CN110845595A - 一种固相合成5-tmara标记的铁调素-25的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种固相合成5‑TMARA标记的铁调素‑25的方法，属多肽合成技术领域。其步骤如下：合成铁调素‑25多肽链；5‑TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5‑TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；除去侧链保护基和从树脂上移除多肽；还原剂的制备和多肽的还原；纯化和折叠粗多肽溶液；纯化得到多肽5‑TMARA标记的铁调素‑25。本发明方法采用固相合成，操作简单，可在实验室大量制备铁调素‑25，所制得的铁调素‑25纯度高，方法合成周期短，5‑TMARA标记的铁调素可用于后期生物体内的跟踪实验。

Description

一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法
技术领域
本发明涉及多肽的合成方法，特别是一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，属于多肽制备技术领域。
背景技术
铁调素是人体内的一种铁平衡调节多肽。活性多肽铁调素-25主要是在肝脏中产生，通过蛋白质溶解切割前铁调素的C-端的25个氨基酸所产生的。随后，N-端的铁调素-25转化为更小的多肽(大约20～24个氨基酸)，这些多肽活性更低并且在尿液中累积。目前有多项研究已把铁调素作为炎症性贫血的潜在生物标记物，使其在恶性贫血检测方面具有重要意义。现有技术中多是采用基因工程制备多肽，其缺陷主要体现在：
1.成本高且时间周期长，不适实验室制备；
2.技术不成熟，失败率高；
3.分子量小的多肽纯化困难，酶切后多肽难回收；
4.质量控制难度较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高收率、低成本、反应条件温和、可在实验室大量制备，有利于进行生物体内跟踪实验的荧光标记的铁调素的合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特点是，其步骤如下：
(1)合成铁调素-25多肽链：使用含有20％哌啶的DMF溶液去除氨基酸的保护基团使其暴露氨基；将被保护的氨基酸活化后加入使其与上一个氨基酸的游离氨基连接；重复此步骤25次得到含有25个氨基酸残基的肽链；使用含有20％哌啶的DMF溶液去除最后一个氨基酸的保护基团使其暴露末端氨基，使用BOC保护基团保护末端游离的氨基；
(2)5-TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5-TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；
(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽：去除所有的侧链保护基团并将多肽链从树脂上切除；
(4)还原剂的制备和多肽的还原：还原多肽链避免暴露在空气中形成二硫键；
(5)纯化和折叠粗多肽溶液；将肽链加入配好的反应液中使其折叠并形成链内二硫键；纯化得到多肽5-TMARA标记的铁调素-25。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(1)合成铁调素-25多肽链的具体步骤如下：
1)取干燥的Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂装柱；向柱中加入DMF并在旋转仪上转动，待树脂溶胀后，通过真空抽滤除去溶液并使用DMF再次洗涤树脂；随后加入含有20％哌啶的DMF溶液并将柱子旋转除去Fmoc基团；氨基酸脱保护后使用DMF洗涤若干次以确保树脂中没有残留的哌啶；
2)将适量的氨基酸和HBTU溶解在无水DMF中，然后加入适量的TMR，搅拌使其充分活化；将反应溶液加入到准备好的树脂中，并将柱子放在旋转仪上旋转反应；使用DIC和Oxyma进行活化步骤，链接完一个氨基酸残基后，通过TNBS试验测试树脂，以确保所有上一个氨基酸游离的N-末端氨基与下一个氨基酸的羧基连接；
3)根据铁调素-25的序列，对每个随后的氨基酸重复上述循环；完成肽链的合成后，加入含有20％哌啶的DMF溶液以除去肽链末端Fmoc-基团，并通过使用DIPCDI和Oxyma将Boc-基团与末端氨基酸连接。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，通过TNBS试验即一滴Picrylsulfonic acid和一滴N，N'-二异丙基乙胺测试树脂以确保所有Fmoc基团都被去除。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，活化时，氨基酸、HBTU、无水DMF和TMR的用量比为：1.2mmol：1.2mmol：2.6ml：2.4mol。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(2)5-TMARA标记多肽的具体步骤如下：
用含有2％水合肼的DMF溶液除去第21个氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH的Dde侧链保护基；使用DMF洗涤4次以确保树脂没有残留的水合肼，再使用纯DMF洗涤树脂以确保柱中没有残留的水；最后向柱中加入过量的5-TMARA，适量的氧化胺、DIC和DMF溶液，将柱轻轻旋转24小时。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽具体步骤如下：
用DMF洗去残留的5-TMARA，Oxyma和DIPCDI后，用甲醇和乙醚洗涤树脂以收缩树脂，再将柱子真空干燥；按水/苯酚/DODT/TFA/茴香硫醚/三乙基硅烷：500μl/50mg/500μl/250μl/8.25ml/100μl组成的裂解溶液并加入到干燥的树脂中，混合，静置；反应结束后，将裂解混合物过滤到离心管中，并将乙醚加入离心管中进行离心提取肽链，并使用乙醚离心洗涤肽链3次，每次5分钟，3500rpm；最后将提取的肽链溶解于0.1％TFA/水中并冷冻干燥。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(4)还原剂的制备和多肽的还原的具体步骤如下：
将6M盐酸胍，10mM EDTA和0.5M Tris溶解于500ml的水中，搅拌溶液直至溶液温度达到室温；然后通过pH/离子计测量溶液pH，并通过滴加6M HCL溶液将其调节至8.0；将500ml还原缓冲液移入1L容量瓶中，加入水，得到1L还原缓冲液；将粗肽和还原缓冲液放入锥形烧瓶中，并将氮气通入溶液中；搅拌溶液并将DTT加入溶液中；通过使用pH测试条测量溶液的pH，并通过滴加6M HCL溶液将溶液pH调节至2-3；还原反应时间持续24小时。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(5)纯化和折叠粗多肽溶液的具体步骤如下：
使用C18反相柱纯化肽，并使用泵控制流速使其保持在20ml/min；用甲醇和0.1％TFA/水洗涤柱以排出气泡；然后加入肽溶液并使用0.1％TFA/水洗掉所有的盐类；使用15％乙腈和85％TFA/水溶液洗去残留的出肽链以外化合物；用60％乙腈和40％TFA/水溶液提取肽；将肽链收集到圆底烧瓶中，并将烧瓶在40℃下旋转蒸发以排除所有乙腈；将适量的盐酸胍，Tris和EDTA加入装有水的玻璃广口瓶中，放置溶液直至溶液温度达到室温；通过pH/离子计测量溶液pH，并滴加6M HCL溶液将其pH调节至7.4；然后将适量的氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽加入缓冲液中；最后，将肽链加入折叠缓冲液中，并将溶液在室温下放置3天。
本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，用以下方法进行高效液相色谱纯化多肽和质谱表征：
折叠后，使用相同的C18反相柱和洗脱液除去离子和氧化剂；将肽溶液收集到圆底烧瓶中，旋转蒸发烧瓶以排除所有乙腈；然后将肽溶液冷冻干燥冷冻储存；将少量的折叠后多肽链使用HPLC纯化，并选择最纯的样品的进行质谱分析；洗脱液的梯度模式为：0到1分钟，0％B缓冲液；1到3分钟，B缓冲液从0增加到20％；3到5分钟，B缓冲液保持20％；5到25分钟，B缓冲液从20％增加到60％；25到27分钟，B缓冲液从60％增加到90％；27到28分钟，B缓冲液保持90％；28到29分钟，B缓冲液减少90％至0％；29至30分钟，B缓冲液保持0％。A缓冲液：90％水和10％甲醇；B缓冲液：90％甲醇和10％水。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法采用固相合成，操作简单，可在实验室大量制备铁调素-25，所制得的铁调素-25纯度高，方法合成周期短，5-TMARA标记的铁调素可用于后期生物体内的跟踪实验。
附图说明
图1为本发明合成方法的合成总路线图；
图2为纯化后的TMARA标记的铁调素-25的HPLC图；保留时间为14.3min，紫外波长为220nm。反相高效液相色谱条件:Poroshell 120C18 column(2.1×50nm,2.7mcm)。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法：
合成路线图参照图1，其步骤如下：
1)合成铁调素-25多肽链
称取1.0g干燥的Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂(0.30mmol/g)装柱。然后，向柱中加入DMF并在旋转仪上转动15min，待树脂溶胀后，通过真空抽滤除去溶液并使用DMF再次洗涤树脂。随后加入含有20％哌啶的DMF溶液并将柱子轻轻旋转10分钟除去Fmoc基团。氨基酸脱保护后使用DMF洗涤四次以确保树脂中没有残留的哌啶，然后通过TNBS试验(一滴Picrylsulfonic acid和一滴N，N'-二异丙基乙胺)测试树脂以确保所有Fmoc基团都被去除。最后，使用纯DMF进行洗涤以确保柱中没有残留的水。
将1.2mmol氨基酸和1.2mmol HBTU溶解在2.6ml无水DMF中，然后加入2.4mol TMR。搅拌反应溶液90s使其充分活化。最后，将反应溶液加入到准备好的的树脂中，并将柱子放在旋转仪上旋转反应1小时。
Fmoc-Cys-OH和Fmoc-His(Trt)-OH不能在碱性环境中活化，因此使用DIC和Oxyma进行活化步骤。链接完一个氨基酸残基后，通过TNBS试验测试树脂，以确保所有上一个氨基酸游离的N-末端氨基与下一个氨基酸的羧基连接。根据铁调素的序列，对每个随后的氨基酸重复该循环。完成肽链的合成后，加入含有20％哌啶的DMF溶液以除去肽链末端Fmoc-基团，并通过使用DIPCDI和Oxyma将Boc-基团与末端氨基酸连接。
去除Fmoc保护基团的机理路线如下路线1：
Figure BDA0002273946690000051
使用TMP和HCTU活化氨基酸的机理路线如下路线2：
路线2中，R1为任意氨基酸的侧链，如：丝氨酸，赖氨酸，脯氨酸，天冬氨酸等人体中的20种氨基酸。
使用DIC和Oxyma活化氨基酸的机理路线如下路线3：
Figure BDA0002273946690000062
路线3中，R1、R2为任意氨基酸的侧链，如：丝氨酸，赖氨酸，脯氨酸，天冬氨酸等人体中20氨基酸，R1、R2可以为一种氨基酸侧链。
肽键形成的机理路线如下路线4：
Figure BDA0002273946690000071
路线4中，R1、R2为任意氨基酸的侧链，如：丝氨酸，赖氨酸，脯氨酸，天冬氨酸等人体中20氨基酸，R1、R2可以为一种氨基酸侧链。
2)5-羧四甲基罗丹明(5-TMARA)标记多肽
合成步骤结束后，用含有2％水合肼的DMF溶液除去第21个氨基酸(Fmoc-Lys(Dde)-OH)的Dde侧链保护基。随后，使用DMF洗涤四次以确保树脂没有残留的水合肼，再使用纯DMF洗涤树脂以确保柱中没有残留的水。最后向柱中加入0.6mmol 5-羧四甲基罗丹明(2过量)，0.6mmol氧化胺，0.6mmol DIC和合适的适量的DMF溶液(确保树脂可以流动)并将柱轻轻旋转24小时。5-羧四甲基罗丹明(5-TMARA，CAS号：91809-66-4)的结构式如下：
Figure BDA0002273946690000072
5-TMARA是5(6)-TMARA纯化后的产物，由于5-TMARA和6-TMARA的共轭略有不同所以生物特性亦不同，相比于5(6)-TMARA，5-TMARA的实验可重复性更强。
去除Lys21的Dde保护基团的机理路线如下路线5：
Figure BDA0002273946690000081
路线5中：R1为21号赖氨酸残基左侧的肽链，R2为21号赖氨酸残基右侧的肽链。
3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽
用DMF洗去残留的5-TMARA，Oxyma和DIPCDI后，用甲醇和乙醚洗涤树脂以收缩树脂。之后，将柱子放入真空中3小时进行干燥。裂解溶液按括号中的顺序制备完成后(水/苯酚/DODT/TFA/茴香硫醚/三乙基硅烷：500μl/50mg/500μl/250μl/8.25ml/100μl)立即加入到干燥的树脂中，轻轻混合30秒并静置3小时。反应结束后，将裂解混合物过滤到离心管中，并将乙醚加入离心管中进行离心提取肽链，并使用乙醚离心洗涤肽链三次(3500r，5分钟)。最后将提取的肽链溶解于0.1％TFA/水中并冷冻干燥。
裂解溶液去除所用侧链保护基团的机理路线如下路线6:
Figure BDA0002273946690000091
路线6中：R1为丝氨酸残基左侧的肽链，R2为丝氨酸残基右侧的肽链，S1为侧链保护基团，如叔丁氧基羰基保护基，苄氧羰基保护基，叔丁基保护基等侧链保护基团。
将6M盐酸胍，10mM EDTA和0.5M Tris溶解于500ml的水中，搅拌溶液直至溶液温度达到室温。然后通过PH/离子计测量溶液PH，并通过滴加6M HCL溶液将其调节至8.0。将500ml还原缓冲液移入1L容量瓶中，加入水，得到1L还原缓冲液。将粗肽和还原缓冲液放入锥形烧瓶中，并将氮气通入溶液中。搅拌溶液并将DTT(约50mg)加入溶液中。通过使用pH测试条测量溶液的PH，并通过滴加6M HCL溶液将溶液pH调节至约2-3。该还原反应需要持续24小时。
5)纯化和折叠粗多肽溶液
使用C18反相柱纯化肽，并使用泵控制流速使其保持在20ml/min。先使用200μl甲醇和200ml 0.1％TFA/水洗涤柱以排出气泡。然后加入肽溶液并使用500ml 0.1％TFA/水洗掉所有的盐类。再使用200ml 15％乙腈和85％TFA/水溶液(0.1％vol/vol)洗去残留的出肽链以外化合物。最后，使用200ml 60％乙腈和40％TFA/水溶液(0.1％vol/vol)提取肽。将肽链收集到200ml圆底烧瓶中，并将烧瓶在40℃下旋转蒸发以排除所有乙腈。将20mol盐酸胍，1molTris和0.1molEDTA加入装有10L水的玻璃广口瓶中，放置溶液直至溶液温度达到室温。通过pH/离子计测量溶液PH，并滴加6M HCL溶液将其pH调节至7.4。然后将适量的氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽加入缓冲液中。最后，将肽链加入折叠缓冲液中，并将溶液在室温下放置3天。
使用GSSG/GSH折叠肽链的机理路线如下路线7：
Figure BDA0002273946690000101
路线7中：R1，R2，R3为合成的铁调素肽链中的不同片段，R1和R2片段间有一个半胱氨酸残基，R1和R3片段间有一个半胱氨酸残基。
6)用高效液相色谱纯化多肽和质谱表征
折叠后，使用相同的C18反相柱和洗脱液除去离子和氧化剂。将肽溶液收集到圆底烧瓶中，旋转蒸发烧瓶以排除所有乙腈。然后，将肽溶液冷冻干燥并放入冷冻储存。先将少量的折叠后多肽链使用HPLC纯化，并选择最纯的样品的进行质谱分析。得到的HPLC洗脱梯度将用于后续的大规模纯化(使用大型的C18硅胶柱并用三相泵进行控制)。洗脱液的梯度模式为：0到1分钟，0％B缓冲液；1到3分钟，B缓冲液从0增加到20％；3到5分钟，B缓冲液保持20％；5到25分钟，B缓冲液从20％增加到60％；25到27分钟，B缓冲液从60％增加到90％；27到28分钟，B缓冲液保持90％；28到29分钟，B缓冲液减少90％至0％；29至30分钟，B缓冲液保持0％。A缓冲液：90％水和10％甲醇；B缓冲液：90％甲醇和10％水。纯化后的TMARA标记的铁调素-25的HPLC图参照图2。

Claims (9)

1.一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)合成铁调素-25多肽链：使用含有20％哌啶的DMF溶液去除氨基酸的保护基团使其暴露氨基；将被保护的氨基酸活化后加入使其与上一个氨基酸的游离氨基连接；重复此步骤25次得到含有25个氨基酸残基的肽链；使用含有20％哌啶的DMF溶液去除最后一个氨基酸的保护基团使其暴露末端氨基，使用BOC保护基团保护末端游离的氨基；
(2)5-TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5-TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；
(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽：去除所有的侧链保护基团并将多肽链从树脂上切除；
(4)还原剂的制备和多肽的还原：还原多肽链避免暴露在空气中形成二硫键；
(5)纯化和折叠粗多肽溶液；将肽链加入配好的反应液中使其折叠并形成链内二硫键；纯化得到多肽5-TMARA标记的铁调素-25。
2.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(1)合成铁调素-25多肽链的具体步骤如下：
1)取干燥的Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂装柱；向柱中加入DMF并在旋转仪上转动，待树脂溶胀后，通过真空抽滤除去溶液并使用DMF再次洗涤树脂；随后加入含有20％哌啶的DMF溶液并将柱子旋转除去Fmoc基团；氨基酸脱保护后使用DMF洗涤若干次以确保树脂中没有残留的哌啶；
2)将适量的氨基酸和HBTU溶解在无水DMF中，然后加入适量的TMR，搅拌使其充分活化；将反应溶液加入到准备好的树脂中，并将柱子放在旋转仪上旋转反应；使用DIC和Oxyma进行活化步骤，链接完一个氨基酸残基后，通过TNBS试验测试树脂，以确保所有上一个氨基酸游离的N-末端氨基与下一个氨基酸的羧基连接；
3)根据铁调素-25的序列，对每个随后的氨基酸重复上述循环；完成肽链的合成后，加入含有20％哌啶的DMF溶液以除去肽链末端Fmoc-基团，并通过使用DIPCDI和Oxyma将Boc-基团与末端氨基酸连接。
3.根据权利要求2所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，通过TNBS试验即一滴Picrylsulfonic acid和一滴N，N'-二异丙基乙胺测试树脂以确保所有Fmoc基团都被去除。
4.根据权利要求2所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，活化时，氨基酸、HBTU、无水DMF和TMR的用量比为：1.2mmol：1.2mmol：2.6ml：2.4mol。
5.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(2)5-TMARA标记多肽的具体步骤如下：
用含有2％水合肼的DMF溶液除去第21个氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH的Dde侧链保护基；使用DMF洗涤4次以确保树脂没有残留的水合肼，再使用纯DMF洗涤树脂以确保柱中没有残留的水；最后向柱中加入过量的5-TMARA，适量的氧化胺、DIC和DMF溶液，将柱轻轻旋转24小时。
6.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽具体步骤如下：
用DMF洗去残留的5-TMARA，Oxyma和DIPCDI后，用甲醇和乙醚洗涤树脂以收缩树脂，再将柱子真空干燥；按水/苯酚/DODT/TFA/茴香硫醚/三乙基硅烷：500μl/50mg/500μl/250μl/8.25ml/100μl组成的裂解溶液并加入到干燥的树脂中，混合，静置；反应结束后，将裂解混合物过滤到离心管中，并将乙醚加入离心管中进行离心提取肽链，并使用乙醚离心洗涤肽链3次，每次5分钟，3500rpm；最后将提取的肽链溶解于0.1％TFA/水中并冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(4)还原剂的制备和多肽的还原的具体步骤如下：
将6M盐酸胍，10mM EDTA和0.5M Tris溶解于500ml的水中，搅拌溶液直至溶液温度达到室温；然后通过pH/离子计测量溶液pH，并通过滴加6M HCL溶液将其调节至8.0；将500ml还原缓冲液移入1L容量瓶中，加入水，得到1L还原缓冲液；将粗肽和还原缓冲液放入锥形烧瓶中，并将氮气通入溶液中；搅拌溶液并将DTT加入溶液中；通过使用pH测试条测量溶液的pH，并通过滴加6M HCL溶液将溶液pH调节至2-3；还原反应时间持续24小时。
8.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(5)纯化和折叠粗多肽溶液的具体步骤如下：
使用C18反相柱纯化肽，并使用泵控制流速使其保持在20ml/min；用甲醇和0.1％TFA/水洗涤柱以排出气泡；然后加入肽溶液并使用0.1％TFA/水洗掉所有的盐类；使用15％乙腈和85％TFA/水溶液洗去残留的出肽链以外化合物；用60％乙腈和40％TFA/水溶液提取肽；将肽链收集到圆底烧瓶中，并将烧瓶在40℃下旋转蒸发以排除所有乙腈；将适量的盐酸胍，Tris和EDTA加入装有水的玻璃广口瓶中，放置溶液直至溶液温度达到室温；通过pH/离子计测量溶液pH，并滴加6M HCL溶液将其pH调节至7.4；然后将适量的氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽加入缓冲液中；最后，将肽链加入折叠缓冲液中，并将溶液在室温下放置3天。
9.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，用以下方法进行高效液相色谱纯化多肽和质谱表征：
折叠后，使用相同的C18反相柱和洗脱液除去离子和氧化剂；将肽溶液收集到圆底烧瓶中，旋转蒸发烧瓶以排除所有乙腈；然后将肽溶液冷冻干燥冷冻储存；将少量的折叠后多肽链使用HPLC纯化，并选择最纯的样品的进行质谱分析；洗脱液的梯度模式为：0到1分钟，0％B缓冲液；1到3分钟，B缓冲液从0增加到20％；3到5分钟，B缓冲液保持20％；5到25分钟，B缓冲液从20％增加到60％；25到27分钟，B缓冲液从60％增加到90％；27到28分钟，B缓冲液保持90％；28到29分钟，B缓冲液减少90％至0％；29至30分钟，B缓冲液保持0％。A缓冲液：90％水和10％甲醇；B缓冲液：90％甲醇和10％水。
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