CN104356221B - 一种制备培西加南的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种制备培西加南的方法。本发明的具体步骤为：A）通过液相法合成二肽片段Fmoc‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑OH；B）采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中7、8位，10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑OH偶联；C）肽树脂裂解，纯化，冻干后得到培西加南。本发明提供了一种合成效率高、成本低、同时还能避免两个赖氨酸偶联不完全产生的缺失肽杂质，适合规模化生产的培西加南的合成工艺。

Description

一种制备培西加南的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽类抗生素的制备方法，特别涉及一种制备培西加南的方法。
背景技术
培西加南，英名为：pexiganan，是含有22个氨基酸的线性多肽，肽序列为：
培西加南是葛兰素史克公司和Genaera公司(原Magainin Pharmaceuticals公司)联合开发的产品。它作为一种广谱的局用抗菌剂，用于治疗糖尿病足部溃疡的感染。培西加南最初是从爪蟾的腹部皮肤分离来的，为动物源的多肽类抗菌药物，是多肽类抗生素族magainin的一员，也是近20年来第2种新的抗生素族，能有效地对抗3000多种分离菌株，包括细菌(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和厌氧菌)、变形虫、真菌和寄生虫。培西加南作用机制不同于其它的抗生素，主要通过攻击微生物的细胞膜来杀菌，而大多数其它的抗生素则是使细菌关键蛋白失去功能。因此，有望成为新一代的抗菌剂。
由于爪蟾的正常细胞组织中含量有限，直接获得培西加南非常困难。CN200510014833和WO2011069280均报道了培西加南的基因工程的生产方法，采用基因工程技术制备抗菌肽，由于存在在于发酵表达量少，收率低，生产成本高的缺点，因此不利于工业化大生产。目前，多肽的合成主要还是运用固相多肽合成法制备，WO2011069280还报道了培西加南的类似物的多肽固相逐步偶联合成方法，此方法合成步骤较多，合成周期长，纯度和收率不高，特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质，因此也不适合规模化生产。
综上所述，现有培西加南的制备过程中，合成步骤较多，合成周期长，效率低，纯度和收率不高，特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质，不适合规模化生产。
发明内容
本发明人用现有的合成方法，制备培西加南，发现现有技术存在的技术问题是：合成步骤较多，合成周期长，效率低，纯度和收率不高，特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质，不适合规模化生产。为此，本发明人对培西加南的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
本发明的目的是提供一种制备培西加南的方法。本发明的合成路线如图1所示：首先通过液相法合成二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；其次采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中7、8位，10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联；肽树脂裂解，纯化，冻干后得到培西加南。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N,N′-二异丙基碳化二亚胺
DCC ：N,N′-二环己基碳二亚胺
PyBOP ：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU ：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1- 羟基苯骈三唑
HOSu ：N-羟基琥珀酰亚胺
Boc ：叔丁氧羰基
Lys ：赖氨酸
Leu ：亮氨酸
Ile ：异亮氨酸
Val ：缬氨酸
Phe ：苯丙氨酸
Ala ：丙氨酸
Gly ：甘氨酸
DMF ：N,N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM ：二氯甲烷
NMP ：N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
Piperidine ：六氢吡啶
DIEA ：N,N′-二异丙基乙胺
为此本发明提供一种培西加南的合成方法，其步骤如下：
步骤1，通过液相法合成二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；
步骤2，采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中7、8位，10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联；
步骤3，肽树脂裂解，纯化，冻干后得到培西加南。
其中，步骤1所述的二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH的合成方法包括如下步骤：1）Fmoc-Lys(Boc)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-OSu，然后Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Lys(Boc)-OH反应得到二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：
1）采用0.10~0.60mmol/g 的氨基树脂为起始树脂；
2）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；
3）在偶联剂系统的存在下，氨基树脂和偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-氨基树脂；
4）重复步骤2）、3），按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中7、8位，10、11位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH。所述氨基树脂选自Rink Amide AM 树脂、Rink Amide MBHA 树脂，优选Rink Amide MBHA 树脂；其中所述氨基树脂的替代度为0.10~0.60mmol/g，优选为0.15~0.40mmol/g；所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。
本发明中，所述的树脂的取代度是采用紫外吸光光度法测定的树脂的取代度，用20%哌啶/DMF溶液将偶联Fmoc保护型氨基酸的树脂上的Fmoc保护基脱保护下来，用紫外吸光光度法测定其浓度，然后采用含Fmoc的氨基酸标准化合物例如Fmoc-Leu-OH，以外标法标定树脂上的Fmoc的mmol数值，除以树脂重量，即得到树脂的取代度或称之为替代度。
本发明的有益效果是：选用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH高效率、相对低成本的固相合成了培西加南，解决了两个赖氨酸偶联不完全，合成收率低，杂质多，不适用于工业化生产的问题；本发明提供了一种合成周期短、效率高、成本低、收率较高，适合规模化生产的培西加南的合成工艺。
附图说明
图1：本发明培西加南的合成路线；
图2 ：二肽片段的HPLC谱图；
图3：二肽片段的质谱谱图；
图4：培西加南粗肽的HPLC谱图；
图5：培西加南精肽的HPLC谱图；
图6：培西加南精肽的质谱谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树脂，其生产厂家和商品型号如下：
Fmoc保护基氨基酸原料、和树脂均为常规的市售试剂（厂家：吉尔生化（上海）有限公司；化学纯）；二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH是本专利描述合成的。
有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学纯）。
另外，下面实施例中提到的“旋蒸浓缩”以及“冻干”以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下：
旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205（瑞士Buchi(布奇)公司）；
旋蒸浓缩条件：30℃下，真空（-0.1Mpa）条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。
冻干设备：冻干机FD-3（北京博医康实验仪器有限公司）；
冻干条件：将冻干盘放入冰箱冷冻室(-20℃) 中，预冻6小时。开启冻干机，打开制冷，预冷30 分钟以上，设置冻干曲线如下：
第一段：在-27℃运行16小时；第二段：在-5℃运行4小时；第三段：在5℃运行2小时；第四段：在30℃运行16小时。
HPLC：Dionex高效液相色谱仪；用十八烷基硅烷键合硅胶（5μm，250×4.6mm）为填充剂；以0.1%TFA溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为220nm；柱温30℃。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
质谱： MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；仪器型号为AUTOFLEX SPEED TOF-TOF。
实施例一：Fmoc-Lys(Boc)-OSu活化酯的合成
称取468.50g Fmoc-Lys(Boc)-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000mlDMF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到503.37g Fmoc-Lys(Boc)-OSu活化酯，收率89%。
实施例二：Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH的合成
称取123.15g H-Lys(Boc)-OH（0.5mol）、282.79g Fmoc-Lys(Boc)-OSu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶，得到的固体油泵拉干得到296.15g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度为98.95%，收率85%；其质谱如图3所示，[M+Na]+：719.525、[M+K]+：735.773，二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH的理论精确分子量为：696.37，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。
实施例三：采用取代度为0.10mmol/g的Rink Amide AM树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂的合成
称取100.00 g取代度为0.10 mmol/g的Rink amide AM树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到104.55g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂。
实施例四：采用取代度为0.10mmol/g的Rink Amide MBHA树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂的合成
称取100.00 g取代度为0.10 mmol/g的Rink amide MBHA树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到105.05g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例五：采用取代度为0.60mmol/g的Rink Amide AM树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂的合成
称取16.67 g取代度为0.60 mmol/g的Rink amide AM树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到21.21g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂。
实施例六：采用取代度为0.60mmol/g的Rink Amide MBHA树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂的合成
称取16.67g取代度为0.60 mmol/g的Rink amide MBHA树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到21.52g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例七：采用取代度为0.15mmol/g的Rink Amide AM树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂的合成
称取66.67g取代度为0.10 mmol/g的Rink amide AM树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到71.21g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂。
实施例八：采用取代度为0.15 mmol/g的Rink Amide MBHA树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂的合成
称取66.67g取代度为0.15 mmol/g的Rink amide MBHA树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到71.64g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例九：采用取代度为0.40 mmol/g的Rink Amide AM树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂的合成
称取25.00g取代度为0.40 mmol/g的Rink amide AM树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到29.54g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂。
实施例十：采用取代度为0.40 mmol/g的Rink Amide MBHA树脂对 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 树脂的合成
称取25.00g取代度为0.40 mmol/g的Rink amide MBHA树脂（10mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取20.91g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到29.76g Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
实施例十一：培西加南 Rink amide AM 树脂的制备
取实施例九的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂（10 mmol）加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide AM 树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取10.63g Fmoc-Leu-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30 mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照培西加南主链肽序，依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH。其中，1）Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；2）Fmoc- Gly-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；3）Fmoc-Val-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到53.55g培西加南Rink amide AM树脂。
实施例十二：培西加南 Rink amide MBHA 树脂的制备
取实施例十的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂（10 mmol）加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink amide AM 树脂30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取10.63g Fmoc-Leu-OH（30mmol）和4.05g HOBt（30 mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照培西加南主链肽序，依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH。其中，1）Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；2）Fmoc- Gly-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；3）Fmoc-Val-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到55.24g 培西加南Rink amideMBHA树脂。
实施例十三：培西加南粗肽的制备
将上述实施例十二5.52g培西加南Rink amide MBHA树脂（1mmol）加入到100 mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲醚=95:5的体积比配置裂解液55 mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到培西加南粗肽2.96g，其HPLC谱图如图4所示，HPLC纯度83.98%，合成收率82%。
实施例十四：培西加南精肽醋酸盐的制备
称取上述实施例十三2.96g培西加南粗肽用2.8L水溶解后，第一次纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA；B相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：A相：0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到培西加南醋酸盐精肽1.73 g，其HPLC谱图如图5所示，HPLC纯度99.76%，纯化总收率70%，总收率56%。其质谱如图6所示，[M]+：2476.672，培西加南的理论精确分子量为：2476.633，样品质谱结果与理论分子量相符。
以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种制备培西加南的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，通过液相法合成二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；
步骤2，采用固相合成法，所述方法包括以下步骤：1)采用0.10～0.60mmol/g的氨基树脂为起始树脂；2)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3)在偶联剂系统的存在下，氨基树脂和Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-氨基树脂；4)重复步骤2)、3)，按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中7、8位，10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联；
步骤3，肽树脂裂解，纯化，冻干后得到培西加南。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
所述氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、Rink Amide MBHA树脂；其中所述氨基树脂的替代度为0.10～0.60mmol/g。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的氨基树脂优选Rink Amide MBHA树脂；所述氨基树脂的替代度优选为0.15～0.40mmol/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。
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