CN104368015A - 一种荧光共轭化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的荧光共轭化合物及其应用，该荧光共轭化合物由荧光分子标记游离脂肪酸构成，应用于检测癌前病变细胞或癌细胞，其可通过主动转运进入细胞内，由于肿瘤组织和正常细胞对该荧光共轭化合物的吸收或代谢速率不同，当荧光内镜、激光共聚焦显微内镜等荧光检测设备发射激光激发荧光化合物后，可显示组织不同部位荧光信号的强弱，因此将肿瘤组织和正常细胞区分开来，从而发现癌前病变细胞或癌细胞。本发明的荧光共轭化合物应用于人类肿瘤及癌前疾病的疾病评估、病理活检、手术切除范围确定，具有成像快速、清晰、特异度高的特点，还可用于制备检测肿瘤及癌前疾病的药物或者示踪试剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光共轭化合物及其应用，具体是一种荧光分子标记的脂肪酸及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物，这种增殖是不可调控的恶性增殖，最终形成肿块。机体的正常细胞在受到损伤时候会增殖分化以修复损伤，而肿瘤细胞则失去了分化成熟的能力无限增殖而挤压周围正常组织并进行远处转移。
肿瘤病人的生存期与确诊时候肿瘤的分期有很大关系，如果能够对肿瘤进行早期发现，肿瘤能被控制或治愈。肿瘤的临床分期是根据原发肿瘤的大小以及播散程度来描述恶性肿瘤的严重程度和受累范围，处于一期的肿瘤，不会侵袭周围组织而处于四期的肿瘤除原发部位肿瘤外已经转移到其它部位组织，并在转移部位增殖形成新的肿瘤。但目前患者未早期就诊、肿瘤早期发现手段仍存在缺陷，是肿瘤患者的主要死因。
目前针对肿瘤的治疗方案主要为放化疗、生物免疫治疗、手术等，在多数实体肿瘤如结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤治疗中手术占据着重要地位。但由于切除不彻底，术后肿瘤复发率及转移率仍较高，如大肠癌根治术后复发率为24.1%，而在这些复发的病例中34.3%为术后1年之内发生。因此，准确的定位肿瘤无论是在常规的检查还是术中都有着重要的指导意义，与病人的预后，生存率密切相关。
目前，主要有以下两方面的因素影响肿瘤的检测：
1、肿瘤发生发展的生物学特性：绝大多数肿瘤的发生发展都是一个多因素多阶段的复杂过程。从致癌因素作用于正常细胞到形成临床上可以检测到的肿瘤往往需要经过一个很长的潜伏期，这个过程大致分为激发阶段和促进阶段，癌症的激发是致癌因素不可逆地将正常细胞转变为潜伏肿瘤细胞的起始步骤，促进过程是潜伏性瘤细胞转变成癌细胞的过程，此时癌细胞发生恶变，逐步呈现恶性表型，突变细胞被赋予新的特性，其不像正常细胞待成熟后增殖且仅更新机体中受损细胞，癌细胞的增殖可发生在早幼期，它一般不分化为成熟、具有生物功能的细胞，当进入失控性的增殖阶段后，不断入侵和破坏邻近组织，最终将转移或扩散到身体的其他部位。但一个癌细胞当增殖数量到达109时，临床才有可能检出，此时很多患者已进入中晚期，而当癌细胞数量达到1012时，已经扩散。
鉴于上述肿瘤发生发展过程的复杂性和失控性，很难知晓疾病发展的阶段和程度，且对于潜伏期肿瘤因其组织的结构和功能未出现明显变化，仅依赖医师临床经验和肿瘤宏观形态学、血清肿瘤标志物判断，尚难以发现早期结肠癌、肺癌、乳腺癌，前列腺癌，宫颈癌，食道癌，膀胱癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤等。
2、目前诊疗技术的缺陷：目前对肿瘤的早期发现主要依靠肿瘤标志物检查、影像学和病理学检查等手段。肿瘤分子标志物检查、影像学检查对发现肿瘤的特异度不高。组织病理学活检是侵入性的，有时候还需要手术切除组织进行分析，有可能造成癌细胞的扩散转移。如检测皮肤癌症黑色素瘤通常是通过物理检查选定癌变皮肤进行活检，这很大程度上依赖于医师的经验，因为癌变组织可能超出其物理判断的范围，容易漏诊，危害患者生命。相反，一些皮肤病理活检不是癌，患者因此会受到不必要的伤害，如面颊部有黑色素时，自患者脸部活检取样本，影响美观。
对于确诊癌症的患者，若其肿瘤浸润深度停留在1-2级，通过肿瘤根治术通常可以取得较好的治疗效果。手术前，常规进行如X线、CT、MRI等解剖结构成像初步定位肿瘤以指导手术，但在手术进行时，这些图片不能指导外科医生对肿瘤进行实时定位，医生仅凭自己的感官来确定肿瘤的位置和深度。为最终确定肿瘤的病理分级，在手术完成前外科医生在病变部位取活检组织，而后送行快速冰冻切片，以确定所有的癌组织已被清除。然而，这个过程往往需要一个训练有素的病理学家快速精确的分析组织样本，同时在未出病检结果前病人仍处于开放式或其他的手术状态，且如果病检结果认为癌组织存在转移，外科医生将继续凭借自己的感官来切除可能残留的肿瘤，虽经过二次清除，据统计仍然有15%-25%的可能存在癌组织的残留。并且与完全切除了肿瘤组织的患者相比，这些患者往往需要经历更昂贵、痛苦的治疗来控制在手术时候残留的癌，并有更高的死亡风险。
近年来功能成像已经受到越来越多医学科研人员的关注，功能成像为肿瘤良恶性的检测提供了良好的契机，其通过光学、超声、核医学、磁共振等显像手段对活体特定的靶点进行成像，揭示肿瘤特别是早期肿瘤发生过程中的细胞功能和基因分子水平的异常。例如：PET-CT在判断人体良恶性肿瘤上的应用就是最好的实践，但是PET-CT在发现胃肠道肿瘤方面存在盲点，和消化道内镜比较对早期肿瘤发现不具有任何优势。而且PET-CT辐射较大，需要昂贵和笨重的检测设备且检查费用昂贵，普通病人难以负担，此外PET-CT不能用于医生体检间、操作间或手术室手术中定位癌症。
激光共聚焦显微内镜是近年来新开发出来的内镜，它是传统电子内镜和共聚焦激光显微镜整合的产物，它的使用准备和操作与一般内窥镜检查大致相同，唯需要在检查过程中使用特殊的荧光剂，如静脉注射荧光素钠和局部喷洒吖啶黄溶液。国内已经开始应用到胃镜与结肠镜的检查中，对较小病灶以及早期胃肠道肿瘤的示踪具有快速、准确的优势。但是目前最常用的荧光对比剂荧光素钠和盐酸吖啶黄，荧光素钠成像是通过进入血液中的荧光染料衬染周边细胞成像，其并不能进入细胞内，且病人使用后可出现一过性的过敏反应，吖啶黄能进入细胞染细胞核，成像清晰，但因其致癌性，目前已为FDA禁用药物，这就需要开发特异性高且安全可靠的生物制剂来提高共聚焦显微内镜的检查效果。
另一方面，游离脂肪酸的吸收和代谢是机体的一个重要生理过程，肠道、心脏、脂肪、肾和肝等几乎所有组织都有长链脂肪酸转运蛋白。脂肪酸转运蛋白的功能异常是多种疾病的发生的重要原因，因此研究脂肪酸吸收和代谢是一个重要的科学问题。目前，研究脂肪酸吸收和代谢主要使用放射性元素标记的脂肪酸分子示踪技术，需要特殊的检测仪器，而且成本较高，最大的确点是对环境的放射性污染，一般不能直接用于人体。
现有技术中未有一种荧光共轭化合物是由荧光分子标记游离脂肪酸构成，且依据正常细胞和肿瘤细胞对该荧光共轭化合物中的游离脂肪酸吸收或代谢差异来实现人类肿瘤及癌前疾病的疾病评估、病理活检、手术切除范围方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光共轭化合物及其应用，该荧光共轭化合物由荧光分子标记游离脂肪酸构成，可用于依据正常细胞和肿瘤细胞对该荧光共轭化合物中的游离脂肪酸吸收或代谢差异，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光内镜或激光共聚焦显微内镜进行荧光成像，直观反映待测部位的荧光信号强弱，从而将肿瘤细胞和正常细胞区分开来，进而发现癌前病变细胞或癌细胞，实现对人类肿瘤及癌前疾病的疾病评估、病理活检、手术切除范围确定。
本发明的技术方案如下：一种荧光共轭化合物是由荧光分子标记游离脂肪酸构成，
其应用于检测癌前病变细胞或癌细胞；所述荧光分子选自荧光素钠、吖啶黄、罗丹明、氟硼荧染料、荧光染料NBD、丹磺酰、香豆素染料、菁染料中的任意一种；所述游离脂肪酸为长链饱和或单不饱和脂肪酸；所述标记是指通过化学反应使荧光分子与游离脂肪酸通过2~30个由C、N、O、P、S、Si中的任意一种或多种组成的线状、环状、苯环或者上述组合的连接基团连接；所述荧光分子的发射波长为400nm~1200nm。
优选的，所述荧光共轭化合物是由荧光素钠C20H10Na2O5标记十八烯酸C18H34O2构成，荧光素钠在十八烯酸的碳9位通过C-O键与十八烯酸连接，其制备方法如下：
（1）在氮气保护下将荧光素钠与巯基丙酸按摩尔比1:0.1~0.15，在45~55℃下搅拌直到形成溶液，在溶液中加入荧光素钠摩尔质量0.2‰的氯化铪(IV)四氢呋喃络合物(1:2)、甲苯，然后在125~135℃下分水回流15~18h，反应结束，减压蒸馏，除去甲苯，获得中间产物；
（2）在氮气保护下，往干燥的烧瓶中依次加入十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈、甲苯，在75~85 ℃反应45~50h，反应结束，将产物沉淀于乙醇水溶液，离心分离后在50℃下真空干燥，即制得荧光素钠标记的十八烯酸；所述十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈混合物的摩尔比为：1:4~6:0.2~0.5。
所述步骤（1）中甲苯用量为：反应体系中每1mol荧光素钠的甲苯用量为180~200ml。
所述步骤（2）中甲苯用量为：反应体系中每1mol荧光素钠-SH的甲苯用量为250~300ml。
本发明所述荧光共轭化合物还可制作成用于检测人类肿瘤及癌前疾病的药物、染色剂或示踪试剂。
所述的人类肿瘤包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤在内的恶性肿瘤；所述癌前疾病包括Barrett 食管、腺瘤性息肉、炎症性肠病。
所述药物包括医学上认可的片剂、胶囊、药丸、粉末、膏剂、栓剂或者把所述荧光共轭化合物溶解在水溶性丙二醇或氯化钠溶液中形成无菌溶液或悬液。
所述荧光共轭化合物在用于检测人类肿瘤及癌前疾病的药物中的含量为0.05~0.1%。
本发明的荧光共轭化合物可经主动转运进入细胞，且积聚在细胞内不被代谢，由于正常细胞和肿瘤细胞对荧光共轭化合物中的游离脂肪酸吸收或代谢差异，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光内镜或激光共聚焦显微内镜进行荧光成像，可直观反映待测部位的荧光信号强弱，将肿瘤细胞和正常细胞区分开来，从而发现癌前病变细胞或癌细胞。
本发明的荧光共轭化合物吸收活体正常组织的荧光强度约为肿瘤组织的1.5~9.8倍（平均值为3.4倍），在荧光成像图中，以暗区形式显示肿瘤生长、浸润范围。
所述荧光共轭化合物的给予方式可以是活体局部给予或静脉给予或口服给予；优选活体局部给予，成像效果更佳。
以本发明所述荧光共轭化合物对活体待检测部位实施荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光内镜或激光共聚焦显微内镜成像技术，优选激光共聚焦显微内镜。
本发明以肿瘤组织的代谢特点为基础，提供了一种可供荧光显微镜和（或）内镜设备检测的荧光标记物，以图像的形式直观显示特定生物物质在细胞中的代谢情况，实现对细胞生物代谢活动异常的相关疾病和肿瘤等疾病及时、快速的诊断，并能特异性地指导靶向性活检，检测结果准确、可靠。本发明的荧光共轭化合物具有稳定的生物学特性，且应用安全、快捷，可直接应用于人体。本发明建立了一种特异、安全的内镜荧光分子成像方法。
本发明的荧光共轭化合物及其应用具有以下优点：
（1）荧光共轭化合物对于发现肿瘤组织有较高的敏感：当先向患者静脉注射、吸入或局部灌注荧光共轭化合物后，癌前病变细胞或肿瘤细胞不或（较低）吸收这种荧光化合物，而在正常细胞中则能吸收较多，一段时间后在病变组织和正常组织间形成显著的浓度差，在特定波长的激光照射下，正常组织发射出较强且具有特定波长的荧光，而病变组织无此吸收峰或吸收峰很弱，并且吸收代谢的荧光基团不易被体内其它酶催化代谢，积聚在细胞内，荧光共轭化合物的这种性质增加了它识别肿瘤组织的敏感性；而将肿瘤和正常组织区分开来；与现有的肿瘤示踪方法相比较这种方法能够在细胞水平发现肿瘤组织；
（2）荧光共轭化合物在体内具有较高的稳定性：荧光素能够通过烷基、酰胺基、磺酰胺基等化学键直接与小分子化合物结合，这些化学键在体内的反应体系中是比较稳定的；同时，连接基团虽然分离了荧光素和小分子化合物，但是小分子化合物不受荧光素的影响，能够像正常生物体的小分子化合物一样通过其特定的转运体系统被吸收和参与机体的代谢，具有无毒副作用的特性；
（3）荧光共轭化合物成像清晰，直观、精确定位肿瘤位置：荧光共轭化合物通过主动转运进入细胞内，除了能够清晰显示细胞轮廓和排列方式，甚至可以清晰辨别细胞质和细胞核，成像质量超出目前临床上运用的所有荧光染料，结合荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光内镜、激光共聚焦内镜等检测设备以图像直观地显示荧光标志物的分布情况；
（4）荧光标记物直接肠道染色，方法快捷：以往的荧光对比剂如荧光素钠是通过静脉注射进入体内，其前期准备工作及药物作用时间长，用荧光标记的生物小分子可行直接局部喷洒染色，在检查的同时对靶点直接喷洒，其经细胞膜主动转运至胞内后荧光成像，反映疾病状态，染色方法方便快捷；
（5）荧光共轭化合物的免疫原性和毒性低：荧光标记的小分子化合物多是人体正常吸收的脂肪酸或它们的衍生物，对人体无毒副作用，在机体引起的免疫和过敏反应只可能是起标记作用的荧光素物质，所以优选已经用于人体的无毒副作用的荧光素；
（6）荧光共轭化合物发现肿瘤组织简便易行，能广泛应用于临床：利用肿瘤细胞和正常细胞对荧光共轭化合物的吸收代谢的差异，能在细胞水平更加精确地辨别肿瘤与非肿瘤组织，方法简便易行，不仅可以指导内窥镜下靶向活检，也可以广泛应用于临床，制备检测人类肿瘤及癌前疾病的药物或者示踪试剂，荧光共轭化合物可以被制作成片剂、胶囊、药丸，粉末形式以方便口服或把其溶解在水溶性丙二醇或氯化钠溶液内形成的无菌溶液或悬液进行肠外注射，可以制成药膏形式局部的应用或制成栓剂进行直肠用药。
附图说明
以下利用附图对本发明做进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1为实施例1中流式细胞仪测定得到的Fluorescein sodium-FA与硬脂酸C18：0在不同肠癌细胞株中的吸收竞争对比柱状图。
图2为实施例1中荧光显微镜观察Fluorescein sodium-FA在正常小鼠结肠粘膜的活体吸收对比图，从左到右依次为：HE染色图、Fluorescein sodium-FA荧光图（染细胞质）、DAPI荧光图（染细胞核）、Fluorescein sodium-FA与DAPI合成图。
图3为实施例1中荧光显微镜观察Fluorescein sodium-FA在正常小鼠死亡30min条件下的吸收对比图，从左到右依次为：HE染色图、Fluorescein sodium-FA荧光图、DAPI荧光图、Fluorescein sodium-FA与DAPI合成图。
图4为实施例1中小鼠化学诱导结肠癌模型活体吸收Fluorescein sodium-FA后在HE染色及荧光显微镜下的成像图，其中Fig1.为放大倍数40X下的小鼠化学诱导癌结肠，Fig2.为放大倍数200X下小鼠的炎症部位及正常结肠黏膜部位HE染色及荧光显微镜下的成像对比（从左到右依次为：HE染色图、Fluorescein sodium-FA荧光图、DAPI荧光图、Fluorescein sodium-FA与DAPI合成图）；Fig3为放大倍数200X下的小鼠腺癌部位HE染色及荧光显微镜下的成像对比（从左到右依次为：HE染色图、Fluorescein sodium-FA荧光图、DAPI荧光图、Fluorescein sodium-FA与DAPI合成图）。
图5为激光共聚焦内镜下，不同荧光染料（左图：Fluorescein sodium-FA，中图：对照组染色剂NBD标记的脱氧葡萄糖（2-NBDG），右图：对照组染色剂吖啶黄）在小鼠正常结肠黏膜的荧光成像对比。
图6为实施例1中激光共聚焦显微内镜下，Fluorescein sodium-FA在小鼠化学诱导结肠癌模型的不同时期（左图：正常结肠，中图：低级别上皮内瘤变，右图：腺癌）结肠黏膜的吸收对比图。
图7为实施例1中激光共聚焦显微内镜下，Fluorescein sodium-FA在正常人体结肠黏膜（左）、人ESD术后结肠腺瘤（中）、腺癌肿瘤标本（右）的吸收对比图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 由荧光分子（荧光素钠，发射波长525nm，绿色荧染料）和游离脂肪酸（十八烯酸：碳18单不饱和脂肪酸）通过在十八烯酸的碳9位置以C-O连接生成荧光共轭化合物（记为Fluorescein sodium-FA，下同），所生成的Fluorescein sodium-FA具有类似原荧光素分子的荧光，其制备方法如下：
（1）在氮气保护下，将荧光素钠与巯基丙酸按摩尔比1:0.13，将0.1mol在荧光素钠与0.13mol巯基丙酸于50℃下搅拌直到形成溶液，在溶液中加入荧光素钠摩尔质量0.2‰（0.02mmol）的氯化铪(IV)四氢呋喃络合物(1:2)、20ml的甲苯，接入分水器，在130℃下分水回流16h，反应结束，减压蒸馏，除去甲苯，获得中间产物；
（2）在氮气保护下，按十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈混合物的摩尔比为：1:5:0.3的比例，往干燥的烧瓶中依次加入0.1mol十八烯酸、0.5mol中间产物、0.03mol偶氮二异丁腈、以及150ml甲苯，在80℃反应48h，反应结束将产物沉淀于乙醇水溶液，离心分离后在50℃下真空干燥，即制得荧光素钠标记的十八烯酸Fluorescein sodium-FA。
以所制得的Fluorescein sodium-FA为例进行以下实验以说明其应用效果。
1、Fluorescein sodium-FA与硬脂酸C18：0在不同肠癌细胞株中的吸收竞争实验，步骤如下：
（1）选取生长于六孔板处于对数生长期的不同肠癌细胞株HT29、SW480、HCT116、LS174T，时间点为30min标记流式管，每组3个复孔；
（2）用HBSS缓冲液及0.1% 的无脂肪酸小牛白蛋白（BSA）溶液预混，配制终浓度为1uM的Fluorescein sodium-FA，同时用0.1%BSA溶液分别配制0.15uM、1.5uM、15 uM的硬脂酸混合液，上述两种液体等体积混匀；
（3）向不同的肠癌细胞株培养板内加入1ml上述混合液，37度温箱孵育30min；30min后向里加入2ml预冷的PBS，并迅速插入冰盒内；
（4）消化细胞株、分别用HBSS重悬，4度离心机需先预降温到4度，然后进行离心，以2000转/分离心5分钟；离心结束，上流式细胞仪检测细胞吸收荧光素强度。
实验结果如图1所示，结果显示，硬脂酸C18：0能很好的抑制Fluorescein sodium-FA的吸收，两者有共同的长链脂肪酸转运载体，说明Fluorescein sodium-FA为天然脂肪酸的类似物。
2、正常小鼠结肠粘膜活体及死亡30min条件下Fluorescein sodium-FA的吸收实验，步骤如下：
（1）小鼠禁食1天，确保小鼠肠道清洁，戊巴比妥0.01g/ml腹腔注射麻醉Balb/C小鼠，剂量为6-7ul/g（死亡小鼠即断颈处理30min后直接打开肠道）；
（2）待小鼠麻醉成功后，打开小鼠腹腔，找到回盲瓣，间断分离3段长约1cm的结肠，将分离的肠段两端用手术缝线结扎，结扎程度以荧光染料不能通过结扎口，同时不影响肠管血运为好。用1ml注射器吸取100ul 200uM的Fluorescein sodium-FA混合液，注射入结扎好的肠段。对照组染色剂为0.02%吖啶黄及500uM的染色剂NBD标记的脱氧葡萄糖2-NBDG；
（3）室温孵育10min后，拆除两侧缝线，剪开肠壁用PBS冲洗滴染部位2次，每次3min，然后有经验内镜医师用激光共聚焦显微内镜观察结肠，再根据共聚焦成像图片判断肿瘤或正常部位，用吸取了印度墨汁的29g注射器精确定位经内镜医师判断过的检查部位，标记部位号码；
（4）将经内镜医师共聚焦内镜发现并标记好的标本，进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察和HE染色后显微镜下观察，得到的HE染色玻片，予经验丰富的病理医师诊断，得出“金标准”结果判断正常与肿瘤组织；综合HE染色结果和激光共聚焦显微内镜下和荧光显微镜下的结果，判断结肠种植瘤肿瘤细胞对Fluorescein sodium-FA的吸收情况。
实验结果如图2、3、5所示，图2为正常的小鼠结肠，由于吸收了大量的Fluorescein sodium-FA，荧光强度大，图3为死亡小鼠的结肠，几乎不吸收Fluorescein sodium-FA，荧光强度极弱。说明Fluorescein sodium-FA是主动转运进入细胞内，只能在活性的组织细胞成像。图5所示：共聚焦显微内镜下，Fluorescein sodium-FA被正常结肠黏膜吸收后，进入细胞质，清晰显示细胞核、腺体的轮廓，对照组染色剂2-NBDG几乎不被正常黏膜吸收，而对照组染色剂吖啶黄能进入细胞质和核，核质边界混淆，干扰细胞形态判断。
3、小鼠化学诱导结肠癌对Fluorescein sodium-FA的吸收实验，步骤如下：
（1）选用6-8周Balb/C雄性小鼠，待小鼠适应环境后，第一天腹腔注射AOM 12.5mg/kg，休息一周后，喂含3%DSS（葡聚糖硫酸钠）的水溶液7天（正常食物饲养），而后休息14天，如此重复3个循环；
（2）戊巴比妥0.01g/ml腹腔注射麻醉Balb/C小鼠剂量为6-7ul/g，约5 min后，打开小鼠腹腔，找到远端结肠几近直肠，用镊子轻轻分离约1cm长的肠段保证肠管内无内容物，而后用两根手术缝线将分离肠段扎闭，松紧适宜，用1ml注射器从结肠浆膜层穿刺，向扎闭肠管内注射100ul 200uM的Fluorescein sodium-FA，10min后松开两端的缝线，剪开肠道，用PBS冲洗干净表面残留的荧光素，于激光共聚焦内镜下观察，精确定位经内镜医师判断过的检查部位，标记部位号码；
（3）将经内镜医师共聚焦内镜发现并标记好的标本，进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察和HE染色后显微镜下观察，得到的HE染色玻片，予经验丰富的病理医师诊断，得出“金标准”结果判断正常与肿瘤组织；综合HE染色结果和激光共聚焦显微内镜下和荧光显微镜下的结果，判断结肠癌肿瘤细胞对Fluorescein sodium-FA的吸收情况。
结果如图4、6所示，图4所示：荧光显微镜下，Fluorescein sodium-FA在同一只诱导癌小鼠正常及腺癌部位吸收差异明显。荧光显微镜下正常部位吸收较多的荧光物质，荧光强度大，而腺癌部位吸收极少的Fluorescein sodium-FA，荧光强度很弱。图6所示，共聚焦显微内镜下Fluorescein sodium-FA在小鼠正常、低级别上皮内瘤变、腺癌吸收的荧光强度逐渐减弱。
4、人体结肠腺瘤-结肠癌离体标本对Fluorescein sodium-FA的吸收实验，步骤如下：
（1）病人ESD术后，立即取结肠腺瘤或结肠癌标本放入锡箔纸包绕的六孔板内，滴取200uM Fluorescein sodium-FA直到完全覆盖标本，放入37度温箱；
（2）染色10分钟后，镊子夹出组织，用PBS冲洗两遍，用棉签将表面残余水擦干，与共聚焦内镜下观察，拍照；
（3）将经内镜医师共聚焦内镜发现并标记好的标本，进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察和HE染色后显微镜下观察，得到的HE染色玻片，予经验丰富的病理医师诊断，得出“金标准”结果判断正常与肿瘤组织；综合HE染色结果和激光共聚焦显微内镜下和荧光显微镜下的结果，判断结肠癌肿瘤细胞对Fluorescein sodium-FA的吸收情况。
实验结果如图7所示，在共聚焦显微内镜下，Fluorescein sodium-FA在人体结肠正常、腺瘤、腺癌组织中的吸收强度逐渐减弱。
实施例2 将实施例1制备得到的荧光共轭化合物Fluorescein sodium-FA制备成口服粉末，通过口服的方式给予人体，口服后，该荧光共轭化合物经主动转运进入人体细胞，且积聚在细胞内不被代谢。
口服10分钟后，以荧光内镜进行检测，由于正常细胞和肿瘤细胞对经过荧光素标记的游离脂肪酸吸收或代谢差异，正常细胞组织的吸收荧光强度是肿瘤组织的吸收荧光强度的3.4倍，在获得的荧光成像图中，暗区形式显示出肿瘤生长、浸润范围，实现将肿瘤细胞和正常细胞区分开来，从而发现癌前病变细胞或癌细胞。
实施例3 将实施例1制备得到的荧光共轭化合物Fluorescein sodium-FA制成的染色剂通过对待观察部位直接喷染（大肠癌中），在共聚焦内镜下，Fluorescein sodium-FA喷染 1分钟后即可显示地显示细胞的排列及异型性，相比传统的荧光素钠需要静脉注射入人体，直接喷染Fluorescein sodium-FA可明显减少患者使用后的副反应，同时直接喷染作用迅速加快了内镜医师的工作效率，适用于紧张、繁忙的临床工作，之前研究运用于临床直接喷染的吖啶黄，因其致癌性已被FDA禁用。直接喷染Fluorescein sodium-FA能通过“暗区”（吸收较少的脂肪酸）特异性的显示肿瘤部位，同时借助共聚焦内镜以及其主动转运进入细胞内，在细胞水平直观反映病变的类型、程度及分期，相当于“活体的免疫组化”，同时因为脂肪酸吸收减少在大肠癌早期即发生，故其可运用于早期大肠癌的筛查，且对于癌前病变以及炎症相关的肿瘤检测有重要意义，在目前国内外临床运用及科学研究领域未曾有任何染色剂可达到此效果，在其它上皮肿瘤：如胃癌、宫颈癌、膀胱癌等也可适用。
实施例4
（1）在氮气保护下，将荧光素钠与巯基丙酸按摩尔比1:0.1，将0.1mol在荧光素钠与0.1mol巯基丙酸于45℃下搅拌直到形成溶液，在溶液中加入荧光素钠摩尔质量0.2‰（0.02mmol）的氯化铪(IV)四氢呋喃络合物(1:2)、18ml的甲苯，接入分水器，在125℃下分水回流18h，反应结束，减压蒸馏，除去甲苯，获得中间产物；
（2）在氮气保护下，按十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈混合物的摩尔比为：1:4:0.4的比例，往干燥的烧瓶中依次加入0.1mol十八烯酸、0.4mol中间产物、0.04mol偶氮二异丁腈、以及120ml甲苯，在75 ℃反应50h，反应结束将产物沉淀于乙醇水溶液，离心分离后在50 ℃下真空干燥，即制得荧光素钠标记的十八烯酸Fluorescein sodium-FA。
实施例5
（1）在氮气保护下，将荧光素钠与巯基丙酸按摩尔比1:0.15，将0.1mol在荧光素钠与0.15mol巯基丙酸于45℃下搅拌直到形成溶液，在溶液中加入荧光素钠摩尔质量0.2‰（0.02mmol）的氯化铪(IV)四氢呋喃络合物(1:2)、18ml的甲苯，接入分水器，在135℃下分水回流15h，反应结束，减压蒸馏，除去甲苯，获得中间产物；
（2）在氮气保护下，按十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈混合物的摩尔比为：1:6:0.2的比例，往干燥的烧瓶中依次加入0.1mol十八烯酸、0.6mol中间产物、0.02mol偶氮二异丁腈、以及180ml甲苯，在85 ℃反应50h，反应结束将产物沉淀于乙醇水溶液，离心分离后在50 ℃下真空干燥，即制得荧光素钠标记的十八烯酸Fluorescein sodium-FA。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种荧光共轭化合物，其特征在于：该荧光共轭化合物由荧光分子标记游离脂肪酸构成，应用于检测癌前病变细胞或癌细胞；所述荧光分子选自荧光素钠、吖啶黄、罗丹明、氟硼荧染料、荧光染料NBD、丹磺酰、香豆素染料、菁染料中的任意一种；所述游离脂肪酸为长链饱和或单不饱和脂肪酸；所述标记是指通过化学反应使荧光分子与游离脂肪酸通过2~30个由C、N、O、P、S、Si中的任意一种或多种组成的线状、环状、苯环或者上述组合的连接基团连接；所述荧光分子的发射波长为400nm~1200nm。
2.根据权利要求1所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述荧光共轭化合物是由荧光素钠标记十八烯酸构成，荧光素钠在十八烯酸的碳9位通过C-O键与十八烯酸连接，其制备方法如下：
（1）在氮气保护下将荧光素钠与巯基丙酸按摩尔比1:0.1~0.15，在45~55℃下搅拌直到形成溶液，在溶液中加入荧光素钠摩尔质量0.2‰的氯化铪(IV)四氢呋喃络合物(1:2)、甲苯，然后在125~135℃下分水回流15~18h，反应结束，减压蒸馏，除去甲苯，获得中间产物；在氮气保护下，往干燥的烧瓶中依次加入十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈、甲苯，在75~85 ℃反应45~50h，反应结束将产物沉淀于乙醇水溶液，离心分离后在50℃下真空干燥，即制得荧光素钠标记的十八烯酸；所述十八烯酸、中间产物、偶氮二异丁腈混合物的摩尔比为：1:4~6:0.2~0.5。
3.根据权利要求2所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述步骤（1）中甲苯用量为：反应体系中每1mol荧光素钠的甲苯用量为180~200ml。
4.根据权利要求2所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述步骤（2）中甲苯用量为：反应体系中每1mol荧光素钠-SH的甲苯用量为250~300ml。
5.根据权利要求1或2所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述荧光共轭化合物制作成用于检测人类肿瘤及癌前疾病的药物、染色剂或示踪试剂。
6.根据权利要求5所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述的人类肿瘤包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤在内的恶性肿瘤；所述癌前疾病包括Barrett 食管、腺瘤性息肉、炎症性肠病。
7.根据权利要求5所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述药物包括医学上认可的片剂、胶囊、药丸、粉末、膏剂、栓剂或者把所述荧光共轭化合物溶解在水溶性丙二醇或氯化钠溶液中形成无菌溶液或悬液。
8.根据权利要求5所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述荧光共轭化合物在用于检测人类肿瘤及癌前疾病的药物中的含量为0.05~0.1%。
9.根据权利要求1所述的荧光共轭化合物，其特征在于：所述荧光共轭化合物吸收活体正常组织的荧光强度为其吸收肿瘤组织的荧光强度的1.5~9.8倍。
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