JP2004516300A - 化学的に合成したポリペプチドをフォールディングする方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、化学的に合成したポリペプチドのフォールディング方法に関し、この方法は２つ以上の誘導体型システイン残基を有するポリペプチドおよび／またはタンパク質を規定のｐＨまたは温度を有するフォールディング緩衝液中で還元剤を用いて処理することを包含し、この誘導体型システイン残基はＳ−ブチル−チオ−システイン残基に対応し、還元剤はシステインである。

Description

【０００１】
本発明は化学的に合成したポリペプチドのフォールディング（折り畳み）方法に関する。さらに、本発明は生物学的に活性なタンパク質を調製する方法に関する。
標準的なＢｏｃ／Ｂｚｌ法に基づく固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を高度に最適化することにより合成された９９残基の酵素であるＨＩＶ−プロテアーゼが充分に活性であり、そのような化学合成が成功を収めて以来、ここ１０年にわたり、合成タンパク質の要求が高まっている。
【０００２】
７６残基からなる小さなタンパク質であるユビキチン結晶が１９９４年に合成され、Ｂｏｃ／Ｂｚｌ法の操作よりも操作上簡便であり化学的に煩雑でない方法であるＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕプロトコールに基づくＳＰＰＳによって、高い純度のタンパク質が合成できることがさらに証明された。
２０００年の時点において、６０−１００アミノ酸残基を含む単一ドメインのタンパク質がペプチド合成装置による化学合成により、構造と機能解析を行うに充分な量でもって、迅速に、信頼性高くかつ経済的に調製可能となっていることが実験的に十分示されている。
【０００３】
化学合成により調製されたジスルフィド架橋を含むタンパク質がフォールディングされると、天然型および遺伝子操作型と同じ性質を示す。タンパク質のジスルフィド架橋は、相当なコンホメーション的拘束性を分子に与える単一または多数の鎖内および／または鎖間環状構造を形成し、それが生物学的に活性なコンホメーションの安定性に寄与するのは明らかである。
【０００４】
フォールディングされた単一ドメインタンパク質の既知構造体は、システイン残基の位置選択的な対合（ペアリング）により調製できる。通常使用される保護方法に適したシステイン保護基の種々の組合わせが開発されており、それらは段階的かつペアとなってシステイン残基を完全なる選択性をもって脱保護および／または同時酸化できる。
【０００５】
しかし、多数のシステイン残基を含むタンパク質においてシステイン残基を位置選択的に対合させるための化学に対する要求が示されたのは、インスリン様ペプチドのヒトリラキシンの最近の合成である。Ａ鎖前駆体の合成はＳＰＰＳ法、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕアプローチおよびｐ−アルコキシベンジルアルコールベースの樹脂を用いて行われ、他方Ｂ鎖前駆体はＰＡＭ樹脂（ポリスチレンベースの樹脂との４−カルボキシアミドメチルベンジルエステル架橋）を用い、次いでＢｏｃ／Ｂｚｌアプローチにより調製された。Ａ鎖前駆体の４つのシステイン残基のうち、２つはＳ−Ｔｒｔ（Ｓ−トリフェニルメチル）誘導体として保護され、他の残基はそれぞれＳ−Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）およびＳ−Ｍｅｂ（Ｓ−ｐ−メチルベンジル）保護を有していた。Ｂ鎖前駆体の２つのシステインはＳ−ＡｃｍおよびＳ−Ｍｅｂ保護基で保護されていた。Ａ鎖の分子内Ｓ−Ｓ架橋をまず、ＡｃＯＨ中、ヨウ素酸化により得た。次いで、ＡおよびＢ鎖をつなぐ２つの分子間ジスルフィド架橋を次の２工程で得る： 第１工程では、Ｓ−Ｍｅｂ保護基のＨＦ脱ブロックにより得られたＡ鎖前駆体の遊離チオールをＢ鎖の活性化Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）（Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）残基と反応させ（分子間へテロジスルフィド形成が目的）、第２工程では、Ｓ−Ａｃｍ基をヨウ素で同時酸化的に除去し、残りのＳ−Ｓ架橋を得る。
【０００６】
ＳＰＰＳプロトコールは化学合成により、同一のブロッキング（保護）基で保護されたシステイン残基を含む種々のポリペプチドを調製できる可能性を提供する。多くの酸化剤で保護基を除去すると、ジスルフィド結合が直接形成される。Ｓ−ＴｒｔまたはＳ−Ａｃｍ保護システインを含むポリペプチドおよび／またはタンパク質は、溶媒、ｐＨおよび反応時間の条件を注意して制御することにより、酸化感受性のＴｙｒ、ＭｅｔおよびＴｒｐの修飾を最小限に抑え、システインチオールが対応するスルホン酸に過剰酸化されるのを防ぎ、ヨウ素、Ｎ−ヨウドスクシンイミドおよびヨウ化シアンで処理すると、実際、効率的にフォールディングすることができる。
【０００７】
タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロアセテートは上記酸化剤と代替でき、そうするとジスルフィド結合の収率が上がる場合がある。この試薬の主たる制限は、その毒性、標的ポリペプチドからのタリウム除去の困難性、および酸化からのＭｅｔとＴｒｐ残基の保護の必要性である。
【０００８】
スルホキシド／シリル化合物およびトリフルオロ酢酸の混合物を含む酸化剤が、Ｓ−Ａｃｍ、Ｓ−Ｂｕｔ、Ｓ−ＭｅｂおよびＳ−Ｍｏｂ（Ｓ−ｐ−メトキシベンジル）システイン残基を含むポリペプチド前駆体のジスルフィド結合への直接酸化に適用され、成功を収めている。しかし、酸化条件下でのクロル化を回避するため、Ｔｒｐインドール環をホルミル基で保護する必要があり、これがこの混合物の主たる制限である。
【０００９】
線状の合成ポリチオール前駆体（還元ポリペプチド体）を酸化的にフォールディングする方法は比較的よく知られており、最も頻繁に応用されている。最も簡便な方法では、空気または何らかの他の穏やかな酸化剤の存在下に、適当なジスルフィド結合を同時に形成させることができる。さらに、低分子量スルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）化合物の還元（ＲＳＨ）および酸化（Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ）型両方の存在下、フォールディングとシステイン対合が得られる。
【００１０】
単一ドメインからなる合成ポリペプチドおよび小さなタンパク質では、水素結合、イオン対形成および疎水性作用が組合されて得られるフォールディングのための熱力学的駆動力が、無作為な再生的酸化において天然の異性体を自発的に産するに実質的に充分であることは明らかである。
【００１１】
酵素インヒビター、毒性物質またはホルモンなどの、多数のシステインを含有する小さなタンパク質を酸化的にフォールディングする研究から、システイン安定化α−ターン、システイン安定化ポリ（Ｐｒｏ）−ＩＩへリックスフォールディングおよびシステイン安定化α−α−構造フォールディングなどの特定の構造モチーフに関する有用な情報が得られており、それらの安定化は、比較的小さなペプチド分子においても正しくジスルフィド架橋するための主たる駆動力となっている。二次構造モチーフを安定化する緩衝液、温度および添加剤の選択に注意を払えば、部分的にフォールディングした、または乱雑な（ミスフォールディングした）タンパク質をインビトロにおいて完全に正確にフォールディングすることができる。
【００１２】
非天然のフォールディングし損ねた異性体を導く、不正確な分子内システイン対合を最小にし、凝集や沈降を促進する無作為な分子間ジスルフィド結合形成を可能な限り排除するよう、ポリチオールポリペプチド種のための多くのフォールディングプロトコールが企画されている。
【００１３】
従って、中性または若干アルカリ性条件下、高い希釈率（１ｍｇ／ｍｌ以下）の前駆体ポリチオール型を用いて、空気酸化が一般的に行われる。通常、これは長時間かかり、反応において無害な副産物（例えば、水）を産する。しかし、空気酸化は、微量な金属イオンがその速度に強く影響するため、制御が困難である。重要なことは、塩基性および疎水性の前駆体分子はフォールディングの最中に、それら塩基性または中性の等電点またはその付近において溶液から凝集し沈降する傾向にあることである。さらに、Ｍｅｔ酸化由来の副産物がフォールディング中に蓄積する。ポリチオール前駆体をフォールディングするのに必要な化学的操作の数は最小にまで減少しているが、空気中の分子酸素により引き起こされるジスルフィド架橋形成は多くの場合、その収率が低く、全く形成されない場合もある。
【００１４】
ＤＭＳＯおよびフェリシアン化カリウムも酸化剤として使用されている。しかし、フェリシアン化カリウムは暗所で使用しなければならず、ＭｅｔおよびＴｒｐがポリペプチド鎖に存在すると、酸化型副産物がフォールディングの際に蓄積する。ＤＭＳＯを使用すると、酸化的フォールディングは反応中、有害な産物を伴うこと無く酸性条件下で、効率的に行うことができるため、しばしば、良好な成績を与える。これは、酸性緩衝液中にて酸化を受ける種はその溶解性が高いため、塩基性かつ疎水性のポリペプチド前駆体をフォールディングするのに特に適した方法である。しかし、最終産物からＤＭＳＯを除去する際の問題、およびジスルフィド架橋形成の選択性が減少することが頻繁に報告されている。さらに、フォールディングし損ねた異性体やオリゴマー化を導くジスルフィド架橋が乱雑になることは、実験条件をいくら注意して制御しても回避できるとは限らない。
【００１５】
酸化型（ＧＳＳＧ）および還元型（ＧＳＨ）グルタチオンおよびシステイン／システイン（Ｃｙｓ／Ｃｙｓ）などの酸化還元（レドックス）緩衝液を使用することにより最も高い頻度により、小さなタンパク質ポリチオール前駆体において正しいシステイン対合およびフォールディングが高い収率で得られる。
【００１６】
従って、ＧＳＳＧ／ＧＳＨまたはＣｙｓ／Ｃｙｓによって誘導されたリボヌクレアーゼＡ（Ｒ．Ｒ． Ｈａｎｔｇａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３， ６１３， １９７４）、ヒルジンの４９アミノ酸コアドメイン（Ｂ．Ｃｈａｔｒｅｎｅｔ および Ｊ．Ｙ． Ｃｈａｎｇ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， ３０３８， １９９２）およびウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）（Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３１， ８３， １９８６）の酸化的フォールディングの際、遊離スルフィドリルおよびジスルフィド基が形成され、フォールディングの工程により恒常的に再形成される。チオレート中間体を介して起こるチオール／ジスルフィド交換は非天然のジスルフィドを天然のものに再編成するので、この全収率および全収量は通常、空気中の酸化的フォールディングよりも良好である。空気中の酸化的フォールディングでは、凝集、オリゴマーやポリマーの形成を回避し、標的タンパク質種の収量を最大にするため、高い希釈率のポリチオール前駆体が必須である。
【００１７】
ヒルジン^１−４９をインビトロでフォールディングする第１の段階では、フォールディングされていない還元型（ポリチオール）から、１つまたは２つのジスルフィド架橋を含む平衡化異性体および３つのジスルフィド結合を含む平衡化種（乱雑異性体）へのフォールディングが、連続してかつ不可逆的に進行する（Ｊ． Ｙ． Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３００， ６４３， １９９４）。天然型も含み、殆どすべての７５種の可能性あるタンパク質が同定されている： １つのＳ−Ｓ架橋を含む１５の異性体、２つのＳ−Ｓ架橋を含む４５の異性体、および３つのＳ−Ｓ架橋を含む１５の異性体。フォールディングの第２の段階では、乱雑な種が非天然のジスルフィドの再編成により再構築し、天然のタンパク質種となる。ジスルフィド形成は主として、酸化型グルタチオンまたはシスチンにより促進され、他方ジスルフィド再編成はチオール触媒、例えば還元型グルタチオンまたはシステインまたはメルカプトエタノールを必要とする。
【００１８】
再編成を促進するチオール試薬の有効性がその酸化還元電位に関係しているのは明らかであり、各々の触媒は至適濃度を持っている。システイン／システインは乱雑なヒルジンが蓄積する工程において、ＧＳＳＧ／ＧＳＨよりも約１０倍強力である。この違いは、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（−０．２４Ｖ）およびＣｙｓ−Ｃｙｓ／Ｃｙｓ（−０．２２Ｖ）系の相対的酸化還元電位により説明されている。最適条件（温度、緩衝液、塩および酸化還元混合物）の組合わせを選択することにより、ヒルジン^１−４９がフォールディングされる工程は１５分以内に完了するに至る程度にまで促進される。
【００１９】
通常、種々のジスルフィド結合を有する合成タンパク質のネイティブな立体配座は、ポリチオール形態のフォールディングに最適な条件下で自然と形成される。しかしながら、多くの例では、上記の酸化還元緩衝液により媒介される酸化的フォールディングに最適化された条件下でさえ、かなりの量の副産物およびミスマッチした形態が産生される。これは特に、特定の膜表面上または特定の分子シャペロンの補助の元でのみネイティブな立体配座を形成する傾向があるタンパク質における場合である（Ｓ． Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１， ２７９， １９９９）。
【００２０】
さらに、広範な用途にもかかわらず、空気またはＧＳＳＧ／ＧＳＨおよびシスチン／システイン酸化還元対合により促進されるポリチオール前駆体の酸化的フォールディングのほとんどは、合成ケモカインおよびケモカインアナログのフォールディング実験により明確に実証されているように、試行錯誤の方法で行われてきた。事実、ネイティブなケモカインおよび多数のアナログは容易にフォールディングし、フォールディングした構造は２つまたは３つのジスルフィド架橋により安定化されるが、いくつかのアナログは、対応するネイティブな分子と同じ条件下で良好にはフォールディングせず、部分的にフォールディングした形態を生じる。これらの知見は、ポリチオール前駆体の１次構造の変化が、折りたたまれるポリペプチド鎖の正確な位置の折りたたみ（α−ターン、ポリプロリンらせんモチーフなど）の誘導に有害な影響を与え得るという強い示唆を示す。それゆえ、多くのチオール前駆体のフォールディングに対する性質は、主に、分子に対して作用する特定の酸化系の機能よりもポリペプチド鎖の固有の特定である。
【００２１】
低強度での緩衝液へのアルコール、アセトニトリルおよびＤＭＳＯの添加による、選択したジスルフィド対形成の上昇もまた、報告されている。このストラテジーは媒体中の静電因子を調節して、選択したシステイン残基を縁取る反対に荷電したアミノ酸の並置を助けることにより特定のジスルフィド結合の形成を強化するということに関する。
【００２２】
ペプチジルジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩ）のような酵素もまた、ジスルフィド交換を触媒し、調節するための添加物として利用されてきた。ＰＤＩを再フォールディング緩衝液へと添加する場合、インビトロでヒルジンをフォールディングするために必要とされる時間は、１０時間から３０秒へと短縮することができる。この場合、インビトロでのフォールディング効率はインビボで観察されるものと有意には異ならない。
【００２３】
システイン残基を酸不安定性基（例えば、Ｔｒｔ）により保護した場合、ポリチオールポリペプチド前駆体は、ポリペプチド−樹脂酸分解性切断により直接得られる。あるいは、そして好ましくは、全システインが酸耐性基（例えば、アセトアミドメチル基（Ａｃｍ））により保護されているポリペプチドを最初にＳ−システイン誘導体として酸分解性ペプチド樹脂切断により単離し、次いで酢酸中Ａｃｍ基をＨｇ（ＡｃＯ）_２での処理により取り除き、続いて大過剰のメルカプトエタノールの存在下でのゲルろ過によりＨｇイオンを除去する。
【００２４】
しかし、いずれの場合にも、種々の副産物が、システインおよびトリプトファン残基で生じることが報告されている。トリプトファンのインドール環はメルカプトメタノールにより誘導体化するかもしれず、システインは多数の副反応（最も重要なものは、ポリペプチド鎖の樹脂からの酸分解性除去の間の酸化およびｔ−ブチルカチオンによるアルキル化である）を生じる。
【００２５】
それゆえ、既存の方法の欠点が原因で、より効率よく、そしてより簡単な、化学的に合成したポリペプチドをフォールディングする方法、および化学合成による生物学的に活性なタンパク質の製造方法に対する必要性が存在する。
【００２６】
それゆえ、本発明の目的は、効率のよい、単純および迅速な、ポリペプチドおよび／またはタンパク質のフォールディング方法、とりわけ、ミスマッチしたジスルフィド架橋を含む異性体の形成を最小にし、高価なジスルフィド再編成試薬（例えば、グルタチオンまたは酵素）の使用を省くことができる方法を提供することであり、この方法は反復可能であり（ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ）、反応が強く（ｒｏｂｕｓｔ）、測定可能である。これらおよび他の目的は、当業者に明らかである。
【００２７】
この目的は、本発明により、化学的に合成されたポリペプチドをフォールディングする方法であって、規定のｐＨおよび温度を有するフォールディング緩衝液中で２つ以上の誘導体化したシステイン残基を含むポリペプチドを還元剤を用いて処理することを含む方法を提供することにより達成される。
【００２８】
さらに、以下、
（ａ）２つ以上の誘導体型システイン残基を含むポリペプチドを化学的に合成すること、
（ｂ）このポリペプチドを、規定のｐＨおよび温度を有するフォールディング緩衝液中で還元剤を用いて処理すること、ならびに
（ｃ）得られたフォールディングしたタンパク質を精製することを含む、生物的に活性なタンパク質の製造方法が提供される。
好ましくは、誘導体化したシステイン残基はＳ−ブチル−チオ−システイン（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）残基に対応する。それゆえ、本発明により、思いがけないことに、Ｓ−ｔ−Ｂｕ−誘導体型システインが脱保護されること、すなわち、Ｓ−ｔ−Ｂｕ部分を失うと同時に、適切なフォールディング緩衝液中で適切な温度およびｐＨでインキュベートすると他のシステインとジスルフィド架橋を形成することがみいだされた。
本発明によると、好ましくは、還元剤は遊離のシステインである。（例えば、実施例１〜５に示すように）過剰のシステインを緩衝液に加えるか、または（実施例６に示すように）システインをポリペプチド内のもの由来であり得る。
【００２９】
本発明の方法の好ましい実施態様において、フォールディング緩衝液は、ポリペプチドを天然のフォールディングを生じさせる平衡条件にするために、１以上のカオトロピック塩を含有する。このことは、例えば、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を（例えば、高濃度のカオトロピック塩による）十分な変性条件下に置き、次いでフォールディングのためにカオトロピック塩をより低い濃度へと希釈することにより達成することができる。好ましくは、カオトロピック塩は、塩化グアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）および尿素からなる群から選択され、そして好ましくはフォールディングの間、０．１〜１Ｍの濃度で存在する。
【００３０】
好ましくは、フォールディング緩衝液の温度は、ペプチド分解の変化を減少させるために２５℃〜４０℃の間、より好ましくは２７℃〜３８℃の間にあり、これは同時に、自然の体温に対応する。最も好ましくは、フォールディングの間、温度は約３７℃である。
【００３１】
本発明の方法の別の好ましい実施態様に従い、フォールディング緩衝液はわずかにアルカリ性のｐＨである。好ましくは、フォールディングプロセスを促進するためにｐＨは７〜９の間にあり、より好ましくは、７〜８．５の間にある。上記から明らかなように、タンパク質フォールディングは複雑なセットの相互作用に依存する。例えば、システインとの反応は酸性のｐＨでは生じず、より高いｐＨ値はポリペプチドの分解の危険性を上昇させる。
【００３２】
フォールディングの後、標的タンパク質は当該分野において周知の方法により精製され得、これには、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｉｃ）相互作用／カチオン交換クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ／ＣＥＣ）、置換クロマトグラフィー（ＤＣ）およびサンプル置換クロマトグラフィー （ＳＤＭ）が挙げられる。最も好ましくは、（逆相）高性能クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ）ならびに置換クロマトグラフィーが使用される。
【００３３】
生物学的に活性なタンパク質を製造するための方法の好ましい実施態様において、この方法は、
（ａ）段階的連鎖伸長により不溶性ポリマー性支持体上でＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドをアセンブリすること、
（ｂ）酸分解により、Ｓ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチド鎖を該支持体から切断すること、
（ｃ）得られたＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドを精製すること、
（ｄ）精製したＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドをモル過剰のシステインとフォールディング緩衝液（これはカオトロピック塩、好ましくは塩化グアニジウムを含有し、アルカリ性のｐＨおよび約３７℃の温度を有する）中で処理することにより、該ポリペプチドをフォールディングすること、
（ｅ）得られたフォールディングしたタンパク質を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製することを含む。
【００３４】
本発明の方法の有利な実施態様において、ポリマー性支持体は十分に自動化されているペプチド合成機で適切に利用され得る場合、これらの支持体は酸不安定性ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで官能化したポリアミドまたはポリスチレンベースの樹脂であり、通常、これは長いポリペプチド鎖の合成を可能にする。
【００３５】
上記で説明したように、本発明は、Ｓ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドの段階的な固相アセンブリ、ならびにこのポリペプチドを還元剤（好ましくはシステイン）の存在下、中性よりもわずかに高いｐＨで、約３７℃の温度でフォールディングに供することにより、かなりの量のネイティブな生物学的に活性なタンパク質が産生され得るという知見に基く。
【００３６】
驚くべきことに、生物学的に活性なタンパク質の産生は、ジスルフィド架橋形成し得ると同時にＳ−ｔ−ブチル保護基を除去する方法で、大モル過剰のシステインを用いて達成されることが見出された。このような方法は、化学合成により得られるシステイン含有ポリペプチドのフォールディングに関して先行技術に記載した方法よりも単純で効率がよい。それゆえ、Ｓ−ｔ−ｂｕｔの除去はポリペプチドのフォールディングと同一の工程で生じる。
【００３７】
あるいは、余分な還元剤をフォールディング緩衝液に添加することなくＳ−ｔ−ブチル−チオシステインおよび適切な酸不安定性基で保護したシステインの組み合わせを使用してポリペプチド鎖の選択した位置で適切なジスルフィド結合を形成させることにより、また、同じフォールディングした物質を得ることができる。この場合、酸性のｐＨでペプチドが樹脂から切断されるときに酸不安定性基が除去される。したがって、遊離のシステインが作製され、次いで分子内「還元剤」として機能してＳ−ｔ−ブチル除去およびジスルフィド形成を可能にする（実施例６に示す）。
【００３８】
本発明の本質は、以下の点に基く。
Ｓ−チオ−ｔ−ブチル型ポリペプチド鎖のポリマー性支持体上での迅速なアセンブリ、
古典的酸化還元システイン／システイン対合の巨大分子酸化形態（タンパク質−Ｓ−Ｓ−システイン、ポリペプチド−Ｓ−Ｓ−システイン）であるシステイン化ポリペプチドを導くわずかにアルカリ条件下での、誘導体のシステイン触媒型チオール−ジスルフィド交換；
フォールディングプロセスの間、分子内ジスルフィド結合が最小化されるように一貫して低いままである、酸化型巨大分子形態の濃縮；
正確なシステイン対合との選択的かつ迅速な形態形成（ネイティブな構造）による、ミスフォールディングした中間体の凝集の欠如。
【００３９】
本発明のポリペプチドのフォールディング方法に従うと、例えば、最初の工程では、Ｓ−ｔ−ブチル誘導体（１０ ｍｇ）を室温で緩衝液（１ｍｌ、ｐＨ８．０、６ Ｍ 塩化グアニジウム、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．１ Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４含有）に溶解し、得られた溶液を室温に約２０分維持する。第２の工程では、まず、溶液をｐＨ７．２まで水で１０倍に希釈し（０．６ Ｍ塩化グアニジウム、１．０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ ｍＭ Ｎａ_２ＨＰ０_４およびポリペプチド誘導体の最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、次いで、システインを非常にモル過剰（ポリペプチドまたはタンパク質誘導体の濃度よりも約１００倍）で攪拌下で加える。温度を、３７℃まで徐々に上昇させ、ポリペプチドのフォールディングを生じさせるために２４時間、一定に維持する。
【００４０】
本発明のフォールディング方法は非常に均一な生成物を生じ、ほんのわずかな改変で固相化学合成によりシステインチオ−ｔ−ブチル誘導体として製造される任意のポリペプチドに適用し得る。さらに、本発明の方法は、前駆体ポリチオール形態を利用する先行技術の方法を超える、例えば以下の点のような多数の他の利点を有する。
ポリペプチド樹脂の酸分解性切断の間、鎖のシステイン残基はアルキル化されない、
システインのスルホン酸への過剰酸化および分子内ジスルフィド架橋形成を導く酸化は両方とも生じない、
Ｈｇ（ＡｃＯ）_２でのＡｃｍ脱保護由来の筴雑Ｈｇイオンを排除するために必要であるメルカプトエタノールによるＴｒｐインドール環の誘導体化の危険性をさける。事実、本発明のフォールデング混合物中のチオール酸システインはＴｒｐをまったく修飾しない、
酸化感受性Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＴｙｒ残基はフォールデングの間修飾されない、
最終フォールディング生成物の製造コストは、ポリチオールポリペプチドおよび酸化還元緩衝液を利用するものと比較して、通常、安価である。
【００４１】
一般的に、標的タンパク質は本発明の方法を使用して高収率で製造されるが、いくつかの場合、例えば、多数のジスルフィド結合を有する複合体タンパク質の場合、完全にはネイティブな構造へと発展していない中間体形態の特定の集団（ミスフォールディングした種）は、平衡状態で溶液中に存在し得ることは当業者に明らかである。ミスフォールディングした種は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより正確にフォールディングした種から簡単に分離することができ、再度、本発明のフォールディング条件に供してプロセスの全体的な収率を上昇させることができる。
【００４２】
本発明において、用語ポリペプチドはアミド連結によりともに結合したアミノ酸のポリマーを意味する。用語タンパク質は、生存生物の細胞および生物学的液体中に存在する３次元構造形態でのポリペプチド種を意味する。例えば、タンパク質は、単一なフォールディングされたポリペプチド鎖からなるか、または複数のフォールディングされたポリペプチド鎖からなる複雑な構造体であり得る。
【００４３】
以下の実施例および図面を本発明を例示するために提供し、これは特許請求の範囲に記載の限定を超えて本発明を制限するものではない。
【００４４】
実施例
実施例１
Ｃｙｓ^{１０，１１，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣ［胸腺および活性化制御型ケモカイン（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）］の合成およびフォールディング
７１アミノ酸残基ケモカイン誘導体を４３３ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ）で、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学および酸不安定性ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで官能化したポリスチレンベースの樹脂（Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ）（この上にＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）−触媒型エステル化によりＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）を結合させる）を用いてアセンブリした。置換の程度は０．５７ ｍｍｏｌ／ｇであった。合成は、０．２７ ｍｍｏｌのスケールで、５倍過剰のＦｍｏｃ−アミノ酸およびＤＣＩ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）活性化試薬（ＤＭＦ中）を用いて行った。カップリング時間は約６０分であり、分光光度計でＦｍｏｃ脱保護をモニターした。
【００４５】
４個のシステインチオールをＳ−ｔ−ブチル基で保護し、他の側鎖全てに関して最大保護スキームを用いた：Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−ｂｕ）、Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＡｒｇ（Ｐｍｃ）。各カップリングの後、酢酸無水物およびＤＩＥＡでのキャッピングをＤＭＦ中で行った。
【００４６】
得られたポリペプチド樹脂を室温で、新しく製造したＴＦＡ／水／ＴＩＳ （トリイソプロピルシラン）／フェノール （７８：５：１２：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｗ、１０ ｍｌ／ｇ樹脂）を用いて、２．５〜３．０時間処理した。切断したポリペプチド誘導体を切断混合物の冷却メチル−ｔ−ブチルエステル（ＭＴＢＥ）への直接ろ過により析出させ、遠心分離により析出物を分離し、エーテルで２回洗浄し、風乾させた。
【００４７】
次いで、粗成生物を希酢酸に溶解し、凍結乾燥し、５０％酢酸に再溶解し、移動相として５０％酢酸を用いる、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（７０×２５ｃｍ）へと供した。回収した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光光度計で分析し、所望のポリペプチド誘導体（ＭＷ ８，４３６．９ Ｄａ）を含有する画分をプールし、水で希釈した後に凍結乾燥させた。
【００４８】
プールした画分を、再度、５０％酢酸に溶解し、２５０×１０ ｍｍ 半分取（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）Ｖｙｄａｃ Ｃ_４カラムにかけてさらに精製した。サンプルを、６０分で２０〜８０％Ｂの線形勾配（ここで、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡおよびＡは水中０．１％ＴＦＡ）で、３ ｍｌ／分の流速で溶離した。２８０ｎｍで検出を行い、標的ポリペプチドを含有する画分のみをプールしてフォールディング前に凍結乾燥した。
【００４９】
ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製したケモカイン誘導体のフォールディングは、最初に生成物１０ｍｇを６Ｍ ＧｎＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４および１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（１ｍｇ 、ｐＨ＝８．０）中に室温で溶解することにより行った。２０分後、水（１０ｍｌ）を添加することにより、溶液を０．６Ｍ ＧｎＨＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．２）およびペプチド濃度１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。システインを約２０ｍＭの濃度で添加（ペプチド濃度に対して約１００倍モル過剰）することによりフォールディングを開始し、徐々に３７℃まで温度を上昇させた。
【００５０】
酢酸で酸クエンチした溶液のアリコート（２５μｌ）の、Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＷａｔｅｒｓ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＭｏｄｕｌｅでのＲＰ−ＨＰＬＣ分析（Ｖｙｄａｃ Ｃ_４分析用カラムおよび２０〜６０％アセトニトリル勾配（４０分間、０．１％ＴＦＡ／水中、流速１．０ ｍｌ／分を用いる））により、空気中３７℃の一定温度で生じるフォールディング反応をモニターした。各ＨＰＬＣピーク（１μｌ）（チオール−ジスルフィド交換反応のフォールディング中間体に対応）を回収し、１：２ アセトニトリル／水中１％ＴＦＡ中のシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の飽和溶液１μｌと混合し、減圧下で乾燥させ、窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ分光光度計（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。２４時間後、７８％のフォールディングしたポリペプチドが形成した。Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）との反応により、ＭＷがフォールディングした生成物のＭＷに対応するピークをさらにチェックし、遊離のチオール基の存在を検出した（各ＳＨについて＋１２５ Ｄａ）。
【００５１】
本発明の方法により得られたｈｕ−ＴＡＲＣの生物学的活性は、Ｉｍａｉ法（Ｔ． Ｉｍａｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， ２１５１４， １９９６）にしたがって行った。
【００５２】
ヒトＴ細胞株であるＨｕｔ７８、Ｈｕｔ １０２およびＪｕｒｋａｔ、ならびに新鮮な単球、好中球およびリンパ球を、ＴＲＡＣに応答してポリカーボネートフィルターを越えての移動に関して評価した。単球または好中球においては、化学合成により製造したＴＡＲＣまたは組換えＴＡＲＣのいずれによっても送化性応答は導かれなかった。Ｔ細胞株であるＨｕｔ７８およびＨｕｔ１０２では、合成性ＴＡＲＣならびに組換えＴＡＲＣは、１００ｎｇ／ｍｌで最大の効果を有する典型的なベル型曲線での移動を誘発した。
【００５３】
実施例２
Ｃｙｓ^{１０，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣおよびＣｙｓ^{１１，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣの合成およびフォールディング
Ｃｙｓ^{１０，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ） ｈｕ−ＴＡＲＣおよびＣｙｓ^{１１，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）ｈｕ−ＴＡＲＣ誘導体の合成、精製およびフォールディングを、Ｃｙｓ^{１０，１１，３４，５０}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣ（実施例１）で採用したものと同一の条件で行った（差異は、それぞれ、Ｃｙｓ^１０およびＣｙｓ^１１でのＴｒｔ保護であり、これはポリペプチド前駆体の樹脂からの切断と同時に除去される）。最終的にフォールディングしたケモカインの収率は、それぞれ、８０％および７９％であった。
【００５４】
実施例３
Ｃｙｓ^{３４，５０}（Ｓ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣの合成およびフォールディング
Ｃｙｓ^{３４，５０}（Ｓ−Ｂｕ）−ｈｕ−ＴＡＲＣ誘導体の合成、精製およびフォールディングを、実施例１および２で採用したものと同一の条件（Ｃｙｓ^１０およびＣｙｓ^１１の両方はＴｒｔにより保護されており、これはＴＦＡによる最終的な樹脂切断の間に除去される）で行った。フォールディングした生成物の収率は、約７５％であった。
【００５５】
実施例４
Ｃｙｓ^{１０，１１，２６，３４，５０，６８}（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）−ｈｕ−Ｉ−３０９の合成およびフォールディング
６（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）保護型システインを含有するｈｕ−Ｉ−３０９の合成を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｗａｎｇ樹脂を用いて、実施例１と同一の条件で０．１２ｍｍｏｌのスケールで行った（置換の程度、０．６１ｍｍｏｌ／ｇ）。得られたポリペプチド樹脂を実施例１に記載のように処理し、Ｇ５０精製型物質を、２５０×１０ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ_１８カラムにかけることによりさらに精製した（図１および２に示す）。
【００５６】
ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製したケモカイン誘導体のフォールディングは、生成物６５ｍｇを、０．６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４および１ｍＭ Ｔｒｉｓ（６０ｍｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、ペプチドに対して１００倍モル過剰の濃度でシステインを添加することにより行った。ポリペプチド溶液を３７℃で４日間、放置した。ＴＦＡを用いてわずかに酸性化させた後、フォールディングした物質を２５０×１０ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ_１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した（図３および４に示す）。Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）との反応後、質量分光計により完全なシステイン対形成をチェックした。ＭＷの上昇は観察されず、これは遊離のチオール基が存在しないことを示す（図５に示す）。最終的にフォールディングしたケモカインは約２５％であった。合成性の、フォールディングしたｈｕ−Ｉ−３０９は、組換えタンパク質と等しい生物学的活性を示した（図６）。
【００５７】
クロマトグラフィー分析は以下の条件を用いて行った。
カラムＣ１８ ２５０×４．６ ｍｍ （Ｖｙｄａｃ＃２３８ＴＰ５４）
移動相：Ａ＝１００％ Ｈ_２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ
Ｂ＝１００％ ＣＨ_３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ
勾配：Ｂ％組成はクロマトグラフィー図で報告する
検出器：２１４ ｎｍ。
【００５８】
実施例５
３日熱マラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）Ｃ−末端フラグメントの合成およびフォールディング
４（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）保護型システインを含む３日熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｖＣＳ）３０３−３７２の合成および精製は、実施例１と同じ条件で行った。
ペプチド（２７ｍｇ）を６Ｍ ＧｕＨＣｌ（２．７ｍｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液中ｐＨ８．５）に添加することにより、フォールディングを行った。溶液を１０分間混合した。次いで、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液中ｐＨ８．８に緩衝化した１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣｌを１３．５ｍｌ、加えた。最終的に、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液中ｐＨ８．８で緩衝化した１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で、３５ｍＭシステインを１０．８ｍｌ加えた。反応混合物を３７℃にした。逆相ＨＰＬＣでフォールディング反応を完了するまで（３〜６時間）追跡し（図７Ａ）、４℃で５分間冷却することにより反応を停止させ、続いて４℃で最終濃度１％ＴＦＡになるまで１０％ＴＦＡを添加した（１０％ＴＦＡを３ｍｌ）。続いて、逆相ＨＰＬＣにより生成物を精製し（図８）、最終生成物の質量を決定した（図９）。最終酸化型生成物の収率は７０〜８０％であった。
【００５９】
以下の条件を用いてクロマトグラフィー分析を行った：
カラム：Ｃ４ ２５０×４．６ ｍｍ （Ｖｙｄａｃ＃２１４ＴＰ５４）
移動相：Ａ＝１００％ Ｈ_２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ
Ｂ＝１００％ ＣＨ_３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ
勾配：Ｂ％組成はクロマトグラフィー図で報告する
検出器：２１４ｎｍ。
【００６０】
実施例６
熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｃ−末端フラグメントのラージスケールでの合成およびフォールディング
４つのうち２つのみが（Ｓ−ｔ−Ｂｕ）保護されているシステインを含む熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳ ２８２〜３８３）のラージスケールでの合成および精製を、以下の点を除いては実施例１と同じ条件で行った（図１０および１１に示す）。
【００６１】
フォールディングは、遊離のシステインをフォールディング緩衝液に添加することなく、部分的に精製したペプチド（１．１ｇ）を０．１Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４（１．０Ｌ、ｐＨ ８．０）に溶解することにより行った。１８時間の間、反応混合物を３２℃に維持した。次いで、生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した（図１２および１３）。最終酸化型生成物の収率はおよそ３７％であった。
【００６２】
クロマトグラフィー分析は以下の条件で行った。
カラム：Ｃ１８ ２５０×４．６ｍｍ （Ｖｙｄａｃ＃２３８ＴＰ５４）
移動相：Ａ＝１００％ Ｈ_２Ｏ ０．１％ ＴＦＡ
Ｂ＝１００％ ＣＨ_３ＣＮ ０．１％ ＴＦＡ
勾配：Ｂ％組成はクロマトグラフィー図で報告する
検出器：２１４ｎｍ。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｓ−ｔ−ブチル除去およびｈｕ−Ｉ−３０９のフォールディングの前のＨＰＬＣプロフィールを示す（実施例４）。
【図２】図２は図１の生成物の質量測定の結果を示す。
【図３】図３は、短い保持時間を示す脱保護したフォールディングしたｈｕ−Ｉ−３０９（実施例４）のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図４】図４は、図３の生成物の質量測定の結果を示す。
【図５】図５は、ＮＥＭでの処理後の、図３に示した生成物の質量測定の結果を示す。図４と比較して質量に変化は観察されず、これは遊離の−ＳＨ基が存在しないことを示す。
【図６】図６は、組換えＩ−３０９と、本発明の合成のフォールディングしたＩ−３０９との生物学活性の比較のグラフである。生物学的活性は、^１２５Ｉで標識したケモカインのヒトリンパ球への結合により評価した。
【図７】図７は、フォールディング後の実施例５のタンパク質の分析用ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図８】図８は、実施例５の、フォールディングしたタンパク質の分取ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図９】図９は、実施例５の精製した生成物の質量測定の結果を示し、これは予測分子量を示す。
【図１０】図１０は、Ｓ−ｔ−ブチル除去およびフォールディングの前の実施例６のポリペプチドのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１１】図１１は、図１０のポリペプチドの質量測定の結果を示す（Ｍ＝Ｈ）。
【図１２】図１２は、フォールディングの後の、実施例６のタンパク質のＨＰＬＣプロフィールを示し、これはより短い保持時間を示す。
【図１３】図１３は、図１２のタンパク質の質量測定の結果（Ｍ＝Ｈ）を示し、これは予測分子量を示す。

Claims (27)

1. ２つ以上の誘導体型システイン残基を有するポリペプチドおよび／またはタンパク質を、規定のｐＨおよび温度を有するフォールディング緩衝液中で還元剤を用いて処理することを含む、化学的に合成したポリペプチドをフォールディングする方法。
2. 誘導体型システイン残基がＳ−ブチル−チオ−システイン残基に対応する、請求項１に記載の方法。
3. 還元剤がシステインである、請求項１または２に記載の方法。
4. フォールディング緩衝液が１つ以上のカオトロピック塩を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
5. カオトロピック塩が、塩化グアニジウムおよび尿素からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. フォールディング緩衝液中のカオトロピック塩が０．１〜１Ｍの濃度で存在する、請求項４または５に記載の方法。
7. フォールディング緩衝液がアルカリ性のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
8. ｐＨが７と９との間にある、請求項７に記載の方法。
9. ｐＨが７と８．５との間にある、請求項７または８に記載の方法。
10. フォールデング緩衝液の温度が２５℃と４０℃との間にある、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
11. 温度が２７℃と３８℃との間にある、請求項１０に記載の方法。
12. 温度が約３７℃である、請求項１０または１１に記載の方法。
13. （ａ）２つ以上の誘導体型システイン残基を有するポリペプチドを化学的に合成すること、
    （ｂ）該ポリペプチドを、規定のｐＨおよび温度を有するフォールディング緩衝液中で還元剤を用いて処理すること、
    （ｃ）得られたフォールディングしたポリペプチドおよび／またはタンパク質を精製することを含む、生物学的に活性なタンパク質の製造方法。
14. 誘導体型システイン残基がＳ−ブチル−チオ−システイン残基に対応する、請求項１３に記載の方法。
15. 還元剤がシステインである、請求項１３または１４に記載の方法。
16. フォールディング緩衝液が１つ以上のカオトロピック塩を含む、請求項１３、１４または１５に記載の方法。
17. カオトロピック塩が、塩化グアニジウムおよび尿素からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. フォールディング緩衝液中のカオトロピック塩が０．１〜１Ｍの濃度で存在する、請求項１５または１６に記載の方法。
19. フォールディング緩衝液がアルカリ性のｐＨを有する、請求項１３〜１８のいずれか１つに記載の方法。
20. フォールディング緩衝液のｐＨが７と９との間にある、請求項１９に記載の方法。
21. ｐＨが７と８．５との間にある、請求項２０に記載の方法。
22. フォールデング緩衝液の温度が２５℃と４０℃との間にある、請求項１３〜２１のいずれか１つに記載の方法。
23. 温度が２７℃と３８℃との間にある、請求項２２に記載の方法。
24. 温度が約３７℃である、請求項２２または２３に記載の方法。
25. （ａ）不溶性のポリマー性支持体上で、段階的な鎖伸長によりＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドをアセンブリすること、
    （ｂ）該Ｓ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチド鎖を酸分解により該支持体から切断すること、
    （ｃ）該得られたＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドを精製すること、
    （ｄ）カオトロピック塩を含み、アルカリ性のｐＨおよび約３７℃の温度を有するフォールディング緩衝液中でモル過剰のシステインを用いて精製したＳ−ｔ−ブチル−チオシステインポリペプチドを処理することにより、該ポリペプチド誘導体をフォールディングすること、
    （ｅ）得られたフォールディングしたタンパク質を逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製することを含む、請求項１３〜２４のいずれかに記載の方法。
26. カオトロピック塩が、塩化グアニジウムである、請求項２５に記載の方法。
27. 該ポリマー性支持体が、酸不安定性ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸リンカーで官能化したポリアミドまたはポリスチレンベースの樹脂である、請求項２５または２６に記載の方法。

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