CN103083680A - 聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康药物结合物及其药物组合物 - Google Patents

聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康药物结合物及其药物组合物 Download PDF

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Abstract

一种具有通式(I)的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物以及包含该结合物的药物组合物。在所述结合物中，PEG代表聚乙二醇，PEG分子量为300-60,000道尔顿；(AA)i代表寡肽，AA代表寡肽中相同或不同的氨基酸；i是2-12的整数，代表寡肽中的氨基酸数量；j是2-12的整数，代表与寡肽连接的依诺替康的数量。在所述结合物中，每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与多个依诺替康相连，药物的负载率大大提高。通过亲水性聚合物的改性可对依诺替康提供保护，改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免毒副作用。

Description

聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康药物结合物及其药物组合物
技术领域
本发明涉及聚乙二醇结合物，尤其是聚乙二醇与氨基酸寡肽以及药物依诺替康的结合物及其药物组合物。 
背景技术
依诺替康(irinotecan，CPT-11)是喜树碱类衍生物，具有良好的抗癌活性和独特的作用机制，是迄今最为畅销的抗肿瘤药物之一。2003年它在全世界的销售额超过10亿美元，并以20％的年销售额增长率，成为世界上销路最好的抗癌药之一。依诺替康具有很广的抗肿瘤谱，I期、II期临床研究结果表明该药对化疗抗拒性肿瘤，如转移性大肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和宫颈癌有肯定疗效，另外对胃癌、恶性淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、皮肤癌、胰腺癌也有一定疗效。现主要作为治疗晚期大肠癌的有效药物，对5-FU耐药的病例仍可有效。但依诺替康毒副作用大、水溶性低。常见不良反应为食欲不振、恶心、呕吐、腹泻、白细胞和中性粒细胞减少、贫血及血小板减少，脱发和乙酞胆碱能综合症。尤其腹泻为最常见，近90％受试者曾有腹泻，其中近30％达到严重腹泻。因此，尤为需要提供一种低毒性的依诺替康，以在增加依诺替康剂量的情况下，提高伊诺替康抗肿瘤的临床效果。 
聚乙二醇(PEG)修饰技术是近年来迅速发展起来的一项新型给药技术，主要应用于注射给药系统。它是一种将聚乙二醇活化后链接到药物分子或表面的技术。聚乙二醇修饰后得到的聚乙二醇-药物衍生物在体内又会缓慢释放出药物小分子而产生疗效。药物小分子经过聚乙二醇修饰后，主要具有以下优点：1、增加药物的水溶性；2、降低毒性；3、延长药物循环半衰期，减少用药次数，提高病人依从性，提高生活质量，降低治疗费用；4、减少酶降解作用，提高生物利用度。与聚乙二醇链接后，药物的药代动力学发生了改变，进而改变药效学。特别是聚乙二醇能使血药浓度维持或接近目标浓度的时间延长，保持药物的药效得以充分地发挥。 
目前，聚乙二醇修饰技术已经广泛应用于蛋白质药物的修饰上。截止到2010年底，在国际市场上主要的6个聚乙二醇修饰的药物产品，其中四个年销售过亿美元： 
Figure BDA0000106167640000011
和 
Figure BDA0000106167640000012
而 
Figure BDA0000106167640000013
和 
Figure BDA0000106167640000014
销售额更是超过十亿美元。MICERA(罗氏的PEG-EPO)于2007年下半年在欧洲上市。目前处于临床前研究的聚乙二醇修饰的蛋白药有几十种，处于临床试验的有超氧化物歧化酶(即将上市，Enzon公司)、白介素-2(II期，Chiron公司)等等。聚乙二醇化技术在医药领域的应用，仅在美国就创造了近60亿美元新药的销售额，带动了一个新型制剂领域的蓬勃发展。 随着大量聚乙二醇新型衍生物的不断研制成功，聚乙二醇修饰技术不仅可以用于蛋白质、多肽等大分子药物改良，也逐渐被人们用于小分子的增溶减毒以及提高疗效作用方面。目前，聚乙二醇修饰的小分子药物在国际市场还没有批准上市，但是几个产品已经进入二、三期临床。 
聚乙二醇修饰技术应用于小分子药物上正在快速发展。有报道表明聚乙二醇可以用于和很多小分子药物连接。US5824701和US5840900号美国专利以及中国专利CN1283643报道了此类衍生物和紫杉醇键合的前药，在该药物模型中聚乙二醇两端都只键合了一个紫杉醇分子。为了提高对药物分子的负载率，US6153655号美国专利披露了一种链端分支聚乙二醇结构，该结构在聚乙二醇的两端通过氨基连接生成了两个功能基团。但是引进非生物的支链小分子引进了药物的不确定性。US5977163和US6262107号美国专利以及中国专利CN1164533公开了一种聚谷氨酸支载的紫杉醇前药，此药物模型中紫杉醇沿聚谷氨酸骨架链随机的连接到谷氨酸的活性羧基上，较宽的聚合率分布以及对聚谷氨酸毒性的不可确知性限制了该发明的使用。美国专利US7744861公开了一类多分支聚乙二醇与依诺替康连接的结构。但这种结构中，每一个聚乙二醇端基只能有一个依诺替康与之相连，药物的负载率受到限制。 
北京键凯科技有限公司早在2002年就开始了小分子药物聚乙二醇修饰的研究。并已经获得多项专利(ZL03801109.3，ZL 200410029615.3，ZL 200480005763.X，ZL 200810093688.7，ZL 02107842.4，ZL 02108778.4)。其中的“亲水性聚合物-多羧基寡肽与药物分子的结合物、包含该结合物的组合物及用途”(ZL 02106691.4)提供了一种与多羧基寡肽连接适合与多个小分子药物键连的聚乙二醇衍生物。 
本发明在过去工作的基础上，尤其是在本实验室前期工作发明的专利(专利号ZL 200410048016.6)的基础上，本申请的发明人希望提供一种新型的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物。在这种结合物中，每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与多个依诺替康相连，药物的负载率大大提高。 
本申请的发明人通过采用聚乙二醇(PEG)化技术解决了依诺替康本身的水溶性低、毒副作用大等问题。所提供的新型的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康键合物具有良好的水溶性，并可通过人体内酶的调控作用，达到良好的缓释目的，药效期长，其抗肿瘤活性与依诺替康相当甚至增加。由于依诺替康的抗肿瘤作用呈现剂量相关性，因此低毒性的聚乙二醇化依诺替康，可以在增加剂量的情况下，进一步提高依诺替康抗肿瘤的临床效果。 
发明内容
本发明的一个方面提供一种通式(I)的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物： 
其中： 
PEG代表聚乙二醇，PEG的分子量为300-60,000道尔顿； 
(AA)i代表寡肽，其中AA代表寡肽中相同或不同的氨基酸； 
i和j可以相同或不同，且 
i是2-12的整数，代表寡肽中的氨基酸数量； 
j是2-12的整数，代表与寡肽连接的依诺替康的数量。 
在本发明的一些实施方案中，PEG的平均分子量为20,000-40,000道尔顿。PEG可以具有直链、Y型或多分支结构。 
在本发明的一些实施方案中，PEG是直链的甲氧基聚乙二醇，且具有如下结构： 
Figure BDA0000106167640000032
其中： 
n是10-1,500的整数，优选400-500的整数； 
x是0-6的整数，优选x是1。 
在本发明的一些实施方案中，PEG平均分子量为40,000道尔顿，且是分支型的聚乙二醇，且具有如下结构： 
Figure BDA0000106167640000033
其中： 
n是10-1,500的整数，优选n为400-500的整数。 
在本发明的一些实施方案中，PEG是Y型聚乙二醇。 
在本发明的一些实施方案中，PEG具有如下多分支结构： 
Figure BDA0000106167640000041
其中， 
n是10-1,500的整数，优选n是160-180的整数； 
R是多分支聚乙二醇的核心分子； 
m是3-8的分支数，优选m是4； 
x是0-12的整数，优选x是1。 
在本发明的一些实施方案中，所述的氨基酸为谷氨酸和甘氨酸，氨基酸寡肽由2个谷氨酸和3个甘氨酸组成。在本发明的另外的实施方案中，所述的氨基酸为谷氨酸和甘氨酸的组合，由3个谷氨酸和4个甘氨酸组成。 
本发明提供具有通式(II)的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物： 
其中： 
PEG代表聚乙二醇，PEG的分子量为300-60,000道尔顿，优选为20,000-40,000道尔顿。 
本发明的另一个方面提供包含上述结合物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的剂型。所述药物组合物具有抗癌活性，具体地，所述抗癌活性包括对肠癌、卵巢癌和肺癌具有抑制性的活性。 
本发明通过提供一种借助亲水性聚合物的改性而对依诺替康提供保护，提供了一种具有改善的药物吸收、延长作用时间、疗效增强、降低了给药剂量并且避免毒副作用的改进的依诺替康类药物。 
具体实施方式
依诺替康是喜树碱类化合物，其结构见式(III)所示。 
Figure BDA0000106167640000051
依诺替康(Irinotecan)结构式 
依诺替康结构中包含有羟基，可以通过酯基、碳酸酯基、酰胺酯基等方式与已经过端基改性的聚合物结合，以达到对依诺替康分子的有效保护和合理利用。特别地，酯基在生物体中可以通过生物降解的方式释放出药物活性成分。通过本方法改进后的药物制剂水溶性良好，起效快，持续时间长，能够有效的起到治疗的作用。 
本发明的结合物按如下方法制备：对亲水性聚合物聚乙二醇进行改性，引入活性官能团羧基，与氨基酸寡肽键合，同时依诺替康上的羟基与甘氨酸的羧基反应成酯，然后氨基酸寡肽上的羧基再与依诺替康甘氨酸上的氨基结合。这种反应方式既保证了依诺替康在体内的活性，又可使反应物产率和纯度最大化。 
直链聚乙二醇-羧酸(PEG-CM)的结构式可如式(IV)所示： 
直链甲氧基聚乙二醇羧酸结构式 
Y型聚乙二醇羧酸的结构式可如式(V)所示： 
Figure BDA0000106167640000053
Y型聚乙二醇羧酸结构式 
多分支聚乙二醇羧酸的结构式可如(VI)所示： 
Figure BDA0000106167640000061
多分支聚乙二醇羧酸结构式 
其中： 
R是多分支聚乙二醇的核心分子； 
m是分支数3-8，优选为4； 
x为1-12的整数，优选为1，即所形成的化合物是聚乙二醇-乙酸(PEG-CM)； 
n为任何整数，表示其聚合度，通常在10-1,500。 
对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60,000道尔顿，这相当于n为大约6～1300。更优选为，n为450，这相应于分子量为20,000。 
本发明的寡肽不是直链结构的，寡肽中的一些酰胺键是在某些氨基酸的侧链上形成的。组成寡肽的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸，优选为谷氨酸、甘氨酸。 
本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物形式进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。因此，采用的给药方式可选择通过口、鼻内、非肠道、局部、透皮或直肠方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。 
通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。 
可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20％)和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。 
如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。 
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明。 
实施例
实施例中所用的聚乙二醇-谷氨酸二肽由北京键凯科技有限公司提供，伊诺替康从上海龙翔生物医药开发有限公司购得，L(+)-谷氨酸从北京化学试剂公司购得，对甲苯磺酸、苯甲醇及二环己基碳二亚胺(DCC)从国药集团化学试剂有限公司购得，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)及1-羟基苯并三氮唑(HOBT)从上海共价化学科技有限公司购得，N-叔丁氧羰基甘氨酸从四川同晟氨基酸有限公司，N-叔丁氧羰基甘氨酸从成都景田生物有限公司购得。 
实施例1：直链聚乙二醇(20k)-氨基酸五肽-依诺替康结合物(CPT-1)的制备 
L(+)-谷氨酸29.4g、对甲苯磺酸40g、苯甲醇80mL溶于甲苯500mL中，氮气保护下回流分出11mL水，继续回流3h，蒸除150mL。冷却到50℃，将反应液倒入盛有600mL石油醚的烧杯中，搅拌1h，过滤收集沉淀。滤饼用95％乙醇280mL加热溶解后，停止加热，冷却过夜。过滤收集沉淀真空干燥，制得L(+)-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐61g。 
谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐30g溶于500mL二氯甲烷中，氮气保护下加入叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯20.86g，全溶后加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)7.55g、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)8.35g，完全溶解后加入二环己基碳二亚胺(DCC)14.3g的二氯甲烷溶液40mL。滴毕，密闭体系反应过夜。TLC监测反应完毕。过滤除去溶剂后，浓缩液中加入20mL乙酸乙酯，滤除固体，母液加入石油醚400mL沉淀，过滤得产品N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)15.8g。 
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)0.776g溶解在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，氮气保护下，加入聚乙二醇乙酸(分子量为20000)20.0g、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)245mg、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)135mg。全部溶解后，加入二环己基碳二亚胺(DCC)412mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气(H2)室温反应过夜。过滤除去钯炭，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到聚乙二醇-谷氨酸二肽(分子量为20000)13.4g。 
盐酸依诺替康13.3g和N-叔丁氧羰基甘氨酸(BOC-gly-OH)20.1g，溶解在120mL无水二氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)18.8g和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)7.4g，室温下搅拌过夜。过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入100mL石油醚。过滤收集沉淀真空干燥，制得伊立替康-N-叔丁氧羰基甘氨酸酯23g。 
依诺替康-N-叔丁氧羰基甘氨酸酯(由上步制得)23g溶解在100mL二氯甲烷中，添加30mL三氟乙酸，室温下搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入500mL乙醚。过滤，收集沉淀，真空干燥，制得依诺替康-甘氨酸酯20g。 
聚乙二醇-谷氨酸二肽(分子量为20000)5.0g、依诺替康-甘氨酸酯1.02g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)115mg、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)153mg溶于50mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，再添加二环己基碳二亚胺(DCC)309mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加100mL异丙醇(IPA)，过滤，产品经真空干燥，得到聚乙二醇-谷氨酸甘氨酸五肽-依诺替康(CPT-1)4.4g。熔点：56-64℃。1H-NMR(DMSO-d6)：0.84-0.89(m，8H)，1.24(m，9H)，1.40-1.50(m，21H)，1.79(m，8H)，2.12(m，10H)，2.89(m，4H)，3.50(m，1800H)，4.05(m，9H)，4.26(m，5H)，5.26(m，5H)，5.48(m，5H)，7.07(m，2H)，7.55-7.60(m，3H)，7.89(m，3H)，8.11(m，4H)，8.20(m，3H)。 
实施例2：直链聚乙二醇乙酸(20k)-氨基酸七肽-依诺替康结合物的制备 
L(+)-谷氨酸29.4g、对甲苯磺酸40g、苯甲醇80mL溶于甲苯500mL中，氮气保护下回流分出11mL水，继续回流3h，蒸除150mL。冷却到50℃，将反应液倒入盛有600mL石油醚的烧杯中，搅拌1h，过滤收集沉淀。滤饼用95％乙醇280mL加热溶解后，停止加热，冷却过夜。过滤收集沉淀真空干燥，制得L(+)-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐61g。 
谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐30g溶于500mL二氯甲烷中，氮气保护下加入叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯20.86g，全溶后加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)7.55g、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)8.35g，完全溶解后加入二环己基碳二亚胺(DCC)14.3g的二氯甲烷溶液40mL。滴毕，密闭体系反应过夜。TLC监测反应完毕。过滤除去溶剂后，浓缩液中加入20mL乙酸乙酯，滤除固体，母液加入石油醚400mL沉淀，过滤得产品N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)15.8g。 
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)6.47g溶解在15mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸6mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，氮气保护下，加入叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯3.37g，全溶后加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)1.22g、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)1.35g，完全溶解后滴加二环己基碳二亚胺(DCC)2.39g的二氯甲烷溶液20mL。滴毕，密闭体系反应过夜。TLC监测反应完毕。过滤，依次用10％柠檬酸(30mL*3)、5％碳酸氢钠(30mL*3)、5％饱和氯化钠水溶液(30mL*3)萃取，无水硫酸钠干燥。过滤，除去溶剂后，浓缩液中加入25mL乙酸乙酯，滤除固体，母液加入石油醚400mL沉淀，过滤得产品N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯三肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)6.8g。 
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯三肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)1.039g溶解 在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入200mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，氮气保护下，加入聚乙二醇乙酸(分子量为20000)20.0g、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)245mg、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)135mg。全部溶解后，加入二环己基碳二亚胺(DCC)412mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气(H2)室温反应过夜。过滤除去钯炭，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到聚乙二醇-谷氨酸三肽(分子量为20000)15.4g。 
聚乙二醇-甘氨酸三肽(由本实施例中制得，分子量为20000)5.0g、依诺替康甘氨酸酯(由实施例1中制得)1.36g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)115mg、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)153mg溶于50mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，再添加二环己基碳二亚胺(DCC)309mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加100mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到直链聚乙二醇-谷氨酸甘氨酸七肽-依诺替康4.5g。熔点：57-64℃。1H-NMR(DMSO-d6)：0.84-0.89(m，8H)，1.24(m，9H)，，1.71-1.74(m，23H)，2.12(m，16H)，2.95-2.99(m，19H)，3.50(m，1800H)，4.22(m，18H)，5.45(m，5H)，5.49(m，5H)，7.07(m，2H)，7.55-7.60(m，3H)，7.89(m，3H)，8.11(m，4H)，8.20(m，3H)。 
实施例3：Y型聚乙二醇(40k)-氨基酸五肽-依诺替康结合物的制备 
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)0.776g(实施例1)溶解在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，氮气保护下，加入Y型聚乙二醇羧酸(分子量为40000，结构如(V))40.0g、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)245mg、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)135mg。全部溶解后，加入二环己基碳二亚胺(DCC)412mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气(H2)室温反应过夜。过滤除去钯炭，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到Y型聚乙二醇-谷氨酸二肽(分子量为40000道尔顿)33.4g。 
Y型聚乙二醇-谷氨酸二肽(由上步制得，分子量为40000)10g、依诺替康甘氨酸酯1.02g(由实施例1中制得)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)115mg、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)153mg溶于50mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，再添加二环己基碳二亚胺(DCC)309mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加100mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到Y型聚乙二醇-谷氨酸甘氨酸五肽-依诺替康9.4g。MALDI-TOF(Mn＝43444，Pd＝1)。熔点：56-64℃。1H-NMR(DMSO-d6)：0.82(m，9H)， 1.23(m，11H)，1.40-1.50(m，20H)，1.79(m，8H)，2.12(m，10H)，3.50(m，3600H)，3.98-4.22(m，20H)，5.26-5.48(m，8H)，7.07(m，2H)，7.80(m，2H)，7.90(m，3H)，8.11(m，4H)，8.20(m，2H)。 
实施例4：4分支聚乙二醇乙酸(30k)-氨基酸二十肽-依诺替康结合物的制备 
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl)0.8g(实施例1)溶解在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液(NaHCO3)洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，加入二氯甲烷200mL。氮气保护下，加入4分支聚乙二醇乙酸(分子量为30000，结构式如(VI)所示)7.5g、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)246mg、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)135mg。全部溶解后，加入二环己基碳二亚胺(DCC)422mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气(H2)室温反应过夜。过滤除去钯炭，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加500mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到多分支聚乙二醇乙酸-谷氨酸八肽(分子量为30000)6.8g。 
聚乙二醇乙酸-谷氨酸八肽(由上步制得，分子量为30000)5.5g、依诺替康甘氨酸酯(由实施例1中制得)1.03g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)118mg、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)163mg溶于50mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，再添加二环己基碳二亚胺(DCC)329mg。室温过夜搅拌反应。过滤除去固体物质，多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加100mL异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。得到多分支聚乙二醇-谷氨酸甘氨酸二十肽-依诺替康4.1g。熔点：56-64℃。1H-NMR(DMSO-d6)：0.82(m，9H)，1.23(m，12H)，1.45-1.53(m，20H)，1.76(m，8H)，2.11(m，9H)，3.50(m，2700H)，3.98-4.23(m，24H)，5.25(m，7H)，5.48(m，8H)，7.07(m，3H)，7.81(m，3H)，7.90(m，3H)，8.11(m，4H)，8.20(m，3H)。 
实施例5：伊诺替康不同制剂对人肠癌HCT-116裸小鼠移植瘤的生长抑制作用 
受试物 
CPT-1为直链聚乙二醇乙酸-氨基酸五肽-依诺替康结合物。 
阳性对照药物 
盐酸依诺替康注射液(CPT-11)，40mg/2ml，批号为8UL002-B，由Aventis Pharma(Dagenham)公司制造。临用时用生理盐水稀释至所需浓度。 
剂量设置 
CPT-1剂量设为45mg/kg(按所含依诺替康的量计算)，静脉注射给药，每周一次，连续三周；CPT-11剂量为45mg/kg，每周静脉注射给药一次；及15mg/kg，每周静脉注射 给药三次，连续三周。 
动物 
BALB/cA裸小鼠，雄性，5-6周龄，体重19±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK(沪)2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。 
细胞株 
人肠癌HCT-116细胞株购自ATCC。用该细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。 
实验方法 
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。CPT-1按45mg/kg剂量组、对照组给等量生理盐水，每周静脉注射一次，连续三周。CPT-11(15mg/kg)作为阳性对照药，每周静脉注射三次，连续给药三周。给药结束后，继续观察一周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。 
结果与讨论 
实验结果如表1所示。CPT1(45mg/kg)每周静脉注射给药一次，连续三周，对人肠癌HCT-116裸小鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制，T/C百分数为27.60％，抑瘤效果优于同样剂量同样给药方案的CPT-1145mg/kg，同样给药方案实验治疗的CPT-11也能一定程度抑制HCT-116皮下移植瘤的生长，但T/C百分数仅为63.56％。阳性对照CPT-11(15mg/kg)每周静脉给药三次，连续三周，同样能显著抑制HCT-116皮下移植瘤的生长，T/C值为39.84％。整个实验过程中，各组裸小鼠体重均有下降，与溶剂对照组相比，仅CPT-1145mg/kg组裸小鼠体重减轻稍强于溶剂对照组。 
表1.PEG化依诺替康对人肠癌HCT-116裸小鼠移植瘤的实验治疗作用 
Figure BDA0000106167640000111
注：t检验，vs溶剂对照组，*p＜0.01，**p＜0.001；vs CPT-11 45mg/kg组，#p＜0.05，##p＜0.001 
实施例6：依诺替康不同制剂对人肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的生长抑制作用 
受试物 
CPT-1为直链聚乙二醇乙酸-氨基酸五肽-依诺替康结合物。 
阳性对照药物 
盐酸依诺替康注射液(CPT-11)，40mg/2ml，批号为8UL002-B，由Aventis Pharma(Dagenham)公司制造。临用时用生理盐水稀释至所需浓度。 
剂量设置 
CPT-1剂量设为45mg/kg(按所含依诺替康的量计算)，静脉注射给药，每周一次，连续三周；CPT-11剂量为45mg/kg，每周静脉注射给药一次；及15mg/kg，每周静脉注射给药三次，连续三周。 
动物 
BALB/cA裸小鼠，雄性，5-6周龄，体重18±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK(沪)2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。 
细胞株 
人肠癌HT-29细胞株购自ATCC。用该细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。 
实验方法 
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。CPT-1及CPT-11按45mg/kg剂量组、对照组给等量生理盐水，每周静脉注射一次，连续三周。CPT-11(15mg/kg)作为阳性对照药，每周静脉注射三次，连续给药三周。给药结束后，继续观察一周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。 
结果与讨论 
实验结果如表2所示。CPT-1(45mg/kg)每周静脉注射给药一次，连续三周，对人肠癌HT-29裸小鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制，给药一周后，实验治疗组小鼠所带肿瘤体积增长即有减缓。至实验结束，T/C百分数为41.08％。阳性对照CPT-11(15mg/kg)每周静脉给药三次，连续三周，同样能显著抑制HT-29皮下移植瘤的生长，T/C值为27.27％。整个实验过程中，各组裸小鼠生长状态良好，仅CPT-11两个不同剂量组裸小鼠体重有下降。 
表2.PEG化依诺替康对人肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的实验治疗作用 
Figure BDA0000106167640000131
注：t检验，vs溶剂对照组，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；vs CPT-11 45mg/kg组，#p＜0.05 
实施例7：伊诺替康不同制剂对人肺癌A549裸小鼠移植瘤的生长抑制作用 
受试物 
CPT-1为直链聚乙二醇乙酸-氨基酸五肽-依诺替康结合物。 
阳性对照药物 
盐酸依诺替康注射液(CPT-11)，40mg/2ml，批号为8UL002-B，由Aventis Pharma(Dagenham)公司制造。临用时用生理盐水稀释至所需浓度。 
剂量设置 
CPT-1剂量设为45mg/kg(按所含依诺替康的量计算)，静脉注射给药，每周一次，连续三周；CPT-11剂量为45mg/kg，每周静脉注射给药一次；及15mg/kg，每周静脉注射给药三次，连续三周。 
动物 
BALB/cA裸小鼠，雌性，5-6周龄，体重18±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK(沪)2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。 
细胞株 
人肺癌A549细胞株购自ATCC。用该细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。 
实验方法 
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。CPT-1及CPT-11按45mg/kg剂量组、对照组给等量生理盐水，每周静脉注射一次，连续三周。CPT-11(15mg/kg)作为阳性对照药，每周静脉注射三次，连续给药三周。给药结束后，继续观察一周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次 测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。 
结果与讨论 
实验结果如表3所示。CPT-1和CPT-11(45mg/kg)每周静脉注射给药一次，连续三周，对人肺癌A549裸小鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制，T/C百分数为20.62％，CPT-1的抑瘤效果远优于同样剂量同样给药方案的CPT-11。与溶剂对照组相比，CPT-1实验治疗一周后，荷瘤鼠皮下移植瘤的生长就有减缓。阳性对照CPT-11(15mg/kg)每周静脉给药三次，连续三周，同样能显著抑制A549皮下移植瘤的生长，T/C值为53.26％。整个实验过程中，各治疗组裸小鼠生长状况良好，体重增加稍缓于溶剂对照组。 
表3.PEG化依诺替康对人肺癌A549裸小鼠移植瘤的实验治疗作用 
Figure BDA0000106167640000141
注：t检验，vs溶剂对照组，*p＜0.001；vs CPT-11 45mg/kg组，#p＜0.01 
实施例8：依诺替康不同制剂对人卵巢癌SKOV-3裸小鼠移植瘤的生长抑制作用 
受试物 
CPT-1为直链聚乙二醇乙酸-氨基酸五肽-依诺替康结合物。 
阳性对照药物 
盐酸依诺替康注射液(CPT-11)，40mg/2ml，批号为8UL002-B，由Aventis Pharma(Dagenham)公司制造。临用时用生理盐水稀释至所需浓度。 
剂量设置 
CPT-1剂量设为45mg/kg(按所含依诺替康的量计算)，静脉注射给药，每周一次，连续三周；CPT-11剂量为45mg/kg，每周静脉注射给药一次；和15mg/kg，每周静脉注射给药三次，连续三周。 
动物 
BALB/cA裸小鼠，雌性，5-6周龄，体重19±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK(沪)2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。 
细胞株 
人卵巢癌SKOV-3细胞株购自ATCC。用该细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。 
实验方法 
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。CPT-1及CPT-11按45mg/kg剂量组、对照组给等量生理盐水，每周静脉注射一次，连续三周。CPT-11(15mg/kg)作为阳性对照药，每周静脉注射三次，连续给药三周。给药结束后，继续观察一周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。 
结果与讨论 
实验结果如表4所示。CPT-1每周静脉注射给药一次，连续三周，对人卵巢癌SKOV-3裸小鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制，T/C百分数为0.53％，抑瘤效果远优于同样剂量同样给药方案的CPT-11，该条件下，CPT-11的T/C百分数为96.46％。CPT-1给药一周后，各小鼠荷瘤体积就有缩小，至试验结束时，CPT-1组有4只荷瘤鼠肿瘤完全消退。阳性对照CPT-11(15mg/kg)每周静脉给药三次，连续三周，同样能显著抑制SKOV-3皮下移植瘤的生长，T/C值为55.69％。整个实验过程中，溶剂对照组和CPT-11两种不同治疗组小鼠体重则有轻微下降；而CPT-1实验治疗组裸小鼠生长状况良好，体重增加。 
表4.PEG化依诺替康对人卵巢癌SKOV-3裸小鼠移植瘤的实验治疗作用 
Figure BDA0000106167640000151
注：t检验，vs溶剂对照组，*p＜0.001；vs CPT-11 45mg/kg组，#p＜0.001，“()”为肿瘤消退动物数 
实施例9：依诺替康不同制剂对人肠癌SW-620裸小鼠移植瘤的生长抑制作用 
受试物 
CPT-1为直链聚乙二醇乙酸-氨基酸五肽-依诺替康结合物。 
阳性对照药物 
盐酸依诺替康注射液(CPT-11)，40mg/2ml，批号为8UL002-B，由Aventis Pharma(Dagenham)公司制造。临用时用生理盐水稀释至所需浓度。 
剂量设置 
CPT-1剂量设为45mg/kg(按所含伊立替康的量计算)，静脉注射给药，每周一次，连续三周；CPT-11剂量为45mg/kg，每周静脉注射给药一次；及15mg/kg，每周静脉注射给药三次，连续三周。 
动物 
BALB/cA裸小鼠，雄性，4-6周龄，体重19±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK(沪)2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。 
细胞株 
人肠癌SW-620细胞株购自ATCC。用该细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。 
实验方法 
取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。CPT-1及CPT-11按45mg/kg剂量组、对照组给等量生理盐水，每周静脉注射一次，连续三周。CPT-11(15mg/kg)作为阳性对照药，每周静脉注射三次，连续给药三周。给药结束后，继续观察一周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。 
结果与讨论 
实验结果如表5所示。CPT-1和CPT-11(45mg/kg)每周静脉注射给药一次，连续三周，对人肠癌SW-620裸小鼠皮下移植瘤的生长有明显抑制作用，而且CPT-1的抑瘤效果均优于同样剂量同样给药方案的CPT-11，每组6只实验治疗荷瘤小鼠实验性治疗三周后，CPT-1治疗组有2只荷瘤小鼠肿瘤完全消退，停药一周后也未见反弹。阳性对照CPT-11(15mg/kg)每周静脉给药三次，连续三周，同样能显著抑制SW-620皮下移植瘤的生长，T/C值为0.13％。整个实验过程中，各治疗组裸小鼠生长状况良好，体重增加超过溶剂对照组。 
表5.PEG化依诺替康对人肠癌SW-620裸小鼠移植瘤的实验治疗作用 
注：t检验，vs溶剂对照组，*p＜0.01，**p＜0.001；vs CPT-1145mg/kg组，#p＜0.001，“()”为肿瘤消退动物数 。

Claims (20)

1.通式(I)的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物：
Figure FDA0000106167630000011
其中：
PEG代表聚乙二醇，PEG的分子量为300-60,000道尔顿；
(AA)i代表寡肽，其中AA代表寡肽中相同或不同的氨基酸；
i和j可以相同或不同，且
i是2-12的整数，代表寡肽中的氨基酸数量；
j是2-12的整数，代表与寡肽连接的依诺替康的数量。
2.如权利要求1所述的结合物，其中，所述PEG的平均分子量为20,000-40,000道尔顿。
3.如权利要求1所述的结合物，其中，PEG具有直链、Y型或多分支结构。
4.如权利要求1所述的结合物，其中，PEG是直链的甲氧基聚乙二醇，且具有如下结构：
Figure FDA0000106167630000012
其中：
n是10-1,500的整数，；
x是0-6的整数。
5.如权利要求4所述的结合物，其中n是400-500的整数。
6.如权利要求4所述的结合物，其中x是1。
7.如权利要求1所述的结合物，其中，PEG平均分子量为40,000道尔顿，且是分支型的聚乙二醇，且具有如下结构：
Figure FDA0000106167630000021
其中：
n是10-1,500的整数。
8.如权利要求7所述的结合物，其中PEG是Y型聚乙二醇。
9.如权利要求7所述的结合物，其中n为400-500的整数。
10.如权利要求1所述的结合物，其中PEG具有如下多分支结构：
Figure FDA0000106167630000022
其中，
n是10-1,500的整数；
R是多分支聚乙二醇的核心分子；
m是3-8的分支数；
x是0-12的整数。
11.如权利要求10所述的结合物，其中n是160-180的整数。
12.如权利要求10所述的结合物，其中m是4。
13.如权利要求10所述的结合物，其中x是1。
14.如权利要求1所述的结合物，其中，所述的氨基酸为谷氨酸和甘氨酸，氨基酸寡肽由2个谷氨酸和3个甘氨酸组成。
15.如权利要求1所述的结合物，其中，所述的氨基酸为谷氨酸和甘氨酸的组合，由3个谷氨酸和4个甘氨酸组成。
16.如权利要求1或2所述的结合物，其中，所述结合物是具有通式(II)的聚乙二醇-氨基酸寡肽-依诺替康结合物：
Figure FDA0000106167630000031
17.包含如权利要求1-16之任一项所述的结合物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂的剂型。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其中，所述药物组合物具有抗癌活性。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述抗癌活性为对肠癌、卵巢癌和肺癌具有抑制性的活性。
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