CN111068068A - 一种rgd多肽-喜树碱多肽药物偶联物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种喜树碱与RGD多肽偶联物、制备方法及其应用，所述的多肽偶联喜树碱类药物，多肽偶联喜树碱类药物的结构包括三个部分：A.RGD靶向肽；B.连接子；C.抗癌药物喜树碱；其中所述的RGD多肽与喜树碱通过丁二酸干作为连接臂相连；所合成的RGD‑喜树碱多肽药物偶联物，可以将喜树碱递送至肿瘤细胞、组织，肿瘤微环境等肿瘤部位，以达到改善喜树碱溶解性的问题，并使药物喜树碱具有靶向的作用，减低对正常细胞及组织的毒副作用，从而达到特异性抗肿瘤的目的。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物技术领域，具体涉及以一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物、制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤作为全球头号杀手，正在侵害这越来越多人的生命。据我国卫生部所公布的的数据显示，无论城市还是农村，恶心肿瘤已超过心血管疾病成为我国居民死亡的第一大原因。
近几十年来随着医药卫生事业的发展，癌症在治疗和控制等各个方面都取得了卓越的进展，各种药物和治疗手段不断涌现，但是手术治疗和化学疗法以及放射治疗依然是现在最主要的三种治疗手段，但是这些治疗手段依然难以对病人有一个很好的效果，其中普通的药物治疗能虽然有着很重要的作用，但是这种治疗手段对正常的组织和细胞都有巨大伤害。
近年来抗肿瘤药物的研究一直是一个热门的领域，并且抗肿瘤药物的市场一直呈现快速增长的趋势，其中增长最快的是靶向抗肿瘤药物。靶向药物包括普通的小分子靶向药物、单克隆抗体等，以肿瘤细胞或者组织作为靶点，可以将药物递送至肿瘤部位，从而减小对正常组织以及正常细胞的伤害，进而达到治疗的目的。喜树碱作为植物类药物有着优秀的抗癌活性，但是由于它的稳定性、溶解性，以及毒副作用严重限制了喜树碱在临床的使用，如何降低喜树碱的毒副作用。提高水溶性以及稳定性，减少喜树碱在正常组织和细胞的分布，已成为喜树碱类药物在临床使用的当务之急。
靶向给药系统是治疗癌症的一种有效途径。根据肿瘤组织或细胞的特点，利用蛋白质、酶、核酸、多肽等，利用靶向的特点将药物递送至肿瘤部位。从而减小毒副作用，提高治疗的效果。
相对于小分子靶向药物以及单抗药物，靶向多肽药物偶联物有着它特有的优势，如：可以通过对药物的修饰来改善药物的水溶性，稳定性等等，同时有因为连接靶向肽让药物具有靶向作用，同抗体类药物相比具有更低的成本，均一性和稳定性也更好控制。所以采用靶向多肽与喜树碱进行偶联是提升喜树碱类药物临床使用。
整合素在肿瘤细胞的表达是高于正常细胞的，整合素可以特异性识别精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)所组成的三肽序列，RGD肽及其修饰物通过与整合素特异性结合，具有阻止肿瘤细胞定位增殖、抗肿瘤新生血管生存的作用。
因此，为了进一步提高药物喜树碱的稳定性、溶解性、安全性、靶向性以及疗效。通过制备多肽药物偶联物(PDC),来进一步解决这些问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物制备方法及其生物活性应用。
为了实现上述目的，本发明采用一下技术方案：
本发明的目的是提供一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物制备方法及其生物活性应用，由下述三个功能部分组成：
A.RGD靶向肽；B.连接子；C.抗癌药物喜树碱(CPT)
RGD多肽-喜树碱药物偶联物可简单的表示为：CPT-Linker-RGD
其中Linker为丁二酸干。
本发明所提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物中，具有以下所述结构：
本发明提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备方法，其包括下述内容：
(1)喜树碱修饰：以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在0℃至室温的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化，得到喜树碱20-OH的修饰产物。
(2)RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物制备
(a)以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；
(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；
(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；
(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；
(e)所需氨基酸合成结束后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；
(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来，得到粗品，经HPLC纯化后使用冷冻干燥机进行抽干得到固体冻干粉制剂。
其中上述步骤(2)中Rink amide resin树脂与DCM份数比例为0.5-2:5-10。
其中上述步骤(2)中Fmoc-Asp(OTBu)-OH、HBTU、DMF的份数比例为1-10:1-10:2-30，其中DIEA足量；
其中上述步骤(2)中RGD多肽、修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC比例为0.5-10:1-10:1-50:1-50:1-50，DMF和树脂是足量的。
上述制备的RGD多肽-喜树碱偶联物的应用：(1)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂的应用；(2)在制备治疗肿瘤化合物中的应用。
更进一步的，上述制备的RGD多肽-喜树碱偶联物的应用，其在实体瘤或非实体瘤上的应用。
上述所述实体瘤或非实体瘤具体为肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌等。
本发明还包括一种治疗肿瘤的化合物，其包括由本发明的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物。
本发明还包括一种治疗肿瘤的药剂，其包括由本发明的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物及其他药物辅料制备而成的药剂。
其中所用的辅料包括药剂学上常用的各种辅料，包括缓释辅料、助溶辅料、助成型辅料、崩解剂、矫味剂、润滑剂等。其包括一些药学上可用的辅料，不限于本发明所述的辅料。
其中上述的药剂可以为颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、胶丸、乳剂、糖浆或滴丸等。
与喜树碱相比，本发明提供的基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物，本发明的优势在于：
(1)RGD与喜树碱通过化学键进行偶联所得到的偶联产物，修饰之后的药物活性有了一定的提高；
(2)利用亲水性的RGD多肽修饰疏水药物喜树碱，提高了药物的溶解性；
(3)利用RGD多肽靶头的靶向作用，可将药物特异性地运送到肿瘤组织，减少正常组织的蓄积，降低其生物毒性，通过配体-受体的相互作用增加肿瘤细胞和肿瘤新生血管对药物的摄取；
(4)本发明所制备的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物，可明显提高喜树碱的抗肿瘤疗效，具有良好的临床应用价值。
附图说明
图1为20-喜树碱的化学结构图；
图2为20-喜树碱的1H NMR表征；
图3为20-喜树碱的质谱表征；
图4为实施例1-4中RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的化学结构图；
图5为实施例1-4中RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的的质谱表征；
图6为实施例1-4中RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的抗肿瘤活性A：SU-DHL-8细胞活性；B:HCT-15细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备方法，其包括下述内容：
(1)喜树碱的修饰：
以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在10℃的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化，得到喜树碱20-OH的修饰产物。
(2)多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备
(a)以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；其中Rink amide resin树脂与DCM份数比例为2:5。
(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；其中Fmoc-Asp(OTBu)-OH、HBTU、DMF的份数比例为1:1:4，其中DIEA足量；
(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；
(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；
(e)所需氨基酸合成结束成为RGD多肽后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；其中RGD多肽、修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC比例为2:4:5:5:5，DMF和树脂是足量的；
(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来。得到粗品。经HPLC纯化后使用冷冻干燥机进行抽干得到固体冻干粉制剂。
实施例2
本实施例提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备方法，其包括下述内容：
(1)喜树碱的修饰：
以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在15℃的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化，得到喜树碱20-OH的修饰产物。
(2)多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备
(a)以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；
(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；
(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；
(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；
(e)所需氨基酸合成结束后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；
(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来。得到粗品。经HPLC纯化后使用冷冻干燥机进行抽干得到固体冻干粉制剂。
其中其中上述步骤(2)中Rink amide resin树脂与DCM份数比例为1.5:6。
其中上述步骤(2)中Fmoc-Asp(OTBu)-OH、HBTU、DMF的份数比例为3:4:7，其中DIEA足量；
其中上述步骤(2)中RGD多肽、修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC比例为2:3:5:5:5，DMF和树脂是足量的。
实施例3
本实施例提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备方法，其包括下述内容：
(1)喜树碱的修饰：
以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在0℃至室温的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化。得到喜树碱20-OH的修饰产物。
(2)多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备
(a)以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；
(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；
(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；
(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；
(e)所需氨基酸合成结束后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；
(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来。得到粗品。经HPLC纯化后使用冷冻干燥机进行抽干得到固体冻干粉制剂。
其中其中上述步骤(2)中Rink amide resin树脂与DCM份数比例为2:5。
其中上述步骤(2)中Fmoc-Asp(OTBu)-OH、HBTU、DMF的份数比例为4:4:10，其中DIEA足量；
其中上述步骤(2)中RGD多肽、修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC比例为4:5:15:15:15，DMF和树脂是足量的。
实施例4
本实施例提供的一种基于RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备方法，其包括下述内容：
(1)喜树碱的修饰：
以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在0℃至室温的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化。得到喜树碱20-OH的修饰产物。
(2)RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的制备
(a)以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；
(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；
(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；
(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；
(e)所需氨基酸合成结束后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；
(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来。得到粗品。经HPLC纯化后使用冷冻干燥机进行抽干得到固体冻干粉制剂。
分别对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4修饰制备的喜树碱(20-喜树碱)进行化学结构鉴定、1H NMR表征、质谱表征，其化学结构鉴定和1H NMR表征、质谱表征分别见图1、图2和图3所示。其中对修饰的喜树碱的结构鉴定、1H NMR表征、质谱表征方法均为本领域的常规检测方法。
分别对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物进行化学结构鉴定和质谱表征，其化学结构鉴定和质谱表征分别见图4和图5所示。其中对RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物的结构鉴定,质谱表征方法均为本领域的常规检测方法。
实施例5 RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物活性检测
(1)消化SU-DHL-8细胞，调整细胞悬液浓度至1×105cells/mL；
(2)将细胞加至实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8检测板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时；
(3)取实施例3制备的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱、或PBS缓冲液加入E-Plate 8检测板内，RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱分别设置7个浓度，10-1M、10-0.5M、100M、100.5M、101M、101.5M、102M，每个浓度梯度设置3个平衡对照孔；
(4)将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察每组试验样品对SU-DHL-8细胞的影响，结果见图6A所示：
(5)分析实验结果，在加入RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱后，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数(NCI)，统计加入RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱细胞6小时后的NCI值，计算不同浓度下RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱对SU-DHL-8的细胞杀伤活性，如图6A所示，RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱对SU-DHL-8细胞的杀伤活性随药物浓度比例增加而增加，且RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物对SU-DHL-8细胞的杀伤活性在同等浓度条件下其杀伤效果强于对照喜树碱。
实施例6 RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物活性检测
(1)消化HCT-15细胞，调整细胞悬液浓度至1×105cells/mL；
(2)将细胞加至实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8检测板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时；
(3)取实施例3制备的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱、或PBS缓冲液加入E-Plate 8检测板内，RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱分别设置7个浓度，10-1M、10-0.5M、100M、100.5M、101M、101.5M、102M,每个浓度梯度设置3个平衡对照孔；
(4)将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察每组试验样品对HCT-15细胞的影响，结果见图6B所示：
(5)分析实验结果，在加入RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱后，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数(NCI)，统计加入RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱细胞6小时后的NCI值，计算不同浓度下RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱对HCT-15的细胞杀伤活性，如图6B所示，RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物以及对照喜树碱对HCT-15细胞的杀伤活性随药物浓度比例增加而增加，且RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物对HCT-15细胞的杀伤活性在同等浓度条件下其杀伤效果强于对照喜树碱。
综上实验证明本发明中的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物可通过抑制SU-DHL-8细胞、HCT-15细胞等途径抑制肿瘤生长及迁移，并进一步发挥抗肿瘤作用，并且RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物制备工艺常规，工艺简单，节省成本，RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物可制备成药剂学上所说的多种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、胶丸、乳剂、糖浆或滴丸等。且本发明所制备的RGD多肽-喜树碱的多肽药物偶联物，可明显提高喜树碱的抗肿瘤疗效，具有良好的临床应用价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种靶向RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物，其特征在于：其结构包括三个部分组成：A.RGD靶向肽；B.连接子；C.抗癌药物喜树碱。
2.一种具有靶向作用的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物，其特征在于：其分子式为CPT(喜树碱)-Arg-Gly-Asp-NH2，其中喜树碱与多肽偶联是使用丁二酸干作为连接体。
3.根据权利要求1或2所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物，其特征在于：所述连接RGD多肽与喜树碱的连接体具有以下化学结构：
其中，左右两端分别以酯键和酰胺键的形式与喜树碱和多肽进行连接。
4.根据权利要求3所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物，其特征在于：
5.任一权利要求1，2，3，4所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：(1)进行喜树碱20-OH的修饰，在20-OH处用丁二酸干进行修饰；(2)采用固相多肽合成的方法进行制备多肽；然后在树脂上将已修饰过的喜树碱进行偶联；最后将已经偶联喜树碱的靶向肽从树脂上裂解下来，得到靶向多肽-喜树碱偶联物粗品。
6.根据权利要求5所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的喜树碱的修饰具体方法如下：以喜树碱和丁二酸干为原料，除水的DCM为溶剂，加入DBU在0℃至室温的条件下进行反应，4h后反应结束，用甲醇重结晶进行纯化；步骤(2)所述的具体合成方法如下：以Rink amide resin树脂为起始原料，用DCM侵泡30min，然后用哌啶/DMF脱去保护；(b)将Fmoc-Asp(OTBu)-OH和HBTU溶解在DMF中，与树脂进行连接，并加入DIEA进行反应；(c)反应结束后使用哌啶/DMF脱去保护；(d)按照上述(b)和(c)中的方法对Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Arg(pdf)-OH进行连接；(e)所需氨基酸合成结束后，将已修饰的喜树碱、HBTU、DMAP、EDC溶于DMF中与树脂进行偶联，直至反应结束；(f)使用TFA、H2O、TIS将靶向多肽-喜树碱偶联物从树脂上裂解下来，得到粗品。
7.权利要求1-4中任一项所述RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物的应用：
(1)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂的应用；
(2)在制备治疗肿瘤化合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物的应用，其特征在于：所述的真核生物为哺乳动物；所述的肿瘤细胞为癌细胞；所述的癌细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、宫颈癌细胞、鼻咽癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
9.一种治疗肿瘤的化合物，包括权利要求1-4中任一项所述的RGD多肽-喜树碱多肽药物偶联物。
10.根据权利要求9所述的治疗肿瘤的化合物，其特征在于：所述肿瘤包括实体瘤或非实体瘤；所述肿瘤具体为肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌等。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200428 |
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