥산-AcOEt 2:1, 2 용리액)에 의해 시험된다. 이 혼합물을 AcOEt 20㎖로 희석시키고, 포화 NaCl 용액으로 세척한다. 유기 상을 건조시키고, 여과 후 진공 하 증발시킨다. 생성물을 헥산/AcOEt 2:1 → 1:1에서 정제시켜 아세틸티오-알파-갈락토시다제 3을 얻는다.
이 반응의 생성물 3을 다이클로로메탄-메탄올 2:1의 혼합물에 용해시킨다. 이 혼합물에 1N 나트륨 메톡사이드(1당량)의 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반한다. 앰버라이트 IR-120H 수지를 첨가하여 pH 5 내지 6을 달성한다. 얻어진 혼합물을 이어서 여과시키고 건조 상태로 농축시켜 최종 생성물(α-갈락토스 C2SH)을 얻는다.
아미노-티오 링커의 제조.
Figure pct00002
건조 THF 20㎖ 중 PPh3(3g, 11.4 m㏖)의 용액에 DIAC(2.3g, 11.4m㏖)를 첨가한다. 이 혼합물을 백색 생성물이 출현할 때까지 0℃에서 15분 동안 교반한다. 이 혼합물에, 건조 THF(20㎖) 중 헥사에틸렌글라이콜(1.45㎖, 5.7 m㏖) 및 HSAc(610㎕, 8.55m㏖)의 용액을 적가 방식으로(투입 깔때기) 첨가한다. 15분 후에 생성물이 TLC 상에 Rf 0.2에서 출현하기 시작한다. 이 용액을 증발기에서 농축시킨다. 이 반응의 조질물을 다이클로로메탄 50㎖ 중에서 용해시키고 K2CO3 10%의 용액으로 세척한다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후 진공 하에 농축시킨다. AcOEt: 헥산 1:1, AcOEt 및 최종적으로 DCM:MeOH 4:1을 용리액으로서 이용하는 조질물의 플래시 크로마토그래피에 의해 아세틸-티오-헥사에틸렌글라이콜 유도체를 얻었다.
이 반응 생성물을 DMF 5㎖에 용해시키고, PPh3(2.25g, 8.55m㏖), NaN3(0.741g, 11.4m㏖) 및 BrCl3C(0,845㎖, 8.55m㏖)를 첨가하고 이어서 이 용액을 실온에서 40분 동안 교반한다. 얻어진 생성물은 TLC(DCM:MeOH 25:1)를 수행할 경우 출발 생성물보다 더 높은 Rf를 갖는다. 이 반응 혼합물을 디에틸에터 100㎖로 희석시키고, H20로 3회 세척한다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 하 증발시킨다. 이 생성물을 DMC/MeOH 200:1 및 DCM/MeOH 40:1의 용리액 혼합물을 이용하는 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 아지도-아세틸티오-헥사에틸렌글라이콜 유도체를 얻는다.
트라이페닐 포스핀 옥사이드를 제거하기 위하여, 이 반응 생성물을 THF 10㎖에 용해시키고, 이 용액에 MgCl2 0.5g을 첨가한다. 이 반응물을 백색 석출물이 출현할 때까지 80℃에서 2시간 동안 교반하고 나서, 셀라이트를 통해서 여과시킨다. 생성물을 에탄올:H20 3:1의 혼합물에 용해시키고, Zn 더스트(0.45g, 6.84m㏖) 및 NH4Cl(0.6g, 11.4m㏖)을 첨가한다. 이 반응물을 출발 물질의 존재가 TLC(DCM/MeOH 25:1)에 의해 더 이상 검출 가능하지 않게 될 때까지 1시간 동안 환류 하에 교반하였다. 이 반응물을 셀라이트를 통해서 여과시키고, 용매를 증발시킨다. 이 반응의 조질물을 AcOEt로 희석시키고 H20 5㎖로 추출한다. 수성 상을 건조 상태로 증발시켜 아미노-티올-헥사에틸렌글라이콜 생성물을 얻는다.
알파-갈락토스 C2 유도체 3 및 헥사에틸렌글라이콜 아민 링커 6을 미다테크 바이오건 보존액(Midatech Biogune stock)으로부터 취하였다. N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC·HCl), HAuCl4, NaBH4는 시그마 알드리치 화학사(Sigma-Aldrich Chemical Company)로부터 구입하였다. 이미다졸-4-아세트산 모노하이드로클로라이드는 알파 에이사사(Alfa Aesar)로부터 구입하였다. 컴퍼니 하이 퀄러티(Company High quality) MeOH 및 나노퓨어 워터(Nanopure water)(18.1 mΩ)를 모든 실험 및 용액에 대해서 사용하였다.
Figure pct00003
α-GalC2(알파)
Figure pct00004
2'-티오에틸-α-D-갈락토피라노사이드(알파)
EG6NH2
Figure pct00005
1-아미노-17-머캅토-3,6,9,12,15,-펜타옥사-헵타데칸올 또는 1-아미노-6-머캅토-헥사에틸렌글라이콜(속칭)
AL/α-Gal NP의 제조(Tox 배취): MeOH(49㎖) 중 아민-머캅토 헥사에틸렌글라이콜 링커 6 및 알파-갈락토스 리간드 3의 1:1비(0.58 m㏖, 3당량)의 혼합물에 금염(gold salt)의 수용액(7.86㎖, 0.19 mmol, 0.025M)을 첨가하였다. 이 반응물을 30초 동안 교반하고 나서, NaBH4의 수용액(1N)을 여러 회 나누어서 첨가하였다(4.32㎖, 4.32 m㏖). 이 반응물을 900rpm에서 100분 동안 진탕시켰다. 이 후에, 현탁액을 14000 rpm에서 1분 원심분리리시켰다. 상청액을 제거하고, 석출물을 물 2㎖에 용해시켰다. 이어서, 현탁액 2㎖를 두 필터(AMICON, 10 KDa, 4㎖)에 도입하고 4500g에서 5분간 원심분리하였다. 필터 내 잔사를 물로 2회 이상 세척하였다. 마지막 잔사를 물 80㎖에 용해시켰다.
금 NP의 제조를 위하여 층류 캐비넷 하에서 제작하였다. 모든 유리 및 플라스틱 재료(에펜도르프, 바이알 및 병 등)를 먼저 오토클레이브 속에서 멸균화시켰다. 모든 다른 1회용품(팁 및 필터 등)은 사전 멸균되었다.
GSH NP
산화된 리간드, 글루타티온(플루카(Fluka) 49741)을 9:1 메탄올:물에 용해시키고, 염화금(III)(시그마-알드리치사, 영국 풀(Poole) 소재)을 첨가하였다. 유기 리간드를 금에 대해서 4배몰 과잉으로 사용하였다. 이 용액을 이어서 플랫-베드 진탕기(flat-bed shaker) 상에서 5분 동안 온화하게 혼합하였다. 나노입자를 환원시키고 나서 격렬한 와류(vortexing) 하에 신선하게 제조된 1M 수소화붕소나트륨(시그마-알드리치사, 영국 풀 소재) 중 금에 대해서 20배몰 과잉의 신속한 첨가를 행하였다. 샘플을 총 30초 동안 와류시키고 나서 플랫 베드 진탕기에서 더욱 1분간 온화한 혼합을 행하였다. 나노입자가 메탄올/물 용매 중에 가용성이 아니므로, 초기 정제는 벤취 원심분리(bench centrifugation), 상청액 제거 및 수 중 나노입자 펠릿의 분산에 의해 행하였디. 추가의 정제는 10 kDa 비바스핀 원심분리 장치(vivaspin centrifugation devices)(GE 헬쓰케어사(GE Healthcare))에서 4회의 수세에 의해 성취하였다. 모든 나노입자 제제의 금 농도는 단일 비색 분석법(colorimetric assay)에 의해 결정하였다. 간략하게, 10㎕의 나노입자 샘플 또는 12 ㎎/㎖의 금 표준(플루카(시그마-알드리치사, 영국 풀에 소재)) 및 블랭크를 1분 동안 ELISA 플레이트에서 50:50 물:왕수 30㎕로 분해시키고 나서, 이것에 2M NaBr 150㎕를 첨가하고, 그 후 405㎚ 흡광도를 즉시 측정한 바, 이 분석은 0 내지 10㎍ 범위에 걸쳐서 우수한 직선성을 지녔다.
실시예 2 - 나노입자에 대한 펩타이드 결합
본 발명자들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 나노입자에 대해서 이하의 두 펩타이드의 능력을 조사하였다:
1. 장기 지속성 GLP-1 유사체 Val(8)GLP-1:
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(서열번호 1); 및
2. 아밀린 유사체 V17 내지 P17:
KCNTATCATQRLANFLPHSSNNFGAILSSTN(서열번호 2).
인슐린 결합에 대한 절차(WO 2011/154711의 실시예 3 참조, 이 문헌의 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 따라서, GLP-1을 AL/αGal NP에 성공적으로 결합시켰다(도 1 및 도 2 참조). 이 방법에 대한 유일한 예비적 변화는 초기에 펩타이드에 대한 잠재적 손상을 피하기 위하여 HCl 중에서 대신에 직접 20mM pH 8.0 트리스/HCl 완충액 중에서 GLP-1을 용해시키는 것이었다.
아마도 인슐린과 비교해서 Val(8)GLP-1(3384g/㏖)의 저분자량에 부분적으로 기인해서, Val(8)GLP-1은 AL/αGal NP에 대해서 보다 큰 능력으로 결합하는 것으로 나타났다. 결합능력> 80 Val(8)GLP-1/나노입자(도 2).
인슐린 결합에 대한 표준 절차(WO 2011/154711의 실시예 3 참조, 이 문헌의 내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 따라서, 아밀린을 GSH NP에 성공적으로 결합시켰다(도 3 및 도 4 참조). 앞서와 같이, 아밀린을 또한 트리스/HCl 완충액에 직접 용해시켰다.
AL/αGal NP(Tox 배취)는 아밀린을 결합시키는 능력을 거의 혹은 전혀 나타내지 않았다(도 3 및 도 4 참조). 어떠한 이론에도 구속되는 것을 원치 않지만, 본 발명자들은 AL/αGal NP에 대한 아밀린의 결합의 결여가 정전기 인력의 결여에 기인할 수 있는 것으로 여기고 있다.
GSH NP는 결합능력 >50 아밀린 펩타이드/나노입자를 달성하는 것으로 나타났다(도 4 참조). 이것은 인슐린 결합 결과에 비해서 상대적으로 높지만, Val(8)GLP-1에서처럼, 이것은 다소 저분자량(3904g/㏖)의 아밀린 대 인슐린에 적어도 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그들 전문이 참고로 본 명세서에 편입되며, 그리고 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 그들의 전문이 참고로 편입되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 편입된다.
본 명세서에 기술된 구체적인 실시형태는 제한 목적이 아니라, 예시 목적으로 제공된다. 본 명세서의 임의의 부제는 단지 편의상 포함되며, 어떠한 경우에도 본 발명의 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Midatech Limited <120> Nanoparticle Peptide Compositions <130> WO/2014/135840 <140> PCT/GB2014/050344 <141> 2014-02-06 <150> GB1303787.4 <151> 2013-03-04 <160> 4 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GLP-1 analogue Val (8) GLP-1 <400> 1 His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amylin analogue V17 to P17 <400> 2 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Pro His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn 20 25 30 <210> 3 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Ser Val Ala 1 5 10 15 Leu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys 20 25 30 Arg Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 35 40 45 Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn 50 55 60 Val Gly Ser Asn Thr Tyr Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys 65 70 75 80 Arg Glu Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Leu 85 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35

Claims (43)

  1. 나노입자 조성물로서,
    (a) 나노입자로서,
    (i) 금속 및/또는 반도체를 포함하는 코어;
    (ii) 상기 코어에 공유 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나로서, 상기 리간드가 글루타티온을 포함하는 상기 코로나
    를 포함하는, 상기 나노입자; 및
    (b) 상기 코로나에 비공유 결합되는 적어도 하나의 아밀린 펩타이드를 포함하는, 나노입자 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아밀린 펩타이드는 하기 (i) 내지 (vi)를 포함하거나 또는 하기 (i) 내지 (vi)로 이루어진, 나노입자 조성물:
    (i) 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 서열에 대해서 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열;
    (ii) 상기 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열을 포함하거나 해당 전장 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
    (iii) 상기 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열의 변이체 서열을 포함하거나 해당 변이체 서열로 이루어진 펩타이드로서, 상기 변이체는 상기 서열번호 2 또는 4에 기재된 전장 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 상이한, 상기 펩타이드;
    (iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나의 단편을 포함하거나 해당 단편으로 이루어진 펩타이드로서, 상기 단편은 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산의 서열 길이를 가진, 상기 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아밀린 펩타이드는 아밀린 활성의 시험관내 또는 생체내 생물학적 검정에서 서열번호 4의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50% 또는 서열번호 2의 아밀린 펩타이드의 활성의 적어도 50%를 발휘하는, 나노입자 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아밀린 활성은 식후혈당 변동폭의 저감; 위 분비의 저해; 위 배출의 저해; 및 식후글루카곤 분비의 억제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나는 코어당 적어도 5, 10, 20개 또는 적어도 50개의 리간드를 포함하는, 나노입자 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나는 코어당 적어도 5, 10, 20개 또는 적어도 50개의 글루타티온 리간드를 포함하는, 나노입자 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자에 결합된 아밀린 펩타이드 분자의 개수는 코어당 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20개 또는 적어도 50개로부터 선택되는, 나노입자 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아밀린 펩타이드는 가역적 방식으로 상기 나노입자의 상기 코로나에 결합되는, 나노입자 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀린 펩타이드는, 결합된 아밀린 펩타이드의 적어도 일분획이 상기 나노입자 조성물을 생리적 용액과 접촉 시 상기 나노입자로부터 방출되도록 상기 코로나에 결합되는, 나노입자 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 글루타티온을 단독으로 또는 다른 종의 리간드와 함께 포함하는, 나노입자 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드는 글루타티온과 탄수화물 리간드의 조합을 포함하는, 나노입자 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 상기 코어의 직경이 1㎚ 내지 5㎚ 범위 내인, 나노입자 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 리간드를 포함하는 해당 나노입자의 직경이 2㎚ 내지 50㎚, 또는 3㎚ 내지 30㎚, 또는 4㎚ 내지 20㎚, 또는 5㎚ 내지 15㎚의 범위 내인, 나노입자 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어는 Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd 및 Zn, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함하는, 나노입자 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어는 자성인, 나노입자 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어는 반도체를 포함하는, 나노입자 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 반도체는 금속 원자를 포함하는, 나노입자 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 반도체는 셀렌화카드뮴, 황화카드뮴, 카드뮴 텔루륨 및 황화아연으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 코어는 양자점으로서 작용 가능하고/하거나;
    상기 반도체는 비금속 원자를 포함하는, 나노입자 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 복수의 상기 나노입자를 포함하고, 상기 조성물 내 상기 나노입자의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 적어도 하나의 결합된 아밀린 펩타이드를 가진, 나노입자 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 담체를 포함하되, 상기 담체에 상기 나노입자 및 결합된 아밀린 펩타이드가 현탁되는, 나노입자 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물은 회합된 형태이거나, 현탁액이거나, 또는 단일의 패키지 혹은 용기 내에 수용되는, 나노입자 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 규정된 양의 아밀린 펩타이드 또는 규정된 수준의 아밀린 펩타이드 활성 단위의 1회 이상의 용량의 형태인, 나노입자 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 코어 및/또는 상기 코로나에 비공유 또는 공유 결합되는 적어도 1종의 침투 촉진제를 더 포함하는, 나노입자 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 침투 촉진제는 알킬-D-말토사이드, 테트라데실-D-말토사이드, 도데실-β-D-말토사이드, 헥실-β-D-말토사이드, 옥틸-β-D-말토사이드, 노닐-β-D-말토사이드, 데실-β-D-말토사이드, 운데실-β-D-말토사이드, 트라이데실-β-D-말토사이드, 헥사데실-β-D-말토사이드 및 리살비산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 침투 촉진제는 상기 코로나에 비공유 결합되는, 나노입자 조성물.
  27. 약물에 이용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 나노입자 조성물.
  28. 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료 방법에 이용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 나노입자 조성물.
  29. 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료용의 의약의 제조에서의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 나노입자 조성물의 용도.
  30. 포유동물 대상체에서 포도당 조절 장애의 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 나노입자 조성물을 상기 치료를 필요로 하는 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 포유동물 대상체에서 혈당 수준을 저하시키는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 나노입자 조성물을 상기 치료를 필요로 하는 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 혈당 수준은 기준, 공복 혹은 식후인 방법.
  33. 상기 대상체는 인간인, 제28항에 따른 나노입자 조성물, 제29항에 따른 용도 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법.
  34. 상기 대상체는 혈당 수준의 부적절한 조절을 유발하는 장애를 가진, 제28항에 따른 나노입자 조성물, 제29항에 따른 용도 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제33항에 따른 나노입자 조성물, 용도 또는 방법.
  35. 상기 대상체는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 전당뇨병(prediabetes)을 가진, 제28항에 따른 나노입자 조성물, 제29항에 따른 용도 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제33항 또는 제34항에 따른 나노입자 조성물, 용도 또는 방법.
  36. 상기 나노입자 조성물은 혈당 조절을 위하여 1종 이상의 치료제와 동시에, 개별적으로 또는 순차로 투여되거나 또는 투여하기 위한, 제28항에 따른 나노입자 조성물, 제29항에 따른 용도 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 조성물, 용도 또는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 1종 이상의 치료제는 인슐린 또는 그의 유사체, GLP-1 또는 그의 유사체, 위 저해 펩타이드(GIP) 또는 그의 유사체, 다이펩티딜 펩티다제-4 (DPP-4) 저해제, 설포닐유레아, 메트포민, 알파-글루코시다제 저해제 및 티아졸리딘다이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나노입자 조성물, 용도 또는 방법.
  38. 상기 나노입자 조성물은 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 피부내(i.d.), 복강내 또는 피하(s.c.) 주사 또는 주입; 협측; 입술밑; 설하; 흡입에 의해; 하나 이상의 점막을 통해서; 비뇨생식기; 직장; 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해서 투여되거나 또는 투여하기 위한, 제28항에 따른 나노입자 조성물, 제29항에 따른 용도 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 조성물, 용도 또는 방법.
  39. 제조 물품으로서,
    제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 나노입자 조성물;
    상기 나노입자 조성물을 수용하는 용기; 및
    삽입물 및/또는 라벨을 포함하는, 제조 물품.
  40. 제39항에 있어서, 상기 삽입물 및/또는 라벨은 포도당 조절 장애의 치료 방법에서 상기 나노입자 조성물의 이용에 관한 설명서, 용량 및/또는 정보를 제공하는, 제조 물품.
  41. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 나노입자 조성물을 제조하는 방법으로서,
    금속 및/또는 반도체를 포함하는 코어 및 상기 코어에 공유 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나를 포함하는 나노입자를 제공하는 단계로서, 상기 리간드는 글루타티온을 포함하는, 상기 제공하는 단계; 및
    적어도 1종의 아밀린 펩타이드를 상기 나노입자의 상기 코로나에 결합시킬 수 있는 조건 하에서 상기 나노입자를 상기 적어도 1종의 아밀린 펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 나노입자 조성물의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 방법은 상기 나노입자를 제조하는 초기 단계를 포함하되, 상기 초기 단계는, 글루타티온을 포함하는 용액을, 코어-형성 물질을 포함하는 용액과 그리고 환원제와 배합시킴으로써 상기 나노입자를 자기조립시키는(self-assemble) 단계를 포함하는, 나노입자 조성물의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 코어-형성 물질은 금염(gold salt) 용액을 포함하는, 나노입자 조성물의 제조 방법.
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