CN106883299A - 脂肪组织靶向多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白多肽领域，具体涉及一类脂肪组织靶向多肽及其制备方法和应用。所述的脂肪组织靶向多肽包括细胞靶向多肽肽段、细胞凋亡多肽肽段以及连接细胞靶向多肽肽段和细胞凋亡多肽肽段的桥链。本发明的脂肪组织靶向多肽可以特异性的使脂肪细胞凋亡，从而达到降脂减肥的疗效。并且由于其分子本身包含的靶向作用机理，可以避免发生现有减肥药物的常见不良反应，相比现有减肥药物具有更直接的疗效和更少的副作用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白多肽领域，具体涉及一类脂肪组织靶向多肽及其制备方法和应用。
背景技术
肥胖症作为一种常见的慢性内分泌代谢疾病，发病率呈逐年上升趋势，已成为全球性的公共健康难题。当人体进食的热量多于消耗量时便以脂肪形式存于体内，超过正常体重的20％即为肥胖。肥胖可发生于任何年龄，但以40岁以后者为多，女性发生率偏高。肥胖分为两大类型：一是单纯性肥胖，病人以肥胖为主要表现，不伴明显的神经和内分泌系统功能的改变，却伴有代谢调节障碍，这类肥胖最为多见。二是继发性肥胖，常继发脑炎、脑膜炎、脑部损害、垂体疾病、肾上腺皮质机能亢进、甲状腺机能低下、胰岛素分泌过多等。
多年来，肥胖症的行为和药物干预一直未被广泛接受。直至20世纪60年代开始了肥胖症行为治疗，使通过改变不良的饮食和运动习惯来减轻体重成为可能。研究表明，现有药物治疗可使体重减轻并能维持3～6个月。虽然研究病例有限，但却提出了一个与以往截然不同的概念，即肥胖症应与其他慢性疾病一样，通过长期的药物治疗来改善。尽管芬氟拉明等药物由于严重的心血管不良反应致使其最终撤出市场，但大量事实证明肥胖症有必要视作一种慢性疾病进行长期的药物治疗。
理想的减肥药物应能减少能量摄取，增加能量消耗，并改善肥胖相关的心血管疾病危险因子。迄今为止，肥胖药物按作用机制主要可分为三类：抑制食欲的药物，影响营养吸收的药物，增加能量消耗的药物。抑制食欲的药物有以下几类，作用于去甲肾上腺素的药物直接作用于中枢神经系统，刺激去甲肾上腺素(NE)的释放或阻断其再摄取，导致神经末梢NE耗竭，进而抑制食欲，减少摄食，降低体重。此类药物如安非拉酮。5-羟色胺(5-HT)受体激动剂通过促进5-HT的释放和(或)抑制其再摄取而达到减肥的目的。短期研究显示，此类药物有部分减轻体重的作用，疗效与作用与去甲肾上腺素类似，如：芬氟拉明、右芬氟拉明、氟西汀和舍曲林等。西布曲明为神经递质再摄取抑制剂类药物的代表，该药物通过NE和5-HT的再摄取，减少摄食，降低体重；不同于芬氟拉明和右芬氟拉明的是，西布曲明不诱导5-HT的释放，因而被认为与心血管疾病的发生无关。目前，FDA批准的减少营养物吸收的药物只有奥利司他，该药物可特异性地抑制胃肠道胰脂肪酶，抑制膳食中脂肪(甘油三酯)水解为可吸收的游离脂肪酸和甘油单脂，减少饮食中脂肪的吸收达30％，从而减轻体重，该药只通过外周组织发挥作用，全身吸收量甚微(﹤1％)。该药是第一个被认可的非食欲抑制性抗肥胖药物，其药理作用呈剂量依赖性，推荐剂量为一日3次，每次120mg。严格来说，目前临床上尚无增加能量消耗类的减肥药物，不过西布曲明除抑制食欲和增加饱腹感外，也有研究发现它能提高基础代谢率及促进产热效应。
发明内容
本发明所解决的现有技术的问题在于：目前临床应用的减肥药物，确实有助于减轻体重和减少体重反弹，但缺乏长期的安全性及疗效评估，长期服用易导致神经、心血管等系统疾病。本发明人通过研究肥胖症发生的机制，发现了全新的药物干预靶点，从而找到了发明所述的脂肪组织靶向多肽。
具体而言，本发明提供了一种脂肪组织靶向多肽，所述的脂肪组织靶向多肽包括细胞靶向多肽肽段、细胞凋亡多肽肽段以及连接细胞靶向多肽肽段和细胞凋亡多肽肽段的桥链。
优选的，其中细胞靶向多肽肽段选自以下序列中的一种：SEQ1，SEQ2，SEQ3，SEQ4，SEQ5，SEQ6，SEQ7，SEQ8，SEQ9，SEQ10，SEQ11，SEQ12，SEQ13，SEQ14，SEQ15，SEQ16，SEQ17，SEQ18，SEQ19，SEQ20，SEQ21，SEQ22，SEQ23，SEQ24，SEQ25，SEQ26，SEQ27，SEQ28，SEQ29，SEQ30；
其中所述的细胞靶向多肽肽段中的氨基酸独立地为甘氨酸和D型或者L型氨基酸，优选为甘氨酸和L型氨基酸。
优选的，所述的细胞靶向多肽肽段中的氨基酸为天然或非天然氨基酸，所述的天然氨基酸优选为经保护基团修饰的天然氨基酸；所述的保护基团优选为叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、烯丙基、(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基-1)乙基)中的一种或几种。
优选的，所述的细胞凋亡多肽肽段选自细胞凋亡因子或下列所述的肽链片段中的一种：SEQ31，SEQ32；
其中所述肽链片段中的氨基酸独立地为D型或者L型氨基酸；优选为氨基酸全部为D型氨基酸或者L型氨基酸；进一步优选为氨基酸全部为D型氨基酸。
优选的，所述的细胞凋亡多肽肽段选自细胞凋亡因子或肽链片段SEQ33；
其中所述肽链片段中的氨基酸独立地为甘氨酸和D型或者L型氨基酸；优选为甘氨酸和D型氨基酸。
优选的，所述的肽链片段中的氨基酸为天然或非天然氨基酸；所述的天然氨基酸优选为经保护基团修饰的天然氨基酸；所述的保护基团优选为叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、烯丙基、(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基-1)乙基)中的一种或几种。
优选的，所述的细胞凋亡因子选自以下中的一种：白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-5、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-18、干扰素-γ，干扰素-α、干扰素-β、肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞集落刺激因子。
优选的，所述的桥链为2～10个的天然或非天然氨基酸片段。
优选的，所述的桥链为2～6个氨基酸组成的片段，更优选为2个氨基酸片段。
更优选的，所述的桥链为包含甘氨酸或丙氨酸。
优选的，所述的脂肪组织靶向多肽为链状或者是环状脂肪组织靶向多肽；所述的环状脂肪组织靶向多肽优选为分子内成环的方式。
优选的，所述的成环方式为化学键，选自C-N、C-O、C＝N、C-C、C＝C、C-S、S-S、CO-NH、CO-S键中的一种或几种以上。
更优选的，所述的成环方式为S-S、CO-NH或CO-S键。
优选的，所述的脂肪组织靶向多肽采用聚乙二醇修饰，所述的脂肪组织靶向多肽的C端、N端或侧链的任一位置与聚乙二醇进行结合。
更优选的，所述的脂肪组织靶向多肽的桥链与聚乙二醇进行结合。
优选的，所述聚乙二醇选自PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500，PEG600，PEG700，PEG800，PEG900，PEG1000，PEG1100，PEG1200，PEG1300，PEG1400，PEG1500，PEG1600，PEG1700，PEG1800，PEG2000，PEG3000，PEG4000，PEG10000，PEG20000，PEG40000中的一种或几种以上。
优选的，所述聚乙二醇选自PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500中的一种或几种以上。
更优选的，所述聚乙二醇选自PEG10，PEG100，PEG200中的一种或几种以上。
本发明同时提供了一种脂肪组织靶向多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用固相合成法，依照脂肪组织靶向多肽的连接次序在偶联剂的作用下，依次进行氨基酸的偶联，合成具有N端保护的链状脂肪组织靶向多肽；
(2)裂解去除N端保护的基团，得到链状的脂肪组织靶向多肽。
优选的，所述偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自以下几种组合中的一种：(1)N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，
(2)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和N，N′-二异丙基乙胺，
(3)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N′-二异丙基乙胺，
(4)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啡啉，
(5)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N-甲基吗啡啉；
所述反应溶剂选自N，N′-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜中的一种或几种以上。
优选的，所述的制备方法还包括将步骤(2)得到的链状脂肪组织靶向多肽进行环化过程，得到环状脂肪组织靶向多肽；所述的环化过程包括液相环化和固相环化。
优选的，所述的液相环化包括如下步骤：
(1)链状脂肪组织靶向多肽在溶剂中进行溶解，
(2)调节溶液成碱性后加入氧化剂进行环化，
(3)调节溶液成酸性后得到环状脂肪组织靶向多肽；
所述的固相环化为将链状脂肪组织靶向多肽加入氧化剂得到环状脂肪组织靶向多肽。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的以上任一项所述的脂肪组织靶向多肽作为活性成分，以及一种或多种药用载体物质和/或稀释剂。
本发明还提供了以上任一项所述的脂肪组织靶向多肽或以上所述的药物组合物在制备治疗和/或预防减肥或其他与减肥相关疾病药物方面的用途。
同时，本发明也提供了以上任一项所述的脂肪组织靶向多肽或以上所述的药物组合物在治疗和/或预防减肥或其他与减肥相关疾病方面的用途。
本发明所取得的有益效果为：本发明获得了一种全新的靶向多肽药物。该化合物结构为将特异性细胞靶向多肽和细胞凋亡多肽通过桥链链接，其能够抑制目标物在脂肪血管内皮细胞中的表达和引起内脏脂肪组织的消融，该物质能促使新陈代谢正常化和在动物实验中快速逆转肥胖，并能破坏受体介导的细胞内化线粒体膜，其包括的D型氨基酸是提供了在血浆中肽酶酶解的抗性。此类化合物可以特异性的使脂肪细胞凋亡，从而达到降脂减肥的疗效。并且由于其分子本身包含的靶向作用机理，可以避免发生现有减肥药物的常见不良反应，相比现有减肥药物具有更直接的疗效和更少的副作用。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的在于提供一种脂肪组织靶向多肽，所述的脂肪组织靶向多肽包括细胞靶向多肽肽段、细胞凋亡多肽肽段以及连接细胞靶向多肽肽段和细胞凋亡多肽肽段的桥链。
本发明主要涉及一类合成的脂肪组织靶向多肽，其特点为细胞靶向多肽和细胞凋亡多肽通过桥链链接而成。并对不同的细胞靶向多肽、桥链和细胞凋亡多肽进行了筛选。该脂肪组织靶向多肽药物具有显著的疗效，并具有较低的生理毒性。本发明提供的脂肪组织靶向多肽，其临床用量范围为每天3-15mg/kg。
同时发明人通过化学合成法增加了脂肪组织靶向多肽的稳定性，如：将合成好的脂肪组织靶向多肽形成分子内二硫环从而增加了稳定性，并通过改变氨基酸序列使得获得的靶向多肽更加不容易被水解，且此多肽改良了肾脏的清除率。
脂肪组织靶向多肽由连续的氨基酸组成，可以选择性的作用在一般的人体器官、组织或细胞上且特别是脂肪组织或细胞上。脂肪组织靶向多肽对脂肪组织细胞具有识别作用，可以选择性的作用到脂肪组织细胞上。选择性定位可以使脂肪组织靶向多肽在目标组织或细胞上得以富集两倍或以上。此合成的脂肪组织靶向多肽具有降低生理毒性的特性，其中生理毒性包括肾脏毒性。
其中，本发明中的细胞靶向多肽可以特异性的作用在一般的人体器官、组织或细胞上且特别是脂肪组织或细胞上，将合成的脂肪组织靶向多肽特异性定位在脂肪组织或者脂肪细胞处；细胞凋亡多肽可以特异性的作用于脂肪组织处的细胞，使其凋亡，得到减肥瘦身的目的。
本发明所述的脂肪组织靶向多肽可以通过采用聚乙二醇(PEG)的方式进行修饰，聚乙二醇可以以单一或者多组的方式与肽链的C端、N端或侧链的任一位置进行结合，修饰后的多肽化合物可以延长其在生物体内的半衰期。
同时本发明所述的靶向脂肪组织多肽肽链可进行分子内成环，从而延长其在体内的半衰期，成环方式可以为二硫键或者酰胺键。其中二硫键采用氧化剂使半胱氨酸侧链巯基进行分子内成环，氧化剂优选为双氧水、碘及空气等。酰胺键采用偶联剂缩合氨基酸侧链的羧基和氨基制备可得。
本发明还提供了脂肪组织靶向多肽的制备方法，但不局限于下列方法：
本发明的路线以CRGGRAKDC-GG-D(KLAKLAKKLAKLAK)为例进行描述。采用固相合成法，以王树脂或者2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTC树脂)为起始树脂，按照所述的脂肪组织靶向多肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸；最后肽树脂裂解，环化，纯化，冻干后得到目标化合物。
为此本发明提供两种脂肪组织靶向多肽的合成方法，其步骤如下：
方法一：
(1)在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-D-Lys(Boc)-OH偶联得到Fmoc-D-Lys(Boc)-树脂；
(2)通过固相合成法，按照脂肪组织靶向多肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸；
(3)裂解，液相环化，纯化，冻干，得到脂肪组织靶向多肽。
其中，步骤(1)中所述树脂固体载体可以采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-D-Lys(Boc)-树脂为0.10～0.50mmol/g取代度的Fmoc-D-Lys(Boc)-CTC树脂，也可以直接通过购买得到。
其中，步骤(1)中所述树脂固体载体也可以采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-D-Lys(Boc)-树脂为0.10～0.50mmol/g取代度的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，也可以直接通过购买得到。
其中，步骤(2)所述的固相合成方法，
1)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-D-Lys(Boc)-树脂上的Fmoc保护基，得到H-D-Lys(Boc)-树脂；
2)在偶联剂系统的存在下，H-D-Lys(Boc)-树脂和Fmoc保护且侧链保护的D型丙氨酸偶联得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-树脂；
3)重复步骤1)、2)，按照脂肪组织靶向多肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，偶联氨基酸顺序为：
Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH；
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA、HATU/DIEA、PyBOP/HOBt/NMM或HATU/NMM；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或它们之间的任意组合；优选为DCM和DMF的组合。
其中，步骤(3)所述的液相环化方法，其步骤为：(1)链状肽在合适的溶剂中进行溶解，(2)调节溶液成碱性加入氧化剂进行环化，(3)调节溶液成酸性淬灭反应，得到环肽粗肽。
方法二：
方法二与方法一的不同之处在于，方法二中步骤(3)采用的是固相环化、裂解、纯化、冻干的方式，得到脂肪组织靶向多肽。
其中，方法二中的固相环化的方法为：(1)在肽树脂中加入氧化剂反应得环状多肽肽树脂，(2)洗涤获得的环状多肽肽树脂。
本发明的脂肪组织靶向多肽可用于治疗肥胖症或肥胖引起的相关疾病，具体地说，预计脂肪组织靶向多肽对于制备疗效更显著副作用更低的治疗肥胖症或肥胖引起的相关疾病的药物将是有用的。
其中本发明提到的多肽序列如下：
SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ2：Cys Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ3：Cys Lys Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ4：Cys Lys Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ5：Cys Asp Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys Cys，
SEQ6：Cys Glu Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys Cys，
SEQ7：Cys Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ8：Cys Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ9：Cys Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ10：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ11：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Glu Cys，
SEQ12：Cys Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ13：Cys Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ14：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ15：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu Cys，
SEQ16：Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ17：Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ18：Lys Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ19：Lys Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ20：Asp Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys，
SEQ21：Glu Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys，
SEQ22：Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ23：Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ24：Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ25：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ26：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Glu，
SEQ27：Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Arg Asp，
SEQ28：Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp，
SEQ29：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp，
SEQ30：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu；
SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，
SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，
SEQ33：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Gly Arg Ala Lys Lys Leu Ala Lys LeuAla Lys。
其中，多肽序列SEQ1一直到SEQ33中出现的Homo-Arg为高精氨酸。
具体而言，在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用单字母表示为CRGGRAKDC；细胞凋亡多肽肽段为SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu AlaLys，其采用单字母表示为：KLAKLAKKLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ2：CysHomo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用单字母表示为：CHomo-RGGRAKDC；细胞凋亡多肽肽段为SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala LysLys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用单字母表示为：KLAKLAKKLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ30：Lys GlyGly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu，其采用单字母表示为KGGG Homo-RARE；细胞凋亡多肽肽段为SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu AlaLys，其采用单字母表示为：KLAKLAKKLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ1：Cys Arg GlyGly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用单字母表示为：CRGGRAKDC；细胞凋亡多肽肽段为SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用单字母表示为：KLAKLAKRLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ2：CysHomo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用单字母表示为：CHomo-RGGRAKDC；细胞凋亡多肽肽段为SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala LysArg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用单字母表示为：KLAKLAKRLAKLAK；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ30：Lys GlyGly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu，其采用单字母表示为：KGGG Homo-RARE；细胞凋亡多肽肽段为SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys LeuAla Lys，其采用单字母表示为：KLAKLAKRLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为甘氨酸或丙氨酸。
在本发明的一种优选实施方式中，细胞靶向多肽肽段为SEQ1：Cys Arg GlyGly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用单字母表示为：CRGGRAKDC；细胞凋亡多肽肽段为SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用单字母表示为KLAKLAKKLAKLAK，细胞凋亡多肽肽段中的氨基酸为D型氨基酸；桥链为聚乙二醇修饰的甘氨酸或丙氨酸。
需要说明的是，本发明中脂肪组织靶向多肽中的氨基酸除甘氨酸以外，其他氨基酸若涉及到D构型或L构型时，均可以为D型或者L型氨基酸，以下实施例中用到的氨基酸在不表明构型时，默认为L型氨基酸，在涉及到D型氨基酸时，均会特别说明为D型氨基酸或者在左下角标注D来表示。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步的详细的说明。但是这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明范围的限制。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc：芴甲氧羰基
Fmoc-AA：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
DCC：N，N′-二环己基碳二亚胺
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羟基苯并三唑
tBu：叔丁基
OtBu:氧叔丁基
Trt：三苯甲基
Boc：叔丁氧羰基
Dde：(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基-1)乙基)
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Cys：半胱氨酸
Pro：脯氨酸
Leu：亮氨酸
Gly：甘氨酸
Arg：精氨酸
Ala：丙氨酸
Asp：天冬氨酸
Glu：谷氨酸
Lys：赖氨酸
DMF：N，N′-二甲基甲酰胺
MeOH：甲醇
DCM：二氯甲烷
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DMSO：二甲基亚砜
TFA：三氟醋酸
Piperidine：六氢吡啶
DMAP：4-二甲氨基吡啶
DIEA：N，N′-二异丙基乙胺
TMP：2,4,6-三甲基吡啶。
其中，实施例中所用的试剂和仪器的厂商型号如下：
Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，购自吉尔生化(上海)有限公司；
保护氨基酸，购自吉尔生化(上海)有限公司；
DMF(N，N′-二甲基甲酰胺)，购自浙江江山化工股份有限公司；
哌啶，购自上海凌峰化学试剂有限公司；
DCM(二氯甲烷)，购自浙江衢化氟化学有限公司；
DIC(N，N′-二异丙基碳化二亚胺)，购自淄博天堂山化工有限公司；
TFA(三氟醋酸)，购自浙江化工院科技有限公司；
苯甲硫醚，购自舒莱维化工科技(杭州)有限公司；
苯甲醚，购自上海凌峰化学试剂有限公司；
HOBt(1-羟基苯并三唑)，购自上海瀚鸿化工科技有限公司；
C18柱，C8柱，购自Daisogel；
四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)，购自安耐吉化学；
电子天平，JY10001，上海精密科学仪器有限公司。
(一)脂肪组织靶向多肽的合成
实施例一
实施例一首先制备合成了链状的SEQ34：CRGGRAKDC-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第12位到第25位的氨基酸均为D型氨基酸。然后通过环化过程将其中第1位的Cys的侧链和第9位的Cys的侧链成一个二硫键的环。其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，得到H-D-Lys(Boc)-王树脂，并用DMF洗涤6次。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH0.5mmol、HOBt0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点；如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时；从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联。偶联完毕，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.751g粗肽树脂。
4)裂解：为了去除树脂和肽链氨基酸侧链的保护基团，称取0.751g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽257.2mg。
5)液相环化：将粗肽用250ml水溶解后，用氨水调节PH至8后，加入双氧水50μl，反应2h后，用醋酸调节PH至6。
6)纯化，冻干：通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(20.7mg，8.02％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2582.5123(理论量为2582)。
实施例二
实施例二首先制备合成了链状的SEQ35：CHomo-RGGRAKDC-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的Cys的侧链和第9位的Cys的侧链成一个二硫键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH0.5mmol、HOBt0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点，从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联。偶联完毕，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.782g粗肽树脂。
4)裂解：称取0.782g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽261.7mg。
5)液相环化：将粗肽用250ml水溶解后，用氨水调节PH至8后，加入双氧水50μl，反应2h后，用醋酸调节PH至6。
6)纯化，冻干：而后通过C8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(22.7mg，8.73％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2598.5088(理论量为2598)。
实施例三
实施例三首先制备得到了链状的SEQ36：KGGG Homo-RARE-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第11位到第24位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的侧链的Lys和第8位的Glu的侧链成一个酰胺键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶联。
4)固相环化：偶联完毕，采用5倍量Pd(PPh3)4脱去Glu上的烯丙基并采用3％水合肼DMF溶液10ml脱去Lys上的Dde，并采用10倍量的PyBop和15倍量的DIEA反应过夜。环化完成后，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.725g粗肽树脂。
5)裂解：称取0.725g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽236.5mg。
6)纯化，冻干：将粗肽用250ml水溶解后。而后通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(22.6mg，9.24％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2445.3248(理论量为2445)。
实施例四
实施例四制备得到了链状的SEQ37：CRGGRAKDC-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的Cys的侧链和第9位的Cys的侧链成一个二硫键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，从而制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、HOBt 0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联。偶联完毕，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.762g粗肽树脂。
4)裂解：称取0.762g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽267.4mg。
5)液相环化：将粗肽用250ml水溶解后，用氨水调节PH至8后，加入双氧水50μl，反应2h后，用醋酸调节PH至6。
6)纯化，冻干：通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(24.2mg，9.27％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2610.5373(理论量为2610)。
实施例五：
实施例五首先制备得到了链状的SEQ38：C Homo-RGGRAKDC-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的Cys的侧链和第9位的Cys的侧链成一个二硫键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，从而制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点，从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联。偶联完毕，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.805g粗肽树脂。
4)裂解：称取0.805g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚＝95:3:2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽284.2mg。
5)液相环化：将粗肽用250ml水溶解后，用氨水调节PH至8后，加入双氧水50μl，反应2h后，用醋酸调节PH至6。
6)纯化，冻干：通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(23.6mg，8.73％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2626.4573(理论量为2626)。
实施例六
实施例六制备得到了链状的SEQ39：KGGG Homo-RARE-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第11位到第24位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的Lys的侧链和第8位的Glu的侧链的成一个酰胺键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF:哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，从而制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶联。
4)固相环化：偶联完毕，采用5倍量Pd(PPh3)4脱去Glu上的烯丙基并采用3％水合肼DMF溶液10ml脱去Lys上的Dde，并采用10倍量的PyBop和15倍量的DIEA反应过夜。环化完成后，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.736g粗肽树脂。
5)裂解：称取0.736g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽230.9mg。
6)纯化，冻干：将粗肽用250ml水溶解后，而后通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(21.0mg，9.24％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为2473.3188(理论量为2473)。
实施例七
实施例七首先制备得到了SEQ40：CRGGRAKDC-G-(PEG)10-CH2CH2-G-KLAKLAKKLAKLAK脂肪组织靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均为D型氨基酸；然后通过环化，将其中第1位的Cys的侧链和第9位的Cys的侧链成一个二硫键的环，其制备过程如下：
1)称取0.1mmol取代度为0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-D-Lys(Boc)-王树脂30分钟后，用DMF：哌啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，从而制备得到H-D-Lys(Boc)-王树脂。
2)称取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、HOBt 0.5mmol加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。从而制备得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王树脂。
3)重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-NH-PEG10-CH2CH2COOH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联。偶联完毕，将肽树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到0.837g粗肽树脂。
4)裂解：称取0.837g全保护的肽树脂，加入到25mL的三口圆底烧瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的体积比配置裂解液10mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到粗肽305.2mg。
5)液相环化：将粗肽用250ml水溶解后，用氨水调节PH至8后，加入双氧水50μl，反应2h后，用醋酸调节PH至6。
6)纯化、冻干：通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物(19.7mg，6.37％)，用MALDI-TOF分析产物，发现质子化的分子离子峰的m/z值为3093.5676(理论量为3093)。
(二)动物实验
1.实验目的
选取C57BL/6小鼠通过饲喂高脂饮食建造肥胖模型，观察脂肪组织靶向多肽对肥胖症小鼠的治疗效果，筛选出最佳治疗效果的脂肪组织靶向多肽和给药剂量，给其他相关实验研究提供参考依据。
2.试验系统及选择的理由
选用C57BL/6小鼠作为实验动物，是因为该啮齿类动物背景资料丰富，是国内外最常采用的啮齿类实验系统，且有利于与同类试验结果进行比较。
3.检疫与驯化
C57BL/6小鼠，购自山东弘立医学动物实验研究有限公司。实验用动物送达本公司后由检疫人员核对签收，并由检疫人员负责适应性饲养3d，每天对动物的行为动作、刺激反应、肌肉紧张力、呼吸、二便、外生繁系统、皮肤粘膜及眼等进行观察。
4.试验动物的识别方法
检疫期采用尾部划线法标记，正式试验采用苦味酸涂抹法标记动物编号，并在笼具上标明实验编号、动物组别及给药剂量。
5.实验动物饲养管理
5.1环境条件
[动物使用许可证号：SYXK(鲁)20110012]
饲养环境：SPF级动物室；
温度设定：20～25℃；
湿度设定：40～70％；
换气次数：10～15次/h；
照明时间：12h(早8：00点到晚8：00开灯)；
5.2饲养条件
笼具：小鼠饲养盒，苏州市通安医学设备厂生产，生产许可证号：SCXK(苏)2003-2006；
放置动物数：5只/盒；
笼具交换：2次/周；
粪便处理方法：随垫料一起更换，2次/周；
清扫及消毒方法：检疫期间隔日用布蘸取消毒液擦拭笼架及地面。实验期间，每次实验结束后清扫地面及工作台，并用布蘸取消毒液擦拭(消毒液：1％新洁尔灭、1％84消毒液、0.2％过氧乙酸，每周更换一次)。
6.试验动物饲料
名称：高脂肪食料TD97366(25.4％脂肪，21.79％蛋白质，38.41％碳化合物)
有效期：常温下3个月
生产单位：Harlan Teklad
保存条件：储存于专用的饲料间，低温、干燥和卫生
饲料检测：每批饲料均有生产商提供的质量合格证明
给料方法：自由摄食
7.试验动物饮用水
种类：反渗透水
给水方法：通过饮水瓶设置的饮水嘴自由摄取
水质检测：每年检测一次，检测依据参考国家标准GB5749-2006。
8.供试品及溶媒的配制
供试品为实施例一到实施例五制备得到的脂肪组织靶向多肽，溶媒为灭菌注射用水。
其配置方法为：在超净工作台中，用电子天平称取不同编号的脂肪组织靶向多肽，将其置于一灭菌容器中，并加入无菌注射用水溶解，使其终浓度为1g/L，现用现配。
实施例五靶向多肽储存液用PBS稀释为不同剂量。
其中，相应的实验标签上标有实验编号、供试品编号、配制浓度、配制人、复核人以及配制时间。
9.实验方法
9.1小鼠试验前喂养
C57BL/6雄性小鼠在抗肥胖试验前用高脂肪食料TD97366(25.4％脂肪，21.79％蛋白质，38.41％碳化合物，购于Harlan Teklad)喂养，使其在试验前平均体重达到50g。
9.2给药剂量与分组
9.2.1脂肪组织靶向多肽样品筛选
将成模小鼠随机分为六组，每组10只小鼠，具体给药剂量与分组见表1。
表1脂肪组织靶向多肽对肥胖小鼠模型给药剂量与分组
其中，给药途径采用颈背部皮下注射的方式，其给药途径与临床药物的给药途径保持一致。给药时间为每天上午的9：30～10：30之间。
9.2.2给药剂量筛选
选取最好的减重靶向多肽(实施例五制备得到的脂肪组织靶向多肽)，将成模小鼠按给予不同的给药途径和不同的给药剂量，随机分为不同的实验组，每组10只小鼠，具体给药剂量与分组见表2。
表2实施例五脂肪组织靶向多肽对肥胖小鼠模型给药剂量与分组
其中，给药途径部分IP代表腹腔注射，IM代表肌肉注射，给药时间为每天上午的9：30～10：30之间。
10.各种指标的检测和数据处理
分别于给药前以及给药后不同的实验点，测量小鼠的体重。对实验小鼠每天给药一次，同时每三天一个间隔进行体重测定。同时采用EXCEL2013和SPSS13.0软件对数据进行录入和统计分析；小鼠体重采用均数±标准差(SD或S)表示。
实验过程中并未发现影响实验研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的异常情况。
11.结果
11.1多肽样品筛选
对小鼠给予实施例一到实施例五的脂肪组织靶向多肽，分别于不同的时间测定小鼠的体重变化，其中实验结果见表3。
表3多肽样品筛选小鼠体重下降值(g)
从表3的实验结果可以看出，小鼠给予不同实施例制备得到的脂肪组织靶向多肽供试品，实施例一到实施例五的小鼠体重都出现了明显的下降，在给药后第15天之后，除了实施例二的小鼠体重下降1.62g，其他小鼠体重普遍下降3～5g，表明实施例一到实施例五的靶向多肽具有明显的治疗效果，可以降低小鼠的体重，缓解小鼠肥胖症状。而且小鼠体重的变化随时间逐步下降，表现出明显的时间依赖性。
11.2给药剂量筛选
选取实施例五的靶向多肽供试品，然后用无菌水稀释成不同的浓度，分别采用不同的给药途径，包括腹腔注射(IP)和肌肉注射(IM)，然后于不同的时间测定小鼠给药前和给药后的体重变化，其中小鼠给药后相较于给药前体重减少值见表4。
表4实施例五脂肪组织靶向多肽给药小鼠体重下降值(g)
从表4可以看出，无论腹腔注射还是肌肉注射脂肪组织靶向多肽，小鼠体重均随着给药浓度的增加，表现出明显的体重下降；而且体重下降值均表现出明显的时间依赖性。尤其是在给药剂量为10mg/kg和15mg/kg时，小鼠表现出非常明显的减重效果。
12.结论
从动物实验数据可以看出，小鼠给予实施例一到实施例五制备得到的脂肪组织靶向多肽供试品，小鼠体重都出现了明显的下降，表明实施例一到实施例五的靶向多肽具有明显的治疗效果，可以降低小鼠的体重，缓解小鼠肥胖症状。而且小鼠体重的变化随时间逐步下降，表现出明显的时间依赖性。样品筛选结果表明实施例五的靶向多肽表现出最好的抗肥胖治疗效果。同时剂量筛选结果显示实施例五的靶向多肽在给药剂量为10mg/kg和15mg/kg时减重效果明显，可以用于缓解小鼠肥胖，降低小鼠体重，而且有剂量效应。
最后说明的是，以上实施例仅为本发明的较佳实施例，仅用以说明本发明的技术方案，并不用于限制本发明，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (19)
1.一种脂肪组织靶向多肽，其特征在于：所述的脂肪组织靶向多肽包括细胞靶向多肽肽段、细胞凋亡多肽肽段以及连接细胞靶向多肽肽段和细胞凋亡多肽肽段的桥链。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，其中细胞靶向多肽肽段选自以下序列中的一种：SEQ1，SEQ2，SEQ3，SEQ4，SEQ5，SEQ6，SEQ7，SEQ8，SEQ9，SEQ10，SEQ11，SEQ12，SEQ13，SEQ14，SEQ15，SEQ16，SEQ17，SEQ18，SEQ19，SEQ20，SEQ21，SEQ22，SEQ23，SEQ24，SEQ25，SEQ26，SEQ27，SEQ28，SEQ29，SEQ30；
其中所述的细胞靶向多肽肽段中的氨基酸独立地为甘氨酸和D型或者L型氨基酸，优选为甘氨酸和L型氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的细胞靶向多肽肽段中的氨基酸为天然或非天然氨基酸，所述的天然氨基酸优选为经保护基团修饰的天然氨基酸；所述的保护基团优选为叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、烯丙基、N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基-1)乙基中的一种或几种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于：所述的细胞凋亡多肽肽段选自细胞凋亡因子或下列所述的肽链片段中的一种：SEQ31，SEQ32；
其中所述肽链片段中的氨基酸独立地为D型氨基酸或者L型氨基酸；优选为氨基酸全部为D型氨基酸或者L型氨基酸；进一步优选为氨基酸全部为D型氨基酸。
5.根据权利要求1-3任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于：所述的细胞凋亡多肽肽段选自细胞凋亡因子或肽链片段SEQ33；
其中所述肽链片段中的氨基酸独立地为甘氨酸和D型或者L型氨基酸；优选为甘氨酸和D型氨基酸。
6.根据权利要求4或5所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的肽链片段中的氨基酸为天然或非天然氨基酸；所述的天然氨基酸优选为经保护基团修饰的天然氨基酸；所述的保护基团优选为叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、烯丙基、N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基-1)乙基中的一种或几种。
7.根据权利要求4-6任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的细胞凋亡因子选自以下中的一种：白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-5、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-18、干扰素-γ，干扰素-α、干扰素-β、肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞集落刺激因子。
8.根据权利要求1-7任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的桥链为2～10个的天然或非天然氨基酸片段，优选为2～6个氨基酸组成的片段，更优选为2个氨基酸片段；进一步优选为包含甘氨酸或丙氨酸。
9.根据权利要求1-8任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的脂肪组织靶向多肽为链状或者是环状脂肪组织靶向多肽；所述的环状脂肪组织靶向多肽优选为分子内成环的方式。
10.根据权利要求9所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的成环方式为化学键，选自C-N、C-O、C＝N、C-C、C＝C、C-S、S-S、CO-NH、CO-S键中的一种或几种以上，优选为S-S、CO-NH或CO-S键。
11.根据权利要求1-10任一项所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述的脂肪组织靶向多肽采用聚乙二醇修饰，所述的脂肪组织靶向多肽的C端、N端或侧链的任一位置与聚乙二醇进行结合，优选为脂肪组织靶向多肽的桥链与聚乙二醇进行结合。
12.根据权利要求11所述的脂肪组织靶向多肽，其特征在于，所述聚乙二醇选自PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500，PEG600，PEG700，PEG800，PEG900，PEG1000，PEG1100，PEG1200，PEG1300，PEG1400，PEG1500，PEG1600，PEG1700，PEG1800，PEG2000，PEG3000，PEG4000，PEG10000，PEG20000，PEG40000中的一种或几种以上；优选为PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500中的一种或几种以上；更优选为PEG10，PEG100，PEG200中的一种或几种以上。
13.一种脂肪组织靶向多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用固相合成法，依照脂肪组织靶向多肽的连接次序在偶联剂的作用下，依次进行氨基酸的偶联，合成具有N端保护的链状脂肪组织靶向多肽；
(2)裂解去除N端保护的基团，得到链状的脂肪组织靶向多肽。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自以下几种组合中的一种：(1)N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，
(2)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和N，N′-二异丙基乙胺，
(3)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N′-二异丙基乙胺，
(4)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啡啉，
(5)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N-甲基吗啡啉；
所述反应溶剂选自N，N′-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜中的一种或几种以上。
15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括将步骤(2)得到的链状脂肪组织靶向多肽进行环化过程，得到环状脂肪组织靶向多肽；所述的环化过程包括液相环化和固相环化。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的液相环化包括如下步骤：
(1)链状脂肪组织靶向多肽在溶剂中进行溶解，
(2)调节溶液成碱性后加入氧化剂进行环化，
(3)调节溶液成酸性后得到环状脂肪组织靶向多肽；
所述的固相环化为将链状脂肪组织靶向多肽加入氧化剂得到环状脂肪组织靶向多肽。
17.一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的权利要求1-12任一项所述的脂肪组织靶向多肽作为活性成分，以及一种或多种药用载体物质和/或稀释剂。
18.权利要求1-12任一项所述的脂肪组织靶向多肽或权利要求17所述的药物组合物在制备治疗和/或预防减肥或其他与减肥相关疾病药物方面的用途。
19.权利要求1-12任一项所述的脂肪组织靶向多肽或权利要求17所述的药物组合物在治疗和/或预防减肥或其他与减肥相关疾病方面的用途。
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