CN102240265A

CN102240265A - 一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统

Info

Publication number: CN102240265A
Application number: CN2010101743446A
Authority: CN
Inventors: 陆伟跃; 闫志强; 顾炳; 孟庆刚; 占昌友; 谢操
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统，该载体系统由含LyP-1氨基酸序列为CGNKRTRGC序列的多肽与脂质体组成，其中LyP-1序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构。该脂质体载体系统可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过LyP-1的介导作用靶向至肿瘤转移淋巴结。该系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和LyP-1介导作用将其靶向至原位肿瘤和淋巴转移肿瘤。本发明脂质体载体系统可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤诊断或治疗的药物靶向递送。

Description

一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统，具体涉及一种用于向原位肿瘤和淋巴转移肿瘤靶向递药的脂质体载体系统及其制备方法和医药用途。

背景技术

随着人类生存环境的恶化，诱发癌症的因素越来越多，癌症的发病率呈明显的上升趋势。癌症已成为威胁人类健康和生命的主要疾病。淋巴转移是实体瘤转移的重要途径，也是肿瘤导致患者死亡的重要原因。淋巴转移一般发生在肿瘤早期或中期，如不及时控制，可能导致肿瘤细胞经淋巴回流至血流扩散，引发更广泛的肿瘤转移。据临床研究统计，60％恶性肿瘤患者初诊时即已发生淋巴转移。目前临床上对肿瘤的常规治疗方法是切除原发瘤和淋巴清扫之后，进行全身化疗或放疗。但是，外科手术不能彻底清除肿瘤转移的淋巴结，从而导致肿瘤复发；化疗药物静注后，药物到达肿瘤转移淋巴结的几率很小，目前尚无有效的手段加以控制和治疗。因此，对淋巴转移肿瘤进行靶向治疗具有重要的临床现实意义。

鉴于机体组织间隙生理学特点(含众多有亲水性孔道(约100nm)，毛细淋巴管壁孔隙(30-120nm)大于毛细血管壁孔隙(＜10nm))，通过组织间隙注射一定纳米尺度(如80nm左右)的载药系统，可以将其靶向至淋巴系统。目前用于靶向淋巴系统递药的纳米载体包括：活性炭、硅粒、高分子聚合物、脂质体、纳米粒、纳米乳和聚合物胶束等。在各种纳米载体中，脂质体以其天然结构特性、便于修饰、易于粒径控制和亲水亲脂性药物兼可包载等的优越性，被认为是最适合的淋巴系统靶向载体。但在脂质体具体实施淋巴系统靶向过程中普遍存在如下问题：①脂质体经组织间隙注射后，淋巴吸收不完全，部分滞留于注射部位组织间隙，滞留量约为总给药剂量的10-40％，反复注射含抗肿瘤药物脂质体，会导致局部组织损伤甚至坏死；②进入淋巴系统的脂质体因机械截留或巨噬细胞吞噬而在正常淋巴结中蓄积，易造成正常淋巴组织损伤；③脂质体在淋巴结中蓄积是一个被动过程，对正常淋巴结和肿瘤转移淋巴结没有选择性，甚至会因肿瘤转移所致淋巴结结构破坏而无法截留或吞噬脂质体时，被肿瘤转移淋巴结摄取脂质体量反而低于正常淋巴结，影响其靶向治疗效果。其中，前两个问题有研究已采用″压力补偿″和″饱和巨噬细胞″策略对其给予了较好的解决并获得中国发明专利(ZL200510024046.8)。但第三个问题-脂质体对肿瘤转移淋巴结的靶向递药问题仍未得到有效解决。

近期研究发现，肿瘤诱导的淋巴管新生现象是促进肿瘤发生淋巴转移的重要因素，并发现淋巴管内皮细胞上的两种蛋白VEGFR-3和VEGFR-2是淋巴管新生过程中所需受体，故有研究者利用VEGFR-3和VEGFR-2的抑制剂来抑制肿瘤组织和淋巴结内的淋巴管新生，从而达到抑制肿瘤淋巴转移的目的。结果表明，这种治疗方法对前期肿瘤治疗效果良好，能有效抑制肿瘤转移，但对已发生淋巴管增生或者发生转移的肿瘤则基本无效。

LyP-1是一种通过噬菌体展示技术筛选得到的环状九肽，其不仅对原位肿瘤具有靶向性，而且对淋巴转移肿瘤也具有靶向能力。LyP-1能靶向的肿瘤包括：黑色素瘤(MDA-MB-435)、乳腺癌(MMTV-PyMT)、前列腺癌(TRAMP)、皮肤癌(K14-HPV16)、骨肉瘤(KRIB)等；LyP-1对淋巴转移肿瘤的靶向性是基于其与肿瘤细胞和肿瘤内淋巴管内皮细胞的特异亲和性识别。现有研究者利用LyP-1修饰白蛋白纳米粒和叠氮纳米粒，还有研究者制备了能够表达LyP-1的病毒性载体，所有这些载药系统都表现出良好的主动靶向至原位肿瘤的效果。目前还未见将LyP-1用于修饰脂质体的报道，也未见将其用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统，具体涉及一种用于向原位肿瘤和淋巴转移肿瘤靶向递药的脂质体载体系统及其制备方法和医药用途。

本发明构建了一种由含LyP-1(氨基酸序列为CGNKRTRGC)序列的多肽与脂质体组成，其中LyP-1序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构。该脂质体载体系统可用于实现向原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的靶向递药。

本发明的脂质体载体系统，可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过LyP-1的介导作用靶向至肿瘤转移淋巴结。该系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和LyP-1介导作用将其靶向至原位肿瘤和淋巴转移肿瘤。此脂质体载体系统可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤诊断或治疗的药物靶向递送。

本发明中，含Lyp-1序列的多肽通过固相合成法合成，HPLC(高效液相色谱法)和MS(质谱法)表征其结构。对其进行荧光素FAM(羧基荧光素)标记考查其体外肿瘤细胞摄取和体内对原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的靶向性，结果证实LyP-1对体外肿瘤细胞和体内原位肿瘤和淋巴转移肿瘤具有特异靶向性。

本发明中，脂质体载体系统的膜材料包括以下成分：a：天然磷脂或合成磷脂，和b：胆固醇，和c：甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物(甲氧基聚乙二醇的分子量为1000～5000)，和d：含LyP-1序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物(聚乙二醇的分子量为1000～8000)。各成分之间的摩尔比为a∶b＝5∶1～1∶2，a∶c＝1000∶1～1000∶100，a∶d＝1000∶1～1000∶100。

所述的天然磷脂或合成磷脂可以是蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂。

所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物和含LyP-1序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

所述的含LyP-1序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，通过以下两种方式合成：

1、含LyP-1序列的多肽提供一个游离巯基，聚乙二醇-磷脂提供一个马来酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物，其反应式如下：

2、含LyP-1序列的多肽提供一个游离氨基，聚乙二醇-磷脂提供一个N-羟基琥珀酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物，其反应式如下：

合成之后通过NMR表征其结构。

所述的脂质体采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压法制备：将一定比例的a、b、c、d溶于氯仿，采用旋转蒸发-薄膜水化法制备LyP-1修饰的脂质体(LyP-1-PEG-脂质体)，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，得到脂质体。激光散射法测定粒径分布。其平均粒径为20～500nm。

本发明通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞分别对载FITC(异硫氰基荧光素)的LyP-1-PEG-脂质体和PEG-脂质体的摄取，结果证实LyP-1在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞。

本发明通过近红外染料DiR标记脂质体，将包载DiR的LyP-1-PEG-脂质体和PEG-脂质体经足垫皮下注射或肌肉注射或静脉注射于淋巴转移肿瘤动物模型体内，在活体成像仪下观测，证明LyP-1-PEG-脂质体对淋巴转移肿瘤和原位肿瘤具有很好的靶向性。

研究结果提示，本发明的脂质体载体系统可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤影像诊断的示踪药物的靶向递送，也可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤治疗的抗肿瘤药物靶向递送。可通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射给药。

附图说明

图1、LyP-1-PEG-DSPE的¹H-NMR图谱，

图中A为Mal-PEG-DSPE的核磁图谱，B为LyP-1-PEG-DSPE的核磁图谱，由图可看出，A图显示出马来酰亚胺峰，而B图中该峰消失，而其余峰基本保持不变，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已与LyP-1反应。

图2、淋巴转移肿瘤裸鼠动物模型照片和病理切片，

图中A为足垫原位肿瘤，B为腹股沟淋巴结，C中左侧为未接种肿瘤侧的腘淋巴结，右侧为接种肿瘤侧的腘淋巴结，D和E分别为3周和6周裸鼠淋巴结的病理切片，F-J分别为心、肝、脾、肺、肾的病理切片；由图可以看出，裸鼠原位肿瘤明显，肿瘤转移后淋巴结体积变大，病理切片显示，3周时淋巴结内有少量转移肿瘤细胞，6周时淋巴结内存在大量转移灶，而其余脏器则无肿瘤转移。

图3、LyP-1-FAM被MDA-MB-435肿瘤细胞摄取照片，

LyP-1-FAM和FAM于37℃分别与MDA-MB-435细胞作用4小时后的荧光显微照片，其中A，B分别为LyP-1-FAM组的明场与暗场照片；C，D分别为FAM组的明场与暗场照片，由图可知，MDA-MB-435细胞对FAM几乎无摄取，而对LyP-1-FAM则几乎所有细胞均有摄取。

图4、LyP-1-FAM被SPC-A-1肿瘤细胞摄取照片，

LyP-1-FAM和FAM于37℃分别与SPC-A-1细胞作用4小时后的荧光显微照片，其中A，B分别为LyP-1-FAM组的明场与暗场照片；C，D分别为FAM组的明场与暗场照片，由图可知，SPC-A-1细胞对FAM几乎无摄取，而对LyP-1-FAM则几乎所有细胞均有摄取。

图5、LyP-1-FAM在淋巴转移肿瘤裸鼠模型体内和淋巴结内的分布图，

淋巴转移肿瘤裸鼠模型尾静脉分别注射FAM和LyP-1-FAM 1h后FAM和LyP-1-FAM在裸鼠体内的活体分布图(A和B)和在腹股沟、腘和髂淋巴结内的离体分布图(C)，本实验中裸鼠为双后足垫接种肿瘤模型鼠。

图6、LyP-1-PEG-脂质体/FITC和PEG-脂质体/FITC粒径分布图，

PEG-脂质体/FITC(A)和LyP-1-PEG-脂质体/FITC(B)粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。

图7、LyP-1-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR粒径分布图，

PEG-脂质体/DiR(A)和LyP-1-PEG-脂质体/DiR(B)粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。

图8、LyP-1-PEG-脂质体/FITC和PEG-脂质体/FITC被MDA-MB-435肿瘤细胞摄取照片，

PEG-脂质体/FITC和LyP-1-PEG-脂质体/FITC于37℃分别与MDA-MB-435细胞作用1小时后的荧光显微照片，其中A，B分别为PEG-脂质体/FITC组的明场与暗场照片；C，D分别为LyP-1-PEG-脂质体/FITC组的明场与暗场照片，由图可知，MDA-MB-435细胞对LyP-1-PEG-脂质体/FITC的摄取量远大于PEG-脂质体/FITC。

图9、LyP-1-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR足垫皮下注射后不同时间在淋巴转移肿瘤裸鼠模型体内分布图，

各图中左侧为PEG-脂质体/DiR组，右侧为LyP-1-PEG-脂质体/DiR组，由图可知，从足垫皮下给药后1小时起，LyP-1-PEG-脂质体/DiR在裸鼠腘淋巴结的分布量开始大于PEG-脂质体/DiR，一直到24小时检测不到淋巴结的分布信号；由图还可看出，PEG-脂质体/DiR组在给药后8小时开始在肝脏的分布远大于LyP-1-PEG-脂质体/DiR组，这是因为LyP-1的介导作用使LyP-1-PEG-脂质体/DiR更多地蓄积于肿瘤转移淋巴结处，而PEG-脂质体/DiR则更多地经淋巴回流入血，被肝脏摄取；图中箭头标示为腘淋巴结；本实验中裸鼠为左后足垫接种肿瘤细胞的模型鼠。

图10、LyP-1-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR经静脉注射后在淋巴转移肿瘤裸鼠模型淋巴结内的分布图，

左图为LyP-1-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR静注4小时后在模型鼠各淋巴结中分布图，其中上图为白光图，中图为荧光图，下图为两者叠加图，各图中上排为PEG-脂质体/DiR组，下排为LyP-1-PEG-脂质体/DiR组，右图为脂质体在各肿瘤接种侧淋巴结中分布的半定量数据；由图可知，在各肿瘤接种侧淋巴结中，LyP-1-PEG-脂质体/DiR的分布要明显大于PEG-脂质体/DiR；本实验中裸鼠为左后足垫接种肿瘤细胞的模型鼠。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

LyP-1-FAM和LyP-1-PEG-DSPE的合成、纯化和表征

1.LyP-1-FAM的合成、纯化和表征

称取Boc-Cys(Mbzl)-PAM树脂0.4167g(取代度0.6mmol/g)于接肽瓶中，树脂用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶胀，二十分钟后，抽干。加入约两倍树脂体积的TFA(三氟乙酸)搅拌反应，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脱去Boc保护基。用HBTU(苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐)的DMF溶液和DIEA(N，N-二异丙基乙胺)活化Boc-Gly，树脂用DMF洗涤后加入Boc-Gly活化液，振摇反应。反应结束后抽去反应液，并用DMF洗涤树脂。随后以上述方法按LyP-1序列顺次连接其余氨基酸，最后连接FAM。反应结束后按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/MeOH(二氯甲烷/甲醇，1/1，v/v)洗涤树脂，真空干燥。

将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol(对甲苯酚)，然后通入HF(氟化氢)，冰浴搅拌反应1hr。反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液。滤液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗过滤，弃滤液，以水复溶沉淀，冻干得LyP-1-FAM纯品，以HPLC及MS对其进行表征。

2.LyP-1-PEG-DSPE的合成、纯化和表征

2.1LyP-1(2Acm)-Cys的合成、纯化和表征

称取MBHA树脂(4-甲苯氢胺树脂)0.3125g(取代度0.8mmol/g)于接肽瓶中，树脂用DMF溶胀，二十分钟后加入Boc-Cys(Acm)活化液(用HBTU的DMF溶液和DIEA活化)，振摇反应。反应结束后抽去反应液，并用DMF洗涤树脂。加入约两倍树脂体积的TFA搅拌反应，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脱去Boc保护基。随后以上述方法按LyP-1序列顺次连接其余氨基酸，最后连接Boc-Cys(Mbzl)。反应结束后按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/MeOH(1/1)洗涤树脂，真空干燥。

将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时。反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液。滤液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗过滤，弃滤液，以水复溶沉淀，冻干得LyP-1(2Acm)-Cys纯品，以HPLC及MS对其进行表征。

2.2LyP-1-PEG-DSPE的合成、纯化和表征

将上述步骤得到的LyP-1(2Acm)-Cys溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG-DSPE(马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物)溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，TLC(薄层层析法)监测反应，待Mal-PEG-DSPE反应完全后停止反应，过量的LyP-1(2Acm)-Cys和DMF通过透析(截留分子量3.5kDa)除去。冷冻干燥，得到直链的LyP-1(2Acm)-PEG-DSPE。最后，取直链LyP-1(2Acm)-PEG-DSPE溶于甲醇中，加入适量柠檬酸溶液和1M的盐酸溶液。逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应，反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类，冷冻干燥得到LyP-1-PEG-DSPE，NMR表征其结构。

实施例2

原位肿瘤和淋巴转移肿瘤动物模型的构建

裸鼠双后足垫或单后足垫皮下接种MDA-MB-435肿瘤细胞，接种浓度1×10⁶细胞/足垫。SPF级别饲养，接种3周和6周后取各级淋巴结和主要脏器进行病理学检查，确定肿瘤发生淋巴转移时间，为肿瘤分期提供参考。

实施例3

LyP-1的体内外靶向性验证

1.LyP-1体外肿瘤细胞靶向性验证

取对数生长期的单层培养MDA-MB-435细胞，用0.25％胰蛋白酶和0.025％乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1％胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的FAM和LyP-1-FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，加入FAM和LyP-1-FAM的系列溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗板两次，在荧光显微境下观察细胞摄取情况。

SPC-A-1细胞对LyP-1的摄取实验基本同MDA-MB-435细胞摄取实验，但SPC-A-1细胞培养用1640培养液。

2.LyP-1体内对原位肿瘤和淋巴转移肿瘤靶向性的验证

MDA-MB-435足垫接种建立淋巴转移肿瘤裸鼠模型。取模型裸鼠2只，尾静脉注射等摩尔量的FAM和LyP-1-FAM，1小时后用10％水合氯醛溶液麻醉裸鼠，在活体动物成像系统(FX Pro，Kodak，USA)内扫描FAM和LyP-1-FAM在裸鼠的体内分布，并取其腹股沟、腘和髂淋巴结置活体动物成像系统内进行扫描，观察期离体分布。

实施例4

LyP-1-PEG-脂质体的制备和表征

1.LyP-1-PEG-脂质体/FITC的制备和表征

PEG-脂质体膜材料处方组成为HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/mPEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(55∶45∶2，mol/mol)，LyP-1修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/LyP-1-PEG-DSPE(55∶45∶2∶0.5，mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24小时。加入FITC水溶液水化，60℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FITC，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径。

2.LyP-1-PEG-脂质体/DiR的制备和表征

制备空白脂质体工艺基本同上，但DiR应同磷脂一同溶于氯仿成膜，且水化介质改为生理盐水。脂质体用动态光散射法测定粒径。

实施例5

LyP-1-PEG-脂质体的体内外靶向性验证

1.LyP-1-PEG-脂质体体外肿瘤细胞靶向性验证

取对数生长期的单层培养MDA-MB-435细胞，用0.25％胰蛋白酶和0.025％乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1％胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的PEG-脂质体/FITC和LyP-1-PEG-脂质体/FITC溶液。将培养板中的培养液吸出，加入PEG-脂质体/FITC和LyP-1-PEG-脂质体/FITC的系列溶液，37℃孵育1h，吸弃上清液。用PBS溶液洗板两次，在荧光显微境下观察细胞内化情况。

2.LyP-1-PEG-脂质体体内对淋巴转移肿瘤靶向性的验证

2.1皮下注射

取淋巴转移肿瘤裸鼠模型2只，左后足垫组织间隙注射PEG-脂质体/DiR和LyP-1-PEG-脂质体/DiR，4小时后用10％水合氯醛溶液麻醉裸鼠，在活体动物成像系统内扫描PEG-脂质体/DiR和LyP-1-PEG-脂质体/DiR在裸鼠的体内分布。

2.2静脉注射

取淋巴转移肿瘤裸鼠模型2只，尾静脉注射PEG-脂质体/DiR和LyP-1-PEG-脂质体/DiR，1小时后将裸鼠处死，取出腘、腹股沟和髂淋巴结，在活体动物成像系统内扫描PEG-脂质体/DiR和LyP-1-PEG-脂质体/DiR在各级淋巴结内的分布。

Claims

1.一种用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统，其特征在于，由含LyP-1序列的多肽与脂质体组成，其中LyP-1序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构；所述的LyP-1氨基酸序列为CGNKRTRGC。

2.按权利要求1所述的用于肿瘤的靶向递药的脂质体载体系统，其特征在于，所述的脂质体其膜材料选自下述成分：a：天然磷脂或合成磷脂，和b：胆固醇，和c：甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物，和d：含LyP-1序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；

所述的脂质体膜材料成分的摩尔比为：a∶b＝5∶1～1∶2，a∶c＝1000∶1～1000∶100，a∶d＝1000∶1～1000∶100。

3.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征在于，所述的天然磷脂或合成磷脂选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。

4.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是，所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇分子量为1000～5000，所述的含LyP-1序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇分子量为1000～8000。

5.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物或含LyP-1序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

6.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是所述的含LyP-1序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中，LyP-1序列多肽通过共价键形式与聚乙二醇-磷脂连接而成复合物。

7.按权利要求6所述的脂质体载体系统，其特征是所述的含LyP-1序列的多肽提供一个游离巯基，聚乙二醇-磷脂提供一个马来酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物；或者含LyP-1序列的多肽提供一个游离氨基，聚乙二醇-磷脂提供一个N-羟基琥珀酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物。

8.按权利要求1所述脂质体载体系统，其特征是所述的脂质体粒径范围为20～500nm。

9.权利要求1所述的脂质体载体系统在制备用于原位肿瘤或淋巴转移肿瘤靶向诊断或治疗药物中的用途。

10.按权利要求9所述的用途，所述的药物通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射给药。