CN103459416A - 新化合物及其对进食行为的效应 - Google Patents

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Abstract

本文提供了PYY肽类似物、包含所述类似物的组合物以及所述类似物用于治疗和预防代谢病症，例如能量代谢病症例如糖尿病和肥胖，以及用于在受试者中降低食欲，减少食物摄入或者减少热量摄入的方法。

Description

新化合物及其对进食行为的效应
1.技术领域
本申请涉及使用试剂来控制食欲、进食、食物摄入、能量消耗和热量摄入，尤其在肥胖领域中。
2.背景技术
根据国家健康和营养检查调查（National Health and NutritionExamination Survey，NHANES III,1988-1994），美国的男性和女性中有三分之一至二分之一超重。在美国，20岁或20岁以上的人中，60%的男性和51%的女性超重或肥胖。此外，在美国，大比例的儿童超重或肥胖。
肥胖的原因是复杂的和多因素的。日益增加的证据表明，肥胖不是一个自我控制的简单问题，而是涉及食欲调节和能量代谢的复杂病症。此外，肥胖与在人群中发病率和死亡率增高有关的多种病症有关。虽然没有最后确定肥胖的病因学，但是遗传因素、新陈代谢因素、生物化学因素、文化因素和心理社会因素被认为起作用。通常，肥胖被描述为其中过多身体脂肪使个体有健康风险的病症。
有强有力的证据表明，肥胖与发病率和死亡率增高相关。疾病风险，例如心血管疾病风险和2型糖尿病疾病风险随体重指数（BMI）的增加而独立地增加。实际上，该风险己被量化为：BMI每高于24.9一个点，对女性来说就增加5%的患心脏病的风险，对男性来说就增加7%的患心脏病的风险（参见，Kenchaiah et al.,N.Engl.J.Med.,347:305,2002;Massie,N.Engl.J.Med.,347:358,2002）。此外，有大量证据表明，胖人体重减轻可减少重要的疾病风险因素。即使较小的减重减轻，例如超重和肥胖成人初始体重的10%，也与风险因素例如高血压、高脂血症和高血糖减少有关。
虽然饮食和锻炼提供了一种降低体重增加的简单方法，但是超重和肥胖的个体经常不能充分地控制这些因素以有效减轻体重。可以使用药物疗法；可用作综合减重计划的一部分的若干体重减轻药物已经被美国食品与药品管理局批准。然而，这些药物中的许多具有严重的不利副作用。当侵入性较小的方法已失败并且患者处于肥胖相关的发病率或死亡率的高风险时，在谨慎选择的临床上患有严重肥胖的患者中，减重外科手术是一个选择。然而，这些治疗是高风险的，并且仅适用于有限数量的患者。不仅仅是肥胖的受试者希望减轻体重。体重在建议范围内，例如在建议范围的上部的人们，可能希望降低他们的体重以使其更接近于理想体重。因此，仍需要可用于在超重和肥胖的受试者中实现体重减轻的试剂。
在WO03/026591中公开了，向受试者外周给予肽YY（下文称为PYY）或其激动剂可导致食物摄入、热量摄入和食欲的降低，以及能量代谢的改变。公开了所述PYY或其激动剂优选为N末端缺失的PYY分子PYY3-36NH2。
本发明基于这样的发现，即其中特定的氨基酸残基缺失和/或取代的PPY类似物也可被给予受试者，以引起食物摄入减少、热量摄入减少、食欲降低以及能量代谢的改变。在许多情况下，比天然PYY相比，本发明的类似物显示出提高的效力和/或更长的作用持续时间和/或更少的副作用。
3.发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种包含由式（I）表示的氨基酸序列的PYY类似物，
Xaa2-Ile-His-Pro-His-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Xaa18-His-Tyr-
Xaa21-Xaa22-Xaa23-Leu-Xaa25-His-Tyr-Leu-Asn-Xaa30-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
[SEQ ID NO1]
（I）
其中
Xaa2选自Pro和Gly；
Xaa18选自Leu、Ile和Lys；
Xaa21选自Tyr和Phe；
Xaa22选自Ile、Leu、Ala和Val;
Xaa23选自Ala、Leu、Gly、Val和Ser;
Xaa25选自Arg和His；和
Xaa30选自Leu和His；
或者是其变体和/或衍生物的化合物；或者其盐，包括这种变体和/或衍生物的盐，
一种变体，为具有最多达2个除Xaa2、Xaa18、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa25和Xaa30以外的氨基酸被不同氨基酸替换的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了本发明的PYY类似物用作药物。
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的PYY类似物，以及可药用载体和任选的其他治疗成分。
根据本发明的另一方面，提供了本发明的PYY类似物或者包含本发明的PYY类似物的药物组合物用于治疗代谢病症。
根据本发明的另一方面，提供了本发明的PYY类似物或者包含本发明PYY类似物的药物组合物，用于降低受试者的食欲，用于减少受试者的食物摄入，或者用于减少受试者的热量摄入。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗疾病或病症或其他不需要的生理状态的方法，其包括皮下给予本发明的PYY类似物或包含本发明PYY类似物的药物组合物。
根据本发明，还提供了一种治疗有此需要的受试者的代谢病症的方法，其包括向受试者给予本发明的PYY类似物或包含本发明PYY类似物的药物组合物。
还提供了本发明的PYY类似物用于制造用于治疗代谢病症的药物的用途。
还提供了本发明的PYY类似物用于制造用于降低受试者的食欲，用于减少受试者的食物摄入，或者用于减少受试者的热量摄入的药物的用途。
4.附图说明
图1示出了本发明的PYY类似物的氨基酸序列（类似物编号1-3），使用这些PYY类似物的结合实验的结果，以及其中将本发明的这些PYY类似物在小鼠中的食欲抑制效应与天然PYY3-36NH2作比较的实验的结果，如实施例1所述。
图2、3和4示出了实施例2中描述的大鼠药物代谢动力学研究的结果。
图5和6示出了实施例3中描述的向超重小鼠长期给予本发明的化合物的结果。
5.序列表
本申请列出的氨基酸序列用氨基酸的标准字母缩写示出。本文给出的具体序列涉及本发明的具体的优选实施方案。
6.定义
为便于阅读本公开的多个实施方案，提供了对具体术语的以下解释：
动物：活的多细胞脊椎生物，该范畴包括，例如哺乳动物和鸟。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽受试者。
食欲：对食物的天然的欲望或渴望。在一个实施方案中，通过调查测量食欲以评估对食物的欲望。食欲增加通常导致进食行为增加。
食欲抑制剂：降低对食物的欲望的化合物。市售的食欲抑制剂包括，但不限于，安非拉酮（二乙胺苯酮）、芬特明、马吲哚和苯丙醇胺苯氟拉明、右苯氟拉明以及氟西汀。
体重指数（BMI）：用于测量体重的数学公式，有时也称为克托莱指数（Quetelet指数）。通过用体重（kg）除以身高的平方（m2）计算BMI。对男性和女性来说，视为“正常”的现行标准是20-24.9kg/m2的BMI。在一个实施方案中，高于25kg/m2的BMI可用于鉴定肥胖的受试者。I级肥胖对应25-29.9kg/m2的BMI。II级肥胖对应30-40kg/m2的BMI；III肥胖对应高于40kg/m2的BMI（Jequier,Am.J Clin.Nutr,45:1035-47,1987）。理想体重基于身高、体型、骨骼结构和性别而在物种间和个体间不同。
保守置换：在多肽中一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替换。术语“保守变化”也包括使用取代氨基酸，即氨基酸上一个或多个原子被另一原子或基团取代，以替换原始氨基酸，条件是针对所述置换的多肽产生的抗体也可与未置换的多肽发生免疫反应。
糖尿病：因为内源性胰岛素不足和/或胰岛素敏感度缺陷，细胞不能运送内源性葡萄糖穿越其细胞膜。糖尿病是受损的碳水化合物、蛋白质以及脂肪代谢的慢性综合征，是由于胰岛素分泌不足或者靶组织胰岛素抗性。糖尿病以两种主要的形式发生：胰岛素依赖型糖尿病（IDDM，I型）和非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM，II型），它们在病因学、病理学、遗传学、发病年龄以及治疗上是不同的。
所述两种主要形式的糖尿病均以不能用控制葡萄糖体内平衡所需的量和精确定时来递送胰岛素为特征。I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）由可导致内源性胰岛素的水平不足的β细胞的破坏引起。II型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病由身体对胰岛素的敏感度的缺陷以及胰岛素产生的相对不足引起。
食物摄入：个体消费的食物的量。食物摄入可用体积或重量测量。例如，食物摄入可以是个体消费的食物的总量。或者，食物摄入可以是个体的蛋白质、脂肪、碳水化合物、胆固醇、维生素、矿物或任何其他食物组分的量。“蛋白质摄入”是指个体消费的蛋白质的量。类似地，“脂肪摄入”、“碳水化合物摄入”、“胆固醇摄入”、“维生素摄入”和“矿物质摄入”是指个体消费的蛋白质、脂肪、碳水化合物、胆固醇、维生素或矿物质的量。
超极化：细胞的膜电位的降低。抑制性神经递质通过超极化抑制神经冲动的传递。这种超极化被称为抑制性突触后电位（IPSP）。虽然细胞的阈电压是不带电的，但是超极化的细胞需要更强的兴奋性刺激以达到阈值。
正常的日常饮食：给定物种的个体的平均食物摄入。正常的日常饮食可以用热量摄入、蛋白质摄入、碳水化合物摄入和/或脂肪摄入来表示。人的正常的日常饮食通常包含以下热量：约2000、约2400或约2800至显著更多的热量。此外，人的正常的日常饮食通常包括约12g至约45g的蛋白质、约120g至约610g的碳水化合物以及约11g至约90g的脂肪。低热量饮食不会超过个人正常热量摄入的约85%，优选不超过约70%。
在动物中，热量和营养需求根据动物的种类和大小而不同。例如，在猫中，每磅的总热量摄入、以及蛋白质、碳水化合物和脂肪的分布百分比随着猫的年龄和生殖状态而改变。然而，对猫来说一般指导线为40卡/磅/天（18.2卡/千克/天）。约30%至约40%应为蛋白质，约7%至约10%应为碳水化合物，约50%至约62.5%应来源于脂肪摄入。本领域的技术人员可容易地鉴定任何物种的个体的正常的日常饮食。
肥胖：过多的体脂肪可能使个人有健康风险的病症（参见Barlowand Dietz,Pediatrics102:E29,1998;National Institutes of Health,National Heart,Lung,and Blood Institute(NHLBI),Obes.Res.6(suppl.2):51S-209S,1998）。过多的体脂肪是能量摄入和能量消耗不平衡的结果。例如，体重指数（BMI）可用于评估肥胖。在一个通常使用的惯例中，25.0kg/m2至29.9kg/m2的BMI是超重的，而30kg/m2或高于30kg/m2的BMI是肥胖的。
在另一惯例中，腰围被用于评估肥胖。在该惯例中，男性腰围为102cm或多于102cm被认为是肥胖的，而女性腰围为89cm或多于89cm被认为是肥胖的。强有力的证据表明，肥胖影响个体的发病率和死亡率。例如，肥胖的个体有更高的患上心脏病、非胰岛素依赖型（2型）糖尿病、高血压、中风、癌症（例如子宫内膜癌、乳癌、前列腺癌和结肠癌）、血脂障碍、胆囊疾病、睡眠性呼吸暂停、生育力降低以及骨关节炎等的风险（参见，Lyznicki et al.,Am.Fam.Phys.63:2185,2001）。
超重：体重超过其理想体重的个体。超重个体可以是肥胖的，但不一定是肥胖的。例如，超重个体是希望减轻其体重的任何个体。在一个惯例中，超重个体是BMI为25.0kg/m2至29.9kg/m2的个体。
聚乙二醇化的和聚乙二醇化：使聚（亚烷基二醇），优选为活性聚（亚烷基二醇）反应以形成共价键的过程。可使用促进剂，例如氨基酸，例如赖氨酸。虽然“聚乙二醇化”经常使用聚（乙二醇）或其衍生物例如甲氧聚（乙二醇）进行，但是本文的术语不限于使用甲氧聚（乙二醇），而是还包括使用任何其他有用的聚（亚烷基二醇），例如聚（丙二醇）。
pI：pI是等电点的缩写。有时使用的另一缩写为IEP。其为具体分子不带净电荷的pH。在低于其pI的pH下，蛋白质或肽携带净正电荷。在高于其pI的pH下，蛋白质或肽携带净负电荷。蛋白质和肽可根据其等电点使用称为等电聚焦法的技术来分离，所述等电聚焦法是利用包含在聚丙烯酰胺凝胶中的pH梯度的电泳法。
肽YY（PYY）：本文使用的术语PYY是指肽YY多肽，一种由沿着小肠下部（回肠）和结肠内层细胞分泌至血液的激素。多个物种的天然存在的野生型PYY序列示于表1。
表1：多个物种的PYY序列
Figure BDA0000387068940000071
外周给药：在中枢神经系统外的给药。外周给药不包括直接向脑给药。外周给药包括，但不限于经血管内、肌肉内、皮下、吸入、口、直肠、透皮或鼻内给药。
多肽：一种聚合物，其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体，优选L-异构体。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”包括任何氨基酸序列并包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别包括天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。术语“多肽片段”是指多肽的一部分，例如在结合受体中显示出至少一条有用序列的片段。术语“多肤的功能性片段”是指保留所述多肽的活性的所有多肽片段。生物功能肽还可以包括融合蛋白，其中目的肽己被融合至不降低其所需活性的另外的肽上。
皮下给药：皮下给药是将物质给予至出现在皮肤的真皮和下面的组织之间的皮下脂肪层。皮下给药可通过使用安装到例如注射器或“笔”型注射装置的皮下注射针注射来实施。可使用其他给药方法例如显微针。使用皮下注射针注射通常导致接受者一定程度的疼痛。这种疼痛可通过使用局部麻醉药或镇痛药来掩盖。但是，用于减少注射的感知疼痛的常用方法仅仅是在即将注射前或注射期间分散受试者的注意力。疼痛可通过使用相对小规格的皮下注射针，通过注射相对小体积的量的物质以及通过避免过酸性或过碱性的组合物来使其最低，所述过酸性或过碱性的组合物可使受试者感受到注射部位的“刺痛”感。具有pH4-pH10的pH的组合物通常被认为是在舒适方面可容忍的。
治疗有效量：足以防止病症发展或导致病症消退的剂量，或者能减轻病症的征兆或症状的剂量，或者能实现所需结果的剂量。在若干实施方案中，本发明的化合物的治疗有效量是足以抑制或终止体重增加的量，或者是足以降低食欲的量，或者是足以减少热量摄入或食物摄入或增加能量消耗的量。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，提供了一种包含由式（I）表示的氨基酸序列的PYY类似物，
Xaa2-Ile-His-Pro-His-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Xaa18-His-Tyr-
Xaa21-Xaa22-Xaa23-Leu-Xaa25-His-Tyr-Leu-Asn-Xaa30-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
[SEQ ID NO1]
（I）
其中
Xaa2选自Pro和Gly；
Xaa18选自Leu、Ile和Lys；
Xaa21选自Tyr和Phe；
Xaa22选自Ile、Leu、Ala和Val;
Xaa23选自Ala、Leu、Gly、Val和Ser;
Xaa25选自Arg和His；并且
Xaa30选自Leu和His；
或者是其变体和/或衍生物的化合物；或者其盐，包括这种变体和/或衍生物的盐，
一种变体，为具有最多达2个除Xaa2、Xaa18、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa25和Xaa30以外的氨基酸被不同氨基酸替换的氨基酸序列。
本发明的PYY类似物包含其中Xaa2为Pro或Gly的序列。根据某些实施方案，Xaa2为Pro[SEQ ID NO18]。根据其他实施方案，Xaa2为Gly[SEQ ID NO19]。
Xaa18选自Leu、Lys和Ile。优选地，Xaa18选自Leu和Ile[SEQ IDNO20]。在一些实施方案中，Xaa18为Leu[SEQ ID NO21]。
Xaa21选自Phe和Tyr。在本发明的一些实施方案中，Xaa21为Phe。[SEQ ID NO22]在其他实施方案中，Xaa21为Tyr[SEQ ID NO23]。
Xaa22选自Ala、Ile、Leu和Val。优选地，Xaa22选自Leu和Ile[SEQID NO24]。在本发明的一些实施方案中，Xaa22为Leu[SEQ ID NO25]。在其他实施方案中，Xaa22为Ile[SEQ ID NO26]。
Xaa23选自Ala、Leu、Gly、Val和Ser。优选地，Xaa23为Ala[SEQID NO27]。
Xaa25选自Arg和His。在本发明的一些实施方案中，Xaa25为Arg[SEQ ID NO28]。在其他实施方案中，Xaa25为His[SEQ ID NO29]。
Xaa30选自His和Leu。在本发明的一些实施方案中，Xaa30为His[SEQ ID NO30]。在其他实施方案中，Xaa30为Leu[SEQ ID NO31]。
在本发明PYY类似物的一个优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala[SEQ ID NO32]。
在PYY类似物的一个优选组中，Xaa18选自Leu和Ile，Xaa21为Tyr，Xaa22选自Ile和Leu，Xaa23为Ala[SEQ ID NO33]。其他位置的残基可以是如上所述的。
在本发明PYY类似物的另一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21为Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala[SEQ ID NO34]。
在本发明PYY类似物的另一优选组中，Xaa2为Pro，Xa21为Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg[SEQ ID NO35]。
在本发明PYY类似物的另一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa18为Leu，Xaa21为Tyr，Xaa22为Leu或Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg或His，Xaa30选自His和Leu[SEQ ID NO47]。
在本发明PYY类似物的又一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa18为Leu，Xaa21为Tyr，Xaa22为Leu或Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30选自His和Leu[SEQ ID NO36]。
在本发明PYY类似物的另一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa18为Leu，Xaa21为Tyr，Xaa22为Ile或Leu，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为Leu[SEQ ID NO37]。
在本发明的一个优选实施方案中，Xaa2为Pro，Xaa18为Leu，Xaa21为Tyr，Xaa22为Ile或Leu，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为His[SEQ ID NO38]。
在本发明PYY类似物的另一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala，Xaa30为Leu[SEQ IDNO39]。
在本发明PYY类似物的仍一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala，Xaa30为His[SEQ IDNO40]。
在本发明PYY类似物的仍一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为Leu[SEQ ID NO41]。
在本发明PYY类似物的仍一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Leu和Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为His[SEQ ID NO42]。
在本发明PYY类似物的又一优选组中，Xaa2为Pro，Xaa21选自Phe和Tyr，Xaa22选自Ala和Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为His[SEQ ID NO43]。
在本发明的一个优选实施方案中，Xaa2为Pro，Xaa18为Leu，Xaa21为Tyr，Xaa22为Ile，Xaa23为Ala，Xaa25为Arg，Xaa30为Leu[SEQ IDNO44]。
式（I）的PYY类似物包括，但不限于，本文实施例和附图中具体描述的PYY类似物。
与人PYY相比，本发明的化合物优选具有更持久的对食物摄入减少的效应，或者具有更强的对食物摄入减少的效应。优选地，它们具有与天然人PYY至少一样强的对食物摄入减少的效应，但是却更持久。食欲抑制的持续时间增加对避免被称为“逃脱”的效应尤其重要。短持续时间的食欲抑制可降低食欲或一餐覆盖的时间，在这一餐中，受试者通常吃更少的食物。但是，如果食欲抑制剂然后被代谢或从循环中被除去，那么然后当受试者到下次进餐时间时，所述受试者可恢复其“正常”食欲。鉴于受试者在上次进餐时吃了较少的食物，事实上所述受试者在所述第二次进餐时可能具有增强的食欲。如果所述受试者满足了这种食欲，那么其在两餐中总共摄入的食物可能不少于没有食欲抑制剂时摄入的食物。也就是说，所述受试者可能从食欲抑制剂的效应中“逃脱”。“逃脱”可通过使用额外剂量的食欲抑制剂，或者通过使用具有更长作用持续时间的食欲抑制剂来减少。如果受试者在更长时间中具有降低的食欲，那么在下次进餐中弥补一餐的不足的程度被降低，因为在具体一餐中的总容量存在实际极限。
优选地，本发明的化合物对Y2受体是选择性的。也就是说，其以比其他受体例如Y1、Y3、Y4、Y5和Y6更高的亲和力结合Y2。基于结合亲和力、药理学和序列识别这些受体。所述受体中的大多数（如果不是全部）为G蛋白偶联受体。Y1受体通常被认为是突触后的，并缓解神经肽Y在外周的许多己知作用。起初，该受体被描述为对神经肽Y的C端片段（例如13-36片断）具有弱的亲合力，但是以相等亲和力与全长神经肽Y和肽YY相互作用（参见PCT公开WO93/09227）。
在药理学上，Y2受体通过显示出对神经肽Y的C端片段的亲合力而不同于Y1。虽然神经肽Y的13-36片段和肽YY提供了提高的亲合力和选择性，但是最常通过对神经肽Y（13-36）的亲合力来区分Y2受体（参见Dumont et al.,Society for Neuroscience Abstracts19:726,1993）。通过Y1和Y2受体的信号传递被与对腺苷酸环化酶的抑制相偶联。还发现与Y2受体的结合可通过选择性抑制N型钙通道来降低突触中的细胞内钙水平。此外，Y2受体，类似Y1受体，显示出与第二信使的差异偶联（参见美国专利No.6,355,478）。在多个大脑区域中发现了Y2受体，包括海马区、黑质外侧、丘脑、下丘脑和脑干。已经克隆了人、小鼠、猴子和大鼠的Y2受体（例如，参见美国专利No.6,420,352和美国专利No.6,355,478）。
本发明的PYY类似物优选地在溶液中（即，在接近生理条件的溶液中，例如出现在组织流体或血浆中的那些）不具有总离子电荷。据假设，在体内条件下不带净电荷可限制其体内的溶解性，并且这有助于皮下给予高浓度肽之后的较慢的吸收并因此延长在循环中的存在。
根据本发明的一个优选方面，本发明的PYY3-36NH2类似物含有至少一个被置换为组氨酸的对应于天然PYY3-36NH2分子中第4、6、19、21、25或30位的氨基酸。更优选地，进行多于一个的至组氨酸的置换。根据某些实施方案，在天然PYY3-36NH2序列第4、6、19、21、25和30位上的2个、3个或4个氨基酸残基被置换为组氨酸残基。优选地，在要求保护的类似物的序列中得到的组氨酸残基的总数为至少2个。
作为进一步的解释，组氨酸为唯一在pH7.4下（即在皮下给药后的循环或皮下生理条件下）不带电的氨基酸。但是，其在pH5（或更低）下完全带电，因为组氨酸的NH侧链的pI约6.0。根据某些优选的实施方案，本发明的PYY类似物在生理pH（pH7.4）下不带电或具有低的总电荷，并且其优选被配制为pH约为pH5（例如，pH4.5至pH6.0——对于可注射组合物比约pH4或5更低的pH可能不合乎需要，因为其很可能增加注射部位的疼痛）的组合物的一部分，以显示出组氨酸离子化并优选在这种较低pH下显示出总净电荷。带电残基数的增加可增加小瓶中可注射组合物的溶解度，从而可以得到待给予的相对浓缩的肽溶液的小体积注射物。但是，在皮下注射后，所述类似物被暴露于生理pH下，在该pH下离子化的残基的数目，尤其是离子化的组氨酸残基的数目下降，因此溶解度降低。这会导致肽在皮下沉淀。His残基的存在会增强这种效应。
根据一些优选实施方案，本发明的PYY类似物具有以下的优选特征的组合：
1)肽序列，其在pH7.4下没有净电荷并且可具有相对少的总带电基团和亲水基团以降低固有溶解度。
2)存在数个组氨酸，这在pH5下产生净正电荷和良好的溶解度，用于给药前储存，并使得给药溶液粘度低（在pH5下）。
3)适合皮下给药的小体积和高浓度，超过pH7.4下的溶解度常数而不超过pH5下的溶解度常数。
除了组氨酸是引起这种有差异pH依赖的溶解度效应的尤其有利的氨基酸残基以外，如果与锌离子一起配制，那么含组氨酸残基的肽的差异溶解度被极大地增强。这是因为锌离子在水性溶液中会结合不带电的组氨酸残基。据认为，锌离子能够同时结合最高大4个不带电的组氨酸。这使得锌与数个个体肽分子的组氨酸残基配位结合，因此使所述肽分子与其他相似的肽分子微弱交联，导致溶解度降低。但是，锌离子不会结合带电的组氨酸。因此，在含有锌离子的组合物中含组氨酸的肽在pH7.4下（而不在pH5.0下）会通过弱的离子键交联。因此，结合到锌离子的His残基的存在会增强皮下注射后肽的沉淀，却不会影响给药前在小瓶或注射器中的溶解度。这意味着，总pI约7的肽在约中性pH下会没有带电残基，在包括锌离子的制剂中含组氨酸残基的肽在小瓶或注射器中有利地是可溶的，但给药后会在皮下沉淀。因此，在包括锌离子的制剂中含有组氨酸的pH7中性肽在小瓶和注射器中有利地是可溶的，但给药后在皮下沉淀。此外，锌增强的沉淀是逐渐可逆的，因为由于锌离子被逐渐从注射部位洗出，注射之后锌离子的浓度会下降。因此，观察到皮下吸收的延迟，并且具有好得多的药物代谢动力学，却不损失生物利用度。给定的含组氨酸的中性肽的吸收速率可通过加入的锌的量来控制。
引入至少一个另外的组氨酸残基优选地产生了如下的本发明PYY类似物：至少一次出现彼此被1-3个插入氨基酸残基分开的两个组氨酸残基（一对氨酸残基）。这种间隔似乎最适合单个锌离子在水性溶液中与成对的两个组氨酸残基形成结合。在本发明的一个有利的实施方案中，将天然PYY3-36NH2序列第4和6位上的氨基酸都置换为组氨酸残基。在该实施方案中，一对两个组氨酸残基都是人工引入的，它们之间有1个插入氨基酸残基。
优选地，本发明的类似物具有6.5-8.5的总pI。更优选7.0-8.0，更优选7.1-7.7，更优选7.2-7.6，更优选所述类似物具有约7.4的总pI。这意味着在生理pH下所述类似物没有明显的总电荷。分子的总pI可以使用本领域技术人员熟知的技术来计算，或者可选择地可通过使用等电聚焦法用实验确定。
为了充分利用这种效应，本发明人已发现以下的特征组合是尤其优选的。
1)肽序列，其在pH7.4下没有净电荷，总体具有相对少的带电基团和相对少的亲水基团，以降低固有溶解度。
2)存在数个组氨酸，这在pH5下产生净正电荷和良好的溶解度，用于给药前储存，并使得在pH5下的给药溶液粘度低。
3)用于小体积高浓度的皮下给药的溶解度，超过pH7.4下的溶解度常数而不超过pH5下的溶解度常数。
4)存在锌离子，这在pH7.4下产生不带电组氨酸残基与邻近分子的交联，但在给药前pH或约pH5下不交联带电的组氨酸。
变体：
变体包括包含由式（I）表示的氨基酸序列的本发明的PYY类似物，所述氨基酸序列具有最多达2个（例如0、1或2个）除Xaa2、Xaa18、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa25和Xaa30以外的氨基酸被不同氨基酸替换（例如，保守置换和非保守置换；参见，例如下表2），所述变体当在本发明的分子中时保留相应非变体分子的至少一些活性。
通常，保守置换是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的彼此替换；含羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的互换，酰胺残基Asn和Gln间的互换，碱性残基Lys和Arg的互换，芳香族残基Phe和Tyr的互换，以及小尺寸的氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly间的互换。在Bowie et al.,Science247:1306-1310,1990中提供了关于如何进行表型沉默的氨基酸置换（即不改变所表达的表型的置换）的指导。
表2：保守氨基酸置换的非限制性实例
Figure BDA0000387068940000151
变体还包括其中最多达2个（例如0、1或2个）除Xaa2、Xaa18、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa25和Xaa30以外的氨基酸被衍生自人以外的物种的PYY中同等位置上存在的氨基酸替换的PYY类似物。多个物种的PYY的序列包括在上文表1中。
衍生物
本发明的化合物可包含通过公知方法修饰的式（I）的结构，所述公知方法包括酰胺化、糖基化、氨甲酰化、酰化例如乙酰化、硫酸化、磷酸化（phosphylation）、环化、酯化和聚乙二醇化。式（I）的结构可在分子内的随机位置或在分子内的预定位置处被修饰，并且可包括1个、2个、3个或更多个连接的化学部分。
本发明的化合物可以是融合蛋白，其中使用本领域中已知的重组方法将式（I）的结构融合至另一蛋白或多肽（融合伴侣）上。或者，这种融合蛋白可用任何已知的方法合成。这种融合蛋白包括式（I）的结构。任何合适的肽或蛋白可用作融合伴侣（例如血清白蛋白、碳酸酐酶、谷胱甘肽-S-转移酶或硫氧还蛋白等）。优选的融合伴侣在体内无有害的生物活性。这种融合蛋白可通过将融合伴侣的羧基端连接至式（I）的结构的氨基端而制备，反过亦然。任选地，可切割的接头可用于将式（I）的结构连接至融合伴侣。得到的可切割的融合蛋白可在体内被切割，使得活性形式的本发明的化合物被释放。这种可切割的接头的实例包括，但不限于，接头D-D-D-D-Y[SEQ ID NO45]、G-P-R、A-G-G和H-P-F-H-L[SEQ ID NO46]，所述接头可分别被肠激酶、凝血酶、泛素裂解酶和肾素切割。参见，例如美国专利6,410,707。
本发明的化合物可以是式（I）的结构的在生理上有功能的衍生物。本文使用的术语“在生理上有功能的衍生物”表示具有与相应未修饰的式（I）的化合物相同生理功能的式（I）化合物的化学衍生物。例如，在生理上有功能的衍生物可以在身体内被转化为式（I）的化合物。根据本发明，在生理上有功能的衍生物的实例包括酯、酰胺和氨基甲酸酯；优选酯和酰胺。
本发明化合物的可药用的酯和酰胺可以包含连接在合适位置处（例如酸基团上）的C1-20烷基-、C2-20烯基-、C5-10芳基-、C5-10ar-C1-20烷基-或氨基酸-酯或-酰胺。合适的部分的实例为具有4-26个碳原子，优选5-19个碳原子的疏水性取代基。合适的脂质基团包括，但不限于以下基团：月硅酰基（C12H23）、棕榈基（C15H31）、油烯基（C15H29）、硬脂酰基（C17H35）、胆酸酯和脱氧胆酸酯。
用脂肪酸衍生物酯化含巯基化合物的方法公开在美国专利No.5,936,092、美国专利No.6,093,692和美国专利No.6,225,445中。包含经二硫键连接到脂肪酸的本发明化合物的本发明化合物的脂肪酸衍生物可以用于将本发明的化合物递送至神经元细胞和组织。相对于相应未脂化的化合物的吸收率，酯化明显增加了所述化合物的吸收，并延长了所述化合物在血液和组织中的停留。此外，在酯化的衍生物中的二硫键在细胞中是相对不稳定的，并因此有利于所述分子从所述脂肪酸部分的细胞内释放。适合的含有脂质的部分为具有4-26个碳原子，优选5-19个碳原子的疏水性取代基。合适的脂质基团包括，但不限于以下基团：棕榈基（C15H31）、油烯基（C15H29）、硬脂酰基（C17H35）、胆酸酯和脱氧胆酸酯。
环化方法包括使用环化树脂通过形成二硫键和头接尾的环化进行环化。环化的肽可具有增强的稳定性，包括由其构象限制造成的对酶降解的增强的抗性。环化特别适合包括N-端半胱氨酸基团的非环化肽。合适的环化肽包括单体的和二聚物的头接尾的环化结构。环化的肽可以包括一个或多个另外的残基，尤其是为形成二硫键而纳入的另外的半胱氨酸或为基于树脂的环化而纳入的侧链。
本发明的化合物可以是式（1）的聚乙二醇化的结构。本发明的聚乙二醇化的化合物可以提供另外的优点，例如多肽的溶解度提高、稳定性增加和循环时间增加，或者免疫原性降低（参见，美国专利No.4,179,337）。
用于衍生本发明的化合物的化学部分还可选自水溶性聚合物例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。用于衍生本发明的化合物的聚合物部分可以具有任意分子量，并且可以是分支的或不分支的。为便于操作和制造，用于衍生本发明的化合物的聚乙二醇的优选分子量约1kDa至约100kDa，术语“约”表示在聚乙二醇的制备中，有些分子比所声明的分子量大，有些比所声明的分子量小。取决于所需的治疗谱，比如所需的持续释放的持续时间、对生物活性的效应（如果有的话）、操作的容易性、抗原性的程度或缺乏以及聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其他己知的效应，可以使用其他分子量的聚合物。例如，聚乙二醇可以具有如下平均分子量：约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、14500、15000、15500、16000、16500、17000、17500、18000、18500、19000、19500、20000、25000、30000、35000、40000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000kDa。
适用于药物的本发明化合物的盐是其中抗衡离子可药用的那些。然而，具有不可药用的抗衡离子的盐在本发明的范围之内，例如，在制备式（1）的化合物和其可药用盐中用作中间体。
本发明的合适的盐包括与有机酸或无机酸或碱形成的那些。可药用的酸加成盐包括与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、蚁酸、苯甲酸、丙二酸、荼-2-磺酸、苯磺酸和羟乙磺酸形成的那些盐。其他酸例如草酸，虽然它自身是不可药用的，但是可在获得本发明化合物和其可药用盐的过程中用作中间体。具有碱基的可药用盐包括铵盐、碱金属盐（例如钾盐和钠盐）、碱土金属盐（例如钙盐和镁盐）以及具有有机碱基的盐（例如二环己胺和N-甲基D-立克糖（glucomine））。
有机化学领域的技术人员会理解，许多有机化合物能与它们在其中发生反应或从其中沉淀或结晶的溶剂形成复合物。这些复合物被称为“溶剂合物”。比如含水的复合物被称为“水合物”。当药品结合溶剂例如水时，这种溶剂合物例如水合物以化学计量或非化学计量的量存在于晶格中。常规筛查药品中水合物的存在，因为可能在药物制备过程的任何阶段或药品或剂型的储存过程中碰到这些。溶剂合物描述于S.Byrnet al,Pharmaceutical Research12(7),1995,954-954和Water-InsolubleDrug Formulation,2nd ed.R.Liu,CRC Press,page553，两者均以引用的方式纳入本文。因此，技术人员会理解式（I）的化合物以及其变体、衍生物和/或盐可因此以溶剂合物的形式存在。式（I）的化合物的适用于医药的溶剂合物是其中结合的溶剂是可药用的那些。例如，水合物是可药用溶剂合物的实例。但是，具有不可药用的结合的溶剂的溶剂合物可在式（I）的化合物及其可药用盐的制备中用作中间体。
病症：
本发明提供了一种包含式（I）的化合物以及可药用载体和任选的其他治疗性成分的药物组合物以及相关的方法。在一些实施方案中，所述药物组合物存在于注射器或其他给药装置中，用于向人皮下给药。
本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，用作药物。
本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，或包含式（I）的化合物的药物组合物，用于治疗肥胖或糖尿病。本发明还提供了式（I）的化合物，或包含式（I）的化合物的药物组合物，用于降低受试者的食欲，用于减少受试者的食物摄入，或者用于减少受试者的热量摄入。
本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物用于制造用于治疗肥胖或糖尿病的药物的用途。本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物用于制造用于降低受试者的食欲，用于减少受试者的食物摄入，或者用于减少受试者的热量摄入的药物的用途。
本发明还提供了一种治疗有此需要的受试者中的肥胖或糖尿病的方法，包括向所述受试者给予有效量的式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，或包含式（I）的化合物的药物组合物。本发明还提供了一种降低受试者的食欲，减少受试者的食物摄入，或者减少受试者的热量摄入的方法，包括向所述受试者给予有效量的式（I）的化合物或包含式（I）的化合物的药物组合物。
在一些实施方案中，所述化合物经肠胃外给予。在一些实施方案中，所述化合物经皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、透皮或舌下给予。
被给予所述化合物的受试者可以是超重的，例如肥胖的。可选择地，或除此之外，所述受试者可以是患有糖尿病的，例如有胰岛素抵抗或葡萄糖耐受不良，或两者都有。所述受试者可患有糖尿病，例如所述受试者可患有II型糖尿病。所述受试者可以是超重的，例如肥胖的并患有糖尿病例如II型糖尿病。或者，所述受试者可患有I型糖尿病。本发明的化合物被认为可保护胰岛细胞，尤其是β细胞，使得它们可保持其正常的生理功能，例如能够在受到毒素（例如链唑霉素）、病原体或受到自身免疫应答攻击时响应于合适的刺激分泌胰岛素。本发明的化合物还被认为可在暴露于毒素、病原体或自身免疫应答后的生理功能衰退之后有效地恢复或拯救胰岛功能，尤其是β细胞功能。功能恢复可达到衰退前呈现的功能的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%。因此，本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，或者包含式（I）的化合物的药物组合物，用于预防胰岛功能（例如β细胞功能）损失和/或恢复胰岛功能（例如β细胞功能）。本发明还提供了式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物用于制造预防胰岛功能（例如β细胞功能）损失和/或恢复胰岛功能（例如β细胞功能）的药物的用途。本发明还提供了一种在受试者中预防胰岛功能（例如β细胞功能）损失和/或恢复胰岛功能（例如β细胞功能）的方法，其包括向所述受试者给予有效量的式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，或包含式（1）的化合物的药物组合物。本发明还提供了一种包含式（I）的化合物与第二活性成分组合的药物组合物，所述第二活性成分为具有胰岛毒性副作用的药物（例如链唑霉素）。
此外，或可选择地，所述受试者可能患有其中肥胖或超重为危险因素的病症或者具有患上所述病症的风险。这种病症包括，但不限于，心血管疾病例如高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭和血脂障碍；中风；胆囊疾病；骨关节炎；睡眠性呼吸暂停；生殖性病症例如多囊卵巢综合征；癌症例如乳癌、前列腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌和食道癌；静脉曲张；黑棘皮病（acnthosis nigricans）；湿疹；运动不耐症；胰岛素抵抗；高血压高胆固醇血症；胆石症（cholithiasis）；骨关节炎；整形外科损伤；胰岛素抵抗例如2型糖尿病和X综合征；以及血栓栓塞性疾病（参见Kopelman,Nature404:635-43;Rissanen et al.,BritishMed.J.301,835,1990）。
与肥胖有关的其他病症包括抑郁、焦虑、惊恐发作、偏头痛、PMS、慢性疼痛状态、纤维肌痛、失眠、冲动行为、强迫性障碍和肌阵挛。此外，肥胖是公认的全身麻醉的并发症发生率增加的危险因素（参见，例如Kopelman,Nature404:635-43,2000）。通常，肥胖会减少寿命并携带例如上文列出的共发病的严重风险。
与肥胖相关的其他疾病或病症为先天缺陷、与神经管缺陷发生率升高有关的母性肥胖、腕管综合征（CTS）；慢性静脉功能不全（CVI）；日间嗜睡；深部静脉血栓形成（DVT）；肾终末期疾病（ESRD）；痛风；热失调；免疫反应受损；呼吸功能受损；不育症；肝病；下腰痛；产科和妇科并发症；胰石病；以及腹疝；黑棘皮病；内分泌失调；慢性缺氧和高碳酸血症；皮肤病效应；象皮病；胃食管反流；跟骨骨剌；下肢浮肿；乳房肥大（mammegaly），其导致大量问题例如胸罩勒痛、皮肤损伤、颈部疼痛、胸部下侧皮肤皱襞中的慢性异味和感染等；大的前腹壁团块，例如具有频繁脂膜炎的腹部脂膜炎，妨碍行走，导致频繁感染、异味、着衣困难、下腰痛；肌与骨骼疾病；假脑瘤（或良性颅内高血压），及滑动裂孔疝。
本发明还提供一种增加受试者中能量消耗的方法。所述方法包括，例如，向受试者外周给予治疗有效量的本发明的化合物，从而改变能量消耗。所有生理过程都燃烧能量。通过调整这些过程的效率或改变正在进行的过程的数目和性质，身体可直接改变能量消耗的速率。例如，在消化期间，身体消耗能量移动食物使其穿过肠，并消化食物，在细跑内，可改变细胞代谢的效率以产生更多或更少的热量。
一方面，本发明的方法涉及操纵弓形回路（arcuate circuitry），这协调地改变食物的摄入并相应改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和热量利用的结果。因此，在本发明这一方面中，给予式（I）的化合物或其变体、衍生物盐或溶剂合物可导致能量消耗增加、热量利用效率降低。
本发明还提供了一种改善受试者的脂质谱的方法。本发明还提供一种减轻病症或疾病的方法，所述症状或病症可通过降低营养物利用度来减轻。
食欲可通过本领域技术人员己知的任何方式来测量。例如，可以通过心理学评估来评估食欲降低。例如，给予本发明化合物可导致感知的饥饿、饱感和/或饱发生变化。饥饿可通过本领域技术人员已知的任何方式来评估。例如，使用心理学测定评估饥饿，例如通过使用调查表，例如但不限于视觉模拟评分（Visual Analog Score，VAS）调查表来评估饥饿感和感官知觉。在一个具体的非限制性的实例中，通过回答与对食物、饮料的欲望、预期的食物消费、恶心以及气味或味道相关的知觉有关的问题来评估饥饿。
本发明的化合物可用于体重控制和治疗，例如减轻和预防肥胖，尤其是下列中的任意一项或多项：预防和减少体重增加；诱导和促进体重减轻；及减轻用体重指数测量的肥胖。本发明的化合物可用于控制食欲、饱感和饥饿中的任意一项或多项，尤其是下列的任意一项或多项：降低、压制和抑制食欲；诱导、增加、增强和促进饱感和饱腹的感觉；以及降低、抑制和压制饥饿和饥饿感。本发明的化合物可以用于维持期望体重、期望体重指数、期望外表和良好健康中的任意一项或多项。
受试者可以是渴望减轻体重的受试者，例如渴望改变其外表的男性和女性受试者。受试者可以渴望降低饥饿感，例如受试者可以是参与需要注意力高度集中的长时间任务的人，例如现役军人、空中交通管制员或长途卡车驾驶员等。
本发明还可用于治疗、预防、改善或减轻由相对高的营养物利用度引起、并发或加重的病症或疾病。本文使用的术语“可通过降低热量（或营养物）利用度减轻的病症或疾病”是表示受试者中由相对高的营养物利用度引起、并发或加重的任何症症或疾病，或者是可通过降低营养物利用度例如通过减少食物摄入而减轻的那些。患有胰岛素抵抗、葡萄糖不耐症的受试者或者患有任何类型的糖尿病例如1、2型糖尿病或妊娠期糖尿病的受试者，也可从本发明的方法获益。
本发明涉及代谢病症例如能量代谢病症的治疗。这种病症包括与热量摄入增加有关的病症或疾病，包括但不限于胰岛素抵抗、葡萄糖不耐症、肥胖症、糖尿病（包括2型糖尿病）、进食障碍、胰岛素抵抗综合征和阿尔茨海默病。
根据本发明，式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物，优选用于治疗人。然而，虽然本发明的化合物通常被用于治疗人受试者，但是它们也可用于治疗其他脊椎动物（例如其他灵长类动物；农场动物例如猪、牛和家禽；运动动物例如马；伴侣动物例如狗和猫）中相似或相同的病症。
组合物
虽然可以单独给予所述活性成分，但是其优选存在于药物制剂或组合物中。因此，本发明提供了一种药物制剂，其包含如上所述的式（I）的化合物或其变体或衍生物或者其盐或溶剂合物，以及可药用的赋形剂。本发明的药物组合物可以采用如下所述的药物制剂的形式。
虽然最合适的途径可能取决于例如接受者的病症和疾病，但是本发明的药物制剂包括适于经口、肠胃外（包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内和关节内）、吸入（包括通过多种形式的计量加压的气雾剂、喷雾器或吹药器产生的细颗粒粉剂或薄雾剂）、直肠和局部（包括皮肤、透皮、透粘膜、含服、舌下和眼内）给药的制剂。
所述制剂可方便地以单位剂型存在并可通过药学领域熟知的任何方法制备。所有的方法都包括使所述活性成分与组成一种或多种辅助剂的载体相结合的步骤。通常，通过使所述活性成分与液体载体或细碎的固体载体或其两者均一且紧密地结合，然后（如有必要）将所述产品塑形为所需的制剂而制备所述制剂。
适于口服给药的本发明的制剂可以以离散的单元提供，例如包含预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；也可以是粉剂或颗粒剂；可以是水性液或非水性液中的溶液剂或混悬剂；或者水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。所述活性成分也可以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式提供。多种可药用的载体及其制剂在标准制剂论文中有记载，例如Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin。还可参见Wang,Y.J.and Hanson,M.A.,Journal of Parenteral Science and Technology,TechnicalReport No.10,Supp.42:2S,1988。
片剂可通过压制或模压而制造，任选与一或多种辅助剂一起。压制片剂可通过将任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式（例如粉剂或颗粒）的所述活性成分在合适的机器中压制而制备。模压片剂可通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物在合适的机器中模压制得。片剂可任选被包衣或刻痕，并可被配制为其中的活性成分缓慢释放或受控释放。本发明的化合物可以例如以适于立即释放或延长释放的形式给予。立即释放或延长释放可以通过使用包含本发明化合物的合适的药物组合物实现，或者，特别是在延长释放的情形中，通过使用装置例如皮下植入物或渗透泵来实现。本发明的化合物还可以通过脂质体给予。
优选地，本发明的组合物适于皮下给药，例如通过注射。根据某些实施方案，所述组合物可含有金属离子如铜、铁、铝、锌、镍或钴离子。这些离子的存在可能限制溶解度，并因此延迟从皮下给药部位到循环系统的吸收。在尤其优选的实施方案中，所述组合物含有锌离子。锌离子可以以任何合适的浓度存在，例如与肽分子的摩尔比为10:1至1:10，8:1至1:8、5:1至1:5、4:1至1:4、3:1至1:3、2:1至1:2或1:1。
口服给药的示例性组合物包括悬浮剂和速释片剂，所述悬浮剂可以含有例如，用于赋予体积的微晶纤维素、作为助悬剂的藻酸或藻酸钠、作为增粘剂的甲基纤维素以及甜味剂或调味剂，例如本领域已知的那些；所述速释片剂可含有，例如，微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、粘合剂、增充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，例如本领域已知的那些。式（I）的化合物或其变体、衍生物、盐或溶剂合物还可以通过舌下和/或含服给药而经口腔递送。模压片剂、压制片剂或冻干片剂是可以使用的示例性形式。示例性组合物包括那些将本发明化合物与速溶稀释剂例如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精一起配制的组合物。这种制剂还可包括高分子量赋形剂例如纤维素（微晶纤维素）或聚乙二醇（PEG）。这种制剂还可包括用来帮助粘膜附着的赋形剂例如羟丙纤维素（HPC）、羟丙甲基纤维素（HPMC）、羧甲基纤维素钠（SCMC）、马来酸酐共聚物（例如Gantrez）和用于受控释放的试剂例如聚丙烯酸共聚物（例如Carbopol934）。还可以加入润滑剂、助流剂、风味剂、着色剂和稳定剂以便于制造和使用。
肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，以及水性和非水性无菌悬浮剂，所述水性和非水性无菌注射液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与目的接受者的血液等渗的溶质；所述水性和非水性无菌悬浮剂可包括助悬剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如在封口的安瓿瓶和小瓶中，并可以储存在冷冻干燥（冻干）条件下，只需在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水或注射用水。临时的注射液和悬浮剂可以由前述的无菌粉剂、颗粒剂和片剂来制备。肠胃外给药的示例性组合物包括可注射的溶液或悬浮剂，其可以含有，例如，合适的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液（Ringer’s solution）、等渗的氯化钠溶液或其他合适的分散剂或湿润剂和助悬剂，包括合成的单甘油酯或二甘油酯和脂肪酸，包括油酸或Cremaphor。水性载体可以是例如pH约3.0至约8.0的等渗缓冲液，优选pH约3.5至约7.4，例如pH3.5至6.0，例如3.5到约5.0。可用的缓冲液包括柠檬酸钠-柠檬酸、磷酸钠-磷酸和乙酸钠-乙酸缓冲液。所述组合物优选不包括氧化剂和已知对PYY和相关分子有害的其他化合物。可包括赋形剂例如其他蛋白质，例如人血清白蛋白或血浆制剂。如果需要，所述药物组合物还可含有少量的无毒辅助性物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或去水山梨糖醇月桂酸酯。
用于经鼻气雾或吸入给药的示例性组合物包括盐水溶液，所述盐水溶液可含有例如苯甲醇或其他合适的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂，和/或其他增溶剂或分散剂例如本领域已知的那些。在用于经鼻气雾或吸入给药的组合物中，本发明的化合物便利地借助于合适的推进剂（例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体）从加压的包装或喷雾器中以喷雾剂的呈现形式递送。在加压的气雾剂的情形中，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量而确定。用于吸入器或吹药器的例如明胶的胶囊和药筒可被配制成含有所述化合物与合适的粉剂基质（例如乳糖或淀粉）的粉末混合物的制剂。在一个具体的非限制性实例中，本发明的化合物从计量剂量阀通过气雾接合器（也称为调节器）以气雾的形式给予。任选地，还包括稳定剂，并且/或者包括用于向肺部深处递送的多孔颗粒（例如，参见美国专利No.6,447,743）。
用于直肠给药的制剂可以以含有常见载体例如可可油、合成甘油酯或聚乙二醇的保留灌肠剂或栓剂提供。这种载体在常温下通常为固体，但在直肠腔中液化和/或溶解以释放药物。
用于在口中（例如含服或舌下）局部给药的制剂包括：在调味基质（例如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶）中含有所述活性成分的锭剂，以及在基质（例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶）中含有所述活性成分的软锭剂。用于局部给药的示例性组合物包括局部的载体，例如Plastibase（与聚乙烯胶化的矿物油）。
优选的单位剂量制剂是含有如前所述有效剂量或其合适部分的所述活性成分的那些。
应理解，除以上具体提到的成分外，本发明的制剂可包括所述制剂类型的领域中常用的其他试剂，例如适于口服给药的制剂可包括调味剂。
本发明的化合物还适于作为持续释放系统给予。本发明持续释放系统的合适实例包括合适的聚合材料，例如形式为成型制品的半渗透性聚合物基质，例如薄膜或微囊；合适的疏水性材料，例如在可接受的油中的乳剂；或离子交换树脂；以及本发明化合物的可略溶的衍生物，例如，可略溶的盐。持续释放系统可以经口、直肠、肠胃外、脑池内（intracistemally）、阴道内、腹膜内给予；局部给予（例如作为粉剂、软膏剂、凝胶剂、滴剂或透皮贴剂）；含服；或作为口腔喷雾剂或鼻喷雾剂。
可适宜地配制用于给药的制剂以受控释放本发明化合物。例如，药物组合物可以为颗粒的形式，包含一种或多种生物可降解聚合物、多糖凝胶和/或生物粘附聚合物、两亲性聚合物、能够修饰式（I）化合物的颗粒的界面性质的试剂。这些组合物显示出可允许活性物质受控释放的一些生物相容性特征。参见美国专利No.5,700.486。
本发明的化合物可经由泵递送（参见Langer，上文；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201,1987;Buchwald et al.,Surgery88:507,1980;Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574,1989）或者通过连续皮下输注，例如使用微型泵来递送。也可使用静脉袋溶液。选择合适的剂量的关键因素是通过测量总体重的降低或脂肪与瘦肉质量比例所得到的结果，或者是通过从业医生认为合适的用来测量肥胖的控制或预防或肥胖相关病症的预防的其他标准所获得的结果。其他受控释放系统在Langer的综述（Science249:1527-1533,1990）中讨论过。在本公开的另一方面，本发明的化合物通过植入泵来递送，描述于例如美国专利No.6,436,091、美国专利No.5,939,380、美国专利No.5,993,414。
可植入的药物输注装置被用于为患者提供药物或任何其他治疗剂的持续、长期的剂量或输注。这种装置基本上可被分类为主动的或者被动的。本发明的化合物可被配制成储库制剂（depot preparation）。这样的储库制剂可以通过植入（例如皮下或肌肉内）给予；或者通过肌肉内注射给予。因此，例如，可将所述化合物与合适的聚合材料或疏水性材料一起配制，例如，作为可接受的油中的乳剂；或离子交换树脂；或者作为可略溶的衍生物，例如作为可略溶的盐。
治疗有效量的本发明化合物可以以单脉冲剂量（pulse dose），以大丸剂剂量给予，或者在一段时间内以多脉冲剂量给予。因此，在多脉冲剂量中，提供本发明化合物的大丸剂给药，然后是一段其中不向所述受试者给予本发明化合物的时间，接下来是第二次大丸剂给药。在具体的非限制性实例中，本发明化合物的多脉冲剂量在一天内、一周内或一个月内给予。
在一个实施方案中，将治疗有效量的本发明化合物和治疗有效量的另外的试剂，例如，另外的食欲抑制剂、减少食物摄入试剂、降血糖剂或血脂调节剂一起给药。食欲抑制剂的另外的具体非限制性实例包括安非拉酮（二乙胺苯丙酮）、苯丁胺、马吲哚和苯丙醇胺、芬氟拉明、右芬氟拉明和氟西汀。本发明的化合物可与所述另外的食欲抑制剂同时给药，或者可以顺次给药。因此，在一个实施方案中，配制本发明化合物并将其与食欲抑制剂一起以单剂量给予。
可以在任何需要例如食欲抑制、食物摄入减少或热量摄入减少的效应时给予本发明的化合物，或者在需要所述效应的时间的略前一些给予本发明的化合物，例如，但不局限于，需要所述效应的时间之前的约10分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟。
本发明化合物的治疗有效量将取决于所利用的分子、治疗的受试者、苦恼之事的严重度和类型以及给药的方式和途径。例如，本发明化合物的治疗有效量可变化，从约0.01μg/每千克（kg）体重至约1g/每千克体重，例如约0.1μg至约20mg每千克体重，例如约1μg至约5mg每千克体重，或者约5μg至约1mg每千克体重。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物可以以如下剂量给予受试者：5-1000nmol/kg体重，例如10-750nmol/kg体重，例如20-500nmol/kg体重，尤其是30-240nmol/kg体重。对于75kg受试者，这种剂量对应于375nmol-75μmol的剂量，例如750nmol-56.25μmol，例如1.5-37.5μmol，尤其是2.25-18μmol。
在一个替代实施方案中，本发明的化合物可以以如下的剂量给予受试者：0.5-135皮摩尔（pmol）/kg体重，例如5-100皮摩尔（pmol）/kg体重，例如10-90皮摩尔（pmol）/kg体重，例如约72pmol/kg体重。在一个具体的非限制性实例中，本发明的化合物以约1nmol或多于约1nmol，约2nmol或多于约2nmol，或者约5nmol或多于约5nmol的剂量给予。在该实例中，本发明化合物的剂量通常不多于100nmol，例如剂量为90nmol或低于90nmol、80nmol或低于80nmol、70nmol或低于70nmol、60nmol或低于60nmol、50nmol或低于50nmol、40nmol或低于40nmol、30nmol或低于30nmol、20nmol或低于20nmol、10nmol。例如，剂量范围可包括任何指定的剂量下限与任何指定的剂量上限的任意组合。因此，本发明化合物的非限制性剂量范围的实例为1-100nmol、2-90mol、5-80nmol。
在一个具体的非限制性实例中，给予约1-约50nmol的本发明化合物，例如以皮下注射的方式给予约2-约20nmol，例如给予约l0nmol。基于使用的具体化合物的效力、化合物递送的途径以及受试者的年龄、体重、性别和生理条件，本领域的技术人员可容易地确定精确剂量。
本发明化合物的合适剂量还包括导致热量摄入、食物摄入或食欲减少或能量消耗增加等价于由正常的饭后PYY水平造成的热量摄入、食物摄入或食欲减少或能量消耗增加的那些剂量。剂量的实例包括，但不限于，可产生血清中PYY水平约40pM-约60pM，或约40pM-约45pM，或约43pM时所显示的效应的剂量。
上文所述的剂量可以例如每日给予1次、2次、3次或4次。或者，其可以每2、3或4日给予1次。在包含锌的缓释制剂中，可以每3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21日给予剂量1次。根据某些实施方案，其可在每次进餐前不久给予1次。
本发明的具体序列
根据本发明的某些具体实施方案，所述PYY类似物具有图1列出的具体序列之一给出的氨基酸序列。
通过以下非限制性实施例阐述本发明。
8.实施例
材料和方法：
动物
所有小鼠实验均使用雄性C57BL/6小鼠（Harlan）。所有大鼠实验均使用雄性Wistar大鼠（Charles River）。
肽合成
肽通过标准的自动芴甲氧羰基（Fmoc）固相肽合成（SPPS）法制备。肽合成在三环酰胺（tryclic amide）接头树脂上进行。使用Fmoc策略连接氨基酸。各个氨基酸依次从C-端至N-端添加。肽偶联通过试剂TBTU介导。在清除剂的存在下，用三氟乙酸实现从所述树脂上裂解肽。天然PYY3-36NH2按先前所述（WO03/026591）获得；也可使用三环酰胺树脂和Fmoc化学法从头合成。
肽通过反相HPLC进行纯化。对所有纯化的肽进行全面的质量控制，在两种缓冲液系统中通过HPLC表明肽的纯度大于95%。酸解后的氨基酸分析确认了氨基酸组成。MALDI-MS表明了预期的分子离子。
实施例1
结合研究
如Morgan et al(Morgan DG,Lambert PD,Smith DM,WildingJPH&Bloom SR.J.Reduced NPY induced feeding in diabetic but notsteroid treated rats:lack of evidence for changes in receptor number oraffinity.Neuroendocrinol1996.8283-290）所述，通过渗透性溶解和差速离心分离了过表达人Y2受体（NPYR200000,Missouri S&T cDNAresource centre）的HEK293细胞的膜制备物。除了所使用的缓冲液为0.02M HEPES pH7.4，5mM CaCl2，1mM MgCl2，1%牛血清白蛋白，0.1mM抑二肽素A（diprotin A），0.2mM PMSF，10μM磷酸阿米酮，125I-PYY1-36作为放射标记以及使用Y2受体以外，如Druce et al（DruceMR,Minnion JS,Field BC,Patel SR,Shillito JC,Tilby M,Beale KE,Murphy KG,Ghatei MA&Bloom SR.Investigation ofstructure-activity relationships of oxyntomodulin(oxm)using oxmanalogues.2009Endocrinology150(4)712-22）所述完成受体结合测定。
小鼠的急喂食研究
将小鼠单个地饲养在IVC笼里。按照体重分级将动物随机分至治疗组中。给予肽或载体前，将小鼠过夜禁食（16小时）。所有肽溶液都在即将给予之前新鲜制备。用于所有研究的载体为5v/v%水和95v/v%氯化钠（0.9w/v%）。肽和载体以按体重校正过的剂量通过皮下注射给予。最大注射体积为100μl。在9:00给予载体或肽，并将动物返回至有已知量食物的养笼中。在注射后第1、2、4、8和24小时测量食物摄入。所有统计数据使用有Dunnett’s后检验的单因素ANOVA，或者使用有Bonferroni后检验的单因素ANOVA计算。
结果
图1示出了本发明的示例PYY类似物的氨基酸序列（类似物No.1-3），结合实验的结果和其中将本发明化合物在小鼠中的食欲抑制效果与人PYY3-36NH2比较的实验结果。第一列含有类似物编号，第二列含有参考编号。随后的列示出了每种示例PYY类似物的氨基酸序列。标题为“结合比例”的列示出了与人PYY3-36NH2相比每种示例PYY类似物结合人Y2受体的强度。大于1.0的值表示与人Y2受体的结合强于人PYY3-36NH2表现出的结合。标题为“食物摄入比例”的列示出了对于每种示例PYY类似物在第0-24小时中（从给予肽开始测量的时间）相对于盐水的食物摄入的减少，表示为与给予天然人PYY3-36NH2的动物表现出的相对于盐水的食物摄入减少的比例。大于1.0的值表示食物摄入的减少比用人PYY3-36NH2实现的食物摄入减少要好。
实施例2–体内的药物代谢动力学研究
材料和方法
用具有图1给出的序列的类似物1、2或3通过皮下注射雄性Wistar大鼠。
每次注射为1mg肽/大鼠，浓度为50mg/ml的肽和1锌离子（为ZnCl2）/肽分子。
在第4小时、第1天、第2天、第4天、第7天或第8天断头处死大鼠并收集躯干血。为了确定基底（内源的）PYY水平，还从未注射肽的2只大鼠收集血液。
通过通常的PYY RIA测量血浆肽水平，使用相同的类似物作为在每个案例中测量的标准物。
结果
结果示于图2、3和4中。虽然内源的PYY的半衰期仅为几分钟，但是循环的类似物水平仍然升高了若干天。
实施例3
用载体（n=12）或类似物2（30nmol/kg（第1天至第6天），然后60nmol/kg）（n=10）每日注射具有38g的平均起始体重的DIO雄性C57BL/6小鼠。所述肽与氯化锌形式的锌离子一起给予，并且所述制剂包含1锌离子/肽分子。每日测量食物摄入和体重。
结果
进食研究的结果示于图5和6中，图5示出了接受载体或类似物2的小鼠的累积食物摄入（以克表示）。图5表明，接受本发明化合物的小鼠的累积食物摄入低于接受载体的小鼠。图6示出了与接受载体的小鼠相比，接受类似物2的小鼠的体重变化百分数。图6表明，接受本发明化合物的小鼠具有比接受载体的小鼠低的体重（低约4%）。
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Claims (30)

1.一种包含由式（I）表示的氨基酸序列的PYY类似物，
Xaa2-Ile-His-Pro-His-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Xaa18-His-Tyr-
Xaa21-Xaa22-Xaa23-Leu-Xaa25-His-Tyr-Leu-Asn-Xaa30-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2
[SEQ ID NO1]
（I）
其中
Xaa2选自Pro和Gly；
Xaa18选自Leu、Ile和Lys；
Xaa21选自Tyr和Phe；
Xaa22选自Ile、Leu、Ala和Val;
Xaa23选自Ala、Leu、Gly、Val和Ser;
Xaa25选自Arg和His；并且
Xaa30选自Leu和His；
或者是其变体和/或衍生物的化合物；或者其盐，包括这种变体和/或衍生物的盐，
一种变体，为具有最多达2个除Xaa2、Xaa18、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa25和Xaa30以外的氨基酸被不同氨基酸替换的氨基酸序列。
2.权利要求1的PYY类似物，其不是变体。
3.权利要求1或2的PYY类似物，其中Xaa2为Pro[SEQ ID NO18]。
4.权利要求1、2或3的PYY类似物，其中Xaa18为Leu[SEQ IDNO21]。
5.权利要求1、2、3或4的PYY类似物，其中
Xaa2为Pro
Xaa18为Leu;
Xaa21为Tyr;
Xaa22为Ile或Leu;
Xaa23为Ala;
Xaa25选自Arg或His；并且
Xaa30选自Leu和His。[SEQ ID NO47]
6.权利要求1、2、3、4或5的PYY类似物，其中Xaa25为Arg[SEQID NO28]。
7.权利要求1、2、3、4、5或6的PYY类似物，其中
Xaa22为Ile[SEQ ID NO26]。
8.权利要求1、2、3、4、5或6的PYY类似物，其中Xaa22为Leu[SEQ ID NO25]。
9.权利要求1、2、3、4、5、6、7或8的PYY类似物，其中Xaa30为Leu[SEQ ID NO31]。
10.权利要求1-9任一项的PYY类似物，其为通过选自酰胺化、糖基化、氨甲酰化、酰化、硫酸化、磷酸化、环化、酯化和聚乙二醇化的一种或多种方法修饰的衍生物。
11.权利要求1-10任一项的PYY类似物，其为衍生物，所述衍生物为融合蛋白。
12.权利要求11的PYY类似物，其通过重组方法产生。
13.权利要求11的PYY类似物，其通过合成方法产生。
14.权利要求1-13任一项的PYY类似物，用作药物。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项的PYY类似物以及可药用载体和任选的其他治疗性成分。
16.权利要求15的药物组合物，存在于注射器或其他用于向人皮下给药的给药装置中。
17.一种治疗或预防疾病或病症或其他不需要的生理状态的方法，包括皮下给予权利要求1-13任一项中限定的PYY类似物或者权利要求16或权利要求15中限定的药物组合物。
18.权利要求1-13任一项的PYY类似物或者权利要求15或权利要求16的药物组合物，用于治疗能量代谢病症例如肥胖或糖尿病。
19.权利要求1-13任一项的PYY类似物或者权利要求15或权利要求16的药物组合物，用于降低受试者的食欲，用于减少受试者的食物摄入或者用于减少受试者的热量摄入。
20.权利要求1-13任一项的PYY类似物或者权利要求15或权利要求16的药物组合物，用于预防胰岛功能损失和/或恢复胰岛功能。
21.一种治疗有此需要的受试者中的能量代谢病症例如肥胖或糖尿病的方法，包括向所述受试者给予权利要求1-13任一项的PYY类似物或者权利要求15或权利要求16的药物组合物。
22.权利要求17或权利要求21的方法，其中所述受试者是超重的。
23.权利要求17或权利要求21的方法，其中所述受试者是肥胖的。
24.权利要求17或权利要求21的方法，其中所述受试者是患有糖尿病的。
25.一种预防受试者中胰岛功能损失和/或恢复胰岛功能的方法，包括向所述受试者给予权利要求1-13任一项的PYY类似物或者权利要求15或权利要求16的药物组合物。
26.权利要求17或21-25任一项的方法，其中所述化合物经肠胃外给药。
27.权利要求17或21-25任一项的方法，其中所述化合物经皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、透皮或舌下给药。
28.权利要求1-13任一项的PYY类似物用于制造用于治疗能量代谢病症例如肥胖或糖尿病的药物的用途。
29.权利要求1-13任一项的PYY类似物用于制造用于降低受试者食欲，减少受试者食物摄入或者减少受试者的热量摄入的药物的用途。
30.权利要求1-13任一项的PYY类似物用于制造用于预防胰岛功能损失和/或恢复胰岛功能的药物的用途。
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