CN103990151A - 一种磁共振成像造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磁共振成像造影剂，由核酸适配体类似物和包载钆的脂质体构成，其中所述核酸适配体类似物通过化学键连接所述包载钆的脂质体上。所述核酸适配体类似物选自巯基修饰的、氨基修饰的或位点修饰的GBI-10、AS1411、A10、MUC1、sgc8、sgc3、sgd3、KH1C1、KDO5、S6、AGRO100、A30和STRG2中的一种或多种。本发明还提供所述磁共振成像造影剂的制备方法及其在制备靶向肿瘤的成像检测制剂或靶向肿瘤的治疗药物中的应用。本发明所述的核磁共振成像造影剂，结构稳定，以核酸适配体类似物为靶头，定向于多种肿瘤，可以早期发现肿瘤细胞，提高诊断和治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于医学影像学技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的磁共振成像造影剂。
背景技术
目前癌症是世界上死亡率位居第二的疾病，严重影响了人类的健康。肿瘤的早期检测和诊断对提高肿瘤治疗的效果显得尤为重要。
目前用于检测肿瘤的方法包括：磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、超声、单光子发射计算机化断层显影(SPECT)和光学成像等。其中，CT、PET和SPECT具有电离辐射，对病人会产生一定伤害，特别是进行多次检查时；超声检查虽然安全，但对检测人员的技术依赖性很高；光学成像则具有很大的局限性，只能穿透几厘米以内的组织。MRI没有电离辐射，可以保证病人经多次检测而不受辐射伤害。与上述其它检测手段相比，MRI在临床上用于肿瘤检测最具优势。但是常规MRI对信号探测的敏感性仍然较低，需要借助造影剂来加快组织中氢质子的弛豫速率，缩短组织的弛豫时间，从而改变组织的信号强度，提高检测组织与周围组织的对比度。
已批准用于临床的MRI造影剂包括：锰造影剂、钆造影剂和铁造影剂。其中，由于钆具有很高的电子自旋和较慢的电子弛豫速率，经长期使用证明其毒副作用较小，被认为是一种最佳的MRI造影剂。但是已经商品化的钆造影剂，如钆特醇钆特酸葡甲胺和钆喷酸葡甲胺等，都缺乏对肿瘤组织的靶向性。因此，无法适用于早期肿瘤的检测。
提高钆造影剂的靶向性，主要通过赋予钆造影剂被动靶向或主动靶向的性质。被动靶向主要是通过EPR(enhanced permeability and retentioneffect)效应，即由于肿瘤新生血管较正常血管的通透性大且肿瘤组织缺乏将大分子排出的完善的淋巴系统，使得大分子或载体较多地分布并滞留到肿瘤组织。主动靶向则是通过一些能与体内肿瘤靶点特异性结合的抗体、多肽或核酸适配体等物质介导钆造影剂特异性地靶向到被检测组织。
现有技术中已出现将抗体连接到包载钆的脂质体作为造影剂的报道。如中国发明专利申请(公开号CN102350002A，公开日2012年2月15日)公开了一种靶向胶质瘤的包括生物素化单克隆抗体及链霉亲和素结合包载钆的空间稳定免疫脂质体两种复合物的磁共振对比剂；所述单克隆抗体为CD105的单克隆抗体。检测时，先给予生物素化单克隆抗体，再给予链霉亲和素结合包载钆的空间稳定免疫脂质体。该对比剂必须分两步注射，操作较繁琐。中国发明专利申请(公开号CN102397564A，公开日2012年4月4日)公开了利用可特异性结合肿瘤细胞表面Tf受体的多肽T7肽修饰的高分子材料，连接造影剂制成肿瘤靶向核磁共振造影剂。公开号CN101120921A(公开日2008年2月13日)的中国发明专利申请，公开了一种由包裹铁造影剂的脂质体及核酸制成的靶向制剂，其中脂质体与核酸通过静电作用形成复合物，造影剂和质粒DNA均包裹在该靶向制剂中。在该靶向制剂中，其靶向性来自铁造影剂的磁性以及脂质体的被动靶向性，核酸对制剂的靶向性没有贡献。
在上述靶向性物质中，抗体因其生物来源的问题，有免疫原性；多肽在体内易被酶解，因而其体内稳定性较差，半衰期较短。核酸适配体主要是通过指数富集的配体进化技术SELEX(systematic evolution of ligands byexponential enrichmen)筛选得到的短单链的寡核苷酸片段，能够形成复杂的三维结构，对各种类型的靶标分子(例如小分子、多肽，蛋白质、病毒颗粒、甚至整个细胞等)都具有较高的亲和力和选择性。与抗体相比，适配体能够直接从体外基因文库中选择得到，不依赖于生物体，因此无免疫原性或低免疫原性。适配体化学性质稳定，保存时间长，并且能够在室温条件下进行运输。适配体还易于通过位点修饰合成各种类似物以提高其稳定性和靶向性。因此，核酸适配体在分子成像的应用方面极具前景。
公开号CN102526770A(公开日2012年7月4日)的中国发明专利申请，公开了基于适配体靶向的超顺磁氧化铁纳米复合物核磁共振影像造影剂。其中所形成的纳米复合物不稳定，在体内被体液稀释后容易解体，从而影响造影剂的靶向性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种新型的特异性靶向于肿瘤的磁共振成像造影剂，使肿瘤能在早期被及时诊断。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种磁共振成像造影剂，由核酸适配体类似物和包载钆的脂质体构成，其中所述核酸适配体类似物通过化学键连接到所述包载钆的脂质体上；优选的，所述化学键选自酰胺键、硫醚键、磷酸键、偶氮键、二硫键和磺酰键中的一种或几种。
所述核酸适配体类似物选自巯基修饰的、氨基修饰的或位点修饰的GBI-10、AS1411、A10、MUC1、sgc8、sgc3、sgd3、KH1C1、KDO5、S6、AGRO100、A30和STRG2中的一种或多种。
所述核酸适配体类似物还可以经放射性物质或荧光物质I标记。
所述放射性物质选自32P、3H、35S和14C中的一种或多种。
所述荧光物质I选自异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和花菁类(Cy3、Cy5)中的一种或几种。
所述包载钆的脂质体包括不含钆的脂质成分和基于钆螯合物的脂质成分，所述不含钆的脂质成分和基于钆螯合物的脂质成分的摩尔比为1:0.1～1:0.5；优选为1:0.2～1:0.4。
所述不含钆的脂质成分包括磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分。其中：
所述磷脂选自二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、大豆卵磷脂(SPC)、氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和卵磷脂(EPC)及其各自的衍生物中的一种或多种。
所述磷脂稳定剂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DMPE-PEG)和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)中的一种或多种。
所述胆固醇类成分选自胆固醇及其衍生物、胆甾烷、胆酸和胆汁酸中的一种或多种。
优选的，所述不含钆的脂质成分还可以包括功能化磷脂；所述功能化磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物(DSPE-PEG-Mal)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交联物(DSPE-PEG-COOH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺(DSPE-PEG-NHS)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交联物(DSPE-PEG-NH2)中的一种或多种。
所述基于钆螯合物的脂质成分选自钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、钆-二乙烯三胺五乙酸-胆固醇(Gd-DTPA-Chol)、钆-二乙烯三胺五乙酸-硬脂胺(Gd-DTPA-SA)、钆-二乙烯三胺五乙酸-磷脂酰乙醇胺(Gd-DTPA-PE)和钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-DSPE)中的一种或多种。
所述包载钆的脂质体都还可以包括抗肿瘤药物和/或荧光物质II，抗肿瘤药物和/或荧光物质II可被包裹在脂质体内核或分散脂质体双分子层中。
所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、博来霉素、顺铂、卡铂、伊立替康、紫杉醇、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、平阳霉素、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、瓦他拉尼(Vatalanib)或其各自的盐中的一种或多种。
所述荧光性物质II选自7-甲氧基香豆素、氨基香豆素、荧光黄、磺酰罗丹明101、溴化乙锭和噻唑橙中的一种或多种。
本发明的另一个目的，在于提供上述磁共振成像造影剂的制备方法；所述制备方法包括以下几种方法中的一种：
I.基于钆螯合物的脂质成分和磷脂、磷脂稳定剂、功能化磷脂和胆固醇类成分先通过常规方法制备所述包载钆的脂质体，再将所述核酸适配体类似物连接到所述包载钆的脂质体上，得到所述磁共振成像造影剂；或
II.先将所述核酸适配体类似物连接到所述功能化磷脂或连接到所述胆固醇及其衍生物，再与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分通过常规方法制备成脂质体，得到所述磁共振成像造影剂。
优选的方法I的技术方案是：按照摩尔比功能化磷脂:核酸适配体类似物＝1:5～1:150，将所述包载钆的脂质体与所述核酸适配体类似物混合，加入缩合剂，室温下反应15min～2h。
进一步优选的，功能化磷脂和核酸适配体类似物的摩尔比为功能化磷脂:核酸适配体＝1:30～1:50。
进一步优选的，反应时间为30～60min。
还优选的，功能化磷脂和缩合剂的摩尔比为功能化磷脂:缩合剂＝1:5～1:150。
进一步优选的，功能化磷脂和缩合剂的摩尔比为功能化磷脂:缩合剂＝1:30～1:50。
上述缩合剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)/1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)中的一种。优选的，缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
另一种优选的方法I的技术方案是：将包载钆的脂质体与交联剂混合，孵育30min～4h，优选1～3h，得到连有交联剂的包载钆的脂质体，然后与所述核酸适配体类似物混合，孵育3～24h，优选8～20h；其中交联剂与核酸适配体类似物所含巯基或氨基的摩尔比为1:1。
优选的，所述交联剂选自N-(β-马来酰亚胺丙基氧)-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、琥珀酰亚胺基-3-(溴代乙酰基氨基)丙酯(SBAP)、4-琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)、4-硫代琥珀酰亚胺基-(P-马来酰亚胺苯基)丁酯(Sulfo-SMPB)和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)中的一种。
方法II中，可以通过如下方法将所述核酸适配体类似物连接到所述功能化磷脂：
在核酸适配体的末端进行氨基修饰，然后再通过酰胺键引入功能化磷脂；或在核酸适配体的末端进行巯基修饰，然后再通过硫醚键引入功能化磷脂；所述功能化磷脂和核酸适配体类似物的摩尔比为1:5～1:150，优选的，摩尔比为1:40。
方法II中，可以通过如下方法将所述核酸适配体类似物连接到所述胆固醇及其衍生物：
先将所述胆固醇及其衍生物的羟基进行亚磷酰化，然后通过磷酸键引入所述核酸适配体类似物；所述胆固醇及其衍生物和核酸适配体类似物的摩尔比为1:1。
方法II中，连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂类成分或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物，与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分通过如下方法制备得到所述磁共振成像造影剂：
1)通过常规方法将连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂与胆固醇类成分制备成脂质体，得到所述磁共振成像造影剂；或
2)通过常规方法将基于钆螯合物的脂质成分和磷脂、磷脂稳定剂与胆固醇类成分先制备所述包载钆的脂质体；将所述连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物与所述包载钆的脂质体进行孵育12小时以上，制备得到所述磁共振成像造影剂。
采用方法I和方法II都还可以包载抗肿瘤药物和/或荧光物质II：包载脂溶性抗肿瘤药物和/或脂溶性荧光物质II时，可将其加在磷脂或胆固醇类等成分中同法制备；包载水溶性抗肿瘤药物和/或水溶性荧光物质II时，可将其加在缓冲液中同法制备；某些特殊药物可按特殊方法包载，如阿霉素可采用硫酸铵梯度法包载。
上述制备方法还包括对所述磁共振成像造影剂进行纯化，可以采用透析法、离心法和葡聚糖凝胶柱层析法等。优选的，纯化方法选自透析法和/或葡聚糖凝胶柱层析法。
上述的制备脂质体的常规方法，包括薄膜分散法、注入法、超声波分散法或逆相蒸发法等。磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇的摩尔比，在本领域通常允许的范围内。
本发明还有一个目的在于提供上述磁共振成像造影剂在制备靶向肿瘤的成像检测制剂或靶向肿瘤的治疗药物中的应用。
优选的，所述肿瘤选自多形性涎腺瘤、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺滤泡状肿瘤、人乳腺导管原位肿瘤、脑胶质瘤、急性髓细胞性白血病、转移性肾肿瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、宫颈癌、食管鳞状细胞癌、消化系统上皮源性肿瘤等中的一种或多种。
本发明采用不同的核酸适配体做包载钆的脂质体的靶头，可以将所述脂质体靶向到体内相应的多种肿瘤靶点，如GBI-10靶向到与肿瘤组织新生血管相关的腱糖蛋白-C，AS1411靶向到前列腺癌过度表达的前列腺特异膜抗原核仁素，STRG2靶向到消化系统上皮源性肿瘤中广泛表达的MUC1黏蛋白，sgc8靶向到食管鳞状细胞癌和急性髓细胞性白血病细胞表面的蛋白酪氨酸激酶PTK7等。本发明所述磁共振成像造影剂可以用于肿瘤的分子成像，特别适用于早期肿瘤的诊断。
本发明所述的核酸适配体类似物可以直接通过但不限于下述方式与脂质体直接连接：通过其所修饰的巯基与功能化磷脂分子中的聚乙二醇链上所连的马来酰亚胺发生化学反应，或者通过其所修饰的氨基与功能化磷脂分子中的聚乙二醇链上所连的羧基发生化学反应，或者通过其所修饰的氨基与功能化磷脂分子中的聚乙二醇链上所连的N-羟基琥珀酰亚胺发生化学反应，或者通过其所含的羟基与胆固醇上亚磷酸化的羟基发生化学反应等，从而使核酸适配体通过化学键与包载钆的脂质体形成稳定的连接。
本发明所述的核酸适配体类似物还可以通过交联剂与包载钆的脂质体形成稳定连接。
本发明所述磷脂稳定剂也称为mPEG化磷脂或mPEG磷脂，其加入可使由磷脂和胆固醇构成的普通脂质体成为空间稳定脂质体、隐形脂质体或长循环脂质体。
本发明所述功能化磷脂也称为功能化PEG磷脂，其PEG一端与磷脂连接，另一端被马来酰亚胺基、羧基等修饰，除了使脂质体具有空间稳定、隐形或长循环的特点外，功能化PEG磷脂所修饰的马来酰亚胺基、羧基等可与核酸适配体靶头连接使脂质体具有主动靶向性。
试验例1的结果表明，与未连接GBI-10的包载钆的脂质体比较，实施例2制备的GBI-10连接的包载钆的脂质体能够更多地与大鼠脑神经胶质瘤细胞C6结合。因此，本发明所述的磁共振成像造影剂能够很好地靶向到肿瘤细胞表面，有望为临床或基础研究提供一种有效的非侵入性的检测肿瘤的手段。
试验例2的结果表明，与未连接GBI-10的包载钆的脂质体和市售Gd-DTPA比较，实施例1制备的GBI-10连接的包载钆的脂质体能够更多地与大鼠脑神经胶质瘤细胞C6结合，并且在MRI下成像效果更好。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为试验例1的激光共聚焦图，其中1A显示的是未连接GBI-10的包载钆的脂质体造影剂与肿瘤细胞作用的结果，1B显示的是实施例2制备的连接有GBI-10的包载钆的脂质体造影剂与肿瘤细胞作用的结果。
图2为试验例2的MRI成像效果图，其中1为实施例1的造影剂与肿瘤细胞作用后，2为对比例1的造影剂与肿瘤细胞作用后，3为市售普通造影剂Gd-DTPA与肿瘤细胞作用后，4为空白肿瘤细胞，5为去离子水，6为PBS缓冲溶液。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1 一种连接核酸适配体GBI-10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端氨基修饰的核酸适配体GBI-10和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物(DSPE-PEG2000-COOH)组成。经修饰的GBI-10的5’末端氨基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物的聚乙二醇链的羧基通过酰胺键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075，精密称取DSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000,DSPE-PEG2000-COOH共30μmol,将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入5ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体溶液。
2.将制备好的包载钆的脂质体溶液与5’氨基修饰的核酸适配体GBI-10溶液以DSPE-PEG2000-COOH:GBI-10摩尔比为1:40混合。然后将溶有相当于DSPE-PEG2000-COOH摩尔数的40倍的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)、40倍的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的步骤1所述缓冲溶液加入至上述脂质体与适配体的混合溶液中，并将混合后的反应液置于恒温震荡摇床中反应2h后用透析法纯化，最终得到目标产物。
实施例2 一种荧光标记的连接核酸适配体GBI-10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端氨基修饰的核酸适配体GBI-10和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物(DSPE-PEG2000-COOH)和荧光物质香豆素-6组成。经修饰的GBI-10的5’末端氨基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物的聚乙二醇链的羧基通过酰胺键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075:0.003，精密称取DSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000，DSPE-PEG2000-COOH,香豆素-6共30μmol，将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，避光旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入5ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，经过透析法纯化，得到含有荧光素的包载钆的脂质体溶液。
2.将制备好的含有荧光素的包载钆的脂质体溶液与5’末端氨基修饰的核酸适配体GBI-10溶液以DSPE-PEG2000-COOH:GBI-10摩尔比为1:40混合。然后将溶有相当于DSPE-PEG2000-COOH摩尔数的40倍的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)、40倍的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的上述缓冲溶液加入至上述脂质体与适配体的混合溶液中，并将混合后的反应液置于恒温震荡摇床中反应2h后用透析法纯化，最终得到目标产物。
采用激光散射粒度仪分别测定制备步骤1(连接GBI-10前)和制备步骤2(连接GBI-10后)得到的脂质体的粒径和Zeta电位。结果显示，连接GBI-10前脂质体的粒径和Zeta电位分别为：115.1±1.5nm和-3.85±0.41mV，连接GBI-10后脂质体的粒径和Zeta电位分别为：122.7±2.5nm和-10.07±0.75mV。结果表明：步骤2得到的脂质体较未连接GBI-10的脂质体粒径略有增加，电位略有降低(GBI-10本身带负电)，说明GBI-10连接到脂质体上。
实施例3 一种连接核酸适配体GBI-10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端修饰了12个胸苷酸的核酸适配体GBI-10和包载钆的脂质体构成。GBI-10序列为：5’-CCC AGA GGG AAG ACTTTA GGT TCG GTT CAC GTC C-3’。所述包载钆的脂质体由氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)组成。修饰的GBI-10的羟基与包载钆的脂质体中的亚磷酰化的胆固醇的羟基通过磷酸键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.将修饰的GBI-10连接到胆固醇上，包括如下3个步骤：
(1)胆固醇3位羟基的亚磷酰化：按照摩尔比1:3.5:3.5精确称取胆固醇、亚磷酰化试剂(2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺)和1H-四氮唑；对胆固醇和1H-四氮唑预先干燥，混合，在氩气保护下加入无水二氯甲烷，冰浴滴加亚磷酰化试剂，室温反应2小时后，加二氯甲烷稀释反应液，再以5％的NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残渣用硅胶柱分离，在氩气保护下，以石油醚-乙酸乙酯(9:1)洗脱得到淡黄色糖浆状产物。
(2)修饰的GBI-10的合成：利用DNA自动合成仪合成所述GBI-10，并在其序列的5’末端多加12个胸苷酸作为与胆固醇连接的linker。
(3)利用DNA合成仪的亚磷酰胺化法一步于修饰的GBI-10的5’末端引入胆固醇分子，合成完毕后，首先用氨水(28％)/甲胺水(40％)比例为1:1的混合溶液将单链DNA从核酸合成树脂上水解切割下来，并于60℃振摇90min后脱除碱基保护基；离心减压干燥除掉相关溶液后，直接经反相柱HPLC纯化，离心减压干燥，分装，于-80℃保存。其序列为：5’-Chol-TTT TTTTTT TTT CCC AGA GGG AAG ACT TTA GGT TCG GTT CAC GTC C-3’，简称Chol-GBI-10。
2.包载钆的脂质体的制备：按摩尔比2:1:0.8:0.16，精密称取HSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000共39.6μmol，将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入4ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体溶液。
3.调整所述包载钆的脂质体溶液浓度≤8mg/ml，然后将该溶液加入到含12nmol的Chol-GBI-10的步骤2所述的缓冲溶液中，孵育24h，用透析法纯化，离心法浓缩，得到目标产物。
实施例4 一种连接核酸适配体GBI-10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端修饰了12个胸苷酸的核酸适配体GBI-10和包载钆的脂质体构成。GBI-10序列为：5’-CCC AGA GGG AAG ACTTTA GGT TCG GTT CAC GTC C-3’。所述包载钆的脂质体由氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)组成。修饰的GBI-10的羟基与包载钆的脂质体中的亚磷酰化的胆固醇的羟基通过磷酸键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.通过与实施例3相同的步骤将GBI-10连接到胆固醇上，得到Chol-GBI-10。
2.按摩尔比2:1:0.8:0.16，精密称取HSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000共79.2μmol，将其溶于20ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，在N2保护下旋转蒸发吹干后，真空干燥至少6h。将含有6nmol Chol-GBI-10的10mL含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6缓冲溶液加入到干燥的脂质中，水化20～30min，然后在37℃下孵育6h。用透析法纯化，最终得到目标产品。
实施例5 一种连接核酸适配体GBI-10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端巯基修饰的核酸适配体GBI-10和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物(DSPE-PEG2000-Mal)组成。经修饰的GBI-10的5’末端巯基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物的聚乙二醇链的马来酰亚胺通过硫醚键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075，精密称取HSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000，DSPE-PEG2000-Mal共60μmol，将其溶于15ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入8ml含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6缓冲溶液水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体的溶液。
2.向5’末端修饰巯基的适配体GBI-10溶液中加入100mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP，催化剂)，4℃下静置30min；将制备好的包载钆的脂质体溶液与所述适配体GBI-10溶液以DSPE-PEG2000-Mal:GBI-10摩尔比为1:5混合。4℃下孵化过夜后加入2mM反应β-巯基乙醇(BME，终止剂)。用SephadexG-50除去游离的适配体，得到目标产品。
实施例6 一种连接核酸适配体AS1411的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端氨基修饰的核酸适配体AS1411和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由卵磷脂(EPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-胆固醇(Gd-DTPA-Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物(DSPE-PEG2000-COOH)组成。经修饰的AS1411的5’末端氨基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物的聚乙二醇链的羧基通过酰胺键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.85:0.25:0.75:0.075:0.075，精密称取EPC，胆固醇，Gd-DTPA-Chol，DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-COOH共30μmol，将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入5ml含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体溶液。
2.将制备好的包载钆的脂质体溶液与5’氨基修饰的适配体AS1411溶液以DSPE-PEG2000-COOH:AS1411摩尔比为1:5混合。然后将溶有相当于DSPE-PEG2000-COOH摩尔数的40倍的EDC、40倍的NHS的步骤1所述缓冲溶液加入至脂质体与适配体的混合溶液中，并将混合后的反应液置于恒温震荡摇床中反应2h后用透析法纯化，最终得到目标产物。
实施例7 一种连接核酸适配体AS1411的含有紫杉醇的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端修饰了12个胸苷酸的核酸适配体AS1411和含有紫杉醇的包载钆的脂质体构成。AS1411序列为：5’-GGT GGTGGT GGT TGT GGT GGT GGT-3’。所述含有紫杉醇的包载钆的脂质体由卵磷脂(EPC)、胆固醇、钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和紫杉醇(PTX)组成。修饰的AS1411与含有紫杉醇的包载钆的脂质体中的亚磷酰化的胆固醇的羟基通过磷酸键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.通过与实施例3相同的步骤将AS1411连接到胆固醇上，其序列为：5’-Chol-TTT TTT TTT TTT GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT-3’，简称Chol-AS1411。
2.含有紫杉醇的包载钆的脂质体的制备：按摩尔比56:21:10:2:1，精密称取EPC，胆固醇，Gd-DOTA-DSPE，DSPE-mPEG2000，PTX，共100μmol，将其溶于10ml乙醇溶液中，37℃下旋转蒸发除去溶剂，并继续放于真空干燥箱真空干燥过夜。再加入15ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体溶液。
3.调整所述含有紫杉醇的包载钆的脂质体溶液浓度≤8mg/ml，然后将该溶液加入到含12nmol的Chol-AS1411的步骤2所述的缓冲溶液中，孵育24h，用透析法纯化，离心法浓缩，得到目标产物。
实施例8 一种连接核酸适配体AS1411的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端巯基修饰的核酸适配体AS1411和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物(DSPE-PEG2000-Mal)组成。经修饰的AS1411的5’末端巯基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物的聚乙二醇链的马来酰亚胺通过硫醚键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075，精密称DSPC，胆固醇，Gd-DOTA-DSPE，DSPE-mPEG2000及DSPE-PEG-Mal共50μmol，将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，加入5ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体的溶液。
2.向5’末端修饰巯基的适配体AS1411溶液中加入100mM催化剂TCEP，4℃下静置30min；将制备好的包载钆的脂质体溶液与所述适配体AS1411溶液以DSPE-PEG2000-Mal:AS1411摩尔比为1:5混合。4℃下孵化过夜后加入2mM反应终止剂BME。用Sephadex G-50除去游离的适配体，得到目标产品。
实施例9 一种连接核酸适配体sgc8的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由3’末端巯基修饰的核酸适配体sgc8和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由卵磷脂(EPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-磷脂酰乙醇胺(Gd-DTPA-PE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺交连物(DSPE-PEG2000-Mal)组成。经修饰的sgc8的3’末端巯基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物的聚乙二醇链的马来酰亚胺通过硫醚键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比60:45:30:2.5:2.5，精密称取EPC，胆固醇，Gd-DTPA-PE，DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-Mal共140μmol，将其溶于适量甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空4h，加入10ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mMCaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体的溶液。
2.向3’末端修饰巯基的适配体sgc8溶液中加入100mM催化剂TCEP，4℃下静置30min；将制备好的包载钆的脂质体溶液与所述适配体溶液以DSPE-PEG2000-Mal:sgc8摩尔比为1:5混合。4℃下孵化过夜后加入2mM反应终止剂BME。用Sephadex G-50除去游离的适配体，得到目标产品。
实施例10 一种连接核酸适配体A10的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端修饰了12个胸苷酸的核酸适配体A10和包载钆的脂质体构成。A10序列为：5’-GGG AGG ACG AUG CGG AUCAGC CAU GUU UAC GUC ACC CU-3’。所述包载钆的脂质体由氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Gd-DOPA-DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)组成。修饰的A10与包载钆的脂质体中的亚磷酰化的胆固醇的羟基通过磷酸键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.通过与实施例3相同的步骤将A10连接到胆固醇上，得到Chol-A10。
2.按摩尔比1.1:0.75:1:0.15:0.001，精密称取HSPC，胆固醇，Gd-DOPA-DSPE，DSPE-mPEG2000和Chol-A10共30μmol，将其溶于10ml乙醇溶液中，在N2保护下，旋转蒸发吹干后，真空干燥12h。将4ml含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2的pH7.6缓冲溶液加入到干燥的脂质中，水化30min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜40次，得到目标产品。
实施例11 一种连接核酸适配体KDO5的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端氨基修饰的核酸适配体KDO5和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物(DSPE-PEG2000-COOH)组成。KDO5的氨基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物的聚乙二醇链的羧基通过酰胺键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.85:0.25:0.75:0.075:0.075，精密称取DSPC，胆固醇，Gd-DTPA-Chol，DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-COOH共50μmol,将其溶于15ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入5ml含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体溶液。
2.将制备好的包载钆的脂质体溶液与5’末端氨基修饰的核酸适配体KDO5溶液以DSPE-PEG2000-COOH:KDO5摩尔比为1:5混合。然后将溶有相当于DSPE-PEG-COOH摩尔数的40倍的EDC、40倍的NHS的步骤1所述缓冲溶液加入至脂质体与适配体的混合溶液中，并将混合后的反应液置于恒温震荡摇床中反应2h后用透析法纯化，最终得到目标产物。
实施例12 一种连接核酸适配体KH1C1的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由5’末端巯基修饰的核酸适配体KH1C1和包载钆的脂质体构成。所述包载钆的脂质体由氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交联物(DSPE-PEG2000-NH2)组成。经修饰的KH1C1的5’末端巯基与包载钆的脂质体中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交联物的聚乙二醇链的氨基通过交联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075，精密称HSPC，胆固醇，Gd-DOTA-DSPE，DSPE-mPEG2000及DSPE-PEG-NH2共50μmol,将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，加入5ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，得到包载钆的脂质体的溶液。
2.将包载钆的脂质体溶液加入到含有34mM SPDP的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，室温孵育2h，用Sephadex G25F纯化，得到连有SPDP的包载钆的脂质体溶液。
3.连有SPDP的包载钆的脂质体溶液与KH1C1溶液按照SPDP与核酸适配体类似物上所含巯基摩尔比为1:1混合，室温下孵育18h，经透析法分离纯化，得到目标产品。
实施例13 一种连接核酸适配体MUC1的磁共振成像造影剂
所述磁共振成像造影剂由3’末端修饰了12个胸苷酸的核酸适配体MUC1和包载钆的脂质体构成。MUC1序列为：5’-GCA GTT GAT CCT TTGGAT ACC CTG G-3’。所述包载钆的脂质体由卵磷脂(EPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-胆固醇(Gd-DTPA-Chol)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)组成。修饰的MUC1与包载钆的脂质体中的亚磷酰化的胆固醇的羟基通过磷酸键连接。
本实施例所述磁共振成像造影剂可以通过如下方法制备：
1.通过与实施例3相同的步骤将修饰的MUC1连接到胆固醇上，得到Chol-MUC1。
2.按摩尔比1.85:0.25:0.75:0.15:0.001，精密称取EPC，胆固醇，Gd-DTPA-Chol，DSPE-mPEG2000和Chol-MUC1共120μmol，将其溶于60ml乙醇溶液中，在N2保护下旋转蒸发吹干后，真空干燥12h。将15ml含25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2的pH7.6缓冲溶液加入到干燥的脂质中，水化30min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜40次，得到目标产品。
对比例1 一种包载钆的脂质体造影剂
所述包载钆的脂质体由二硬脂磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺(Gd-DTPA-BSA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交联物(DSPE-PEG2000-COOH)和荧光物质香豆素-6组成。通过如下方法制备：
按摩尔比1.1:1:0.75:0.075:0.075:0.003，精密称取DSPC，胆固醇，Gd-DTPA-BSA，DSPE-mPEG2000,DSPE-PEG2000-COOH,香豆素-6共30μmol,将其溶于10ml甲醇与氯仿的混合液(1:1，v/v)，避光旋转蒸发除去溶剂，并继续抽真空2h，再加入5ml含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2的pH7.6的缓冲溶液进行水化，探头超声5min，用脂质体挤出仪将脂质体全部挤出过膜20次，经过透析法纯化，得到目标产品。
试验例1 本发明所述磁共振成像造影剂对肿瘤细胞的靶向结合作用
试验目的：证明本发明所述的磁共振成像造影剂具有靶向肿瘤的效果。
试验对象：
1.实施例2制备得到的磁共振成像造影剂；
2.对比例1制备的未经适配体GBI-10修饰的磁共振成像造影剂
试验方法：
向长满50％大鼠脑神经胶质瘤细胞C6细胞的玻底培养皿中分别加入100μl用无血清Ham’s F10稀释的两种脂质体造影剂，培养一段时间后，用4％多聚甲醛室温下固定，加入Hoechst33342进行细胞核染色。用预冷的PBS漂洗3次，加入500μl冷PBS溶液，用激光共聚焦显微镜以465nm波长的激光束激发香豆素-6进行图像分析。
试验结果：结果见图1，其中1A的照片显示的是对比例1的造影剂与肿瘤细胞作用的结果，1B的照片显示的是实施例2的造影剂与肿瘤细胞作用的结果。图中蓝色表示C6细胞核，黄绿色表示脂质体。比较1A、1B两图可以看出：1B中C6细胞与脂质体的结合显著多于1A，说明实施例2的造影剂能够更好地靶向到肿瘤细胞表面。
试验结论：核酸适配体能够显著提高包载钆的磁共振成像造影剂对肿瘤细胞的靶向性。
试验例2 本发明所述磁共振成像造影剂对肿瘤细胞的靶向结合作用
试验目的：证明本发明所述的磁共振成像造影剂具有靶向肿瘤的效果。
试验对象：
1.实施例1制备得到的磁共振成像造影剂；
2.对比例1制备的未经适配体GBI-10修饰的磁共振成像造影剂
3.市售普通造影剂马根维显(钆喷酸葡胺，Gd-DTPA)；
4.空白C6细胞；
5.去离子水；
6.PBS缓冲溶液
试验方法：
向长满80％大鼠脑神经胶质瘤细胞C6细胞的培养瓶中分别加入用无血清Ham’s F10稀释的两种脂质体造影剂以及Gd-DTPA，培养一段时间后，用胰酶消化细胞，并吹打成细胞悬液、离心，细胞集落用预冷PBS漂洗并重悬，加入4％多聚甲醛，并转移至EP管中；空白细胞组在培养相同时间后同法处理；用等量去离子水与PBS缓冲溶液分别作为对照。采用3.0T MR扫描仪，对上述细胞悬液体、空白细胞以及两个对照进行MRI显影测试。
试验结果：结果见图2，其中从左到右依次为实施例1的造影剂、对比例1的造影剂、Gd-DTPA、空白细胞、水和PBS。从图2可以看出：实施例1的造影剂在MRI下成像效果最好，说明该EP管中Gd浓度最高，也就是实施例1的造影剂与C6细胞结合的量最多。
试验结论：核酸适配体能够显著提高包载钆的磁共振成像造影剂对肿瘤细胞的靶向性和成像效果。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种磁共振成像造影剂，由核酸适配体类似物和包载钆的脂质体构成，其中所述核酸适配体类似物通过化学键连接到所述包载钆的脂质体上；
优选的，所述化学键选自酰胺键、硫醚键、磷酸键、偶氮键、二硫键和磺酰键中的一种或多种；
优选的，所述核酸适配体类似物选自巯基修饰的、氨基修饰的或位点修饰的GBI-10、AS1411、A10、MUC1、sgc8、sgc3、sgd3、KH1C1、KDO5、S6、AGRO100、A30和STRG2中的一种或多种；
还优选的，所述核酸适配体类似物还可以经放射性物质或荧光物质I标记；优选的，所述放射性物质选自32P、3H、35S和14C中的一种或多种；优选的，所述荧光物质I选自异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基四甲基罗丹明、花菁类Cy3和花菁类Cy5中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的磁共振成像造影剂，其特征在于，所述包载钆的脂质体包括不含钆的脂质成分和基于钆螯合物的脂质成分，所述不含钆的脂质成分和基于钆螯合物的脂质成分的摩尔比为1:0.1～1:0.5；优选为1:0.2～1:0.4；
优选的，所述基于钆螯合物的脂质成分选自钆-二乙烯三胺五乙酸-十八胺、钆-二乙烯三胺五乙酸-胆固醇、钆-二乙烯三胺五乙酸-硬脂胺、钆-二乙烯三胺五乙酸-磷脂酰乙醇胺和钆-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的磁共振成像造影剂，其特征在于，所述不含钆的脂质成分包括磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分；其中，
所述磷脂选自二硬脂磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和卵磷脂及其各自的衍生物中的一种或多种；
所述磷脂稳定剂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或多种；
所述胆固醇类成分选自胆固醇及其衍生物、胆甾烷、胆酸和胆汁酸中的一种或多种；
优选的，所述不含钆的脂质成分还可以包括功能化磷脂；所述功能化磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺交联物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交联物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交联物中的一种或多种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的磁共振成像造影剂，其特征在于，所述包载钆的脂质体还可以包括抗肿瘤药物和/或荧光物质II；抗肿瘤药物和/或荧光物质II可被包裹在脂质体内核或分散脂质体双分子层中；
优选的，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、博来霉素、顺铂、卡铂、伊立替康、紫杉醇、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、平阳霉素、舒尼替尼、索拉非尼、吉非替尼、伊马替尼、瓦他拉尼或其各自的盐中的一种或多种；
优选的，所述荧光物质II选自7-甲氧基香豆素、氨基香豆素、荧光黄、磺酰罗丹明101、溴化乙锭和噻唑橙中的一种或多种。
5.权利要求1至4中任一项所述磁共振成像造影剂的制备方法，包括以下几种方法中的一种：
I.所述基于钆螯合物的脂质成分和磷脂、磷脂稳定剂、功能化磷脂和胆固醇类成分先通过常规方法制备所述包载钆的脂质体，再将所述核酸适配体类似物连接到所述包载钆的脂质体上，得到所述磁共振成像造影剂；或
II.先将所述核酸适配体类似物连接到所述功能化磷脂或连接到所述胆固醇及其衍生物，再与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分通过常规方法制备成脂质体，得到所述磁共振成像造影剂；
优选的，所述制备方法还包括对所述磁共振成像造影剂进行纯化，所述纯化采用透析法、离心法和葡聚糖凝胶柱层析法中的一种或多种；更优选的，所述纯化采用透析法和/或葡聚糖凝胶柱层析法。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法I中，按照摩尔比功能化磷脂:核酸适配体类似物＝1:5～1:150，将所述包载钆的脂质体与所述核酸适配体混合，加入缩合剂，室温下反应15min～2h；
进一步优选的，功能化磷脂和核酸适配体类似物的摩尔比为功能化磷脂:核酸适配体＝1:30～1:50；更优选的，反应时间为30～60min；
还优选的，功能化磷脂和缩合剂的摩尔比为功能化磷脂:缩合剂＝1:5～1:150；更优选的，功能化磷脂和缩合剂的摩尔比为功能化磷脂:缩合剂＝1:30～1:50；
优选的，所述缩合剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三氮唑、1-羟基苯并三氮唑/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐中的一种；更优选的，所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法I中，将包载钆的脂质体与交联剂混合，孵育30min～4h，优选1～3h，得到连有交联剂的包载钆的脂质体，然后与所述核酸适配体类似物混合，孵育3～24h，优选8～20h；其中交联剂与核酸适配体类似物所含巯基或氨基的摩尔比为1:1；
优选的，所述交联剂选自N-(β-马来酰亚胺丙基氧)-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基-3-(溴代乙酰基氨基)丙酯、4-琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物、4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯、4-硫代琥珀酰亚胺基-(P-马来酰亚胺苯基)丁酯和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中的一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法II中，通过如下方法将所述核酸适配体类似物连接到所述功能化磷脂：
在核酸适配体的末端进行氨基修饰，然后再通过酰胺键引入功能化磷脂；或在核酸适配体的末端进行巯基修饰，然后再通过硫醚键引入功能化磷脂；
所述功能化磷脂和核酸适配体类似物的摩尔比为1:5～1:150，优选的，摩尔比为1:40；
或者，方法II中，通过如下方法将所述核酸适配体类似物连接到所述胆固醇及其衍生物：
先将所述胆固醇及其衍生物的羟基进行亚磷酰化，然后通过磷酸键引入所述核酸适配体类似物；所述胆固醇及其衍生物和核酸适配体类似物的摩尔比为1:1。
9.根据权利要求5或8所述的制备方法，其特征在于，所述方法II中，连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物，与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂和胆固醇类成分通过如下方法制备得到所述磁共振成像造影剂：
1)通过常规方法将连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物与基于钆螯合物的脂质成分、磷脂、磷脂稳定剂与胆固醇类成分制备成脂质体，得到所述磁共振成像造影剂；或
2)通过常规方法将基于钆螯合物的脂质成分和磷脂类成分与胆固醇类成分先制备所述包载钆的脂质体；将所述连接有核酸适配体类似物的功能化磷脂或连接有核酸适配体类似物的胆固醇及其衍生物与所述包载钆的脂质体进行孵育12小时以上，制备得到所述磁共振成像造影剂。
10.权利要求1至4中任一项所述的磁共振成像造影剂，和权利要求5至9中任一项制备方法制备得到的磁共振成像造影剂在制备靶向肿瘤的成像检测制剂或靶向肿瘤的治疗药物中的应用；
优选的，所述肿瘤选自多形性涎腺瘤、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、恶性黑色素瘤、甲状腺滤泡状肿瘤、人乳腺导管原位肿瘤、脑胶质瘤、急性髓细胞性白血病、转移性肾肿瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、宫颈瘤、食管鳞状细胞癌、消化系统上皮源性肿瘤中的一种或多种。
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