DE60118598T2

DE60118598T2 - Verfahren zur rückfaltung von chemisch hergestellten polypeptiden

Info

Publication number: DE60118598T2
Application number: DE60118598T
Authority: DE
Inventors: Antonio Verdini; Giampietro Corradin; Mario Roggero
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2000-11-27
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2021-11-28
Also published as: US20050239162A1; ES2261509T4; RU2275377C2; CN1249078C; ATE322501T1; DK1337549T3; NO20032356L; HUP0302395A2; CA2416054A1; ZA200300642B; DE60118598D1; WO2002050099A2; US20020082384A1; JP2004516300A; ES2261509T3; EP1337549B1; NZ523679A; KR20030081315A; BR0113091A; CN1449406A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Falten chemisch synthetisierter Polypeptide. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen biologischer aktiver Proteine.
Im Verlauf des letzten Jahrzehntes hat es eine Eskalation beim Bedarf an synthetischen Proteinen nach der erfolgreichen chemischen Synthese von vollständig aktiver HIV-Protease gegeben, einem 99-Reste-Enzym, das durch hoch optimierte Verfahren der Festphasenpeptidsynthese (SPPS), basierend auf dem Standard Boc/Bzl-Ansatz hergestellt wurde.
Die Synthese von kristallinem Ubichitin, einem kleinen Protein aus 76 Resten, 1994, hat weiterhin demonstriert, dass hochreine Proteine durch SPPS basierend auf dem Fmoc/t-Bu-Protokoll synthetisiert werden können, einem Verfahren, das operational einfacher und chemisch weniger kompliziert als die Boc/Bzl-Prozedur ist.
Jetzt im Jahr 2000 gibt es vielfältige experimentelle Evidenz, dass Einzel-Domain-Proteine, die zwischen 60 und 100 Aminosäure-Reste enthalten, rasch, zuverlässig und ökonomisch durch chemische Synthese, mit Hilfe eines Peptid-Synthetisierers, in Mengen, die für strukturelle und funktionale Studien hinreichend sind, produziert werden können.
Disulfid-Brücken enthaltende Proteine, die durch chemische Synthese hergestellt werden, haben, wenn einmal gefaltet, die gleichen Eigenschaften wie natürliche und gentechnisch hergestellte Formen. Disulfid-Brücken von Proteinen bilden einzelne oder mehrere zyklische intra- und/oder Interketten-Strukturen, die den Molekülen beachtliche Konformations-Beschränkungen auferlegen, und somit entscheidend zur Stabilisierung der bioaktiven Konformation beitragen.
Gefaltete Einzeldomainproteine bekannter Struktur können durch regioselektive Paarung von Cystein-Resten hergestellt werden. Verschiedene Kombinationen von Cystein-Schutzgruppen, die mit den üblicherweise verwendeten Schutzschemata kompatibel sind, wurden entwickelt, die eine schrittweise und paarweise Deprotektion und/oder Kooxidation von Cystein-Resten bei vollständiger Selektivität gestatten.
Jedoch ist eine Demonstration dafür, wie anspruchsvoll die bei regioselektiver Paarung der Cystein-Reste in mehrere Cystin-Reste enthaltenen Proteinen involvierte Chemie ist, die kürzliche Synthese eines insulin-artigen Peptids, menschlichem Relaxin. Die Synthese des A-Kettenvorläufers wurde unter Verwendung von SPPS-Verfahren, des Fmoc/t-Bu-Ansatzes und eines P-Alkoxybenzyl-Alkohol-basierten Rests durchgeführt, während der B-Kettenvorläufer unter Verwendung von PAM-Harz (4-Carboxyamidomethylbenzyl-Ester-Verknüpfung mit polystyrol-basiertem Harz) nach dem Boc/Bzl-Ansatz hergestellt wurde. Von den vier Cystein-Resten des A-Kettenvorläufers wurden zwei als S-Trt (S-Triphenylmethyl)-Derivate geschützt, während die anderen S-Acm (S-Acetamidomethyl) und S-Meb (S-p-methylbenzyl)-Schutz hatten. Die zwei Cysteine des B-Kettenvorläufers wurden durch S-Acm und S-Meb-Schutzgruppen geschützt. Die intramolekulare S-S-Brücke der A-Kette wurde zuerst durch Iodoxidation in AcOH erhalten. Dann wurden die zwei Intermolekular-Disulfid-Brücken, die die A- und B-Ketten verbinden, in zwei Schritten erhalten: Im ersten Schritt wurde das freie Thiol des A-Kettenvorläufers, erhalten durch HF-Deblockierung der S-Meb-Schutzgruppe, mit dem aktivieren Cys(Npys) (S-3-Nitro-2-Pyridin-Sulphenyl)-Rest der B-Kette reagiert (gerichtete intermolekulare Heterodisulfid-Bildung) und in einem zweiten Schritt wurde die verbleibende S-S-Brücke durch kooxidative Entfernung der S-Acm-Gruppen mit Iod erhalten.
SPPS-Protokolle bieten die Möglichkeit, durch chemische Synthese eine Vielzahl von Polypeptiden herzustellen, die mit derselben Blockier-(Schutz-)Gruppe geschützte Cystein-Reste enthalten. Wenn einmal die Schutzgruppen durch eine Anzahl von oxidierenden Reagenzien entfernt sind, bilden sich die Disulfid-Bindungen direkt. Polypeptide und/oder Proteine, die S-Trt oder S-Acm-geschützte Cysteine enthalten, können tatsächlich bei Behandlung mit Iod, N-Iodsuccinimid und Zyanogeniodid unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen von Lösungsmitteln, pH und Reaktionszeit, welche die Modifikation von oxidations-sensitiven Tyr, Met und Trp minimieren und die Überoxidation von Cystein-Thiolen an den entsprechenden Sulfonsäuren vermeiden, effizient gefaltet werden.
Thallium (III)-Trifluoracetat kann die obigen Oxidationsmittel ersetzen, was manchmal bessere Ausbeuten an Disulfid-Bindungen erbringt. Die Hauptbeschränkungen dieses Reagenz sind seine Toxizität, die Schwierigkeit, Thallium aus dem Ziel-Polypeptid zu entfernen und die Notwendigkeit, Met- und Trp-Reste vor Oxidation zu schützen.
Oxidations-Reagenzien, die eine Mischung von Sulfoxid/Silyl-Verbindungen und Trifluoressigsäure enthalten, sind erfolgreich für die direkte Oxidation zu Disulfid-Bindungen von Polypeptid-Vorläufern, die S-Acm, S-But, S-Meb und S-Mob (S-p-Methoxybenzyl)-Cystein-Reste enthalten, verwendet worden. Die Notwendigkeit, den Trp-Indol-Ring mit Formyl zu schützen, um Chlorierung unter oxidierenden Bedingungen zu vermeiden, ist jedoch die Hauptbeschränkung dieser Mischung.
Verfahren für das oxidative Falten linearer, synthetischer Polythiol-Vorläufer (reduzierter Polypeptid-Formen) sind populärer und werden häufiger eingesetzt. Beim einfachsten Verfahren können sich geeignete Disulfid-Bindungen in Anwesenheit von Luft oder anderen milden Oxidierungsmitteln spontan bilden. Darüber hinaus wird eine Falten- und Cystein-Paarung in Anwesenheit sowohl von reduzierten (RSH) als auch oxidierten (R-S-S-R)-Formen einer niedermolekular-gewichtigen Sulphydryl-Verbindung erhalten.
Bei synthetischen Polypeptiden und kleinen Proteinen, die aus einer einzelnen Domäne bestehen, ist die thermodynamische Antriebskraft für die Faltung, die aus einer Kombination von H-Bindung, Ionen-Paarung und hydrophoben Effekten herrührt, offensichtlich hinreichend maßgeblich, um die nativen Isomere spontan in einer zufälligen Renaturierungs-Oxidation zu erzeugen.
Aus Studien des oxidativen Faltens von multiplen Cystein-enthaltenden kleinen Proteinen, wie Enzym-Inhibitoren, Toxinen oder Hormonen sind nützliche Informationen über bestimmte strukturelle Motive, z. B. Cystein-stabilisierte α-Turns, Cystein-stabilisierte Poly(Pro)-II Helixfaltung und Cystein-stabilisierte á-â-Strukturfaltung erhalten worden, deren Stabilisierung die Hauptantriebskraft für die korrekte Disulfid-Brückenbildung selbst bei relativ kleinen Peptidmolekülen ist. Falls man der Auswahl von Puffern, der Temperatur und von Zusätzen, die die sekundären Strukturmotive stabilisieren, Aufmerksamkeit schenkt, können selbst vollständig korrekte Faltungen von partiel gefalteten oder verwickelten (fehlgefalteten) Protein in vitro erhalten werden.
Es sind eine Anzahl von Faltungsprotokollen für Polythiol-Polypeptid-Spezies entworfen worden, um die inkorrekte intramolekulare Cystein-Paarung zu vermindern, die zu nicht-nativen, fehlgefalteten Isomeren führt, und soweit als möglich zufällige intermolekulare Disulfid-Bindungsausbildung zu vermeiden, welche Aggregation und Präzipitation fördern.
Somit wird die Luftoxidation allgemein bei einer hohen Verdünnung der Vorläufer-Polythiolform (1 mg/ml oder weniger) unter neutralen oder leicht alkalischen Bedingungen durchgeführt. Üblicherweise erfordert sie eine lange Dauer und erzeugt ein harmloses Nebenprodukt, wie Wasser, in der Reaktion. Luftoxidationen sind jedoch schwierig zu kontrollieren, da Spurenmengen von Metall-Ionen ihre Raten stark beeinflussen. Wichtiger, basische und hydrophobe Vorläufer-Moleküle tendieren dazu, aus der Lösung an oder nahe ihres basischen oder neutralen isoelektrischen Punktes während des Faltungsprozesses zu aggregieren oder zu präzipitieren. Weiterhin akkumulieren Nebenprodukte aufgrund der Oxidation von Met während der Faltung. Obwohl die Anzahl von chemischen Vorgängen, die zum Falten von Polythiol-Vorläufern notwendig ist, auf ein Minimum reduziert ist, ergibt die vom molekularen Sauerstoff in der Luft geförderte Disulfid-Brückenausbildung in vielen Fällen niedrige Ausbeuten, und tritt manchmal gar nicht auf.
DMSO und Kaliumferricyanid sind ebenfalls als Oxidantien verwendet worden. Kaliumferricyanid muss jedoch im Dunkeln verwendet werden und falls Met und Trp in der Polypeptidkette vorhanden sind, akkumulieren Oxidations-Nebenprodukte während der Faltung. Die Verwendung von DMSO gibt oft bessere Ergebnisse aufgrund der Tatsache, dass oxidative Faltungen unter sauren Bedingungen bei einer effizienten Rate durchgeführt werden können, ohne schädliche Produkte in der Reaktion. Das Verfahren ist besonders geeignet zum Falten von basischen und hydrophoben Polypeptidvorläufern aufgrund der höheren Löslichkeits-Charakteristika von Spezies, die Oxidation in sauren Puffern erfahren. Jedoch ist oft von Problemen beim Entfernen von DMSO aus dem Endprodukt und Reduktion der Selektivität von Disulfid-Brückenbindung berichtet worden. Darüber hinaus kann ein Verfalten von Disulfid-Brücken, was zu verwickelten Isomeren und Oligomerisierung führt, nicht immer vermieden werden, selbst bei sorgfältiger Kontrolle der experimentellen Bedingungen.
Höhere Ausbeuten an korrekter Cystein-Paarung und Faltung in kleinen Protein-Polythiol-Vorläufern werden am häufigsten durch die Verwendung von Redox-Puffern erhalten, wie etwa oxidiertem (GSSG) und reduziertem (GSH)-Glutathion und Cystin/Cystein (Cys/Cys).
Somit werden während der oxidativen Faltung von Ribonuclease A (R. R. Hantgan et al., Biochemistry 13, 613, 1974) der 49 Aminosäuren-Kerndomäne von Hirudin (B. Chatrenet und J. Y. Chang J. Biol. Chem. 267, 3038, 1992) und bovinem Pankreas-Trypsininhibitor (BPTI) (T. E. Creighton Methods Enzymol. 131, 83, 1986), induziert durch GSSG/GSH oder Cys/Cys freie Sulfhydrile und Disulfid-Gruppen konstant während des Faltungsprozesses gebildet und umgebildet. Die Gesamtraten und Ausbeuten sind üblicherweise besser als bei oxidativer Faltung in Luft, weil Thiol/Disulfid-Austausch, der zwischen Thiolat-Zwischenstufen auftritt, das Umschaufeln nicht-nativen Disulfids zum natürlichen erleichtert. Bezüglich der oxidativen Faltung in Luft ist eine hohe Verdünnung des Polythiol-Vorläufers notwendig, um Aggregation, Ausbildung von Oligomeren und Polymeren zu vermeiden und die Ausbeuten der Zielprotein-Spezies zu maximieren.
Während der ersten Stufe des Faltens von Hirudin^1–49 in vitro schreitet die Faltung sequenziell und irreversibel von der ungefalteten, reduzierten Form (Polythiol) zu equilibrierten Isomeren fort, die ein und zwei Disulfid-Brücken enthalten, und zu equilibrierten Spezies, die drei Disulfid-Bindungen (verwickelte Isomere) enthalten (J. Y. Chang Biochem. 300, 643, 1994). Nahezu alle 75 möglichen Protein-Spezies, einschließlich der nativen, sind identifiziert worden: 15 Isomere mit einer S-S-Brücke, 45 Isomere mit zwei S-S-Brücken und 15 Isomere mit 3 S-S-Brücken. Während der zweiten Faltungsstufe reorganisieren die verwickelten Spezies sich durch Umlagern der nicht-nativen Disulfide, um die native Protein-Spezies zu erreichen. Die Disulfid-Bildung wird primär durch oxidiertes Glutathion oder Cystin gefördert, während Disulfid-Umlagern einen Thiol-Katalysator erfordert, z. B. reduziertes Glutathion oder Cystein oder Mercaptoethanol.
Die Effektivität von Thiol-Reagenzien beim Fördern des Umschaufelns ist anscheinend in Beziehung stehend mit ihrem Redox-Potential und jeder Katalysator zeigt eine optimale Konzentration. Cystin/Cystein ist etwa zehnmal potenter als GSSG/GSH beim Prozess der Akkumulierung von verwickelten Hirudinen. Dieser Unterschied ist durch das relative Redox-Potential von GSSG/GSH(–0,24 V) und Cys-Cys/Cys (–0,22 V)-Systemen erklärt worden. Durch Auswählen einer Kombination von optimalen Bedingungen (Temperatur, Puffer, Salze und Redox-Mischung) wurde der Faltungsprozess von Hirudin^1–49 bis zu dem Ausmaß beschleunigt, dass es innerhalb von 15 Minuten zum Abschluss kam.
Im Allgemeinen sollte sich die native Konformation eines synthetischen Proteins, das mehrere Disulfid-Bindungen enthält, unter optimalen Bedingungen für das Falten von Polythiol-Formen spontan ausbilden. In vielen Fällen jedoch wird selbst bei optimierten Bedingungen durch die obigen Redox-Puffer mediierte oxidative Faltungen eine beachtliche Menge an Nebenprodukten und fehlgepassten Formen hergestellt. Dies ist insbesondere bei Proteinen der Fall, die dazu tendieren, die native Konformation nur auf der Oberfläche von spezifischen Membranen oder unter Hilfe eines spezifischen molekularen Chaperons auszubilden (S. Sakakibara Biopolymers, Peptide Science 51, 279, 1999).
Weiterhin sind trotz ihres weit verbreiteten Einsatzes die meisten oxidativen Faltungen von Polythiol-Vorläufern, die durch Luft oder die GSSG/GSH und Cystin/Cystein-Redox-Paare gefördert wurden, in einer Versuchs- und Irrtumsweise durchgeführt worden, wie klar durch Faltungsexperimente synthetischer Chemokine und Chemokin-Analoge gezeigt ist. Während sich native Chemokine und eine Anzahl ihrer Analoge leicht falten, wobei die gefaltete Struktur durch zwei oder drei Disulfid-Brücken stabilisiert wird, falten sich tatsächlich verschiedene Analoge unter den gleichen Bedingungen wie die entsprechenden nativen Moleküle nicht gut, was zu partiell gefalteten Formen führt. Diese Beobachtungen repräsentieren eine starke Indikation, dass Änderungen an der Primärstruktur der Polythiol-Vorläufer negativ die Einführung korrekter lokaler Faltungen (α-Turns, Polyprolin-Helix-Motive etc.) in den zu faltenden Polypeptinketten beeinträchtigen. Daher ist die Leichtigkeit, viele Thiol-Vorläufer zu falten, hauptsächlich eine intrinsische Eigenschaft der Polypeptidkette, und weniger eine Funktion des spezifischen Oxidationssystems, das auf die Moleküle wirkt.
Eine Verbesserung ausgewählter Disulfid-Paarungen durch Zugabe von Alkoholen, Acetonitril und DMSO zum Puffern bei niedriger Ionenstärke sind ebenfalls berichtet worden. Diese Strategie involviert das Verstärken der Ausbildung von spezifischen Disulfid-Bindungen durch Einstellen elektrostatischer Faktoren im Medium, um die Gegenüberstellung von entgegengesetzt geladenen Aminosäuren zu begünstigen, die an die ausgewählten Cystein-Reste angrenzen.
Enzyme wie etwa Peptidyl-Disulfid-Isomerase (PDI) und Prolyl-Isomerase (PPI) sind ebenfalls als Additive eingesetzt worden, um Disulfid-Austausch zu katalysieren und zu modulieren. Die zum Falten von Hirudin in vitro erforderliche Zeit kann von 10 Stunden auf 30 Sekunden abgekürzt werden, falls PDI dem Umfaltungs-Puffer zugesetzt wird. In diesem Fall unterscheidet sich die Effizienz der Faltung in vitro nicht-signifikant von der in vivo beobachteten.
Polythiol-Polypeptid-Vorläufer werden direkt durch Polypeptid-Harz acidolytische Spaltung erhalten, wenn die Cystein-Reste durch säure-labile Gruppen, z. B. Trt, geschützt sind. Alternativ und vorzugsweise werden Polypeptide, bei denen alle Cysteine durch eine säureresistente Gruppe, z. B. die Acetoamidomethyl-Gruppe (Acm) geschützt sind, zuerst als S-Cystein-Derivate durch acidolytische Peptid-Harz-Spaltung isoliert und dann wird die Acm-Gruppe durch Behandlung mit Hg(AcO)₂ in Essigsäure eliminiert, gefolgt von der Entfernung von Hg-Ionen durch Gel-Filtration in Anwesenheit eines großen Überschusses an Mercaptoethanol.
In beiden Fällen jedoch sind verschiedene Nebenreaktionen berichtet worden, die an Cystein- und Tryptophan-Resten auftreten. Der Indol-Ring von Tryptophan kann durch Mercaptoethanol derivatisiert werden und Cystein ergibt eine Anzahl von Nebenreaktionen, von denen die wichtigste eine Oxidation und Alkylierung durch T-Butyl-Kationen während der acidolytischen Entfernung der Polypeptidkette aus dem Harz ist.
Somit existiert aufgrund der Nachteile der existierenden Methodologien ein Bedarf für effizientere und einfachere Prozesse zum Falten chemisch synthetisierter Polypeptide und der Herstellung biologisch aktiver Proteine durch chemische Synthese.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, einen effizienten, simplen und raschen Prozess zum Falten von Polypeptiden und/oder Proteinen bereitzustellen, bei dem unter anderem die Ausbildung von fehlgepassten, Disulfid-Brücken enthaltenden Isomeren minimiert wird, und die Verwendung von teuren Disulfid-Umlagerungs-Reagenzien wie etwa Glutathion oder Enzymen vermieden werden kann, und welches Verfahren wiederholbar, robust und skalierbar ist. Diese und andere Aufgaben werden für Durchschnittsfachleute ersichtlich sein.
Ein Verfahren zum Herstellen von biologisch aktiven Proteinen wird bereitgestellt, das umfasst:

(a) chemisches Synthetisieren eines Polypeptids, das zwei oder mehr S-ter-Butylthio-Cystein-Reste umfasst;
(b) Behandeln des Polypeptids mit einem Reduktionsmittel in einem Faltungspuffer mit einem vorgegebenen pH und Temperatur; und
(c) Reinigen der erhaltenen gefalteten Proteine.

Somit ist gemäß der Erfindung unerwarteterweise gefunden worden, dass S-t-Bu-derivatisierte Cysteine deprotektiert werden können, das heißt ihre S-t-Bu-Einheit verlieren, während Disulfid-Brücken mit anderen Cysteinen ausgebildet werden, bei Inkubation in einem geeigneten Faltungspuffer bei geeigneter Temperatur und pH. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Reduktionsmittel vorzugsweise freies Cystein. Ein Überschuss an Cystein kann dem Puffer zugegeben werden (wie beispielsweise in den Beispielen 1–5 illustriert) oder das Cystein kann von innerhalb des Polypeptids abgeleitet sein (wie in Beispiel 6 illustriert).
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst der Faltungspuffer ein oder mehr chaotrope Salze, um das Polypeptid in Gleichgewichtsbedingungen zu bringen, die das Auftreten einer natürlichen Faltung gestatten. Dies kann beispielsweise durch Platzieren des Polypeptids und/oder Proteins in voll-denaturierende Bedingungen, beispielsweise durch Hochkonzentration der chaotropen Salze und dann Verdünnen der chaotropen Salze auf eine niedrigere Konzentration zur Faltung erreicht werden. Die chaotropen Salze werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus Guanidium-Chlorid und Harnstoff besteht und liegen vorzugsweise während der Faltung in einer Konzentration von 0,1–1 M vor.
Vorzugsweise liegt die Temperatur des Faltungspuffers zwischen 25° und 40°C, bevorzugtererweise zwischen 27° und 38°C, um die Änderungen an Peptid-Degradierung zu verkleinern, während sie natürlichen Körpertemperaturen entsprechen. Am bevorzugtesten ist die Temperatur während der Faltung etwa 37°C. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Prozesses der Erfindung hat der Faltungspuffer einen leicht alkalischen pH. Vorzugsweise liegt der pH zwischen 7 und 9, bevorzugtererweise zwischen 7 und 8,5, um den Faltungsprozess zu fördern. Wie aus dem obigen ersichtlich sein mag, hängt die Proteinfaltung von einem komplexen Set von Interaktionen ab. Die Reaktion mit Cystein tritt beispielsweise nicht bei saurem pH auf und höhere pH-Werte steigern das Risiko eines Abbaus des Polypeptids.
Nach Faltung kann das Zielprotein durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt werden, einschließlich Anionen- und Kationen-Austausch-Chromatographie, hydrophober Interaktions-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, hydrophile Interaktion/Kationenaustausch-Chromatographie (HILIC/CEC), Verdrängungs-Chromatographie (DC, Displacement Chromatography) und Probenverdrängungs-Chromatographie (SDM). Am bevorzugtesten werden (Umkehrphasen-)Hochleistungs-Chromatographie bei der Eluierung wie auch Verdrängungs-Chromatographie eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Prozesses zum Herstellen biologisch aktiver Proteine umfasst der Prozess die Schritte:

(a) Aufbauen von S-t-Butyl-Thio-Cystein-Polypeptid auf einem unlöslichen Polymer-Trägermittel mittels schrittweise Kettenverlängerung;
(b) Abtrennen der S-t-Butyl-Thio-Cystein-Polypeptid-Kette vom Träger durch Acidolyse;
(c) Reinigen des erhaltenen S-t-Butyl-Thio-Cystein-Polypeptids;
(d) Falten des gereinigten S-t-Butyl-Thio-Cystein-Polypeptids durch Behandeln der Polypeptide mit einem molaren Überschuss von Cystein in einem Faltungspuffer, der ein chaotropes Salz, vorzugsweise Guanidinium-Chlorid, umfasst und der einen alkalischen pH und eine Temperatur von etwa 37°C aufweist; und
(e) Reinigen der erhaltenen gefalteten Proteine durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des Prozesses der Erfindung ist der Polymer-Träger ein Polyamid oder ein polystyrol-basiertes Harz, das mit dem säurelabilen Hydroxymethylphenoxy-Essigsäure-Linker funktionalisiert ist, da diese Träger geeigneterweise für vollautomatisierte Peptid-Synthetisierer verwendet werden können und allgemein Synthese langer Polypeptid-Ketten gestatten.
Wie oben erklärt, basiert die vorliegende Erfindung auf der schrittweisen Festphasen-Assemblierung von S-t-Butyl-Thio Cystein-Polypeptiden und der Erkenntnis, dass beachtliche Mengen an nativen, biologisch aktiven Proteinen durch Unterwerfen der Polypeptide einer Faltung in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, vorzugsweise Cystein, bei einem pH etwas über Neutralität und einer Temperatur von etwa 37°C hergestellt werden können.
Es ist überraschenderweise gefunden wurden, dass die Herstellung von biologisch aktiven Proteinen mit einem hohen molaren Überschuss von Cystein in einer Prozedur erzielt wird, die die S-t-Butyl-Schutzgruppe entfernt, während sie eine Disulfid-Brückenausbildung gestattet. Solche eine Prozedur ist einfacher und effizienter als die im Stand der Technik für die Faltung von Cystein enthaltenen Polypeptiden, die durch chemische Synthese erhalten werden, beschriebene Prozeduren. Die Entfernung von S-t-but tritt somit im selben Schritt auf wie das Falten des Polypeptids.
Alternativ kann dasselbe gefaltete Material auch durch Verwenden einer Kombination von S-t-Butyl-Thio-Cystein und mit geeigneten säurelabilen Gruppen an ausgewählten Positionen der Polypeptid-Kette geschütztes Cystein erhalten werden, um die Ausbildung der geeigneten Disulfid-Bindungen ohne Extrazugabe eines Reduktionsmittels zum Faltungspuffer zu erzwingen. In diesem Fall werden die säurelabilen Gruppen entfernt, wenn das Peptid aus dem Harz bei saurem pH abgespalten wird. Freie Cysteine werden somit erzeugt, die wiederum als ein intramolekulares "Reduktionsmittel" dienen, um eine S-t-Butyl-Entfernung und Disulfid-Bildung zu gestatten (wie in Beispiel 6 illustriert).
Die Essenz der vorliegenden Erfindung basiert auf:

– der raschen Assemblierung von S-thio-t-butylierten Polypeptid-Ketten auf dem Polymer-Träger;
– cystein-katalysiertem Thiol-Disulfid-Austausch der Derivate in leicht-alkalischen Bedingungen, was zu cysteinilierten Polypeptiden führt, welche die makromolekular oxidierten Formen (Protein-S-S-Cystein; Polypeptid-S-S-Cystein) des klassischen Redox-Cystin/Cystein-Paars sind;
– der Konzentration der oxidierten makromolekularen Form, die während des Faltungsprozesses konstant niedrig bleibt, so dass intermolekularer Disulfid-Austausch minimiert wird; und
– einem Mangel an Aggregation falsch gepaarter Zwischenformen aufgrund der präferenziellen und raschen Ausbildung von Formen mit korrekter Cystein-Paarung (nativer Struktur).

Gemäß dem Prozess zum Falten von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung werden beispielsweise in einem ersten Schritt 10 mg S-t-Butyl-Derivat bei Raumtemperatur in 1 ml eines Puffers, pH 8,0, der 6 M Guanidinium-Chlorid, 10 mM Tris und 0,1 M Na₂HPO₄ umfasst, gelöst und die sich ergebende Lösung wird bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten gehalten. Im zweiten Schritt wird die Lösung zuerst 10-fach mit Wasser auf einen pH 7,2 verdünnt (0,6 M Guanidinium-Chlorid, 1,0 mM Tris, 10 mM Na₂HPO₄ und Endkonzentration des Polypeptid-Derivats 1 mg/ml) und dann wird ein starker molarer Überschuss an Cystein (etwa 100-fach über die Konzentration des Polypeptids oder Protein-Derivats) unter Rühren zugegeben. Die Temperatur wird graduell auf 37°C erhöht und für etwa 24 Stunden konstant gehalten, um das Auftreten des Faltens des Polypeptids zu gestatten.
Der Faltungsprozess der vorliegenden Erfindung führt zu einem hoch-homogenen Produkt und ist mit nur kleinen Modifikationen auf jegliches Polypeptid anwendbar, das durch festphasen-chemische Synthese als Cystein-Thio-t-Butyl-Derivat hergestellt wird. Zusätzlich haben die Prozesse gemäß der Erfindung eine Anzahl von anderen Vorteilen gegenüber dem vorbekannten Prozess, der Vorläufer-Polythiol-Formen einsetzt, wie etwa

– die Cystein-Reste der Kette werden während der acidolytischen Spaltung von Polypeptid-Harz nicht alkyliert;
– sowohl Überoxidation von Cystein zu Sulfonsäure als auch Oxidation, die zu intermolekularer Disulfid-Brückenbildung führt, treten nicht auf;
– das Risiko einer Derivatisierung des Trp Indol-Rings durch Mercaptoethanol, der notwendig ist, um kontaminierende Hg-Ionen zu eliminieren, die sich aus der Acm-Deblockierung mit Hg(Aco)₂ ergeben, wird vermieden. Tatsächlich modifiziert das Cystein-Thiolat in der Faltungsmischung der vorliegenden Erfindung das Trp überhaupt nicht;
– Oxidations-senstive Met, Trp und Tyr-Reste werden während des Faltens nicht modifiziert;
– die Kosten der Produktion der endgültigen gefalteten Produkte ist allgemein niedriger im Vergleich zu jenen, die Polythiol-Polypeptide und Redox-Puffer einsetzen.

Es wird für Fachleute ersichtlich sein, dass, obwohl Zielproteine allgemein in hoher Ausbeute unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, in gewissen Fällen, z. B. im Falle von komplexen Proteinen mit mehreren Disulfid-Bindungen eine gewisse Population von Zwischenformen, die sich nicht komplett zu nativer Struktur entwickelt haben (fehlgefaltete Spezies) in Lösung im Gleichgewicht bleiben können. Fehlgefaltete Spezies können leicht von korrekt gefalteten Spezies durch RP-HPLC getrennt werden und werden wieder den Faltungsbedingungen der vorliegenden Erfindung unterworfen, um die Gesamtausbeute des Prozesses zu verbessern.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Ausdruck Polypeptid auf ein Polymer von Aminosäuren, die durch Amid-Verknüpfungen miteinander verbunden sind. Der Ausdruck Protein bezieht sich auf eine Polypeptid-Spezies in ihrer dreidimensionalen Form, wie sie in Zellen und biologischen Fluiden lebender Organismen vorkommt. Proteine können beispielsweise aus einzelnen gefalteten Polypeptid-Ketten bestehen oder können komplexe Strukturen sein, die aus mehreren gefalteten Polypeptid-Ketten bestehen.
Die folgenden Beispiele und Figuren werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu illustrieren und sollen die Erfindung nicht über die Beschränkungen hinaus beschränken, die in den Ansprüchen dargestellt sind.
1 zeigt das HPLC-Profil vor S-t-Butyl-Entfernung und Faltung von hu-I-309 (Beispiel 4).
2 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des Produktes von 1.
3 zeigt das HPLC-Profil von deprotektiertem, gefaltetem hu-I-309 (Beispiel 4), was eine kürzere Rückhaltezeit demonstriert.
4 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des Produktes von 3.
5 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des in 3 gezeigten Produktes nach Behandlung mit NEM. Keine Massenänderung wird im Vergleich zu 4 beobachtet, was die Abwesenheit freier -SH-Gruppen anzeigt.
6 ist eine Vergleichsgrafik zwischen der biologischen Aktivität von rekombinantem I-309 und dem synthetischen, gefalteten I-309 der vorliegenden Erfindung. Die biologische Aktivität wurde durch Binden des Chemokins, das mit ¹²⁵I markiert war, an menschliche Lymphozyten bestimmt.
7 zeigt das analytische HPLC-Profil des Proteins von Beispiel 5 nach Faltung.
8 zeigt das präparative HPLC-Profil des gefalteten Proteins von Beispiel 5.
9 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des gereinigten Produkts von Beispiel 5, das das erwartete Molekulargewicht zeigt.
10 zeigt das HPLC-Profil des Polypeptids von Beispiel 6 vor S-t-Butyl-Entfernung und Faltung.
11 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des Polypeptids von 10 (M=H).
12 zeigt das HPLC-Profil des Proteins von Beispiel 6 nach Faltung, was eine kürzere Rückhaltezeit zeigt.
13 zeigt das Ergebnis der Massenbestimmung des Proteins von 12 (M=H), das das erwartete Molekulargewicht zeigt.
Beispiele
Beispiel 1
Synthese und Faltung von Cys^10,11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC (Thymus- und Aktivierungs-reguliertes Chemokin).
Das 71-Aminosäuren-Reste-Chemokin-Derivat wurde auf ein 433-A-Peptid-Synthetisierer (Perkin Elmer/ABI) unter Verwendung von Fmoc/t-Bu-Chemie und einem mit den säurelabilen Hydroxymethylphenoxy-Essigsäure-Linker (Wang-Harz) funktionalisiertem polystyrol-basierten Harz zusammengebaut, an das Fmoc-Ser-(t-Bu) durch DMAP (4-Dimethylaminopyridin)-katalysierte Veresterung angebracht war. Der Substitutionsgrad betrug 0,57 mmol/g. Die Synthese wurde in einem 0,27 mmol/g Maßstab unter Verwendung eines fünffachen Überschusses von Fmoc-Aminosäuren und DCI (N,N'-Diisopropylcarbodiimid)/HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) Aktivierungs-Reagenzien in DMF durchgeführt. Die Kopplungszeit betrug etwa 60 Minuten unter spektrophotometrischer Überwachung der Fmoc-Deprotektion.
Die vier Cystein-Thiole waren mit S-t-Butyl-Gruppen geschützt und es wurde ein maximales Schutzschema für alle vier Seitenketten verwendet: Ser(t-Bu), Thr(t-Bu), Tyr(t-Bu), Asp(0-t-bu), Glu(0-t-Bu), Lys(Boc), Trp(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt) und Arg(Pmc). Nach jeder Kopplung wurde eine Verkappung mit Essigsäure-Anhydrid und DIEA in DMF ausgeführt.
Das sich ergebende Polypeptid-Harz wurde bei Raumtemperatur mit einer frisch hergestellten Mischung von TFA/Wasser/TIS (Triisopropylsilan)/Phenol (78:5:12:5, v/v/v/w, 10 ml/g Harz) für 2,5 bis 3,0 Stunden behandelt. Das abgespaltene Polypeptid-Derivat wurde durch direkte Filtration der Spaltmischung in kaltem Methyl-t-Butyl-Ether (MTBE) präzipitiert und das Präzipitat durch Zentrifugation getrennt, zweimal mit Ether gewaschen und in Luft getrocknet.
Das Rohprodukt wurde dann in verdünnter Essigsäure gelöst, lyophilisiert, wieder in 50%-iger Essigsäure gelöst und auf eine Sephadex G-50-Säule (70 × 25 cm) unter Verwendung von 50%-iger Essigsäure als mobiler Phase aufgebracht. Die gesammelten Fraktionen wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert und die das gewünschte Polypeptid-Derivat (MW 8.436,9 Da) enthaltenden wurden zusammengeführt und nach Verdünnung mit Wasser lyophylisiert.
Die zusammengeführten Fraktionen wurden wieder in 50%-iger Essigsäure gelöst und weiterhin durch Beladen auf eine 250 × 10 mm halb-präparative Vydac C₄-Säule gereinigt. Proben wurden bei einer Flussrate von 3 ml/min mit einem linearen Gradienten von 20–80% B in 60 Minuten eluiert, wobei B 0,1% TFA in Acetonitril und A 0,1% TFA in Wasser waren. Die Detektion wurde bei 280 Nanometer vorgenommen und nur die das Ziel-Polypeptid enthaltenen Fraktionen wurden zusammengeführt und vor der Faltung lyophylisiert.
Das Falten des durch RP-HPLC gereinigten Chemokin-Derivates wurde ausgeführt durch zuerst Auflösen von 10 mg des Produktes in 1 mg 6 M GnHCl, 0,1 M Na₂HPO₄ und 10 mM Tris bei pH = 8,0 und Raumtemperatur. Nach 20 Minuten wurde die Lösung durch Zugabe von 10 ml Wasser auf die Endkonzentration von 0,6 M GnHCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1 mM Tris, pH = 7,2 und eine Peptid-Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Das Falten wurde durch Zugabe von Cystein bei einer Konzentration von etwa 20 mM (etwa 100-fache molarer Überschuss in Bezug auf die Peptid-Konzentration) und graduelles Steigern der Temperatur auf 37°C initiiert.
Die Faltungsreaktion, die bei der konstanten Temperatur von 37°C in Luft auftritt, wurde durch RP-HPLC-Analyse von 25 Mikroliter-Aliquots von Lösung, die mit Essigsäure säureabgeschwächt war, auf einem Waters 2690-Trennmodul überwacht, das mit einem Waters 996-Photodioden-Array-Detektor ausgerüstet war, unter Verwendung einer Vydac C₄-Analysesäule und eines 20–60% Acetonitril-Gradienten in 0,1% TFA/Wasser in 40 Minuten mit einer Flussrate von 1,0 ml/min. 1 Mikroliter jedes HPLC-Peaks (entsprechend den Faltungs-Zwischenstufen der Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen) wurde gesammelt, mit einem Mikroliter gesättigter Lösung von Sinapinsäure in 1:2 Acetonitril/1% TFA in Wasser gemischt, unter Vakuum getrocknet und durch MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert, unter Verwendung eines Voyager-DE-Spektrometers (Perseptive Biosystem, Framingham, MA), der mit einem Stickstofflaser ausgerüstet war. 78% des gefalteten Polypeptids bildeten sich nach 24 Stunden. Der Peak, dessen Molekulargewicht dem des gefalteten Produkts entsprach, wurde weiter durch Reaktion mit N-Ethylmaleimid (NEM) überprüft, um die Anwesenheit freier Thiol-Gruppen zu entdecken (+125 Da für jede SH).
Die biologische Aktivität von durch diese Methodik der vorliegenden Erfindung erhaltenes hu-TARC wurde gemäß dem Imai-Verfahren durchgeführt (T. Imai et al., J. Biol. Chem., 271, 21514, 1996).
Humane T-Zelllinien Hut 78, Hut 102 und Jurkat, wie auch frische Monozyten, Neutrophile und Lymphozyten wurden hinsichtlich ihrer Migration über ein Polycarbonat-Filter in Reaktion auf TARC untersucht. Es wurde keine chemotaktische Reaktion bei Monozyten oder Neutrophilen hervorgerufen, weder durch mit chemischer Synthese hergestelltes TARC noch durch rekombinantes TARC. Bei den T-Zelllinien Hut 78 und Hut 102 induzierten synthetisches TARC wie auch rekombinantes TARC die Migration mit einer typischen glockenförmigen Kurve mit einem Maximaleffekt bei 100 ng/ml.
Beispiel 2
Synthese und Faltung von Cys^10,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC und Cys^11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC
Die Synthese, Reinigung und Faltung von Cys^10,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC und Cys^11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC-Derivaten ist unter denselben Bedingungen durchgeführt worden die auch für Cys^10,11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC (Beispiel 1) verwendet wurden, wobei der einzige Unterschied war, dass die Trt-Protektion bei Cys¹⁰ bzw. Cys¹¹, nachfolgend der Spaltung der Polypeptid-Vorläufer aus dem Harz entfernt wurde. Die Ausbeuten an endgültigen gefalteten Chemokinen betrug 80% bzw. 79%.
Beispiel 3
Synthese und Faltung von Cys^34,50(S-Bu)-hu-TARC
Die Synthese, Reinigung und Faltung von Cys^34,50(S-Bu)-hu-TARC-Derivat wurde unter denselben Bedingungen wie bei den Derivaten von Beispiel 1 und 2 durchgeführt, außer dass sowohl Cys¹⁰ als auch Cys¹¹ durch Trt geschützt waren, das während der abschließenden Harz-Spaltung durch TFA entfernt wurde. Die Ausbeute am gefalteten Produkt betrug etwa 75%.
Beispiel 4
Synthese und Faltung von Cys^{10,11,26,34,50,68}(S-t-Bu)-I-309
Die Synthese von 6 (S-t-Bu)-geschützte Cysteine enthaltendem hu-I-309 wurde in einem 0,12 mmol-Maßstab unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines Fmoc-Lys(Boc) Wang-Harzes (Substitutionsgrad 0,61 mmol/g) durchgeführt. Das sich ergebende Polypeptid-Harz wurde wie für Beispiel 1 beschrieben behandelt und das G50-gereinigte Material wurde weiter durch Beladen auf eine 250 × 10 mm Vydac C₁₈-Säule gereinigt (wie in 1 und 2 gezeigt).
Das Falten des durch RP-HPLC gereinigten Chemokin-Derivates wurde durch Auflösen von 65 mg Produkt in 60 ml 10,6 M GuHCl, 10 mM NaHPO₄ und 1 mM Tris bei pH 8,0 und Zugabe von Cystein bei einer Konzentration von 100-fachem molarem Überschuss in Bezug auf das Peptid durchgeführt. Die Polypeptid-Lösung wurde bei 37°C für 4 Tage stehengelassen. Nach Ansäuerung mit TFA wurde das gefaltete Material durch RP-HPLC unter Verwendung einer 250 × 10 mm Vydac C₁₈-Säule (wie in 3 und 4 gezeigt) isoliert. Eine komplette Cystein-Paarung wurde durch Massenspektrometrie nach Reaktion mit N-Ethylmaleimid (NEM) überprüft. Es wurde kein Molekulargewichtsanstieg beobachtet, was die Abwesenheit freier Thiol-Gruppen anzeigt, (wie in 5 gezeigt). Die Ausbeute an endgültigem gefalteten Chemokin war fast 25%. Das synthetische gefaltete hu-I-309 zeigte eine biologische Aktivität äquivalent zum rekombinanten Protein (6).
Eine analytische Chromatographie wurde unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: C18 250 × 4,6 mm (Vydac#238TP54)
Mobile Phase: A = 100% H₂O 0,1% TFA
B = 100% CH₃CN 0,1% TFA
Gradient: B %-Zusammensetzung ist auf dem Chromatogramm angegeben
Detektor: 214 Nanometer
Beispiel 5
Synthese und Faltung von Plasmodium vivax C-terminalem Fragment
Die Synthese und Reinigung von Plasmodium vivax circumsporozoitem Protein (PvCS) 303–372, das 4 (S-t-Bu)-geschützte Cysteine enthält, wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Faltung wurde unter Zugabe von 27 mg Peptid in 2,7 ml 6 M GuHCl in 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,5 durchgeführt. Die Lösung wurde 10 Minuten lang gemischt. Dann wurden 13,5 ml 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl gepuffert bei pH 8,8 in 0,2 M Tris-Puffer zugegeben. Schließlich wurden 10,8 ml 35 mM Cystein in 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl, gepuffert bei pH 8,8 in 0,2 M Tris-Puffer, zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf 37°C gebracht. Die Faltungsreaktion wurde auf einer Umkehrphasen-HPLC bis zum Abschluss verfolgt (3–6 Stunden) (7A) und die Reaktion wurde durch Abkühlen für 5 Minuten bei 4°C, gefolgt von der Zugabe von 10% TFA bei 4°C beendet, um eine Endkonzentration von 1% TFA (3 ml 10% TFA) zu erreichen. Das Produkt wurde nachfolgend durch Umkehrphasen-HPLC (8) gereinigt und die Masse des Endproduktes bestimmt (9). Die Ausbeute des oxidierten Endproduktes betrug 70–80%.
Es wurde eine analytische Chromatographie unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: C4 250 × 4,6 mm (Vydac#214TP54)
Mobile Phase: A = 100% H₂O 0,1% TFA
B = 100% CH₃CN 0,1% TFA
Gradient: B %-Zusammensetzung ist auf dem Chromatogramm angegeben
Detektor: 214 Nanometer
Beispiel 6
Synthese im Groß-Maßstab und Faltung von Plasmodium falciparum C-terminalem Fragment
Eine Groß-Maßstabs-Synthese und Reinigung von Plasmodium falciparum circumsporozoitem Protein (PfCS 282–383), das nur 2 (S-t-Bu)-geschützte Cysteine von 4 enthielt, wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt (wie in den 10 und 11 gezeigt) außer wie nachfolgend.
Die Faltung wurde durch Auflösen von 1,1 g partiell gereinigten Peptid in 1,0 L 0,1 M CH₃COONH₄, pH 8,0 ohne Zugabe freien Cysteins zum Faltungspuffer durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde bei 32°C über 18 Stunden gehalten. Das Produkt wurde dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (12 und 13). Die Ausbeute an oxidiertem Endprodukt betrug fast 37%.
Es wurde eine analytische Chromatographie unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: C18 250 × 4,6 mm (Vydac#238TP54)
Mobile Phase: A = 100% H₂O 0,1% TFA
B = 100% CH₃CN 0,1% TFA
Gradient: B %-Zusammensetzung ist auf dem Chromatogramm angegeben
Detektor: 214 Nanometer

Claims

Verfahren zum Falten chemisch synthetisierter Polypeptide, umfassend: Behandeln eines Polypeptids und/oder Proteins, welches zwei oder mehr S-ter-butyl-thio-Cystein-Reste umfasst, mit einem Reduktionsmittel in einem faltenden Puffer, welcher einen pH zwischen 7 und 9 aufweist, bei einer Temperatur zwischen 25°C und 40°C.
Verfahren zum Präparieren biologisch aktiver Proteine, umfassend: (a) chemisches Synthetisieren eines Polypeptids, welches zwei oder mehr S-terbutyl-thio-Cystein-Reste umfasst; (b) Behandeln dieses Polypeptids mit einem Reduktionsmittel in einem faltenden Puffer, welcher einen pH zwischen 7 und 9 aufweist, bei einer Temperatur zwischen 25°C und 40°C; und (c) Reinigen der erhaltenen gefalteten Polypeptide und/oder Proteine.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel Cystein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel ein intramolekulares Reduktionsmittel ist, welches aus freien Cysteinen in den Polypeptid-Ketten gebildet wird, welche bei Abtrennen der Polypeptid-Kette von dem Harz in saurem pH aus mit Säure-labilen Gruppen geschützten Cysteinen an ausgewählten Positionen der Polypeptid-Kette erzeugt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der faltende Puffer ein oder mehrere chaotropische Salze umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die chaotropischen Salze aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Guanidin-Chlorid und Harnstoff besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die chaotropischen Salze in dem faltenden Puffer in einer Konzentration von 0,1–1 M vorhanden sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der pH zwischen 7 und 8,5 liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Temperatur zwischen 27°C und 38°C liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Temperatur ungefähr 37°C beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, umfassend die Schritte: (a) Aufbauen von S-t-butyl-thio-Cystein-Polypeptid auf einem unlöslichen Polymer-Träger mittels schrittweiser Ketten-Verlängerung; (b) Abtrennen der S-t-butyl-thio-Cystein-Polypeptid-Kette von dem Träger mittels Acidolyse; (c) Reinigen des erhaltenen S-t-butyl-thio-Cystein-Polypeptids; (d) Falten des gereinigten S-t-butyl-thio-Cystein-Polypeptids durch Behandeln der Polypeptid-Derivate mit einem molaren Überschuss von Cystein in einem faltenden Puffer, welcher ein chaotropisches Salz umfasst, und einen alkalischen pH und eine Temperatur von ungefähr 37°C aufweist; (e) Reinigen der erhaltenen gefalteten Proteine mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie in inverser Phase.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das chaotropische Salz Guanidin-Chlorid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei der Polymer-Träger ein Polyamid oder Polystyren-basierter Harz ist, welcher mit dem Säure-labilen Hydroxymethyl-Phenoxyessigsäure-Verbinder/Linker funktionalisiert ist.