WO2008077621A1 - Verfahren zur ausbildung von disulfidbrücken - Google Patents

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alkyl
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Karsten Knorr
Marco Emgenbroich
Carsten BÜNGENER
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Definitions

  • disulfide bridges are known in the art. For example, in a standard method of cyclizing peptides by forming intramolecular disulfide bridges, it is known to use K 3 [Fe (CN) e] as the oxidant. This reagent ensures clean cyclization products at high yields; Side reactions are avoided. In addition, cyclizations due to the influence of oxygen or iodine are still known. However, these methods have the disadvantage that they are either too slow or result in a large number of unwanted by-products.
  • Another known method for the cyclization of peptides is the use of immobilized Ellmann's reagent (5,5; -dithiobis (2-nitrobenzoic acid)) as the oxidant.
  • This method allows the complete oxidation of, for example, a linear peptide; Impurities caused by the reagent are avoided.
  • This approach has recently been extended to cross-linked ethoxylate-acrylate-resin (CLEAR) supports. These are compatible with both organic and aqueous solvent mixtures.
  • disulfide bridges are not only important for the peptide and protein chemistry, but also plays an important role in the cosmetic and therapeutic area, as well as the structure of keratin-containing structures such as skin, nails and hair by disulfide bridges Proteins are determined or influenced.
  • the outer skin is basically divided into 3 main layers: epidermis, dermis (dermis or corium) and subcutis (subcutis).
  • the epidermis or "epidermis” is one of the epithelial tissues, it is a multi-layered keratinizing squamous epithelium, which is usually between 0.03 to 0.05 millimeters, on the palms and soles but up to several millimeters thick. As the outermost layer of skin, it forms the actual protective cover against the environment. It is multi-layered and consists to 90 percent of keratinocytes, the actual epidermal cells, which are held together by so-called desmosomes. In the uppermost layers, the epidermis consists of keratinized squamous epithelial cells.
  • stratum corneum There are five different layers: the stratum corneum, the stratum lucidum, the stratum granulosum, the stratum spinosum, and the basal stratum.
  • stratum corneum the stratum corneum
  • stratum lucidum the stratum granulosum
  • stratum spinosum the stratum spinosum
  • basal stratum A typical property of the epidermis is its mechanosensitivity, e.g. due to the formation of calluses on hands and feet as a result of increased strain becomes visible.
  • Keratinocyte is the predominant (over 90 percent) cell type in the epidermis (epidermis). This cell type produces keratin and differentiates as it passes from the bottom layer of the epidermis to the top layers (ie, facing the outside world). In the so-called basal cell layer, proliferating cells are located directly on the basal membrane, providing a constant supply of new keratinocytes.
  • Keratin is a structural protein responsible for the stability and shape of the cells. Certain subgroups of this protein (the so-called trichocytic keratins) are also a major component of hair and nails.
  • the strength of these keratins is enhanced by fiber formation.
  • Next to the Structure-forming keratin is also included in keratin matrix as part of keratinization of squamous epithelium (epidermis) and in the development of keratin-based skin appendages (hair, nails), many other cellular molecules of the initially differentiating, later dying keratinocytes.
  • filaggrin An important protein is the so-called filaggrin, which is responsible for the cross-linking. While keratinocytes perish and produce large amounts of these proteins, massive cross-linking occurs in the upper layers of the skin (stratum lucidum and stratum corneum). A key chemical reaction that significantly affects the ultimate strength of the resulting keratin image is the closure of disulfide bridges between the sulfhydryl-rich proteins of the keratin matrix.
  • This covalent crosslinking via disulfide bridges imparts particular strength to the keratin formation.
  • Keratines in the ears, hair or nails are less pliable than the soft keratins from the skin.
  • ⁇ -keratins such as rhinoceros horns
  • up to 18% of the amino acids are involved in cross-linking via disulfide bridges.
  • the hair is also strongly keratinhaltig.
  • the hair can be roughly divided into three layers, cuticle, codex and medulla.
  • the outermost layer consists of flat, overlapping cells that are oriented similar to a pine cone to the tip of the hair. It consists of six to ten such cell layers.
  • the dandruff layer indicates the health of the hair. In healthy hair, the cuticle layer lies flat, resulting in a smooth, translucent surface. The light is optimally reflected and thus gives the healthy shine of the hair. Alkaline environment opens the scales, acidic environment closes them. The dandruff layer may be severely strained by cosmetic treatments such as dying or perming; The hair then becomes dull and brittle.
  • the cortex (“bark”), fiber layer or fiber trunk accounts for about 80% of the hair content, where all the relevant chemical processes that occur, for example, in cosmetic treatments take place.
  • the cortex consists of fiber bundles that consist of a large number of very fine keratin fibers
  • the connection between the two cells is made by the cell membrane complex, which can be thought of as a kind of cementitious substance, and the tear strength and elasticity of the hair are due to this cementation.
  • the medulla Inside the hair is the medulla (Hair medulla). It consists of cell walls, degradation products of cortex cells and fats.
  • the disulfide bridges in keratin described above are exploited in particular in cosmetic applications in order to deform keratin-containing structures, in particular hair.
  • the hair is usually first treated with a deforming agent based on a keratin-reducing compound, which causes an opening of the disulfide bridges of the hair keratin.
  • a deforming agent based on a keratin-reducing compound, which causes an opening of the disulfide bridges of the hair keratin.
  • Keratinreducing mercapto compounds such as, for example, salts or esters of mercaptocarboxylic acids, are generally used as shaping agents.
  • the hair is then brought into the desired shape, eg. By winding on curlers or smoothing the hair.
  • a second chemical modification is made, which is primarily to re-form disulfide bonds from the SH groups by oxidation. Due to the deformation imposed on the hair, the new bonds are formed elsewhere than the original bonds. This causes the strands of hair to be fixed in the imposed new shape and thus a permanent deformation is achieved.
  • Hydrogen peroxide is often used for the oxidation step to form new disulfide bridges.
  • hydrogen peroxide has the disadvantage that it attacks the hair and thus strained.
  • the present invention is therefore based on the object to provide an alternative method for generating disulfide bridges. It is another object of the present invention to provide an improved process for treating keratin-containing structures to form disulfide bridges.
  • This object is achieved by a method for forming disulfide bridges, which is characterized in that the reaction is carried out in a liquid or pasty mixture containing at least one heterocyclic compound having at least one nitrogen atom in the ring.
  • heterocyclic compounds are preferably added in catalytic amounts and remain unchanged during the reaction. You can also if necessary be removed after the reaction.
  • heterocyclic compounds are suitable, which are described in more detail below.
  • metal compounds such as metal ions or metal ion-containing or releasing compounds, such as metal salts or metal complexes can be used.
  • claim 1 relates to a process for forming disulfide bridges, characterized in that the reaction is carried out in a medium containing at least one compound which promotes the formation of disulfide bridges, said compound being selected from the group consisting of:
  • Hydroxy group is the heterocycle unsaturated
  • - is hydrogen, an optionally substituted alkyl radical, an optionally substituted aryl radical or a saturated or unsaturated Heterocyclyl having 3 to 10 ring members and 1 to 3 heteroatoms, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl is unsubstituted or monosubstituted or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl with 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4 carbon atoms and / or
  • the above-defined heterocyclic compounds promote the formation of disulfide bridges and thus can act as a kind of catalyst in the reaction. Their effect is further enhanced by adding at least one metal compound according to the invention. It is therefore advantageous to add these compounds to the reaction mixture in order to promote the formation of disulfide bridges in the case of different SH group-carrying substances, in particular peptides and proteins, and keratin-containing structures.
  • the at least one metal compound may be a metal ion-containing or releasing compound. It is preferably selected from the group of metal salts, metal salt complexes and soluble metal compounds.
  • Metal compounds to be used according to the invention are therefore preferably ions or such releasing compounds or ionic complexes of metals. Even high-affinity chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetate (EDTA), do not hinder the reinforcing properties of the metal-containing additives according to the invention and can be used as auxiliaries.
  • Particularly suitable metals are transition metals, such as iron, cobalt, nickel, copper, zinc, manganese, chromium or silver; Alkaline earth metals, such as, for example, calcium or magnesium or else main group metals, such as, for example, aluminum.
  • the ions of other transition metals also show a reinforcing effect.
  • the salts of copper, chromium, manganese, cobalt, nickel, zinc, magnesium and calcium are particularly suitable.
  • the metal compound can be selected from the group of copper (II) salts, chromium (III) salts, manganese (II) salts, cobalt (II) salts, nickel (II) salts, zinc (II) salts, magnesium (II) salts, calcium (II) salts and iron (II) and iron (III) salts.
  • the metal compounds to be used according to the invention show an advantageous effect on the oxidation reaction even in small amounts.
  • the additive is used in an amount of at least 1 ⁇ M, at least 2 ⁇ M and more preferably in an amount of at least 3 ⁇ M and more preferably in an amount of at least 10 ⁇ M.
  • significantly higher amounts are used, but it has been shown that from a certain amount of metal-containing additive, the reaction can not be further accelerated by increasing the concentration.
  • the concentration optimum may vary depending on the metal-containing substance and the substance to be oxidized. It is therefore advisable to determine the optimum experimentally.
  • the metal-containing additive shows an accelerating effect even in small amounts and in the presence of high-affinity complexing agents is particularly advantageous in the treatment of keratin-containing structures. This, since it is known from cosmetic treatments that, for example, copper and iron in larger quantities can cause discoloration of keratin-containing structures (in particular of the hair), which should be avoided.
  • the compound according to alternative (a) has the following basic structure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R1 to R6 and may accordingly have one or more double bonds;
  • V, W, X, Y and Z are either carbon atoms or nitrogen atoms, the heterocycle having a total of not more than three, preferably two, nitrogen atoms;
  • R6 represents hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, or R6 together with R5 represents a five- or six-membered ring, which may also have heteroatoms and optionally carries further substituents, or R6 is missing.
  • substituents R 2 to R 6 may be absent if a nitrogen atom having a double bond is present at the linking position in the ring (see, for example, the compounds 2,6-dihydroxypyridine hydrochloride; uracil-6-carboxylic acid, 4,6 -Dihydroxypyrimidin).
  • Oxo group in the context of the invention means that the respective substituent forms an oxo group with the ring atom and, correspondingly, an oxygen atom is bonded to the ring via a double bond:
  • the heterocycle is unsaturated in the case of the presence of hydroxy groups.
  • Tautomers are structural isomers that differ only in the position of a group (eg, hydrogen) and in the position of a double bond.
  • a group eg, hydrogen
  • oxo group 0
  • the aromatically present compounds such as the 2,6-dihydroxy-pyridine hydrochloride can tautomerize. This is especially true for the enol forms, which may preferentially tautomerize toward the keto form.
  • Tautomeric (isomeric) forms of the substances shown are therefore included according to the invention.
  • the six-membered heterocycle has two nitrogen atoms which may be positioned differently.
  • active compounds of this structure are uracil-6-carboxylic acid, 2,4-dihydroxy-6-methylpyrimidine, 2,4-dimethyl-6-hydroxypyrimidine, 2-isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-dihydroxy 2-methylpyrimidine, 4,6-dihydroxypyrimidine, 1, 2-dihydro-3,6-pyridazinedione:
  • the compound has the following substructure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R2, R3, R4 and R6 and may accordingly have one or more double bonds; in which
  • R2 and R3 each independently of one another represent hydrogen, an optionally substituted alkyl or aryl radical, an optionally substituted radical - (CH 2 ) n COOX where n is 0 to 10 and X is hydrogen or alkyl, an electron-withdrawing substituent, a functional group in particular a hydroxy group, an oxo group (OO) according to the invention, -CONH 2 or an oxime (NN-OH) or R 2 together with R 3 represents a five- or six-membered ring which may likewise have heteroatoms and optionally carries further substituents, or R2 and / or R3 are missing; - R4 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R4 is absent;
  • R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R6 is missing.
  • Active examples of this embodiment are, for example, barbituric acid, alloxan monohydrate and violuric acid
  • R4 and R6 are independently hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, preferably hydrogen or a branched or unbranched C1 to C10 alkyl radical, particularly preferably a C1 to C4 alkyl radical or hydrogen.
  • the compound which promotes the formation of disulfide bonds is purine derivatives whose skeleton corresponds to the following general formula
  • R4 and R6, are hydrogen, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; preferably hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 10 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or C O-aryl radical; particularly preferably hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 -aryl radical; in particular hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 alkyl radical;
  • the cyclic compound can thus be based on a purestan skeleton.
  • the purine skeleton can be regarded as a condensed ring system composed of the two heterocycles pyrimidine and imidazole. Its systematic IUPAC name is 7H-imidazole [4,5-d] pyrimidine.
  • the 7H-purine is in a tautomeric equilibrium with its isomer, the 9H-purine, and compounds which are based on both tautomeric forms are also included in the context of the present invention:
  • At least one radical R4, R6, R7 and R9 is an alkyl group and at least one, preferably two of the radicals R4, R6, R7 and R9 represent hydrogen or a C 1 to C 3 alkyl group, preferably methyl.
  • heterocyclic compounds based on purine are 3-methylxanthine, theobromine, theophylline, caffeine, isocaffeine, xanthine, theophylline-7-acetic acid, theophylline-8-butyric acid and 3-isobutyl-1-methylxanthine:
  • R2 and R3 together form an optionally substituted six-membered ring optionally having at least one heteroatom.
  • This embodiment is preferably compounds in which an aromatic has been fused to the basic heterocycle. This prefers a bridge of two carbon atoms. Examples in which a 5-membered ring has been condensed (for example imidazole) have already been explained above (compounds based on the purine skeleton). Further examples of fused ring structures are pyrazine and quinoxaline.
  • the compound has the following basic structure:
  • rings may be unsaturated depending on the choice of the substituents and may carry one or more double bonds, and accordingly
  • R4 and R6, each independently of the other, are or are absent for hydrogen, an optionally substituted alkyl radical or an optionally substituted aryl radical; preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 - to do-alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or C 10 -
  • Aryl radical particularly preferably represents hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical or a given if substituted C 6 aryl radical; in particular hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 alkyl radical;
  • R10 and R13 are hydrogen, an optionally substituted alkyl radical or an optionally substituted aryl radical, or R10 and / or R13 are absent; are preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C r to Cio-alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or Ci O -aryl radical; particularly preferably represents hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 aryl group; in particular hydrogen or a Ci to C 6 alkyl radical substituted by at least one hydroxyl group;
  • R 2, R 3, R 4 and R 5 may furthermore be, independently of one another, hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 - to C 10 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or C 10 -
  • aryl preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 - to C 6 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 -aryl radical; in particular hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 -alkyl radical, in particular methyl radical.
  • R 6 is preferably hydrogen or an alkyl radical, C 1 to C 8 , preferably C 1 to C 4 , particularly preferably hydrogen or a methyl group.
  • Electron-withdrawing groups or atoms which may also be used herein as substituents on the heterocycle (see above), are, for example, electron-withdrawing groups or atoms which as substituents lower the electron density on a corresponding aromatic heterocyclic ring (also referred to as deactivating groups). Electron-withdrawing groups have an (-) - M and / or a (-) - I effect.
  • the resonance effect (M effect, mesomeric effect) generally only works when the group is directly attached to the unsaturated heterocyclic system. It acts via ⁇ -electrons, in contrast to the field effect (I-effect, inductive effect), which acts through space, through solvation molecules or preferably via ⁇ bonds of a system.
  • An electron-withdrawing effect can be either inductive (i.e., by the so-called (-) I effect) and / or mesomerically (i.e., by the so-called (-) - M effect).
  • the classification of aromatic substituents in substituents with (+) - l and (-) - l effect and with (+) - M effect and (-) - M effect is known in the art per se. For further details, reference is made to Beyer / Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23rd revised and updated edition, pages 515 to 518, the disclosure of which is included in the present invention.
  • the terms" electron-withdrawing group "and” functional group can be used.
  • Corresponding groups are examples of useful substituents.
  • the compound according to alternative (b) has a substituent A which
  • heterocyclyl is hydrogen, an optionally substituted C 1 - to do-alkyl radical, an optionally substituted C 6 - or Cio-aryl radical or a saturated or unsaturated heterocyclyl having 3 to 10 ring members and 1 heteroatom, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl is unsubstituted or mono- or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4
  • Carbon atoms and / or mercapto preferably represents hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical, an optionally substituted C 6 -aryl radical or saturated heterocyclyl having 5 or 6 ring members and 1 heteroatom, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl is unsubstituted or monosubstituted or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4 carbon atoms and / or mercapto; in particular hydrogen, an optionally substituted C 1 to C 3
  • heterocyclic compounds described above can be used both in pure form and as mixtures of various possible isomeric forms, in particular of stereoisomers, such as E and Z, threo and erythro, and optical isomers, such as R and S isomers or atropisomers and of tautomers.
  • the invention includes both the pure isomers and their mixtures.
  • the heterocyclic compounds have acidic or basic properties and can form salts, optionally also internal salts. If the compounds of the formula (I) bear hydroxy, carboxy or other groups which induce acidic properties, these compounds can be reacted with bases to form salts.
  • bases are, for example, hydroxides, carbonates, bicarbonates of the alkali and alkaline earth metals, in particular those of sodium, potassium, magnesium and calcium, furthermore ammonia, primary, secondary and tertiary amines with (C 1 -C 4 ) -alkyl radicals and also mono-, Di- and trialkanolamines of (CrC 4 ) -alkanols.
  • acids are, for example, mineral acids, such as hydrochloric, sulfuric and phosphoric acids, organic acids, such as acetic acid or oxalic acid, and acidic salts, such as NaHSO 4 and KHSO 4 .
  • mineral acids such as hydrochloric, sulfuric and phosphoric acids
  • organic acids such as acetic acid or oxalic acid
  • acidic salts such as NaHSO 4 and KHSO 4 .
  • heterocyclic compounds which can be used according to the invention for promoting the formation of the disulfide bridges can also be described as follows:
  • radicals R 1 ', R 2 ' and R 3 ' are either the same or different; However, at least one of the radicals represents an alkyl group. It is understood that tautomers, in which Among other things, the double bond migrates, also be captured by the above formula. Corresponding structural isomers are therefore also encompassed by this formula. As has been stated, these compounds are particularly suitable for promoting the formation of disulfide bridges in amino acid-containing substances, in particular in peptides and proteins.
  • At least one, preferably two of the radicals R 1 ', R 2 ' and R 3 ' which are either identical or different, preferably represents either hydrogen or a C 1 to C 5 alkyl group.
  • the radicals may include a functional group.
  • residues R 4 '(on the nitrogen) and R 5 ' are present at the remaining positions on the heterocyclic 5-membered ring (especially in the tautomeric forms).
  • These are customizable, preferably organic radicals. According to one embodiment, they are functional groups which allow the attachment of the substance to, for example, a carrier. This variant will be described in detail below.
  • heterocyclic compounds to be used according to the invention are N-methyl-2-pyridone, 2,6-dihydroxypyridine
  • peptides and proteins in particular peptides having an amino acid length between 5 and 100, preferably 10 and 50, more preferably between 15 to 40 amino acids in water even at higher peptide concentration at room temperature according to the invention according to the process can be cyclized by formation of intramolecular disulfide bridges.
  • the method is therefore particularly suitable for the formation of intramolecular disulfide bridges and therefore in particular for the cyclization of peptides.
  • polypeptides and proteins can be cyclized with the appropriate method.
  • disulfide bridges with differently structured substances carrying SH groups.
  • disulfide bridges for example, in a cyclization, takes place due to the addition of the heterocyclic compound of the invention such as caffeine or a caffeine-like substance (see above formulas) in some peptides almost quantitatively. However, this is not mandatory. Surprisingly, it is not necessary (but possible) to add an oxidizing agent to accelerate the reaction, since the atmospheric oxygen is sufficient in the presence of the above-characterized substance to form disulfide bridges.
  • the reaction rate may increase in the course of the reaction.
  • the positive influence of the inventive addition of the above-characterized substance is surprising in that it is mostly - in contrast to the substances used in the prior art DMSO or iodine - not oxidizing agent.
  • the atmospheric oxygen is sufficient for the oxidation, wherein the reaction rate increases in an advantageous manner due to the addition of the heterocyclic compound according to the invention.
  • Increasing the reaction rate might also suggest an autocatalytic mechanism, possibly through the cyclized product.
  • the process according to the invention can advantageously be carried out at room temperature.
  • the apparently autocatalytic course of the reaction occurs both in unbuffered and in buffered solutions (for example phosphate buffer, pH 6 - 9).
  • buffered solutions for example phosphate buffer, pH 6 - 9
  • the amount of substance added to the reaction mixture to promote the formation of the particular intramolecular disulfide bridges will vary depending on the compound and the substance to which disulfide bridges are to be formed. As a rule, small catalytic amounts are sufficient.
  • the amount to be employed is preferably at least about 0.0001 mg / ml, more preferably in a range of about 0.0001, 0.001 or 0.01 to 20 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 15 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 10 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 5 mg / ml, preferably 0.001 or 0.01 to 1 mg / ml, and more preferably in a range of 0.03 to 0.5 mg / ml.
  • the amounts vary depending on the selected substance (eg caffeine or caffeine-like substance) and the peptide or protein to be treated and should therefore be individually optimized in each case.
  • a particularly suitable concentration range for peptides with a length of about 15 to 25 amino acids is 0.05 to 0.3 mg / ml, more preferably 0.075 to 0.15 mg / ml.
  • the amounts vary depending on the peptide and can also be significantly higher; the amounts should therefore preferably be optimized for the particular peptide.
  • the reaction rate can be further accelerated if an additional oxidizing agent is added to the reaction mixture.
  • an additional oxidizing agent for example, glutathione in oxidized form (GSSG) may be mentioned.
  • a disulfide bridge is formed in a peptide or protein between two cysteines.
  • the disulfide bridge can also be formed between other natural and non-natural amino acids, provided that they have corresponding groups which are suitable for forming a disulfide bridge (-SS-).
  • Thiolysin, homocysteine and other cysteine derivatives are to be mentioned as examples of suitable amino acids in addition to cysteine.
  • the term disulfide bridge however, is not to be equated with the term cysteine bridge, but includes the formation of corresponding -SS bonds between any natural or non-natural SH-containing amino acids or other SH-containing compounds.
  • the method according to the invention can therefore also disulfide bridges in other SH-containing compounds, in particular polymers, train.
  • a plurality of disulfide bridges can also be formed with the method according to the invention.
  • the present process can be used particularly advantageously for the cyclization of EPO-mimetic peptides (see, for example, WO 96/40479).
  • Novel EPO mimetic peptides are described in PCT / EP2005 / 012075 (WO 2006/050959), the disclosure content of which with respect to the peptides is hereby made the subject of this application in its entirety.
  • these novel EPO mimetic peptides have no proline in position 10 of the EPO mimetic consensus motif (for numbering, see Johnson et al., 1997). Rather, the proline is replaced by a non-conservative amino acid, in particular a basic amino acid, in particular lysine.
  • EPO mimetic peptides show a particularly good activity in cyclized form.
  • two peptide monomers (the monomers correspond to binding domains) are each cyclized with an EPO mimetic consensus and linked to a dimer, since binding to the EPO receptor is most effective in this form.
  • the EPO mimetic monomers have an average of 10 to 25 amino acids.
  • they are synthesized as continuous dimers (bivalent peptides) to avoid separate dimerization steps.
  • Cyclization by the process according to the invention has some decisive advantages over the processes known in the prior art. Thus, better yields and greater purity of the product are achieved than with the method known in the art.
  • Another decisive advantage of the method according to the invention is the simple separability of the cyclization reagent according to the invention from the reaction product by a simple HPLC.
  • the heterocyclic compound eg caffeine
  • caffeine can be separated off by liquid-liquid extraction.
  • caffeine can be separated from an aqueous peptide solution by repeated extraction with dichloromethane.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the reaction time can be reduced to less than eight hours (for example by lowering the pH, choosing an additional oxidizing agent).
  • H-CYIQNCPLG-OH which is also cyclized by formation of an intramolecular cysteine bridge.
  • the intramolecular disulfide bridge is preferably formed between two amino acids. These may be natural or non-natural, the only requirement is the ability to form a disulfide bridge by reacting the SH group. Cysteine is probably the best known disulfide bridge-forming amino acid, which is also used in nature predominantly for the formation of disulfide bridges. Disulfide bridges occur in nature especially in the formation of intra- and intermolecular disulfide bridges. Thus, for example, they effect the cohesion between the individual polypeptide chains of proteins (for example insulin) in the form of intermolecular disulfide bridges and regularly stabilize the conformation within a protein by forming intramolecular disulfide bridges. The proteins are to be seen here only as a special case of SH-functionalized polymers. Synthetic fibers having SH functions can also be treated with the substances of the invention and e.g. be stabilized.
  • the keratin of wool and hair contains, for example, more than 10% cysteine, which is why there are also many disulfide bridges. If these disulfide bridges are broken up (for example, by lyes, light, heating, etc.), the tensile strength of the fibers decreases sharply.
  • the method according to the invention can therefore also be used to form disulfide bridges in fibers (natural and synthetic fibers). The same applies to the Treatment of hair, in which disulfide bridges are also of great importance for structural strength.
  • the method according to the invention can therefore also be used to form disulfide bridges in hair, which also opens up a field of cosmetic application (for example shampoos, reagents for forming perms, etc.).
  • the method according to the invention can be used, for example, as means for closing the disulfide bridges in the context of a permanent wave treatment.
  • a particularly suitable oxidizing agent is oxidized glutathione (GSSG). The resulting improvement in the closure of disulfide bridges in both quantitative and temporal terms is clearly described in the experimental examples.
  • the present invention also relates to the use of the previously described heterocyclic compounds in cosmetic compositions.
  • these cosmetic compositions can be promoted according to the formation of disulfide bridges, for example, hair or nails.
  • the cosmetic preparations may contain, in addition to the previously described heterocyclic compound, suitable solvents and in such
  • Formulations contain usual additives. Emulsifiers and co-emulsifiers, surfactants, oil bodies, preservatives, perfume oils, and cosmetic substances are examples.
  • Care and active ingredients such as AHA acids, fruit acids, ceramides, phytantriol, collagen,
  • Vitamins and pro-vitamins for example vitamins A, E and C, retinol, bisabolol, panthenol, natural and synthetic sunscreens, natural products, opacifiers,
  • Micropigments such as titanium oxide or zinc oxide, superfatting agents, pearlescent waxes,
  • Bodying agents thickeners, solubilizers, complexing agents, fats, waxes,
  • Silicone compounds hydrotropes, dyes, stabilizers, pH regulators,
  • Reflectors proteins and protein hydrolysates, protein hydrolysates, salts, gelling agents, bodying agents, silicones, humectants, moisturizers and other common additives.
  • polymers can be contained to adjust the respective desired properties.
  • UV light stabilizers may also be present in the cosmetic preparations.
  • Hair cosmetic preparations comprise, in particular, styling agents and / or conditioners in hair cosmetic preparations, such as hair treatments, hair mousses, hair gels, hair sprays, hair lotions, hair conditioners, hair shampoos, hair emulsions, perms, permanent waving preparations, hair dyeing and bleaching agents, setting lotions or similar products.
  • the hair cosmetic preparations can be applied as (Erosol) spray, (Erosol) foam, gel, gel spray, cream, lotion, milk or wax.
  • the agent is a product for the hair selected from shampoos and hair products which are rinsed or not rinsed and applied before, during or after shampooing, coloring, decoloring, perming or wrinkling ,
  • a method for the treatment of hair is provided, which is characterized in that the hair with the cosmetic agent, containing at least one of the previously explained in more detail heterocyclic compound are brought into contact and optionally rinsed with water.
  • the heterocyclic compound is preferably selected from the compounds and classes of compounds detailed above.
  • the present invention also provides a process for forming disulfide bridges in keratin-containing structures, in which the keratin-containing structure is treated with at least one compound which promotes the formation of disulfide bridges, this compound being selected from the group consisting of:
  • Oxo group ( 0), wherein in the case of the presence of a hydroxy group, the heterocycle is unsaturated;
  • - is hydrogen, an optionally substituted alkyl radical, an optionally substituted aryl radical or a saturated or unsaturated heterocyclyl having 3 to 10 ring members and 1 to 3 heteroatoms, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl unsubstituted or mono- or polysubstituted is halogen, alkyl of 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl of 3 to 6
  • Suitable heterocyclic compounds are described above and are also useful with the method of treating keratin-containing structures. We therefore refer to our comments in this regard. In addition, already low enough
  • the keratin-containing structures may be, for example, fibers, such as, for example, hair, or the skin or nails. Furthermore, one of those described above
  • Metal compounds are used to further accelerate the reaction.
  • the method for the deformation of keratin-containing structures, in particular hair is used, it is advantageous if, in a first step, first the existing disulfide bridges are at least partially opened and the hair is then brought into the desired shape.
  • Suitable substances for opening the disulfide bridges are known to the person skilled in the art and are also described above in connection with the prior art.
  • keratin-reducing mercapto compounds such as, for example, salts or esters of mercaptocarboxylic acids can be used.
  • new disulfide bridges are then knotted by the process of the invention.
  • heterocyclic compounds to be used according to the invention are gentler than the conventionally used oxidizing agents, such as, for example, hydrogen peroxide.
  • oxidizing agents such as, for example, hydrogen peroxide.
  • one Embodiment has the following basic structure of the heterocyclic compound which promotes formation of disulfide bridges:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R1 to R6 and may accordingly have one or more double bonds;
  • V, W, X, Y and Z are either carbon atoms or nitrogen atoms, the heterocycle having a total of not more than three, preferably two, nitrogen atoms;
  • R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, or R6 is absent.
  • the heterocyclic compound preferably has the following substructure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R2, R3, R4 and R6 and may accordingly have one or more double bonds; in which
  • - R4 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or
  • Aryl radical or R4 is absent
  • R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R6 is missing.
  • the method can also be used to form disulfide bridges of synthetic substances which have only functional groups bearing SH groups, but are not constructed from amino acids, for example (but for example from an organic polymer).
  • the separation of the substance promoting the formation of disulfide bridges is considerably facilitated.
  • a carrier is loaded with the disulfide bridge promoting substance.
  • the carrier may, for example, be a (hydrophilic) resin.
  • the binding of the substance to the carrier has the consequence that the separation of the supported substance, for example.
  • Both derivatives promote the formation of disulfide bridges and thus the cyclization of peptides in solution.
  • an immobilized reagent capable of accelerating the closure of disulfide bridges is obtained.
  • the reagent can be removed by simple filtration from the reaction solution.
  • R 1 'to R 3 ' radicals as here in the case of 8- (3-Carbo xypropyl) -1
  • 3-dimethylxanthine for example, a functional group as R 5 'for coupling to the carrier, attach.
  • heterocyclic substances to be used according to the invention are particularly suitable for the cyclization of peptides, in particular EPO mimetic peptides, by forming intramolecular disulfide bridges.
  • Such disulfide bridges are formed between SH-containing groups.
  • natural and non-natural amino acids which have free SH groups are suitable disulfide bridge formers.
  • the compounds of the above formula can be used, for example, to treat SH group-containing substances and materials to promote the formation of disulfide bridges.
  • the substances can be used, for example, for the treatment of hair or fibers (natural and synthetic fibers). This applies in particular to cysteine-containing fibers.
  • the heterocyclic compounds to be used according to the invention can also be used, for example, in liquid formulations (for example in the form of rinses or shampoos or other agents for the treatment of hair such as, for example, perming agents).
  • Corresponding compositions comprising at least one heterocyclic compound according to the invention are therefore also encompassed by the invention.
  • the heterocyclic disulfide bond promoting compound has the following basic structure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R1 to R6 and may accordingly have one or more double bonds;
  • V, W, X, Y and Z are either carbon atoms or nitrogen atoms, the heterocycle having a total of not more than three, preferably two, nitrogen atoms;
  • R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, or R6 is absent.
  • the heterocyclic compound has the following substructure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R2, R3, R4 and R6 and may accordingly have one or more double bonds; in which
  • R 2 and R 3 each independently of one another represent hydrogen, an optionally substituted alkyl or aryl radical, an optionally substituted radical - (CH 2 J n COOX with n being 0-10 and X is hydrogen or alkyl, an electron-withdrawing substituent, a functional group in particular a hydroxy group, an oxo group (OO) according to the invention, -CONH 2 or an oxime (NN-OH), or R 2 and / or R 3 are absent;
  • - R4 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R4 is absent; - R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R6 is missing.
  • the invention further relates to the use of the above-described heterocyclic compounds or compositions containing these heterogeneous compounds for the formation of disulfide bridges, in particular of intra- or intermolecular disulfide bridges in peptides and proteins as well as keratin-containing structures. These compounds are preferably used in combination with a metal compound according to the invention.
  • a corresponding composition comprising at least one heterocyclic compound according to the invention, which promotes the formation of disulfide bridges, and preferably a metal compound according to the invention.
  • composition according to the invention is used according to one embodiment as a cosmetic and / or therapeutic composition for the treatment of keratin-containing structures such as skin, hair or nails.
  • this composition can be used in the case of hair, for example, for hair deformation or fixation.
  • the composition is preferably applied to the nail to promote the formation of disulfide bridges and thus to harden the nail.
  • heterocyclic compounds according to the present invention have a hair growth-promoting and stabilizing effect. Without being limited to this explanation, it is assumed that this hair growth-promoting or stabilizing effect of the substances according to the invention is also traceable to promoting the formation of the disulfide bridges.
  • the cross-linking of the disulfide bridges occurs during the intradermal phase of the hair shaft formation.
  • the extent of hardening of the keratin mass determines the
  • the basal keratin mass Keratinocytes As part of the overall mechano-sensitivity of the skin, the basal keratinocytes react to backpressure with greater proliferation, resulting in more stable hair growth. If the back pressure is weaker, the supply of keratin mass weakens, which can set a negative cycle in motion. In extreme cases, this can contribute to the development of thinning hair or hair loss (alopecia).
  • the disulfide bridge-closing properties of the substances according to the invention presumably intervene in this growth-regulating interplay, by promoting the early hardening of the hair shaft and thus enabling better back pressure, which promotes hair growth. Therefore, the treatment of the hair and the easily accessible from the outside intradermal sections of the hair with the substances according to the invention - even without the intention of deformation as described above - is suitable to prevent premature hair loss or minimize it.
  • the substances according to the invention also have a hair growth-promoting and stabilizing effect by way of stable disulfide cross-linking.
  • the compounds according to the invention can therefore be used in suitable external cosmetic or therapeutic preparations in order to prevent hair loss, e.g. the so-called androgenetic alopecia, or to promote and stabilize hair growth.
  • composition according to the invention can also be applied to the skin in order to promote the formation of disulfide bridges in the keratin-containing skin layers. This is particularly advantageous for the treatment of skin diseases or symptoms of skin diseases that are associated with a weakening of the keratin structure, such as, for example, hypokeratosis or epidermolysis.
  • heterocyclic compounds characterized according to the invention Due to the catalytic effect of heterocyclic compounds characterized according to the invention on the formation of disulfide bridges, they can also be used, for example, for catalysis in the formation of intermolecular or intramolecular disulfide bridges for the preparation of dynamic combinatorial libraries. They can therefore serve to form disulfide bridges between synthetic or natural or modified natural molecules. Therefore, they can find application in the production of dynamic combinatorial libraries for drug discovery. In dynamic combinatorial libraries, the individual units are often linked to macromolecules via disulfide bridges (see Fig. 15). Details of the libraries are described, for example, in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water" by S. Otto, RLE Furlan and JKM Sanders, J.
  • EPO mimetic peptides and oxytocin were chosen as examples of the peptides that can be cyclized by the method according to the invention.
  • Fig. 2 shows the cyclization of the same peptide as in Fig. 1 (0.7 mg / ml) to its cyclized form in the absence of caffeine. As can be clearly seen, the reaction rate is considerably reduced.
  • EMP1 Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Am
  • APG1 Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am
  • APG2 Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQRG-Am
  • FIG. 8 Shown is the cyclization of dimeric EPO mimetic peptides.
  • the cyclization of di- or multimeric peptides is preferably carried out in several steps.
  • FIG. 8 shows the synthesis scheme based on a bivalent (dimeric) EPO-mimetic peptide, which is cyclized in 2 steps by formation of two intramolecular disulfide bridges.
  • the first disulfide bridge is formed by the method according to the invention.
  • the second intramolecular disulfide bridge was performed using optimized iodine oxidation.
  • the first cyclization using caffeine according to the invention is preferably carried out at pH 6, while the second cyclization was carried out in 80% acetic acid according to the example shown.
  • the yield of the synthesis was typically between 60 and 90%.
  • EPO mimetic peptides are very difficult to cyclize.
  • An example of this is the following peptide:
  • Aad 2-aminoadipic acid, "homoglutamic acid” NaI: naphthylalanine
  • oxytocin, reduced (OyxR), crude product was dissolved in water (or H 2 O / ACN / TFA) and allowed to stand in air with various concentrations of caffeine (and possibly GSSG).
  • the reaction batch was measured by HPLC at regular intervals to determine the levels of OxyR and the product oxytocin (oxy).
  • the reaction time until complete conversion of OxyR correlates with the concentration of caffeine in the reaction solution. Up to a concentration of 0.5 mg / ml caffeine, the more caffeine the faster the oxidation proceeds. The peptide concentration has only a minor influence on the duration of the reaction.
  • Minoxidil as a further representative of the heterocyclic compounds according to the invention, therefore likewise has a positive effect on the formation of disulfide bridges.
  • the yield in solution of the minoxidil-catalyzed reaction is over 95%.
  • the fact that the reaction is a catalytically proceeding reaction is shown by the fact that the concentration of minoxidil in the reaction does not decrease practically (decrease ⁇ 2% at 4.4 eq minoxidil based on BB57, see FIG. 14).
  • Oxidizing agent here oxidized glutathione-GSSG
  • the method according to the invention can be used advantageously also in the cosmetic field and in particular in the hairdressing sector for the treatment of hair.
  • Hair samples are a) in H 2 O, or an aqueous solution of b) 10 mg / ml caffeine, c)
  • the hair after removal of the reaction solution with Ellman's reagent (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), DTNB) is reacted.
  • Ellman's reagent (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), DTNB) is reacted.
  • additional reference samples are untreated hair and reduced hair, which was otherwise subjected to no further treatment.
  • the hair samples are each with 200 ⁇ l one Add 10 mM phosphate buffer, pH 8.0 and 1 mM EDTA, and 300 ⁇ l of a 1 mM DTNB solution in the same EDTA-containing buffer. The solution is measured after a few minutes in a UV-Vis spectrometer.
  • FIGS. 40 to 59 demonstrate the reinforcing effect of the metal-containing additive.
  • the activities of the additives were again determined by the cyclization of the following example substance BB57, an epo-mimetic peptide containing 2 free cysteines
  • Fig. 40 shows the oxidation of BB57 to BB57C by caffeine. A complete turnover took place after approx. 15h. This reaction can surprisingly be further accelerated by the combination with iron (II) salts. With slight addition of iron (II) sulfate (3 .mu.M), the reaction time to complete conversion to about 10h shortened. The results are shown in FIG. 41. Intermediates appeared directly at the beginning in the HPLC chromatogram, but these converted into the product as the reaction progressed.
  • Fig. 42 shows the oxidation of BB57 to BB57C by caffeine and the addition of ferrous ions (30 ⁇ M).
  • the monitoring was carried out by means of the Ellmans test. Caffeine cyclization time is reduced to about one hour with iron (II).
  • Figure 43 shows the oxidation of BB57 to BB57C by caffeine and the addition of various ferric ions (30 ⁇ M). The monitoring took place again by means of the Ellmans test. The caffeine cyclization time is also shortened to about one hour with iron (III) salts.
  • Figure 44 shows oxidation of BB57 to BB57C by caffeine and the addition of copper (II) ions (30 ⁇ M). The monitoring took place again by means of the Ellmans test. The cyclization time is also shortened by the addition of copper salts.
  • Figure 45 shows the oxidation of BB57 with and without Fe (II) salt, ferrous sulfate (3 ⁇ M), followed by the Ellmans test.
  • the increase potential is further clarified by the example with the substance alloxan monohydrate. With alloxan (5 ⁇ g / ml) 0.66 mg / ml BB57 are almost completely cyclized within about 2 hours.
  • Figure 47 shows the acceleration of the oxidation of BB57 with alloxan and the addition of iron (III) ions (30 ⁇ M). Monitoring was carried out by Ellmans test. As previously shown for caffeine, iron (III) ions also measure an acceleration effect in combination with alloxan.
  • the ions of other transition metals also show a reinforcing effect.
  • the effects of the salts copper (II) sulfate, chromium (III) chloride, manganese (II) sulfate, cobalt (II) chloride, nickel (II) chloride, zinc (II) sulfate, magnesium (II) sulfate and calcium (II) chloride are tracked for accelerating the oxidation of BB57 by alloxan or caffeine, respectively.
  • a particularly strong effect can be observed with the iron (II) and iron (III) salts.
  • Figure 49 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ion of cobalt (II) chloride. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Fig. 50 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ions of nickel (II) chloride. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Fig. 51 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ion of zinc (II) sulfate.
  • the monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Figure 52 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ions of manganese (II) sulfate. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Fig. 53 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ions of chromium (III) chloride. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Figure 54 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ion of calcium (II) chloride. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Figure 55 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ion of magnesium (II) chloride. Monitoring over Ellman's reagent.
  • Figure 56 shows the oxidation of BB57 by alloxan and the metal ions of silver (I) nitrate. Monitoring over Ellman's reagent.
  • Stable metal ion complexes also have an accelerating effect, as shown by the example of potassium hexacyanoferrate in the following two examples.
  • Figures 57 and 58 show the cyclization of BB57 with alloxan and alloxan in combination with potassium hexacyanoferrate (II) or potassium hexacyanoferrate (III) (30 ⁇ M). The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • FIG. 59 shows the cyclization of BB57 with alloxan in combination with iron ions (3 ⁇ M) with and without 2 equivalents of EDTA. The monitoring was carried out using the Ellman's reagent.
  • Ammonium thiolactate (commercial permwave formulation) reduced to open. Subsequently, the reduction solution is removed and the hair was washed several times with water. Subsequently, the hairs were the different
  • the specific effectiveness of the heterocyclic reaction accelerator in combination with the metal-containing compound according to the invention was demonstrated on the basis of the following examples. In some experiments, combinations of different metal additives are used instead of larger amounts of a single salt component.
  • the contents of the "artificial drinking water" mixture described below are based on the maximum values given in the Drinking Water Ordinance of the Federal Republic of Germany using the following combination of metal ions: 0.2 mg / L iron (Fe 3+ ), 5 mg / L zinc (Zn 2+ ), 2mg / L copper (Cu 2+ ) and some hardness components 100mg / L calcium (Ca 2+ ) and 50mg / L magnesium (Mg 2+ ).
  • Fig. 61 shows the oxidation of hair with alloxan, alloxan with ferric chloride and alloxan with the above-described mixture "artificial drinking water.”
  • iron (III) chloride and artificial drinking water is under control After 10 minutes a lesser advantage to see through the salt additions, which proves the extraordinary properties of alloxan on keratinveni structures.
  • Fig. 62 shows the oxidation of reduced hair with caffeine and alloxan, respectively in combination with a mixture of salts corresponding to the maximum content in drinking water.
  • the monitoring comparison of caffeine and alloxan on hair shows that both reagents in combination with artificial drinking water completely oxidize the hair, but the reaction with caffeine takes longer.
  • Fig. 63 shows the oxidation of reduced hair with various amounts of alloxan in combination with varying amounts of iron (III) ions.
  • the monitoring was carried out by means of Ellmans reagent.
  • This example with different amounts of alloxan and ferric chloride shows that small amounts of alloxan, a 0.1% solution in combination with small amounts of iron ions, is sufficient to achieve almost complete reoxidation of the thiols in the hair after 10 minutes. These small amounts are particularly advantageous, since this little burden on the structure of the hair.
  • the process according to the invention is therefore gentler than conventional processes which, for example, operate on the basis of hydrogen peroxide.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bei SH-Gruppen tragenden Substanzen, insbesondere Peptiden bspw. durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken, bei dem eine heterozyklische, wenigstens ein Stickstoffatom aufweisende Verbindung (bspw. Koffein oder eine koffeinähnliche Substanz) zur Katalyse der Reaktion eingesetzt wird. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Zugabe der heterozyklischen Substanz sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit an Disulfidbrücken tragendem Produkt erhöht.

Description

AplaGen GmbH
Arnold-Sommerfeld-Ring 2, 52499 Baesweiler
Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bekannt. So ist es beispielsweise bei einer Standardmethode zur Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken bekannt, K3[Fe(CN)e] als Oxidationsmittel einzusetzen. Dieses Reagenz gewährleistet saubere Zyklisierungspro- dukte bei hohen Ausbeuten; Nebenreaktionen werden vermieden. Darüber hinaus sind noch Zyklisierungen durch den Einfluss von Sauerstoff oder Jod bekannt. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie entweder zu langsam sind oder eine Vielzahl unerwünschter Nebenprodukte zur Folge haben. Eine andere bekannte Methode zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von immobilisierten Ellmann's-Reagenz (5,5;- Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)) als Oxidationsmittel. Diese Methode ermöglicht die vollständige Oxidation bspw. eines linearen Peptids; Unreinheiten durch das Reagenz werden vermieden. Dieser Ansatz wurde erst kürzlich zu Cross-Linked-Ethoxylate-Acrylate- Resin (CLEAR)-Trägern erweitert. Diese sind sowohl mit organischen als auch mit wässrigen Lösungsmittelmischungen kompatibel.
Eine weitere im Stand der Technik bekannte Methode zur Ausbildung von Disulfidbrücken bspw. zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von DMSO als Oxidationsmittel. Dieses Verfahren führt ebenfalls zu einer vollständigen Oxidation des linearen Peptids. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass die Reaktion sehr langsam ver- läuft und dass der Überschuss an DMSO vor der weiteren Prozessierung entfernt werden muss, was sich bei diesem organischen Lösungsmittel schwierig gestaltet.
Aus obigen Ausführungen ergibt sich, dass mehrere Methoden zur Ausbildung von Disulfidbrücken bei Peptiden und Proteinen bekannt sind. Jede dieser Methoden hat jedoch entweder hinsichtlich der Ausbeute, der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Reinheit Nachteile.
Die kontrollierte Ausbildung bzw. Förderung von Disulfidbrücken ist jedoch nicht nur für die Peptid- und Proteinchemie bedeutsam, sondern spielt auch im kosmetischen und therapeutischen Bereich eine wichtige Rolle, da auch die Struktur von keratinhaltigen Strukturen wie der Haut, der Nägel und des Haares durch disulfidbrückenhaltige Proteine bestimmt bzw. beeinflusst wird.
Die äußere Haut (Cutis) gliedert sich prinzipiell in 3 Hauptschichten: Oberhaut (Epidermis), Lederhaut (Dermis oder Corium) und Unterhaut (Subcutis).
Die Epidermis oder "Oberhaut" gehört zu den Epithelgeweben, es handelt sich um ein mehrschichtiges verhornendes Plattenepithel, das üblicherweise zwischen 0,03 bis 0,05 Millimeter, an den Handinnenflächen und den Fußsohlen aber bis zu mehrere Millimeter dick ist. Sie bildet als äußerste Hautschicht die eigentliche Schutzhülle gegenüber der Umwelt. Sie ist mehrschichtig und besteht zu 90 Prozent aus Keratinozyten, den eigentlichen Epidermiszellen, die durch so genannte Desmosomen zusammengehalten werden. In den obersten Schichten besteht die Epidermis aus verhornten Plattenepithelzellen. Man unterscheidet insgesamt fünf Schichten: Homschicht (Stratum corneum), Glanzschicht (Stratum lucidum), Körnerschicht (Stratum granulosum), Stachelzellschicht (Stratum spinosum) sowie die Basalschicht (Stratum basale). Eine typische Eigenschaft der Epidermis ist ihre Mechanosensitivität, die z.B. durch die Schwielenbildung an Händen und Füßen als Folge vermehrter Belastung sichtbar wird.
Der Keratinozyt ist der in der Epidermis (Oberhaut) hauptsächlich (über 90 Prozent) vorkommende Zelltyp. Dieser Zelltyp produziert Keratin und differenziert während er von der untersten Schicht der Oberhaut zu den obersten Schichten (also der Außenwelt zugewandt) gelangt. In der sogenannten Basalzellschicht befinden sich proliferierende Zellen direkt auf der Basalmembran, die für einen ständigen Nachschub neuer Keratinozyten sorgen.
Keratin ist ein Strukturprotein, das für Stabilität und Form der Zellen verantwortlich ist. Bestimmte Untergruppen dieses Proteins (die sog. trichozytischen Keratine) sind auch Hauptbestandteil von Haaren und Nägeln.
Die Festigkeit dieser Keratine wird durch Faserbildung verstärkt. Die einzelnen Aminosäureketten bilden eine rechtsgängige Alpha-Helix aus; je drei dieser Helices bilden eine linksgängige Superhelix (= Protofibrille). Elf dieser Protofibrillen vereinigen sich zu einer Mikrofibrille, welche sich wiederum ihrerseits zu Bündeln vereinigen und dadurch Makrofibrillen ausbilden, die die Zellen des Haares umgeben. Neben dem strukturbildenden Keratin werden im Rahmen der Verhornung von Plattenepithel (Epidermis) und bei der Entstehung von Keratin-basierten Hautanhangsgebilden (Haare, Nägel) auch viele andere zelluläre Moleküle der zunächst differenzierenden, später absterbenden Keratinozyten in die Keratinmatrix eingeschlossen. Ein wichtiges Protein ist dabei das sogenannte Filaggrin, das für die Quervernetzung mitverantwortlich ist. Während die Keratinozyten zugrunde gehen und dabei große Mengen dieser Proteine produzieren, kommt es in den oberen Schichten der Haut (Stratum lucidum und Stratum corneum) zu massiven Quervernetzungen. Eine wesentliche chemische Grundreaktion, die die Endfestigkeit des entstehenden Keratingebildes wesentlich beeinflusst, ist die Schließung von Disulfidbrücken zwischen den Sulfhydryl-reichen Proteinen der Keratinmatrix.
Diese kovalente Quervernetzung über Disulfid-Brücken verleiht dem Keratingebilde eine besondere Festigkeit. Je höher der Anteil an Disulfid-Brücken zwischen den einzelnen Helices ist, desto geringer ist die Biegsamkeit der Faser. Keratine in Hörn, Haar oder Nägeln sind weniger biegsam als die weichen Keratine aus der Haut. In den härtesten α-Keratinen wie dem Hörn der Nashörner sind bis zu 18 % der Aminosäuren an solchen Quervernetzungen über Disulfidbrücken beteiligt.
Wie ausgeführt, ist auch das Haar stark keratinhaltig. Das Haar kann grob in drei Schichten unterteilt werden, Cuticula, Codex und Medulla.
Die äußerste Schicht, Cuticula oder Schuppenschicht genannt, besteht aus flachen, übereinandergreifenden Zellen, die ähnlich wie bei einem Tannenzapfen zur Haarspitze orientiert sind. Sie besteht aus sechs bis zehn solcher Zelllagen. Die Schuppenschicht zeigt den Gesundheitszustand des Haares an. Beim gesunden Haar liegt die Schuppenschicht flach an und ergibt so eine glatte, durchscheinende Oberfläche. Das Licht wird optimal reflektiert und ergibt so den gesunden Glanz des Haares. Alkalisches Milieu öffnet die Schuppen, saure Umgebung verschließt sie. Die Schuppenschicht kann durch kosmetische Behandlungen wie Färben oder Dauerwellen stark strapaziert werden; das Haar wird dann stumpf und spröde.
Der Cortex („Rinde"), Faserschicht oder Faserstamm macht ca. 80 % des Haaranteils aus. Hier spielen sich sämtliche relevanten chemischen Prozesse ab, die bspw. bei kosmetischen Behandlungen erfolgen. Der Cortex besteht aus Faserbündeln, die aus einer großen Zahl feinster Keratinfasem, den Fibrillen, bestehen. Diese entstehen vermutlich dadurch, dass sich Cortexzellen aneinanderlagern. Die Verbindung zwischen den beiden Zellen wird durch den Zellmembrankomplex hergestellt, den man sich als eine Art Kittsubstanz vorstellen kann. Die Reißfestigkeit und Elastizität des Haares sind auf diese Verkittung zurückzuführen. Im Inneren des Haares befindet sich die Medulla (Haarmark). Sie besteht aus Zellwandungen, Abbauprodukten der Cortexzellen und Fetten.
Die zuvor beschriebenen Disulfidbrücken im Keratin werden bei insbesondere bei kosmetischen Anwendungen ausgenutzt, um keratinhaltige Strukturen, wie insbesondere Haare zu verformen.
Bei der dauerhaften Haarverformung (bspw. einer Dauerwelle oder einer Haarglättung) werden die Haare in der Regel zunächst mit einem Verformungsmittel auf der Basis einer keratinreduzierenden Verbindung behandelt, welche eine Öffnung der Disulfidbrücken des Haarkeratins bewirkt. Dadurch entstehen freie SH-Gruppen. Als Verformungsmittel werden in der Regel keratinreduzierende Mercaptoverbindungen, wie zum Beispiel Salze oder Ester von Mercaptocarbonsäuren, verwendet.
In diesem Zustand werden die Haare dann in die gewünschte Form gebracht, bspw. durch Aufwicklung auf Lockenwickler bzw. Glättung der Haare. Sobald sie in die neue Form gebracht wurden, erfolgt eine zweite chemische Modifizierung, welche vor allem darin besteht, aus den SH-Gruppen durch Oxidation wieder Disulfidbindungen zu bilden. Aufgrund der den Haaren aufgezwungenen Verformung werden die neuen Bindungen an anderen Stellen gebildet als die ursprünglichen Bindungen. Dies bewirkt, dass die Haarsträhnen in der ihr aufgezwungenen neuen Form fixiert werden und somit eine dauerhafte Verformung erreicht wird.
Für den Oxidationsschritt zur Ausbildung von neuen Disulfidbrücken wird oftmals Wasserstoffperoxid eingesetzt. Wasserstoffperoxid hat jedoch den Nachteil, dass es das Haar angreift und somit strapaziert.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbrücken bereitzustellen. Ferner liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen zwecks Ausbildung von Disulfidbrücken bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Reaktion in einem flüssigen oder pastösen Gemisch durchgeführt wird, das wenigstens eine heterozyklische Verbindung enthält, die mindestens ein Stickstoffatom im Ring aufweist.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Oxidationsreaktion von zwei freien
Thiolgruppen hin zu einer Disulfidbrücke um ein Vielfaches beschleunigt. Die heterocyclischen Verbindungen werden dabei vorzugsweise in katalytischen Mengen zugegeben und bleiben während der Reaktion unverändert. Sie können bei Bedarf auch nach der Reaktion entfernt werden. Als Substanzen ist eine Vielzahl heterocylischer Verbindungen geeignet, die im Folgenden noch näher beschrieben werden. Überraschender Weise wurde ferner gefunden, dass die beschleunigende Eigenschaft dieser heterozyklischen Verbindungen hinsichtlich der Ausbildung von Disulfidbrücken durch weitere Zusatzstoffe noch verstärkt werden kann. Als Zusatzstoffe können Metallverbindungen, wie beispielsweise Metallionen bzw. Metallionen enthaltende oder freisetzende Verbindungen, wie beispielsweise Metallsalze oder Metallkomplexe eingesetzt werden.
Durch die Zugabe bereits geringer Mengen dieser Metallverbindungen (wenigstens eine) kommt es zu einer weiteren Beschleunigung der durch die heterozyklischen Verbindungen katalysierten Oxidation von SH-Gruppen-haltigen Verbindungen wie bspw. Peptiden, Proteinen oder keratinhaltigen Strukturen (wie bspw. Haut, Nägeln oder Haaren).
Entsprechend betrifft Anspruch 1 ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Reaktion in einem Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer
Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
Figure imgf000006_0001
in welcher der Substituent A
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gege- benenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder
Mercapto steht.
Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die oben definierten heterozyklischen Verbindungen die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern und somit in der Reaktion als eine Art Katalysator wirken können. Ihre Wirkung wird durch Zugabe wenigstens einer erfindungsgemäßen Metallverbindung noch verstärkt. Es ist daher vorteilhaft, diese Verbindungen dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um die Ausbildung von Disulfidbrücken bei unterschiedlichen SH-Gruppen tragenden Substanzen, wie insbesondere Peptiden und Proteinen sowie keratinhaltigen Strukturen, zu fördern.
Die wenigstens eine Metallverbindung kann eine Metallionen enthaltende oder freisetzende Verbindung sein. Sie ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Metallsalze, Metallsalzkomplexe und löslichen Metallverbindungen.
Erfindungsgemäß einzusetzende Metallverbindungen sind daher vorzugsweise Ionen bzw. solche freisetzende Verbindungen oder lonenkomplexe von Metallen. Auch hochaffine Chelatkomplexbildner, wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), behindern die verstärkenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen metallhaltigen Zusätze nicht und können als Hilfsmittel eingesetzt werden. Als Metalle sind insbesondere Übergangsmetalle, wie Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink, Mangan, Chrom oder Silber; Erdalkalimetalle, wie bspw. Calcium oder Magnesium oder aber Hauptgruppenmetalle, wie bspw. Aluminium geeignet. Auch die Ionen weiterer Übergangsmetalle zeigen einen verstärkenden Effekt.
Besonders geeignet sind die Salze des Kupfers, Chroms, Mangans, Kobalts, Nickels, Zinks, Magnesiums und Calciums. Ein besonders starker Effekt ist jedoch bei den Eisen(ll)- und Eisen(lll)-salzen zu beobachten, die daher vorzugsweise eingesetzt werden. Entsprechend kann die Metallverbindung ausgewählt sein aus der Gruppe der Kupfer(ll)salze, Chrom(lll)salze, Mangan(ll)salze, Kobalt(ll)salze, Nickel(ll)salze, Zink(ll)salze, Magnesium(ll)salze, Calcium(ll)salze sowie Eisen(ll)- und Eisen(lll)salze.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Metallverbindungen zeigen bereits in geringen Mengen einen vorteilhaften Effekt auf die Oxidationsreaktion. Vorzugsweise wird der Zusatz in einer Menge von wenigstens 1 μM, wenigstens 2 μM und besonders bevorzugt in einer Menge von wenigstens 3 μM und besonders bevorzugt in einer Menge von wenigstens 10 μM eingesetzt. Jedoch können auch deutlich höhere Mengen eingesetzt werden, wobei sich jedoch gezeigt hat, dass ab einer bestimmten Menge an metallhaltigem Zusatz die Reaktion nicht durch Erhöhung der Konzentration weiter beschleunigt werden kann. Das Konzentrationsoptimum kann je nach metallhaltiger Substanz und zu oxidierendem Stoff variieren. Es empfiehlt sich daher, das Optimum experimentell zu bestimmen. Dass der metallhaltige Zusatz bereits in geringen Mengen und in Gegenwart hochaffiner Komplexbildner eine beschleunigende Wirkung zeigt, ist insbesondere bei der Behandlung von keratinhaltigen Strukturen von Vorteil. Dies, da von kosmetischen Behandlungen bekannt ist, dass bspw. Kupfer und Eisen in größeren Mengen eine Verfärbung von keratinhaltigen Strukturen (insbesondere des Haares) bewirken können, was zu vermeiden ist.
Gemäß einer Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur auf:
Figure imgf000008_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2JnCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R6 fehlt.
Fehlen können die genannten Substituenten R2 bis R6 dann, wenn an der verknüpfenden Position im Ring ein Stickstoffatom sitzt, das eine Doppelbindung aufweist (siehe bspw. die Verbindungen 2,6-Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid; Uracil-6- Carbonsäure, 4,6-Dihydroxypyrimidin).
Ein zentrales Merkmal der erfindungsgemäßen Substanzen gemäß der Alternative (a) ist das Vorhandensein des 6-gliedrigen, stickstoffhaltigen Heterozyklus sowie der Hydroxy- oder erfindungsgemäßen Oxogruppe (=O) am benachbarten Kohlenstoffatom. „Oxogruppe" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der jeweilige Substituent mit dem Ringatom zusammen eine Oxogruppe bildet und entsprechend ein Sauerstoffatom über eine Doppelbindung an den Ring gebunden ist:
Figure imgf000009_0001
So haben umfangreiche Versuche gezeigt, dass Verbindungen ohne eine solche funktionelle Gruppe (Hydroxygruppe, Oxogruppe =0) regelmäßig nicht die Fähigkeit aufwiesen, die Ausbildung der Disulfidbrücken zu fördern (so bspw. Aminopyrazin, 2,4- Diaminopyrimidin, Melamin, Pyrazincarbonsäure und Pyrazinamid).
Wie sich aus der Definition der Substituenten ergibt, gibt es Verbindungen, die nur ein Stickstoffatom im Heterozyklus aufweisen und die vorteilhaften Wirkungen hinsichtlich der Förderung der Ausbildung der Disulfidbindungen aufzuweisen. Ein Beispiel für eine
Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und einer erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung N-Methyl-2-Pyridon:
Figure imgf000010_0001
Ein weiteres Beispiel für eine Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und mit einer Hydroxylgruppe am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung 2,6- Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid:
Figure imgf000010_0002
H
Wie im Anspruch festgelegt, ist der Heterozyklus im Falle des Vorhandenseins von Hydroxygruppen ungesättigt. Versuche haben gezeigt, dass in diesem Fall das Vorhandensein wenigstens einer Doppelbindung für die katalytische Wirkung augenscheinlich bedeutsam ist. Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, wird spekuliert, dass dies darauf zurückzuführen sein könnte, dass Verbindungen dieser Struktur tautomerisieren können. Tautomere sind Strukturisomere, die sich lediglich in der Stellung einer Gruppe (bspw. Wasserstoff) und in der Stellung einer Doppelbindung unterscheiden. Im Falle der Hydroxy- und der Oxogruppe (=0) spricht man auch von Keto-Enol-Tautomerie. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die aromatisch vorliegenden Verbindungen, wie das 2,6-Dihydroxy-pyridin Hydrochlorid tautomerisieren können. Dies trifft insbesondere auf die Enolformen zu, die vorzugsweise in Richtung der Ketoform tautomerisieren können. Tautomere (Isomere) Formen der dargestellten Substanzen sind daher erfindungsgemäß mit umfasst.
Vorzugsweise weist der sechsgliedrige Heterozyklus zwei Stickstoffatome auf, die unterschiedlich positioniert sein können. Beispiele für aktive Verbindungen dieser Struktur sind Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion:
Figure imgf000011_0001
Ein Beispiel für Verbindungen, bei denen R5 und R6 zusammen eine Ringstruktur bilden, ist 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin:
Figure imgf000011_0002
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung folgende Substruktur auf:
Figure imgf000011_0003
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
Aktive Beispiele dieser Ausführungsform sind bspw. Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure
Figure imgf000012_0001
Auch sind entsprechende Derivate dieser Stoffe geeignet.
Weitere Beispiele dieser Ausführungsform sind Uracilderivate der folgenden allgemeinen Formel:
Figure imgf000012_0002
wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.
Beispiele mit guter Aktivität sind Uracil und
Figure imgf000012_0004
Figure imgf000012_0003
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbindungen fördert, um Purinderivate, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht
Figure imgf000013_0001
wobei der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und wobei
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder CiO-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;
- R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasser- stoff oder C1- bis C3-Alkyl stehen.
Wie dargelegt, kann die cyclische Verbindung demnach auf einem Puringrundgerüst basieren. Das Puringrundgerüst kann als kondensiertes Ringsystem, zusammengesetzt aus den beiden Heterocyclen Pyrimidin und Imidazol, aufgefasst werden. Sein systematischer lUPAC-Name ist 7H-lmidazol[4,5-d]pyrimidin. Das 7H-Purin steht mit seinem Isomer, dem 9H-Purin, in einem tautomeren Gleichgewicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verbindungen als umfasst gelten, welche auf beiden tautomeren Formen basieren:
Figure imgf000014_0001
7H Purin 9H Purin
Je nach Wahl der Substituenten am Pyrimidin-Ring kann dieser auch weniger Doppelbindungen aufweisen.
In einer ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Rest R4, R6, R7 und R9 eine Alkylgruppe und mindestens einer, vorzugsweise zwei der Reste R4, R6, R7 und R9 stellen Wasserstoff oder eine C1- bis C3-Alkylgruppe, vorzugsweise Methyl, dar.
Besondere Beispiele dieser heterozyklischen Verbindungen auf der Basis von Purin sind 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure und 3-lsobutyl-1-Methylxanthin:
Figure imgf000014_0002
Wie diese ausgewählten Beispiele zeigen, sind tautomere Verbindungen, denen anstelle des oben dargestellten 7H-Puringrundgerüsts das 9H-Puringrundgerüst zugrunde liegt, ebenfalls umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bilden R2 und R3 zusammen einen gegebenenfalls substituierten Sechsring, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist. Bei dieser Ausführungsform handelt es sich vorzugsweise um Verbindungen, bei denen ein Aromat an den Grundheterozyklus ankondensiert wurde. Dies bevorzugt an einer Brücke aus zwei C-Atomen. Beispiele, in denen ein 5-Ring ankondensiert wurde (bspw. Imidazol), wurden bereits vorstehend erläutert (Verbindungen auf Basis des Puringrundgerüsts). Weitere Beispiele für ankondensierte Ringstrukturen sind Pyrazin und Chinoxalin.
Ein Beispiel für eine Verbindung mit einem Benzolring als ankondensierten 6-Ring ist 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on:
Figure imgf000015_0001
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weist die Verbindung folgende Grundstruktur auf:
Figure imgf000015_0002
wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können und
R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O) darstellt;
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis do-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C1O-
Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenen- falls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest stehen;
R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) steht oder R5 fehlt;
R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten Cr bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder CiO-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten Ci bis C6- Alkylrest stehen;
R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.
Ausgesuchte Beispiele für unter diese Formel fallende Verbindungen sind bspw. (-)- Riboflavin, Lumazin und Alloxazin
Figure imgf000016_0001
Es hat sich als vorteilhaft für die Wirkung erwiesen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Alternative (a) keine exozyklischen Aminogruppen tragen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen daher keine exozyklischen Aminogruppen auf.
Die oben genannten Substituenten R2, R3, R4 und R5 können ferner unabhängig voneinander Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter d- bis C10-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6- oder C10-
Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C1- bis C6-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder ein gegebenenfalls substituierter C1 bis C3-Alkylrest, insbesondere Methylrest, sein.
R6 ist vorzugsweise Wasserstoff oder ein Alkylrest, C1 bis C8, vorzugsweise C1 bis C4, besonders bevorzugt Wasserstoff oder eine Methylgruppe.
Elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche vorliegend auch als Substituenten an dem Heterocyclus verwendet werden können (siehe oben), sind bspw. elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche als Substituenten die Elektronendichte an einem entsprechenden aromatischen heterozyklischen Ring erniedrigen (auch als deaktivierende Gruppen bezeichnet). Elektronenziehende Gruppen besitzen einen (-)-M- und/oder einen (-)-l-Effekt. Der Resonanz-Effekt (M- Effekt, mesomerer Effekt) wirkt im Allgemeinen nur, wenn die Gruppe direkt an dem ungesättigten heterozyklischen System gebunden ist. Er wirkt über π-Elektronen, im Gegensatz zum Feld-Effekt (I-Effekt, induktiver Effekt), welcher über den Raum, über Solvenz-Moleküle oder vorzugsweise über σ-Bindungen eines Systems wirkt.
Ein elektronenziehender Effekt kann entweder induktiv (d.h. durch den so genannten (- )-l-Effekt) und/oder mesomer (d.h. durch den so genannten (-)-M-Effekt) erfolgen. Die Einteilung von aromatischen Substituenten in Substituenten mit (+)-l- und (-)-l-Effekt sowie mit (+)-M-Effekt und (-)-M-Effekt ist dem Fachmann an sich bekannt. Für weitergehende Ausführungen wird auf Beyer/Walter, „Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23. überarbeitete und aktualisierte Auflage, Seiten 515 bis 518, verwiesen, dessen diesbezügliche Offenbarung in die vorliegende Erfindung eingeschlossen wird.
Einige, nicht-beschränkende Beispiele für Gruppen mit (-)-M-Effekt sind -SO2-, -SO2O-, -00-, -COO-, -CONH-, -CONR-, -SOR-, -CN, -NO2, -CHO, -CO-, -COSH, -COS", -SO3H und die erfindungsgemäße Oxogruppe (=O). Wie hieraus deutlich wird, können sich die Begriffe „elektronenziehende Gruppe" und „funktionelle Gruppe" überschneiden. Entsprechende Gruppen sind Beispiele für einsetzbare Substituenten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A auf, der
für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C1- bis do-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; - insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-
Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist; steht.
Besondere Beispiele dieser Pyrimidinderivate sind die folgenden Verbindungen:
Aminexil
Figure imgf000018_0001
Minoxidil Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der erfindungsgemäß zu verwendenden heterozyklischen Verbindung hilfreich. Daher können auch weitere, zuvor nicht explizit erwähnte Derivate der heterozyklischen Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden.
Die zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen können sowohl in reiner Form als auch als Mischungen verschiedener möglicher isomerer Formen, insbesondere von Stereoisomeren, wie E- und Z-, threo- und erythro-, sowie optischen Isomeren, wie R- und S-Isomeren oder Atropisomeren und von Tautomeren vorliegen. Die Erfindung umfasst sowohl die reinen Isomeren als auch deren Gemische.
Je nach Art der oben definierten Substituenten weisen die heterozyklischen Verbindungen saure oder basische Eigenschaften auf und können Salze, gegebenenfalls auch innere Salze bilden. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Hydroxy, Carboxy oder andere, saure Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Basen zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Basen sind beispielsweise Hydroxide, Carbonate, Hydrogencarbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, insbesondere die von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium, weiterhin Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre Amine mit (C1-C4-)-Alkylresten sowie Mono-, Di- und Trialkanolamine von (CrC4)-Alkanolen. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Amino, Alkylamino oder andere, basische Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Säuren zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Säuren sind beispielsweise Mineralsäuren, wie Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure, organische Säuren, wie Essigsäure oder Oxalsäure, und saure Salze, wie NaHSO4 und KHSO4. Die so erhältlichen Salze sind ebenfalls einsetzbar.
Weitere bevorzugte Gruppen der oben genannten Verbindungen werden nachfolgend diskutiert.
Beispiele für heterozyklische Verbindungen, die erfindungsgemäß zur Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken eingesetzt werden können, können ferner wie folgt beschrieben werden:
Figure imgf000019_0001
Die Reste R1', R2' sowie R3' sind entweder gleich oder verschieden; wenigstens einer der Reste stellt jedoch eine Alkylgruppe dar. Es versteht sich, dass Tautomere, bei de- nen u.a. die Doppelbindung wandert, ebenfalls durch die obige Formel erfasst werden. Entsprechende Strukturisomere werden daher ebenfalls von dieser Formel umfasst. Diese Verbindungen eignen sich wie dargelegt insbesondere zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden und Proteinen.
Wenigstens einer, vorzugsweise zwei der Reste R1', R2' sowie R3', die entweder gleich oder verschieden sind, stellt vorzugsweise entweder Wasserstoff oder eine C1 bis C5 Alkylgruppe dar. Insbesondere kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl-Gruppe, haben sich als vorteilhaft erwiesen. Ferner kann wenigstens einer der Reste eine funktionelle Gruppe beinhalten. Ferner ist es auch möglich, dass an den verbleibenden Positionen am heterozyklischen 5-Ring Reste R4' (am Stickstoff) und R5' (am zwischen den Stickstoffatomen liegenden Kohlenstoff) vorliegen (insbesondere bei den tautomeren Formen). Diese sind beliebig gestaltbare, vor- zugsweise organische Reste. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich um funktionelle Gruppen, die die Anbindung der Substanz an bspw. einen Trägerstoff ermöglichen. Diese Variante wird nachfolgend noch im Detail beschrieben.
Besonders bevorzugte Beispiele der erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen sind N-Methyl-2-Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-
Hydrochlorid, Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin,
4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion, 7-Hydroxy-5- methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure, Uracil, 1 -Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin,
Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure, 3- lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin,
Alloxazin, Minoxidil (= 6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin-3-oxid) und Aminexil (= 2,4-
Diaminopyrimidin-3-oxid).
Diese Substanzen lassen sich erfindungsgemäß besonders gut zur Ausbildung von Disulfidbrücken einsetzten. Besonders bevorzugt sind:
N-Methyl-2-pyridon, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat, Violursäure, 4,6-Dihydroxy- pyrimidin, Uracil-6-carbonsäure, Minoxidil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, 3- lsobutyl-1-methylxanthin, Koffein, Isokoffein, Lumazin, Alloxazin.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich insbesondere Peptide und Proteine, insbesondere Peptide mit einer Aminosäurelänge zwischen 5 und 100, vorzugs- weise 10 und 50, besonders bevorzugt zwischen 15 bis 40 Aminosäuren in Wasser selbst bei höheren Peptidkonzentration bei Raumtemperatur nach dem erfindungsge- mäßen Verfahren durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zyklisieren lassen. Das Verfahren ist daher besonders zur Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken und daher insbesondere zur Zyklisierung von Peptiden geeignet. Ferner lassen sich Polypeptide und Proteine mit dem entsprechenden Verfahren zyklisieren. Ferner lassen sich auch Disulfidbrücken bei anders strukturierten SH-Gruppen tragenden Substanzen ausbilden. Die Ausbildung der Disulfidbrücken, bspw. bei einer Zyklisierung, erfolgt aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung wie bspw. Koffein bzw. einer koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formeln) bei einigen Peptiden beinahe quantitativ. Dies ist jedoch nicht zwingend. Überraschender Weise ist es nicht erforderlich (jedoch möglich), ein Oxidationsmittel zur Beschleunigung der Reaktion zuzugeben, da der Luftsauerstoff in Anwesenheit der oben charakterisierten Substanz zur Ausbildung von Disulfidbrücken ausreichend ist.
Versuchsergebnisse haben ferner gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zunehmen kann. Die positive Beeinflussung durch die erfindungsgemäße Zugabe der oben charakterisierten Substanz ist insofern überraschend, da es sich zumeist - im Gegensatz zu den im Stand der Technik eingesetzten Substanzen DMSO oder lod - nicht um Oxidationsmittel handelt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Luftsauerstoff zur Oxidation ausreichend, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung in vorteilhafter Weise zunimmt. Die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch einen autokatalytischen Mechanismus ggf. durch das zyklisierte Produkt nahe legen.
Vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass trotz der Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und selbst bei Einsatz von hohen Peptidkonzentrationen, oft keine oder nur wenig Oligomerisierungsprodukte auftreten. Die im Falle einer Zyklisierung eines Peptids unerwünschte Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken wurde daher nicht beobachtet. Die einzusetzende Peptidkonzentration hängt jedoch von dem jeweils ein- gesetzten Peptid ab und sollte daher für jedes Peptid optimiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafter Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Der augenscheinlich autokatalytische Verlauf der Reaktion tritt sowohl in ungepufferten als auch in gepufferten Lösungen (bspw. Phosphatpuffer, pH 6 - 9) auf. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht werden kann, wenn der pH-Wert abgesenkt wird. Es ist daher vorteilhaft, den pH-Wert bei < = 7 einzustellen, vorzugsweise in einem pH Bereich von ca. 4 bzw. 5 bis 6,5, besonders bevorzugt ist ein pH Wert um die 6 (5.5 bis 6.5). Die Menge an Substanz, die dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, um die Ausbildung der insbesondere intramolekularen Disulfidbrücken zu fördern, variiert je nach Verbindung und dem Stoff, bei dem Disulfidbrücken ausgebildet werden sollen. In der Regel reichen kleine katalytische Mengen. Die einzusetzende Menge liegt vorzugsweise bei wenigstens ca. 0,0001 mg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,0001 , 0,001 oder 0,01 bis 20mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 15mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 10mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 5mg/ml, vorzugsweise 0,001 oder 0,01 bis 1 mg/ml und besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,5 mg/ml. Die Mengen variieren je nach gewählter Substanz (bspw. Koffein oder koffeinähnlicher Substanz) und zu behandelndem Peptid bzw. Protein und sollten daher jeweils individuell optimiert werden. Ein besonders geeigneter Konzentrationsbereich für Peptide mit einer Länge von ca. 15 bis 25 Aminosäuren (insbesondere im Falle von EPO-mimetischen Peptiden) liegt bei 0,05 bis 0,3mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,075 bis 0,15 mg/ml. Die Mengen variieren jedoch wiederum je nach Peptid und können auch deutlich höher liegen; die Mengen sollten daher vorzugsweise für das jeweilige Peptid optimiert werden.
Die Reaktionsgeschwindigkeit kann weiter beschleunigt werden, wenn dem Reaktionsgemisch ein zusätzliches Oxidationsmittel zugegeben wird. Beispielsweise sei GIu- tathion in oxidierter Form (GSSG) genannt.
Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass die Zyklisierung effektiv auch bei hohen Peptidkonzentrationen durchgeführt werden kann, ohne dass unerwünschte Oligomeri- sierungen auftreten. Hohe Peptidkonzentrationen sind daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei vielen Peptiden eher unproblematisch. Vielmehr hat sich bei einigen Peptiden später gezeigt, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zykli- sierungsreaktion bei hohen Peptidkonzentrationen sogar besser abläuft. Je nach Peptid liegen geeignete Peptidkonzentrationen bei ca. 0,05 bzw.0,1 oder 0,5 bis 5 mg/ml, bevorzugt sind Konzentrationen in einem Bereich von 0,7 bis 1 ,5 mg/ml. Die genaue Konzentration hängt selbstverständlich von dem jeweiligen Peptid, seiner Länge sowie seiner Aminosäurezusammensetzung ab und variiert entsprechend. Die vorliegenden Angaben sind daher nicht beschränkend anzusehen. Für EPO-mimetische Peptide hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, eine Konzentration von ca. 0,7 bis 1 mg/mJ einzusetzen. Sie lassen sich besonders effektiv durch die Zugabe von Koffein zyklisie- ren.
Üblicher Weise wird eine Disulfidbrücke in einem Peptid oder Protein zwischen zwei Cysteinen ausgebildet. Jedoch kann erfindungsgemäß die Disulfidbrücke auch zwischen anderen natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren ausgebildet werden, sofern diese entsprechende Gruppen aufweisen, die zur Ausbildung einer Disulfidbrücke (-S-S-) geeignet sind. Thiolysin, Homocystein und andere Cysteinderivate sind neben Cystein als Beispiele für geeignete Aminosäuren zu nennen. Der Begriff Disulfidbrücke ist jedoch nicht mit dem Begriff Cysteinbrücke gleichzusetzen, sondern umfasst die Ausbildung entsprechender -S-S- Bindungen zwischen irgendwelchen natürlichen oder nicht-natürlichen SH-haltigen Aminosäuren oder anderen SH-Gruppen haltige Verbindungen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich daher auch Disulfidbrücken bei anderen SH-Gruppen haltigen Verbindungen, insbesondere Polymeren, ausbilden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können selbstverständlich auch mehrere Disulfidbrücken ausgebildet werden.
Besonders vorteilhaft kann das vorliegende Verfahren zur Zyklisierung von EPO-mime- tischen Peptiden (siehe bspw. WO 96/40479) eingesetzt werden. Neuartige EPO mimetische Peptide sind in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Peptide hiermit vollumfänglich zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird. Wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) ausführlich beschrieben ist, weisen diese neuartigen EPO mimetischen Peptide kein Prolin in der Position 10 des EPO mimetischen Konsensusmotivs auf (hinsichtlich der Nummerierung wird auf Johnson et al, 1997 verwiesen). Vielmehr ist das Prolin gegen eine nicht konservative Aminosäure, insbesondere eine basische Aminosäure wie insbesondere Lysin, ausgetauscht.
EPO mimetische Peptide zeigen eine besonders gute Aktivität in zyklisierter Form. Übli- cherweise werden daher zwei Peptidmonomere (die Monomere entsprechen Bindungsdomänen) mit einem EPO mimetischen Konsensus jeweils zyklisiert und zu einem Dimer verbunden, da die Bindung an den EPO-Rezeptor in dieser Form am effektivsten ist. Die EPO mimetischen Monomere weisen durchschnittlich 10 bis 25 Aminosäuren auf. Vorzugsweise werden sie, wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, als kontinuierliche Dimere (bivalente Peptide) synthetisiert, um separate Dimerisierungsschritte zu vermeiden.
Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zur Zyklisierung von EPO-mimetischen oder auch TPO-mimeti- sehen Peptiden bekannt. Kern der bekannten Lehren ist die Oxidation der Cystein- Reste (oder entsprechender anderer SH-Gruppen haltigen Aminosäuren) im EPO-mimetischen Konsensus. Als typisches Oxidationsmittel wurde bislang DMSO eingesetzt, was jedoch die eingangs geschilderten Nachteile aufweist.
Die Zyklisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hat gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren einige entscheidende Vorteile. So werden bessere Ausbeuten sowie eine größere Reinheit des Produkts als mit dem im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt. Ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Methode ist die einfache Trennbarkeit des erfindungsgemäßen Zyklisierungsrea- genz vom Reaktionsprodukt durch eine einfache HPLC. Gemäß einer weiteren Variante lässt sich die heterozyklische Verbindung (bspw. Koffein) durch Flüssig-Flüssig-Extrak- tion abtrennen. So lässt sich z.B. Koffein durch wiederholte Extraktion mit Dichlor- methan von einer wässrigen Peptidlösung abtrennen. Bei der Zyklisierung längerer Peptide ist auch die Anwendung von Grössenausschlusschromatographie (size exclu- sion chromatography, SEC) möglich. Die Aufreinigung ist daher erheblich vereinfacht.
Je nach SH-Gruppen haltiger Substanz bzw. Peptid und eingesetzten Reaktionsbedingungen kann die Reaktionszeit auf unter acht Stunden gesenkt werden (bspw. durch Absenkung des pH-Werts; Wahl eines zusätzlichen Oxidationsmittels). Üblicherweise liegt die Reaktionszeit < = vierundzwanzig Stunden, vorzugsweise unter zwanzig Stunden, besonders bevorzugt unter fünfzehn Stunden und ganz besonders bevorzugt zwischen fünf und zehn Stunden.
Neben den erwähnten EPO mimetischen Peptiden wurden jedoch auch andere Peptide erfolgreich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisiert. So unter anderem an dem von Oxytocin abgeleitetem Peptid, welches im Gegensatz zu Oxytocin eine Carbonsäure am C-Term anstelle eines Amides besitzt:
H-CYIQNCPLG-OH das ebenfalls durch Ausbildung einer intramolekularen Cysteinbrücke zyklisiert vorliegt.
Wie erwähnt, wird die intramolekulare Disulfidbrücke vorzugsweise zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet. Diese können natürlich oder nicht-natürlich sein, einzige Voraussetzung ist die Fähigkeit zur Ausbildung einer Disulfidbrücke durch Reaktion der SH- Gruppe. Cystein ist wohl die bekannteste Disulfidbrücken-ausbildende Aminosäure, die auch in der Natur überwiegend zur Ausbildung von Disulfidbrücken eingesetzt wird. Disulfidbrücken treten in der Natur insbesondere bei der Ausbildung intra- und intermolekularer Disulfidbrücken auf. So bewirken sie bspw. den Zusammenhalt zwischen den einzelnen Polypeptidketten von Proteinen (bspw. Insulin) in Form von intermolekularen Disulfidbrücken und bewirken innerhalb eines Proteins durch Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken regelmäßig eine Stabilisierung der Konformation. Die Proteine sind hier nur als ein Sonderfall SH-funktionalisierter Polymere zu sehen. Auch synthetische Fasern, die SH-Funktionen aufweisen können mit den erfindungsgemäßen Substanzen behandelt und z.B. stabilisiert werden.
Das Keratin der Wolle und des Haares enthält bspw. über 10% Cystein, weswegen dort auch viele Disulfidbrücken vorliegen. Werden diese Disulfidbrücken aufgebrochen (bspw. durch Laugen, Licht, Erwärmung etc.), nimmt die Reißfestigkeit der Fasern stark ab. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch dazu eingesetzt werden, um Disulfidbrücken in Fasern (Natur- und Synthetikfasern) auszubilden. Gleiches gilt für die Behandlung von Haaren, bei denen Disulfidbrücken ebenfalls eine große Bedeutung für die Strukturfestigkeit haben. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich daher auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken in Haaren einsetzen, wodurch auch ein kosmetischer Anwendungsbereich eröffnet wird (bspw. Shampoos, Reagenzien zur Ausbildung von Dauerwellen etc.). So lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise als Mittel zur Schließung der Disulfidbrücken im Rahmen einer Dauerwellenbehandlung einsetzen. Hierzu ist es besonders vorteilhaft, wenn zusätzlich zu der oben näher charakterisierten heterozyklischen Substanz zur Förderung der Disulfidbrückenbildung ein Oxidationsmittel oder die beschriebene Metallverbindung zugegeben wird. Es hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch deutlich beschleunigt werden kann und die Disulfidbrücken entsprechend schneller geschlossen werden. Dies hat zur Folge, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Haaren, die Einwirkzeit und somit auch die Dauer der Behandlung für den Kunden in vorteilhafter Weise verkürzt werden kann. Ein besonders geeignetes Oxidationsmittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG). Die dadurch erzielte Verbesserung der Schließung der Disulfidbrücken in quantitativer als auch zeitlicher Hinsicht, ist anschaulich in den experimentellen Beispielen beschrieben.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen in kosmetischen Zusammensetzungen. Mit diesen kosmetischen Zusammensetzungen können entsprechend die Ausbildung von Disulfidbrücken beispielsweise bei Haaren oder Nägeln gefördert werden.
Die kosmetischen Zubereitungen können neben der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindung geeignete Lösungsmittel sowie in derartigen
Formulierungen übliche Zusätze enthalten. Zu nennen sind beispielsweise Emulgatoren und Coemulgatoren, Tenside, Ölkörper, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische
Pflege und Wirkstoffe wie AHA-Säuren, Fruchtsäuren, Ceramide, Phytantriol, Collagen,
Vitamine und Pro-Vitamine, beispielsweise Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, natürliche und synthetische Lichtschutzmittel, Naturstoffe, Trübungsmittel,
Mikropigmente wie Titanoxid oder Zinkoxid, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse,
Konsistenzgeber, Verdicker, Solubilisatoren, Komplexbildner, Fette, Wachse,
Silikonverbindungen, Hydrotrope, Farbstoffe, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren,
Reflektoren, Proteine und Proteinhydrolysate, Eiweißhydrolisate, Salze, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silikone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive.
Des Weiteren können zur Einstellung der jeweils gewünschten Eigenschaften Polymere enthalten sein.
Zum Schutz der Haare vor Beeinträchtigung durch UV-Strahlung können in den kosmetischen Zubereitungen auch UV-Lichtschutzmittel enthalten sein. Haarkosmetische Zubereitungen umfassen insbesondere Stylingmittel und/oder Konditioniermittel in haarkosmetischen Zubereitungen wie Haarkuren, Haarschäume, Haargele, Haarsprays, Haarlotionen, Haarspülungen, Haarshampoos, Haaremulsionen, Egalisierungsmittel für Dauerwellen, Dauerwellenpräparate, Haarfärbe- und Bleichmittel, Festigerlotions oder ähnliche Produkte. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen Zubereitungen als (Erosol-) Spray, (Erosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion, Milch oder Wachs appliziert werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Mittel um ein Produkt für das Haar, das unter den Haarwaschmitteln und Produkten für das Haar ausgewählt ist, die ausgespült oder nicht ausgespült werden und vor, während oder nach einer Haarwäsche, Färbung, Entfärbung, Dauerwelle oder Entkräuselung aufgetragen werden.
Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Behandlung von Haaren zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Haare mit dem kosmetischen Mittel, enthaltend wenigstens eine der zuvor näher erläuterten heterozyklischen Verbindung in Kontakt gebracht werden und ggf. mit Wasser gespült wird. Die heterozyklische Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den oben eingehend erläuterten Verbindungen und Verbindungsklassen.
Insbesondere wird mit der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken in keratinhaltigen Strukturen zur Verfügung gestellt, bei dem die keratinhaltige Struktur mit wenigstens einer Verbindung behandelt wird, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße
Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
Figure imgf000027_0001
in welcher der Substituent A
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6
Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
Geeignete heterozyklische Verbindungen sind oben beschrieben und sind auch mit dem Verfahren zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen einsetzbar. Wir verweisen daher auf unsere diesbezüglichen Ausführungen. Zudem reichen bereits geringe
Mengen des Disulfidbrücken fördernden Reagenz aus, um die vorteilhafte Wirkung zu erzielen. Hier hat insbesondere das Alloxan sowie ähnlich strukturierte Verbindungen derselben Klasse (siehe oben) eine besonders gute und gleichzeitig schonende Wirkung gezeigt. Die keratinhaltigen Strukturen können bspw. Fasern, wie bspw. Haare sein, oder jedoch die Haut oder Nägel. Ferner kann eine der oben beschriebenen
Metallverbindungen eingesetzt werden, um die Reaktion noch weiter zu beschleunigen.
Sofern das Verfahren zur Verformung von keratinhaltigen Strukturen, wie insbesondere Haaren, eingesetzt wird, ist es vorteilhaft, wenn in einem ersten Schritt zunächst die bestehenden Disulfidbrücken zumindest teilweise geöffnet werden und die Haare dann in die gewünschte Form gebracht werden. Geeignete Substanzen zur Öffnung der Disulfidbrücken sind dem Fachmann bekannt und auch oben im Zusammenhang mit dem Stand der Technik beschrieben. So können insbesondere keratinreduzierende Mercaptoverbindungen, wie zum Beispiel Salze oder Ester von Mercaptocarbonsäuren, verwendet werden. Im Anschluss daran werden dann neue Disulfidbrücken nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geknüpft. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen schonender sind als die herkömmlich eingesetzten Oxidationsmittel, wie bspw. Wasserstoffperoxid. Gemäß einer Ausführungsform weist die heterozyklische, die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernde Verbindung folgende Grundstruktur auf:
Figure imgf000028_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt. ie heterozyklische Verbindung hat vorzugsweise folgende Substruktur:
Figure imgf000029_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder
Arylrest steht oder R4 fehlt;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
Wie ausgeführt sind besonders vorteilhafte Vertreter dieser Gruppe das Alloxan - Monohydrat bzw. Alloxanderivate.
Ferner kann das Verfahren wie dargelegt auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken von synthetischen Substanzen eingesetzt werden, die lediglich entsprechende SH-Gruppen tragende funktionelle Gruppe aufweisen, aber bspw. nicht aus Aminosäuren aufgebaut sind (jedoch bspw. aus einem organischen Polymer).
Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung wird die Abtrennung der die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernden Substanz erheblich erleichtert. Gemäß dieser Idee wird ein Trägerstoff mit der Disulfidbrücken fördernden Substanz beladen. Der Trägerstoff kann bspw. ein (hydrophiles) Harz sein. Die Bindung der Substanz an den Trägerstoff hat zur Folge, dass die Abtrennung der geträgerten Substanz bspw. durch einfaches
Abfiltrieren möglich ist. Daher kann es vorteilhaft sein, in dem obigen Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken Koffein bzw. Koffeinähnliche Substanzen (siehe obige Formeln) einzusetzen, die an einen Trägerstoff gebunden sind, um die Abtrennung zu erleichtern.
Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der Substanz hilfreich. Daher können auch Derivate der die Disulfidbrücken ausbildenden Substanz eingesetzt werden.
Beispiele für geeignete Koffein-Derivate sind:
Theophyllin-8-Buttersäure
Figure imgf000030_0001
und
Theophyllin-7-Essigsäure
Figure imgf000030_0002
Beide Derivate fördern die Ausbildung von Disulfidbrücken und damit auch die Zyklisie- rung von Peptiden in Lösung. Bindet man diese Substanzen über ihre funktionelle Gruppe kovalent an einen geeigneten Trägerstoff, so erhält man ein immobilisiertes Reagenz, das in der Lage ist, das Schließen von Disulfidbrücken zu beschleunigen. Nach der Reaktion kann das Reagenz durch einfaches Abfiltrieren von der Reaktionslösung entfernt werden. Wie anhand dieser Verbindungen deutlich wird, ist es erfindungsgemäß auch möglich, an die verbleibenden Positionen am heterozyklischen Ring auch unabhängig von den Resten R1' bis R3' Reste, wie hier im Falle von 8-(3-Carbo- xypropyl)-1 ,3-dimethylxanthin bspw. eine funktionelle Gruppe als R5' zur Kopplung an die Trägersubstanz, anzuhängen. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Substanzen sind insbesondere in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Metallverbindung besonders geeignet zur Zyklisierung von Peptiden, insbesondere EPO mimetischen Peptiden, durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken.
Solche Disulfidbrücken werden zwischen SH-haltigen Gruppen ausgebildet. Insbesondere natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, die freie SH-Gruppen aufweisen, sind geeignete Disulfidbrückenbildner.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern, können die Substanzen der obigen Formel bspw. zur Behandlung von SH-Gruppen haltigen Substanzen und Materialien eingesetzt werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern. So lassen sich die Substanzen bspw. zur Behandlung von Haaren oder Fasern (Natur- und Synthetikfasern) einsetzten. Dies trifft insbesondere auf cysteinhaltige Fasern zu. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen können bspw. auch in flüssigen Formulierungen (bspw. in Form von Spülungen oder Shampoos oder anderen Mitteln zur Behandlung von Haaren wie bspw. Dauerwellenreagenzien) zum Einsatz kommen. Entsprechende Zusammensetzungen enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße heterozyklische Verbindung werden daher ebenfalls von der Erfindung umfasst. Gemäß einer Ausführungsform weist die heterozyklische, die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernde Verbindung folgende Grundstruktur auf:
Figure imgf000031_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt; - R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein
Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt.
Vorzugsweise weist die heterozyklische Verbindung die folgende Substruktur auf:
Figure imgf000032_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2JnCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt; - R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
Wie ausgeführt sind besonders vorteilhafte Vertreter dieser Gruppe das Alloxan - Monohydrat bzw. Alloxanderivate.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen bzw. Zusammensetzungen enthaltend diese heterogenen Verbindungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken, insbesondere von intra- oder intermolekularen Disulfidbrücken in Peptiden und Proteinen sowie keratinhaltigen Strukturen. Vorzugsweise werden diese Verbindungen in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Metallverbindung eingesetzt.
Für diese Anwendung wird ferner eine entsprechende Zusammensetzung bereitgestellt, aufweisend wenigstens eine erfindungsgemäße heterozyklische Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, sowie vorzugsweise eine erfindungsgemäße Metallverbindung. Weitere Ausführungsformen und vorteilhafte Ausgestaltungen einer entsprechenden Zusammensetzung sind oben im Zusammenhang mit dem Verfahren erläutert worden und gelten auch für die erfindungsgemäße Zusammensetzung.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird gemäß einer Ausführungsform als kosmetische und/oder therapeutische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Haaren oder Nägeln eingesetzt.
Wie oben im Detail erläutert, kann diese Zusammensetzung im Falle von Haaren bspw. zur Haarverformung bzw. Fixierung eingesetzt werden. Zur Behandlung von Nägeln wird die Zusammensetzung vorzugsweise auf den Nagel aufgetragen, um hier die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern und so den Nagel zu härten bzw. zu festigen.
Darüber hinaus wurde überraschender Weise festgestellt, dass die heterozyklischen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Haarwuchs fördernde und stabilisierende Wirkung aufweisen. Ohne auf diese Erläuterung festgelegt zu sein, wird vermutet, dass diese haarwuchsfördernde bzw. stabilisierende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen ebenfalls auf die Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken rückführbar ist.
Bei der Bildung des Haares kommt es nämlich noch während der intradermalen Phase der Bildung des Haarschaftes zur Quervernetzung der Disulfidbrücken. Während der intradermalen Phase bestimmt das Ausmaß der Aushärtung der Keratinmasse den
Widerstand gegen den Proliferationsdruck der die Keratinmasse generierenden basalen Keratinozyten. Im Rahmen der allgemeinen Mechano-Sensitivität der Haut reagieren die basalen Keratinozyten auf Gegendruck mit stärkerer Proliferation, was stabileres Haarwachstum zur Folge hat. Ist der Gegendruck schwächer, schwächt sich auch der Nachschub an Keratinmasse ab, was einen negativen Kreislauf in Gang setzen kann. Im Extremfall kann dies zur Entstehung von schütterem Haar oder Haarausfall (Alopezie) beitragen. Dieser Mechanismus wird - als negativer Loop - deutlich, z.b. bei der sogenannten „Traction Alopecia" oder Traktions-Alopezie. Hier kommt es durch chronischen Zug am Haar unter häufig unphysiologischer Belastung (Einflechtung von Gegenständen, Zug durch Gummibänder oder Flechtstrukturen des Haares) lokal zur dauerhaften Verminderung des Gegendruckes auf die proliferierenden Keratinozytenschicht; dies führt zu einem fokalen Haarausfall.
Die Disulfidbrücken-schließenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen greifen vermutlich in dieses wachstumsregulierende Wechselspiel ein, indem sie die frühe Aushärtung des Haarschaftes fördern und damit einen besseren Gegendruck ermöglichen, was das Haarwachstum fördert. Daher ist die Behandlung des Haares und der von außen leicht erreichbaren intradermalen Abschnitte des Haares mit den erfindungsgemäßen Substanzen - auch ohne dass bereits die Absicht der Verformung wie zuvor beschrieben besteht - dazu geeignet, dem vorzeitigen Haarausfall vorzubeugen bzw. ihn zu minimieren. Die erfindungsgemäßen Substanzen besitzen auf dem Wege der stabilen Disulfidquervernetzung auch eine den Haarwuchs fördernde und stabilisierende Wirkung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher in geeigneten externen kosmetischen oder therapeutischen Zubereitungen eingesetzt werden, um dem Haarausfall, z.b. der sogenannten androgenetischen Alopezie, entgegenzuwirken bzw. das Haarwachstum zu fördern und zu stabilisieren.
Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch auf die Haut aufgetragen werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken in den keratinhaltigen Hautschichten zu fördern. Dies ist insbesondere vorteilhaft zur Behandlung von Hautkrankheiten oder Symptomen von Hautkrankheiten, die mit einer Schwächung der Keratinstruktur einhergehen, wie bspw. die Hypokeratose oder die Epidermolyse.
Augrund der katalytischen Wirkung der erfindungsgemäß charakterisierten heterozyklischen Verbindungen auf die Ausbildung von Disulfidbrücken können diese bspw. auch zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken eingesetzt werden. Sie können daher zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen synthetischen oder natürlichen oder modifizierten natürlichen Molekülen dienen. Sie können daher bei der Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken für die Wirkstoffsuche Anwendung finden. Bei dynamischen kombinatorischen Bibliotheken werden die einzelnen Einheiten oftmals über Disulfidbrücken zu Makromolekülen vernetzt (siehe Fig. 15). Einzelheiten zu den Bibliotheken sind bspw. in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, J. Amer. Chem. Soc, 2000, 122, 12063-12064"; „Selection and amplification of hosts from dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, Science, 2002, 297, 590-593"; "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Ramström, Lehn. Nat Rev Drug Discov. 2002" und WO01 /64605 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachfolgend anhand einiger Beispiele verdeutlicht werden. Als Beispiele für die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierbaren Peptide wurden EPO mimetische Peptide und Oxytocin gewählt.
Fig. 1
Gezeigt ist der Reaktionsverlauf der Zyklisierung eines EPO-mimetischen Peptids der folgenden Sequenz
GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (BB57)
(0,7 mg/ml) zu dem entsprechenden zyklisierten Produkt in Anwesenheit von Koffein (0,3 mg/ml) mit Luft in Wasser bei Raumtemperatur. Wie die Kurve deutlich zeigt, nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zu, was einen autokatalytischen Mechanismus der Reaktion nahe legt. Die Abkürzung Am steht allgemein für eine Amidierung.
Fig. 2 Gezeigt ist die Zyklisierung desselben Peptids wie in Fig. 1 (0,7 mg/ml) zu seiner zyklisierten Form in Abwesenheit von Koffein. Wie deutlich erkennbar ist, ist die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich herabgesetzt.
Im Falle von EPO-mimetischen Peptiden hat sich eine optimale Konzentration von Koffein in einem Bereich von 0,075 bis 0,15 mg/ml ergeben. Der Umsatz ist bereits nach zehn Stunden quantitativ.
Fig. 3
Dargestellt ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Umsetzung des in Fig. 1 ge- zeigten EPO-mimetischen Peptids von der Koffeinkonzentration. Wie dargestellt, sind sehr gute Ergebnisse in einem Konzentrationsbereich von 0,03 mg/ml bis 0,3 mg/ml erzielbar. Die optimalen Werte liegen in einem Bereich von 0,06 mg/ml bzw. 0.075 und 0,15 mg/ml. Fig. 4
Dargestellt ist die Abhängigkeit der Zyklisierungsgeschwindigkeit vom pH-Wert. Wie deutlich erkennbar ist, ist der autokatalytische Verlauf der Reaktion nicht auf eine Änderung des pH-Werts zurückzuführen, da dieser Effekt auch in den dargestellten gepuf- ferten Lösungen (Phosphatpuffer, pH 6 bis 9) auftritt. Jedoch hat sich gezeigt, dass die Ausbeute an zyklisierten Peptid bei höheren pH-Werten sinkt. Ferner hat sich überraschender gezeigt, dass die Reaktion schneller verläuft, je niedriger der pH-Wert der Lösung ist. Daher ist ein niedrigerer pH-Wert von unter 7 und vorzugsweise < = 6,5 bevorzugt.
Fig. 5
Dargestellt ist der Einfluss des milden Oxidationsmittels Glutathion (oxidierte Form) auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Hier fand die Umsetzung des in Fig. 1 dargestellten Peptids (0,7 mg/ml H2O) in Anwesenheit von 0,1 mg/ml (0,5 Äquivalente) Glutathion, oxidierte Form (GSSG) und Koffein (0,3 mg/ml) statt. Innerhalb von fünf bis sechs Stunden war die Reaktion bereits vollendet. Die Umsetzung des Peptids nur mit GSSG (in Abwesenheit von Koffein) erfolgt nur langsam. Ferner hat sich gezeigt, dass unerwünschte Nebenprodukte entstehen (s. Abb. 6).
Fig. 6
Dargestellt sind Chromatogramme, die jeweils nach einer Stunde Reaktion aufgezeichnet wurden und die die Umsetzung des eingesetzten EPO-mimetischen Peptids mit 0,5 äquivalenten GSSG belegen.
Fig. 7
Dargestellt ist eine tabellarische Übersicht, die das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik bekannten Methoden vergleicht. Die getesteten Peptide wiesen folgende Sequenz auf:
EMP1 : Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Am APG1 : Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am APG2: Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am
Die in wϊro-Experimente zeigten eine vergleichbare Aktivität der Peptide, die nach den verschiedenen Methoden zyklisiert wurden. Die erfindungsgemäße Methode zeichnet sich jedoch durch bessere Ausbeuten sowie Reinheiten im Verhältnis zu den anderen getesteten Zyklisierungsmethoden aus, wie Fig. 7 anschaulich belegt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass das eingesetzte Zyklisie- rungsreagenz auf einfache Weise durch HPLC abgetrennt werden kann. Weitere Beispiele von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierten EPO-mi- metischen Peptiden sind nachfolgend aufgeführt:
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-Am (APG3) Ac-C(Mob)-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-Am (APG4)
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (APG5) (Sama)-GGTYSCHFGKLT-Nai -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am (APG6)
Fig. 8 Gezeigt ist die Zyklisierung von dimeren EPO mimetischen Peptiden. Die Zyklisierung von di- oder multimeren Peptiden erfolgt vorzugsweise in mehreren Schritten. Fig. 8 zeigt das Syntheseschema anhand eines bivalenten (dimeren) EPO-mimetischen Peptids, das in 2 Schritten durch Ausbildung von zwei intramolekularen Disulfidbrücken zyklisiert wird. Nach diesem Verfahren wird die erste Disulfidbrücke nach dem erfin- dungsgemäßen Verfahren ausgebildet. Die zweite intramolekulare Disulfidbrücke wurde unter Einsatz einer optimierten lod-Oxidation durchgeführt. Zur Kupplung der Peptide an einen polymeren Carrier wurden ferner teilweise weitere Cystein-Reste ins Molekül eingebracht. Dieses Cystein wurde durch geeignete Schutzgruppen tBu or Mob) geschützt.
Die erste erfindungsgemäße Zyklisierung unter Einsatz von Koffein wird vorzugsweise bei pH 6 durchgeführt, während die zweite Zyklisierung gemäß dem gezeigten Beispiel in 80% Essigsäure erfolgte. Die Ausbeute der Synthese lag typischer Weise zwischen 60 und 90%.
Fig. 9
Einige der EPO mimetischen Peptide lassen sich nur sehr schwer zyklisieren. Ein Beispiel dafür ist das folgende Peptid:
Ac - GGTYSCHFG- Har- LT- l -Nal -VCK-Aad-Q-Aad- G-NH2
Har=Homoarginin
Aad = 2-Aminoadipinsäure, "Homoglutaminsäure" NaI: Naphtylalanin
Bei dieser Sequenz hat sich gezeigt, dass die Erhöhung der Konzentration an Zyklisie- rungsreagenz von Vorteil ist. So war die Zyklisierung mit 10mg/ml Koffein innerhalb von 24h erfolgreich. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die Ausbeute lag nach ca. 21 h in Lösung bereits bei > 90%. Fig. 10 bis 12
Neben EPO mimetischen Peptiden wurde auch ein von Oxytocin abgeleitetes, reduziertes Peptid mit Koffein bzw. der Koffein-ähnlichen Substanz (siehe obige Formel) zyklisiert.
Bei der Reaktionsdurchführung wurde Oxytocin, reduziert (OyxR), Rohprodukt, in Wasser (bzw. H2O/ACN/TFA) gelöst und mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein (und evtl. GSSG) an der Luft stehen gelassen. Der Reaktionsansatz wurde per HPLC in regelmäßigen Abständen vermessen, um die Gehalte an OxyR und dem Produkt Oxytocin (Oxy) zu bestimmen.
Die in Fig. 10 bis 12 gezeigten Tabellen und die dazugehörige Graphik geben eine zusammenfassende Übersicht über die Ergebnisse.
Erkennbar ist, dass die Produktausbeute mit der Peptidkonzentration korreliert. Geringere Peptidmengen führen bei Oxytocin zu besseren Ergebnissen.
Die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz von OxyR korreliert mit der Konzentra- tion an Koffein in der Reaktionslösung. Bis zu einer Konzentration von 0.5mg/ml Koffein gilt je mehr Koffein, desto schneller läuft die Oxidation ab. Die Peptidkonzentration hat nur einen untergeordneten Einfluss auf die Dauer der Reaktion.
GSSG scheint keinen Einfluss auf Geschwindigkeit oder Ausbeute zu haben.
OxyR, HPLC gereinigt, cyclisiert schon spontan „recht" schnell. Die Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich mit Koffein jedoch nochmals deutlich verkürzen. Geringe Mengen ACN/TFA haben geringen Einfluss auf die Ausbeute, die Reaktionszeit wird etwas verlängert.
Fig. 13 und 14
Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Peptids BB57 mit der Substanz Minoxidil:
Figure imgf000038_0001
Dazu wurden 0,7mg BB57 und 0,3mg Minoxidil (6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin 3- oxid, Minox) in 1ml destilliertem Wasser gelöst und an der Luft stehen gelassen. Der Umsatz von BB57 zu oxidiertem BB57C wurde mit HPLC (UV-Detektion bei 216nm) beobachtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt.
Wie Fig. 13 zeigt, ist die Oxidation in Anwesenheit von Minoxidil nach ca. 29h abge- schlössen (bei einer Vergleichsmessung mit Koffein sind es ca. 24h). Minoxidil hat als weiterer Vertreter der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen daher ebenfalls eine positive Wirkung auf die Ausbildung von Disulfidbrücken. Die Ausbeute in Lösung der Minoxidil-katalysierten Reaktion liegt über 95%. Daß es sich bei der Reaktion um eine katalytisch ablaufende Reaktion handelt, zeigt sich dadurch, daß die Konzentration von Minoxidil bei der Reaktion praktisch nicht abnimmt (Abnahme ≤ 2% bei 4.4 eq Minoxidil bezogen auf BB57, siehe Fig. 14).
Fig. 15
Gezeigt sind mögliche Verknüpfungsstrategien über Disulfidbrücken zur Erzeugung vernetzter Makromoleküle. Derartige Bausteine finden oft in dynamischen kombinatorischen Bibliotheken Anwendung.
Fig. 16
Ferner wurden Versuche durchgeführt, um zu demonstrieren, dass Haare, welche zuvor im Sinne einer Dauerwellenbehandlung reduziert wurden, sich mit einer Kombination der erfindungsgemäßen Substanz (hier Koffein) und einem zusätzlichen
Oxidationsmittel (hier oxidiertes Glutathion-GSSG) in Anwesenheit von Luft beschleunigt oxidativ schließen. Damit lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise auch im kosmetischen Bereich und insbesondere im Friseurbereich zur Behandlung von Haaren anwenden.
Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:
Je 5-6 mg Haare werden mit 400μl einer 10%gen Lösung einer Ammoniumthioglykolat- haltigen „Well-Lotion" (Produkt „Poly Lock - starke Dauerwelle", Schwarzkopf & Henkel,
Germany) 0,5h bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird entfernt und das Haar anschließend 6mal mit je 400μl H2O gewaschen. Je eine dieser so behandelten
Haarproben wird a) in H2O, bzw. einer wässrigen Lösung von b) 10mg/ml Koffein, c)
5mg/ml GSSG in H2O und d) 10mg/ml Koffein und 5mg/ml GSSG bei Raumtemperatur über 3 Tage behandelt.
Zur Bestimmung der freien, noch verbliebenen Thiolgruppen werden die Haare nach Abtrennung der Reaktionslösung mit Ellmansreagenz (5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure), DTNB) umgesetzt. Als zusätzliche Referenzproben dienen unbehandeltes Haar sowie reduziertes Haar, welches ansonsten keiner weiteren Behandlung unterworfen wurde. Die Haarproben werden dazu mit je 200μl eines 10OmM Phosphatpuffers, pH 8.0 und 1mM EDTA, und 300 μl einer 1 mM DTNB-Lösung in demselben EDTA-haltigen Puffer gegeben. Die Lösung wird nach einigen Minuten in einem UV-Vis-Spektrometer vermessen.
Die UV-Vis-Spektren der Proben zeigen, dass die Reduktion der Haare durch die Behandlung mit der Ammoniumthiolglykolathaltigen „Well-Lotion" erfolgreich war (siehe Abb. 29, Kurven e und f, die einmal unbehandelte und einmal reduzierte Haare zeigen). Dies kann man daran erkennen, dass die Bande bei 412nm - ein Maß für die Zahl freier Thiolgruppen - am größten ist. Eine Behandlung in Anwesenheit von Luft mit a) H2O, b), mit einer koffeinhaltigen Lösung, c) der GSSG-haltigen Lösung führt jeweils nur zu einer teilweisen Oxidation der Thiolgruppen. Jedoch lässt sich bereits hier erkennen, dass das Koffein einen positiven Einfluss auf die Schließung der Disulfidbrücken hat. Die Kombination d) aus Koffein und dem Oxidationsmittel GSSG führte jedoch zu einer nahezu quantitativen Oxidation der Thiolgruppen bei Haaren. Dieser Versuch belegt daher, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Schließung von Disulfidbrücken auch erfolgreich an Haaren eingesetzt werden kann.
Fig. 17 bis 39
Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Referenzpeptids BB57 mit verschiedenen Substanzen, die erfindungsgemäß die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern können.
Die Versuche wurden wie zuvor dargelegt durchgeführt (siehe oben). Die getestete Substanz sowie die getesteten Mengen sind jeweils angegeben.
Die nachfolgenden Fig. 40 bis 59 belegen den verstärkenden Effekt des metallhaltigen Zusatzes. Die Aktivitäten der Zusatzstoffe wurden wiederum anhand der Zyklisierung der folgenden Beispielsubstanz BB57, eines Epo-mimetischen Peptides, welches 2 freie Cysteine enthält
GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am untersucht.
Dabei wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke verfolgt. Der Reaktionsverlauf wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden verfolgt. Im Falle einer längeren Reaktionsdauer über mindestens 3 Stunden mittels RP-HPLC oder im Falle schnellerer Reaktionenzeit über den so genannten Ellmans-Test (Monitoren der freien Cysteine im Edukt) mittels UV/VIS-Spektroskopie. Als Referenz ist jeweils der Reaktionsverlauf der Katalyse mit der Substanz Koffein abgebildet. Dazu wurden 0,7mg/ml BB57 mit 0,3mg/ml Koffein versetzt und die Abnahme an Edukt sowie die Zunahme an Produkt mittels HPLC verfolgt.
Fig. 40 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein. Ein vollständiger Umsatz erfolgte nach ca. 15h. Diese Reaktion kann überraschenderweise durch die Kombination mit Eisen(ll)salzen noch weiter beschleunigt werden. Bei geringer Zugabe von Eisen(ll)sulfat (3μM) verkürzte sich die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz auf etwa 10h. Die Ergebnisse sind in Fig. 41 gezeigt. Es traten direkt zu Beginn im HPLC Chromatogramm Intermediate auf, die sich jedoch im weiteren Reaktionsverlauf in das Produkt umwandelten.
Durch Zugabe von einer leicht größeren Menge (30μM) Metallsalz zu einer Lösung aus 0,7mg/ml Peptid und 0,3mg/ml Koffein konnte die Beschleunigung noch weiter verstärkt werden. In den folgenden Beispielen sind die Effekt der Metallionen aus Eisen(ll)sulfat, Eisen(lll)chlorid und Cu(ll)sulfat zu sehen.
Fig. 42 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von Eisen(ll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit durch Koffein wird mit Eisen(ll) auf etwa eine Stunde verkürzt.
Fig. 43 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von verschiedenen Eisen(lll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte wieder mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit durch Koffein wird auch mit Eisen(lll)-salzen auf etwa eine Stunde verkürzt.
Fig. 44 zeigt Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von Kupfer(ll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte wieder mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit wird auch durch die Zugabe von Kupfersalzen verkürzt.
Fig. 45 zeigt die Oxidation von BB57 mit und ohne Fe(ll)salz, Eisen(ll)sulfat (3μM), verfolgt mittels des Ellmans-Tests. Das Steigerungspotential wird hier durch das Beispiel mit der Substanz Alloxan-monohydrat noch weiter verdeutlicht. Mit Alloxan (5μg/ml) werden 0,66mg/ml BB57 innerhalb von etwa 2h nahezu vollständig cyclisiert. Durch die Zugabe von Eisen(ll)ionen in Form von Eisen(ll)sulfat (3μM) kann diese Reaktionszeit auf unter eine Stunde verkürzt werden.
Eine Vergleichsmessung alleine mit Eisen(ll)sulfat (30μM) ergab keinerlei Aktivität hinsichtlich einer beschleunigenden Wirkung auf die Cyclisierung von BB57. Nur die Kombination der hetrocyclischen Substanzen mit den Metallionen ergibt den beschriebenen Beschleunigungseffekt. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in Fig. 46 gezeigt.
Fig. 47 zeigt die Beschleunigung der Oxidation von BB57 mit Alloxan und der Zugabe von Eisen(lll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte mittels Ellmans-Test. Wie auch zuvor bei Koffein gezeigt, wird durch Eisen(lll)ionen auch ein Beschleunigungseffekt in Kombination mit Alloxan vermessen.
Wenn die Reaktion nicht wie bei allen anderen beschriebenen Beispielen in deionisiertem Wasser, sondern in Leitungswasser durchgeführt wird, kommt es zu einem ähnlichen Beschleunigungseffekt. Es reichen folglich also Spuren von Ionen aus, um diese zusätzliche Beschleunigung zu erzielen, sofern die lonenkonzentration im Wasser ausreichend hoch ist (Trinkwasseranalytik gemäß Firma Enwor, Kreis Aachen). Die Ergebnisse der Beschleunigung der Oxidation von BB57 mit Alloxan in Leitungswasser sind in Fig. 48 gezeigt. Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans- Tests.
Auch die Ionen weiterer Übergangsmetalle zeigen einen verstärkenden Effekt. In den nachfolgenden Beispielen wurden die Effekte der Salze Kupfer(ll)sulfat, Chrom(lll)chlorid, Mangan(ll)sulfat, Kobalt(ll)chlorid, Nickel(ll)chlorid, Zink(ll)sulfat, Magnesium(ll)sulfat und Calcium(ll)chlorid auf die Beschleunigung der Oxidation von BB57 durch Alloxan, bzw. Koffein verfolgt. Ein besonders starker Effekt ist bei den Eisen(ll)- und Eisen(lll)-salzen zu beobachten.
Fig. 49 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Kobalt(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Fig. 50 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Nickel(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Fig. 51 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Zink(ll)sulfat. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Fig. 52 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Mangan(ll)sulfat. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Fig. 53 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Chrom(lll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz. Fig. 54 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Calcium(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Fig. 55 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Magnesium(ll)chlorid. Monitoring über Ellmans Reagenz.
Fig. 56 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und der Metallionen von Silber(l)nitrat. Monitoring über Ellmans Reagenz.
Stabile Metallionenkomplexe haben ebenfalls eine beschleunigende Wirkung, wie am Beispiel von Kaliumhexacyanoferrat in den folgenden beiden Beispielen gezeigt werden konnte.
Fig. 57 und 58 zeigen die Cyclisierung von BB57 mit Alloxan sowie Alloxan in Kombination mit Kaliumhexacyanoferrat(ll) oder Kaliumhexacyanoferrat(lll) (30μM). Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
Durch die Zugabe von Ethylendiamintetraacetat, EDTA, als Komplexbildner wird der starke Effekt der Eisenionen leicht abgeschwächt. Dennoch verbleibt ein starker Beschleunigungseffekt. Fig. 59 zeigt die Cyclisierung von BB57 mit Alloxan in Kombination mit Eisenionen (3μM) mit und ohne 2 Äquivalenten EDTA. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.
In Versuchen an menschlichen Haaren wurden ferner die oxidativen Eigenschaften der vorgestellten Kombinationen aus heterocylischen Verbindungen, am Beispiel von
Koffein und Alloxan, mit Eisenionen gezielt untersucht. Dazu wurden für jeden
Messpunkt bei 5mg Haaren zuerst die Disulfidbrücken mit Ammoniumthioglykolat/
Ammoniumthiolactat (handelsübliche Formulierung für Dauerwellen) reduziert, um diese zu öffnen. Anschließend wird die Reduktionslösung entfernt und die Haare wurden mehrfach mit Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Haare den verschiedenen
Oxidationsmischungen ausgesetzt, um die Disulfidbrücken erneut zu schließen. Nach
Abfiltrierung dieser Lösungen wurde der Gehalt an Thiolgruppen mittels des Ellmans-
Reagenz bestimmt. Dadurch kann eine Aussage über die Geschwindigkeit und Effizient des Oxidationsschrittes und damit der erneuten Schließung der Disulfidbrücken getroffen werden.
Anhand der anfolgenden Beispiele wurde die besondere Effektivität der heterocyclischen Reaktionsbeschleuniger in Kombination mit der erfindungsgemässen metallhaltigen Verbindung gezeigt. In einigen Versuchen werden anstelle größerer Mengen einer einzelnen Salzkomponente, auch Kombinationen verschiedener Metallzusätze verwendet. Die Gehalte in der nachfolgend beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser" basiert auf den Maximalwerten aus der Trinkwasserverordnung der BRD, wobei die folgende Kombination von Metallionen verwendet wurde: 0,2mg/L Eisen (Fe3+), 5mg/L Zink (Zn2+), 2mg/L Kupfer (Cu2+) und einigen Härtekomponenten 100mg/L Calcium (Ca2+) und 50mg/L Magnesium (Mg2+).
Fig. 60 zeigt die Oxidation von Haaren mit Koffein, Koffein mit Eisen(lll)chlorid und Koffein mit der zuvor beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser". Bei dem gegenüber Alloxan schwächeren Katalysator Koffein ist der Einfluss der Salzzugabe auf die Reaktion innerhalb der ersten 10 Minuten zu sehen.
Fig. 61 zeigt die Oxidation von Haaren mit Alloxan, Alloxan mit Eisen(lll)chlorid und Alloxan mit der zuvor beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser". Bei der Oxidation mit Alloxan und den Zusätzen Eisen(lll)clorid und künstlichem Trinkwasser ist bei der Kontrolle nach 10 Minuten ein geringerer Vorteil durch die Salzzugaben zu sehen, was die außerordentlichen Eigenschaften des Alloxans auf keratinhaltige Strukturen belegt.
Fig. 62 zeigt die Oxidation von reduziertem Haar mit Koffein bzw. Alloxan jeweils in Kombination mit einer Mischung aus Salzen, die dem maximalen Gehalt in Trinkwasser entsprechen. Der Monitoring-Vergleich von Koffein und Alloxan an Haaren zeigt, dass beiden Reagentien in Kombination mit künstlichem Trinkwasser das Haar vollständig oxidieren, allerdings braucht die Reaktion mit Koffein länger.
Fig. 63 zeigt die Oxidation von reduziertem Haar mit verschiedenen Mengen Alloxan in Kombination mit unterschiedlichen Mengen an Eisen(lll)ionen. Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans-Reagenz. Dieses Beispiel mit unterschiedlichen Mengen Alloxan und Eisen(lll)chlorid zeigt, dass geringe Mengen Alloxan, eine 0,1%ige Lösung in Kombination mit geringen Mengen Eisenionen ausreicht, um nach 10 Minuten eine nahezu vollständige Rückoxidation der Thiole im Haar zu erreichen. Diese geringen Mengen sind besonders vorteilhaft, da dadurch die Struktur des Haares wenig belastet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher schonender als herkömmliche Verfahren, die bspw. auf Basis von Wasserstoffperoxid arbeiten.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine
Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem
Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
Figure imgf000045_0001
in welcher der Substituent A für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine
Metallverbindung zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Metallverbindung eine Metallionen freisetzende oder enthaltende Verbindung ist, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe von Metallsalzen, Metallsalzkomplexen und löslichen Metallverbindungen.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der Kupfer(ll)salze, Chrom(lll)salze, Mangan(ll)salze, Kobalt(ll)salze, Nickel(ll)salze, Zink(ll)salze, Magnesium(ll)salze, Calcium(ll)salze sowie Eisen(ll)- und Eisen(lll)salze.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur aufweist
Figure imgf000046_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe
(=0) darstellt;
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich
Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine
Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere
Substituenten trägt, oder R6 fehlt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Substruktur enthält
Figure imgf000047_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Uracilderivat der folgenden allgemeinen Formel darstellt:
Figure imgf000048_0001
wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um Purinderivate handelt, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht
Figure imgf000048_0002
in der der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und in welcher die Substituenten
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder C10-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenen- falls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest stehen;
R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich
Wasserstoff oder C1- bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C3-Alkyl, stehen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass R2 und R3 zusammen einen Sechsring bilden, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Grundstruktur aufweist:
Figure imgf000049_0001
wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können,
R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O) darstellt; R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-
Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Cr bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;
R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) steht oder R5 fehlt;
R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten C1 bis C6-
Alkylrest stehen;
R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine
Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A aufweist, der
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto;
bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Cr bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie
Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto;
insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3- Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist;
steht.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch ge- kennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-2-Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-Hydrochlorid, Uracil-6- carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6-hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6- Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion, 7-Hydroxy-5- methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat,
Alloxanderivate und Violursäure, Uracil, 1-Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7- Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure, 3-lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3- Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin, Alloxazin, Minoxidil und Aminexil.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine intramolekulare Disulfidbrücke in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden, Proteinen oder keratinhaltigen Strukturen, ausgebildet wird, wobei die Reaktion in einem wässrigen Medium durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine intramolekulare Disulfidbrücken zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet wird, die eine SH-Gruppe aufweisen, vorzugsweise zwischen zwei Cysteinresten.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsgemisch ein Oxidationsmittel, vorzugsweise Glutathion in oxidierter Form, zugegeben wird.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide eine Länge zwischen 5 und 100, 5 und 50 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 10 und 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.
17. Verwendung wenigstens einer heterozyklischen Verbindung wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung zur Zyklisierung von Peptiden und/oder Proteinen eingesetzt wird, wobei die Peptide vorzugsweise eine Länge zwischen 5 und 250, 5 und 100, 5 und 50, vorzugsweise 10 bis 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 in Kombination mit einer Metallverbindung wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.
20. Verwendung nach einem oder mehren der Ansprüche 17 bis 19 zur Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen wenigstens zwei SH-Gruppen tragenden Aminosäuren.
21. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 17 bis 20 zur Behand- lung von SH-Gruppen tragenden Substanzen, Strukturen und Produkten zur
Ausbildung von Disulfidbrücken.
22. Verwendung nach Anspruch 21 zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Nägeln, Haaren und Fasern, insbesondere cysteinhaltigen Fasern.
23. Verwendung einer heterozyklischen Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert, zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken.
24. Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken in keratinhaltigen Strukturen, wobei die keratinhaltige Struktur mit wenigstens einer Verbindung in Kontakt gebracht wird, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a. eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
b. eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
Figure imgf000053_0001
in welcher der Substituent A
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6
Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Metallverbindung eingesetzt wird, wie sie in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert ist.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine heterozyklische Verbindung wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 12 definiert ist, eingesetzt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26 zur Behandlung von Haaren, aufweisend die folgenden Schritte:
Öffnung der bestehenden Disulfidbrücken Optional Spülen der Haare Formgebung der Haare - Ausbildung neuer Disulfidbrücken durch Einsatz wenigstens einer heterozyklischen Verbindung, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert ist; Optional Spülen der Haare.
28. Zusammensetzung, enthaltend wenigstens eine Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a. eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem
Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
b. eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
Figure imgf000054_0001
in welcher der Substituent A
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie
Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Metallverbindung aufweist, wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.
30. Zusammensetzung gemäß Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine heterozyklische Verbindung aufweist, wie sie in den Ansprüchen 5 bis 12 definiert ist.
31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung folgende Grundstruktur aufweist:
Figure imgf000055_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei,
Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt; - R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein
Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt.
32. Zusammensetzung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung folgende Substruktur enthält
Figure imgf000056_0001
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt; - R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass Alloxan- Monohydrat oder ein Alloxanderivat als heterozyklische Verbindung eingesetzt wird.
34. Verwendung einer Zusammensetzung zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung wenigstens eine heterozyklische Verbindung aufweist, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert ist und/oder eine Zusammensetzung ist, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 28 bis 33 definiert ist.
35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zusätzlich wenigstens eine Metallverbindung, wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist, aufweist.
36. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine kosmetische und/oder therapeutische
Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Haaren oder Nägeln ist.
37. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 28 bis 33 zur Herstellung eines kosmetischen und/oder therapeutischen Präparats zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen, wie insbesondere der Haut und Hautanhangsgebilden wie Haaren und Nägeln.
38. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat zur Stabilisierung von keratinhaltigen Strukturen durch Ausbildung von
Disulfidbrücken eingesetzt wird.
39. Verwendung nach Anspruch 37 oder 38 zur Herstellung eines kosmetischen und/oder therapeutischen Präparats zur Behandlung von schütterem Haar, Haarausfall, zur Förderung des Haarwachstums und/oder zur Stabilisierung und
Kräftigung des Haares.
40. Verwendung nach Anspruch 37 oder 38 zur Herstellung eines therapeutischen Präparats zur Behandlung von Hautkrankheiten oder Symptomen von Hautkrankheiten, die mit einer Schwächung der Keratinstruktur einhergehen, insbesondere der Hypokeratose oder der Epidermolyse.
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