CN102516361A - Nrp-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法。该载体系统的组成为：a.磷脂；b.胆固醇；c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；d.含RPARPAR序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；上述各成分之间的摩尔比为：a:b=5:1~1:5，a:c=1000:0.1~1000:100，a:d=1000:0.1~1000:100。该系统可通过通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和RPARPAR介导作用将其靶向至肿瘤部位。此脂质体递药系统可用作肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

Description

NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其介导的主动靶向脂质体递药系统及其制备方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病，近年来其发病率呈明显的上升趋势。目前临床上对肿瘤的常规治疗方法是切除肿瘤原发灶和进行淋巴清扫之后，进行全身化疗或放疗。但是，外科手术不能彻底清除肿瘤细胞和肿瘤转移淋巴结，从而导致肿瘤复发；化疗药物静注给药后，对肿瘤组织无选择性，具有严重的全身性毒副作用；放疗往往会引起患者严重的局部皮肤反应、血象变化、局部粘膜反应等。由于肿瘤组织对具有一定粒径的纳米颗粒（10-500nm）具有EPR（高通透性和滞留）效应，即处在血循环中的纳米颗粒可被动靶向至肿瘤组织，发挥所包载药物的抗肿瘤作用。目前，已有多种利用此效应用于肿瘤靶向治疗的纳米递药系统上市，如阿霉素脂质体、顺铂脂质体和紫杉醇白蛋白纳米粒。同时由于肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞上表达有一系列特异性受体，研究者们利用其配体修饰纳米递药系统，以实现对肿瘤组织的主动靶向递药。大量研究表明，与被动靶向相比，主动靶向纳米递药系统显示出对肿瘤组织更好的靶向性和生长抑制作用，但是，由于主动靶向制剂复杂的处方和制备工艺、质量控制较难、未知的生物安全性等问题，至今仍只有少量产品进入Ⅰ期或Ⅱ期临床。因此，目前急需对其进行系统的研究，尤其是安全性评价，研究成果必将加快推进肿瘤靶向纳米递药系统的临床应用进程。

Neuropilin-1（NRP-1）是细胞表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，通常表达在一些肿瘤细胞和血管内皮细胞表面，是血管内皮生长因子165（VEGF165）的受体，在肿瘤转移、血管新生、调节血管通透性等方面发挥重要功能。人神经胶质瘤临床病理标本中有NRP-1显著表达，且其表达量随神经胶质瘤恶性程度增加而增加，但在相应的正常组织上皮细胞中却没有表达。目前已有研究者利用NRP-1受体抑制剂来抑制肿瘤血管新生从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。目前尚未见利用NRP-1受体多肽介导纳米递药系统用于肿瘤靶向治疗的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。

本发明的目的之二在于提供该NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物介导的主动靶向脂质体递药系统，用于实现向肿瘤的靶向递药。

本发明的目的之三在于提供该主动靶向脂质体递药系统的制备方法。

一种NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该复合物由NRP-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中NRP-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1:1:1；所述的NRP-1配体多肽的氨基酸序列为：RPARPAR。

上述的聚乙二醇的重均分子量可以为400~8000。

上述的聚乙二醇重均分子量可以为2000~5000。

上述的磷脂可以为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

一种主动靶向脂质体递药系统，含有上述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该载体系统的组成为：

a.磷脂；

b.胆固醇；

c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；

d.NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；

上述各成分之间的摩尔比可以为：a:b=5:1~1:5，a:c=1000:0.1~1000:100，a:d=1000:0.1~1000:100。

上述的组分a所述的磷脂可以为：蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱 、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。

上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇重均分子量可以为400~8000。

上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇重均分子量可以为1000~4000。

根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂可以为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

一种制备上述的主动靶向脂质体载体系统的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，真空干燥；再溶于0.155M的硫酸铵溶液，在20-70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20-70℃水浴中依次挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为含有.NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的主动靶向脂质体载体系统。

上述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的制备方法的具体步骤为：

a.将取代度为0.6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸（对甲苯磺酰基）-对乙酰氨基苄酯）oc-Arg(Tos)-PAM树脂用 N，N-二甲基甲酰胺DMF溶胀，抽干；再用三氟乙酸TFA脱去Boc保护基，抽去TFA；

b.用苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的DMF溶液和N,N-二异丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；

c.将步骤a所得树脂用DMF洗涤后加入步骤b所得的Boc-Ala活化液，25℃振摇反应25分钟，抽去反应液，并用DMF洗涤树脂；

d.重复步骤a—c，按CRPARPAR序列顺次连接其余氨基酸；反应结束后洗涤树脂、TFA脱保护基，真空干燥；

e.将步骤d所得树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得CRPAKPAR纯品；

f.将步骤e得到的CRPARPAR溶于pH7.0的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的CRPARPAR和DMF，冷冻干燥，得到直链的RPARPAR-PEG-DSPE。

含RPARPAR序列的多肽与马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂反应合成多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，反应方程式如下：

合成之后通过HPLC和FTIR验证。

脂质体采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压过膜法制备。将一定比例的a、b、c、d溶于氯仿，采用旋转蒸发-薄膜水化法制备RPARPAR修饰的脂质体（RPARPAR-脂质体），用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，得到脂质体。激光散射法测定粒径分布。其平均粒径为30~1000nm。

RPARPAR多肽是通过噬菌体展示技术筛选得到的一个直链七肽，是NRP-1的配体，它对NRP-1高表达的肿瘤细胞和肿瘤血管表现出特异亲和性，且具有介导噬菌体穿透肿瘤血管进入肿瘤组织内部的能力。

本发明制备了一种含RPARPAR序列的多肽修饰的可用于靶向肿瘤的脂质体递药系统。该系统可通过通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和RPARPAR介导作用将其靶向至肿瘤部位。此脂质体递药系统可用作肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

本发明通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞分别对载羧基荧光素（FAM）的RPARPAR-脂质体和脂质体的摄取，结果证实RPARPAR在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞。

本发明通过近红外染料DiR标记脂质体，将包载DiR的RPARPAR-脂质体和普通脂质体经静脉注射于肿瘤动物模型体内，在活体成像仪下观测，证明RPARPAR-脂质体对肿瘤组织具有很好的靶向性。

研究结果提示，本发明的脂质体递药系统可用作肿瘤影像诊断示踪药物的靶向递送，也可用作抗肿瘤药物的靶向递送。

附图说明

图1为含RPARPAR序列多肽-聚乙二醇-磷脂复合物（RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE）的高效液相色谱（HPLC）图，其中A为马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物（Mal-PEG ₃₃₅₀ -DSPE）的HPLC图谱，B为RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE的HPLC图谱，由图可看出，连接含RPARPAR序列多肽后，主峰位置由25min移动至15min，表明Mal-PEG ₃₃₅₀ -DSPE已与含RPARPAR序列多肽发生反应。

图2为RPARPAR-PEG-DSPE的红外（FTIR）图谱，图中A为Mal-PEG ₃₃₅₀ -DSPE的红外图谱，B为RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE的核磁图谱，由图可看出，与A图相比，B图在N-H和C=O的特征峰部位（分别位于约3420和1666cm^-1）的吸收均有明显增强，显示RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE合成成功。

图3为RPARPAR-脂质体/FAM和脂质体/FAM粒径分布图，脂质体/FAM和RPARPAR-脂质体/FAM粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。

图4为RPARPAR-脂质体/DiR和脂质体/DiR粒径分布图，脂质体/DiR和RPARPAR-脂质体/DiR粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。

图5为RPARPAR-脂质体/FAM和脂质体/FAM被PC-3肿瘤细胞摄取照片，RPARPAR-脂质体/FAM（A）和脂质体/FAM（B）于37℃分别与肿瘤细胞作用4小时后的荧光显微照片，由图可知，肿瘤细胞对RPARPAR-脂质体/FAM的摄取量远大于脂质体/FAM。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE的合成、纯化和表征

a)         CRPARPAR的合成、纯化和表征

采用Boc固相多肽合成技术合成CRPARPAR多肽。称取精氨酸修饰的树脂0.4167g（取代度0.6mmol/g）于接肽瓶中，树脂用 DMF溶胀20min，抽干。加入约两倍树脂体积的TFA搅拌反应1min，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脱去Boc保护基。用HBTU（苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐）的DMF（N’N-二甲基甲酰胺）溶液和DIEA（N,N-二异丙基乙胺）活化Boc-Ala，加入树脂后振摇反应20min。反应结束后抽去反应液，并用DMF洗涤树脂。随后以上述方法按CRPARPAR序列依次连接其余氨基酸。按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/MeOH（1/1，v/v）洗涤树脂，真空干燥。将干燥后的树脂0.75g放入多肽切割管中，加入0.7g P-cresol，然后通入10ml HF，冰浴搅拌反应1h。反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液。滤液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗过滤，弃滤液，以水复溶沉淀，冻干得CRPARPAR纯品，质谱法表征其分子量。

₃₃₅₀ 的合成、纯化和表征

将上述步骤得到的CRPARPAR溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG ₃₃₅₀ -DSPE（马来酰亚胺-聚乙二醇（分子量3350）-1,2-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物）溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC（高效液相色谱法）监测反应，待Mal-PEG ₃₃₅₀ -DSPE反应完全后停止反应，过量的CRPARPAR和DMF通过透析（截留分子量3.5kDa）除去。冷冻干燥，得RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE，HPLC和FTIR表征其结构。HPLC图谱显示，主峰保留时间由A图的25 min左右移动至B图的15min左右；FTIR图谱显示，与A图相比，B图在N-H和C=O的特征峰部位（分别位于约3420和1666cm^-1）的吸收均有明显增强，显示RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DSPE合成成功。

实施例2：RPARPAR-PEG ₂₀₀₀ -DSPE（1,2-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）的合成、纯化和表征

将CRPARPAR多肽溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG ₂₀₀₀ -DSPE（马来酰亚胺-聚乙二醇（分子量2000）-1,2-硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物）溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC（高效液相色谱法）监测反应，待Mal-PEG ₂₀₀₀ -DSPE反应完全后停止反应，过量的CRPARPAR和DMF通过透析（截留分子量3.5kDa）除去。冷冻干燥，得RPARPAR-PEG ₂₀₀₀ -DSPE，HPLC和FTIR表征其结构。HPLC图谱显示，主峰保留时间由A图的24 min左右移动至B图的14min左右；FTIR图谱显示，与A图相比，B图在N-H和C=O的特征峰部位（分别位于约3420和1666cm^-1）的吸收均有明显增强，显示RPARPAR-PEG ₂₀₀₀ -DSPE合成成功。

实施例3：RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DOPE（1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺）的合成、纯化和表征

将CRPARPAR多肽溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG ₃₃₅₀ -DOPE（马来酰亚胺-聚乙二醇（分子量3350）-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺复合物）溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC（高效液相色谱法）监测反应，待Mal-PEG ₃₃₅₀ -DOPE反应完全后停止反应，过量的CRPARPAR和DMF通过透析（截留分子量3.5kDa）除去。冷冻干燥，得RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DOPE，HPLC和FTIR表征其结构。HPLC图谱显示，主峰保留时间由A图的24 min左右移动至B图的14min左右；FTIR图谱显示，与A图相比，B图在N-H和C=O的特征峰部位（分别位于约3420和1666cm^-1）的吸收均有明显增强，显示RPARPAR-PEG ₃₃₅₀ -DOPE合成成功。

实施例4：RPARPAR-脂质体/FAM的制备和表征

脂质体膜材料处方组成为 HSPC（氢化大豆磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（甲氧基聚乙二醇（分子量2000）-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物）(55: 45: 2, mol/mol)，RPARPAR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ RPARPAR-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入FAM水溶液水化，60℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机 （若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器） 依次将脂质体挤压过 400、200、100和 50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，RPARPAR修饰对其粒径无明显影响。

实施例5：RPARPAR-脂质体/FAM的制备和表征

脂质体膜材料处方组成为 EPC（蛋磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（甲氧基聚乙二醇（分子量2000）-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物）(55: 45: 2, mol/mol)，RPARPAR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 EPC/Chol/mPEG-DSPE/ RPARPAR-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入FAM水溶液水化，40℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在40℃水浴中，使用高压均质机 （若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器） 依次将脂质体挤压过 400、200、100和 50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为80nm左右，RPARPAR修饰对其粒径无明显影响。

实施例6：RPARPAR-脂质体/DiR的制备和表征

脂质体膜材料处方组成为 HSPC（氢化大豆磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物） (55: 45: 2, mol/mol)，RPARPAR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ RPARPAR-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，加入DiR甲醇溶液（1.5mg/ml）30μl，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入生理盐水水化，60℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机 （若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器） 依次将脂质体挤压过 400、200、100和 50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的DiR，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，RPARPAR修饰对其粒径无明显影响。

实施例7：RPARPAR-脂质体/DiR的制备和表征

脂质体膜材料处方组成为 DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物） (55: 45: 2, mol/mol)，RPARPAR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 DPPC/Chol/mPEG-DSPE/ RPARPAR-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，加入DiR甲醇溶液（1.5mg/ml）30μl，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入生理盐水水化，60℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机 （若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器） 依次将脂质体挤压过 400、200、100和 50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的DiR，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径，结果显示，平均粒径均为75nm左右，RPARPAR修饰对其粒径无明显影响。

实施例8：RPARPAR-脂质体体外肿瘤细胞靶向性验证

取对数生长期的单层培养PC-3肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶和0.025%乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于培养皿中，每孔体积 1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5%二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的脂质体/FAM和RPARPAR-脂质体/FAM溶液。将培养皿中的培养液吸出，加入脂质体/FAM和RPARPAR-脂质体/FAM的系列溶液，37℃孵育1h，吸弃上清液。用PBS溶液洗皿两次，在激光共聚焦显微境下观察细胞内化情况。结果显示脂质体/FAM几乎不被摄取，而RPARPAR-脂质体/FAM则被大量摄取，说明RPARPAR-脂质体/FAM对肿瘤细胞具有良好的体外靶向性。

实施例9：RPARPAR-脂质体体内静脉注射后对淋巴转移肿瘤靶向性的验证

将处于对数生长期的PC-3细胞胰酶消化，PBS洗涤，分散于PBS中，以1×10⁷细胞（100μl）浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。取成瘤裸鼠模型6只，随机分为两组，分别尾静脉注射脂质体/DiR和RPARPAR-脂质体/DiR，给药后不同时间点将裸鼠麻醉，在活体动物成像系统内扫描脂质体/DiR和RPARPAR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织的分布。结果显示与脂质体/DiR相比，RPARPAR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织内的分布显著增加，表明RPARPAR的修饰实现了脂质体对肿瘤的靶向递药。

Claims (11)

1.一种NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该复合物由NRP-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中NRP-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1:1:1；所述的NRP-1配体多肽的氨基酸序列为：RPARPAR。

2.根据权利要求1所述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的聚乙二醇的重均分子量为400~8000。

3.根据权利要求2所述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的聚乙二醇重均分子量为2000~5000。

4.根据权利要求1所述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的磷脂为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

5.一种主动靶向脂质体递药系统，含有根据权利要求1、2或3所述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该载体系统的组成为：

a.磷脂；

b.胆固醇；

c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；

d.NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；

上述各成分之间的摩尔比为：a:b=5:1~1:5，a:c=1000:0.1~1000:100，a:d=1000:0.1~1000:100。

6.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是组分a所述的磷脂为：蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱 、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。

7.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇重均分子量为400~8000。

8.根据权利要求7所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇重均分子量为1000~4000。

9.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

10.一种制备根据权利要求5～9种任一项所述的主动靶向脂质体载体系统的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，真空干燥；再溶于0.155M的硫酸铵溶液，在20-70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20-70℃水浴中依次挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为含有.NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的主动靶向脂质体载体系统。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的NRP-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的制备方法的具体步骤为：

将取代度为0.6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸（对甲苯磺酰基）-对乙酰氨基苄酯）oc-Arg(Tos)-PAM树脂用 N，N-二甲基甲酰胺DMF溶胀，抽干；再用三氟乙酸TFA脱去Boc保护基，抽去TFA；

用苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的DMF溶液和N,N-二异丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；

将步骤a所得树脂用DMF洗涤后加入步骤b所得的Boc-Ala活化液，25℃振摇反应25分钟，抽去反应液，并用DMF洗涤树脂；

重复步骤a—c，按CRPARPAR序列顺次连接其余氨基酸；反应结束后洗涤树脂、TFA脱保护基，真空干燥；

将步骤d所得树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得CRPAKPAR纯品；

f.将步骤e得到的CRPARPAR溶于pH7.0的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的CRPARPAR和DMF，冷冻干燥，得到直链的RPARPAR-PEG-DSPE。

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