CN101690823B - 含rgdv阿糖胞苷偶联物药质体制备及作为抗肿瘤剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含RGDV阿糖胞苷偶联物药质体制备及作为抗肿瘤剂的应用，本发明将阿糖胞苷的N⁴位上连接了一个含有RGDV序列的四肽片段，同时，结合上不同长度的脂肪酸，合成一系列具有两亲性的阿糖胞苷偶联物，并将其制成药质体，通过药质体良好的靶向作用以及RGDV作为整合素受体结合位点的双重作用，更好将阿糖胞苷靶向到肿瘤部位，本发明以荷肉瘤S180小鼠为模型评价了阿糖胞苷系列偶联物药质体制剂的抗肿瘤活性，结果显示阿糖胞苷系列偶联物药质体比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性。

Description

含RGDV阿糖胞苷偶联物药质体制备及作为抗肿瘤剂的应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤靶向阿糖胞苷系列偶联物及其药质体的构建方法，本发明还涉及抗肿瘤靶向阿糖胞苷偶联物药质体的应用，属于生物医药领域。

背景技术

阿糖胞苷(Cytosine Arabinoside，Ara-C)是典型的嘧啶核苷类拮抗剂，是临床上常用的抗白血病药物，已有四十余年历史，已成为治疗急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)的最主要药物之一。

静脉给药后，Ara-C迅速在系统池中脱氨基成为Ara-U，同时，Ara-C也被快速转运到细胞中，代谢成为有抗肿瘤活性的Ara-CTP。Ara-C在细胞内脱氨基的程度相对较低。由于其在系统池中的迅速脱氨基和半衰期短，通常采用持续静脉给药或频繁大剂量给药。

对阿糖胞苷的修饰主要集中在N⁴位，保护氨基被脱除。首先，从阿糖胞苷结构中可知其裸露的氨基和阿糖上的众多羟基使它具有很强的极性。为了改变其水溶性强的特点，可以将其与脂溶性强的脂肪酸相连。再者，本发明认为连接脂肪酸与阿糖胞苷的桥链可以进行进一步的研究。

整合素最早由Richard于1987年提出，指细胞与细胞或细胞与细胞外基质相关联的细胞膜表面的一族细胞黏附分子。整合素分子都是由α，β两条链经非共价键连接而成的异源二聚体蛋白。目前已知至少有25种α亚单位和11种β亚单位，二者相互连接组成约20多种不同的整合素分子。

许多恶性肿瘤的生长和转移均与整合素表达异常或分子结构改变相关。同时，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp，RGD)是整合素特异识别序列片段，RGD三肽及修饰物通过与整合素特异结合，具有阻止肿瘤细胞定位增殖、抗肿瘤新生血管生成作用。

本发明选择在阿糖胞苷的N⁴位连接一个含有RGDV四个氨基酸序列肽段，把药物主动的靶向到肿瘤部位。并连接上不同长度的脂肪酸，增加其脂溶性，使其具有适当的油水分配系数，再通过加入少许的辅助材料，便可以将其制备成药质体，进一步增加其靶向性。

发明内容

本发明的目的之一是提供阿糖胞苷系列偶联物及其制备方法；

本发明的目的之二是提供一种抗肿瘤靶向阿糖胞苷系列偶联物药质体及其制备方法；

本发明的目的之三是将上述的抗肿瘤靶向阿糖胞苷系列偶联物及其药质体在恶性肿瘤治疗中的用途。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的阿糖胞苷系列偶联物其分子式为：

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C；或

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH。

其中n＝7，9，11，13或15，Arg-Gly-Asp-Val为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸四肽序列，Ara-C为阿糖胞苷。

本发明的阿糖胞苷系列偶联物，其制备方法，步骤如下：

首先合成C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH和HCl·H-Val-Ara-C，两者缩合得到

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C；和

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH的混合物，进一步分离得到纯的单一化合物。

详细步骤如下：

1)将Boc-Arg(NO₂)-OH与H-Gly-OBzl缩合，得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

2)将Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl脱除Boc-，得到H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

3)C_nH_2n+1COOH与H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

4)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl脱除-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH；

5)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH与H-Asp(OBzl)₂缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂；

6)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂脱除-NO₂、-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH；

7)将Boc-Val-OH与Ara-C缩合，得到Boc-Val-Ara-C；

8)将Boc-V-Ara-C脱除Boc-，得到H-Val-Ara-C；

9)将C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH与HCl·H-Val-Ara-C缩合，得到

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C，和

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH(n＝7，9，11，13，15)的混合物，通过高压液相制备色谱进行分离纯化，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。

优选的步骤如下：

1)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将Boc-Arg(NO₂)-OH与H-Gly-OBzl缩合，得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

2)将Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl在4NHCl-EtoAc溶液中脱除Boc-，得到H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

3)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将脂肪酸与H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

4)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl在2NNaOH中脱除-OBzl，冰浴，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH；

5)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH与H-Asp(OBzl)₂缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂；

6)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂在乙醇溶液中，用Pd\C作催化剂，通入H₂，脱除-NO₂、-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH；

7)以无水DMF作溶剂，在EDC、HOBt和NMM存在下将Boc-Val-OH与Ara-C缩合，得到Boc-Val-Ara-C；

8)将Boc-V-Ara-C在4NHCl-EtoAc溶液中脱除Boc-，得到H-Val-Ara-C；

9)以无水DMF作溶剂，在EDC、HOBt和NMM存在下将

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH与HCl·H-Val-Ara-C缩合，得到

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C和

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH(n＝7，9，11，13，15)的混合物，

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C和C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH通过高压液相制备色谱进行分离纯化，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。

阿糖胞苷系列偶联物的合成路线如下：

CH₃(CH₂)_nCO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C    n＝6，8，10，12，14

CH₃(CH₂)_nCO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH

本发明的阿糖胞苷系列偶联物，可以作为药物活性成分，制备成药物制剂组合物，优选的，本发明的药物制剂组合物是脂质体组合物(药质体)，其制备是将上述阿糖胞苷系列偶联物与天然卵磷脂按照薄膜分散法进行制备，既可得到阿糖胞苷偶联物药质体；其中，在该靶向药质体中，优选的，各组分按照以下质量百分比组成：天然卵磷脂5-95％，阿糖胞苷偶联物5-95％。

一种制备抗肿瘤靶向阿糖胞苷偶联物药质体的方法，优选的，将阿糖胞苷系列偶联物与天然卵磷脂用适当的溶剂(如氯仿、二氯乙烷、甲醇等)溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入注射用生理盐水，超声分散，得具乳光的药质体胶体溶液。

经检测，所制备的阿糖胞苷系列偶联物药质体胶体溶液中，分散颗粒的粒径为150-500nm，Zeta电位为-15mV至-30mV。

附图说明

图1药质体与混悬剂抑瘤率柱状图

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实例1.Boc-Val-Ara-C的制备

将6.5g(30mmmol)Boc-Val-OH，5.76g(40mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，2.7g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将5.6g(20mmol)阿糖胞苷盐酸盐加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF，用过量乙醚洗残留物，蒸干乙醚，乙酸乙酯溶解，用5％NaHCO₃洗、饱和NaCl洗。浓缩乙酸乙酯层，无水Na₂SO₄干燥。柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝25∶1)。得4.42g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)443.2[M+H]⁺，884.8[2M+H]⁺；Mp.130.8～133.2℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=65.6$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例2.HCl·H-Val-Ara-C的制备

将4.42g(10mmol)Boc-Val-Ara-C溶解在适量4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨得3.98g(90％)标题化合物，为白色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)343.1[M+H]⁺，685.1[2M+H]⁺；Mp.188.0～191.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=102.6$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例3.Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将13.4g(42mmol)Boc-Arg(NO₂)-OH，5.4g(40mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入10.7g(46mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把8.1g(40mmol)TosOH·Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到16.3g(87.4％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)467.1[M+H]⁺。

实例4.HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将4.66g(10mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶解在适量4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨得4.43g(95％)粗产品，为无色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)367.1[M+H]⁺，733.1[2M+H]⁺。

实例5.C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将1.71g(11.9mmol)C₇H₁₅COOH，1.46g(10.8mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入2.89g(14.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把4.35g(10.8mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到4.51g(85％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)515.3[M+Na]⁺，1007.5[2M+Na]⁺；Mp.145.0～18.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=15.02$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例6.C₉H₁₉CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将2.05g(11.9mmol)C₉H₁₉COOH，1.46g(10.8mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入2.89g(14.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把4.35g(10.8mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到4.49g(88％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)543.3[M+Na]⁺，1063.9[2M+Na]⁺；Mp.146.3～147.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=17.67$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例7.C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将2.38g(11.9mmol)C₁₁H₂₃COOH，1.46g(10.8mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入2.89g(14.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把4.35g(10.8mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到4.91g(91％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)571.3[M+Na]⁺，1120.0[2M+Na]⁺；Mp.146.3～147.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=14.48$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例8.C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将2.71g(11.9mmol)C₁₃H₂₇COOH，1.46g(10.8mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入2.89g(14.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把4.35g(10.8mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到5.48g(94％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)599.3[M+Na]⁺，1176.0[2M+Na]⁺；Mp.151.0～152.1℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=19.76$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例9.C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl的制备

将3.05g(11.9mmol)C₁₅H₃₁COOH，1.46g(10.8mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入2.89g(14.0mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把4.35g(10.8mmol)HCl·H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Gly-OH消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到5.87g(90％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)627.4[M+Na]⁺，1232.0[2M+Na]⁺；Mp.152.7～154.2℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-3.01$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例10.C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-OH的制备

将2.46g(5mmol)C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C₈H₁₆CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.81g(90.0％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)401.2[M-H]^-，803.4[2M-H]^-；Mp.108.5～111.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=14.3$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例11.C₉H₁₉CO-Arg(NO₂)-Gly-OH的制备

将2.60g(5mmol)C₉H₁₉CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C₈H₁₆CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.98g(92.0％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)453.2[M+Na]⁺，883.4[2M+Na]⁺；Mp.159.4～160.7℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-4.36$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例12.C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-OH的制备

将2.74g(5mmol)C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C₈H₁₆CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.94g(84.6％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)481.3[M+Na]⁺，939.4[2M+Na]⁺；Mp.164.3～166.6℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-9.21$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例13.C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-OH的制备

将2.88g(5mmol)C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C₈H₁₆CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.94g(89％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)509.2[M+Na]⁺，995.8[2M+Na]⁺；Mp.164.1～165.8℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-6.55$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例14.C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-OH的制备

将3.02g(5mmol)C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C₈H₁₆CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO₄水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到2.24g(87％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)537.3[M+Na]⁺，1051.7[2M+Na]⁺；Mp.163.7～165.8℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-9.17$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例15.C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂的制备

将2.11g(5.25mmol)C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-OH，0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.5mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)₂悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Asp(OBzl)₂消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝30∶1)。得到2.09g(93％)无色固体。ESI-MS(m/z)698.3[M+H]⁺，720.3[M+Na]⁺；Mp.81.6～83.8℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-0.47$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例16.C₉H₁₉CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂的制备

将2.26g(5.25mmol)C₉H₁₉CO-Arg(NO₂)-Gly-OH，0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.5mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)₂悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Asp(OBzl)₂消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝30∶1)。得到2.39g(95％)无色固体。ESI-MS(m/z)726.4[M+H]⁺，748.5[M+Na]⁺；Mp.90.4～91.9℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-5.83$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例17.C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂的制备

将2.40g(5.25mmol)C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-OH，0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.5mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)₂悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Asp(OBzl)₂消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝30∶1)。得到2.44g(91％)无色固体。ESI-MS(m/z)754.4[M+H]⁺，776.4[M+Na]⁺；Mp.60.2～63.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-0.56$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例18.C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂的制备

将2.55g(5.25mmol)C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-OH，0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.5mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)₂悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Asp(OBzl)₂消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝30∶1)。得到2.73g(92％)无色固体。ESI-MS(m/z)782.3[M+H]⁺，804.5[M+Na]⁺；Mp.58.0～61.2℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-0.27$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例19.C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂的制备

将2.70g(5.25mmol)C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-OH，0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)溶于适量无水DMF中。冰浴下再滴入1.34g(6.5mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)的无水DMF溶液，冰浴下搅拌20分钟，得到反应液(I)。冰浴下把2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)₂悬浮于适量无水DMF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH至7-8，得到反应液(II)。冰浴下把反应液(I)滴加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示HCl·H-Asp(OBzl)₂消失，停止反应。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、柱层析分离(展开剂：氯仿∶甲醇＝30∶1)。得到2.42g(92％)无色固体。ESI-MS(m/z)810.5[M+H]⁺，832.5[M+Na]⁺；Mp.56.2～69.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=-4.10$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例20.C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备

将0.70g(1mmol)C₇H₁₅CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.33g(90％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)473.2[M+H]⁺；Mp.123.5～125.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=8.31$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例21.C₉H₂₁CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备

将0..73g(1mmol)C₁₀H₂₀CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.40g(95％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)501.2[M+H]⁺；Mp.117.3～120.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=8.31$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例22.C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备

将0.76g(1mmol)C₁₁H₂₃CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.41g(97％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)529.3[M+H]⁺；Mp.114.1～116.2℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=10.9$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例23.C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备

将0.79g(1mmol)C₁₃H₂₇CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.38g(95％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)557.3[M+H]⁺；Mp.105.5～107.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=3.1$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例24.C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备

将0.82g(1mmol)C₁₅H₃₁CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.38g(96％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)585.4[M+H]⁺；Mp.130.2～133.7℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=3.8$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例25.C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₈-1)的制备

将1.42g(3mmol)C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp-OH，0.87g(4.5mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，0.41g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将1.48g(3.9mmol)HCl·H-Val-Ara-C加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF。用甲醇溶解残留物，并用制备型液相仪将C₈-1和C₈-2进行分离。分离以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。得到261mg(92％)C₈-1。ESI-MS(m/z)797.9[M+H]⁺820.4[M+Na]⁺；Mp.169.8～171.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=45.5$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例26.C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₈-2)的制备

用制备型液相仪纯化C₈-1和C₈-2的混和物时，可同时得到119mg(93％)C₈-2。ESI-MS(m/z)797.7[M+H]⁺820.1[M+Na]⁺；Mp.162.1～163.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=54.3$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例27.C₉H₁₉CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₀-1)的制备

将1.5g(3mmol)C₉H₁₉CO-Arg-Gly-Asp-OH，0.87g(4.5mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，0.41g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将1.48g(3.9mmol)HCl·H-Val-Ara-C加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF。用甲醇溶解残留物，并用制备型液相仪将C₁₀-1和C₁₀-2进行分离。分离以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。得到248mg(97％)C₁₀-1。ESI-MS(m/z)825.7[M+H]⁺847.7[M+Na]⁺；Mp.166.7～169.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=52.9$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例28.C₉H₁₉CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₀-2)的制备

用制备型液相仪纯化C₁₀-1和C₁₀-2的混和物时，可同时得到124mg(97％)C₁₀-2。ESI-MS(m/z)825.8[M+H]⁺847.8[M+Na]⁺；Mp.164.2～167.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=41.5$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例29.C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₂-1)的制备

将1.58g(3mmol)C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp-OH，0.87g(4.5mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，0.41g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将1.48g(3.9mmol)HCl·H-Val-Ara-C加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF。用甲醇溶解残留物，并用制备型液相仪将C₁₂-1和C₁₂-2进行分离。分离以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。得到358mg(98％)C₁₂-1。ESI-MS(m/z)854.0[M+H]⁺876.0[M+Na]⁺；Mp.164.5～166.3℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=63.89$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例30.C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₂-2)的制备

用制备型液相仪纯化C₁₂-1和C₁₂-2的混和物时，可同时得到179mg(92％)C₁₂-2。ESI-MS(m/z)854.2[M+H]⁺876.2[M+Na]⁺；Mp.162.4～163.8℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=46.3$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例31.C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₄-1)的制备

将1.66g(3mmol)C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp-OH，0.87g(4.5mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，0.41g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将1.48g(3.9mmol)HCl·H-Val-Ara-C加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF。用甲醇溶解残留物，并用制备型液相仪将C₁₄-1和C₁₄-2进行分离。分离以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。得到290mg(90％)C₁₄-1。ESI-MS(m/z)881.6[M+H]⁺903.6[M+Na]⁺；Mp.162.8～164.5℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=76.9$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例32.C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₄-2)的制备

用制备型液相仪纯化C₁₄-1和C₁₄-2的混和物时，可同时得到106mg(94％)C₁₄-2。ESI-MS(m/z)881.8[M+H]⁺904.0[M+Na]⁺；Mp.160.1～161.7℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=54.3$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例33.C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₆-1)的制备

将1.74g(3mmol)C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp-OH，0.87g(4.5mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(HCl·EDC)，0.41g(3mmol)HOBt溶于50ml无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下反应1小时，将1.48g(3.9mmol)HCl·H-Val-Ara-C加入反应液，于45℃油浴中反应24小时。吹干无水DMF。用甲醇溶解残留物，并用制备型液相仪将C₁₆-1和C₁₆-2进行分离。分离以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。得到109mg(91％)C₁₆-1 ESI-MS(m/z)909.9[M+H]⁺931.2[M+Na]⁺；Mp.159.8～162.0℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=52.1$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例34.C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₆-2)的制备

用制备型液相仪纯化C₁₆-1和C₁₆-2的混和物时，可同时得到82mg(97％)C₁₆-2。ESI-MS(m/z)909.6[M+H]⁺931.2[M+Na]⁺；Mp.156.4～158.8℃； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{25}=60.3$ (c1，MeOH∶CHCl₃＝1∶1)。

实例35.阿糖胞苷偶联物对黑色素瘤A375细胞生长的抑制作用

药物配制：将各阿糖胞苷偶联物溶于含4％DMSO的PBS磷酸盐缓冲液。其中，C₈-1、C₁₀-1、C₁₂-1、C₁₄-1、C₁₆-1、阿糖胞苷(Ara-C)制成5×10^-4mol/l，1×10^-4mol/l，5×10^-5mol/l，2×10^-5mol/l，10^-5mol/l，5×10^-6mol/l六个浓度；C₈-2、C₁₀-2、C₁₄-2制成7.1×10^-4mol/l，2.8×10^-4mol/l，1.4×10^-4mol/l，7.1×10^-5mol/l，2.8×10^-5mol/l，1.4×10^-5mol/l六个浓度；C₁₂-2、C₁₆-2制成8×10^-4mol/l，3.2×10^-4mol/l，1.6×10^-4mol/l，8×10^-5mol/l，3.2×10^-5mol/l，1.6×10^-5mol/l六个浓度。本组的阴性对照是含4％DMSO的PBS磷酸盐缓冲液。

实验方法：将A375细胞制成1×10⁴/ml细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100μl，37℃ 5％CO₂孵育箱中培养24h。实验设不含肿瘤细胞组、阴性对照组、阳性对照组及各种药物试验组。加入上述药物10μl，每个浓度重复3孔，培养48h，每孔加5mg/ml的MTT 25μl，培养4h。将96孔板弃去上液，每孔加DMSO100μl，振荡器振摇10min，自动酶标仪测定光密度OD值(测量波长570nm，参比波长630nm)。A375细胞存活率＝[(抗癌药物组OD值-不含细胞组OD值)/(细胞对照组OD值-不含细胞组OD值)]×100％并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果见表1

表1阿糖胞苷偶联物与Ara-C对黑色素瘤细胞株A375作用的IC₅₀

在细胞水平上来看，在对阿糖胞苷进行结构改造后，各阿糖胞苷系列偶联物具有抑制肿瘤细胞生长的活性，并且优于阿糖胞苷本身。

实例36.C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₈-1)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₈-1(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例37.C₇H₁₅CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₈-2)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₈-2(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例38.C₉H₁₉CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₀-1)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₀-1(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例39.C₉H₁₉CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₀-2)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₀-2(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例40.C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₂-1)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₂-1(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例41.C₁₁H₂₃CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₂-2)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₂-2(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例42.C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₄-1)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₄-1(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例43.C₁₃H₂₇CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₄-2)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₄-2(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例44.C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C(C₁₆-1)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₆-1(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例45.C₁₅H₃₁CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH(C₁₆-2)药质体的制备

薄膜分散法制备，取磷脂(50％，m/m)及C₁₆-2(50％，m/m)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入注射用生理盐水，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径150～500nm，Zeta-Potential-15～-30mV。

实例46.阿糖胞苷偶联物药质体对S180腹水瘤小鼠的治疗作用

取腹腔接种S₁₈₀腹水瘤第八天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，用75％酒精消毒后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3ml灭菌生理盐水的15ml的离心管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混匀。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起，试管加盖，1000转/分离心5分钟，弃去上清液。试管底部有的乳白色的胶状物。往试管底部的乳白色胶状物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起。取100μl该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放入冰中待用。取100μl上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100μl台盼兰染液，混匀。取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。将原液中的存活瘤细胞稀释成5.0×10⁶个/ml，用于接种。用2％碘酒棉球和75％酒精棉球在小鼠右侧腋下消毒，并注入0.2ml瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批ICR种小鼠接种，随机分组，放入动物室饲养。

药物配制：本实验设药物混悬剂和药质体两种剂型。

药质体治疗组为各阿糖胞苷偶联物药质体，阳性对照组为含有等摩尔量阿糖胞苷的脂质体，以及C₁₂-Val-Ara-C药质体，阴性对照组为空白脂质体。药质体的制备：将各药物与磷脂质量比为1∶1的比例采用薄膜分散法以生理盐水为分散体系配制成药质体溶液。

混悬剂治疗组为各化合物的CMC-Na混悬液，阳性对照为阿糖胞苷的CMC-Na溶液，阴性对照为CMC-Na溶液。药物混悬液制备：称取药物并研碎，加入两滴吐温80润湿，用0.5％CMC-Na制成混悬液。

各组药物以3.58mmol/L等摩尔浓度配制。

实验方法：将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组8只，共25组。各组小鼠正常饲养，从接种后24小时开始给药，每隔1天一次，共4次。每次尾静脉注射上述药物0.2ml。8天后将各组荷瘤小鼠处死，解剖，取瘤。并称体重和瘤重，按抑瘤率＝[(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。获得的数据以(X±SDg)表示，组间用双样本等方差的t检验。

取出处死的小鼠的肿瘤组织，用生理盐水洗涤后用锡纸包好放入-80℃冰箱中，取材、切片、HE染色，将制成的病理切片置显微镜下观察，照相。

结果见表2和表3

表2.各药质体组对荷肉瘤S₁₈₀小鼠的治疗作用

n＝8，*)与空白脂质体组瘤重比较，P＜0.01；#)与阿糖胞苷药质体组比较，P＜0.05；&)与C₁₂-V-Ara-C约质体组比较，P＜0.05

表3.混悬剂对荷肉瘤S₁₈₀小鼠的治疗作用n＝8

结果表明：在表1中，将各组瘤重进行统计学分析后可知，各阿糖胞苷偶联物药质体均有较好的抗肿瘤活性；各阿糖胞苷偶联物药质体与对照Ara-C药质体比较，其中C₁₀-1、C₁₀-2、C₁₂-1、C₁₂-2、C₁₄-1、C₁₄-2、C₁₆-1、C₁₆-2组有更好的抗肿瘤活性；各阿糖胞苷偶联物药质体与对照C₁₂-V-Ara-C药质体比较，其中C₁₀-1、C₁₀-2、C₁₂-1、C₁₂-2、C₁₄-1、C₁₆-1有更好的抗肿瘤活性。在表2中，将各组瘤重进行统计学分析后可知，将药物制成混悬剂，其抗肿瘤活性与空白对照组、阿糖胞苷组和C₁₂-V-Ara-C组比较均没有明显差异。从图1可知，各阿糖胞苷偶联物药质体的抑瘤率要明显高于各阿糖胞苷偶联物混悬剂的抑瘤率。

Claims (10)

1.一种阿糖胞苷系列偶联物，结构如下：

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C；或

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH。

其中n＝7，9，11，13或15，Arg-Gly-Asp-Val为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸四肽序列，Ara-C为阿糖胞苷。

2.含有权利要求1的偶联物的药物组合物。

3.权利要求2的药物组合物，是药质体，其特征在于：由权利要求1所述的阿糖胞苷系列偶联物和天然卵磷脂组成。

4.按照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，阿糖胞苷系列偶联物和天然卵磷脂质量百分比为：阿糖胞苷偶联物5-95％，天然卵磷脂5-95％。

5.按照权利要求2所述的药物组合物，是包括注射剂在内的各类药物制剂。

6.权利要求1所述的阿糖胞苷系列偶联物在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。

7.权利要求1所述的阿糖胞苷系列偶联物的制备方法，步骤如下：

以C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH和HCl·H-Val-Ara-C为原料，将两者缩合得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C；和

C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(-Val-Ara-C)-OH的混合物，进一步分离得到纯的单一化合物，其中n＝7，9，11，13或15，Arg-Gly-Asp-Val为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸四肽序列，Ara-C为阿糖胞苷。

8.权利要求7所述的制备方法，步骤如下：

1)将Boc-Arg(NO₂)-OH与H-Gly-OBzl缩合，得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

2)将Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl脱除Boc-，得到H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

3)C_nH_2n+1COOH与H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

4)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl脱除-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH；

5)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH与H-Asp(OBzl)₂缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂；

6)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂脱除-NO₂、-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH；

7)将Boc-Val-OH与Ara-C缩合，得到Boc-Val-Ara-C；

8)将Boc-V-Ara-C脱除Boc-，得到H-Val-Ara-C；

9)将C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH与HCl·H-Val-Ara-C缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C，和C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH，其中n＝7，9，11，13，15的混合物，通过高压液相制备色谱进行分离纯化，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分可得到纯的单一化合物。

9.权利要求7所述的制备方法，步骤如下：

1)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将Boc-Arg(NO₂)-OH与H-Gly-OBzl缩合，得到Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

2)将Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl在4NHCl-EtoAc溶液中脱除Boc-，得到H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

3)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将脂肪酸与H-Arg(NO₂)-Gly-OBzl缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

4)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OBzl在2NNaOH中脱除-OBzl，冰浴，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH；

5)以无水DMF和无水THF作溶剂，冰浴，在DCC、HOBt和NMM存在下将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-OH与H-Asp(OBzl)₂缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂；

6)将C_nH_2n+1CO-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)₂在乙醇溶液中，用Pd\C作催化剂，通入H₂，脱除-NO₂、-OBzl，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH；

7)以无水DMF作溶剂，在EDC、HOBt和NMM存在下将Boc-Val-OH与Ara-C缩合，得到Boc-Val-Ara-C；

8)将Boc-V-Ara-C在4NHCl-EtoAc溶液中脱除Boc-，得到H-Val-Ara-C；

9)以无水DMF作溶剂，在EDC、HOBt和NMM存在下将C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-OH与HCl·H-Val-Ara-C缩合，得到C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp-Val-Ara-C和C_nH_2n+1CO-Arg-Gly-Asp(Val-Ara-C)-OH，其中n＝7，9，11，13，15的混合物，通过高压液相制备色谱进行分离纯化，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外检测，不同保留时间接收上述两种组分得到纯的单一化合物。

10.一种权利要求4所述药物组合物的制备方法，包括：将所述各组分用氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入磷酸盐缓冲液，超声分散，即得。

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