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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Synthese und Charakterisierung
neuer Systeme zum Hinführen und
zur Vektorisierung von Molekülen
therapeutischen Interesses zu Targetzellen.
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Präziser ausgedrückt interessiert
sich die Erfindung für
Molekularkomplexe, die in der Lage sind, mehrere funktionelle Moleküle zu kombinieren,
die prädefinierte
Eigenschaften der Erkennung oder Effizienz aufweisen, für ihr Herstellungsverfahren
und ihre therapeutische Verwendung oder ihre Verwendung als diagnostisches
Werkzeug.
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Die
Literatur beschreibt zahlreiche Verfahren der Gewinnung von polyfunktionellen
monovalenten Biokonjugatkomplexen (Lemieux et al. Trends in Biotechnology,
1998, 16, 506-513). Allerdings rufen diese Komplexe eine relativ
schwache biologische Reaktion hervor. Also wurden multivalente Systeme
hergestellt (Tam et al., Biomedical Peptides, Proteins & Nucleic Acids,
1995, 1, 123-132). Die Studien zeigten, dass die polyvalenten Komplexe
ganz generell weitaus bessere biologische Werkzeuge als die monovalenten
Biokonjugatkomplexe sind (Grubbs, R.H. et al., J.Am. Chem. Soc.,
2001, 123, 1275-1279).
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Das
Interessante solcher Biokonjugatkomplexe besteht darin, die individuellen
Eigenschaften von wenigstens zwei unterschiedlichen Molekülklassen
zu verknüpfen.
Allerdings ist eine der auftauchenden Schwierigkeiten die potentielle
Interaktion, die die unterschiedlichen Moleküle eines Biokonjugats aufweisen
können. Diese
Interaktion kann die aus der Biokonjugation resultierenden Eigenschaften
verändern.
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Eine
Lösung
dieses Problems besteht in der räumlichen
Trennung der Biokonjugationspunkte, was zur Entwicklung adressierbarer
Molekularschablonen oder -chassis geführt hat. L. Scheibler, P. Dumy
et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3725-3734, beschreibt die Synthese
und Charakterisierung der Molekularchassis, die mit Koordinationsgruppen
und Alkanketten funktionalisiert sind.
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Eine
weitere Schwierigkeit ist die Fixierung auf dem Chassis der interessierenden
Moleküle.L.
Scheibler, P. Dumy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 696-699,
beschreibt ein auf einer Seite chemoselectiv funtionalisiertes Chassis
mittels einer Oximverbindung.
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Der
Lehre vom Stand der Technik ermöglicht
es allerdings nicht, ein auf beiden Seiten funktionalisiertes Chassis
zu synthetisieren, da zumindest eine der Funtionalisierungen chemoselektiv
ist und jede Seite therapeutisch, diagnostisch oder kennzeichnend
interessierende Moleküle
aufweist.
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Die
Erfindung besteht also in einem Herstellungsverfahren eines beidseitig
gepfropften homodetischen Cyclopeptids.
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Präziser ausgedrückt besteht
die Erfindung also im Herstellungsverfahren eines homodetischen
gepfropften Cyclopeptids, das ein zwei Seiten definierendes Chassis
bildet, die obere und untere Seite genannt werden, wobei die genannten
Seiten beide gepfropt sind, dadurch gekennzeichnet dass man ein
lineares Peptid synthetisiert, wobei die besagte Synthese ausgehend
von modifizierten und nicht modifizierten Aminosäuren durchgeführt wird,
wobei einige von ihnen orthogonale Schutzgruppen tragen, wobei man
eine intramolekulare Cyclisierung des hergestellten linearen Peptids
durchführt,
alle oder einen Teil der orthogonalen Schutzgruppen durch eine geschützte Vorstufe
ersetzt, wobei man auf die eine und/oder andere Seite des besagten Chassis
mittels einer Oximverbindung mindestens ein interessierendes Molekül pfropft.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft also das Herstellungsverfahren des
Molekularchassis eines polyfunktionellen Moleküls, das in vier Etappen gewonnen
wird: 1) Synthese eines linearen Peptids; (2) Intramolekulare Cyclisierung
dieses linearen Peptids zur Gewinnung eines Molekularchassis; (3)
Funktionalisierung dieses Chassis; (4) Pfropfen von mindestens einem
interessierenden Molekül
auf die eine und/oder die andere Seite des Chassis.
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Die
für die
Peptidsynthese verwendeten Aminosäuren sind beliebiger Natur,
einschließlich
der Aminosäuren
der Reihe (D), der Aminosäuren
der Reihe (L), als auch jeder modifizierten Aminosäure, wobei
die Aminosäuren
natürlich
oder synthetisiert sind. Einige dieser Aminosäuren werden durch orthogonale
Schutzgruppen ersetzt. Orthogonale Schutzgruppen sind chemische
Gruppen, die perpendikular zur Medianebene des Chassis ausgerichtet
sind; sie maskieren die Reaktivität eines Atoms oder einer Atomgruppe
und ihre chemische Eliminierung beeinträchtigt nicht die anderen im
Molekül
vorhandenen Schutzgruppen unterschiedlicher Natur. Ihre Auswahl
hängt von
der Natur der Aminosäure
und des gewünschten
Chassis ab.
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Gemäss einem
ersten Ausführungsmodus
der Erfindung, wird die auf der soliden Phase ausgeführte Synthese
des linearen Peptids von einem Glycinrest aus iniziiert, dessen
carboxylitische Funktion mit einem Harz verankert ist, und die Cyclisierung
des erzielten linearen Peptids wird nach Freisetzung des Harzes
in Lösung
durchgeführt.
Die Elongationsstrategie eines solchen linearen Peptids wird im
Stand der Technik beschrieben (P. Dumy et al., Tetrahedron Lett.
1995, 36, 1255-1258). Die Iniziierung der Synthese durch einen Glycinrest
ermöglicht
das Verhindern jeglichen Epimerisationsrisikos während der folgenden Cyclisierungsetappe.
Vorzugsweise wird das Glycin durch seine carboxylitische Funktion
an das Harz gebunden. Seine Alpha-Aminofunktion wird durch eine Schutzgruppe
geschützt,
die durch Synthese die Elongation des Peptids ermöglicht.
Zum Ende der Synthese des linearen Peptids wird die alpha-aminoterminale Funktion
des Peptids im Laufe einer ersten Etappe von der Schutzgruppe befreit
und die carboxyterminale Funktion wird im Laufe einer zweiten Freisetzungsetappe
des geschützten
linearen Peptids vom Harz befreit, wobei die Seitenketten durch
ihre orthogonale Schutzgruppe geschützt bleiben. Die N- und C-terminalen
chemischen Funktionen, die vom linearen löslichen Peptid freigesetzt
werden, reagieren, um im Laufe einer intramolekularen, in Lösung durchgeführten Cyclisierungsetappe
eine intramolekulare Peptidverbindung zu bilden.
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Gemäss einem
zweiten Ausführungsmodus
der Erfindung werden die Synthese des linearen Peptids und danach
seine Cyclisierung ganz auf der soliden Phase durchgeführt. Bei
diesem Ausführungsmodus
wird die Synthese des linearen Peptids durch einen Aminosäurerest,
dessen Seitenkette mit einem Harz verankert ist, iniziiert, wobei
seine Carboxylfunktion frei von Verankerung bleibt. Die Alpha-Aminofunktion
und die Carboxylfunktion dieser Aminosäure werden jeweils durch eine
Schutzgruppe geschützt,
wobei beide Schutzgruppen untereinander orthogonal sind.
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Zum
Ende der Synthese des linearen Peptids werden die alpha-aminoterminalen und
carboxylterminalen Funktionen selektiv von ihren jeweiligen Schutzgruppen
befreit, und das gewonnene lineare Peptid bleibt durch die Seitenkette
des ersten Aminosäurerests
verbunden. Die terminalen chemischen Funktionen des erzielten linearen
Peptids sind jetzt frei, um untereinander zu reagieren und im Laufe
einer auf der soliden Phase durchgeführten Etappe intramolekularer
Cyclisierung, einen intramolekularen Zyklus zu bilden.
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Bei
diesem Ausführungsmodus
wird das Verfahren vorteilhafterweise ganz oder teilweise auf dem Peptidsynthese-Roboter automatisiert.
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Vorteilhafterweise
wird das Cyclopeptid aus 5, 10 oder 14 Aminosäureresten gebildet, wobei vorzugsweise
10 Aminosäuren
ein Cyclodecapeptid bilden. Das nach der Erfindung cyclierte Cyclopeptid
weist mindestens eine Krümmung,
vorzugsweise zwei Krümmungen
auf. Manche Cyclopeptide weisen laut Erfindung eine Zentralsymmetrie
auf.
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Gemäss einem
bevorzugten Ausführungsmodus
weist das Cyclopeptid 10 oder 14 Aminosäurenreste auf und bildet zwei
Krümmungen,
wobei jede Krümmung
aus einer (L)Pro-(D)AA oder (D)Pro-(L)AA, AA-Kombination gebildet
wird, die vorzugsweise eine Aminosäure mit Glycin darstellt, wobei
die zwei Krümmungen
von drei und/oder fünf
Aminosäurenresten
getrennt sind.
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Das
Vorhandensein des Prolinrests in der Krümmung rechtfertigt sich durch
die Tatsache, dass Prolin im Vergleich zu den anderen Aminosäuren und
aufgrund seiner cyclischen Struktur eine charakteristische räumliche
Konfiguration zeigt. Dieses Charakteristikum verleiht dem Peptidskelett
eine konformationelle Restriktion verglichen mit dem, das mit anderen
Aminosäuren,
außer
Prolin und seinen Derivaten, übernommen wird.
Diese Restriktion ist insbesondere der Ursprung der Krümmungen
in den sekundären
und supersekundären
Polypeptidstrukturen.
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Der
andere Aminosäurerest
der Krümmung,
obenstehend mit dem Kürzel
AA vertreten, ist vorzugsweise ein anderer Aminosäurerest
als der des Prolins und von gegensätzlicher Steriochemie, sehr
vorzugsweise der Glycinrest.
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Die
Krümmungen
werden von den Aminosäureresten
getrennt, vorzugsweise einer ungeraden Anzahl von Aminosäurenrest,
und sehr vorzugsweise drei und/oder fünf Aminosäuren für jeweils ein Cyclodecapeptid und
ein Cycloterapeptid.
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Die
Cyclopeptide mit zwei Krümmungen
mit einer geraden Anzahl von Aminosäureresten weisen einen Medianplan
auf, der eine sogenannte obere und eine sogenannte untere Seite
definiert.
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Vorzugsweise
haben die drei und/oder fünf
Aminosäurenreste
jeweils eine von einer Schutzgruppe orthogonal geschützte chemische
Funktion. Die Schutzgruppen der Seitenketten dieser Aminosäuren bewegen sich
abwechselnd beidseitig des Medianplans des besagten Chassis und
definieren eine sogenannte untere und obere Seite in Bezug zu diesem
Plan.
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Diese
Aminosäurenreste
sind vorzugsweise Aminosäurenreste,
die chemische Funktionen vom Typ -NH2, -SH oder -COOH tragen. Gemäss einem
besonderen Ausführungsbeispiel
der Erfindung sind diese drei oder fünf Aminosäurenreste vorzugsweise Aminosäuren mit
Aminoseitenkette, und sehr vorzugsweise Lysin.
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Gemäss einem
besonderen Ausführungsbeispiel
der Erfindung sind die orthogonalen Schutzgruppen der Aminosäurenreste
untereinander identisch, die nicht zentralen orthogonalen Schutzgruppen
der Aminosäurenreste
sind untereinander identisch, die zentralen orthogonalen Schutzgruppen
der Aminosäurenreste einerseits
und die orthogonalen Schutzgruppen der anderen Aminosäurenreste
andererseits unterscheiden sich voneinander.
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Gemäss einem
besonderen Ausführungsbeispiel
der Erfindung beginnt man das Pfropfen des Chassis durch Ersetzen
orthogonaler Schutzgruppen des Chassis durch eine geschützte Vorstufe
der Oxiaminfunktion oder eine maskierte Vorstufe der Aldehydfunktion,
insbesondere vom Typ a-Oxoaldehyd, durch eine geschützte Vorstufe
der Thiolfunktion oder durch einen Marker. Gemäss ersten Variante ist die
geschützte
Vorstufe der Thiolfunktion ein dissymmetrisches Disulfidderivat
des Cysteins und im Besonderen eine Npys-Gruppe (1b).
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Gemäss einer
anderen Variante der Erfindung ist diese geschützte Vorstufe die geschützte Säure 2-Oxyessigsäure (AOA)
auf Stickstoff oder ein Serinderivat, Vorstufe der a-Oxoaldehydfunktion,
deren Amino und Hydroxylfunktionen geschützt sind und deren Entschützung und
darauffolgende oxydative Spaltung die Aldehydgruppierung freisetzt
und vorzugsweise Boc-Ser(tBu)OH ist.
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Gemäss einem
ersten Ausführungsmodus
der Erfindung führt
man zunächst
die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen der unteren Seite
durch einen Marker, vorzugsweise Biotin oder Fluorescin durch, dann
ersetzt man in einer zweiten Etappe die orthogonalen Schutzgruppen
der oberen Seite des Chassis durch eine geschützte Vorstufe der Oxiamin-
oder a-Oxoaldehydfunktion.
Anschließend
lässt man
die Oxiamin- oder a-Oxoaldehydfunktion der zuvor entschützten Vorstufe
mit einem interessierenden Molekül
oder einem intermediären
Molekül,
das eine Oxiamin- bzw. a-Oxoaldehydfunktion trägt, reagieren. Bei diesem Ausführungsmodus
ist die Substituierung der unteren Seite klassisch, während die
Substituierung der oberen Seite chemoselektiv ist.
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Gemäss einem
zweiten Ausführungsmodus
der Erfindung führt
man zunächst
die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen der unteren Seite
des Chassis durch eine geschützte
Vorstufe der Oxiaminfunktion aus, dann ersetzt man in einer zweiten
Etappe die orthogonalen Schutzgruppen der oberen Seite des Cyclopeptids
durch eine geschützte
Vorstufe der a-Oxoaldehydfunktion.
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Gemäss einem
dritten Ausführungsmodus
führt man
zunächst
die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen der oberen Seite
des Chassis durch eine geschützte
Vorstufe der Oxiaminfunktion aus, dann ersetzt man in einer zweiten
Etappe die orthogonalen Schutzgruppen der unteren Seite des Cyclopeptids durch
eine geschützte
Vorstufe der a-Oxoaldehydfunktion.
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Einem
vierten Realisationsmodus der Erfindung folgend führt man
die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen einer Seite des
Chassis durch eine geschützte
Vorstufe der Aldehyd- oder
Oxiaminfunktion aus, dann die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen
der anderen Seite des Chassis durch eine geschützte Vorstufe der Thiolfunktion.
Man führt
danach das Pfropfen des interessierenden Moleküls aus, indem man komplementäre funktionelle
Gruppen in Reaktion bringt. Bei diesem Ausführungsmodus führt man
zunächst
das Pfropfen des interessierenden, eine Aldehyd- oder Oxiamin-Vorstufe
tragenden Moleküls
auf die eine Oxiamin- bzw. Aldehyd-Vorstufe tragende Seite des Chassis
aus und bringt dann die andere Seite des Chassis in seiner freien
Thiolform oder in Form von aktivem dissymetrischen Disulfid mit
einem zweiten interessierenden Molekül, das eine aktive dissymetrische
Disulfid- bzw. eine freie Thiolform trägt, in Reaktion. Dieses zweite
Molekül
wird dann mittels einer Disulfidspange auf dem Chassis befestigt.
Die interessierenden Moleküle
können
ein Peptid, ein Protein, ein Oligosaccharid, eine Nukleinsäure, ein
organisches Molekül,
ein anorganisches Molekül
(1b und 2b) sein.
Vorteilhafterweise kann diese Spange das intrazelluläre Aussalzen
des interessierenden Moleküls
ermöglichen,
damit es seine biologische Rolle spielen kann.
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In
den oben genannten Ausführungsmodi
bringt man die aktiven Funktionen, insbesondere Oxiamin- oder a-Oxoaldehyd
der zuvor entschützten
Vorstufen mit einem oder mehreren interessierenden Molekül(en) oder
einem intermediären
Molekül,
das eine komplementäre
Funktion trägt,
in unserem Beispiel a-Oxoaldehyd beziehungsweise
Oxiamin, in Reaktion. Vorzugsweise bringt man die auf dem Chassis
plazierte Oxiaminfunktion der Vorstufe mit einem interessierenden,
eine a-Oxoaldehydfunktion tragenden Molekül in Reaktion, dann oxidiert
man die Vorstufe der auf dem Chassis plazierten a-Oxoaldehydfunktion
und verfolgt die Reaktion mit dem Zusammenführen des Chassis mit mindestens
einem interessierenden Molekül
oder einem intermediären Molekül, das eine
Oxiaminfunktion trägt.
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Das
oder die intermediären
Molekül(e)
tragen einerseits eine Oxiaminfunktion, die fähig ist, mit der oder den auf
dem Chassis plazierten a-Oxoaldehydfunktion(en) zu reagieren, und
sie tragen anderseits eine Vorstufe von mindestens einer a-Oxoaldehydfunktion.
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Das
oder die interessierenden Moleküle
sind untereinander identisch oder unterschiedlich.
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Vorteilhafterweise
ist das interessierende Molekül
eine Nukleinsäure,
ein Peptid, ein Oligosaccharid, oder ein organisches Molekül. Jedes
therapeutisch oder diagnostisch interessierende Molekül, das eine
Oxiamin- oder a-Oxoaldehydfunktion
trägt,
kann auf das Chassis gepfropft werden.
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Gemäss einer
ersten Variante der Erfindung pfropft man auf eine Seite des Chassis
mit Peptidderivaten des Cyclo-(RGDfK) und des Cyclo-(RGDyK) Ligande
des Integrins aVb3, um das Molekül
zu den Geweben zu führen,
die diesen Empfänger
darstellen und die biologischen Effekte zu einem therapeutischen
oder diagnostischen Zweck zu verändern.
- • Ist
der Zweck therapeutisch, pfropft man die andere Seite des Chassis
gemäß Erfindung
mit einem apoptogenen Peptid vom Typ (KLAKKLAK), oder einem bekannten
organischen Molekül
vom Typ (Doxorobucin) oder einem toxischen Protein (Ricin-A, galénine...)
intrazellulär
- • Ist
der Zweck die Diagnose in vitro und in vivo, pfropft man die andere
Seite des Chassis mit einem oder mehreren Chromophor(en), einem
oder mehreren Biotin(en), einem oder mehreren Fluorophor(en), einem oder
mehreren Radioemitter(n) oder einer Vorstufegruppe (chemisch oder
Ligand).
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Gemäss einer
zweiten Variante der Erfindung pfropft man eine Seite des Chassis
mit Carbohydratderivaten zum Targeting ihres transmembranären Rezeptors
vom Typ Lektin, insbesondere Mannoserezeptor, Galaktoserezeptor,
Asialoprotein-Rezeptor, Glucose-Transportrezeptor GLUT... zu therapeutischen
oder diagnostischen Zwecken.
- • Ist der
Zweck therapeutisch, pfropft man die andere Seite des Chassis gemäß Erfindung
mit einem oder mehreren T-abhängigen epitopen
Peptid(en) vom Typ (KLAKKLAK), oder einem bekannten organischen Molekül vom Typ
(Doxorobucin) oder einem toxischen Protein (Ricin-A, Galenin...)
intrazellulär
- • Ist
der Zweck die Diagnose in vitro und in vivo, pfropft man die andere
Seite des Chassis mit einem oder mehreren Chromophor(en), einem
oder mehreren Biotin(en), einem oder mehreren Fluorophor(en), einem oder
mehreren Radioemitter(n) oder einer Vorstufegruppe (chemisch oder
Ligand).
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Gemäss einer
dritten Variante der Erfindung pfropt man eine Seite des Chassis
mit B-abhängigen
Epitopen vom Typ Peptid oder Carbohydrat, besonders Tumormarker
(Tn, sTn, Tf), einem oder mehreren T-abhängigen Epitopen (Peptide Th1
oder Th2) und einem Immunoadjuvanten, um eine zelluläre Reaktion
zu Impfungszwecken hervorzurufen.
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Einer
vierten Variante der Erfindung folgend, funktionalisiert man die
Oberflächen
mit dem Ziel, ihnen in den miniaturisierten Systemen vom Typ Biochip
nützliche
Erkennungseigenschaften zu verleihen.
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Vorteilhafterweise
wird das Verfahren, wenn die Synthese und die Cyclisation in der
soliden Phase durchgeführt
werden, ganz oder teilweise auf dem Peptidsynthese-Roboter automatisiert.
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Die
Erfindung hat bei dem, was aus dem Verfahren gemäß der Erfindung erzielt wird,
ebenfalls ein charakterisiertes gepfropftes homodetisches Cylopeptid
zum Ziel.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist eine therapeutische und diagnostische
Komposition dadurch gekennzeichnet, dass sie ein bei dem Verfahren
gemäß der Erfindung
erzieltes homodetisches Cyclopeptid enthält.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines gepfropften, bei
dem der Erfindung gemäßen Verfahren
erzielten homodetischen Cyclopeptids oder einer Kompositition, in
der es enthalten ist, für
die Herstellung eines zur Krebsbehandlung bestimmten Medikaments.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines gepfropften,
bei dem der Erfindung gemäßen Verfahren
erzielten homodetischen Cyclopeptids oder einer Kompositition, in
der es enthalten ist, als Werkzeug für die Krebsdiagnose.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines gepfropften, bei
dem der Erfindung gemäßen Verfahren
erzielten homodetischen Cyclopeptids oder einer Kompositition, in
der es enthalten ist, für
die Diagnose und/oder die Suppression der Neoangionese.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines gepfropften, bei
dem der Erfindung gemäßen Verfahren
erzielten homodetischen Cyclopeptids oder einer Kompositition, die
es enthält,
des Chassis zur Funktionalisierung der Oberflächen mit dem Ziel, ihnen in
den miniaturisierten Systemen vom Typ Biochip nützliche Erkennungseigenschaften
zu verleihen.
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Die
Verwendung der Oberfläche
als funktionelle, mit Erkennungseeigenschaften ausgestatteten Schmelzfläche stellt
eine Auswahlstrategie für
die Konzeption dieser Systeme dar, die transferabel ist mit einer breiten
technologischen Reihe, die ihre mikro- oder nanometrischen Miniaturisation
sowie ihre Konnektik ermöglicht.
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Einerseits
ist die Funktionalisierung der Wirtsoberfläche durch einen an der Erkennung
beteiligten Partner (Sonde: Moleküle, Biomoleküle, Zellen)
eine Schlüsseletappe
zum Realisieren dieser molekularen Interaktion an der Schmelzfläche der
Oberfläche
und des Analyts. Diese Adressierung muss ausreichend sanft sein,
um die Integrität
und die molekularen Eigenschaften der Sonde zu bewahren, reproduktibel,
um nutzbar und räumlich
kontrolliert zu sein, um parallel die unterschiedlichen Targets
ermitteln zu können.
Andererseits kann die Funtionalisierung mit einem messbaren und
quantifizierbaren Signal auch zur Erkennungstransduktion der Targetsonde
führen,
was die Ermittlung des Targets ermöglicht. Das Hauptinteresse
dieser Strategie besteht im Fehlen der Targetmarkierung, was die
Generalisation der Annäherung
an alle Kategorien von Targets ermöglicht.
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In
diesem Rahmen ermöglicht
das Verfahren der Erfindung, eine Seite des Chassis für die Adressierung
der Oberfläche
zu benutzen, zum Beispiel durch Verwendung von Thiolpfröpflingen
oder durch Elektropolymerisation unter Verwendung von Pendants vom
Typ Pyrrol. Die andere Seite wird gemäß dem Verfahren der Erfindung
für das
Pfropfen des interessierenden Moleküls auf die Oberfläche genutzt.
Vorteilhafterweise erlaubt die Verwendung einer von einer Fotolabilgruppe
vom Typ NVOC geschützten
Vorstufe der a-Oxoaldehydfunktion die räumlich kontrollierte Adressierung
der Oberfläche
durch ein interessierendes Molekül.
Das Verfahren der Erfindung ist weitaus vorteilhafter für die Funktionalisierung
der Oberfläche
als die klassisch angewandten Methoden.
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Andere
Ausführungsmodi
des Chassis und seiner Pfropfung gemäss Erfindung werden in der
folgenden detaillierten Beschreibung aufgeführt, die sich mit Blick auf
die Abbildungen liest und die Erfindung uneingeschränkt illustriert.
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Die 1a illustriert
das Herstellungsschema von Cylolodekapeptiden gemäß Erfindung,
was einerseits auf der oberen Seite das Vorstufenserin der a-Oxoaldehydfunktion
und auf der unteren Seite die Oxiaminfunktion aufweist und andererseits
die Oxiaminfunktion auf der oberen Seite und das Vorstufenserin
der a-Oxoaldehydfunktion auf der unteren Seite.
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Die 1b illustriert
das Herstellungsschema von Cylolodekapeptiden gemäß Erfindung,
das auf der oberen Seite entweder das Vorstufenserin der a-Oxoaldehydfunktion
oder die a-Oxoaldehydfunktion aufweist und andererseits auf der
unteren Seite die C-Npys-Funktion.
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Die 2a und 2b illustrieren
das Herstellungsschema von polyfunktionellen Makromolekülen durch
sukzessives chemoselektives Zusammenfügen der Biomoleküle R1 und
R2 durch Oximverbindung, einerseits auf der unteren, dann auf der
oberen Seite des Cyclodekapeptids, und andererseits auf der oberen und
dann auf der unteren Seite des Cyclopeptids.
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Die 3 illustriert
das Syntheseschema von polyfunktionellen Makromolekülen durch
sukzessives chemoselektives Zusammenfügen durch Oximverbindung, wobei
das Biomolekül
R1 auf eine Seite des Cyclodekapeptids gepfropft wird, wobei vier
eine Oxiaminfunktion und mindestens eine Vorstufenserinfunktion
der a-Oxoaldehydfunktion aufweisenden Moleküle auf die andere Seite des
Cyclodekapeptids gepfropft werden und wo schließlich das Biomolekül R2 nach
Demaskierung der a-Oxoaldehydfunktionen gepfropft wird.
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Die 4 illustriert
das Syntheseschema von polyfunktionellen Makromolekülen durch
sukzessives chemoselektives Zusammenfügen durch Oximverbindung, wobei
das Biomolekül
R1 auf eine Seite des Cyclodekapeptids gepfropft wird, wobei vier
eine Oxiaminfunktion und vier eine Vorstufenserinfunktion der a-Oxoaldehydfunktion
aufweisenden Moleküle
auf die andere Seite des Cyclodekapepts gepfropft werden und wo schließlich das
Biomolekül
R2 nach Demaskierung der a-Oxoaldehydfunktionen gepfropft wird.
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Die 5 stellt
die Rückgewinnung
des Fluoreszenzsignals des aVb3-Rezeptors nach Immunomarkierung
(Antikörper
LM609-R-Phycoerythrin) je nach Zeitaufwand für die unterschiedlichen Inkubationsbedingungen
der lebenden Zellen HEK (FRAP-Experiment) dar. Die mit der multivalenten
Mischung RGD (volle Quadrate) beobachtete Verzögerung bedeutet eine Mobilitätsminderung
der aVb3-Rezeptoren, charakteristisch für das Clusteringphänomen, das
unter anderen Bedingungen nicht beobachtet wird.
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Die 6 stellt
durch nach Zellinkubation (HEK) mit der multivalenten RGD-Fluoreszin-Mischung durch
FACS gewonnene Fluoreszenzhistogramme dar.
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Die 7 vergleicht
die Kaptationskinetiken durch die Krebszellen PC3 der multivalenten
RGD-Mischung, die gemäß Erfindung
(RAFT[cycloRGD]4: Rauten) mit denen der Kontrollmoleküle aufgrund
der radioaktiven Aktivität
des Jod-125 zusammengeführt wurden.
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Gemäss dem ersten
Ausführungsmodus
auf 1a führt
man zunächst
die Substituierung der orthogonalen Schutzgruppen PG der unteren
Seite, also PG2 und PG5 durch eine geschützte Vorstufe der a-Oxoaldehydfunktion
und vorzugsweise Boc-Ser (tBu)OH durch; in einer zweiten Etappe
substituiert man die orthogonalen Schutzgruppen der oberen Seite
des Chassis, PG1, PG3, PG4, PG6 durch eine geschützte Vorstufe der Oxiaminfunktion,
und vorzugsweise Boc-AOA-OSu; in einer dritten, auf 2a dargestellten
Etappe entfernt man alle Schutzgruppen, die ebenfalls entschützte Oxiaminfunktion
auf der unteren Seite wird in Anwesenheit eines ersten interessierenden
Moleküls,
das eine a-Oxoaldehydfunktion trägt,
reagieren; in einer vierten, auf 2a dargestellten
Etappe oxidiert man die Serylreste mit a-Oxoaldehydfunktion auf der oberen Seite;
in einer fünften
Etappe lässt
man die a-Oxoaldehydfunktionen der oberen Seite mit einem zweiten
interessierenden, eine Oxiaminfunktion tragenden Molekül reagieren.
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Gemäß dem zweiten
Ausführungsmodus
auf den 1a und 2a, vertauscht
man die Reihenfolge der Substituierungen der orthogonalen Schutzgruppen
und die Pfropfung der oberen und unteren Seiten jeweils bezüglich des
ersten Modus.
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Gemäss einem
besonderen auf 3 dargestellten Ausführungsmodus
gemäß Erfindung
trägt das letzte, über seine
Oxiaminfunktion, die seine Pfropfung auf die auf dem Chassis befindlichen
a-Oxoaldehydfunktion(en) ermöglichen,
auf das Chassis gepfropfte interessierende Molekül mindestens eine Vorstufe
einer a-Oxoaldehydfunktion, die es erlaubt, das Verfahren gemäß Erfindung
weiterzuführen,
indem diese Vorstufe in a-Oxoaldehyd oxidiert wird und indem man
letzteres mit einem interessierenden, eine Oxiaminfunktion aufweisenden
Molekül
auf eine Weise, die eine zusätzliche
Oximverbindung schafft, in Reaktion bringt. Diese zusätzliche
Etappe erlaubt den Aufbau eines Modularsystems über interaktive Oximkopplung auf
dem Chassis durch Demaskierung der a-Oxoaldehydfunktion durch sukzessive
Oxidation.
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Wie
es die 4 beschreibt, erlaubt es dieser besondere Modus
vorteilhafterweise, die Anzahl der vor Ort im Chassis präsentierten
Moleküle
im Fall eines interessierenden Moleküls zu erhöhen, das über seine Oxaminfunktion auf
das Chassis gepfropft seine Pfropfung auf die auf dem Chassis befindliche(n)
a-Oxoaldehydfunktion(en) ermöglichend
mehr als eine Vorstufe einer a-Oxoaldehydfunktion trägt.
- Beispiel
1: Cyclopeptid gemäß Erfindung
ein Chassis bildend, das auf eine Seite mit Peptidderivaten des
Cyclo(RGDfK) und/oder des Cyclo(RGDyK) gepfropft ist, die Liganden
des aVb3-Integrin sind.
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Die
Cyclo(RGDfK)-Peptide erkennen das aVb3-Integrin. Dieses Integrin
ist auf der Zelloberfläche
der Tumoren oder der endothelialen Zellen bei der tumorellen Neoangiogenese überbetont.
Die Pfropfung dieses Peptids auf eine Seite des Chassis gemäß Erfindung
steigert die Erkennungseigenschaften dieses Peptids durch dieses
Integrin. Außerdem
werden die biologischen Effekte dieses Integrins wie zum Beispiel
das Clustering und die Endoctose des Moleküls vom so gepfropften Chassis
gemäß Erfindung
ausgelöst,
während
sie nicht vom Peptid allein ausgelöst werden.
- 1)
Träger
für die
Zellkulturen in vitro: Die auf einer ihrer Seiten eine Biotiongruppe
aufweisenden Chassis, was generell, dank der starken Biotin-Streptavidin-Interaktion
die Funktionalisierung dieser Seite durch Steptavidin ermöglicht.
Die andere Seite des Chassis kann durch ein interessierendes oder
freies Molekül funktionalisiert
werden. Die Verwendung von beispielsweise haftenden Liganden wie
das (RGDfK)-Cyclo aufweisender Chassis ermöglicht die Zellfixierung, die
der aVb3-Rezeptor und ihre in vitro-Kultur ausdrückt. Bei niedriger auf der
Oberfläche
absorbierter Moleküldichte
gestalten sich die Mischungen besonders effizient.
- 2) Induktion einer Gruppierung (Clustering) von Zellrezeptoren
(5): Die Gruppierung der Integrine auf der Zelloberfläche HEK293,
die verstärkt
das Integrin b3 aufweisen, wurde anhand der FRAP-Experimente gezeigt.
Die lebenden Zellen werden mit den mit Phycoerythrin (LM609-PE)-markierten anti αvβ3-Antikörpern und
mit den unterschiedlichen Peptiden in Kontakt gebracht. Eine Zone
der Zelloberfläche
wird dann fotoblanchiert, damit die Kinetik des Wiederauftauchens
des Fluorieszenzsignals in dieser Zone gemessen werden kann. Diese
Maßnahme
reflektiert die Migrationsgeschwindigkeit des αvβ3-Integrins
in der Plasmamembran einer lebenden Zelle. Wenn mehrere Integinmoleküle vom Peptid überbrückt werden,
wird der so geformte „Cluster" weniger schnell
als das native, kleinere und freiere ☐v☐3-Inegrin
migrieren. Die in der 5 dargestellten Resultate zeigen,
dass das einzige erzielte Peptid gemäß Erfindung in der Lage ist, eine
solche Gruppierung von αvβ3-Inegrin auf der Zelloberfläche zu induzieren.
- 3) Aktive Internalisation der Drogen oder vektorisierten Produkte:
Dieselben Zellen, die bei 37 oder 4°C 15 bis 30 Minuten mit den
zuvor mit Fluoreszin markierten Peptiden in Kontakt gebracht werden,
werden nach Immonomarkierung vorzeitiger Endosombläschen (Anti-Early-Endosom-Markierung
1a) unter dem Konfokalmikroskop beobachtet.
Die so erzielten
Resultate zeigen, dass nur das gemäß Erfindung erzielte Peptid
bei 37°C
an den interzellulären
Schnittstellen und im Inneren der Zellen an der Oberfläche sichtbar
ist. Ein wichtiger Teil des intrazellulären Signals ist mit der EE1A-Markierung
colokalisiert, was zeigt, dass zumindest ein Teil des RAFT-RGD-Peptids
durch Endozytose internalisiert wird.
Die unter denselben Bedingungen
inkubierten CRGD- und RAFT-RGD-Peptide
sind nicht durch Immunofluoureszenz ermittelbar. Dies zeigt ihre
Unfähigkeit,
sich ebenso effizient wie die gemäß Erfindung auf ihrem Integrin-Target
gewonnene Mischung zu fixieren. Wird die Inkubation der Peptide
bei 4°C
vorgenommen, wird nur die extrazelluläre Markierung mit dem gemäß Erfindung
erzielten Peptid beobachtet, was bestätigt, dass die Internalisation
dank einem aktiven Prozess stattfindet.
- 4) Target-Vektor (ADN, Peptide, Proteine, PNA, Oligonukleotide,
siRNA):
Nur die αvβ3-Integrin aufweisenden Zellen werden vom
gemäß Erfindung
erzielten Peptid erkannt. Die Inkubation der HEK293-Zellen, die entweder
b1- oder b3-Integrin mit dem gemäß Erfindung
erzielten Fluoreszenzpeptid verstärkt aufweisen, zeigt, dass
das Peptid sich nur auf den Zellen fixiert, die αvβ3-Heterodimer
verstärkt
aufweisen. Diese Eigenschaft kann gemäß Erfindung für den Transport
der interessierenden Moleküle
zu einem Target-Rezeptor verwendet werden.
- 5) Tumloren, die αvβ3-Integrin aufweisen: Das gemäß Erfindung
gewonnene und einer tumorträchtigen Maus
intravenös
injizierte Fluoreszenzpeptid bringt bei der medizinischen Abbildung
zum Vorschein, dass dieses Peptid stark gehäuft in den hypervaskulären Zonen
des Tumors vorgefunden wird.
- 6) Blutgefäße Unsere
mit den Fluoreszenzpeptiden gemäß Erfindung
erzielten Resultate zeigen, dass das Endothelium durch diese intravenös injizierten
Moleküle
erkannt werden kann. Andere Gewebe und insbesondere die hepatische
Kapsel, die Gefäße der Leber
und Milz wurden auch dank dieser Moleküle abgebildet. Das Pfropfen
anderer Ligande sollte ermöglichen,
das für
das Endothelium gewonnene Signal zu erhöhen.
- 7) Enzymatische Aktivitäten
in der Medizin oder in vitro auf Zellkultur (insbesondere Proteasenktivität)
Gemäß Erfindung
ist es möglich,
auf das Chassis Peptide zu pfropfen, die eine spezifische durch
eine Protease erkannte Sequenz enthalten. Pfropft man ein Fluoreszenzpeptid
aufwärts
der Spaltungsstelle und ein Molekül, das die Fluoreszenz absorbiert,
abwärts
dieser Stelle, verhindert die geringe Distanz zwischen den 2 Markern
jegliches Aussenden von Fluoreszenz. Stattdessen werden die 2 Fluorophore
bei Präsenz
der spezifischen Protease zerlegt, und es findet also quantifizierbare
Lichtaussendung statt. Diese Maßnahme ermöglicht es,
die in dem beobachteten Bereich vorhandene Proteasekonzentration
zu bestimmen. Die Erfindung erlaubt es, dieses System zu den Targetgeweben
zu leiten, um diese Regionen spezifisch abzubilden.
- 8) Radiodetektion der endothelialen Gewebe bei der tumorellen
Neoangiogenese oder bei Tumoren, die _V_3-Integrin aufweisen (7)
Die
Markierung durch radioaktives 127-Jod ermöglicht die Ermittlung des Moleküls und damit
seiner Verbindung mit dem Integrin an der Zelloberfläche und
weiterhin seines Eintritts in das Zytosol nach Endozytose. Der Empfangs-
und Dosiseffekt hängt
von den Zusammensetzungen ab. Dieser Effekt ist auf tumorellen (PC-3)
und endothelialen (HMVEC) Zellen, die Integrin aufweisen, gemessen
worden. Auch hier haben im Gegensatz zum isolierten Ligand nur die
gemäß Erfindung
gepfropften Cyclopeptide den beobachteten Effekt. Diese Eigenschaft
ermöglicht
die Abbildung der Neoangigenesezonen aufgrund radioaktiver Aktivität.
- Beispiel 2: Cyclopeptide gemäß Erfindung,
die auf einer Seite ein gepfropftes Chassis mit den B-abhängigen Epitopen
vom Karbohydrattyp bilden, genauer Tumormarker (Tn, sTn, Tf), einen
oder mehreren T-abhängigen Epitopen
(Peptide Thl oder Th2) und ein Immunoadjuvant.
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Diese
Substituenten werden gewählt,
um eine zelluläre
Reaktion zu Impfungszwecken hervorzurufen.
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Zucker
sind bekannt dafür,
bei zahlreichen Pathologien ein sehr wichtiges Element darzustellen,
insbesondere bei Krebs (Tumormarker) oder bei viralen und bakteriellen
Infektionen. Sie sind dagegen schwach immunigen, was ihre Verwendung
in Vakzinkompositionen zu evidenten therapeutischen Zwecken beträchtlich einschränkt. Außerdem läuft die
Erkennung der Zuckermuster über
eine traubenförmige
Präsentation
und ist auch eine Einschränkung
für ihre
Verwendung. Die Erfindung ermöglicht
die traubenförmige
Präsentierung
der Zuckermuster und ebenso ihre chemische Handhabung zur Realisierung
von Epitopkombinationen, die es rechtzeitig erlauben, ein Erlernen
des Immunsystems zum Schutz des Organismus vor Pathologien und Infektionen,
die diese Muster implizieren, auszulösen.
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