CN110411992A - 一种甲状腺组织结构的成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲状腺组织结构的成像方法,包括以下步骤:(1)利用荧光标记的脂质标记甲状腺组织;(2)用荧光显微镜对所述甲状腺组织进行扫描成像,以显示所述甲状腺组织的滤泡结构。本发明提供的甲状腺组织结构的成像方法,采用荧光标记脂质,使甲状腺细胞膜被荷脂并标记荧光,提供了动态、清晰的甲状腺组织微观结构,可广泛应用于甲状腺疾病动物模型甲状腺组织结构的评估,对于甲状腺疾病的发病机制研究和防控策略制定意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种甲状腺组织结构的成像方法,可用于评估甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进等多种甲状腺疾病动物模型的甲状腺组织结构微观形态。
背景技术
近年来,世界范围内甲状腺疾病的患病率显著上升。1988年至1994年,全美健康营养抽样调查17353人,甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进的检出率分别为4.6%和1.3%。2010年中国首次十城市居民甲状腺疾病流行病学调查结果显示,甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进的患病率也居高不下。2012年国际著名杂志Lancet中的一篇社论指出,全世界正面临着甲状腺疾病的威胁。未及时治疗的甲状腺功能异常可能给患者带来严重的、甚至威胁生命的并发症。甲状腺功能减退是冠心病发生发展的独立危险因素,是继发性高血压和血脂异常的重要原因。甲状腺功能亢进可导致心律失常、骨质疏松的危险性增加,严重危害人类健康。因此,甲状腺疾病动物模型的建立和评估,可用于甲状腺疾病的发病机制和治疗策略的研究,意义重大。
目前,甲状腺疾病动物建模后,一般使用甲状腺组织大体观察(肉眼观察其颜色、大小和形态)、超声成像(超声扫描评估其大小、质地)和病理学检查(石蜡包埋后组织切片HE染色,观察其形态结构)三种方法对甲状腺的形态和组织结构进行评估。然而,上述三种方法都有其明显的局限性:大体观察仅能对整个腺体进行外观的评估,难以获得组织微观结构信息;超声成像虽能反映组织内部血流、结构情况,但由于超声图像的特性,评价指标过于片面;病理学检查在微观评估方面显著优于以上两种方法,但由于该方法基于组织切片,无法采集到立体、完整的腺体信息。
发明内容
为了解决上述问题,本发明旨在提供一种甲状腺组织的成像方法,用以提高甲状腺组织结构的成像效果,特别是形态的立体成像,丰富了动物甲状腺疾病模型评估的可选方法。
一方面,本发明提供了一种甲状腺组织结构的成像方法,包括以下步骤:
(1)利用荧光标记的脂质标记甲状腺组织;
(2)用荧光显微镜对标记的甲状腺组织进行扫描成像,以显示甲状腺组织的滤泡结构。
进一步地,所述荧光标记的脂质选自荧光标记的胆固醇、荧光标记的饱和脂肪酸中的一种或多种,优选为荧光标记的胆固醇。
更进一步地,所述荧光标记的胆固醇为氟硼二吡咯类荧光分子探针;所述荧光标记的饱和脂肪酸为荧光标记棕榈酸。
进一步地,所述步骤(1)中利用荧光标记胆固醇溶液对甲状腺组织进行标记,所述荧光标记胆固醇溶液为含有0.2mg/ml荧光标记胆固醇的无水乙醇溶液。
优选地,上述0.2mg/ml荧光标记胆固醇的无水乙醇溶液采用以下方法配制:将荧光标记胆固醇以无水乙醇为溶剂配制为1mg/ml的母液,呈透明黄绿色,在于标记前取100μl母液,用无水乙醇稀释至500μl备用;更优选地,所述荧光标记胆固醇溶液需现用现配。
进一步地,所述步骤(1)中荧光标记的脂质对甲状腺组织进行标记的时间为1-15分钟。
进一步地,所述方法还包括将所述甲状腺组织包埋于培养皿底部的步骤;优选地,需将甲状腺组织修剪后包埋,所述修剪具体为:沿甲状腺包膜修剪组织周围的脂肪和结缔组织。
进一步地,使用1.5%琼脂溶液包埋甲状腺组织。
更进一步地,所述1.5%琼脂溶液采用以下方法制得:将0.75g医用琼脂粉溶解于50ml磷酸缓冲液中,微波加热至澄清,晾至室温。
进一步地,所述步骤(2)中的荧光显微镜为双光子激光扫描荧光显微镜。
更进一步地,所述用双光子激光扫描荧光显微镜对甲状腺组织进行扫描成像的条件为:激发光波长为910nm,发射光波长为500-550nm,20×物镜拍摄,在平面上拼合成甲状腺组织图像;Z轴拍摄2μm步进,深入至80-100μm,重建获得立体的甲状腺组织图像,清晰显示甲状腺组织内部的滤泡结构。
在一种实施方式中,上述方法中可采用常规方法对甲状腺组织进行荧光标记,如将离体甲状腺组织浸泡于上述配制的荧光标记胆固醇溶液1分钟后清洗甲状腺组织,利用脂质通过主动和被动运输进入细胞的生物学原理,使甲状腺细胞膜被荷脂并标记荧光。
在另一种实施方式中,还可以采用注射的方法对甲状腺组织进行荧光标记。例如对大鼠甲状腺组织进行荧光标记,可以沿大鼠颈外动脉注入荧光标记胆固醇溶液后离体甲状腺组织并清洗;优选的,对大鼠甲状腺组织进行荧光标记时,需注射500μl上述配制的荧光标记胆固醇溶液;更优选地,还可以使用血管夹夹闭颈总动脉下端及颈内动脉上端,有效阻断颈外动脉,提高甲状腺组织的标记效率;更优选的,在注射前使用3%戊巴比妥钠以1ml:1kg剂量体重比将大鼠麻醉。
另一方面,本发明还提供了一种用于甲状腺组织结构成像的试剂,所述试剂为荧光标记胆固醇的溶液;优选的,所述荧光标记胆固醇的溶液为含有0.2mg/ml荧光标记胆固醇的无水乙醇溶液;优选地,上述荧光标记胆固醇的溶液用于大鼠甲状腺组织结构成像时,需使用0.1mg荧光标记胆固醇。
另一方面,本发明还提供了荧光标记的脂质在用于甲状腺组织结构成像中的应用;优选的,所述荧光标记的脂质用于观察甲状腺组织结构的形态;更优选的,荧光标记的脂质用于标记甲状腺中的滤泡结构。
通过本发明提供的甲状腺组织结构的成像方法能够带来如下有益效果:
(1)本发明利用脂质是哺乳动物细胞膜的固有成分,通过主动和被动运输方式进入细胞的生物学原理,采用荧光标记脂质的方法,使甲状腺细胞膜被荷脂并标记荧光,提供了动态、清晰显示甲状腺组织微观结构,如滤泡大小及形态、滤泡上皮细胞的排列及状态、滤泡内胶质的多少等的方法;
(2)本发明采用从两侧甲状腺的供血动脉注射,同时夹闭颈总动脉下端和颈内动脉的方法,可使荧光标记的脂质更加有效、快速地分布于甲状腺组织,特异性更高,减少了操作带来的荧光损失;
(3)本发明采用双光子激光扫描荧光显微镜的实验手段,与普通共聚焦荧光显微镜相比,穿透深度更深,可获得包含深部组织的立体图像和信息,对于甲状腺组织微观结构的评估更为全面;
(4)本发明提供的甲状腺组织结构的成像方法,可广泛应用于甲状腺疾病动物模型甲状腺组织结构的评估,对于甲状腺疾病的发病机制研究和防控策略制定意义重大。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1为未与气管及甲状软骨游离的离体甲状腺组织,由上到下依次为其正面外观和反面外观;
图2为琼脂包埋于共聚焦显微镜专用培养皿底部的已被荧光标记的离体甲状腺组织;
图3为拍摄得到的甲状腺组织结构平面荧光图(图中圈出位置为大小不一的滤泡结构);
图4和图5为重建得到的甲状腺组织结构立体荧光图(Width:6.65mm;Height:6.65mm;Depth:0.08mm)。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思,下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而,对于本领域技术人员来说显而易见的是,本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中,为了避免与本申请发生混淆,对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
本发明提供的甲状腺成像方法,需利用荧光标记的脂质标记甲状腺,本领域技术人员应当理解,下述实施例中甲状腺的荧光标记方法并非唯一标记方式,还可以采用常规技术手段进行荧光标记。如,将离体甲状腺组织浸泡于配制的荧光标记胆固醇溶液1分钟后清洗甲状腺组织,利用脂质通过主动和被动运输进入细胞的生物学原理,使甲状腺细胞膜被荷脂并标记荧光。
在下述实施例中,所用到的试剂如下:
荧光标记胆固醇:NBD-Cholesterol(Molecular Probes,Cat No.N1148);
无水乙醇:药用级无水乙醇(Aladdin,Cat No.64-17-5);
实验动物动物麻醉剂:3%戊巴比妥钠;
PBS缓冲液:PBS盐平衡液(Hyclone,Cat No.SH30256.01B);
医用琼脂粉:琼脂(Sigma,Cat No.9002-18-0)。
在下述实施例中,所用到的器械设备如下:
超净工作台,震荡混悬仪,眼科剪,眼科镊,血管钳,小号拉钩,血管夹,1ml无菌注射器,共聚焦显微镜专用培养皿(Mattek,Cat No.P35G-1.5-10-C),多光子共聚焦荧光显微镜(Nikon,A1RMP)。
实施例1
实施例1提供了一种甲状腺组织结构的成像方法,包括以下步骤:
(1)配制荧光标记胆固醇溶液:1000g,1min离心试剂瓶,将10mg NBD-cholesterol粉剂离心至管底;超净台内关闭风机,远离红外灯,加入无水乙醇10ml,迅速盖严盖子,振荡混匀即为1mg/ml的NBD-cholesterol无水乙醇母液,呈透明黄绿色;无菌分装至高压灭菌的EP管,避光-30℃保存;动物体内注射前使用无水乙醇将100μl 1mg/ml的NBD-cholesterol无水乙醇母液稀释至500μl备用,现用现配。
(2)麻醉并暴露颈动脉鞘:大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉(1ml/kg体重),充分麻醉后,75%酒精消毒皮肤,并沿颈正中线做切口,钝性分离皮下组织、颌下腺和胸锁乳突肌,暴露双侧颈动脉鞘。
(3)游离颈总动脉及颈内动脉:使用血管钳将颈总动脉与颈内静脉、迷走神经游离,沿颈总动脉向上方继续钝性分离肌肉组织至较好暴露颈总动脉分叉处、颈外动脉及颈内动脉,分离过程尽量避免损伤血管、神经。
(4)体内注射并取材:使用血管夹小心夹闭颈总动脉下端及颈内动脉上端,使用1ml注射器沿颈外动脉缓慢注入配制好的荧光标记胆固醇溶液500μl,5分钟后小心离体甲状腺组织,PBS缓冲液冲洗表面。
(5)配制1.5%琼脂溶液:精密天平称量0.75g医用琼脂粉放入锥形瓶,加入50mlPBS缓冲液,微波高火加热20秒至沸腾,再加热10秒至溶液澄清透明,常温晾凉备用。
(6)修剪组织:沿甲状腺包膜修剪组织周围的脂肪及结缔组织,注意不要破坏甲状腺组织的完整性,注意避光。
(7)包埋组织:使用晾至常温的琼脂溶液将修整好的甲状腺组织平整的包埋于共聚焦显微镜专用培养皿底部至凝固,注意避光。
(8)应用多光子共聚焦荧光显微镜对甲状腺组织进行共振扫描,成像条件为:激发光波长910nm,发射光波长500-550nm,20×物镜拍摄,在平面上拼合成甲状腺的完整图像;Z轴拍摄2μm步进,共拍摄43层,重建得到立体的甲状腺图像,清晰显示甲状腺组织内部滤泡结构(Width:6.65mm;Height:6.65mm;Depth:0.08mm)。
上述步骤的部分实验过程如图1-2所示,最终获得的甲状腺组织结构成像结果如图3-5所示。
图1为未与气管及甲状软骨游离的离体甲状腺组织,由上到下依次为其正面外观和反面外观。如图1所示,甲状软骨下方、气管两侧的两叶蝴蝶状的红色组织即为甲状腺的左右两叶。
图2为与气管与甲状软骨分离后,使用琼脂包埋于共聚焦显微镜专用培养皿底部的甲状腺组织。如图2所示,其蝴蝶状的外观形态清晰可见。
图3为应用多光子共聚焦荧光显微镜对甲状腺组织进行共振扫描,在平面上拼合成的甲状腺的完整图像。如图3所示,显示绿色荧光的部位为甲状腺滤泡上皮细胞及滤泡腔内荷脂并标记的NBD-胆固醇。其中,图3中圆形圈出的位置即为甲状腺组织的滤泡结构,其大小、形态、排列方式等清晰可见,并且由该成像结果可以看出,滤泡大小不一,形态为球形或类球形,滤泡上皮细胞的排列整齐成高柱状,滤泡内胶质丰富。
图4和图5为应用双光子激光扫描荧光显微镜对甲状腺组织进行超高速共振扫描,在Z轴上重建的离体图像(Width:6.65mm;Height:6.65mm;Depth:0.08mm),两张图片旋转角度不同。
综合上述可得,本发明提供的甲状腺组织的成像方法,可以实现甲状腺组织结构的立体成像,动态、清晰地显示甲状腺组织的微观结构,可广泛应用于甲状腺疾病动物模型甲状腺组织结构的评估,对于甲状腺疾病的发病机制研究和防控策略制定意义重大。
以上所述仅为本申请的实施例而已,并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种甲状腺组织结构的成像方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)利用荧光标记的脂质标记甲状腺组织;
(2)用荧光显微镜对标记的甲状腺组织进行扫描成像,以显示所述甲状腺组织的滤泡结构。
2.根据权利要求1所述的成像方法,其特征在于,所述荧光标记的脂质选自荧光标记的胆固醇、荧光标记的饱和脂肪酸中的一种或多种,优选为荧光标记的胆固醇。
3.根据权利要求2所述的成像方法,其特征在于,所述荧光标记的胆固醇为氟硼二吡咯类荧光分子探针;所述荧光标记的饱和脂肪酸为荧光标记棕榈酸。
4.根据权利要求1所述的成像方法,其特征在于,所述步骤(1)中利用荧光标记胆固醇溶液对甲状腺组织进行标记,所述荧光标记胆固醇溶液为含有0.2mg/ml荧光标记胆固醇的无水乙醇溶液。
5.根据权利要求1所述的成像方法,其特征在于,所述步骤(1)中荧光标记的脂质对甲状腺组织进行标记的时间为1-15分钟。
6.根据权利要求1所述的成像方法,其特征在于,所述方法还包括将所述甲状腺组织包埋于培养皿底部的步骤;优选地,需将所述甲状腺组织修剪后包埋,所述修剪具体为:沿甲状腺包膜修剪组织周围的脂肪和结缔组织。
7.根据权利要求6所述的成像方法,其特征在于,所述甲状腺组织使用1.5%琼脂溶液包埋。
8.根据权利要求7所述的成像方法,其特征在于,所述1.5%琼脂溶液采用以下方法制得:将0.75g医用琼脂粉溶解于50ml磷酸缓冲液中,微波加热至澄清,晾至室温。
9.根据权利要求1所述的成像方法,其特征在于,所述步骤(2)中的荧光显微镜为双光子激光扫描荧光显微镜。
10.根据权利要求9所述的成像方法,其特征在于,所述用双光子激光扫描荧光显微镜对甲状腺组织进行扫描成像的条件为:激发光波长为910nm,发射光波长为500-550nm,20×物镜拍摄,在平面上拼合成甲状腺组织图像;Z轴拍摄2μm步进,深入至80-100μm,重建获得立体的甲状腺组织图像,清晰显示甲状腺组织内部的滤泡结构。
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