DE69926531T2

DE69926531T2 - Gegen gastrointestinale transport rezeptoren gerichtete retro-invertierte peptide und deren verwendung

Info

Publication number: DE69926531T2
Application number: DE69926531T
Authority: DE
Inventors: Daniel Joseph Blackrock O'MAHONY
Original assignee: Elan Corp PLC
Current assignee: Merrion Research Ill Ltd
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2019-11-20
Also published as: WO2000031123A3; DE69926531D1; ATE301131T1; AU1174400A; US7491796B1; WO2000031123A2; EP1131344B1; CA2349290A1; JP2002530429A; EP1131344A2; US20090238886A1; JP4566406B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Peptide, die auf Transportrezeptoren des Magen-Darm-Trakts (GIT) zielen oder sich spezifisch daran binden können. Insbesondere betrifft diese Erfindung retro-invertierte Formen von Peptidsequenzen und -motiven, die die Arzneimittelabgabe und den Arzneimitteltransport durch Gewebe wie epitheliale Zellwände der Lumenseite des GIT verbessern. Die Herstellung von Peptiden und Antikörpern ist ebenso bereitgestellt. Die Erfindung betrifft des Weiteren Arzneimittel, Formulierungen und damit verbundene Verfahren.
Stand der Technik
Proteasen spalten Peptidbindungen zwischen benachbarten L-Aminosäuren, wodurch diese Peptide für den Abbau im GIT empfänglich werden. Künstliche aus D-Aminosäuren zusammengesetzte Proteine oder Peptide sind größtenteils gegen proteolytischen Abbau widerstandsfähig. Werden jedoch D-Aminosäuren für alle L-Aminosäuren in einem Peptid/Protein ersetzt, ist das entsprechende D-Peptid/-Protein ein Spiegelbild des ursprünglichen Peptid/Proteins und weist auf Grund dieser Konformationsänderung wahrscheinlich eine modifizierte oder verloren gegangene biologische Aktivität auf. Retro-invertierte Peptide sind Peptide mit allen D-Aminosäuren, werden verglichen mit dem ursprünglichen L-Peptid/Protein jedoch in umgekehrter Reihenfolge oder Sequenz synthetisiert. Der Carboxyterminus des ursprünglichen Peptids/Proteins wird zum Aminoterminus (und umgekehrt) des retro-invertierten Peptids/Proteins, und die erhaltene Seitenkettenoberfläche des retro-invertierten Peptid/Proteins gleicht dem ursprünglichen L- Peptid/-Protein. Das Reinergebnis des Kombinierens von D-Enantiomeren und Umkehrsynthese ist; dass die Positionen von Carbonyl- und Amingruppen in jeder Amidbindung ausgetauscht werden, während die Position von Seitenkettengrup pen bewahrt wird (Brady, L. and Dodson, G., Nature, 368L: 692–693 (1994), Jameson et al., Nature, 368, 744–746 (1994)). Diese Abänderung im Proteingerüst ist dahingehend selbstkompensierend, dass Wasserstoffbindungsdonoren zu Wasserstoffbindungsakzeptoren (Amidcarbonylgruppen) werden und umgekehrt. Bleibt die Position der Seitenketten in Bezug auf das Gerüst unverändert, bleibt die modifizierte Oberfläche des retro-invertierten Peptids/Proteins verglichen mit dem ursprünglichen L- Peptid/-Protein unverändert.
Früher identifizierten wir, wie in WO 98/51325 offenbart und beansprucht, statistische Peptide und deren Fragmente, Motive, Derivate, Analoga oder Peptidomimetika davon, die sich an GIT-Transportrezeptoren wie die D2H-, hSi-, HPT1-und hPEPT1-Rezeptoren (hier nachstehend „GIT-Zielmittel") spezifisch binden können. Diese GIT-Zielmittel können den Transport eines Wirkstoffs durch ein menschliches oder tierisches Magen-Darm-Gewebe erleichtern und finden z.B. beim Erleichtern des Transports von Wirkstoffen von der Lumenseite des GIT in das systemische Blutsystem und/oder beim Zielen von Wirkstoffen auf den GIT Verwendung. Folglich kann das Zielmittel z.B. durch Binden (kovalent oder nicht kovalent) des GIT-Zielmittels an einen oral verabreichten Wirkstoff auf spezifische Rezeptorstellen oder Transportwege gezielt werden, von welchen es bekannt ist, dass sie im menschlichen Magen-Darm-Trakt wirken, wodurch dessen Absorption im systemischen System erleichtert wird. Vorzugsweise ist der Wirkstoff ein Arzneimittel oder ein arzneimittelhaltiges Nano- oder Mikroteilchen.
Offenbarung der Erfindung
Überraschenderweise fanden wir, dass retro-invertierte Formen der GIT-Zielmittel auf spezifische Rezeptorstellen in vivo zielen und/oder die Aufnahme von Wirkstoffen unterstützen und/oder die Wirkstoffabgabe im gesamten GIT in den systemischen Kreislauf verbessern. Durch Verwendung einer Retro-inversions-D-Peptidsynthese entdeckten wir retro-invertierte D-Peptide der GIT-Zielmittel, die dieselbe Funktion der GIT-Zielmittel beibehalten, jedoch eine verbesserte Stabili tät gegen Proteasen im menschlichen oder tierischen GIT aufweisen. Diese retroinvertierten Peptide und diese retro-invertierten Peptide enthaltende Zusammensetzungen können zur Abgabe eines Wirkstoffs, wie eines Arzneimittels oder eines arzneimittelhaltiges Nano- oder Mikroteilchens zur Behandlung eines Zustands in einem das Arzneimittel benötigenden Patienten in vivo durch eine beliebige der in der vorstehend genannten WO 98/51325 offenbarten Verwendungen oder Verfahren verwendet werden. Zudem stellt die Erfindung Antikörper bereit, die die retro-invertierten Peptide dieser Erfindung immunspezifisch binden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Glukosegehalte von systemischem Blut infolge einer intestinalen Verabreichung einer Kontrolle (PBS), von erfindungsgemäßen mit ZElan 021 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 018 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 091 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 129 beschichteten insulinhaltigen Teilchen und mit ZElan 144 beschichteten insulinhaltigen Teilchen (Insulinbeladung: 300 iu), und
2 zeigt die systemischen Insulingehalte infolge intestinaler Verabreichung einer Kontrolle, von. erfindungsgemäßen mit ZElan 021 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 018 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 091 beschichteten insulinhaltigen Teilchen, mit ZElan 129 beschichteten insulinhaltigen Teilchen und mit ZElan 144 beschichteten insulinhaltigen Teilchen (Insulinbeladung: 300 iu).
Durchführungsmodi der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft retro-invertierte Peptide (hier auch „retroinvertierte Zielpeptide" oder „Retro-Inversions-Zielpeptide" genannt), die auf spezifische Rezeptorstellen in vivo zielen und/oder die Aufnahme von Wirkstof fen unterstützen und/oder die Wirkstoffabgabe über den GIT in den systemischen, Portalen oder hepatischen Kreislauf verbessern. Insbesonderebinden sich diese retro-invertierten Peptide spezifisch an einen oder mehrere der Rezeptoren HPT1, HPEPT1, D2H oder hSi des menschlichen Magen-Darm-Trakts, deren Äquivalente in anderen Säugern und finden im Allgemeinen in Zielwirkstoffen für ausgewählte Stellen und/oder ausgewählte Gewebe im Körper, in welchen diese Rezeptoren exprimiert werden, Verwendung. Diese Peptide werden von D-Aminosäuren synthetisiert und weisen eine umgekehrte Sequenzreihenfolge der in der vorstehend genannten WO 98/51325 offenbarten und beanspruchten GIT-Zielmittel auf. Ebenso offenbart sind Derivate (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Fragmente) dieser retro-invertierten Peptide, wobei die Derivate den retro-invertierten Peptiden funktionell ähneln (d.h. eine oder mehrere bekannte funktionelle Aktivitäten der retro-invertierten Peptide aufzeigen können). Diese funktionellen Aktivitäten schließen die Fähigkeit der Bindung an die Magen-Darm-Traktrezeptoren HPT1, HPEPT1, D2H oder hSi oder des Konkurrierens mit der Bindung daran, oder die Fähigkeit der Bindung an einen gegen das retro-invertierte Peptide gerichteten Antikörper ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Derivate können für die gewünschte Aktivität durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich Binden an eine Rezeptordomäne oder an Caco-2-Zellen in vitro oder an intestinales Gewebe in vitro oder in vivo getestet werden.
Derivate können durch Abändern der retro-invertierten Peptidsequenzen durch eine funktionell äquivalente Aktivität bereitstellende Substitutionen, Additionen oder Deletionen hergestellt werden. Derivate schließen diejenigen ein, die als primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz des retro-invertierten Peptids, einschließlich abgeänderte Sequenzen, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste in den Sequenzen unter Erhalt einer stillen Änderung substituiert werden, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere als funktionelles Äquivalent wirkende Aminosäure einer ähnlichen Polarität unter Erhalt einer stillen Abänderung substituiert werden. Substitute für eine Aminosäure in der Sequenz können aus anderen Vertretern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Aspartamsäure und Glutaminsäure ein.
Eingeschlossen im Umfang der Erfindung sind retro-invertierte Peptide ein, die z.B. durch Glycosoylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen Zellliganden usw. modifiziert werden. Beliebige zahlreiche chemische Modifikationen können durch bekannte Techniken durchgeführt werden. In einer spezifischen Ausführungsform werden die Amino- und/oder Carboxytermini modifiziert. Weiterhin können, falls erwünscht, nicht klassische Aminosäuren oder chemische Aminosäurenanaloga als Substitution oder Addition in die retro-invertierte Peptidsequenz eingebracht werden. Nicht klassische Aminosäuren schließen im Allgemeinen α-Aminoisobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, Abu, 2-Aminobuttersäure, γ-Abu, ε-Ahx, 6-Aminohexansäure, Aib, 2-Aminoisobuttersäure, 3-Aminopropionsäure, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Fluoraminosäuren, Designer-Aminosäuren wie β-Methylaminosäuren, Cα-Methylaminosäuren, Nα-Methylaminosäuren und Aminosäureanaloga ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische und diagnostische Verfahren und die retro-invertierten Zielpeptide enthaltende Zusammensetzungen.
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die die Retro-Inversions-Zielpeptide der Erfindung umfassen, die an ein einen Wirkstoff umfassendes Material gebunden sind. Derartige Zusammensetzungen finden beim Zielen des Wirkstoffs auf den GIT und/oder beim Erleichtern der Übertragung durch das Lumen des GIT in den systemischen Kreislauf in einem menschlichen oder tierischen Patienten Verwendung. Die retro-invertierten D-Peptide finden auch beim Zielen von Wirkstoffen auf ausgewählte Stellen/ausgewählte Gewebe in einem menschlichen oder tierischen Patienten, in welchen die Rezeptoren oder andere verwandte Rezeptoren exprimiert werden, allgemeine Verwendung. Wo sich z.B. die retro-invertierten D-Peptide an andere Rezeptoren wie verwandte Rezeptoren, Verbindungsvarianten der Rezeptoren oder verwandte Rezeptoren, die als Überfamilie vorliegen, binden, oder wo sich die Peptide durch nicht spezifische Wechselwirkungen wie nicht spezifische Ionenpaare, Wasserstoffbindung oder hydrophobe Paare binden, können sie zur Abgabe von Arzneimitteln an Gewebe oder Zelltypen in diese Rezeptoren exprimierenden Säugern oder Menschen verwendet werden. Ist zudem der Wirkstoff ein Abbildungsmittel, können solche Zusammensetzungen in vivo verabreicht werden, um selektierte Stellenselektierte Gewebe wie den GIT (oder bestimmte Transportrezeptoren davon) abzubilden. Andere Wirkstoffe schließen ein beliebiges Arzneimittel oder Antigen oder ein beliebiges Arzneimittel- oder Antigen-beladenes oder Arzneimittel- oder Antigeneingekapseltes Nanoteilchen, Mikroteilchen, Liposom oder eine Mizellenformulierung, die eine biologische Antwort in einem Menschen oder Tier hervorrufen kann, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für Arzneimittel- oder Antigen-beladene oder Arzneimittel- oder Antigen-eingekapselte Formulierungen schließen diejenigen ein, in welchen der Wirkstoff in Nano- oder Mikroteilchen wie bioabbaubare Nano- oder Mikroteilchen eingekapselt oder beladen ist und das Retro-Inversions-Zielpeptid in adsorbierter, aufgetragener oder kovalent wie direkt oder über eine Bindungseinheit gebundener Form auf der Oberfläche des Nano- oder Mikroteilchens aufweisen. Zudem kann das retro-invertierte Zielpeptid das Nano- oder Mikroteilchen selbst bilden, oder kann das retro-invertierte Zielpeptid an dem Polymer oder den Polymeren, das/die bei der Herstellung der bio abbaubaren Nano- oder Mikroteilchen oder Arzneimittel-beladenen oder Arzneimittel-eingekapselten Nano- oder Mikroteilchen verwendet wird/werden, kovalent angelagert sein, oder kann das Peptid direkt an den Wirkstoff konjugiert sein. Eine derartige Konjugation an Wirkstoffe schließt Proteine ein, in welchen das retroinvertierte Peptid direkt am Protein- oder Peptidwirkstoff von Interesse konjugiert ist. Zudem können die retro-invertierten Peptide dieser Erfindung an Aufbaublöcke oder Untereinheiten oder Polymermonomere, die bei der Synthese der Basispolymere verwendet werden, angelagert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Störungen durch Verabreichung einer therapeutischen Verbindung (hier als „therapeutisches Mittel" bezeichnet) ein. Derartige therapeutische Mittel schließen ein Retro-Inversions-Zielpeptid, das an einen wertvollen Wirkstoff bei der Behandlung oder beim Vorbeugen einer Erkrankung oder Störung (vorzugsweise einer Erkrankung oder Störung eines Säugers, besonders bevorzugt eines Menschen) gebunden ist, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Wirkstoff ist vorzugsweise ein Arzneimittel.
Jedes beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Arzneimittel kann abhängig von der zu behandelnden oder vorzubeugenden Erkrankung oder Störung und vom Typ des Patienten, an welchen es verabreicht wird, verwendet werden. Wie hier verwendet schließt der Begriff „Arzneimittel" ohne Beschränkung jeden beliebigen pharmazeutischen Wirkstoff ein. Beispielhafte Arzneimittel schließen Peptide oder Proteine, Hormone, Analgetika, Mittel gegen Migräne, Antiblutgerinnungsmittel, Antiemetika, Herz-Kreislauf-Mittel, Mittel gegen Bluthochdruck, Narkoseantagonisten, Chelatbildner, Antianginamittel, Chemotherapeutika, Beruhigungsmittel, antineoplastische Mittel, Prostaglandine und antidiuretische Mittel ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Typische Arzneimittel schließen Peptide, Proteine oder Hormone wie Insulin, Calcitonin, Calcitoningen-regulierendes Protein, atrielles natriuretisches Protein, Kolonie-stimulierenden Faktor, Betaseron, Erythropoietin (EPO), Interferone wie α-, β- oder γ-Interferon, Somatropin, Somatotropin, Somatostatin, insulinartigen Wachstumsfaktor (Somatomedine), luteinizierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Wachstumshormon freisetzendes Hormon (GHRH), Oxytocin, Estradiol, Wachstumshormone, Leuprolidacetat, Faktor VIII, Interleukine wie Interleukin-2 und Analoga davon, Analgetika wie Fentanyl, Sufentanil, Butorphanol, Buprenorphin, Levorphanol, Morphine, Hydromorphon, Hydocodon, Oxymorphon, Methadon, Lidocain, Bupivacain, Diclofenac, Naproxen, Paverin und Analoga davon, Mittel gegen Migräne wie Heparin, Hirudin und Analoga davon, Antiblutgerinnungsmittel wie Scopolamin, Ondansetron, Domperidon, Etoclopramid und Analoga davon, Herz-Kreislauf-Mittel, Mittel gegen Bluthochdruck und Gefäßverdünnungsmittel wie Diltiazem, Clonidin, Nifedipin, Verapamil, Isosorbid-5-mononitrat, organische Nitrate, Mittel, die bei der Behandlung von Herzstörungen verwendet werden, und Analoga davon, Beruhigungsmittel wie Benzodiazeine, Phenothiozine und Analoga davon, Narkoseantagonisten wie Naltrexon, Naloxon und Analoga davon, Chelatbildner wie Deferoxamin und Analoga davon, antidiuretische Mittel wie Desmopressin, Vasopressin und Analoga davon, Antianginamittel wie Nitroglycerin und Analoga davon, antineoplastische Mittel wie 5-Fluorouracil, Bleomycin und Analoga davon, Prostaglandine und Analoga davon, und chemotherapeutische Mittel wie Vincristin und Analoga davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielhafte Arzneimittel schließen auch Antisense-Oligonukleotide, Gene, genkorregierende Hybridoligonukleotide, Ribozyme, aptamere Oligonukleotide, Dreifach-Helix bildende Oligonukleotide, Hemmstoffe für Signaltransduktionswege, Tyrosinekinasehemmstoffe und DNA modifizierende Mittel ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Arzneimittel, die verwendet werden können, schließen auch ohne Beschränkung gentherapeutische Mittel enthaltende Systeme, einschließlich nichtvirale Systeme zur therapeutischen Genabgabe und virale Vektorsysteme für therapeutische Gene, die mit einem Retro-Inversions-Peptid nach einer Virusreinigung modifiziert werden, ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird einem menschlichen Patienten ein therapeutisches Mittel therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht.
Zusätzliche Beschreibungen und Quellen für therapeutische Mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind hier in verschiedenen Abschnitten zu finden.
Die Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung (und Prophylaxe) bereit, wobei einem Patienten eine wirksame Menge eines therapeutischen Mittels der Erfindung verabreicht wird. In einem bevorzugten Aspekt ist das therapeutische Mittel im Wesentlichen rein. Der Patient ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Tiere, wie Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde usw., und ist vorzugsweise ein Säuger und besonders bevorzugt ein Mensch.
Wie es klar ist, kann jede beliebige Erkrankung oder Störung von Interesse, die für eine Therapie oder Prophylaxe empfänglich ist, durch Bereitstellen eines Arzneimittels in vivo systemisch oder durch Zielen eines Arzneimittels (durch Bindung an ein Retro-Inversions-Zielpeptid der vorliegenden Erfindung) in vivo an den GIT oder andere ausgewählte Stellen, ausgewählte Gewebe oder Zelltypen, die den Rezeptor oder andere Rezeptoren wie verwandte Rezeptoren, Verbindungsvarianten der Rezeptoren, verwandte Rezeptoren, die als Überfamilie vorliegen, oder mit welchen das retro-invertierte Peptid durch eine nicht spezifische Wechselwirkung wie nicht spezifische Ionenpaare oder Wasserstoffbindungen oder hydrophobe Paare wechselwirkt, enthalten (unter Verwendung eines beliebigen Verabreichungswegs) durch Verabreichung eines therapeutischen Mittels der Erfindung behandelt oder verhindert werden. Derartige Erkrankungen können, um nur wenige zu nennen, Bluthochdruck, Diabetes, Osteroporose, Bluterkrankheit, Anämie, Krebs, Migräne und Angina pectoris einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Jeder beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Verabreichungsweg kann verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf oral, nasal, topisch, intravenös, interperitoneal, interdermal, mucosal, intrathekal, intramuslculär usw. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung oral, in einer derartigen Ausführungsform wirkt das erfindungsgemäße retro-invertierte Zielpeptid vorteilhafterweise zum Erleichtern des Transports des therapeutischen Wirkstoffs durch das Lumen des GIT in den portalen, hepatischen oder systemischen Kreislauf.
Die vorliegende Erfindung stellt auch therapeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen bereit. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist ein Retro-Inversions-Zielpeptid mit einem therapeutischen oder prophylaktischen Wirkstoff, vorzugsweise einem Arzneimittel oder arzneimittelhaltigen Nano- oder Mikroteilchen verbunden. Stärker bevorzugt ist der Wirkstoff ein Arzneimitteleinkapselndes oder Arzneimittel-beladenes Nano- oder Mikroteilchen wie ein bioabbaubares Nano- oder Mikroteilchen, wobei das Peptid auf der Oberfläche des Nano- oder Mikroteilchens physikalisch absorbiert oder aufgetragen oder kovalent wie direkt oder über eine Bindungseinheit gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das Peptid das Nano- oder Mikroteilchen selbst bilden oder direkt an den Wirkstoff konjugiert sein. Vorzugsweise liegt die Teilchengröße im Bereich von 10 nm bis 500 μm, stärker bevorzugt 50 bis 800 nm, besonders bevorzugt 200 bis 600 nm.
Folglich ist in einer spezifischen Ausführungsform ein Retro-Inversions-Zielpeptid an eine ein Medikament enthaltende Vorrichtung mit langsamer Freisetzung (kontrollierter Freisetzung) gebunden. In einer spezifischen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (Hrg.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974), Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (eds.), Wiley, New York (1984), Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983), siehe auch Levy et al., Science 228: 190 (1985), During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989), Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit. Derartige Arzneimittel umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines therapeutischen Mittels und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einer spezifischen Ausführungsform bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglich" die Genehmigung durch eine Aufsichtsbehörde der Bundes- oder einer Staatenregierung oder die Auflistung in der US-Pharmakopädie oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopädie zur Verwendung bei Tieren und insbesondere bei Menschen. Der Begriff „Träger" bedeutet ein Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff, einen Exzipienten oder ein Vehikulum, mit welchen das therapeutische Mittel verabreicht wird. Bei derartigen pharmazeutischen Trägern kann es sich um sterile Flüssigkeiten wie Wasser und Öle, einschließlich diejenigen aus Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen handeln. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn das Arzneimittel intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glyzerinlösungen können insbesondere für injizierbare Lösungen ebenso als flüssige Träger eingesetzt werden. Geeignete pharmazeutische Exzipienten schließen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Silicagel, Natriumstearat, Glyzerinmonostearat, Talkum, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glyzerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol, Sorbit, Trehelose und dergleichen ein. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch geringe Mengen eines Netz- oder Emulsionsmittels oder pH-Puffermittel enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit Dauerfreisetzung und dergleichen annehmen. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägern wie Triglyzerin formuliert werden. Orale Formulierungen können Standardträger wie von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsacharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat pharmazeutischer Qualität usw. einschließen. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in „Remington's Pharmacrutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Derartige Zu sammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge des therapeutischen Mittels, vorzugsweise in gereinigter Form zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, so dass eine Form bereitgestellt wird, die einem Patienten angemessen verabreicht werden kann.
Der Wirkstoff der Erfindung kann als neutrale oder Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen diejenigen, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie diejenigen, die von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure usw. abgeleitet werden, und diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie diejenigen, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisenhydroxid, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain usw. gebildet werden, ein.
Die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustands wirksame Menge des therapeutischen Mittels der Erfindung hängt von der Natur der Störung oder dem Zustand ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Zudem können wahlweise Tests in vitro eingesetzt werden, um die Identifizierung von optimalen Dosisbereichen zu unterstützen. Die genaue in der Formulierung einzusetzende Dosis hängt auch von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Erkrankung oder Störung ab und sollte gemäß der Beurteilung des Arztes und den jeweiligen Umständen des Patienten entschieden werden.
Erfindungsgemäß kann ein retro-invertiertes Zielpeptid auch als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die sich immunspezifisch an ein Immunogen binden. Derartige Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimere, einkettige Antikörper Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsgenbank ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Diese Antikörper können in mit der Lokalisierung und Aktivität der Retro-Inversions-Zielpeptidsequenzen der Erfindung verbundenen Verfahren, z.B. zum Abbilden dieser Peptide nach einer Verabreichung in vivo (z.B. zum Überwachen der Behandlungseffizienz), Messen der Gehalte davon in geeigneten physiologischen Proben, in diagnostischen Verfahren, usw. verwendet werden. Zum Beispiel können Antikörper oder Antikörperfagmente, die für eine Domäne eines Retro-Inversions-Zielpeptids wie eine Dansylgruppe oder ein etwas anderes in das Peptid eingebrachtes Epitop spezifisch sind, zum 1) Identifizieren der Gegenwart des Peptids auf einem Nanoteilchen oder einem anderen Substrat, 2) Quantifizieren der Menge des Peptids auf dem Nanoteilchen, 3) Messen des Peptidgehalts in geeigneten physiologischen Proben, 4) Durchführen von Immunhistologie von Gewebeproben, 5) Abbilden des Peptids nach Verabreichung in vivo, 6) Reinigung des Peptids aus einem Gemisch unter Verwendung einer Immunaffinitätssäule, 7) Binden oder Fixieren des Peptids auf der Oberfläche des Nanoteilchens oder 8) wenn entweder einem Wirkstoff enthaltenden Teilchen oder dem Wirkstoff selbst auch eine Kennzeichnung zugeführt wird, Verfolgen des Schicksals sowohl des Teilchens/Wirkstoffs als auch des Retro-Inversions-Zielpeptids, um zu bestimmen, ob und/oder wo sie abgetrennt wurden, verwendet werden: Verwende 7 von vorstehenden Ausführungsformen des Anbringens des Antikörpers (oder Fragments des Antikörpers) an der Oberfläche von Arzneimittel-beladenen Nanoteilchen oder anderen Substraten und dann Inkubieren dieses Konjugats mit dem Peptid. Dieses Verfahren führt zum Binden des Peptids in einer bestimmten fixierten Ausrichtung, was zu einem Teilchen führt, das das Peptid in an den Antikörper in derartiger Weise gebundener Form enthält, dass das Peptid vollständig aktiv ist. Zudem können Antikörper oder Antikörperfragmente, die für eine spezifische Domäne eines retroinvertierten Zielpeptids spezifisch sind, 9) bei konfokalen mikroskopischen Abbildungstechniken oder anderen Abbildungstechniken zum Aufzeigen oder Bestätigen oder Identifizieren des Orts oder der Lokalisierung des Peptids auf der Oberfläche eines Nano- oder Mikroteilchens, 10) bei konfokalen mikroskopischen Abbildungstechniken oder anderen Abbildungstechniken zum Aufzeigen oder Bestätigen oder Identifizieren des Orts oder der Lokalisierung des Peptids auf der Oberfläche eines Nanoteilchens oder eines Mikroteilchens, das auch mit einem fluoreszierenden Mittel beladen wurde, 11) im Falle von mit dem Peptid beschichteten Nanoteilchen oder Mikroteilchen, die in durch ein Mikroton oder eine andere geeignete Technik zwei Hälften geschnitten wurden, in geeigneten quantitativen Techniken wie konfokalen mikroskopischen Abbildungstechniken oder anderen quantitativen Abbildungstechniken zum Identifizieren oder Quantifizieren der jeweiligen Verteilung des Peptids zwischen der Oberfläche der Nanoteilchen oder Mikroteilchen und der unteren Oberfläche innerhalb einer Matrix der Nanoteilchen oder Mikroteilchen, 12) in konfokalen mikroskopischen Abbildungstechniken oder anderen Abbildungstechniken zum Aufzeigen oder Bestätigen oder Identifizieren des Orts eines Peptids auf der Oberfläche eines Nanoteilchens oder Mikroteilchens, das mit einem fluoreszierenden Mittel wie TRME oder Fluoraszen beladen wurde, 13) zum Identifizieren dessen, welches Epitop oder welche Domäne des Peptids für eine Identifizierung durch den Antikörper verantwortlich ist, Peptidderivate wie cyclische Formen oder Derivate, die Zwischenkettendisulfidbindungen enthalten, oder andere Zwischenkettensulfidbindungen können ebenso bei Abbildungsstudien zum Identifizieren dessen, welche Domäne oder welches Epitop des Peptids für die Erkennung durch den Antikörper verantwortlich ist, verwendet werden, 14) im Falle von Peptidderivaten, in welchen das Epitop oder die Domäne, das/die für die Bindung an einen Zielrezeptor verantwortlich ist, von Disulfidbindungen oder anderen Zwischenkettenbindungen eingegrenzt ist, und wobei diese Domäne auch für die Bindung des Antikörpers verantwortlich ist, zum Bestimmen dessen, ob das Epitop oder die Domäne exponiert oder für die Bindung an den Antikörper verfügbar ist, wenn das Peptid oder Derivat auf die Oberfläche eines Nanoteilchens, Mikroteilchens oder anderen Substanz aufgetragen ist, 15) wenn das Eptiop oder die Domäne auf dem Peptid, das sich an die Zielrezeptoren im menschlichen Magen-Darmtrakt oder die Zielrezeptoren auf epithelialen Modellzellen wie Caco-2-Zellen oder polarisierte Caco-2-Zellen bindet, und wo dieses Epitop oder diese Domäne auf dem Peptid auch für die Bindung durch den Antikörper verantwortlich ist, für Konkurrenzstudien zum Konkurrieren um die Bindung des Peptids an dessen Zielrezeptorstellen, und 16) wo das Epitop oder die Domäne auf dem Peptid, das sich an die Zielrezeptoren im menschlichen Magen-Darm-Trakt oder die Zielrezeptoren auf epithelialen Modellzellen wie Caco-2-Zellen oder polarisierte Caco-2-Zellen bindet oder wo die ses Epitop oder diese Domäne auf dem Peptid auch für die Bindung durch den Antikörper verantwortlich ist, für Konkurrenzstudien, in welchen Nanoteilchen oder Mikroteilchen mit dem Peptid beschichtet und bei Zellbindungsstudien und/oder bei Rezeptorbindungsstudien verwendet werden, verwendet werden.
Abtide (oder Antigenbindungspeptide), die für eine Domäne des retro-invertierten Zielpeptids verantwortlich sind, wie eine Dansylgruppe oder ein etwas anderes in das Peptid eingebrachtes Epitop, können für dieselben wie vorstehend für die Antikörper identifizierte Zwecke verwendet werden.
Die retro-invertierten Peptide dieser Erfindung können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Kurz gesagt, bestehen z.B. Festphasenpeptidsysthesen aus der Kupplung der Carboxylgruppen der C-terminalen Aminosäure an ein Harz und der anschließenden Addition von N-alpha-geschützten Aminosäuren. Bei den Schutzgruppen kann es sich um beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Schutzgruppen handeln. Bevor jede neue Aminosäure an die wachsende Kette addiert wird, wird die Schutzgruppe für die vorher an die Kette addierten Aminosäuren entfernt. Die Kupplung von Aminosäuren an geeignete Harze ist von Rivier et al., US-Patent Nr. 4,244,946 beschrieben. Derartige Festphasensynthesen wurden z.B. durch Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, Vale et al., 1981, Science 213: 1394–1397, Marki et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3178 und in den US-Patenten Nr. 4,305,872 und 4,316,891 beschrieben. In einem bevorzugten Aspekt wird eine automatische Peptidsyntheseapparatur eingesetzt.
Beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung können Peptide auf einer automatischen Peptidsyntheseapparatur von Applied Biosystems Inc. („ABI") Model 431 A unter Verwendung des Syntheseprotokolls „Fastmoc" geliefert von ABI, das 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluroniumhexafluorphosphat („HBTU") (R. Knorr et al., 1989, Tet. Lett., 30: 1927) als Kupplungsmittel verwendet, synthetisiert werden. Die Synthesen können durch 0.25 mmol im Handel erhältliches 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl(9-fluorenylethoxycarbonyl)aminomethyl)phenoxypolystyrolharz („Rink-Harz" von Advanced ChemTech) (H. Rink, 1987, Tet. Lett. 28: 3787) durchgeführt werden. Fmoc-Aminosäuren (1 mmol) werden gemäß dem Fastmoc-Protokoll gekoppelt. Die folgenden Seitenketten-geschützten Fmoc-Aminosäurederivative werden verwendet: FmocArg(Pmc)OH, FmocAsn(Mbh)OH, FmocAsp(^tBu)OH, FmocCys(Acm)OH, FmocGlu(^tBu)OH, FmocGln(Mbh)OH, FmocHis(Tr)OH, FmocLys(Boc)OH, FmocSer(^tBu)OH, FmocThr(^tBu)OH, FmocTyr(^tBu)OH. [Abkürzungen: Acm: Acetamidomethyl, Boc: tert-Butoxycarbonyl, ^tBu: tert-Butyl, Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Mbh: 4,4'-Dimethoxybenzhydryl, Pmc: 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl, Tr: Trityl].
Die Synthese wird unter Verwendung von N-Methylpyrrolidon (NMP) als Lösungsmittel mit in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöstem HBTU durchgeführt. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird unter Verwendung von etwa 20%igem Piperidin in NMP bewirkt. Am Ende jeder Synthese wird die Menge an vorliegendem Peptid durch Ultraviolettspektroskopie getestet. Eine Probe von trockenem Peptidharz (etwa 3–10 mg) wird gewogen, dann wird 20%iges Piperidin in DMA (10 ml) zugesetzt. Nach 30-minütiger Beschallung wird die UV(Ultraviolett)-Absorption des Dibenzofulven-Piperidin-Addukts (gebildet durch Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Gruppe) bei 301 nm aufgezeichnet. Die Peptidsubstitution (in 20 mmol/g^–1) kann gemäß folgender Gleichung berechnet werden:
wobei A die Absorption bei 301 nm ist, v das Volumen von 20%igem Piperidin in DMA (in ml) ist, 7800 der Extinktionscoeffizient (in mol^–1dm³cm^–1) des Dibenzofulven-Piperidin-Addukts ist, und w das Gewicht der Peptinharzprobe (in mg) ist.
Schließlich wird die N-terminale Fmoc-Gruppe unter Verwendung von 20%igem Piperidin in DMA abgespalten, dann unter Verwendung von Essigsäureanhydrid und Pyridin in DMA acetyliert. Das Peptidharz wird mit DMA, CH₂Cl₂ und schließlich Diethylether gründlich gewaschen.
Beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung kann die Spaltung und die Abspaltung der Schutzgruppen wie folgt durchgeführt werden. Das luftgetrocknete Peptidharz wird mit Ethylmethylsulfid (EtSMe), Ethandithiol (EDT) und Thioanisol (PhSMe) für eine Dauer von etwa 20 Minuten vor der Zugabe von 95%iger wässriger Trifluoressigsäure (TFA) behandelt. Ein Gesamtvolumen von etwa 50 ml dieser Reagenzien wird pro Gramm Peptidharz verwendet. Das folgende Verhältnis wird verwendet: TFA:EtSMe:EDT:PhSMe (10:0,5:0,5:0,5). Das Gemisch wird für eine Dauer von 3 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂-Atmosphere gerührt. Das Gemisch wird filtriert und das Harz mit TFA (2 × 3 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wird im Vakuum eingedampft und wasserfreier Diethylether dem gelb/orangen Rückstand zugesetzt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird durch Filtration isoliert. Siehe King et al., 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255–266 im Hinblick auf verschiedene Spaltungsverfahren.
Die Reinigung der synthetisierten Peptide kann durch Standardverfahren, einschließlich Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größensäulenchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, (HPLC)), Zentrifugation, Differentiallöslichkeit oder durch jede beliebige andere Standardtechnik durchgeführt werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren an andere Moleküle (z.B. eine nachweisbare Markierung, ein Molekül, das die Adsorption an einen Festen Träger oder ein Toxin gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung erleichtert) gebunden werden. Derartige Verfahren schließen die Verwendung von homobifunktionellen und heterobifunktionellen Vernetzungsmolekülen ein.
Die homobifunktionellen Moleküle weisen mindestens zwei reaktive funktionelle Gruppen auf, die gleich sind. Die reaktiven funktionellen Gruppen oder ein homobifunktionelles Molekül schließen z.B. Aldehydgruppen und aktive Estergruppen ein. Homobifunktionelle Moleküle mit Aldehydgruppen schließen z.B. Glutaraldehyd und Subaraldehyd ein. Die Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel wurde von Poznansky et al., 1984, Science 223: 1304–1306 offenbart.
Homobifunktionelle Moleküle mit mindestens zwei aktiven Estereinheiten schließen Ester von Dicarbonsäuren und and N-Hydroxysuccinimid ein. Einige Beispiele für derartige N-Succinimidylester schließen Disuccinimidylsuberat und Dithiobis(succinimidylpropionat) und ihre löslichen Bissulfonsäuren und Bissulfonatsalze wie deren Natrium- und Kaliumsalze ein. Diese homobifunktionellen Reagenzien sind von Pierce, Rockford, Illinois, erhältlich.
Die heterobifunktionellen Moleküle weisen mindestens zwei verschiedene reaktive Gruppen auf. Einige Beispiele für heterobifunktionelle Reagenzien, die reaktive Disulfidbindungen enthalten, schließen N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Carlsson et al., 1978, Biochem J. 173: 723–737), Natrium-S-4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methylbenzylthiosulfat und 4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-(2-pyridyldithio)toluol ein. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat ist bevorzugt. Einige Beispiele für heterobifunktionelle Reagenzien, die reaktive Gruppen mit einer Doppelbindung, die mit einer Thiolgruppe reagiert, umfassen, schließen Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat und Succinimidyl-m-maleimidobenzoat ein.
Andere heterobifunktionelle Moleküle schließen Succinimidyl-3-(maleimido)propionat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyclohexan)-1-carboxylat, Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester ein. Das Natriumsulfonatsalz von Succinimidyl- m-maleimidobenzoat ist bevorzugt. Viele der vorstehend erwähnten heterobifunktionellen Reagenzien und deren Sulfonatsalze sind von Pierce erhältlich.
Zusätzliche Informationen im Hinblick dessen, die diese sowie andere polyfunktionelle Reagenzien hergestellt und verwendet werden, kann aus den folgenden und anderen auf dem Fachgebiet verfügbaren Veröffentlichungen erhalten werden: Carlsson et al., 1978, Biochem. J. 173: 723–737, Cumber et al., 1985, Methods in Enzymology 112: 207–224, die et al., 1978. Biochem 17: 5399–5405, Sun et al., 1974, Biochem. 13: 2334–2340, Blattler et al., 1985, Biochem. 24: 1517–152, Liu et al., 1979, Biochem. 18: 690–697, Youle und Neville, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5483–5486, Lerner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3403–3407, Jung und Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761: 162, Caulfield et al., 1984, Biochem. 81: 7772–7776, Status, 1982, Biochem. 21: 3950–3955, Yoshitake et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101: 395–399, Yoshitake et al., 1982, J. Biochem. 92: 1413–1424, Pilch und Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254: 3375–3381, Novick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487, Lomant und Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104: 243–261, Hamada und Tsuruo, 1987, Anal. Biochem. 160: 483–488, Hashida et al., 1984, J. Applied Biochem. 6: 56–63.
Zusätzlich sind Vernetzungsverfahren von Means and Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1: 2–12 besprochen.
Synthese und Charakterisierung von retro-invertierten Zielpeptiden
Ähnlich denjenigen, die in der vorstehend genannten WO 98/51325 beschrieben sind, wurden synthetisch dansylierte Peptide bei Genosys Biotechnologies, UK und Anaspec Inc., USA, hergestellt. Charakterisierungsprofile schlossen das Erscheinungsbild, die Löslichkeit, HPLC und Massenspektrometrie (Mindestreinheit > 95%) ein. Tabelle 1 zeigt die primären Sequenzen für sowohl das retroinvertierte Peptid, das durch Bezugnahme auf bestimmte GIT-Zielmittel synthetisiert wurde, als auch die ursprünglichen GIT-Zielmittel selbst.
Analyse der Bindung von dansylierten Peptiden von Coco-2-Zellmembranfraktionen durch ELISA
Ähnlich den in der vorstehend genannten WO 98/51325 beschriebenen Verfahren wurden Caco-2-Zellmembran (P100) und cytosole (5100) Fraktionen unter Verwendung einer Modifikation des in Kinsella, B. T., O'Mahony, D. J. und G. A. FitzGerald, 1994, J. Biol. Chem. 269(47): 29914–29919, beschriebenen Verfahrens hergestellt. Zusammenfließende Caco-2-Zellmonoschichten (wuchsen in Kolben mit 75 cm² für eine Dauer von bis zu einer Woche bei 37°C und 5% CO₂) wurden zweimal in PBS von Dulbecco (DPBS) gewaschen, und die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 1000 UpM nach einer Behandlung mit 10 mM EDTA-DPBS geerntet. Die Zellen wurden dreimal in DPBS gewaschen, und das fertige Zellpellet wurde erneut in 3 Volumen eisgekühltem HED-Puffer (20 mM HEPES (pH 7,67), 1 mM EGTA, 0,5 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) suspendiert. Man ließ die Zellen für eine Dauer von 5 Mi nuten auf Eis vor der Homogenisierung für eine Dauer von 30 Sekunden quellen. Die Homogenate wurden mit 40.000 UpM für eine Dauer von 45 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand (S100) wurde entfernt und das Pellet (P100) erneut in HEDG-Puffer (20 mM HEPES (pH 7,67), 1 mM EGTA, 0,5 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl, 10% Glyzerin, 1 mM PMSF) suspendiert. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bradford-Tests (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72: 248–254) bestimmt.
Die Bindung von Peptiden an Membran (P100) wurde durch den Nachweis der in das Peptid eingebrachten Dansyleinheiten getestet. ELISA-Platten von Costar mit 96 Mulden wurden mit P100-Fraktionen (100 μg/ml in 0,05 M NaHCO₃ (pH 9,6), 100 μl/Mulde) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit 2% Marvel-DPBS für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dreimal in 1%igem DPBS-Tween gewaschen. Peptide (200 μg/ml in 2% Marvel-DPBS) wurden auf den Platten serienverdünnt und für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal gewaschen und die dansylierten Peptide unter Verwendung von i) Mäuse-Antidansyl-Antiserum (Cytogen DB3-226,3, 1: 1340 Verdünnung in 2% Marvel-DPBS) oder ii) Kaninchen-Antidansyl-Antiserum (La Jolla Diagnostics LAJD-119, Verdünnungen von 1:1000) für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur nachgewiesen. Die Platten wurden vor der Inkubation dreimal mit i) Ziegen-Anti-Mäuse-IgGλ:HRP-Antikörper (Southern Biotechnology 1060-05, Verdünnung von 1:10.000 in 2% Marvel-DPBS) oder ii) Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Sigma A-0545, 1:8.000) für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur gewaschen. Nach drei Waschungen wurden die Reaktionen unter Verwendung von IC-Blue-Substrat und Red-Stop-Lösung (Neogen Co. 300176 bzw. 301475) bei 650 nm sichtbar gemacht.
ZElan021, HAX42 [K(dns)-[SDHALGTNLRSDNAKEPGDYNCCGNGNSTGRKVFNRRRPSAIPT] mit voller Länge, wurde für eine Bindung an P100 mit einer vorgegebenen aus den Daten des Signal-zu-Lärm-Verhältnisses bestimmten Peptidkonzentration der willkürliche Wert von 1,00 verliehen. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der P100-Tests mit den HAX42-verwandten Peptiden ZElan021, ZElan091 und ZElan146. Testnummer 1 wurde mit 20 μg/ml, 2 und 3 wurden mit 50 μg/ml und 4 bis 8 mit 25 μg/ml durchgeführt. Die Ergebnisse für die retro-invertierte Form ZElan146 zeigten verglichen mit dem HAX42-Fragment ZElan091 eine angemessene Bindung und dass die Aktivität des GIT-Zielmittels nicht eliminiert war, als es zu seiner retro-invertierten Form umgewandelt wurde.
K_D-Werte oder die Konzentration der Peptide, die zum Erreichen einer halbmaximalen Bindung an Caco-2 P100-Fraktionen erforderlich war, sind für ZElan021, HAX42, [K(dns)-[SDHALGTNLRSDNAKEPGDYNCCGNGNSTGRKVFNRRRPSAIPT] mit voller Länge, HAX42-Fragment ZElan091 und die retro-invertierte Form dieses Fragments, ZElan146 sowie für ZElan018 PAX2, [K(dns)-[STPPSREAYSRPYSVDSDSDTNAKHSSI-INRRLRTRSRPNG] mit voller Länge, PAX2-Fragment ZElan129, und die retroinvertierte Form dieses Fragments ZElan 144 in Tabelle 3 angegeben.
Herstellung und Analyse von Peptid-beschichteten Insulin-beladenen PLGA-Teilchen
Insulin-beladene PLGA-Teilchen werden mit erfindungsgemäßen retroinvertierten Peptiden oder GIT-Zielmittel durch die in der vorstehend genannten WO 98/51325 beschriebenen Coaktivierungsverfahren beschichtet. Insbesondere werden einen Wirkstoff enthaltende feste Teilchen aus einem Polymer mit einer Teilchengröße zwischen etwa 10 nm und 500 μm, besonders bevorzugt 50 bis 800 nm gebildet. Zudem enthalten die Teilchen retro-invertierte Zielpeptide, die in die Teilchen unter Verwendung einer Anzahl an wie nachstehend umrissenen und in der vorstehend genannten WO 98/51325 beschriebenen Verfahren eingebracht.
Das Polymer der organischen Phase (B) des allgemeinen nachstehend angegebenen Verfahrens kann löslich, durchlässig, undurchlässig, bioabbaubar oder gastroretentiv sein. Das Polymer kann aus einem Gemisch aus Polymer oder Copolymeren bestehen und ein natürliches oder synthetisches Polymer sein. Beispielhafte bioabbaubare Polymere schließen ohne Beschränkung Polyglycolide, Polylactide, Poly(lactidcoglycolide), einschließlich DL-, L- und D-Formen, Copolyoxalate, Polycaprolacton, Polyesteramide, Polyorthoester, Polyanhydride, Polyalkylcyanoacrylate, Polyhydroxybutyrate, Polyurethane, Albumin, Casein, Citosanderivate, Gelatin, Acacia, Cellulosen, Polysaccharide, Alginsäure, Polypeptide und dergleichen, Copolymere davon, Gemische davon und Stereoisomere davon ein. Beispielhafte synthetische Polymere schließen Alkylcellulosen, Hydroxalkylcellulosen, Celluloseether, Celluloseester, Nitrocellulosen, Polymers von Acryl- und Methacrylsäuren und Ester davon, Dextrane, Polyamide, Polycarbonate, Polyalky lene, Polyalkylenglykole, Polyalkylenoxide, Polyalkylenterephthalate, Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester, Polyvinylhalogenide, Poyvinylpyrrolidon, Polysiloxane und Polyurethane und Copolymere davon ein.
Typischerweise werden Teilchen unter Verwendung des folgenden allgemeinen Verfahrens gebildet.
Eine wässrige Lösung (A) eines Polymers, eines oberflächenaktiven Mittels, eines Oberflächenstabilisierungs- oder Modifizierungsmittels oder Salzes oder eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise eines Polyvinylalkohols (PVA) oder Derivats mit einer prozentualen Hydrolyse von 50–100% und einem Molekulargewichtsbereich von 500–500.000, besonders bevorzugt einer Hydrolyse von 80–100% und einem Molekulargewicht von 10.000 bis 150.000 wird in ein Gefäß eingebracht. Das Gemisch (A) wird unter Niedrigscherbedingungen mit 10–2.000 UpM, vorzugsweise 100–600 UpM gerührt. Der pH-Wert und/oder die Ionenstärke dieser Lösung kann unter Verwendung von Salzen, Puffern oder anderen Modifikationsmitteln modifiziert werden. Die Viskosität dieser Lösung kann unter Verwendung von Polymeren, Salzen oder anderen Viskositätsverbesserungs- oder Modifikationsmitteln modifiziert werden.
Ein Polymer, vorzugsweise Poly(lacid-co-glycolid), Polylactid, Polyglycolid oder eine Kombination davon oder in beliebiger enantiomerer Form oder ein kovalen tes Konjugat dieser Polymere mit einem Zielliganden wird unter Bildung der organischen Phase (B) in wassermischbaren organischen Lösungsmitteln gelöst. Besonders bevorzugt wird abhängig von dem verwendeten Polymer eine Kombination aus Aceton und Ethanol in einem Verhältnisbereich von 0:100 Aceton: Ethanol bis 100: 0 Aceton: Ethanol verwendet.
(Ein) zusätzliches) Polymer(e), Peptid(e), Zucker, Salze, natürliche(s)/biologische(s) Polymer(e) und andere Mittel können ebenso der organischen Phase (B) zugesetzt werden, um die physikalischen und chemischen Eigen schaften des erhaltenen Teilchenprodukts zu modifizieren.
Ein Arzneimittel oder eine bioaktive Substanz kann in entweder die wässrige Phase (A) oder die organische Phase (B) eingebracht werden. Ein Retro-Inversions-Zielpeptid oder GIT-Zielmittel kann zu diesem Punkt auch entweder in die wässrige Phase (A) oder die organische Phase (B) eingebracht werden.
Die organische Phase (B) wird mit kontinuierlicher Geschwindigkeit der gerührten wässrigen Phase (A) zugesetzt. Das Lösungsmittel wird vorzugsweise durch Temperaturerhöhung über die Umgebungstemperatur und/oder die Verwendung einer Vakuumpumpe abgedampft. Die Teilchen liegen nun als Suspension (C) vor. Ein Retro-Inersions-Zielpeptid oder GIT-Zielmittel kann zu diesem Punkt in die gerührte Suspension eingebracht werden.
Eine zweite Schicht aus Polymer(en), Peptid(en), Zuckern, Salzen, natürlichen/biologischen Polymeren und anderen Mitteln kann an dieser Stufe durch ein beliebiges geeignetes Verfahren auf dem vorgebildeten teilchenförmigen Kern abgeschieden werden.
Die Teilchen (D) werden dann unter Verwendung von standardmäßigen Kolloidalabtrennungstechniken, vorzugsweise durch Zentrifugation mit hoher „g"-Kraft, Filtration, Kreuzfließfiltration, Gelpermeationschromatographie, Affinitätschro matographie oder Ladungsabtrennungstechniken von der Suspension (C) abgetrennt. Der Überstand wird verworfen, und die Teilchen (D) werden in einer Waschlösung (E) vorzugsweise in Wasser, einer Salzlösung, Puffer oder organischem Lösungsmittel(n) suspendiert. Die Teilchen (D) werden von der Waschflüssigkeit in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, abgetrennt und erneut (üblicherweise zweimal) gewaschen. Ein Zielligand kann in der Waschlösung (E) bei der anfänglichen, Zwischen- und/oder der Endwaschstufe gelöst und zum Waschen der Teilchen (D) verwendet werden.
Die Teilchen können dann getrocknet werden. Die Teilchen können dann weiter verarbeitet, z.B. tablettiert, eingekapselt oder sprühgetrocknet werden.
Das Freisetzungsprofil der vorstehend gebildeten Teilchen kann abhängig von der verwendeten und/oder gewünschten Formulierung von unmittelbar bis kontrolliert oder verzögerte Freisetzung variiert werden.
Die Arzneimittelbeladung kann im Bereich von 0–90% G/G liegen. Die Beladung des Retro-Inversions-Zielpeptids oder des GIT-Zielmittels kann im Bereich von 0–90% G/G liegen.
Insulin-beladene Nanoteilchen aus PLGA (RG504H) wurden wie vorstehend angegeben für die folgenden Zielliganden hergestellt: HAX42 (ZElan021) mit voller Länge, PAX2 (ZElan018) mit voller Länge, HAX42-Fragment ZElan091, PAX2-Fragment ZElan129, HAX42-Fragment-retro-invertiertes Peptid ZElan146 und PAX2-Fragment-retro-invertiertes Peptid ZElan144. Der Rinderinsulingehalt (HPLC) und die Peptidbeladung (Dansylfluoreszenz) wurden vor der Analyse der Insulinabgabe unter Verwendung des offenen Schleifenmodells in Wistar-Ratten getestet. Tabelle 4 zeigt den Insulingehalt und die Zielpeptidbeladung der PLG-Teilchen.
Tierversuche
Ein Test in vivo über die orale Insulinbioverfügbarkeit von verschiedenen Retro-Inversions-Zielpeptiden wurde unter Verwendung von offenen Schleifenstudien durchgeführt, wobei die vorstehend beschriebene Nanoteilchen (Tabelle 4) enthaltende Testlösung direkt in den Krummdarm von Wistat-Ratten ähnlich den in der vorstehend genannten WO 98/51325 beschriebenen Protokollen injiziert wurde. Kurz gesagt, ließ man Wistar-Ratten (300–350 g) für eine Dauer von 4 Stunden fasten, und sie wurden 15 bis 20 Minuten vor der Verabreichung der Testlösung durch intramuskuläre Verabreichung mit einer Lösung von Ketamin [0,525 ml Ketamin (100 mg/ml) und 0,875 ml Acepromazinmaleat-BP ACP (2mg/ml)] anästhesiert. Den Ratten wurde dann 2–3 cm unter der Pyloris intraduodenal eine Testlösung (Injektionsvolumen: 1,5 ml PBS) injiziert. Insulin (schnellwirkendes Rinderinsulin, 28,1 iu/mg) wurde in die wie vorstehend beschriebenen Teilchen auf eine Gesamtdosis von 300 iu Insulin (etwa 210 mg Teilchen) eingebracht. Blutglukosewerte für die Ratten wurden unter Verwendung eines Glucometers^TM (Bayer, 0,1 to 33,3 m/mol/l) gemessen, Plasmainsulinwerte wurden unter Ver wendung von Phadeseph RIA Kit^TM (Upjohn Pharmacia, 3 bis 240 μU/ml doppelt getestet) gemessen. Proben von systemischen und Portalblut wurden entnommen.
Die Testgruppen schlossen Tiere ein, die Testlösungen erhielten, die mit den folgenden wie in Tabelle 4 dargestellten Peptiden beschichteten Teilchen enthielten. Kontrollgruppen schlossen ein: 1) PBS-Kontrolle (1,5 ml) offene Schleife, 2) Insulinlösung (1 iu/0,2 ml) subkutan, 3) Insulinteilchen, kein Peptid.
Tabelle 5 zeigt die Insulinbioverfügbarkeit für die vorstehend beschriebenen Insulin-beladenen Nanoteilchen (oberflächenmodifiziert mit Retro-Inversions-Zielpeptid oder GIT-Zielmittel), ausgedrückt als prozentuale Bioverfügbarkeit der verabreichten oralen Dosis, verglichen mit der subkutanen Insulinbezugsdosis. 1 und 2 zeigen (1) die systemische Blutglukose- und (2) Insulingehalte nach intestinaler Verabreichung von Kontrolle (PBS), erfindungsgemäßen ZElan021-beschichteten insulinhaltigen Teilchen, ZElan018-beschichteten insulinhaltigen Teilchen, ZElan091-beschichteten insulinhaltigen Teilchen, ZElan 129-beschichteten insulinhaltigen Teilchen und ZElan144-beschichteten insulinhaltigen Teilchen (Insulinbeladung: 300 iu).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Retro-invertiertes Peptid, das sich spezifisch an einen Magen-Darm-Trakt-Rezeptor bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ZElan144 (IC(dns)-rtrlrrnhsshkant), ZElan145 (Kdns)-gphrrgrpnsskrt) und ZElan146 (K(dns)-gtsngngccnydgp) oder einem Bindungsteil davon umfasst, die/der sich an einen Magen-Darm-Trakt-Rezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HPT1, hPEPT1, D2H und hSI bindet.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid nicht mehr als 50 Aminosäurereste umfasst.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid nicht mehr als 40 Aminosäurereste umfasst.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid nicht mehr als 30 Aminosäurereste umfasst.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid nicht mehr als 20 Aminosäurereste umfasst.
Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das an ein einen Wirkstoff umfassendes Material gebunden ist, wobei der Wirkstoff bei der Behandlung einer Erkrankung oder Störung eines Säugers wertvoll ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Wirkstoff ein Medikament ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Material ein einen Wirkstoff enthaltendes Teilchen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Material eine das Medikament enthaltende Vorrichtung mit langsamer Freisetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Peptid an das Material kovalent oder nicht kovalent gebunden ist.
Zusammensetzung, umfassend ein chimeres Protein, das an ein einen Wirkstoff umfassendes Material gebunden ist, wobei das chimere Protein eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ZElan144 (K(dns)-rtrlrrnhsshkant), ZElan145 (Kdns)-gphrrgrpnsskrt) und ZElan146 (K(dns)-gtsngngccnydgp) oder einem Bindungsteil davon umfasst, die/der sich an einen Magen-Darm-Trakt-Rezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HPT1, hPEPT1, D2H und hSI, bindet, der sich über eine kovalente Bindung an eine Aminosäuresequenz eines zweiten Proteins bindet, und wobei der Wirkstoff bei der Behandlung einer Erkrankung oder Störung eines Säugers wertvoll ist.
Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, das an ein ein Medikament enthaltendes Teilchen nicht kovalent gebunden ist.
Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, das an ein Medikament kovalent gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, die den Transport des Wirkstoffs durch menschliches oder tierisches Magen-Darm-Gewebe erleichtert.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, die den Wirkstoff auf eine ausgewählte Stelle oder ein ausgewähltes Gewebe in einem Menschen oder Tier abzielt.
Arzneimittel, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 6 in einem zur Verwendung bei Menschen in vivo geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger.
Antikörper, der die Domäne an einem sich an einen Magen-Darm-Trakt-Rezeptor bindendes Peptid immunspezifisch binden kann, wobei das Peptid ein beliebiges nach den Ansprüchen 1 bis 5 ist.
Molekül, umfassend ein Fragment des Antikörpers nach Anspruch 17, wobei das Fragment das Peptid immunspezifisch binden kann.
Arzneimittel, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer das Peptid nach den Ansprüchen 1 bis 5 umfassenden Zusammensetzung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das Peptid auf der Oberfläche eines Nano- oder Mikroteilchens aufgetragen, absorbiert oder an diesem kovalent gebunden ist.
Nano- oder Mikroteilchen, das aus dem Peptid nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5 gebildet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Nano- oder Mikroteilchen ein mit einem Medikament beladenes oder ein Medikament einkapselndes Nano- oder Mikroteilchen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Medikament Insulin oder Leuprolid ist.
Retro-invertiertes Peptid nach einem der Ansprüche 1–5 zur Verwendung beim Verbessern der Abgabe eines Wirkstoffs über den Magen-Darm-Trakt in den systemischen, portalen oder hepatischen Kreislauf.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6–16 und 20–23 zum Verbessern der Abgabe eines Wirkstoffs in über den Magen-Darm-Trakt in den systemischen, portalen oder hepatischen Kreislauf.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6–16 und 20–23 zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung oder Störung eines Säugers.