DE69922245T2 - Biologisch wirksame konjugate mit einem reporterrest und verfahren zu dessen nachweis - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugatderivat, insbesondere ein Polymerkonjugatderivat, eines biologisch wirksamen Moleküls, wie z.B. eines Proteins, eines Peptids, eines Polypeptids. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur chemischen Identifizierung des Konjugatderivats.
  • Das erfindungsgemäße Konjugat weist einen Verbindungsarm auf, der aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro, besteht.
  • Obwohl Dank der Gentechnik heutzutage eine große Anzahl neuer Peptide und Proteine mit möglicherweise geeigneten pharmakologischen Aktivitäten synthetisiert werden, ist deren therapeutisches Potential häufig durch negative Eigenschaften, die ihrer chemischen Struktur eigen sind, drastisch eingeschränkt. So können beispielsweise Polypeptide, sobald sie verabreicht sind, häufig leicht von Endo- oder Exoproteasen gespalten, durch Filtration über die Niere schnell ausgeschieden werden und können häufig immunologische Reaktionen bewirken, trotz der Tatsache, daß sie menschliche Sequenzen besitzen. Weiterhin kann die Größe sowie die Natur des Makromoleküls ein Ziel im Körper diktieren, das nicht immer das für ihre therapeutische Wirkung gewünschte Ziel darstellt.
  • Die Konjugation an die Proteinoberfläche von biokompatiblen, nichttoxischen, nichtimmunogenen, wasserlöslichen Polymeren stellte sich als ein Verfahren heraus, durch das diese Probleme verringert werden können und das in einigen wenigen Fällen geeignete therapeutische Anwendungen gestattet. Ein für eine solche Konjugation häufig verwendetes Polymer ist Polyethylenglykol (PEG), was teilweise auf seine sehr günstigen biologischen Eigenschaften zurückzuführen ist (siehe „Poly(ethylene glycol) chemistry and biological application" M.J. Harris Hrsg. Plenum Press, (1994), (hiermit durch Bezugnahme aufgenommen), ebenso wie u.a. Dextran, Albumin, Poly-N-vinylpyrrolidon und Poly-N-acryloylmorpholin. In „New synthetic polymers for enzyme and liposome modification Poly(ethylen glycol), S. 182, ACS Symp Series 680, 1997, werden ebenso einige der letzteren Polymere offenbart.
  • Proteine und Peptide wurden ebenso an Antikörper und andere hochaffine Liganden konjugiert, um auf eine spezifische Stelle im Körper abzuzielen.
  • Es stellte sich heraus, daß verschiedene Aminosäurereste in Proteinen für die Polymerkonjugation geeignet sind, einschließlich, z.B. der Aminogruppen des Lysins und der alpha-aminoterminalen Gruppen. Dabei wurden die Thiolgruppe des Cysteins, die Guanidinogruppe des Arginins und die terminale Carboxylgruppe ebenso wie die Carboxylgruppe der Asparagin – oder Glutaminsäure betrachtet. Zu den veröffentlichten Untersuchungen und Methodologien für die Modifizierung von Proteinaminogruppen gehören diejenigen von Davies und Abuchowski (Abuchowski et al. 1977a und 1977b), von Benchamp et al., 1983, Veronese et al., 1985, Zalipsky et al., 1983, Delgrado et al., 1990. Die SH-Gruppenmodifikation von Proteinen ist in der Arbeit von Morpurgo et al., 1996, beschrieben, während die Guanidinomodifikation von Pande et al. beschrieben wird. Polysaccharidreste wurden, wenn sie in Proteinen vorliegen, seltener genutzt und dann in erster Linie für die Bindung. Unter diesen Resten ist jedoch die Konjugation an die Aminogruppen die bei weitem wichtigste.
  • Trotz des gegenwärtigen Wissenstandes in Verbindung mit der Polymerkonjugation bei der Herstellung von Prodrugs gilt weiterhin, daß im allgemeinen ein heterogenes und komplexes Muster von Produkten erhalten wird, da alle diese Gruppen in Polypeptiden und Proteinen in sehr großer Anzahl vorkommen können (und auch die Gruppen selbst auf der Makromoleküloberfläche unterschiedlich exponiert sein können oder unterschiedliche Nukleophylität besitzen). Bis heute ist es nach wie vor sehr schwierig, die Position der Polymerkonjugation in der Primärsequenz des Proteins erfolgreich anzugeben.
  • Diese Schwierigkeit wird noch dadurch erhöht, daß es in der Mehrzahl der Fälle äußerst schwierig, wenn nicht gar unmöglich ist, die unterschiedlichen Konjugate aus dem Konjugationsgemisch aufzutrennen, selbst wenn die nun zur Verfügung stehenden höchstentwickelten Verfahren eingesetzt werden. Die Hinderung durch das Proteinmolekül kann die Ladungen auf der Proteinoberfläche maskieren und somit die Bindung an Ionenaustauschharze ebenso wie die Selektivität der Bindung an Affinitätsliganden reduzieren und verringert das Potential verschiedener Verfahren, einschließlich der Gelfiltrationschromatographie, bei der Erfüllung dieser Aufgabe.
  • In der Literatur wurde über verschiedene Ansätze zur Identifizierung der Konjugationsstelle berichtet, vor allem wenn es sich bei der Konjugationsspezies um ein hochmolekulares Polymer handelt.
  • Ein Ansatz beruht auf dem Vergleich der durch HPLC erhaltene Fingerabdrücke, im Fall des PEG-konjugierten Produkts, mit denen, die im Fall des nativen nichtkonjugierten Polypeptids erhalten wurden. Obwohl einige Informationen über die Bindungsstellen auf Basis der Identifizierung der fehlenden PEG-Peptide im tryptischen Verdau des Konjugats erhalten wurden, beruhten diese Informationen auf der Annahme, daß Trypsin dort, wo das PEG gebunden ist, oder in dessen enger Umgebung unwirksam ist und daß dort keine Freisetzung der entsprechenden Peptide erfolgt.
  • Obwohl sich dieser Ansatz bei der Untersuchung des Wachstumshormonpeptids als geeignet er wies (Ross Clark et al. J. Biol. Chem. 271, 21969–21977, 1996), kann er nicht immer als schlüssig betrachtet werden, da er auf indirekten Beweisen beruht und von einem Verfahren abhängig ist, das Informationen über die Bindungsstelle von PEG nur im Fall relativ kurzer Polypeptide, die bei der proteolytischen Verdauung einfache Muster ergeben, liefern kann.
  • Ein weiterer Ansatz beruhte auf der Protein-„PEGlierung" mit einem Polymer, das zwischen dem PEG und dem Protein einen Bernsteinsäurearm trägt. Dabei wurde Bernsteinsäure über eine labile Esterfunktion mit PEG und über ein stabiles Amid mit dem Protein verknüpft. Die PEG-Ketten wurden von dem Protein durch milde basische Hydrolyse der labilen Esterbindung, die PEG mit Bernsteinsäure verknüpft, abgetrennt, während die Bernsteinsäuregruppierung als Reportergruppe, verknüpft mit den Resten, wo PEG gebunden war, zurückblieb, wobei die markierten Peptide dann mittels Massenspektrometrie erkannt wurden (M.M. Vestling et al. Drug Metab. Disp. 21, 911–917). Dabei weist dieses Verfahren wenigstens zwei starke Einschränkungen auf: die erste liegt in der Chemie der Verknüpfung von PEG mit Protein, wobei die Chemie im allgemeinen nicht als geeignet oder zweckmäßig für Produkte zur Verwendung im Menschen angesehen wird, da die Ester verknüpfung zwischen PEG und Bernsteinsäure leicht im physiologischen Kreislauf gespalten werden kann, was zu neuen Produkten führt; die zweite Einschränkung liegt in der Tatsache, daß die Identifizierung des mit Bernsteinsäure markierten Peptids in der Peptidkarte nur durch Massenspektrometrie durchgeführt werden kann. Eine Standard-Aminosäureanalyse, die das übliche Verfahren für Sequenzuntersuchungen darstellt, kann in einem solchen Fall nicht angewandt werden, da während der starken sauren Hydrolyse, die vor der Aminosäure-identifizierung durchgeführt werden muß (AAA), die Bernsteinsäuregruppierung von der Aminosäure, an der sie gebunden ist, abgetrennt wird. Aus diesem Grund kann man selbst mit den neuesten AAA-Verfahren die Peptide, an die Bernsteinsäure gebunden war, nicht identifizieren. Weiterhin beeinträchtigt die Schwäche der gleichen Bindung den Einsatz anderer wichtiger Verfahren der Sequenzanalysebestimmungen.
  • Im US-Patent Nr. 5,286,637 (Veronese et al.), erteilt am 15. Februar 1994, werden ebenfalls ein Ansatz und ein Verfahren unter Verwendung von M-PEG beschrieben. Deren erfindungsgemäßes Verfahren beruht auf der Verknüpfung eines Aminosäure- oder Peptid-Abstandhalterarms mit verschiedenen Strukturen und Eigenschaften mit der Hydroxylfunktion von Monoalkoxypolyethylenglykol über eine Carbonatverknüpfung, an der die NH2-Gruppe der Aminosäure bzw. des Peptids beteiligt ist. Dieser Reaktion folgt die Aktivierung der COOH-Funktion des Aminosäure- oder Peptid-Abstandhalterarms als Succinimidylester, der somit gegenüber der Aminogruppe des biologisch wirksamen Peptids, Proteins oder Arzneistoffs reaktiv wird. Die Verwendung dieses Verfahrens weist den allen Verfahren zur Konjugation von PEG-Ketten gemeinsamen Nachteil auf, daß die Verwendung der meisten, wenn nicht aller, Auftrennungsverfahren des Konjugatprodukts ebenso wie eine geeignete Auftrennung des PEGylierten Verdauungsgemischs beeinträchtigt ist.
  • Aus diesem Grund stellt die genaue Identifizierung der Stelle der Polymerbindung in das Protein weiterhin bei der Herstellung des entsprechenden Prodrug immer noch ein Problem dar, obwohl sie eine wesentliche Voraussetzung für ein rationelles Ziehen einer Korrelation zwischen der Struktur und Aktivität der Prodrug-Konjugate dar stellt. Das Wissen um diese Korrelation kann in der Tat eine der nützlichsten Richtlinien bei der Gestaltung neuer Konjugate mit zweckmäßigeren pharmakokinetischen, pharmakologischen und therapeutischen Eigenschaften darstellen.
  • Die genaue Identifizierung der Konjugationsstelle ist ebenso für eine genauere analytische Charakterisierung eines biologisch wirksamen makromolekularen Produkts wichtig, insbesondere, wenn das Konjugat für eine therapeutische Verwendung vorgesehen ist und eine genaue Charakterisierung benötigt wird, um den Anforderungen der Gesundheitsbehörde zu entsprechen.
  • Die Wichtigkeit des Auffindens eines Verfahrens zur Identifizierung der ursprünglichen Lokalisierung der funktionellen Einheit wird bei der Verwendung von Makromolekülen in der Therapie aufgezeigt: dort sind Konjugate notwendig. In solchen Konjugaten (bei denen beispielsweise in therapeutischen Anwendungen eine PEG + Protein-Kombination verwendet werden kann) kann das PEG mit vielen unterschiedlichen Stellen des Makromoleküls verknüpft sein. Es ist wichtig, daß man über ein Verfahren verfügt, mit dem sich feststellen läßt, an genau welcher Stelle bzw. Stellen das mit dem Makromolekül verknüpfte PEG + Protein verbunden war. Durch die vorliegende Erfindung wird eine gebundene Aminosäure-Reportergruppierung beibehalten, wodurch die Identifizierung und Beschreibung, mittels einer Analyse, des Konjugationsprodukts unterstützt wird.
  • Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung bestehen darin, biologisch wirksame Konjugatderivate bereitzustellen, während die in den obenerwähnten Verfahren für die Polymermodifikationen von Polypeptiden und Proteinen dargestellten Einschränkungen überwunden werden.
  • Daher handelt es sich bei einem der Erfindungsgegenstände um ein biologisch wirksames Konjugatderivat mit der folgenden allgemeinen Formel (I) FE-L-M (I);wobei:
    • M
    für den entsprechenden Rest eines biologisch wirksamen Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden und Polypeptiden,
    FE
    für eine funktionalisierende Einheit; und
    L
    für einen Verbindungsarm, bestehend aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro, der durch chemische Behandlung gespalten werden kann, wobei Nle, βAla, Gly bzw. Pro als eine mit M verknüpfte Reportergruppe zurückbleibt, steht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung stellte sich heraus, daß spezifische Abstandhaltergruppen es ermöglichen, die funktionelle Einheit FE von dem Konjugat mit verminderter Härte abzutrennen, so daß eine Zerstörung oder andersweitige Denaturierung des Moleküls vermieden wird, während eine am Molekül zur Identifizierung gebundene Aminosäure-Reportergruppierung erhalten bleibt.
  • Der Verbindungsarm L ist unter physiologischen Bedingungen stabil, kann jedoch durch spezifische und ausgewählte physikalisch-chemische Mittel gespalten werden, wodurch eine mit Standard-Analyseverfahren nachweisbare stabile Reportergruppierung an M gebunden bleibt und dadurch ihre Gegenwart gegebenenfalls durch Massenspektroskopie identifiziert werden und sie durch chemische oder enzymatische Behandlung zur Auswertung mittels einer Standard-Aminosäureanalyse gespalten werden kann.
  • Ein alternatives Identifikationsverfahren kann eine Maldi-Massenspektroskopieanalyse eines ungespaltenen Konjugats beinhalten.
  • In dem erfindungsgemäßen biologisch wirksamen Konjugatderivate handelt es sich bei der funktionalisierenden Einheit FE um ein Polymer mit einem Molekulargewicht im Bereich von 2 Kd bis 50 Kd. Die funktionalisierende Einheit FE kann entweder ein lineares Polymer oder ein verzweigtes Polymer sein.
  • Vorzugsweise entspricht in dem erfindungsgemäßen biologisch wirksamen Konjugatderivat der Rest M einem biologisch wirksamen Molekül, wobei es sich bei dem Molekül um ein Protein, ausgewählt aus Insulin, Lysozym, Interferon, insbesondere Interferon α–2b, Erythropoetin, G-CSF, GH, handelt.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifizierung von Verknüpfungsstellen der Konjugation der funktionalisierenden Einheit FE eines biologisch wirksamen Konjugats FE-L-M, wie es in der vorliegenden Anmeldung oben beschrieben ist, wobei das Verfahren eine spezifisch chemische Spaltung des Verbindungsarms L, das Freisetzen nach Entfernen und Trennen von FE mit klassischen Verfahren umfaßt, wobei Nle, βAla, Gly bzw. Pro als eine mit M verknüpfte Reportergruppe zurückbleibt.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Zwischenverbindung zur Herstellung des biologisch wirksamen Konjugats FE-L-M, wie es in der vorliegenden Anmeldung oben beschrieben ist, wobei die Zwischenverbindung die folgende allgemeine Formel (II) FE-L (II)aufweist, wobei:
    • FE
    für ein funktionalisierende Einheit, ausgewählt aus PEG, PVP, PacM, Dextran, Hormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, und
    L
    für einen Ver bindungsarm, bestehend aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro, steht.
  • Die Reportergruppierung eignet sich zur Identifizierung des ursprünglichen Orts der funktionellen Einheit. Die unten ausführlich beschriebene vorliegende Erfindung macht sich die Verwendung einer besonderen PEG-Aminosäuresequenz zunutze, bei der PEG so freigesetzt werden kann, daß eine Reporter-Aminosäure an das Makromolekül gebunden bleibt, die zur Identifizierung der Stelle der PEG-Bindung genutzt wird.
  • Ohne Beschränkung und im Sinne der Erfindung lassen sich mehrere funktionalisierende Einheiten vorhersehen – beispielsweise handelt es sich bei FE typischerweise um ein Polymer, wenn M für therapeutische Anwendungen vorgesehen ist. Obgleich viele Polymere von der vorliegenden Erfindung umfaßt sein können, wird das Polymer vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PEG, PVP, PAcM, Dextran u.a. Noch stärker bevorzugt sind PEG, PVP und PacM. Noch stärker bevorzugt ist PEG aufgrund seiner sehr günstigen biologischen Eigenschaften. Noch stärker bevorzugt ist MPEG.
  • Wie oben beschrieben, kann es sich bei FE, wie es in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, um ein Polymer oder eine aus Polymeren bestehende funktionelle Einheit handeln. Vorzugsweise weist das FE/Polymer ein Molekulargewicht von mehr als 2 kd auf; das Molekulargewicht liegt besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 50 kd. Ist FE ein Polymer, so kann es sich bei FE um ein lineares oder verzweigtes Polymer handeln.
  • Weitere funktionalisierende Einheiten können von der vorliegenden Erfindung umfaßt sein, beispielsweise hochaffine Liganden zum Abzielen auf spezifische Stellen. In diesem Fall kann es sich bei FE um einen beliebigen einer Reihe hochaffiner Liganden handeln. Vorzugsweise kann es sich bei FE um ein Hormon, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, oder um eine Verbindung, die mit einer Hochumsatz-Technik für eine Erkennungsstelle ausgewählt wird. Insbesondere kann FE ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Antikörper(n) oder Antikörperfragment(en).
  • Der Verbindungsarm L besteht aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro.
  • Weist das Konjugat die folgende Struktur auf: FE-Gln-Gly-M, so läßt sich FE vorzugsweise mittels Hydrazinbehandlung spezifisch abtrennen, wobei die Aminosäure Gly an M gebunden zurückgelassen wird.
  • Weist das Konjugat die folgende Struktur auf: FE-Asp-Pro-M, so läßt sich FE durch milde Säurebehandlung spezifisch abtrennen, wodurch Pro noch gebunden an M zurückbleibt.
  • In den oben angegebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die an M gebundenen Reportergruppierungen sehr stabil gegenüber saurer Hydrolyse und können daher leicht mit der Standard-Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse ebenso wie mit Massenspektrometrie, falls das sie enthaltende nichthydrolysierte Peptid mit dieser Technik analysiert wird, leicht identifiziert werden. An M gebundene Reportergruppierungen sind ausgewählt aus der Gruppe Nle, beta-Ala, Gly oder Pro. Besonders bevorzugt sind an M gebundene Reportergruppierungen ausgewählt aus unnatürlichen Aminosäuren, Nle oder beta-Ala. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Reportergruppierung um Norleucin.
  • In einer Hauptausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das erfindungsgemäße Verfahren im allgemeinen darin, Verknüpfungsstellen auf Makromolekülen zu identifizieren oder analysieren, wobei eine Verbindung mit der Zusammensetzung FE-L-M verwendet wird, indem die Bindungsstelle von FE an die M-Gruppierung auf Grundlage einer spezifischen physikalisch-chemischen Spaltung von L identifiziert und FE danach mit chromatographischen Verfahren freigesetzt, entfernt und getrennt wird.
  • Die Eignung der allgemeinen erfindungsgemäßen Verfahren wird weiterhin durch das Verwenden als nichtlimitierende Beispiele demonstriert (die Lokalisierung der Stelle der PEG-Konjugation in der Primärsequenz eines PEGlierten Nonapeptids und Insulins, entweder wenn das Insulin an einer oder auf der Ebene von zwei Aminogruppen PEGliert wurde).
  • In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Polypeptide mit PEG-Met-Nle modifiziert. Dadurch wird die Konjugation von PEG an das therapeutisch relevante Protein, Lysozym, mit seiner anschließenden vollständigen Entfernung durch CNBr veranschaulicht.
  • In mehreren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mehrere PEG-Peptidderivatverbindungen als Beispiele der Struktur: FE-L dargestellt.
  • Unter diesen sind die folgenden als veranschaulichend angegeben und erscheinen in mehreren Beispielen: PEG-Met-Nle, PEG-Met-Val (nicht Teil der Erfindung), PEG-Met-β-Ala, PEG-Gln-Gly, PEG-Asp-Pro. Alle diese ausgewählten PEG-Derivatverbindungen wurden am terminalen COOH mit einem der in der Literatur angegebenen Verfahren nämlich Hydroxysuccinimidylester (OSu), aktiviert und danach an die repräsentativen Polypeptide und Proteine gekoppelt.
  • Als zusätzliche bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde Lysozym mit PEG-Met-Nle, PEGliert, als OSU aktiviert, wobei wiederum die Polymergruppierung durch CNBr-Behandlung abgetrennt wurde.
  • In allen diesen obigen ausgewählten beispielhaften Ausführungsformen wurden die FE-L-M-Komplexe nach Konjugation durch HPLC- oder FPLC-Behandlung gereinigt, um das aktivierte nichtreagierte Polymer ebenso wie das nichtmodifizierte M abzutrennen.
  • Als weiterer Schritt wurden die gereinigten Konjugate untersucht und die Zusammensetzung bevorzugterweise durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse quantifiziert, um auf Grundlage des Verhältnisses der Reporter-Aminosäuregruppe zum Aminosäuregehalt von M (ebenso wie durch Massenspektrometrie des nichthydrolysierten Derivats) die Anzahl der an M gebundenen Polymerketten zu bestimmen.
  • Weiterhin wurden die gereinigten Konjugate mittels eines kolorimetrischen Trinitrobenzol sulfonat-(TNBS)-Tests analysiert, um die Anzahl der nichtreagierten Aminogruppen zu bestimmen (und mit einem für PEG spezifischen Iod-Test), in einer bevorzugten Ausführungsform, sein Vorhandensein zu zeigen.
  • Analysen für die Verbindungen und unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigen, daß alle FE-L-Moleküle mit den Polypeptiden verknüpft waren, ähnlich zu dem, was passiert, wenn PEG gemäß anderen Verfahren aktiviert wird. Ebenso stellte sich heraus, daß die Erhöhung des Molekulargewichts, wie sie durch die Maldi-Massenspektrometrie bestimmt wurde, dem um das Gewicht von FE-L oder um Vielfache davon erhöhten Molekulargewicht des Polypeptids entspricht. Weiterhin ließ sich das Vorhandensein der Reporter-Aminosäuregruppen im Polypeptid überraschenderweise stets zeigen und durch Aminosäureanalyse quantitativ bestimmen, wobei der erhaltene Wert der auf Grundlage der kolorimetrischen Aminogruppenbestimmung berechneten Modifikation entsprach. Schließlich stellte sich heraus, daß in allen Fällen die Konjugate gegenüber Iod reaktiv sind und eine Abnahme oder ein Verschwinden der Polypeptid-Aminogruppen in einem Ausmaß stattfindet, das der Anzahl an gebundenem FE-L entspricht.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird nach Abtrennung des PEG mit der obenerwähnten Verfahrensweise das PEG-freie Polypeptid über Gelfiltration gereinigt, von wo es aufgrund seiner Gewichtsabnahme bei höherem Volumen eluiert. Das neue Elutionsvolumen entspricht ungefähr dem von M vor der PEG-Modifikation; theoretisch, wobei der geringe Unterschied auf die Gewichtserhöhung aufgrund der Bindung der Reportergruppe, die nach Abtrennung von FE an M gebunden bleibt, zurückzuführen ist.
  • Schritte zur Sequenzstrukturbestimmung, wie z.B. Edman-Abbau, Reduktion und Carboxymethylierung, oder proteolytischer Abbau könnten ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Stelle der PEG-Anbindung anzuzeigen, wobei der Nachweis der Reporter-Aminosäure durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse oder, falls möglich, durch Massenspektrometrie des nichthydrolysierten Peptids einfacher ist.
  • Einige dieser interessanten Eigenschaften sind in den folgenden Beispielen, die nicht einschränkend sein sollen, und mit den folgenden analytischen Spektren dargestellt, wobei:
  • 1 das 1H-NMR-Spektrum von MPEG-Met-Nle-OH in CDCl3 darstellt;
  • 2 die HPLC-Elution von nativem Insulin darstellt;
  • 3a) die HPLC-Elution von MPEG-Met-Nle- Insulin darstellt, wobei b) die HPLC-Elution von aus der CNBr-Spaltung von MPEG-Met-Nle-Insulin erhaltenem Nle-Insulin darstellt;
  • 4a) die HPLC-Elution von (MPEG-Met-Nle)2-Insulin darstellt, wobei b) die HPLC-Elution von aus der CNBr-Spaltung von (MPEG-Met-Nle)2-Insulin erhaltenem (Nle)2–Insulin darstellt;
  • 5a) das Maldi-Massenspektrum von aus der CNBr-Spaltung von MPEG-Met-Nle-Insulin erhaltenem Nle-Insulin darstellt, wobei b) das Maldi-Massenspektrum von aus der CNBr-Spaltung von (MPEG-Met-Nle)2-Insulin erhaltenem (Nle)2-Insulin darstellt,
  • 6 das chromatographische Profil von a) nativem Lysozym darstellt, wobei b) MPEG-Met-Nle-Konjugat -Lysozym und c) aus der CNBr-Spaltung von MPEG-Met-Nle-Konjugat-Lysozym erhaltenes Nle-Lysozym darstellt.
  • Beispiel 1. Synthese von MPEG-Met-Val-OH (5000 Da)
  • In wasserfreiem Methylenchlorid gelöstes MPEG-OH 5000 (wobei MPEG für Polyethylenglykol-Methylether steht) wurde bei pH 8 mit 4-Nitrophenylchlorformiat in Gegenwart einer äquimolaren Menge an Triethylamin unter Erhalt von MPEG-p-Nitrophenylcarbonat umgesetzt. 1 g des Produkts (0,19 mmol) wurde in kleinen Portionen zu 283 mg (1,14 mmol) in 4 ml einer 50%igen Acetonitrillösung in Wasser gelöstem H-Met-Val-OH gegeben und mit TEA auf pH 8 gebracht. Nach Rühren über Nacht wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit fester Citronensäure auf 3 eingestellt; 4-Nitrophenol wurde durch Etherextraktion abgetrennt, während das Produkt später mit Chloroform extrahiert wurde. Die organische Lösung wurde mit festem trockenem Na2SO4 wasserfrei gemacht und unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Zugabe von 200 ml Diethylether zum Chloroform wurde die Lösung 1 Stunde bei –20°C gekühlt und das getrennte Produkt durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Das MPEG-Met-Val-OH wurde weiter durch Ionenaustausch chromatographie an einer QAE-Sephadex® A50-Säule (2,5 × 55 cm) gereinigt, zunächst mit Wasser und danach mit einer wäßrigen Lösung von 10 mM NaCl eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden zum Nachweis von PEG mit dem Iod-Test analysiert. Die das Natriumsalz des MPEG-Peptids enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, angesäuert und lyophylisiert. Die Ausbeute betrug 70–75% an MPEG-Peptid. Das Produkt wurde mittels 1H-NMR (200 MHz; CDCl3) identifiziert.
  • Beispiel 2. Synthese von MPEG-Met-Nle-OH (5000 Da)
  • Um MPEG-Met-OH zu erhalten, wurde MPEG 5000 an Met-OH nach dem in Beispiel 1 bei der Herstellung von MPEG-Met-Val-OH beschriebenen Verfahren gebunden. 523 mg (2,88 mmol) H-Nle-OMe sowie eine äquimolare Menge an TEA (401 μl) wurden zu einer Lösung 10 ml wasserfreiem Dichlormethan mit 3,71 g (0,72 mmol) des synthetisierten MPEG-Met-OH, 305 mg (0,72 mmol) 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (CMC) und 97 mg (0,72 mmol) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) gegeben. Nach 3 Tagen Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch in 250 ml Diethylether getropft, das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde weiter durch Ionenaustauschchromatographie an ein er QAE-Sephadex® A50-Säule (2,5 × 55 cm) gereinigt, zunächst mit Wasser und danach mit einer wäßrigen Lösung von 10 mM NaCl eluiert. Die Fraktionen wurden mit dem Iod-Test analysiert, um das Vorhandensein von PEG zu zeigen. Die den MPEG-Peptid-Methylester (MPEG-Met-Nle-OMe) enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophylisiert. Die Ausbeute betrug 93%. Die Struktur des Produkts wurde mittels 1H-NMR (200 MHz; CDCl3) verifiziert.
  • Der Methylester von Nle wurde in einer Lösung aus Methanol mit 20 Äquivalenten 1N NaOH verseift, und das Gemisch 2 Tage bei Raumtemperatur unter Rühren stehengelassen. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1N HCl auf 2 gebracht und das Produkt in Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wurde mit festem trockenem Na2SO4 wasserfrei gemacht und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Zugabe von 200 ml Diethylether unter starkem Rühren ergab ein Feststoffprodukt, das durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet wurde. Die Ausbeute betrug 67% an MPEG-Met-Nle-OH. Die Produktidentität wurde mittels 1H-NMR (200 MHz; CDCl3) identifiziert. Das Spektrum ist in 1 angegeben.
  • Beispiel 3. Synthese von MPEG-Met-Nle-OH (10 000 Da)
  • Das Produkt wurde gemäß Beispiel 2 hergestellt, wobei jedoch von einem MPEG-OH mit einem Molekulargewicht von 10 000 ausgegangen wurde.
  • Beispiel 4. Synthese von (MPEG-Met-Nle)2-Nonapeptid
  • Das terminale COOH von MPEG-Met-Nle-OH wurde als Hydroxysuccinimidester (MPEG-Met-Nle-OSu) gemäß einem Verfahren, das bereits in der Literatur für MPEG mit Nle als Aminosäure-Abstandhalter angegeben wurde (Applied Biochemistry and Biotechnology, 27, 45–54, 1991), aktiviert.
  • Ein mittels Festphasensynthese erhaltenes vollkommen geschütztes Nonapeptid mit der folgenden Struktur: Nps-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys-(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH wurde entschützt, wobei es in einem 1:1-Gemisch aus Trifluoressigsäure und Dichlormethan 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten wurde. Die Lösung wurde bis zur Trockne eingeengt und die Nps-Gruppe durch wiederholte Extraktionen in Diethylether bei 0°C abgetrennt. Das Produkt wurde schließlich im Vakuum 12 Stunden über KOH getrocknet. Die Ausbeute des vollständig entschützten Peptids betrug 90%.
  • 43 mg (4,0 μmol) MPEG-Met-Nle-OSu wurden in kleinen Portionen zu 0,9 mg (0,8 μmol) des in 1 ml DMSO, bei pH 8 mit TEA, gelösten entschützten Nonapeptids gegeben (Molverhältnis Nonapeptid:MPEG-Met-Nle-OSu = 1:5). Nach 3tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit 1 N HCl auf 3 ein gestellt und das Produkt mehrmals in Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wurde mit festem trockenem Na2SO4 wasserfrei gemacht und zur Trockne eingeengt. Das Konjugat wurde mittels eines halbpräparativen HPLC-Systems von Shimadzu weiter gereinigt, wobei eine Reverse-Phase-Vydac® 218TP54-Säule (gebundene C18-Phase, Innenabmessungen: 0,46 × 25 cm, Partikeldurchmesser: 5 μm) sowie ein linearer Gradient aus wäßriger 0,05%iger Trifluoressigsäure und 0,05%iger Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurden. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm verfolgt. Das Produkt wurde mit dem Iod-Test für MPEG und durch Aminosäureanalyse charakterisiert.
  • Beispiel 5. Synthese von MPEG-Met-Nle-Insulin
  • 8,6 mg (1 μmol) von wie in Beispiel 4 hergestelltem MPEG-Met-Nle-OSu wurden zu 6 mg (1 μmol) in 1 ml DMSO gelöstem Rinderinsulin gegeben (Molverhältnis Insulin-Aminogruppen:MPEG = 3:1), und das Gemisch wurde unter Rühren 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Konjugat wurde mittels eines präparativen HPLC-Systems von Shimadzu gereinigt, wobei eine Reverse-Phase-Vydac® 218TP1022-Säule (gebundene C18-Phase, Innenabmessungen: 2,2 × 25 cm, Partikel-durchmesser: 10 μm) sowie ein linearer Gradient aus wäßriger 0,05%iger Trifluoressigsäure und 0,05%iger Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurden und die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm verfolgt wurde. Die Fraktionen des Hauptelutionspeaks von konjugiertem Insulin wurden gesammelt und lyophylisiert. Die Identität des Produkts wurde durch einen kolorimetrischen Aminogruppentest, der den Verlust von einem Aminorest in Insulin anzeigte, sowie durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse bestimmt, die das Vorhandensein von einem Nle pro Insulin zeigte, wiederum als Unterstützung einer Bindung einer einzelnen Polymerkette pro Insulinmolekül.
  • Beispiel 6: Synthese von (MPEG-Met-Nle)2-Insulin
  • 17 mg (2 μmol) des wie in Beispiel 4 hergestellten MPEG-Met-Nle-OSu wurden zu 6 mg (1 μmol) in 1 ml DMSO gelöstem Rinderinsulin gegeben (Molverhältnis Insulin-Aminogruppen:MPEG = 3:2). Nach 5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch durch Reverse-Phase-HPLC wie in Beispiel 5 für MPEG-Met-Nle-Insulin beschrieben gereinigt. Die Fraktionen des Hauptelutionspeaks von konjugiertem Insulin wurden gesammelt und lyophylisiert. Die Identität des Konjugats wurde durch einen kolorimetrischen Aminogruppentest, der den Verlust von zwei Aminoresten anzeigte, sowie durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse bestimmt, die das Vorhandensein von zwei Nle pro Insulin zeigte, was darauf hindeutete, daß pro Insulinmolekül zwei PEG-Gruppierungen gebunden waren.
  • Beispiel 7. Umsetzung des (MPEG-Met-Nle)2-Nonapeptids mit CNBr
  • 1 mg (85,2 μmol) des, wie in Beispiel 4 beschrieben, erhaltenen (MPEG-Met-Nle)2-Nonapeptids wurde mit 100 Äquivalenten CNBr in wäßriger 70%iger Ameisensäure versetzt (nach Methods in Enzymology, S. 238–254, 1967). Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und danach in 10 Volumen Wasser gegossen und lyophylisiert (dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt). Die erhaltenen Produkte wurden mittels eines analytischen HPLC-Systems von Shimadzu analysiert, wobei eine Reverse-Phase-Vydac® 218TP54-Säule (gebundene C18-Phase, Innenabmessung en: 0,46 × 25 cm, Partikeldurchmesser: 5 μm) sowie ein linearer Gradient aus wäßriger 0,05%iger Trifluoressigsäure und 0,05%iger Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurden. Das Elutionsmuster deutete auf eine Verschiebung der Elutionszeiten von 36,3 min für das PEG-Peptid-Konjugat zu 15,8 min für das gleiche Produkt nach Behandlung mit CNBr hin. Dieser Wert lag in der Nähe des Werts für das Peptid allein (16,4 min), was zeigt, daß die PEG-Gruppierung entfernt worden war. Eine Aminosäure analyse nach saurer Hydrolyse sowie eine Massenspektrometrie zeigten das Vorhandensein von zwei Nle-Resten pro Peptidmolekül, was auf die Zuverlässigkeit dieses Verfahrens beim Abtrennen von PEG von dem Molekül unter Zurücklassen von Me als an dem Polypeptid gebundene Reportergruppe hindeutet.
  • Beispiel 8. Bestimmung der Anzahl von an unterschiedlich modifizierten Insulinproben gebundenen Polymerketten nach Abtrennung des Polymers
  • Die, wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben, erhaltenen Produkte, die Insulinkonjugaten mit einer bzw. zwei MPEG-Met-Nle-Ketten entsprachen, wurden mit CNBr in wäßriger 70%iger Ameisensäure behandelt. Das Molverhältnis zwischen Insulingehalt und CNBr betrug 1 zu 200. Nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch in 10 Volumen Wasser gegossen und lyophylisiert, wobei dieser Vor gang zweimal wiederholt wurde. Die erhaltenen Produkte wurden mittels eines analytischen HPLC-Systems von Shimadzu analysiert, wobei eine Reverse-Phase-Vydac® 218TP54-Säule (gebundene C18-Phase, In nenabmessungen: 0,46 × 25 cm, Partikeldurchmesser: 5 μm) sowie ein linearer Gradient aus wäßriger 0,05%iger Trifluoressigsäure und 0,05%iger Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurden. Das Elutionsmuster deutete auf eine Verschiebung der Elutionszeiten von den 22,2 min bzw. 23,2 min der PEG-Insulin-Konjugate mit einer bzw. zwei PEG-Ketten zu 18,9 min bzw. 19,2 min für die Produkte nach CNBr-Spaltung hin. Diese Werte, die in der Nähe des Werts für Insulin allein (18,3 min) liegen, zeigten, daß die PEG-Gruppierung entfernt worden war (siehe 2, 3 und 4). Die Massenspektrometrieanalyse ergab eine Masse von einem Insulinmolekül plus einem Me-Rest, wenn vom monoderivatisierten Insulin (MPEG-Met-Nle-Insulin) ausgegangen wurde, sowie plus zwei Resten im Fall von (MPEG-Met-Nle)2-Insulin (siehe 5). Die Massen-spektrenmusster waren weitaus deutlicher als die in der Analyse der Konjugate (Beispiele 5 und 6) erhaltenen, da die Gegenwart des Polymers mit seiner Polydispersivität die Spektren und deren Interpretation komplizierter und unsicher macht. Weiterhin wurden diese Werte durch Aminosäureanalyse bestätigt, wobei diese Ergebnisse darauf hindeuteten, daß ein oder zwei Nle-Reste pro Insulinmolekül in den Proben vorhanden waren.
  • Alle diese Daten unterstützen die Möglichkeit, PEG aus dem Molekül unter Zurücklassen von gebundenem Nle zu entfernen, womit sich die Zuverlässigkeit des Verfahrens zeigt.
  • Beispiel 9. Reduktion und Carboxymethylierung von Nle-Insulin
  • 500 μg (0,08 μmol) aus MPEG-Met-Nle-Insulin, wie in Beispiel 8 beschrieben, erhaltenes Nle-Insulin wurden in 250 μl TRIS-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 2 mM EDTA und 6 M Gdn-HCl gelöst. Danach wurden 3,5 mg 1,4-Dithio-L-treitol (DTT) zugegeben und das Gemisch 2 Stunden bei 37°C stehenge lassen. Schließlich wurden 9,2 mg Iodacetamid zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Die Lösung wurde lyophylisiert, und die Produkte wurden mittels eines halbpräparativen HPLC-Systems von Shimadzu aufgetrennt, wobei eine Reverse-Phase-Vydac® 218TP54-Säule (gebundene C18-Phase, Innenabmessungen: 0,46 × 25 cm, Partikeldurchmesser: 5 μm) mit einem linearen Gradienten von wäßriger 0,05%iger Trifluoressigsäure und 0,05%iger Trifluoressigsäure in Acetonitril verwendet wurde. Die eluierten Produkte, die durch Absorption bei einer Wellenlänge von 226 nm verfolgt wurden, zeigten das Vorhandensein von Hauptpeaks an, die der α- und β-Kette des Insulins entsprachen und die getrennt und wiedergewonnen wurden. Die Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse zeigte Nle als zusätzliche Aminosäure unter denen des β-Kette-Peaks. Durch Edman-Abbau (gemäß Protein Practical Chemistry, S. 371-373, 1986) wurden im ersten Schritt Phe und Nle freigesetzt, was darauf hindeutete, daß die α-Aminogruppe frei war und infolgedessen PEG an 29Lys der β-Kette gebunden war. Weiterhin zeigte die Massenspektrometrieanalyse, daß die Erhöhung um eine Nle-Masse nur in der β-Kette vorhanden war.
  • Beispiel 10. Reduktion und Carboxymethylierung von Nle2-Insulin
  • 600 μg (0,1 μmol) aus MPEG-Met-Nle-Insulin, wie in Beispiel 8 beschrieben, erhaltenes Nle2-Insulin wurden in 20 0 μl TRIS-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 2 mM EDTA und 6 M Gdn-HCl gelöst. 7,6 mg 1,4-Dithio-L-treitol (DTT) wurden in das Gemisch gegeben und 3 Stunden bei 37°C stehengelassen. Schließlich wurden 18,5 mg Iodacetamid zugegeben und 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Die Lösung wurde lyophylisiert, und die erhaltenen Produkte wurden isoliert und analysiert, wie in Beispiel 9 für das Nle-Insulin angegeben. Durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse stellte sich heraus, daß Nle-Aminosäure sowohl in der α- als auch der β-Kette vorhanden war. Weiterhin wurde durch Massenspektrometrie eine Gewichtserhöhung, die einem Nle-Rest entspricht, in beiden Ketten festgest ellt. Die Daten deuteten darauf hin, daß die PEGlierung unter den Bedingungen von Beispiel 6 an beiden Ketten stattfand.
  • Beispiel 11. Synthese von MPEG-Met-Nle-Lysozym
  • 42,2 mg (7,8 μmol) MPEG-Met-Nle-OSu wurden in kleinen Portionen und unter Rühren zu 3, 75 mg (0,26 μmol) in 1 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5 gelöstem Lysozym aus Hühnereiweiß gegeben. Das Molverhältnis Lysozym-Aminogruppen:MPEG betrug 1:5. Nach 30minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Konjugat mittels eines halbpräparativen FPLC-Systems gereinigt, wobei eine Superose 12TM-Gelfiltrationssäule (1,5 × 25 cm), die mit 0,01 M Phosphat-Puffer und 0,15 M NaCl, pH 7,2 eluiert wurde, verwendet wurde. Die Fraktionen wurden auf Lysozymelution durch Absorption bei 280 nm und zur PEG-Bestimmung mit dem Iodtest analysiert. Die das modifizierte Lysozym enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und auf ein kleines Volumen durch Ultrafiltration mit einem Amicon-System unter Verwendung einer YM3-Membran (Ausschlußgrenze: 3000) eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde mit Wasser verdünnt und ultrafiltriert. Dieses Verfahren wurde zur Abtrennung der Salze wiederholt und das Produkt schließlich lyophylisiert. Mittels eines kolorimetrischen Aminogruppen-Tests wurde ein Modifikationsgrad von 87% berechnet. Ein ähnlicher Wert wurde auf Grundlage des Nle-Gehalts durch Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse erhalten. Eine quantitative Bestimmung des Modifikationsgrads durch Massenspektrometrie war unzuverlässig.
  • Beispiel 12. Freisetzung von M PEG mit CNBr unter Erhalt von Nle-Lysozym
  • 0,04 μmol des, wie in Beispiel 11 angegeben, erhaltenen modifizierten Lysozyms wurden mit 600 Äquivalenten CNBr in wäßriger 70%iger Ameisensäure versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde danach in 50 ml Wasser gegossen und lyophylisiert (der Vorgang wurde zweimal wiederholt). die erhaltenen Produkte wurden mittels Gelfiltration auf einem FPLC-System analysiert, wobei die gleiche Säule und die gleichen Elutionsbedingungen, die für das Polymer-modifizierte Lysozym, wie in Beispiel 11 angegeben, verwendet wurden, eingesetzt wurden, um die chromatographischen Profile miteinander zu vergleichen. Es stellte sich heraus, daß die Elution des Lysozympeaks, der nach Polymerkonjugation früher erschien, zu ungefähr dem ursprünglichen Lysozym– elutionsvolumen nach CNBr-Behandlung verschoben wurde. Dementsprechend kehrten die mit TNBS tritrierbaren Aminogruppen, die nach der Lysozymmodifikation mit dem Polymer auf ungefähr 10% reduziert worden waren, auf die Werte für nichtmodifiziertes Lysozym nach Behandlung mit CNBr zurück (siehe 6). Die Massenspektrenmuster waren ebenso sehr eindeutig und einfach zu interpretieren, da das Lysozymgewicht um 6 Nle-Reste anstieg. Die Aminosäureanalyse zeigte ebenso eine Nle-Menge, die in der Nähe der mit dem TNBS-Test sowie Massenspektrometrie bestimmten Menge lag. Alle diese Daten unterstützen die Konjugation von PEG an Protein mit seiner anschließenden Abtrennung nach CNBr-Behandlung, wobei jedoch Nle als an das Protein gebundene Reporter-Aminosäure zurückbleibt.
  • Beispiel 13
  • 15 mg in 4 ml 0,1 M Borat-Puffer pH 7,8 gelöstes Interferon α-2b wurde mit 100 mg PEG-Met-Nle-Osu (10 000 Da lineares PEG oder 10 000 Da verzweigtes PEG) umgesetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und danach auf pH 6 gebracht, durch Ultrafiltration eingeengt und auf die Superdex-200-Gelfiltrationssäule aufgetragen. Neben einer kleineren Menge an nichtmodifiziertem Protein wurden zwei Peaks von unterschiedlich modifiziertem Interferon erhalten. Die PEG-modifizierten Proteinpeaks behielten größtenteils die biologische antivirale Aktivität. Die Proteine wurden durch Lyophylisierung gewonnen und wie in Beispiel 12 mit BrCN behandelt. In allen Fällen erhöhte die Frei setzung des PEG aus dem konjugierten Protein das Elutionsvolumen, wobei das neue Volumen dem der nichtkonjugierten Form entsprach, was die Freisetzung des PEG aus den Konjugaten wie in Beispiel 12 zeigt.
  • Beispiel 14
  • Interferon α-2b wurde gemäß der in Beispiel 13 angegebenen Verfahrensweise modifiziert, jedoch mit PEG-Met-Nle-Osu von linearem oder verzweigtem PEG von 20 000 Da. In diesem Experiment wurde ebenfalls PEG 20 000 Da mit Met-β-Ala als Peptidarm verwendet.
  • In allen Fällen wurden biologisch aktive Produkte erhalten. Weiterhin wurde durch die Behandlung mit BrCN Protein freigesetzt, das kein PEG, jedoch Nle oder β-Ala als an die Proteine gebundene Reportergruppen enthielt.
  • Beispiel 15
  • Nach der Vorgehensweise aus Beispiel 13 und 14 wurde G-CSF mit PEG-Met-Nle-Osu von 10 000 Da in der linearen oder verzweigten Form und von 20 000 Da in der linearen oder verzweigten Form konjugiert. PEG-Met-β-Ala wurde ebenfalls in der Konjugation eingesetzt.
  • In allen Fällen wurde biologisch aktives Protein erhalten, wobei sich PEG durch BrCN-Behandlung abtrennen ließ und Nle oder β-Ala als an das Protein gebundene Reporter-Aminosäure zurückließ.
  • Beispiel 16
  • Nach Beispiel 15 wurde das Glykoprotein Erythropoetin mit PEG-Met-Nle oder PEG-Met-β-Ala modifiziert. In diesem Fall ergab die Konjugation ebenfalls aktives Protein, wobei die Freisetzung von PEG durch BrCN-Behandlung erreicht wurde.
  • Beispiel 17
  • Gemäß einer ähnlichen Vorgehensweise wie der in Beispiel 1 beschriebenen wurde, ausgehend von MPEG-OH 5000 und H-Gln-Gly-OH, MPEG-Gln-Gly-OH hergestellt und danach in seinen Succinimid-aktivierten Ester MPEG-Gln-Gly-OSu umgewandelt.
  • Beispiel 18
  • Gemäß einer ähnlichen Vorgehensweise wie der in Beispiel 5 beschriebenen wurde das biologisch wirksame Konjugat MPEG-Gln-Gly-Insulin unter Verwendung des aktivierten Esters aus Beispiel 17 erhalten. Dieses Konjugat zeigte biologische Aktivitäten und war in der Lage, durch Anwenden einer klassischen Hydrazinbehandlung an der Gln-Gly-Bindung selektiv gespalten zu werden.
  • Beispiel 19
  • Gemäß einer ähnlichen Verfahrensweise wie der in Beispiel 1 beschriebenen wurde, ausgehend von MPEG-OH 5000 und H-Asp-Pro-OH, MPEG-Asp-Pro-OH hergestellt und danach in seinen Succinimid-aktivierten Ester MPEG-Asp-Pro-OSu umgewandelt.
  • Beispiel 20
  • Gemäß einer ähnlichen Vorgehensweise wie der in Beispiel 5 beschriebenen wurde das biologisch wirksame Konjugat MPEG-Asp-Pro-Insulin unter Verwendung des aktivierten Esters aus Beispiel 19 erhalten. Dieses Konjugat zeigte biologische Aktivitäten und war in der Lage, durch Anwenden einer klassischen milden Säurebehandlung an der Asp-Pro-Bindung selektiv gespalten zu werden.
  • Abkürzungen
  • Als Hilfe zum Verständnis der vorliegenden Erfindung wird die folgende Liste von hier verwendeten Abkürzungen, die einem Durchschnittsfachmann leicht verständlich sind, bereitgestellt.
    • Asp
    Asparaginsäure
    Boc
    N-tert.-Butoxycarbonyl
    CMC
    1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)- carbodiimid
    metho-p-
    Toluolsulfonat
    DMSO
    Dimethylsulfoxid
    DTT
    1,4-Dithio-L-threitol
    EDTA
    Ethylendiamintetraessigsäure
    FPLC
    Schnelle Protein-Flüssigkeits chromatographie
    Gdn-HCl
    Guanidinhydrochlorid
    HOBt
    1-Hydroxybenzotriazol
    HPLC
    Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
    Leu
    Leucin
    Lys
    Lysin
    Met
    Methionin
    MPEG oder mPEG
    Polyethylenglykol-Methylether
    Nle
    Norleucin
    NMR
    Kernmagnetresonanz
    Nps
    2-Nitrophenylsulfenyl
    OMe
    Methoxy
    OSu
    Succinimidyloxy
    OtBu
    tert.-Butoxy
    PAcM
    Polyacryloylmorpholin
    QAE
    quaternäres Aminoethyl
    Ser
    Serin
    tBu
    tert.-Butyl
    TEA
    Triethylamin
    Thr
    Threonin
    TNBS
    2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
    TRIS-HCl
    Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid
    Tyr
    Tyrosin
    Val
    Valin

Claims (8)

  1. Biologisch wirksames Konjugatderivat mit der folgenden allgemeinen Formel (I) FE-L-M (I),wobei: M für den entsprechenden Rest eines biologisch wirksamen Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden und Polypeptiden, FE für eine funktionalisierende Einheit, ausgewählt aus PEG, PVP, PacM, Dextran, Hormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, und L für einen Verbindungsarm, bestehend aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro, der durch chemische Behandlung gespalten werden kann, wobei Nle, βAla, Gly bzw. Pro als eine mit M verknüpfte Reportergruppe zurückbleibt, steht.
  2. Biologisch wirksames Konjugatderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionalisierenden Einheit FE um ein Polymer mit einem Molekulargewicht im Bereich von 2 Kd bis 50 Kd handelt.
  3. Biologisch wirksames Konjugatderivat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polymer um PEG handelt.
  4. Biologisch wirksames Konjugatderivat nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionalisierenden Einheit FE um ein lineares Polymer handelt.
  5. Biologisch wirksames Konjugatderivat nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionalisierenden Einheit FE um ein verzweigtes Polymer handelt.
  6. Biologisch wirksames Konjugatderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologisch wirksamen Molekül um ein Protein, ausgewählt aus Insulin, Lysozym, Interferon, Erythropoetin, G-CSF, GH, handelt.
  7. Verfahren zur Identifizierung von Verknüpfungsstellen der Konjugation der funktionalisierenden Einheit FE, das eine spezifische chemische Spaltung des Verbindungsarms L, Freisetzen nach Entfernen und Trennen von FE mit klassischen Verfahren umfaßt, wobei Nle, βAla, Gly bzw. Pro als eine mit M verknüpfte Reportergruppe zurückbleibt und wobei FE, L und M die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung aufweisen.
  8. Zwischenverbindung zur Herstellung des biologisch wirksamen Konjugatderivats nach Anspruch 1, die die folgende allgemeine Formel (II) FE-L (II)aufweist, wobei: FE für eine funktionalisierende Einheit, ausgewählt aus PEG, PVP, PacM, Dextran, Hormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, und L für einen Verbindungsarm, bestehend aus einem Dipeptid, ausgewählt aus Met-Nle, Met-βAla, Gln-Gly und Asp-Pro, steht.
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