CN102702330B - 环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物 - Google Patents

环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物及其制备方法和应用，所述促黑激素类似物由功能单位与生物素或负载单位相连而成；其功能单位是由环状核心序列c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)与连接单位Arg连接构成的七肽结构，其结构为Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)，其负载单位是HIV-1 TAT蛋白的第47-60片段中的第48-57多肽片段Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg或第55-57多肽片段Arg-Arg-Arg。本发明的促黑激素类似物可透过粘膜或皮肤吸入，可用于男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症等疾病的治疗。

Description

环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物
技术领域
本发明涉及一种环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物及其制备方法和应用。
背景技术
随着生活节奏的加快，工作压力的加大，遗传因素的影响，男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症都日益凸显出来，严重影响人们的生活质量。其中，肥胖症是众所周知的导致动脉硬化、高血压、心脏病、糖尿病等常见疾病的因素之一，而男女性功能障碍和色素沉着不足症导致的性生活不和谐和皮肤癌等疾病也严重影响到患者的身心健康和家庭幸福。
目前，治疗男性性功能障碍的一线药物为西地那非等磷酸二脂酶抑制剂，但此类药物对女性患者无效，而且部分患者报道响应逐渐消失。治疗肥胖症的药物也只有少数几个，如西布曲明和奥利司他。治疗色素沉着不足症的多肽药物也少之又少。PT-141和MT-II是两种目前正在研发中的对男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症有一定疗效的多肽类药物。
由于生物细胞膜的阻挡性，多肽等大分子药物很难由细胞膜直接进入体内，故目前使用的多肽类药物大多采用注射给药的给药方式，而男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症的治疗是长期的，如能研发出能经粘膜或皮肤给药的多肽类药物则可免除患者长期注射给药的不便和痛苦。因此，研发出一种能经粘膜或皮肤给药的用于治疗男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症的多肽类药物是必须和当务之急的，其具有广阔的市场前景。
α-MSH是一种源于前阿黑皮素（POMC）的线性十三肽。早在20世纪50年代，人们就发现对狗、猴、猫以及兔子等中枢给予α-MSH后能引起其性兴奋和食欲抑制，其作用机理是通过作用于促黑激素受体亚型MC-Rs中MC-3、MC-4受体而产生性行为和食欲抑制调节效应。后来，人们还发现对牛蛙等动物给予α-MSH后，其皮肤颜色会加深，其机制是通过作用于促黑激素受体亚型MC-Rs中的MC-1受体而产生皮肤色素调节效应。研究表明，MC-Rs激动剂在治疗男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症等方面有潜在的应用价值。
α-MSH是一个线性十三肽，C端含有酰胺结构，N端乙酰化，其一级结构如下：
Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2。
人们后来研究发现：α-MSH的最小活性序列是His-Phe-Arg-Trp，围绕着此核心序列，人们设计合成了一系列此类化合物，包括线性肽和环肽，在治疗男女性功能障碍、肥胖症、色素沉着不足症等方面有一定的疗效。其中，PT-141、MT-II便是其中的两种。
由于生物细胞膜的屏障，多肽等大分子不能直接进入细胞，这给许多疾病的治疗带来了困难。细胞穿膜肽（CPP）是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用，也有研究者称这类短肽为蛋白传导域（PTD）或特洛伊木马肽。
人们发现和证实，人免疫缺损病毒HIV-1的反式激活蛋白TAT能跨膜转移到细胞膜和细胞核内。人们还发现HIV-1的TAT蛋白中的一个富含碱性氨基酸片段，此带正电荷的多肽片段与蛋白传导功能密切相关，称之为蛋白传导域。进一步研究发现，全长86个氨基酸残基的TAT蛋白中的第49－57残基组成的序列即可完全行使蛋白传导的功能，并且无细胞毒性。这些发现为研制一种高效、安全的载体，主动介导多肽类大分子跨越生物膜屏障提供了广阔的前景。
生物素又称维生素H，是人体必需维生素之一，有促进生长的作用，对白发、秃发有一定疗效。白发症是色素沉着不足症之一，促黑激素对其有很强治疗作用，将促黑激素环状核心序列与生物素创造性的结合在一起，在使毛发变黑的同时又能促进其生长，这是本发明在医药或化妆品领域的一种创新。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促黑激素类似物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种促黑激素类似物，其多肽结构（包括所有的对映体、非对映体、立体异构体等）如下：X-Z-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-Y 和其无生理毒性的盐，其中，
X=生物素酰基或无，
Z=Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg或Arg-Arg-Arg或无，
Y=NH2或OH，
c=环肽，
当X=生物素酰基时，Z=无；
当Z=Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg或Arg-Arg-Arg时，X=无；
X、Z不能同时为无；
无生理毒性的盐是指可保留母体化合物预期生理活性而不会产生任何意料之外毒副作用的盐，具体可以为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、海藻酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、钾盐、钠盐、锂盐、锌盐、铜盐、钡盐或钙盐。
所述的促黑激素类似物，其多肽结构为下述六种时，疗效尤其好：
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2和其无生理毒性的盐、
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH和其无生理毒性的盐、
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2和其无生理毒性的盐、
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH和其无生理毒性的盐、
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2和其无生理毒性的盐或
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH和其无生理毒性的盐；其中，Biotin=D-(+)生物素酰基，Dab=（L）2,4二氨基丁酸残基，D-Phe=右旋苯丙氨酸残基（结构式如下）。
所述无生理毒性的盐优选为乙酸盐。上述促黑激素类似物中氨基酸残基除D-Phe外，其余皆为（L）型。
所述促黑激素类似物的制备方法，采用固相合成法，具体包括以下步骤：先在固相树脂上制备出未与固相树脂裂解的、未脱侧链保护基的功能单位氨基酸序列，然后在固相树脂上将功能单位氨基酸序列的N末端进行生物素酰化，或者继续将负载单位氨基酸序列中的氨基酸残基依次从C端到N端分别与功能单位氨基酸序列的N末端连接，在脱除最后一个氨基酸残基的N端保护基后经裂解、纯化、干燥成肽；N端生物素酰化的包含功能单位氨基酸序列的固相树脂也要经裂解、纯化、干燥成肽的步骤；其中，功能单位氨基酸序列为：Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)；
负载单位氨基酸序列为：Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg或Arg-Arg-Arg。
所述促黑激素类似物在制备用于治疗男性勃起功能障碍、女性性欲低下、肥胖症、色素沉着不足症药物中的应用。
所述促黑激素类似物的给药方式优选为粘膜给药、皮肤给药或注射给药。
所述药物中含有具有下述六种结构的多肽成分中的至少一种以及可药用载体或赋形剂：
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2、
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH、
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2、
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH、
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2或
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH。
其中：可药用载体或赋形剂可以为含有磷酸缓冲液的生理盐水。
所述促黑激素类似物在制备促黑激素MC-Rs激动剂中的应用。
所述MC-Rs仅指MC-1受体、MC-3受体、MC-4受体或MC-5受体。
HIV-1 TAT蛋白的第47～60残基片段由十四个氨基酸残基构成，其一级结构为：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-OH。
本发明将具有MC-Rs激动活性的促黑激素类似物的多肽序列与生物素或HIV-1 TAT蛋白的第47～60残基片段中的不同残基组成的不同多肽片段结合，设计出一种能经粘膜或皮肤吸入的促黑激素类似物，该促黑激素类似物具有MC-Rs激动剂的活性，可用于男女性功能障碍、肥胖症或色素沉着不足症的治疗。
本发明提供的多肽由功能单位和生物素或负载单位两部分构成，其功能单位与生物素或负载单位之间由酰胺键连接。
功能单位的结构是：Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-Y (Y=NH2或OH)，其环状结构由Lactam交联桥连接。c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)为其环状核心序列。Dab-D-Phe-Arg-Trp为其核心序列。N末端Arg为连接性氨基酸。该功能单位由一个七肽构成。从结构上看，其侧链连接成环状，脂溶性增加，更有利于透过粘膜、皮肤，其序列与其他促黑激素受体激动剂相似但不相同。
将功能单位N端和生物素相连接构成2种多肽结构，即多肽1和多肽2，结构式如下：
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2 （多肽1）；
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH  （多肽2）。
负载单位由HIV-1 TAT蛋白的第47～60片段中的不同氨基酸片段组成。
负载单位1由HIV-1 TAT蛋白的第55～57氨基酸片段组成，含三个氨基酸残基，其结构为：Arg-Arg-Arg-OH。
负载单位2由HIV-1 TAT蛋白的第48～57氨基酸片段组成，含十个氨基酸残基，其结构为：Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-OH。
将功能单位N端分别与负载单位1、2连接组成4种多肽结构，即多肽3、4、5和6，结构式如下：
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2（多肽3）；
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH（多肽4）；
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2（多肽5）；
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH（多肽6）。
本发明中常见英文缩写的含义为：
Biotin为生物素酰基
c为环肽
Dab为2,4二氨基丁酸
Gly为甘氨酸
Arg为精氨酸
Lys为赖氨酸
Gln为谷氨酰胺酸
Asp为天冬氨酸
D-Phe为右旋苯丙氨酸
Trp为色氨酸
DMF为二甲基甲酰胺
DCM为二氯甲烷
TFA为三氟乙酸
HBTU为苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯
NMM为N-甲基吗啡啉。
本发明将不同的负载单位与功能单位以肽键相连后进行试验。经实验结果证明：十肽负载单位与功能单位相连后形成的多肽最容易穿透不同粘膜（包括口腔粘膜、胃粘膜、鼻粘膜）；三肽负载单位与功能单位相连后形成的多肽最容易穿透皮肤。实验证明，本发明提供的负载单位可携带本发明提供的功能单位穿透粘膜和毛细血管壁，并可穿透血脑屏障进入大脑皮质。将本发明提供的负载单位或生物素与本发明提供的功能单位连接后形成的多肽作为药物，在相对很小剂量即可很容易经消化道粘膜和呼吸道粘膜吸收，从而使口服和粘膜给药成为可能，这是其他多肽类药物很难做到的。同样，由于本发明负载单位可携带功能单位穿透皮肤，使多肽经皮外给药成为可能。
为观察不同的多肽载体对不同粘膜的穿透性，本发明分别将三肽载体（Arg-Arg-Arg-OH）、十肽载体（Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-OH）、十一肽载体（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-OH）与绿色荧光蛋白偶联在一起，分别应用到大鼠的口腔粘膜、鼻粘膜、胃粘膜及皮肤，用药后15分钟取血，并杀死大鼠取口腔粘膜、鼻粘膜、胃粘膜及皮肤标本，用组织化学方法观察穿透深度，同时检测血中绿色荧光蛋白的含量。
实验证明，十肽载体最容易穿透不同粘膜，而三肽载体最容易穿透皮肤。
不同载体对不同粘膜的穿透性
                 口腔粘膜   胃粘膜   鼻粘膜   皮肤
三肽载体         ++            +          ++        ++++
十肽载体        ++++       ++        ++++       ++
十一肽载体      +++        +++       +++         ++
动物实验证明，多肽5、6经口腔粘膜给药，或多肽1、2经注射给药，或多肽3、4经皮肤给药，都可诱发雄性大鼠的阴茎勃起及雌性大鼠的求偶行为。在20只雄性大鼠中，有17只有明显阴茎勃起，并有求偶行为。有勃起反应持续时间为30分钟到2小时，平均60分钟。10只雌性大鼠8只出现强烈求偶行为。对照组只口服生理盐水，20只雄性大鼠和10雌性大鼠均未出现明显勃起和求偶行为。体内试验证明，在给予本发明多肽的同时，同时给予促黑激素MC-3、MC-4受体阻滞剂SHU-9119后，各受试大鼠均未出现明显勃起和求偶行为。这说明本发明多肽可激活中枢促黑激素MC-3、MC-4受体，并且是通过中枢促黑激素MC-3、MC-4受体起作用的，其作用类似于天然神经递质。由于其作用靶点是中枢神经系统勃起中心，除生理作用外还有心理正反馈作用，可同时用于心理性和器质性男性勃起功能障碍的治疗。
动物实验同时提示，在有外界性刺激条件下，本发明多肽能唤醒性欲低下女性的性欲，并增加阴道壁血流。据统计性欲低下约发生于30%的女性，目前尚无有效药物对其进行治疗。我们在动物实验中发现，本发明多肽可选择性刺激性欲低下雌性大鼠的求偶行为，同时发现，阴道内温度升高，说明阴道血流增加，这些证据表明黑色素能神经系统不仅调节男性阴茎勃起和性欲，而且也调节女性的性欲，是目前所知的唯一明确调节女性性欲的系统，也成为治疗女性性欲低下的希望。
动物实验证明，多肽5、6经口腔粘膜给药或多肽1、2经注射给药，都可抑制小鼠的觅食行为，从而减轻小鼠的体重。在6只小鼠中，均有明显体重下降，与对照组相比平均下降5%；对照组只口服生理盐水，各6只小鼠未见明显体重下降。体内试验证明，在给予本发明多肽的同时，同时给予促黑激素MC-3、MC-4受体阻滞剂SHU9119后，受试小鼠未见明显体重下降。这说明本发明多肽能激活促黑激素MC-3、MC-4受体，并是通过促黑激素MC-3、MC-4受体起作用的，其作用类似于天然神经递质。
动物实验证明，多肽3、4、5、6经皮肤给药或多肽1、2经注射给药，都可刺激黑色素的生成。在受试牛蛙或大鼠中，与对照组相比，皮肤黑度提高许多；对照组只给予生理盐水，未见皮肤颜色加深。这说明本发明多肽可激活促黑激素MC-1受体，并是通过促黑激素MC-1受体发挥作用，象天然神经递质一样起到促进皮肤色素生成作用。
经大量动物实验表明，在试验狗体内长期大剂量给药，未发现明显低血压，也未发现明显的肝脏及肾脏损害。
附图说明
图1为实施例12的牛蛙试验结果，其中，A为生理盐水对照组牛蛙；B为多肽1试验组牛蛙。
具体实施方式
以下实施例仅用于解释本发明，但不能由此限制本发明。
实施例1
在氨基（NH 2 ）型固相树脂上制备功能单位氨基酸序列
步骤1、精确称取10克（0.36毫摩尔/克）的Fmoc-Lys(Mmt)-Linker Amide AM Resin加入200毫升的反应瓶中，并加入100毫升DMF溶涨树脂30分钟，抽干，再用DMF振荡洗涤树脂三次，每次50毫升，2分钟一次，抽干，加50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF，即哌啶/DMF混合液中含有20%体积百分数的哌啶）振荡反应30分钟，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂三次，抽干，取少许茚三酮检测，呈阳性。
步骤2、依次向反应瓶中加入50毫升DMF，三倍摩尔量Fmoc-Trp-OH，三倍摩尔量HBTU、三倍摩尔量NMM，振荡反应30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液，再用DMF振荡洗涤树脂三次，每次大约一分钟，抽干，加50毫升脱保护液于树脂中，振荡反应30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用DMF振荡洗涤树脂三次，抽干。
步骤3、按步骤2的操作方法依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH、Fmoc- Arg(Pbf)-OH连接到上步树脂上，N末端Fmoc- Arg(Pbf)无脱保护步骤，构成多肽树脂，结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)--Asp(O-2-Phipr)-Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys(Mmt)-Linker Amide AM Resin。
步骤4、将已干燥的上步多肽树脂加入反应瓶中，再将已配制的400毫升1%TFA/DCM反应液（即TFA/DCM混合液中含有1%体积百分数的TFA）加入反应瓶中，25度下反应1小时，反应结束后，用DCM洗涤树脂三次，DMF振荡洗涤树脂4次，再用5%NMM/DMF反应液（即NMM/DMF混合液中含有5%体积百分数的NMM）洗涤树脂三次，抽干，茚三酮检测呈阳性。依次向反应瓶中加入50毫升DMF、3.8克HBTU、1.1毫升NMM，振荡反应1小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液，再用DMF振荡洗涤树脂三次，甲醇洗涤树脂三次，干燥，得到如下结构肽树脂：
Fmoc- Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)- Linker Amide AM Resin
步骤5、将上步多肽树脂按步骤2中的脱保护方法脱除N端 Arg上的Fmoc保护基后制得含功能单位氨基酸序列的肽树脂，结构为：
Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)- Linker Amide AM Resin。
实施例2
多肽1的合成
将实施例1制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例1中步骤2的操作将生物素与其连接，连接时间为2小时，无脱保护步骤，得到多肽树脂，结构为：
Biotin-Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)- Linker Amide AM Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽1，结构为：
Biotin-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2。
实施例3
多肽3的合成
将实施例1制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例1中步骤2的操作依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH与其连接，得到多肽树脂，结构为：Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-c(Asp-Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Linker Amide AM Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽3，结构为：
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2。
实施例4
多肽5的合成
将实施例1制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例1中步骤2的操作依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH与其连接，得到多肽树脂，结构为：
Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)- Linker Amide AM Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽5，结构为：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp- Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2。
实施例5
在羟基(OH)型固相树脂上制备功能单位氨基酸序列
步骤1、精确称取10克（0.73毫摩尔/克）的Fmoc-Lys(Mmt)-Wang Resin加入200毫升的反应瓶中，并加入100毫升DMF溶涨树脂30分钟，抽干，再用DMF振荡洗涤树脂三次，每次50毫升，2分钟一次，抽干，加50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF，即哌啶/DMF混合液中含有20%体积百分数的哌啶）振荡反应30分钟，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂三次，抽干，取少许茚三酮检测，呈阳性。
步骤2、依次向反应瓶中加入50毫升DMF，三倍摩尔量Fmoc-Trp-OH，三倍摩尔量HBTU、三倍摩尔量NMM，振荡反应30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液，再用DMF振荡洗涤树脂三次，每次大约一分钟，抽干，加50毫升脱保护液于树脂中，振荡反应30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阳性，抽出脱保护液，用DMF振荡洗涤树脂三次，抽干。
步骤3、按步骤2的操作方法依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Asp(O-2-Phipr)-OH、Fmoc- Arg(Pbf)-OH连接到上步树脂上，N末端Fmoc- Arg(Pbf)无脱保护步骤，构成多肽树脂，结构为：
Fmoc- Arg(Pbf)--Asp(O-2-Phipr)-Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys(Mmt)-Wang Resin。
步骤4、将已干燥的上步多肽树脂加入反应瓶中，再将已配制的400毫升1%TFA/DCM反应液（即TFA/DCM混合液中含有1%体积百分数的TFA）加入反应瓶中，25度下反应1小时，反应结束后，用DCM洗涤树脂三次，DMF振荡洗涤树脂4次，再用5%NMM/DMF反应液（即NMM/DMF混合液中含有5%体积百分数的NMM）洗涤树脂三次，抽干，茚三酮检测呈阳性，依次向反应瓶中加入50毫升DMF、3.8克HBTU、1.1毫升NMM，振荡反应1小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液，再用DMF振荡洗涤树脂三次，甲醇洗涤树脂三次，干燥，得到如下结构肽树脂：
Fmoc- Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Wang Resin。
步骤5、将上步多肽树脂按步骤2中的脱保护方法脱除N端 Arg上的Fmoc保护基后制得含功能单位氨基酸序列的肽树脂，结构为：
Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Wang Resin。
实施例6
多肽2的合成
将实施例5制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例5中步骤2的操作将生物素与其连接，连接时间为2小时，无脱保护步骤，得到多肽树脂，结构为：
Biotin-Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Wang Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽1，结构为：
Biotin -Arg -c(Asp- Dab -D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH。
实施例7
多肽4的合成
将实施例5中制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例5中步骤2的操作依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH与其连接，得到多肽树脂，结构为：
Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-c(Asp-Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Wang Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽4，结构为：
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH。
实施例8
多肽6的合成
将实施例5中制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例5中步骤2的操作依次将保护氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH与其连接，得到多肽树脂，结构为：
Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-c(Asp- Dab(Boc)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Lys)-Wang Resin。
将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽，粗肽用高效液相色谱纯化（色谱柱用C-18，洗脱液用乙腈/水/1%TFA，反相洗脱）后，冻干制得多肽6，结构为：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- Arg -c(Asp- Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH。
实施例9
实验动物
成年雄性及雌性SD大鼠，重约225克到250克。单个笼养，SPF饲养环境，模拟自然白昼及黑夜光线，充足食物和水，实验前给大鼠充足时间以适应环境，所有行为学研究都固定时间完成（14－18点）。
实验方法及结果
口腔滴注本发明多肽（实施例4的多肽5）可诱发阴茎勃起。
实验发现经口腔滴注本发明多肽可诱发阴茎勃起。口腔滴注不同剂量本发明多肽5（25，50，100和200纳克/每克体重）后，动物实验证明，经口腔粘膜给药，功能单位氨基酸序列与负载单位氨基酸序列相连的多肽可诱发大鼠阴茎勃起，在剂量为100纳克/每克体重时，20只大鼠中，有17只有阴茎勃起，11只有强烈阴茎勃起，并有求偶行为，有勃起反应持续时间为30分钟到2小时，平均60分钟（见表1）。本实验设对照组，为生理盐水组，各20只大鼠中，未见明显阴茎勃起。
本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用。
SHU-9119可选择性的阻滞MC-3和MC-4受体，在我们的实验中应用本发明多肽的同时，注射SHU-9119（剂量2纳克/每克体重），结果发现，本发明多肽（剂量为12.5,25,50,和100纳克/每克体重）无法诱导勃起，在20只大鼠中，只有在100纳克/每克体重时，2例仍观察到轻度勃起。说明本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用。
采用同样的剂量和施用方法，用多肽6代替多肽5取得近似的实验结果（见表2）。
采用同样的剂量、注射给药的方式，用多肽1或多肽2也取得近似的实验结果（见表3和4）。
结论：本发明多肽是一种可经粘膜、肌肉吸收进入血流的多肽，动物实验证实其具有引发男性阴茎勃起的功能，可用于治疗男性勃起功能障碍。
实施例10
实验动物
成年雄性及雌性SD大鼠，重约225克到250克。单个笼养，SPF饲养环境，模拟自然白昼及黑夜光线，充足食物和水，实验前给大鼠充足时间以适应环境，所有行为学研究都固定时间完成（14－18点）。
实验方法及结果
口腔滴注本发明多肽（实施例4的多肽5）可诱发雌性大鼠求偶行为
实验证明本发明多肽可使雌性大鼠发生求偶行为的改变。实验雌性大鼠在麻醉后行双侧卵巢切除术后，成为性欲低下型大鼠。实验中发现，口腔滴注本发明多肽5（100纳克/每克体重）后，雌性大鼠进入雄性大鼠所在的上层的频率由平均3次增加为11次，首次进入上层的时间由平均11分钟减少为3分钟。说明，口腔滴注本发明多肽5可刺激性欲低下的雌性大鼠的求偶行为。对阴道温度改变的观察中发现，阴道内温度升高，说明阴道血流增加。对照生理盐水无以上作用。
本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用
SHU-9119可选择性的阻滞MC-3和MC-4受体，在我们的实验中应用本发明多肽的同时，注射SHU-9119（剂量2纳克/每克体重），结果发现，本发明多肽（剂量为12.5,25,50,和100纳克/每克体重）无法诱导明显求偶行为，在10只大鼠中，只有在100纳克/每克体重时，2例仍观察到轻度求偶行为。说明本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用。
采用同样的剂量、同样的施用方法，用多肽6代替多肽5取得近似的实验结果。
采用同样的剂量、注射给药的方式，用多肽1或多肽2也取得近似的实验结果。
结论：本发明多肽是一种可经粘膜、肌肉吸收进入血流的多肽，动物实验证实其具有提高女性性欲的功能，可用于治疗女性性欲低下。
实施例11
实验动物
成年雄性及雌性昆明种小鼠，体重30克左右，分成若干组，每组6只。笼养，SPF饲养环境，模拟自然白昼及黑夜光线，充足食物和水，实验前给小鼠充足时间以适应环境。
实验方法及结果
肌肉注射本发明多肽（实施例2的多肽1）可抑制食欲
实验发现经肌肉注射本发明多肽可抑制食欲。肌肉注射不同剂量本发明多肽1（100纳克/每克体重）后，动物实验证明，经肌肉注射给药，功能单位氨基酸序列与生物素相连的多肽可抑制小鼠食欲，在剂量为100纳克/每克体重时，6只大鼠中平均体重比对照组下降5%。本实验设对照组，为生理盐水组，6只小鼠中，未见明显体重下降，结果见表5。
本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用
SHU-9119可选择性的阻滞MC-3和MC-4受体，在我们的实验中应用本发明多肽的同时，注射SHU-9119（剂量2纳克/每克体重），结果发现，本发明多肽（剂量为100纳克/每克体重）无法抑制食欲，说明本发明多肽是通过中枢的MC-3和MC-4受体起作用。
用同样的剂量、同样的施用方法用多肽2代替多肽1取得近似的实验结果（见表6）。
用同样的剂量、口腔滴注的方式用多肽5或多肽6也取得近似的实验结果（见表7和8）。
结论：本发明多肽是一种可经粘膜、肌肉吸收进入血流的多肽，动物实验证实其具有抑制食欲的作用，可用于肥胖症的治疗。
实施例12
实验动物：牛蛙。将牛蛙在自然光线下照射一周，使其肤色均匀。
实验方法及结果
皮下注射本发明多肽（实施例2的多肽1）可促生黑色素
实验发现经皮下注射本发明多肽可促生黑色素。皮下注射不同剂量本发明多肽1（25，50，100和200纳克/每克体重）后，动物实验证明，经皮下注射给药，功能单位氨基酸序列与生物素相连的多肽可促生黑色素，在剂量为100纳克/每克体重时，牛蛙可见皮肤颜色加深。对照组只注射生理盐水，其牛蛙中，未见明显肤色变化（见附图1）。说明本发明多肽是通过MC-1受体起作用的。
用同样的剂量、同样的施用方法用多肽2代替多肽1取得近似的实验结果。
用50毫克/毫升溶液的剂量、皮肤涂抹的方式，用多肽5或多肽6进行试验，也取得近似的实验结果。
结论：本发明多肽是一种可经肌肉、皮肤吸收进入血流的多肽，动物实验证实其具有促生黑色素的作用，可用于色素沉着不足和抗紫外线辐射治疗。
实施例13
实验动物
成年雄性及雌性SD大鼠，重约225克到250克。单个笼养，SPF饲养环境，模拟自然白昼及黑夜光线，充足食物和水，实验前给大鼠充足时间以适应环境，所有行为学研究都固定时间完成（14－18点）。
实验方法及结果
将大鼠腹部的毛用脱毛剂脱除，雌雄各10只，将本发明多肽（实施例3的多肽3）用生理盐水配成50毫克/毫升的溶液，每日三次涂抹腹部裸露皮肤处，每次间隔8小时，涂药2小时后可观察到雄性大鼠的阴茎勃起现象和雌性大鼠发情现象（效果和多肽5相近）；经7天的连续给药，可见大鼠腹部给药处皮肤变黑。
表 经皮给药本发明多肽3可诱发雄鼠阴茎勃起，雌鼠发情
剂量            50毫克/毫升的溶液
雄鼠勃起总数        9/10    0/10
雌鼠发情总数        7/10    0/10
注：0表示生理盐水对照。
用多肽4代替多肽3后效果相似。
表 经皮给药本发明多肽4可诱发雄鼠阴茎勃起，雌鼠发情
剂量            50毫克/毫升的溶液
雄鼠勃起总数        8/10    0/10
雌鼠发情总数        6/10    0/10
注：0表示生理盐水对照。
结论：本发明多肽是一种可经皮肤吸收进入血流的多肽，动物实验证实其具有促进勃起和性欲、促生黑色素的作用，其作用于MC-1、MC-3、MC-4受体。
实施例14
初步大动物实验： 在对实验狗皮下大剂量（200微克/每千克体重）皮下注射本发明多肽（实施例3的多肽5）的实验。注射后未见明显血压波动，肝肾功能指标正常，反应症状包括食欲降低，其中2次注射后发生呕吐。在用药后半年内观察无明显长期副作用。
根据动物实验，建议剂量为每公斤体重0.1毫克，建议剂型为水剂或油剂舌下含服，也可制成粘膜吸入剂。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  张, 嘎
 
<120>  环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.4
 
<210>  1
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  生物素酰化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(7)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  D型
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  酰胺
 
<400>  1
 
Arg Asp Xaa Phe Arg Trp Lys
1                             5          
 
 
<210>  2
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  生物素酰化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(7)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  D型
 
<400>  2
 
Arg Asp Xaa Phe Arg Trp Lys
1                            5          
 
 
<210>  3
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(10)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  D型
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  酰胺
 
<400>  3
 
Arg Arg Arg Arg Asp Xaa Phe Arg Trp Lys
1                           5                            10 
 
 
<210>  4
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(10)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  D型
 
<400>  4
 
Arg Arg Arg Arg Asp Xaa Phe Arg Trp Lys
1                            5                            10 
 
 
<210>  5
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(17)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  D型
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  酰胺
 
<400>  5
 
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Asp Xaa Phe Arg Trp
1                           5                            10                               15     
 
 
Lys
   
 
 
<210>  6
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(17)
<223>  环化
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Dab
 
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  D型
 
<400>  6
 
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Asp Xaa Phe Arg Trp
1                          5                             10                               15     
 
 
Lys  

Claims (5)

1.一种促黑激素类似物，其特征在于，其多肽结构为：
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-NH2、
Arg-Arg-Arg-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-OH；
其中，Dab=（L）2,4二氨基丁酸残基，D-Phe=右旋苯丙氨酸残基，c=环肽；
同时该促黑激素类似物还包括有无生理毒性的盐，所述无生理毒性的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、苯甲酸盐、海藻酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、钾盐、钠盐、锂盐、锌盐、铜盐、钡盐或钙盐。
2.如权利要求1所述的促黑激素类似物，其特征在于，所述无生理毒性的盐为乙酸盐。
3.权利要求1或2所述促黑激素类似物以粘膜给药、皮肤给药或注射给药方式在制备用于治疗男性勃起功能障碍、女性性欲低下、肥胖症或色素沉着不足症药物中的应用。
4.权利要求1或2所述促黑激素类似物在制备促黑激素MC-Rs激动剂中的应用。
5.权利要求4所述促黑激素类似物在制备促黑激素MC-Rs激动剂中的应用，其特征在于 ，所述MC-Rs指MC-1受体、MC-3受体、MC-4受体或MC-5受体。
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