KR20030081315A

KR20030081315A - 화학적으로 합성한 폴리펩티드의 폴딩 방법

Info

Publication number: KR20030081315A
Application number: KR10-2003-7004957A
Authority: KR
Inventors: 베르디니안토니오; 코라딘지암피에트로; 로게로마리오
Original assignee: 알엠에프 딕타진 에세.아.
Priority date: 2000-11-27
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2003-10-17
Also published as: MXPA03003576A; ES2261509T3; EP1337549B1; AU2960302A; NO20032356L; NZ523679A; CN1249078C; ES2261509T4; DK1337549T3; HUP0302395A3; CU23034A3; AU2002229603B2; EP1337549A2; CN1830999A; DE60118598D1; DE60118598T2; NO20032356D0; HUP0302395A2; US20020082384A1; CA2416054A1

Abstract

본 발명은 2개 이상의 유도된 시스테인 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 및/또는 단백질을 예정된 pH와 온도를 갖는 폴딩 완충제 중에서 환원제로 처리하여서 이루어지는 화학적으로 합성한 폴리펩티드의 폴딩 방법을 제공한다.

Description

화학적으로 합성한 폴리펩티드의 폴딩 방법{Process for Folding Chemically Synthesized Polypeptides}

지난 10년 동안, 표준 Boc/Bzl 접근에 기초한 고체상 펩티드 합성(SPPS)의 매우 최적화된 방법들에 의해 제조된 99개 잔기 효소인, 충분한 활성을 가진 HIV-프로테아제의 성공적인 화학적 합성후 합성 단백질의 수요가 점증되어 왔었다.

76개의 아미노산 잔기로 이루어지는 작은 단백질인 결정상 우비퀴틴 (ubiquitin)의 합성(1994년)은, Boc/Bzl 방법보다 화학적으로 덜 복잡하고 조작이 더 단순한 방법인 Fmoc/t-bu 프로토콜에 기초한 SPPS에 의해 고도로 순수한 단백질이 합성될 수 있다는 것을 추가로 입증하였다.

2000년 현재, 60 내지 100개 사이의 아미노산 잔기를 함유하는 단일한 도메인(domain)의 단백질이, 펩티드 합성기의 도움으로 화학적 합성에 의하여, 구조적 및 기능적 연구를 하기에 충분한 양으로, 신속하고, 신빙성 있게, 경제적으로 생산될 수 있다는 중요한 실험적 증거가 있다.

화학적 합성에 의해 제조된, 이중황화물 다리(disulfide bridges)를 함유하는 단백질은, 일단 폴딩되면 자연적인 형태와 유전공학적으로 조작된 형태가 동일한 특성을 가진다. 단백질의 이중황화물 다리는 단일 또는 다중 분자내(intra) 및/또는 분자간(inter) 환형 구조(cyclic structure)를 형성하며, 이 구조는 분자에 구조적인 제한을 상당히 부여하므로 생물 활성 구조의 안정화에 결정적으로 기여한다.

공지 구조를 가진 폴딩된 단일 도메인 단백질들은 시스테인 잔기의 위치 선택적인 패어링(pairing)에 의해 제조될 수 있다. 통상 사용되는 보호 기구와 양립할 수 있는 시스테인 보호기들의 여러가지 조합은 단계적이며 패어링하는 방식으로 탈보호(deprotection) 및/또는 완전히 선택성을 갖는 시스테인 잔기의 공산화 (cooxidation)를 허용하도록 개발되었다.

그러나, 다중 시스테인 잔기를 함유하는 단백질에서 시스테인 잔기의 위치 선택적인 패어링(pairing)에 관여하는 화학이 어떻게 요구하고 있는가에 대한 증거는 최근 인슐린 유사 펩티드인 인간 릴렉신(relaxin)의 합성이다. A 사슬 전구체의 합성은 SPPS 법, Fmoc/t-Bu 접근법 및, p-알콕시벤질 알콜계 수지를 사용하여 행하였고, 반면에 B 사슬 전구체는 Boc/Bzl 접근법에 따라 PAM 수지(폴리스티렌계 수지에 4-카르복실아미도메틸벤질 에스테르 결합)를 사용하여 제조하였다. A 사슬 전구체의 4개의 시스테인 잔기 중에서, 둘은 S-Trt(S-트리페닐메틸) 유도체로서 보호되었고, 다른 것들은 S-Acm(S-아세트아미도메틸) 및 S-Meb(S-p-메틸벤질)로서 각각 보호되었다. B 사슬 전구체의 2개의 시스테인은 S-Acm 및 S-Meb 보호기에 의하여보호되었다. A 사슬의 분자내 S-S 다리는 처음에 AcOH 중에서 요오드 산화에 의해 얻어졌다. 이어서, A 사슬과 B 사슬을 연결하는 2개의 분자간 이황화물 다리는 2 단계로 얻어지는데, 즉, 첫번째 단계에서는, S-Meb 보호기의 HF 데블로킹에 의해 얻어진 A 사슬 전구체의 유리 티올을 B 사슬의 활성화 시스테인(Npys)(S-3-니트로-2-피리딘 설페닐) 잔기(분자간 이종 이황화물 형성을 유도하는)와 반응시키고, 두번째 단계에서는, S-Acm 기들을 요오드로 공산화적으로 제거함으로서 나머지 S-S 다리가 얻어졌다.

SPPS 프로토콜은 화학적 합성에 의해, 동일한 블로킹(보호)기로 보호된 시스테인 잔기를 함유한 여러가지 폴리펩티드를 제조할 가능성을 제공한다. 일단 보호기가 다수의 산화제들에 의해 제거되면, 이황화물 결합이 즉시 형성된다. S-Trt 또는 S-Acm 보호 시스테인을 함유하는 폴리펩티드 및/또는 단백질은, 산화 민감성 티로신, 메티오닌, 트립토판의 수식을 최소화하고, 시스테인 티올이 대응하는 술폰산으로 과도하게 산화되는 것을 피하게 하는 조심스럽게 조절된 용매, pH 및 반응 시간의 조건 하에서, 요오드, N-요오도숙신이미드 및 요오드화 시아노겐으로 처리했을때, 정말 효율적으로 폴딩될 수 있다.

탈륨(Ⅲ) 트리플루오로아세테이트는 때때로 이황화물 결합의 수율을 더 좋게 하는 상기 산화제를 대신할 수 있다. 이 시약의 주요한 한계는 그의 독성, 탈륨을 표적 폴리펩티드로부터 제거하는 것의 어려움, 그리고 메티오닌과 트립토판 잔기를 산화로부터 보호할 필요가 있는 것이다.

설폭시드/실릴 화합물 및 트리플루오로아세트산의 혼합물을 함유하는 산화제는, S-Acm, S-But, S-Meb 및 S-Mob (S-p-메톡시벤질) 시스테인 잔기들을 함유하는 폴리펩티드 전구체의 이황화물 결합으로의 직접적인 산화에 성공적으로 사용되어 왔었다. 그러나, 이 혼합물의 주요한 한계는 산화 조건하에서 염소화를 피하기 위해, 트립토판 인돌 고리를 포밀기로 보호할 필요가 있다는 것이다.

선형의 합성 폴리 티올 전구체(환원된 폴리펩티드 형태)의 산화적 폴딩법이 더욱 널리 보급되어 있고, 가장 흔히 사용된다. 가장 간단한 방법에서는, 적당한 이황화물 결합이 공기 또는 기타 약한 산화제 존재하에서 자발적으로 형성될 수 있다. 또한, 폴딩과 시스테인 패어링은 저분자량 설피드릴 화합물의 산화 형태(RSH) 및 환원 형태(R-S-S-R) 모두의 존재하에서 얻어진다.

단일 영역으로 이루어진 합성 폴리펩티드 및 작은 단백질에 있어서, 수소 결합, 이온 패어링, 소수성 효과의 조합으로부터 생성되는 폴딩용 열역학적 추진력은 임의로 산화를 재생하는 천연적인 이성질체를 자발적으로 생성하는데 실질적으로 충분하다.

효소 저해제, 독소 또는 호르몬과 같이, 다중 시스테인을 함유한 작은 단백질의 산화적 폴딩의 연구로부터, 시스테인-안정화-턴, 시스테인-안정화 폴리(프로)-Ⅱ 나선 폴드 및 시스테인-안정화--구조 폴드와 같은 특별한 구조적 모티프(motif)에 관하여 유용한 정보가 나오며, 이들의 안정화는 비교적 작은 펩티드 분자들에 있어서도 정확한 이황화물 다리를 형성하기 위한 주요한 추진력이 된다. 2차 구조 모티프를 안정화 시킬 완충제와 온도, 첨가제에 대해 관심을 기울인다면, 부분적으로 폴딩되거나 뒤섞인(잘못 폴딩된) 단백질의 완전히 정확한 폴딩까지도 생체외(in vitro)에서 얻을 수 있다.

집합 및 침전을 촉진시키는 임의적인 분자간 이황화물 결합을 가능한 피하고, 비천연적이고 잘못 폴딩된 이성질체를 유도하는 부정확한 분자내 시스테인 패어링을 최소화하기 위하여, 폴리티올 폴리펩티드 종을 위한 폴딩 프로토콜이 고안되어왔다.

그래서, 공기 산화는 일반적으로 중성 또는 약 알칼리성 조건 하에서 전구체 폴리티올 형태를 고희석(1㎎/㎖ 또는 그 이하)하여 행한다. 이것은 통상적으로 오랜 지속시간을 요구하며, 반응에서 물과 같은 무해한 부산물을 생산한다. 그러나, 미량의 금속 이온들이 그들의 속도에 강하게 영향을 미치는 때문에 공기 산화는 조절하기 힘들다. 더욱 중요한, 염기성 및 소수성 전구체 분자들은 폴딩 공정 중 그들의 염기성 또는 중성 등전점 또는 그 근처에서 용액 밖으로 집합하고, 침전하는 경향이 있다. 더구나, 메티오닌의 산화에 기인한 부산물들이 폴딩 도중 축적된다. 비록 폴리티올 전구체를 폴딩하는데 필요한 화학적 조작의 수가 최소로 줄더라도, 공기의 산소 분자에 의해 촉진되는 이황화물 다리의 형성은 많은 경우에 수율이 낮거나, 때때로 전혀 일어나지 않기도 한다.

DMSO와 페리시안 칼륨이 또한 산화제로서 사용된다. 그러나, 페리시안 칼륨은 암소에서(in the dark) 사용되어야 하며, 만약 메티오닌과 트립토판이 폴리펩티드 사슬 중에 존재한다면, 산화 부산물들이 폴딩 중에 축적된다. 산화적 폴딩이 반응에서 해로운 생성물이 없이 능률적인 속도로, 산성 조건 하에서 실행될 수 있다는 사실 때문에, DMSO의 사용은 종종 더 좋은 결과를 가져온다. 이 방법은 산성 완충제 중에서 산화를 행하는 종류들이 가지는 보다 높은 용해도 특성 때문에 염기성 및 소수성 폴리펩티드 전구체를 폴딩하는데 특히 적합하다. 그러나, 최종 생성물로부터 DMSO 제거와 이황화물 다리 형성의 선택성 감소에서의 문제점들이 종종 보고되어 왔었다. 더구나, 실험적 조건을 주의깊게 조절한다고 해도, 잘못 폴딩된 이성질체와 저중합체형성(oligomerization)을 유도하는 이황화물 다리의 뒤얽힘 (scrambling)을 항상 피할 수 있는 것은 아니다.

작은 단백질 폴리티올 전구체에서의 정확한 시스테인 패어링과 폴딩에 대한 더 높은 수율은, 대부분 종종 산화(GSSG) 및 환원(GSH) 글루타티온과 같은 산화/환원 완충제와 시스틴/시스테인(Cys/Cys)을 사용함으로서 얻을 수 있다.

따라서, 리보뉴클레아제 A의 산화적 폴딩(R.R. Hantgan et al. Biochemistry 13, 613, 1974) 도중에, GSSG/GSH 또는 Cys/Cys, 유리 설피드릴과 이황화물 기들에 의해 유도된 히루딘(Hirudin)의 49개 아미노산 코어 영역(B. Chatrenet and J.Y. Chang J. Biol Chem. 267, 3038, 1992)과 소 췌장 트립토판 저해제(BPTI)(T. E. Creghton Methods Enzymol. 131. 83, 1986)가 형성되고, 재폴딩 공정 전체에 걸쳐서 일정하게 재형성(reform)된다. 티올레이트 중간체를 통해서 일어나는 티올/이황화물 교환이 비천연적 이황화물의 천연적 황화물로의 리셔플링(reshuffling)을 촉진하기 때문에, 전체적인 속도와 수율은 통상적으로 공기 중에서의 산화적 폴딩보다 더 좋다. 공기 중에서의 산화적 폴딩에 대해서는, 집합 및 올리고머와 폴리머의 형성을 피하고, 표적 단백질 종의 수율을 최대화하기 위하여 폴리티올 전구체를 고도로 희석하는 것이 필요하다.

인비트로에서 히루딘^1-49(Hirudin^1-49)의 폴딩의 제 1단계 도중, 폴딩되지 않고, 환원된 형태(폴리티올)로부터 1 또는 2개의 이황화물 다리를 포함하는 평형화된 이성질체 또는 3개의 이황화물 결합을 갖는 평형화된 이성질체(뒤얽힌 이성질체)로 폴딩이 연속적이고 비가역적으로 진행된다(J. Y. Chang Biochem. J. 300, 643, 1994). 천연적인 단백질을 포함하여 거의 모든 75 개의 가능한 단백질이 밝혀졌다. : S-S 다리 1개를 가진 이성질체 15개, S-S 다리 2개를 가진 이성질체 45개, S-S 다리 3개를 가진 이성질체 15개. 폴딩의 두번째 단계 도중, 비천연적 이황화물들을 천연적 단백질 종이 되도록 리셔플링함으로서 뒤얽힌 종류들을 재조직한다. 이황화물의 형성은 주로 산화된 글루타티온 또는 시스테인에 의해 촉진되는 반면에, 이황화물 리셔플링은 환원된 글루타티온 또는 시스테인 또는 머캅토에탄올 등의 티올 촉매를 필요로 한다. 리셔플링 촉진에 있어서 티올 시약의 효율성은 명백하게 그의 산화 환원 전위와 관련되고, 각각의 촉매는 최적 농도를 나타낸다. 시스틴/시스테인은 뒤얽힌 히루딘의 축적 과정에서 GSSG/GSH 보다 약 10배 이상 강하다. 이 차이점은 GSSG/GSH(-0.24V) 및 Cys-Cys/Cys(-0.22V) 계의 상대적 산화환원 전위에 의해 설명되어 왔다. 최적 조건들(온도, 완충제, 염, 산화환원 혼합물)의 조합을 선택함으로서, 히루딘^1-49의 폴딩 과정은 15분 이내에 완결될 정도로 촉진되었다.

일반적으로, 몇 개의 이황화물 결합을 포함하는 합성 단백질의 천연적인 형태는 폴리티올 형태를 폴딩하기 위한 최적 조건들 하에서 자발적으로 형성되어야한다. 그러나, 많은 경우에 있어서, 최적 조건들에서 산화적 폴딩이 상기 산화환원 완충제에 의하여 조정될지라도, 상당한 양의 부산물과 잘못 짝지워진 형태들이 형성된다. 이것은 특히 특정 분자 샤패론(chaperon)의 도움 하에서나 또는 특정 막의 표면에서만 자연적인 형태를 형성하려는 단백질의 경우이다(S. Sakakibara Biopolymers, Peptide Science 51, 279, 1999).

또한, 공기나 GSSG/GSH 및 시스틴/시스테인 산화환원 짝에 의해 촉진된 폴리티올 전구체의 산화적 폴딩의 대부분은, 그의 폭넓은 사용에도 불구하고, 산화적인 폴딩들은 합성 케모카인(chemokine)이나 케모카인 유사체의 폴딩 실험에 의해 명백히 증명된 바와 같이, 시행착오를 겪는 방식으로 실행되어 왔다. 실제로, 천연적인 케모카인과 많은 그들의 유사체들은 쉽게 폴딩되고, 그 폴딩된 구조가 2개 또는 3개의 이황화물 다리에 의해 안정화되어 있는 반면, 몇몇 유사체들은 대응하는 천연적인 분자들과 같은 조건 하에서는 잘 폴딩 되지 않아서 부분적으로 폴딩된 구조들이 생긴다. 이들 관찰에서 폴리티올 전구체의 1차 구조에서의 변화가 폴딩되어질 폴리펩티드 사슬에 있어서 정확한 국소적인 폴딩들(-턴, 폴리프롤린 나선 모티프 등)을 유도하는데 불리하게 영향을 미칠지도 모른다는 강한 암시를 나타낸다. 그러므로, 많은 티올 전구체가 폴딩하는 경향은 주로 분자에 작용하는 특정 산화계의 기능이라기 보다는 폴리펩티드의 고유한 특성이다.

알콜, 아세토니트릴 및 DMSO를 낮은 이온 세기에서 완충제에 첨가함으로서 선택된 이황화물 패어링이 향상되는 것이 또한 보고되어 있다. 이런 전략은 선택된 시스테인 잔기들과 접하는 반대로 하전된 아미노산의 병렬을 촉진하기 위하여 정전기적 요소들을 매체 중에서 조정함으로서 특정 이황화물 결합의 형성의 강화를 포함한다.

펩티딜 이황화물 이성화효소(PDI) 및 프로릴 이성화효소(PPI)와 같은 효소들이 또한 이황화물 교환을 촉매하고 조정하기 위한 첨가제로 사용되어 왔다. PDI가 리폴딩 완충제에 첨가되었을 경우, 생체외에서 히루딘을 폴딩하기 위하여 필요한 시간은 10시간에서 30초로 단축될 수 있다. 이 경우에 있어서, 생체외 폴딩의 효율은 생체내(in vivo)에서 관찰된 것과 많이 다르지 않다.

폴리티올 폴리펩티드 전구체는 시스테인 잔기가 Trt 등의 산에 불안정한 (acid-labile) 기에 의해 보호될 때, 폴리펩티드-수지 산첨가 분해성 분열에 의해 직접적으로 얻어진다. 다른 방법으로, 바람직하게, 시스테인이 모두 아세트아미도메틸 기(Acm)등의 산-내성 기에 의해 보호되는 폴리펩티드는 처음에 산첨가 분해성 펩티드-수지 분열에 의해 S-시스테인 유도체로 단리되고, 이어서 Acm 기는 아세트산 중에서 Hg(AcO)₂을 처리함으로서 제거되고, 다음에 과량의 머캅토에탄올이 존재하에서 겔 여과함으로서 Hg 이온을 제거한다.

그러나 양자의 경우에 있어서, 몇개 부반응이 시스테인과 트립토판 잔기에서 일어나는 것이 보고되었다. 트립토판의 인돌 고리는 머캅토에탄올에 의해 유도될 수 있으며, 시스테인은 많은 부반응을 일으키는데, 그 중 가장 중요한 것은 수지로부터 폴리펩티드 사슬의 산첨가 분해성 제거 도중 산화와 t-부틸 양이온에 의한 알킬화이다.

그래서, 현존하는 방법론의 단점들 때문에, 화학적으로 합성한 폴리펩티드 를 폴딩하고, 생물학적으로 활성을 가진 단백질을 화학적 합성에 의해 제조하기 위해 더욱 효율적이고, 더욱 단순한 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 화학적으로 합성한 폴리펩티드의 폴딩(folding) 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 생물학적으로 활성을 가진 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 S-t-부틸기 제거 및 hu-I-309(실시예 4)의 폴딩 전의 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.

도 2는 도 1의 생성물의 질량 측정의 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 더 짧은 보유시간을 설명해주는, 탈보호되고, 폴딩된 hu-I-309(실시예 4)의 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.

도 4는 도 3의 생성물의 질량 측정의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 NEM으로 처리한 후, 도 3에서 나타낸 생성물의 질량측정의 결과를 나타낸 것이다. 도 4와 비교하여 질량에는 변화가 관찰되지 않았으며, 이것은 유리-SH 기가 없음을 나타내는 것이다.

도 6은 재조합형 I-309와 본 발명의 합성되어 폴딩된 I-309의 생물학적 활성 간의 비교 그래프이다. 생물학적 활성은¹²⁵I로 표지된 케모카인을 인간 림프구에 결합함으로서 평가되었다.

도 7은 폴딩 후 실시예 5의 단백질의 분석적 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.

도 8은 실시예 5의 폴딩된 단백질의 조제용 HPLC 윤곽을 나타낸 것이다.

도 9는 기대된 분자량을 설명하는 실시예 5의 정제 생성물의 질량 측정의 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 S-t-부틸의 제거 및 폴딩 전에 실시예 6의 폴리펩티드의 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.

도 11은 도 10의 폴리펩티드의 질량 측정의 결과를 나타낸 것이다(M=H).

도 12는 보다 짧은 보유시간을 설명하는, 폴딩 후 실시예 6의 단백질의 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.

도 13은 기대된 분자량을 설명하는 도 12의 단백질의 질량 측정의 결과를 나타낸 것이다(M=H).

따라서, 본 발명의 목적은 효율적이고 단순하며 신속한 폴리펩티드 및/또는 단백질의 폴딩 방법을 제공하는 것이며, 이 방법에서 특히 잘못 짝지워진 이황화물 다리를 함유하는 이성질체들의 형성을 최소화하고, 글루타티온 또는 효소들과 같은 비싼 이황화물-리셔플링제(reshuffling reagents)의 사용을 생략할 수 있으며, 이 방법은 반복적이고, 확고하며, 저울로 달아서 행할 수 있다(scalable). 이들과 기타 목적들은 당업자들에게 명백할 것이다.

상기 목적은 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 폴딩하는 방법을 제공함으로서 본 발명에 의해 성취될 수 있는데, 이 방법은 2개 이상의 유도된 시스테인 잔기를 포함하는 하나의 폴리펩티드를 예정된 pH와 온도를 가진 폴딩 완충제 중에서 환원제로 처리하는 것으로 구성된다.

또한, 생물학적으로 활성을 가진 단백질들의 제조 방법은,

(a) 2개 이상의 유도된 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하고;

(b) 상기 폴리펩티드를 예정된 pH와 온도를 가진 폴딩 완충제 중에서 환원제로 처리하고; 그리고

(c) 얻어진 폴딩 단백질을 정제하는 것으로 이루어진다.

유도된 시스테인 잔기는 S-부틸-티오-시스테인(S-t-Bu) 잔기에 대응하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명자들은 S-t-Bu-유도 시스테인을 적절한 온도와 pH에서 적절한 폴딩 완충제 중에서 배양했을때, 다른 시스테인들과 이황화물 다리를 형성하는 동안, 탈보호, 즉 S-t-Bu-부분들을 유리할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명에 의하면, 환원제는 유리 시스테인이 바람직하다. 과잉의 시스테인이 완충제에 첨가될 수 있거나(실시예 1~5에서 나타낸 예에 있어서는), 또는 시스테인이 폴리펩티드 내로부터 유도될 수도 있다(실시예 6에서 설명한 바와 같이).

본 발명의 방법 중 바람직한 구현예에서, 폴딩 완충제는, 폴리펩티드를 자연적 폴딩이 일어나게 하는 평형 상태로 유도하기 위하여 1 이상의 카오트로픽 솔트(chaotrophic salt)로 구성된다. 이것은 예를 들면, 폴리펩티드 및/또는 단백질을 예를 들어, 고농도의 카오트로픽 솔트에 의한 완전한 변성 조건하에 두고, 이어서, 폴딩을 위해 카오트로픽 솔트를 더 낮은 농도로 희석함으로서 성취될 수 있다. 카오트로픽 솔트는 바람직하기는 염화 구아니듐 및 요소로 이루어지는 군에서 선택하는 것이 바람직하고, 폴딩 도중 0.1~1 M 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

바람직하기는, 폴딩 완충제의 온도는 25 내지 40℃ 사이이고, 더욱 바람직하기는 27 내지 38℃ 사이이며, 이 온도는 자연적 체온에 상응하며, 펩티드 분해의 변화를 최소화 하기 위한 것이다. 폴딩 중 가장 바람직한 온도는 폴딩 동안 약 37℃이다.

본 발명의 방법 중 다른 바람직한 구현예에 의하면, 폴딩 완충제는 약 알칼리성 pH를 가진다. 바람직하기는, 폴딩 공정을 촉진하기 위하여, pH는 7과 9 사이이고, 더욱 바람직하기는 7과 8.5 사이이다. 상기로부터 명백한 바와 같이, 단백질 폴딩은 복잡한 세트의 상호작용에 의존한다. 시스테인과의 반응은, 예를 들면, 산성 pH에서는 일어나지 않고, 더 높은 pH 값은 폴리펩티드가 분해될 위험을 높혀준다.

폴딩 후, 표적 단백질은 당업계에서 잘 알려진 방법, 예를 들면 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 친수성 상호작용/양이온 교환 크로마토그래피 (HILIC/CEC), 치환 크로마토그래피(DC), 및 샘플 치환 크로마토그래피(SDM)에 의하여 정제될 수 있다. 가장 바람직하기는, 치환 크로마토그레피 뿐만 아니라 용출시 (역상) 고성능 크로마토그래피가 이용된다.

생물학적으로 활성을 가진 단백질들을 제조하는 방법 중 바람직한 구현예에서, 이 방법은,

(a) S-t-부틸-티오-시스테인 폴리펩티드를 단계적인 사슬 신장에 의해, 불용성 중합성 지지체 상에 어셈블링(assembling)하고,

(b) 상기 S-t-부틸-티오-시스테인 폴리펩티드 사슬을 산첨가분해에 의한 상기 지지체로부터 분열시키고,

(c) 얻어진 S-t-부틸-티오-시스테인 폴리펩티드들을 정제하고,

(d) 상기 폴리펩티드를 카오트로픽 솔트, 바람직하기는 염화 구아니듐으로 이루어지고, 알칼리성 pH와 약 37℃의 온도를 가진 폴딩 완충제 중에서 몰 과량의 시스테인으로 처리함으로서, 정제된 S-t-부틸-티오-시스테인 폴리펩티드를 폴딩하고,

(e) 얻어진 폴딩된 단백질을 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계들로 이루어진다.

본 발명의 방법 중 유리한 구현예에서, 중합성 지지체는 산에 불안정한 히드록시메틸 페녹시아세트산 결합제로 기능화한 폴리아미드 또는 폴리스티렌계 수지이며, 이 중합성 지지체는 전자동 펩티드 합성기를 위해 적합하게 사용될 수 있고, 일반적으로 긴 폴리펩티드 사슬을 합성하게 한다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 S-t-부틸-티오-시스테인 폴리펩티드의 단계적인 고체상 집합 및 상기 폴리펩티드를 환원제, 바람직하기는 시스테인 존재하에서, 중성보다 약간 높은 pH와 37℃에서, 폴딩함으로서 생물학적으로 활성을 가진 천연적인 단백질을 다량으로 생산할 수 있다는 사실에 기초한다는 것이다.

본 발명자들은 생물학적으로 활성을 가진 단백질의 생산이 이황화물 다리를 형성하면서 S-t-부틸 보호기를 제거하는 방법으로, 높은 몰과량의 시스테인을 사용하여 성취될 수 있음을 놀랍게도 발견했다. 이러한 방법은 화학적 합성에 의하여 얻어진 시스테인을 함유하는 폴리펩티드를 폴딩하기 위하여 선행 기술에서 알려진 방법보다 더 단순하고 효율적이다. 따라서, S-t-but의 제거는 폴리펩티드의 폴딩과 같은 단계에서 일어난다.

다른 방법으로, 동일한 폴딩 재료가 또한, S-t-부틸-티오 시스테인과 환원제를 폴딩 완충제에 여분으로 첨가하지 않고, 적당한 이황화물 결합을 형성하도록 강제하기 위해 폴리펩티드 사슬의 선택적인 위치에서 산에 불안정한 적당한 기술로보호시킨 시스테인의 조합을 사용함으로서 얻을 수 있다. 이 경우에 있어서, 산에 불안정한 기는, 펩티드가 산성 pH에서 수지로부터 분열될 때에 제거된다. 따라서, 차례로 분자내 “환원제”로서 작용하여 S-t-부틸을 제거하고 이중황화물 형성하게 해주는 유리 시스테인들이 생성된다.(실시예 6에서 설명한 바와 같이)

본 발명의 본질적 요소는 다음에 기초한다.

- 중합성 지지체 상에 S-티오-t-부틸화 폴리펩티드 사슬의 신속한 어셈블리;

- 고전적 산화 환원 시스틴/시스테인 짝의 거대 분자 산화 형태(단백질-S-S-시스테인; 폴리펩티드-S-S 시스테인)인 시스테이닐화된 폴리펩티드로 유도하는 약 알칼리성 조건하에서 유도체들의 시스테인-촉매화된 티올-이황화물 교환;

- 산화된 거대분자 형태의 농도를 폴딩 과정 전반에 걸쳐 일정하게 낮게 유지하여, 분자간 이황화물 교환을 최소화하고,

- 정확한 시스테인 패어링을 가지는 형태(천연적 구조)의 우선적이고, 신속한 형성에 기인한 잘못 폴딩된 중간체들의 집합의 부족;

본 발명의 폴리펩티드를 폴딩하는 방법에 의하면, 예를 들어, 첫번째 단계에서는, S-t-부틸 유도체 10㎎을 6M 염화 구아니듐, 10mM Tris 및 0.1M Na₂HPO₄로 이루어지고, pH 8.0을 갖는 완충제 1㎖ 중에 실온에서 용해시키고, 생성되는 용액을 실온에서 약 20분 동안 유지한다. 두번째 단계에서는, 이 용액을 처음에 물로 10배 희석하여 pH 7.2,(0.6M 염화 구아니듐 , 1.0mM Tris와 10mM Na₂HPO₄및 폴리펩티드 유도체의 최종 농도 1㎎/㎖)가 되게 한 후, 높은 몰 과량의 시스테인(폴리펩티드유도체 또는 단백질 유도체의 농도보다 약 100 배)를 교반 하에 첨가한다. 폴리펩티드의 폴딩이 일어나도록 하기위하여, 온도를 37℃까지 점차로 올려서 이 온도를 약 24 시간 동안 일정하게 유지시킨다.

본 발명의 폴딩 방법으로 매우 균질한 생성물이 생산되고, 이 방법은 최소의 변형만으로, 시스테인 티오-t-부틸 유도체과 같이 고체상 화학적 합성에 의해 제조되는 어떤 폴리펩티드에도 적용가능하다. 그외에, 본 발명에 의한 방법은 전구체 폴리티올 형태를 이용한 선행 기술의 방법에 비하여 다음과 같은 다수의 다른 잇점을 가진다.

- 사슬의 시스테인 잔기가 폴리펩티드 수지의 산첨가분해성 분열 도중 알킬화 되지 않고;

- 시스테인의 술폰산으로의 과도한 산화 및 분자간 이황화물 다리를 유도하는 산화가 모두 일어나지 않고;

- Hg(AcO)₂로 탈블로킹하는 Acm으로부터 유도된 오염 Hg이온들을 제거하기 위하여 필요한, 머캅토에탄올에 의한, 트립토판 인돌 고리 유도체화의 위험을 피할 수 있다. 실제로, 본 발명의 폴딩 혼합물 중에서 시스테인 티올레이트는 트립토판을 전혀 수식하지 않는다;

- 산화 민감성 메티오닌, 트립토판, 티로신 잔기들이 폴딩 도중 수식되지 않고;

- 최종적으로 폴딩된 생성물의 생산 비용은 일반적으로 폴리티올 폴리펩티드와 산화환원 완충제를 사용한 경우에 비해 낮다.

표적 단백질이 일반적으로 본 발명의 방법에 의하여 높은 수율로 제조되더라도, 경우에 따라서는, 예를 들면 다중 이황화물 결합을 가지는 복합 단백질의 경우에는, 천연적 구조(잘못 폴딩된 구조)로 완전히 발전하지 않는 중간체 형태의 특정군이 평형 상태에서 용액 중에 남아 있을 수 있는 것은 당업자들에게는 명백할 것이다. 잘못 폴딩된 종들은 RP-HPLC에 의해 정확하게 폴딩된 종들로부터 쉽게 분리될 수 있고, 이들은 다시 본 발명의 폴딩 조건으로 처리하여 공정의 전체 수율을 높일 수 있다.

본 발명에 의하면, “폴리펩티드”라는 용어는 아미드 결합에 의하여 함께 결합된 아미노산의 폴리머를 언급한다. “단백질”이란 용어는 살아있는 유기체의 세포 및 생물학적 유체 중에서 생길 때에 삼차원 형태를 가진 폴리펩티드 종류를 언급한다. 단백질은, 예를 들면, 단일하게 폴딩된 폴리펩티드 사슬들로 구성되어 있거나, 또는 다중적으로 폴딩된 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 복합 구조로 이루어질 수 있다.

다음의 실시예들과 도면들은 본 발명을 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명에 있어서 하기의 청구항의 제한에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.

실시예 1

Cys ^10,11,34,50 (S-t-bu)-hu-TARC(흉선 및 활성화 조절 케모카인)의 합성 및 폴딩

71개의 아미노산 잔기를 가지는 케모카인 유도체를 Fmoc/t-Bu 화학, 및 그 위에 Fmoc/Ser(t-Bu)이 DMAP(4-디메틸아미노피리딘)-촉매화 에스테르화에 의해 부착된 산에 불안정한 히드록시메틸페녹시아세트산 결합제(Wang resin)로 기능화된 폴리스테렌계 수지를 사용하여 433 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer/ABI)에서 조합하였다. 치환도는 0.57mmol/g이었다. 합성은 DMF 중에서 5배 과량의 Fmoc-아미노산과 DCI(N,N'-디이소프로필카보디이미드)/HOBt(1-히드록시벤조트리아졸) 활성화제를 사용하여 0.27mmol 규모로 행하였다. 결합 시간은 Fmoc 탈보호를 분광광도계(spectrophotometry)로 모니터한 결과 약 60분이었다.

4개의 시스테인 티올은 S-t-부틸기로 보호하고, 기타 측쇄들: Ser(t-Bu), Thr(t-Bu), Tyr(t-Bu), Asp(O-t-bu), Glu(O-t-Bu), Lys(Boc), Trp(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), 및 Arg(Pmc) 모두에 대하여 최대 보호기구를 사용하였다. 각 결합 후, DMF 중에서 DIEA와 아세트산 무수물로 씌움(capping)이 행하였다.

생성되는 폴리펩티드-수지를 실온에서 새로 조제된 TFA/물/TIS (트리이소프로필실란)/페놀 (78:5:12:5, v/v/v/w, 10㎖/g 수지)의 혼합물로 2.5~3 시간 동안, 처리하였다. 분열된 폴리펩티드 유도체는 분열된 혼합물을 차가운 메틸-t-부틸 에테르(MTBE)로 직접 여과함으로서 침전되었으며, 원심분리에 의해 분리된 침전물을 에테르로 2회 세척한 후, 공기 중에서 건조하였다.

이어서, 조 생성물을 묽은 아세트산에 용해시키고, 동결 건조시키고, 50% 아세트산에 재용해시킨 후, 이동상으로서 50% 아세트산를 사용한 Sephadex G-50 칼럼(70×25㎝)에 제공하였다. 모아진 획분들은 MALDI-TOF 질량 분광 분석법으로 분석하고, 원하는 폴리펩티드 유도체(MW 8,436.9 Da)를 함유하는 것들을 모우고, 물에 희석시킨 후 동결 건조시켰다.

모여진 획분을 다시 50% 아세트산에 용해시키고, 또한 250 ×10㎜ 반조제용 Vydac C₄컬럼에 로딩(loading)해서 정제했다. 샘플을 60분 중 20~80% B의 선형 구배로 유속 3㎖/분으로 용출시켰으며, 여기에서 B는 아세토니트릴 중의 0.1% TFA이고, A는 물 중의 0.1% TFA이다. 검출을 280nm에서 행하였고, 표적 폴리펩티드를 함유하는 획분만을 모아서, 폴딩하기 전에 동결 건조시켰다.

RP-HPLC에 의해 정제된 케모카인 유도체의 폴딩은 처음에 pH 8.0 및 실온에서 생산물 10mg을 6M GnHCl 1 mg, 0.1 M Na₂PO₄및 10mM Tris에 용해시킴으로서 행하였다. 20분 후, 용액에 물 10ml를 첨가하여 희석하여 0.6M GnHCl, 10mM Na₂PO₄, 1mM Tris(pH 7.2)의 최종 농도로 만들었고, 펩티드 농도를 1mg/ml로 만들었다. 폴딩은 약 20mM 의 농도(펩티드 농도에 비해 약 100배 몰 과량)에서 시스테인을 첨가하고,온도를 37℃까지 서서히 올림으로서 개시된다.

공기중에서 37℃의 일정한 온도에서 일어나는 폴딩 반응은, 40분 내에1.0㎖/분의 유속으로 0.1% TFA/물 중 20~60% 아세토니트릴의 농도 구배와 Vydac C₄분석용 칼럼을 사용하여, Waters 996 Photodiode Array detector가 장착된 Waters 2690 Seperation Module로, 아세트산으로 산으로 급냉시킨(acid quenched) 용액의 25㎕ 획분의 RP-HPLC 분석에 의해 모니터했다. 각각의 HPLC 피크에서의 1㎕(티올이황화물 교환 반응의 폴딩 중간체에 상응함)을 모우고, 물 중의 아세토니트릴/1% TFA(1:2) 중의 시나핀의 포화 용액 1㎕와 혼합하고, 진공 중에서 건조하고, 질소 레이저가 장착된 Voyager-DE 분광계(Perseptive Biosystem, Framinham, MA)를 사용하는 MALDI/TOF 질량 분광분석법에 의해 분석했다. 78%의 폴딩된 폴리펩티드가 24 시간 후에 형성되었다. 또한, 그의 분자량이 폴딩된 생성물의 분자량에 상응하는 피크를 N-에틸말레이미드(NEM)와의 반응에 의해 검사하여, 유리 티올기(모든 SH 마다 +125 Da)들의 존재를 검출하였다.

본 발명의 방법론에 의하여 얻어진 hu-TARC의 생물학적 활성은 이마이 방법 (T. Imai et al., J. Biol. Chem., 271, 21514, 1996)을 따라 확인하였다.

새로운 단구, 호중구, 림프구들 뿐만 아니라, 인간 T 세포주들인 Hut 78, Hut 102, 및 Jurkat가 TARC에 반응하여 폴리카보네이트 필터를 가로질러서 이동했는지를 평가하였다. 단구와 호중구들에 대하여는 화학적 합성에 의해 제조된 TARC 나 재조합형 TARC 어느것에 의하여서도 주화성 반응(chemotactics response)을 유도해내지 못한다. T 세포주인 Hut 78, Hut 102에서는, 재조합형 TARC 뿐만 아니라 합성 TARC도 100ng/ml에서 최대 효과를 가지는 전형적인 종-형태의 곡선으로의 이동을 유도했다.

실시예 2

Cys ^10,34,50 (S-t-Bu)-hu-TARC 및 Cys ^11,34,50 (S-t-Bu)-hu-TARC의 합성 및 폴딩

Cys^10,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC 및 Cys^11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC 유도체들의 합성, 정제 및 폴딩은 Cys^10,11,34,50(S-t-Bu)-hu-TARC (실시예 1)에서 채택한 것과 같은 조건에서 행하였고, 유일한 차이점은 Cys¹⁰및 Cys¹¹각각에서의 Trt 보호이며, 이것은 수지로부터 폴리펩티드 전구체들의 분열에 부수하여 제거되었다. 최종 폴딩된 케모카인의 수율은 각각 80%와 79% 이였다.

실시예 3

Cys ^34,50 (S-Bu)-hu-TARC의 합성 및 폴딩

Cys^34,50(S-Bu)-hu-TARC 유도체의 합성, 정제 및 폴딩은, 실시예 1, 2의 유도체들의 조건과 동일한 조건에서 행하였으며, 예외로 Cys¹⁰및 Cys¹¹모두 Trt에 의해 보호되었으며, 이 Trt는 TFA에 의해 최종 수지가 분열하는 동안 제거된다. 폴딩된 생성물의 수율은 약 75% 이였다.

실시예 4

Cys ^{10,11,26 34,50 68} (S-t-Bu)-hu-I-309의 합성 및 폴딩

(S-t-Bu)로 보호된 6개의 시스테인을 함유하는 hu-I-309의 합성은 Fmoc-Lys(Boc) Wang 수지(치환도 0.61 mmol/g)를 사용하여 실시예 1과 같은 조건에서 0.12 mmole의 스케일로 행하였다. 생성되는 폴리펩티드-수지는 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리하였고, G50으로 정제된 재료를 250 ×10mm Vydac C₁₈칼럼에 로딩함으로서 더욱 정제된다. (도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이)

RP-HPLC에 의해 정제된 케모카인 유도체의 폴딩은 생성물 65㎎를 pH 8.0에서 60㎖의 0.6M GuHCl, 10mM NaHPO₄, 1mM Tris 중에 용해시키고, 펩티드에 대하여 100배 몰 과량의 농도에서 시스테인을 첨가해서 행하였다. 폴리펩티드 용액을 37℃에서 4 일동안 방치했다. TFA로 산처리한 후, 폴딩된 재료를 250 ×10 mm Vydac C₁₈칼럼을 사용하는 RP-HPLC에 의해 단리시켰다(실시예 3 및 4에 나타낸 바와 같이). 완전한 시스테인 패어링은 N-에틸말레이미드(NEM)와의 반응 후 질량 분광분석법에 의해 검사했다. 분자량의 증가가 관찰되지 않았고, 이것은 유리 티올기가 없다는 것을 나타낸다(도 5에 나타낸 바와 같이). 최종적으로 케모카인의 수율은 거의 25% 이였다. 합성되고 폴딩된 hu-I-309는 재조합형 단백질에 상당하는 생물학적 활성을 나타낸다(도 6).

분석 크로마토그래피를 다음의 조건으로 행하였다.

칼럼 : C₁₈250 ×4.6 mm(Vydac #238TP54)

이동상: A= 100% H₂0 0.1% TFA

B= 100% CH₃CN 0.1% TFA

구배 : B %조성이 크로마토그램에 기록된다.

검출기 : 214nm

실시예 5

Plasmodium vivax C-말단 단편의 합성 및 폴딩

(S-t-Bu)로 보호된 4개의 시스테인들을 함유하는 Plasmodium vivax circumsporozoite 단백질 (PvCS) 303-372의 합성 및 폴딩은 실시예 1에서와 같은 조건에서 실행하였다.

폴딩은 펩티드 27mg에 0.1M Tris 완충제(pH 8.5) 중의 6M GnHCl 2.7ml에 첨가해서 행하였다. 이 용액은 10분간 혼합하였다. 이어서, 0.2M Tris 완충제(pH 8.8)로 완충시킨 13.5ml의 1mM EDTA, 0.2M NaCl를 첨가하였다. 최종적으로 0.2M Tris 완충제(pH 8.8)로 완충화된 1mM EDTA, 0.2M NaCl에 35mM 시스테인 10.8㎖를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃가 되게 하였다. 폴딩 반응은 역상 HPLC에서 완결되었고(3~6 시간)(도 7a), 반응을 4℃에서 5분간 냉각시켜서 정지시켰고, 이어서 4℃에서 10% TFA를 첨가하여 최종 농도 1% TFA에 이르도록 했다(10% TFA 3㎖). 이어서, 생성물을 역상 HPLC(도 8)에 의해 정제하고 최종 생성물의 질량을 측정하였다(도 9). 최종적으로 산화된 생산물의 수율은 70~80% 이였다.

분석 크로마토그래피를 다음의 조건을 사용하여 행하였다.

칼럼 : C₄250 ×4.6 mm (Vydac #214TP54)

이동상: A= 100% H₂0 0.1% TFA

B= 100% CH₃CN 0.1% TFA

구배 : B %조성이 크로마토그램에 기록된다.

검출기 : 214nm

실시예 6

Plasmodium falciparum C-말단 단편의 대규모 합성 및 폴딩

4 개 중 (S-t-Bu)으로 보호된 단 2개의 시스테인만을 함유하는 Plasmodium falciparum circumsporozoite 단백질 (PfCS 282-383)의 대규모 합성 및 정제를 다음을 제외하고는 실시예 1과 같은 조건에서 행하였다(도 10 및 11에 나타낸 바와 같이).

폴딩은 유리 시스테인을 폴딩 완충제에 첨가하지 않고, 부분적으로 정제된 펩티드 1.1g을 0.1M CH3₃COONH₄(pH 8.0) 1ℓ에 용해시켜서 행하였다. 반응 혼합물을 32℃에서 18시간 동안 유지하였다. 생성물은 역상 HPLC에 의해 정제된다(도 12 및 13). 최종적으로 산화된 생성물의 수율은 거의 37%였다.

분석 크로마토그래피를 다음과 같은 조건으로 사용하여 행하였다.

칼럼 : C₁₈250 ×4.6mm (Vydac #238TP54)

이동상: A= 100% H₂0 0.1% TFA

B= 100% CH₃CN 0.1% TFA

구배 : B %조성이 크로마토그램에 기록된다.

검출기 : 214nm

Claims

2 개 이상의 유도된 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 단백질을 예정된 pH와 온도를 갖는 폴딩 완충제 중에서 환원제로 처리하는 것으로 이루어지는 화학적으로 합성된 폴리펩티드의 폴딩 방법.
제 1항에 있어서, 상기 유도된 시스테인 잔기가 S-부틸-티오-시스테인 잔기에 상응하는 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 환원제가 시스테인인 방법.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제가 1 이상의 카오트로픽 염으로 이루어지는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 염화 구아니듐 및 요소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 4항 또는 5항에 있어서, 상기 폴딩 완충제 중의 카오트로픽 염이 0.1 내지 1M의 농도로 존재하는 방법.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제가 알칼리성 pH를 가지는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 pH가 7 내지 9 사이에 있는 방법.
제 7항 또는 8항에 있어서, 상기 pH가 7 내지 8.5 사이에 있는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제의 온도가 25 내지 40℃ 사이에 있는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 온도가 27 내지 38℃ 사이에 있는 방법.
제 10항 또는 11항에 있어서, 상기 온도가 약 37℃인 방법.
생물학적으로 활성을 가진 단백질의 제조 방법으로 상기 방법이,

(a) 두 개 이상의 유도된 시스테인 잔기들을 포함하는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하고;

(b) 상기 폴리펩티드를 예정된 pH와 온도를 가지는 폴딩 완충제 중의 환원제로 처리하고; 그리고

(c) 얻어진 폴딩된 폴리펩티드 및/또는 단백질을 정제하는 단계로 이루어지는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 유도된 시스테인 잔기가 S-부틸-티오-시스테인 잔기에 상응하는 방법.
제 13항 또는 14항에 있어서, 상기 환원제가 시스테인인 방법.
제 13항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제가 1 이상의 카오트로픽 염으로 이루어지는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 염화 구아니듐 및 요소로 이루어지는 군들로부터 선택되는 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 폴딩 완충제 중의 카오트로픽 염이 0.1 내지 1M의 농도로 존재하는 방법.
제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제가 알칼리성 pH를 가지는 방법
제 19항에 있어서, 상기 폴딩 완충제의 pH가 7 내지 9 사이에 있는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 pH는 7과 8.5 사이에 있는 방법.
제 13항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴딩 완충제의 온도가 25 내지 40℃ 사이에 있는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 온도가 27 내지 38℃ 사이에 있는 방법.
제 22항 또는 제 23항에 있어서, 상기 온도가 약 37℃인 방법.
제 13항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) S-t-부틸-티오 시스테인 폴리펩티드를 단계적 사슬 신장에 의하여 불용성 중합성 지지체 위에 어셈블링하고;

(b) 상기 S-t-부틸-티오 시스테인 폴리펩티드 사슬을 산첨가 분해에 의하여 상기 지지체로부터 절단시키고;

(c) 얻어진 S-t-부틸-티오 시스테인 폴리펩티드를 정제하고;

(d) 상기 폴리펩티드 유도체를 카오트로픽 염을 포함하고, 알칼리성 pH와 37℃의 온도를 가지는 폴딩 완충제 중에서 과량의 시스테인으로 처리함에 의해 정제된 S-t-부틸-티오 시스테인 폴리펩티드를 폴딩하고; 그리고

(e) 얻어진 폴딩된 단백질을 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하는것으로 이루어지는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 카오트로픽 염이 염화 구아니디늄인 방법.
제 25항 또는 26항에 있어서, 상기 중합성 지지체가 산에 불안정한 히드록시메틸페녹시아세트산 링커로 기능화된, 폴리아미드 또는 폴리스티렌계 수지인 방법.