CN107029252A - 一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法 - Google Patents

一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学工程领域,具体涉及一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统(mEND‑ Fe3O4@CMCS)的制备方法,采用水热法制备磁性Fe3O4纳米颗粒,以戊二醛为交联剂,利用乳化交联的方法制备磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS,再通过Sulfo‑SMCC的交联作用将Endoglin适配体修饰在Fe3O4@CMCS表面,得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS,此方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND‑ Fe3O4@CMCS能有效的靶向小鼠肿瘤新生血管内皮细胞(mTEC)表面CD105分子,实现对荷肝癌移植瘤小鼠的MRI成像能力,具有灵敏度高、T2成像效率好、MRI造影效果好,同时低毒性、驰豫率高、生物相容性好且对肝脾具有靶向性等优点。

Description

一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域,具体涉及一种能靶向的特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统(mEND- Fe3O4@CMCS)的制备方法。
背景技术
Endoglin(CD105)是一种分子量约为68 kd的细胞膜糖蛋白,是转化生长因子-β(TGF-β)受体复合物的组成成分之一,能独立存在于细胞表面,是与内皮细胞增殖相关且可被缺氧环境诱导的蛋白。核酸适配体(aptamer)是一类具有高度特异性以及高亲和力的核酸分子,通过指数富集系统(SELEX)从随机的寡核苷酸库中筛选而得到的小分子DNA或RNA,因此它对靶点具有较高的亲和力和特异性,可用于疾病的诊断和靶向治疗。磁性纳米材料具有磁学性能,使它能够对外加的磁信号或外部的磁场做出迅速的磁响应,通过一定的方法控制磁刺激信号,能使其高效地运用在磁性分离纯化、肿瘤药物靶向递送、肿瘤热疗以及核磁共振成像等方面。公开号为CN201410209779.8 的发明专利,公开了一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法,此方法操作复杂、费时且技术要求高,有副作用。制备由Endoglin适配体修饰的磁性mEND- Fe3O4@CMCS纳米探针,该探针能特异性结合肝癌新生肿瘤血管内皮细胞的方法未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种平均粒径大小为87.15±1.66 nm、成像效率好的特异性磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS的制备方法,利用此探针系统能有效的靶向小鼠肿瘤新生血管内皮细胞(mTEC)表面CD105分子,实现对荷肝癌移植瘤小鼠的MRI成像能力。
为了解决这个技术问题,本方法采用如下步骤:
a.水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子;
b. 磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS 的制备;
c. 磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS 的制备:将步骤b中的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于HEPES缓冲液中,加入sulfo-SMCC,恒温摇床孵育;
磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒,加入2-Endoglin适配体到交联过的磁性粒子中,混匀,恒温摇床孵育,然后加入牛血清蛋白,封闭;
用偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次,磁分离,得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS。
本发明与现有技术相比具有如下优点
1)由本方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS能够特异性的与肝癌中表达CD105分子的新生血管内皮细胞结合,阻断Endoglin受体抑制CD105+ cells对靶向性纳米材料的内吞作用,具有较好的靶向CD105+ cells的能力,灵敏度高,且其靶向作用具有剂量依赖性。
2)由本方法制备的磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS平均粒径大约87.15±1.66 nm,表面电位为 -31.9±0.5 mV,无明显团聚现象,通过GE 3.0T MRI成像仪对其进行成像分析,T2成像效率更好,MRI造影效果显著提高,对肿瘤细胞的诊断和治疗有更好的指导作用。
3)本发明制备工艺简单,易于实现大规模工业化生产,具有粒径小、饱和磁化率高、悬浮分散稳定,同时低毒性、驰豫率高、生物相容性好且对肝脾具有靶向性等优点。
4)本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。
附图说明
图1 :Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS纳米粒子TEM表征图。
图2 :纳米粒子FTIR结果图(a)CMCS (b)Fe3O4(c)mEND-Fe3O4@CMCS。
图3 :纳米材料热重分析曲线图。
图4 :mEND-Fe3O4@CMCS 特异性结合表达CD105+的细胞:荧光显微镜观察(A)FITC标记的mEND-Fe3O4@CMCS处理后不同细胞系的荧光图片。(B)FITC标记的RS-Fe3O4@ CMCS处理不同细胞系的荧光图片。(C)未标记的Endoglin-Aptamer竞争封闭细胞表面受体后mEND-Fe3O4@CMCS结合CD105+ cells的结果。FITC(绿色),DAPI(蓝色)。
图5:流式分析仪检测不同纳米材料分别与293T、H22、CD105-cells 或CD105+cells细胞的结合能力图。
图6:mEND-Fe3O4@CMCS、RS-Fe3O4@CMCS、Fe3O4分别标记CD105+ cells后普鲁士蓝染色细胞实验结果图。PBS为对照control组。
图7:细胞内铁的吞噬量 (A)CD105+ cells吞噬不同纳米颗粒的定量分析图 (B)CD105+ cells吞噬不同浓度mEND- Fe3O4@CMCS纳米颗粒的定量分析图。
图8:纳米材料对CD105 + cells,CD105- cells,293T 和 H22细胞的毒性作用(A)Fe3O4 (B)mEND - Fe3O4@CMCS。
图9:Fe3O4、mEND-Fe3O4@CMCS体外T2-weighted MRI成像结果图。
图10:不同纳米材料与CD105+ cells孵育后体外MRI成像结果图。
图11:Fe3O4、RS-Fe3O4@CMCS和mEND-Fe3O4@CMCS在小鼠体内MRI成像结果图。
图12:对小鼠的重要脏器(心、肝脏、肺、脾脏、肾脏)HE染色结果图。
具体实施方式
本发明提供的一种能靶向的特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统(mEND-Fe3O4@CMCS)的制备方法总体思路是:mEND- Fe3O4@CMCS经过了亲水性的壳聚糖包裹和修饰。修饰后的mEND- Fe3O4@CMCS能够特异性的与肝癌中表达CD105分子的新生血管内皮细胞结合,阻断Endoglin受体抑制CD105+ cells对靶向性纳米材料的内吞作用,具有较好的靶向CD105+ cells的能力,从而提高了材料的成像效率。
下面结合具体实例对本发明进行进一步描述。
实施例1
水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子:
称取2.502 g(0.009 mol)七水硫酸亚铁,溶解于30 mL的ddH2O中,并加入浓度为50 g/L 的PEG-2000水溶液10 mL,充分搅拌混匀,并逐滴加入30 mL稀氨水,继续快速搅拌,并逐滴加入270 μL H2O2溶液,至溶液呈现黑色后,继续搅拌20 min;将溶液转移至高压反应釜中,于160℃下恒温反应6 h后,磁分离洗涤3次,70℃烘干,即得磁性Fe3O4纳米粒子。
实施例2
磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备:
称取羧甲基壳聚糖CMCS 0.4 g于20 mL ddH2O中,待搅拌完全溶解后过滤,滤液备用;在滤液中加入0.4 g 制备好的Fe3O4磁性纳米粒子,超声5 min,得到分散均匀的Fe3O4磁性纳米粒子分散液;于250 mL的三口瓶里加入58.2 mL 液体石蜡油,1.8 mL span-80;然后边搅拌边加入中分散均匀的Fe3O4磁性纳米粒子分散液(水相),混合液超声30 min,使其分散均匀,充分搅拌反应2 h;加入25 %的戊二醛溶液2 mL,继续搅拌反应1.5 h;待反应完全后用石油醚磁分离洗涤3次,再用丙酮磁分离洗涤3次;所得产物于真空干燥箱70℃干燥,研磨得到磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS。
实施例3
磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS的制备:
将磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS(-NH2)溶解于pH为7.2的HEPES缓冲液中,加入40 μL sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N- hydroxysuccinimideester sodium salt)),恒温摇床4 ℃孵育2 h,用磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒,除去多余的交联剂后加入2-Endoglin适配体,修饰巯基到交联过的磁性粒子中,混匀;利用温度恒温摇床4 ℃孵育2 h;加入100 μL 1 %的牛血清蛋白封闭30 min;用1 ml偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次,使用磁力架分离所得磁性颗粒,得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS。
磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS纳米材料的性能测定:
图1为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS纳米粒子的TEM表征图,结果表明单纯Fe3O4颗粒形态不规则,聚集现象严重。Fe3O4@CMCS与mEND-Fe3O4@CMCS颗粒呈圆形,平均粒径大约87.15±1.66 nm,分布均匀,无明显团聚现象。
图2为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS纳米粒子FTIR结果图,红外分析结果显示,mEnd- Fe3O4@CMCS(c)基本保留了CMCS的特征峰,并在584 cm-1处出现了Fe3O4的特征峰,证明CMCS成功包裹Fe3O4
图3为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS纳米材料热重分析曲线图,热重(TG)曲线显示在600 ℃-800 ℃区间内,mEND- Fe3O4@CMCS基本维持不变,表明mEND- Fe3O4@CMCS的热稳定性好。
图4为实施例3所制备的mEND-Fe3O4@CMCS 特异性结合表达CD105+的细胞:荧光显微镜观察(A)FITC标记的mEND-Fe3O4@CMCS处理后不同细胞系的荧光图片。(B)FITC标记的RS-Fe3O4@ CMCS处理不同细胞系的荧光图片。(C)未标记的Endoglin-Aptamer竞争封闭细胞表面受体后mEND -Fe3O4@CMCS结合CD105+ cells的结果。FITC(绿色),DAPI(蓝色),mEND-Fe3O4@CMCS探针与CD105+ cells结合后的荧光强度明显减弱,表明阻断Endoglin受体可以抑制CD105+ cells对靶向性纳米材料的内吞作用。
图5为流式分析仪检测实施例2、实施例3所制备的Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS分别与293T、H22、CD105-cells 或CD105+ cells细胞的结合能力图,结果表明通过流式细胞术的方法检测细胞结合FITC荧光强度,CD105+ cells与mEND- Fe3O4@CMCS探针结合后其细胞荧光明显增强。
图6为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS分别标记CD105+ cells后普鲁士蓝染色细胞实验结果图。PBS为对照control组,蓝色代表了细胞摄取的含铁纳米材料,细胞着色越深说明细胞内吞噬的铁离子含量越多。CD105+ cells经过与不同材料Fe3O4、RS- Fe3O4@CMCS、mEND- Fe3O4@CMCS分别共培养后,加入mEND- Fe3O4@CMCS探针共培养组的细胞胞内染色(蓝色)最多,颜色深,进入CD105+ cells的铁纳米材料更多。
图7为细胞内铁的吞噬量 (A)CD105+ cells吞噬实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS的定量分析图 (B)CD105+ cells吞噬不同浓度实施例3所制备的mEND- Fe3O4@CMCS纳米颗粒的定量分析图,如图7A所示,分别加入铁离子浓度为50 μg/mL的Fe3O4、mEND- Fe3O4@CMCS、RS- Fe3O4@CMCS不同材料与CD105+ cells共培养后,与mEND- Fe3O4@CMCS共孵育的细胞组平均细胞内铁含量为16.78 pg Fe/cell,较其他各组明显升高(* P< 0.05);同时,如图7B所示,随着加入mEND- Fe3O4@CMCS探针浓度的增加,CD105+ cells胞内的铁离子含量也随之相应的增加,表明经Endoglin适配体修饰的磁性mEND- Fe3O4@CMCS纳米材料具有较好的靶向CD105+ cells的能力,且其靶向作用具有剂量依赖性。
图8为实施例1、实施例3所制备的Fe3O4、mEND-Fe3O4@CMCS对CD105 + cells,CD105-cells,293T 和 H22细胞的毒性作用(A)Fe3O4(B)mEND - Fe3O4@CMCS,用CCK-8法检测Fe3O4和mEND- Fe3O4@CMCS对不同细胞的毒性。分别与293T、H22、CD105- cells或CD105+ cells等细胞共培养24 h后,随着培养液中mEND- Fe3O4@CMCS探针浓度的增加,细胞活力仍然大于80%,对细胞存活率无明显抑制作用。而随着加入Fe3O4的浓度的增加,Fe3O4对各种细胞的存活率的抑制明显增大,当铁浓度大于40 μg/mL时,可见明显的细胞活性的下降,表现出明显的细胞毒性。表明经适配体修饰及壳聚糖包裹后的磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS细胞毒性更小。
图9为实施例1、实施例3所制备的Fe3O4、mEND-Fe3O4@CMCS体外T2-weighted MRI成像结果图,制备的Fe3O4和mEND- Fe3O4@CMCS颗粒都能明显的缩短T2弛豫时间,有良好的T2增强作用,并能引起MRI成像上的变化,表现为:随着纳米材料浓度的增加,MRI信号强度随之降低,图像上显示为暗信号,并且随着浓度的递增而暗信号越强。当加入相同的铁浓度时,mEND- Fe3O4@CMCS组的暗信号明显的强于Fe3O4组。经过了亲水性的壳聚糖包裹和修饰能够促进水分子进一步接触磁性纳米颗粒,从而可以提高材料的成像效率。
图10为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS与CD105+ cells孵育后体外MRI成像结果图,结果显示不同的造影剂T2加权图,在同一Fe离子浓度的条件下,mEND-Fe3O4@CMCS组的信号下降最明显,而Fe3O4和RS- Fe3O4@CMCS组的信号与空白细胞组的信号强度基本无变化。
图11为实施例1、实施例2、实施例3所制备的Fe3O4、Fe3O4@CMCS、mEND-Fe3O4@CMCS在小鼠体内MRI成像结果图,结果显示mEND- Fe3O4@CMCS组小鼠荷瘤部位信号明显降低,说明mEND - Fe3O4@CMCS可以显著的降低小鼠荷瘤部位的T2 信号强度,提高BALB/c小鼠肝癌移植瘤部位成像对比度,使得两者的交界面得以清楚显示。
图12为实施例3所制备的 mEND-Fe3O4@CMCS对小鼠的重要脏器(心、肝脏、肺、脾脏、肾脏)的HE染色结果图,结果表明mEND- Fe3O4@CMCS对小鼠的主要脏器无毒性损伤。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施例加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,包括如下步骤:
a.水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子;
b. 磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS的制备;
c. 磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS 的制备:将步骤b中的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于HEPES缓冲液中,加入sulfo-SMCC,恒温摇床孵育;
磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒,加入2-Endoglin适配体到交联过的磁性粒子中,混匀,恒温摇床孵育,然后加入牛血清蛋白,封闭;
用偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次,磁分离,得到磁性Endoglin适配体成像探针mEND-Fe3O4@CMCS。
2.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于步骤a水热法制备磁性Fe3O4纳米粒子的步骤是:将FeSO4·7H2O水溶液和PEG-20000水溶液混合,不断搅拌下滴加稀氨水调节溶液pH值为10.0,溶液呈墨绿色;30℃持续搅拌下逐滴加入H2O2溶液,此时溶液呈黑色;将溶液转移至高压反应釜中,于160℃下恒温反应6 h;磁分离收集下层沉淀,先后用纯水和无水乙醇磁分离洗涤,然后将其置于70℃下烘干;烘干后研磨即得磁性Fe3O4纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于步骤b磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS 的制备步骤是:将羧甲基壳聚糖CMCS溶于ddH2O中,待搅拌完全溶解后过滤,滤液备用;在滤液中加入步骤a制备好的Fe3O4磁性纳米粒子,超声分散均匀;在250 mL的三口瓶里加入60 mL液体石蜡油,边搅拌边加入Fe3O4磁性纳米粒子分散液,混合液超声分散均匀,搅拌反应2 h;加入戊二醛溶液2 mL,继续搅拌反应1.5 h;得到所需产物,用石油醚磁分离洗涤3次,再用丙酮磁分离洗涤3次;所得产物于真空干燥箱70℃干燥,研磨得到磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS。
4.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于步骤c中,将步骤b得到的磁性壳聚糖纳米颗粒Fe3O4@CMCS溶解于pH为7.2的HEPES缓冲液中,加入40μL sulfo-SMCC;恒温摇床4 ℃共孵育2 h后,磁力架分离已交联SMCC的磁性颗粒,除去多余的交联剂;加入2-Endoglin适配体,修饰巯基到交联过的磁性粒子中,混匀;利用恒温摇床4℃孵育2 h;加入1 %的牛血清蛋白100 μL封闭30 min;用1 ml偶联缓冲液洗涤纳米粒子2-3次,使用磁力架分离所得磁性颗粒,得到适配体偶联的磁性Endoglin适配体成像探针mEND- Fe3O4@CMCS。
5.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于所述2-Endoglin适配体浓度为10、20、40、60、80 nM。
6.根据权利要求1所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于:所述探针mEND- Fe3O4@CMCS的平均粒径为85-90 nm,表面电位为 -31.9±0.5mV。
7.根据权利要求3所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于所述液体石蜡油中含有1.8 mL的span-80。
8.根据权利要求3所述的一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法,其特征在于所述戊二醛溶液浓度为25%。
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