KR20180120220A - 난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도 - Google Patents

난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도 Download PDF

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Abstract

난소암을 특이 표적하는 생분해성 양친성 폴리머와 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 그 용도를 제공한다. 상기 생분해성 양친성 폴리머는 표적 분자에 결합되는 디티오카보네이트(dithiocarbonate) 모노머가 함유된 폴리머로 만들어진다. 상기 생분해성 양친성 폴리머로 제조된 폴리머 베시클은 외부 가교제 없이 스스로 가교할 수 있으며, 결합은 환원 민감성을 가지고 따라서 약물 제어 방출 시스템 (drug controlled release system)에 사용될 수 있으며, 나노 약물의 임상 적용에 유리하다.

Description

난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도
본 발명은 생분해성 폴리머 재료와 그 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 난소암 특이적으로 표적 생분해성 양친 성폴리머, 그로 인해 제조된 폴리머 베시클 및 난소암에 대한 표적 치료에 적용에 대한 것이고, 그것은 의료재료분야에 속한다.
생분해성 폴리머는 매우 독특한 성능을 가지고 있으며, 수술 봉합사, 뼈 고정장치, 생물 조직 공정 지지 재료(골격체, scaffolds), 약물 방출 제어 담체 등 생물 의학의 각 영역에서 광범위하게 사용된다. 합성된 생분해성 폴리머는 주로 지방족 폴리에스테르(폴리글리콜릭에시드 PGA, 폴리락틱에시드 PLA, 락틱-글리콜릭에시드 공중 합체 PLGA, 폴리카프로락톤 PCL), 폴리카보네이트(폴리트리메틸렌카보네이트 PTMC) 등이 미국 식약청(FDA)의 허가를 받은 가장 일반적으로 사용되는 생분해성 폴리머이다. 단, PTMC, PCL, PLA, PLGA 같은 현재의 생분해성 폴리머의 구조는 비교적 단일하고, 변형 가능한 작용기가 부족하여, 순환하는 안정한 약물 담체를 제공하는 것이 종종 어렵다. 폴리카보네이트의 분해산물은 주로 이산화탄소 및 중성 디올이며, 산성 분해산물은 생성되지 않는다. 그 중 기능성 고리형 카보네이트 모노머 및 고리형 에스테르류 모노머, GA 、LA와 ε-CL 등, 그리고 기타 고리형 카보네이트 모노머의 공중합으로 다른 성질의 생분해성 폴리머를 얻는다. 그 밖에, 선행기술에 의해 제조된 생분해성 폴리머로부터 얻어지는 생분해성 나노담체는 체내에서 순환이 불안정하다. 종양세포 흡수가 낮고, 세포 내 약물농도가 낮은 문제, 이것은 나노 약물의 약효를 낮추고, 독성 부작용을 초래한다. 기능성 생분해성 폴리머에 의해 제조된 미셀(micellar) 나노미터 약물은 체내 순환에 안정하다. 다만 소수성의 소분자 항암약물이 들어갈 수 있고, 침투능력이 뛰어난 친수성 소분자 항암약물에 대해서는 기능을 발휘할 수 없어 약물 운반체로서의 사용은 크게 제한된다. 암은 인류 건강을 위협하는 주범으로, 그 발병률과 사망률은 매년 상승하는 추세를 보인다. 난소암은 난소종양의 일종의 악성종양이고, 난소에서 자라는 악성종양을 의미한다. 그 중 90%~95%가 난소 원발성암이고, 그 외 5%~10%가 기타 부위에 먼저 발생한 암이 난소로 전이된다. 난소의 배아 발육으로 인해, 조직해부(분석)과 내분비 기능은 비교적 복잡하고, 그 발생한 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 난소 암의 초기 단계에서 특이 증상이 없기 때문에, 스크리닝효과는 제한적이고,그 조직 유형과 양성, 악성을 감별하는 것은 상당히 어렵다. 따라서 조기 진단이 비교적 어렵고, 난소암은 개복탐사술 중에 발견되는 종양의 30%만이 난소에 국한되어 있으며, 대다수는 이미 자궁 양측 부속기(난소 등), 대망막(greater omentum), 골반강(Pelvic) 각 기관으로 퍼져나가 있다. 진료 시 60~70%는 이미 말기이고, 말기 병례 치료 효과는 좋지 않다. 지금까지 난소암은 진단뿐만 아니라 치료까지 큰 난제였다. 따라서, 난소 암의 발병률은 자궁 경부암과 자궁 내막 암의 발병률보다 낮아 부인과 악성 종양에서 3위를 차지하지만, 사망률은 자궁 경부암과 자궁 내막 암의 합계를 초과하며 부인과 암에서 가장 높으며 여성 건강을 심각하게 위협하는 가장 큰 질환이다.
즉, 난소암은 높은 발생성의 여성 악성 종양이다. 발병된 사람의 절대 수가 많지는 않으나, 사망률이 높고, 특히 조기 발견이 어려워 조기 진단이 어렵고 대부분 이미 늦게 진단되며, 수술절제의 최적시기를 놓친다. 또한, 그 치료는 완치율이 낮고, 전이가 쉬우며 약제내성이 쉬운 특성을 갖는다. 나노약물은 전통 화학 치료 약물의 체내분포를 바꿀 수 있고, 종양 내 약물 침투도를 증가시키며, 치료 효과를 높이고, 난소암 치료의 열쇠이자 희망이다. DOXIL(pegylated liposomal doxorubicin)은 FDA 가장 빨리 사용 비준을 받은 리보솜 베시클 나노약물로, 난소암 치료에 임상 효과가 있다. 다만, DOXIL도 문제가 있다. 그 중 하나는, 최대내약용량(MTD)이 비교적 적고, 치료의 창(Therapeutic window)이 상대적으로 좁으며, 독 부작용의 문제가 쉽게 발현된다. 둘째, DOXIL은 EPR 효과 수동 표적 작용에 기반한 것으로 다른 종양의 거대한 개체 차이성으로 인해 나노약물을 하나의 통용되는 통일의 메커니즘을 이용하여 모든 종양 조직과 종양 세포에 운반하는 것이 매우 어렵다(참조: S Eetezadi, SN. Ekdawi, C. Allen, Adv. Drug Deliv Rev, 2015, 91, 7-22）. 다른 종양에 있어서, 다른 종양의 표면성질 차이는 매우 크고, 다른 환자에 있는 같은 종양의 차이도 매우 크다. 비록 같은 종양이라도 종양세포는 서로 같지 않다. 따라서 맞춤형 치료가 더욱 중요하다. 따라서, 우리는 목표 종양에 적합한 표적 체계를 맞춤형으로 설계해야 하며, 하나의 적응증에 활용하는 약물 활용을 다른 병증에 함부로 사용할 수 없다. 따라서 맞춤형 치료가 특히 중요하다. 그래서 종양 특이성을 구비하고, 나노약물의 기타 장점을 실현하며 종양 세포의 유효 약물의 침투도를 높이고, 체내외 치료 효과를 향상시키는 특정 종양의 능동 표적 나노약물을 연구 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 난소암 특이 표적의 생분해성 양친성 폴리머와 그로 인해 제조된 폴리머 베시클, 그리고 난소암 표적 치료 약물 제조에 있어서 항난소암 약물의 담체로 작용하는 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구체적 기술 방안은,
난소암 특이 표적의 생분해성 양친성 폴리머, 표적분자에 결합하는 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머로부터 제조되는 것으로서, 상기 표적분자는 GE11（폴리펩타이드), FA（엽산), transferrin（트랜스페린）또는 Herceptin 단백질이고; 상기 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학 구조식은 아래 구조식 중 하나이다.
식 Ⅰ
Figure pct00001
식 Ⅱ
Figure pct00002
그 중 R1 은 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
Figure pct00003
R2는 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
Figure pct00004
그 중, k는 113~170이고, x는 15~45이고, y는 80~300이고, m은 220~280이다.
본 발명이 공개한 디티오카보네이트 모너머를 함유하는 폴리머의 소수성 블록은 이황화 5원 고리 관능기를 함유하는 사이클릭 카보네이트 단원 사이드 체인을 구비한다. 디블록(diblock) 폴리머일 수 있다.
Figure pct00005
또한, 트리블록(tribolick) 폴리머일 수 있다.
Figure pct00006
바람직한 기술 방안으로, R1은 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
Figure pct00007
상기 R2는 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
Figure pct00008
상기 k는 113~170, X는 20~40, y는 125~250이다.
바람직하게는, 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학구조식이 식 Ⅰ일 때, 분자량은 30~55kDa이다. 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학구조식이 식 Ⅱ일 때, 분자량은 60~95kDa이다. 본 발명에서 공개하는 폴리머의 분자량은 조절 가능하며, 각 구조 단원(元)의 조성 및 비율은 자가 가교결합(self-crosslinking)를 형성하고, 안정한 폴리머 베시클 구조를 형성하는데 적합하다.
본 발명에서 공개하는 난소암 특이 표적 생분해성 양친성 폴리머는 생분해성을 가지고, 그 소수성 부분의 분자량은 친수성 부분의 분자량의 약 3배 이상이다. 용제 치환법, 투석법(透析法, dialysis method), 박막수화법(薄膜水化法) 등의 방법을 통하여 제조하여 폴리머 베시클 구조를 얻을 수 있다. 제조된 폴리머 베시클은 나노미터 크기이고, 입경 50~160 나노미터이며, 난소암 치료를 위한 약물의 담체로 작용할 수 있다. 베시클의 소수성 막에 소수성 소분자 항난소암 약물 파클리탁셀(paclitaxel(taxol)), 도세탁셀, 독소루비신, 올라파립, 제피티닙 등을 적재한다. 또한, 베시클의 큰 친수성 내강(lumen)에 친수성 항난소암 약물, 특히 친수성 소분자 항암약물인 독소루비신 하이드로클로라이드(Doxorubicin hydrochloride), 에피루비신 하이드로클로라이드 (Epirubicin hydrochloride), 이리노테칸 하이드로클로라이드(Irinotecan Hydrochloride)와 미톡산트론 하이드로클로라이드(Mitoxantrone Hydrochloride)을 적재할 수 있다. 이것은 기존의 양친매성 폴리머에서 형성된 미셀 담체가 소수성 약물만 적재하는 단점과 종래기술에서 높은 효율로 적재할 수 없었던 것을 극복하였고, 체내 순환 친수성 소분자 항암 약물의 적재 결함을 안정화시킨다.
또한 본 발명은 폴리머 베시클을 개시한다. 상기 디티오카보네이트 포함 폴리머 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머로부터 제조하여 얻을 수 있다. 또는 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머로부터 제조하여 얻을 수 있다. 또는 상기 디티오카보네이트 포함 폴리머 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머와 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머로부터 제조하여 얻을 수 있다. 예를 들어 상기 디티오카보네이트 포함 폴리머 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머와 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머는 다른 비율로 혼합될 수 있고, 다른 표적 밀도(비중)를 가지는 폴리머 베시클을 제조할 수 있다. 즉, 난소암 표적 자가 가교결합 베시클을 얻어 난소암 세포에 베시클 나노 약물의 섭취량을 증가시킬 수 있다. 또 상기 디티오카보네이트 포함 폴리머 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머에서 제조된 베시클의 외표면은 종양 세포 특이성 표적 분자와 결합하여 암세포 표적 베시클이 제조되고, 이로써 난소암 세포의 섭취량이 증가한다. 예를 들어, 베시클의 PEG 말단에 마이클 첨가(Michael addition) 또는 아실아미드화 반응(化反)에 의해 GE11, FA, transferrin 또는 Herceptin 등이 결합된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리머 베시클은 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머와 디티오카보네이트 포함 폴리머 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머로부터 제조되고, 질량 %는 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머의 용량이 1~40wt.%이다.
본 발명의 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머와 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머는 중합체는 물질을 첨가하지 않고 자체적으로 가교결합 할 수 있고, 자가 가교 폴리머 베시클을 얻을 수 있다. 폴리머가 약물 전달체로 사용될 때, 최적 표적과 치료 효과에 도달하기 위해서, 가장 기본적이고 가장 중요한 성능은 체내에서의 장기간 순환이다. 가교 구조 형성은 폴리머 담체가 체내에서 장기간 순환하는 데 필요한 과정이고, 종래 기술은 모두 가교제를 첨가하여 폴리머 나노 담체가 안정한 가교 구로를 이루게 하였다. 그러나 가교제의 첨가는 나노 약물 제조 공정의 복잡성을 증가시키고, 나노 약물의 생산 비용을 증가시키며, 약물의 최종 순도를 낮추어, 나노 약물 임상에 적용을 위한 대량 생산에 불리하고, 약물 적재 효율, 약물 방출 수준 에 영향을 줄 수 있으며 독성 부작용을 증가시키고 폴리머 적재 나노 약물의 생체 상용성(적합성)을 낮춘다. 본 발명에서 먼저 게시한 폴리머 구조는 외부 가교제가 없는 조건 하에서 자가 가교결합하고 베시클 소수성 막 내에 안정적인 화학 결합 구조가 형성되어 체내에서 안정적으로 장기 순환 할 수 있음에 따라 가교제의 부작용을 피할 뿐만 아니라, 약을 적재한 폴리머 베시클이 종양에 도달하여 암세포에 진입 식균(endocytosis)한 후, 세포 내에서 대량 환원성 물질 존재 환경 하에 신속하게 가교결합을 해소하고 최대량으로 약물을 방출하여 효과적으로 난소암세포를 죽일 수 있다. 동시에 자가 가교결합 폴리머의 안정성은 가교제에 의해 가교된 폴리머 베시클과 동등하거나 우수하며, 보다 중요하게는 본 발명은 일부 약물에 대한 가교제의 교란(방해, 간섭)을 피했다. 자가 가교결합 폴리머 베시클의 약물 적재 이용에 성공은, 종래 소분자 약물의 부작용을 피할 뿐만 아니라, 항암 약물의 이용 공간을 확장하고 체질에 큰 차이가 있는 각 개체에 활용이 가능하다.
본 발명은 또한 난소암을 치료하는 나노 약물의 제조에 있어서 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머의 용도를 개시한다. 또한, 본 발명은 난소암 치료 약물 제조에 있어서 상기 폴리머 베시클의 용도를 개시한다. 특히, 난소암 치료 약물 제조에 있어서 자가 가교 폴리머 베시클이 담체로서의 용도를 개시한다. 자가 가교 폴리머 베시클은 가교제의 사용을 비하고 약물 안정성을 더욱 향상시키며, 약물 조제 단계를 줄인다. 본 발명 폴리머에 기초하여 제조된 항난소암 나노 약물은 베시클 항난소암 나노 약물이다.
상기 방안의 실시에 따라 본 발명과 종래기술의 비교하여 이하의 장점이 있다.
1. 본 발명에서 개시된 디설파이드를 포함하는 사이드 체인의 생분해성 양친매성 폴리머는 생분해성, 탁월한 난소암 표적성을 가지고, 폴리머 베시클을 제조할 수 있는데, 다양한 성질의 약물을 적재하고, 가교제를 첨가하지 않고 자가 가교결합하여 안정한 자가 가교결합 폴리머 베시클 나노 약물을 형성할 수 있다. 이에 따라, 종래 기술에서의 나노 약물의 체내 순환의 불안정, 약물의 쉬운 조기 방출 및 독성 부작용의 결함이 극복된다.
2. 본 발명에 의해 개시된 자가 가교결합 베시클 나노 약물의 가교결합은 가역성이 있다. 즉 체내에서의 장기간의 순환을 지지하며, 난소암 세포에서 고도로 농축될 수 있지만, 난소암 세포 내에 들어간 후에 신속하게 결합을 해소하여 약물을 방출할 수 있다. 효과적인 특이적 난소암 세포 사멸을 실현할 수 있고 독성 부작용이 없다. 종래 기술의 가교 나노 약물이 지나치게 안정하고 세포 내에서 약물 방출이 늦으며 약물 내성을 일으키는 결함을 극복한다.
3. 본 발명에서 개시된 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머는 가교결합제를 첨가하지 않고 자가 가교결합 베시클을 제조할 수 있으며, 그 방법이 간단하여 종래 기술의 가교 나노 약물 제조시 필수적으로 가교제 등 물질을 첨가 및 복잡한 조작과 제조공정 등의 결함을 극복함으로써, 나노 약물의 임상 적용에 유리하다.
4. 본 발명에 개시된 난소암 특이 표적하는 생분해성 양친매성 폴리머의 자가 조립에 의해 제조된 자가 가교결합 폴리머 베시클은 친수성 소분자 항암 약물의 방출 제어 시스템에 사용될 수 있다. 이로써 기존의 생분해성 나노 미셀 담체가 단지 소수성 소분자 약물에 활용되는 결함과 종래 기술은 고효율 적재가 불가능한 것을 극복하였으며 체내 순환하는 친수성 소분자 항암물질의 결함을 안정하게 하였다. 더욱이, 난소암을 표적하는 자가 가교결합 베시클을 제조할 수 있고, 난소암의 고효율 표적 치료 방면에서 더욱 광범위하게 활용되는 가치가 있다.
도 1은 실시예 15에서 가교결합된 베시클 PEG5k-P(CDC5.8K-co-TMC23k)의 입경 분포 (A) 및 전자 투영 현미경 영상 (B), 가교결합 베시클 안정성 검사 (C) 및 감응도 검사 (D) 도이다.
도 2는 실시예 20에서 DOX·HCl 적재 가교결합 베시클 PEG5k-P(CDC5,8k-co-TMC23k)의 체외 방출을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 20에서 DOX·HCl 적재 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 체외 방출을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 21에서 SKOV3 난소암 세포에 대하여 표적 가교결합된 베시클 GE11-CLPs의 독성 결과 도면이다
도 5는 실시예 22에서 SKOV3 난소암 세포에 대하여 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 독성 결과 도면이다.
도 6은 실시예 22에서 SKOV3 난소암 세포에 대하여 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 반치사량 독성 결과 도면이다.
도 7은 실시예 24 중 SKOV3 난소암 세포에 대하여 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 세포 식균 결과 도면이다.
도 8은 실시예 29 중 마우스에 대하여 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 혈액 순환 결과 도면이다.
도 9는 실시예 30 중 피하 난소암 마우스에 대한 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 생물 분포 결과 도면이다.
도 10은 실시예 31을 위하여 마우스에 대한 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 최대 투약 허용량 결과 도면이다.
도 11은 실시예 32 중 피하 난소암 마우스에 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 다회 투여 치료 도면으로, A는 종양 생장곡선이고, B는 마우스 치료 후의 종양 사진이며, C는 체중 변화이고, D는 생존 곡선이다.
도 12는 실시예 33 중 피하 난소암 마우스에 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 단회 투여 치료 도면으로, A는 종양 생장곡선이고, B는 마우스 치료 후의 종양 사진이며, C는 체중 변화 곡선이고, D는 생존 곡선이다.
이하에서 실시예와 첨부 도면과 관련하여 본 발명에 대하여 더 설명한다.
실시예 1. 디설파이드 5 원 고리 관능기를 함유하는 싸이클릭 카보네이트 모노머(CDC)의 합성
일수화 수황화나트륨 (28.25g, 381.7mmol)을 400mL의 N,N-디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF)에 용해시키고, 완전히 녹을 때까지 50°C에서 가열한다. Dibromoneopentyl glycol(20g, 76.4mmol)을 적가하여 48시간 동안 반응시킨다. 반응물을 감압하에 증류시켜 용제 DMF를 제거한 다음, 200mL의 증류수로 희석하고, 250mL의 에틸아세테이트로 4회 추출하고, 최종적으로 유기상을 회전 증발시켜 황색 점성 화합물 A를 수득 하였다. 수율 70%;
테트라히드로푸란(THF) 400mL에 용해 된 화합물 A를 공기 중에서 24시간 동안 방치하고, 분자간 티올기(메르캅토기)를 황-황 결합으로 산화시켜 화합물 B를 수득 하였다. 수율> 98 %;
질소 보존 하에 화합물 B(11.7g, 70.5mmol)를 무수 THF(150mL)에 용해시키고, 완전히 용해될 때까지 저었다. 그런 다음 0°C로 식혔다. 에틸클로로포르메이트(15.65mL, 119.8mmol)를 넣고, 이어서, Et3N(22.33mL, 120.0mmol)을 적가하였다. 첨가가 완료된 후, 얼음 수조에서 4 시간 동안 추가로 반응시켰다. 반응이 완료된 후, Et3N·HCl을 여과해내고, 여과액을 회전식 증발기로 농축하고, 에틸 에테르를 여러 번 재결정(recrystallization)하여, 디설파이드 5 원 고리 작용기를 함유하는 황색 결정체의 싸이클릭 카보네이트 모노머(CDC)를 수득하였다. 수율 64%.
실시예 2. 디블록 폴리머 PEG5k-P (CDC5.8k-co-TMC23k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 1g (0.52mmol) 및 트리메틸렌카보네이트 (TMC) 0.4g (4.90mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 5mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.12g (0.02mmol) CH3O-PEG5000과 0.5mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L) 를 넣은 다음 반응기를 밀봉하고, 상자에서 꺼내어, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, Acetic acid가 반응을 종결시키고, 차가운 에틸에테르에 침전시키고, 마지막으로 여과하고 진공 건조시켜 PEG5k-P (CDC5.8k-co-TMC23k)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 2.08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3.08(s, -CCH2, 3.30(m, -OCH3), 3.65 (-OCH2CH2O-) , 4.28 (t, -COCH2CH2CH2O -), 4.31 (m, -CCH2). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=114, x=30.2, y=225.5로 계산된다. GPC 측정 분자량: 45.6 kDa, 분자량 분포: 1.53.
Figure pct00009
실시예 3. 디블록 폴리머 Mal-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC19.2k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 1g (0.52mmol) 및 TMC 0.4g (3.85mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 3mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.12g (0.02mmol) Mal-PEG6000과 0.1mol/L의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L)을 넣은 다음 반응기를 밀봉하고, 상자에서 꺼내어, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, Acetic acid가 반응을 종결시키고, 차가운 에틸에테르에 침전시키고, 마지막으로 여과하고 진공 건조시켜 Mal-PEG6k-P(CDC4.8k-co-TMC 19.2k)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 2.08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3.08(s, -CCH2, 3.30(m, -OCH3), 3.65 (t, -OCH2CH2O-) , 4.28 (t, -COCH2CH2CH2O -), 4.31 (m, -CCH2), 그리고 6.70 (s, Mal). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=136, x=25, y=l88로 계산된다. GPC 측정 분자량: 38.6 kDa, 분자량 분포: 1.42.
Figure pct00010
실시예 4. 디블록 폴리머 NHS-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 1g (0.52mmol) 및 TMC 0.4g (4.12mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 5mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.11g (0.017mmol) NHS-PEG6500과 0.5mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L)을 넣은 다음 반응기를 밀봉하고, 상자에서 꺼내어, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, Acetic acid가 반응을 종결시키고, 차가운 에틸에테르에 침전시키고, 마지막으로 여과하고 진공 건조시켜 NHS-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 2.08 (t, -COCH2CH2CH2O-), 3.08 (s, -CCH2, 3.30(m, -OCH3), 3.65 (-OCH2CH2O-), 4.28 (t, -COCH2CH2CH2O-), 4.31 (m, -CCH2), 그리고 2.3 (s, NHS). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=148, x=31.3, y=221.6로 계산된다. GPC 측정 분자량: 51.3 kDa, 분자량 분포: 1.43.
Figure pct00011
실시예 5. 디블록 폴리머 PEG7.5k-P(CDC5. 8k-co-TMC20.0k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 60mg (0.31mmol) 및 TMC 0.2g (1.93mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 1mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 75mg (0.01mmol) CH3O-PEG75000과 0.5mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L)을 넣은 다음, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, PEG7.5k-P(CDC5. 8k-co-TMC20.0k)를 얻었다. 반응식과 1H NMR 특징 피크는 실시예 2와 동일하다. 핵자성(核磁)은 아래 식 k=170, x=30, y=196으로 계산된다. GPC 측정 분자량: 54.5 kDa, 분자량 분포: 1.36.
실시예 6. 디블록 폴리머 PEG5k-P(CDC3.9k-co-LA18.0k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 0.08g (0.42mmol) 및 락티드(LA) 0.3g (2.1mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 2mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.1g (0.02mmol) CH3O-PEG5000과 0.1mol/L의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mL)을 넣은 다음, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, PEG5k-P(CDC3.9k-co-LA18.0k)를 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.59 (s, -COCH(CH3)O-), 3.08(s, -CCH2), 3.30(m, -OCH3), 3,65(-OCH2CH2O-), 4.31(m, -CCH2), 5.07(s, -COCH(CH3)O-). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=114, x=20, y=125로 계산된다. GPC 측정 분자량: 34.3 kDa, 분자량 분포: 1.32.
Figure pct00012
실시예 7. 디블록 폴리머 PEG6.5k-P(CDC5.8k-co-LA28.3k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 0.1g (0.57mmol) 및 LA 0.5g (3.5mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 3mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.11g (0.015mmol) CH3O-PEG6500과 0.5mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L)을 넣은 다음, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, PEG6.5k-P(CDC5.8k-co-LA28.3k)를 얻었다. 반응식과 1H NMR 특징 피크는 실시예 6과 동일하다. 핵자성(核磁)은 아래 식 k=148, x=30, y=190로 계산된다. GPC 측정 분자량: 42.4 kDa, 분자량 분포: 1.43.
실시예 8. 디블록 폴리머 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 모노머 0.1g (0.52mmol) 및 LA 0.5g (5.56mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 4mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.15g (0.025mmol) Mal-PEG6000과 0.1mol/L의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mL)을 넣은 다음, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)를 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.59 (s, -COCH(CH3)O-), 3.08(s, -CCH2), 3.30(m, -OCH3), 3,65(t, -OCH2CH2O-), 4.31(m, -CCH2), 5.07(s, -COCH(CH3)O-), 그리고 6.70(s, Mal). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=136, x=20, y=129로 계산된다. GPC 측정 분자량: 32.5 kDa, 분자량 분포: 1.44.
Figure pct00013
실시예 9. 트리블록 폴리머 P(CDC3.8k-co-TMC18.8k)-PEG10k-P(CDC3.8k-co-TMC18.8k)의 합성
질소 환경 하에, 0.8g (7.84mmol)의 TMC와 0.16g (0.83mmol)의 CDC를 디클로로메탄(dichloromethane) 8mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.2g (0.04mmol)의 HO-PEG-OH10000과 1mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.2mol/L)을 넣은 다음, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, 트리블록 폴리머 P(CDC3.8k-co-TMC18.8k)-PEG10k-P(CDC3.8k-co-TMC18.8k)를 얻었다. 1H NMR 특징 피6크는 실시예 2와 동일하다. 핵자성(核磁)은 아래 식 m=227, x=20, y=184로 계산된다. GPC 측정 분자량: 92.3 kDa, 분자량 분포: 1.4.
Figure pct00014
실시예 10. 디블록 폴리머 NHS-PEG7.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k)의 합성
질소 환경 하에, CDC 0.1g (0.52mmol) 및 LA 0.4g (2.8mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 3mL에 용해시키고, 밀봉된 반응기에 넣은 후, 0.013mmol NHS-PEG7500과 1mL의 촉매제 bis(bis(trimethylsilyl)amino)zinc dichloromethane 용액 (0.1mol/L)을 넣은 다음, 반응기를 밀봉하고, 상자에서 꺼내어, 40 ℃의 오일 배스에 반응 2 일 후, 실시예 2와 동일하게 처리하여, NHS-PEG7.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k)를 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): 1.59 (s, -COCH(CH3)O-), 3.08(s, -CCH2), 3.30(m, -OCH3), 3,65(t, -OCH2CH2O-), 4.31(m, -CCH2), 5.07(s, -COCH(CH3)O-), 그리고 2.3(s, NHS). 핵자성(核磁)은 아래 식 k=170, x=20, y=96으로 계산된다. GPC 측정 분자량: 42.3 kDa, 분자량 분포: 1.45.
Figure pct00015
상기와 유사한 제조 방법을 채택하여 다양한 디티오카보네이트 모노머를 포함하는 폴리머를 제조할 수 있다. 원료비율과 특성을 표1에 게시하였다.
표 1. 각 폴리머 제조 조건, 산물의 핵자성과 GPC 특성 결과
Figure pct00016
실시예 11. 표적 폴리머 transferrin-PEG7.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k)의 합성
트렌스페린 transferrin 커플드(Coupled, 偶) 폴리머의 합성은 2 단계로 나눠진다. 제1 단계는 실시예 8과 같이 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)를 제조하였다. 제2 단계는 transferrin이 마이클 반응을 통해 그것과 결합되는 것이다. 먼저 상술한 폴리머 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)를 DMF에 용해시켰다. 2배 몰량의 transferrin을 첨가하고, 30℃에서 2일간 반응시키고, 투석, 동결 건조하여, transferrin-PEG7.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k)를 얻었다. transferrin의 접지율(接枝率)은 핵자성 및 BCA 단백질 키트 시험에 의해 95 %로 측정 계산되었다.
실시예 12. 표적 폴리머 Herceptin-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)의 합성
인류 표피 생장 인자 항체 Herceptin 커플드(Coupled, 偶) 폴리머의 합성은 3단계로 나눠진다. 제1 단계는 실시예 8에 따라 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)를 제조하였다. 제2 단계는 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)와 cysteamine 마이클 첨가 반응으로 말단기를 아미노기로 전환시켰다. 제3 단계는 FA의 카르복실기가 아실아미드화 반응에 의해 그것과 결합하는 것이다. 먼저 전 단계에서 얻어진 폴리머를 0.5ml DMF에 용해시켰고, 2ml의 붕산완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 2배 몰량의 Herceptin을 첨가하였다. 30℃에서 2일간 반응시키고, 투석, 동결 건조하여, 최종 산물 Herceptin-PEG6k-P(CDC3.6k-co-LA18.6k)을 얻었다. FA 접지율은 핵자성 및 BCA 단백질 키트 시험에 의해 96%로 측정 계산되었다.
실시예 13. 표적 폴리머 FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)의 합성
엽산(FA) 커플드 폴리머의 합성은 2단계로 나눠진다. 제1 단계는 실시예 4에 따라 NHS-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 제조하였다. 제2 단계는 FA의 아미노기가 아실아미드화 반응에 의해 그것과 결합하는 것이다. 먼저 상술한 폴리머를 DMF에 용해시켰다. 2배 몰량의 FA를 첨가하고, 30℃에서 2일간 반응시킨 후, 투석하여 유리 FA를 제거하고, 동결 건조하여 FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 얻었다. 핵자성 측정 시험을 통하여 FA 접지율은 88%로 측정되었다.
실시예 14. 표적 폴리머 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)의 합성
고리형 폴리펩타이드 YHWYGYTPQNVI(GE11) 커플드 폴리머의 합성은 2 단계로 나눠진다. 제1 단계는 실시예 4에 따라 NHS-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 제조하였다. 제2 단계는 GE11의 아미노기가 아실아미드화 반응에 의해 그것과 결합하는 것이다. 먼저 상술한 폴리머를 DMF에 용해시키고, 2배 몰량의 GE11을 첨가하고, 30℃에서 2일간 반응시킨 후, 투석하여 유리 GE11을 제거하고, 동결 건조하여 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 얻었다. GE11 접지율은 핵자성 및 BCA 단백질 키트 시험에 의해 96%로 측정 계산되었다.
실시예 11 내지 13의 방법에 따르면, 실시예 2 내지 10 및 표 1의 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머 결합 표적 분자를 사용하여 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머를 제조할 수 있다.
실시예 15. 자가 가교결합 폴리머 베시클 제조
용제 치환법을 채용하여 폴리머 베시클을 제조하였다. 100μL의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)의 DMF 용액(10mg/mL)을 900μL 인산염 완충용액(PB, 10 mM, pH 7.4)에 적가하고, 37℃(200rpm)에서 셰이커에 하룻밤 방치하여 자가 가교결합을 진행한 후, 투석주머니(MWCO 7000)에 넣고 하룻밤 투석하였다. 5회 매체 PB를 변경하였다. 도 1은 상술한 자가 가교결합 베시클 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k) 입경분포(A)와 전자 투영 현미경 영상 (B), 가교결합 베시클 안정성 검사 (C) 및 감응도 검사 (D) 도이다. 얻은 자가 가교결합 베시클의 치수는, 동적 광산란 입자 크기 분석기(DLS)를 통해 측정한 형성 나노미터 베시클은 130nm이고, 도 1A에 도시된 바와 같이, 입도 분포는 좁다. 도 1B를 통해 알 수 있듯이, TEM 측정 나노미터 입자는 중공의 베시클 구조이다. 자가 자교 베시클은 고배율 희석과 소태아혈청 존재 하에서 여전히 변하지 않는 입경과 입경분포를 유지한다(도 1C). 다만 모의 종양세포 복원 환경에서 빠르게 방출하고 가교를 풀었다(도 1D). 이로부터 알 수 있듯이, 얻어진 베시클은 자가 가교결합하고, 환원 민감성 가교 해제 성질을 가진다. 상기와 동일한 제조 방법을 채용하여 PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k)는 자가 가교결합 나노미터 베시클을 형성할 수 있고 입경은 100nm, 입경분포는 0.1이다.
실시예 16. 투석법과 박막수화법을 채용하여 자가 가교결합 폴리머 베시클 제조
투석법을 채용하여 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조하였다. 100μL의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)의 DMF 용액(10mg/mL)을 투석주머니(MWCO 7000)에 넣고, PB 중에, 37℃(200rpm)에서 셰이커에 하룻밤 방치하여 자가 가교결합을 진행한 후, PB 중 24시간동안 투석하였고, 5회 용액을 변경하였다. DLS로 측정한 가교결합 베시클은 약 60nm이고, 입경분포는 0.08이다.
박막수화법을 채용하여 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조하였다. 2mg의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)을 0.5mL의 Dichloromethane 또는 Acetonitrile 같은 저비점 유기용제에 녹이고, 25mL의 뾰족한 바닥 플라스크에서, 회전 김이 바닥부에서 박막을 형성한 후, 다시 0.1mBar의 진공 상태에서 24 시간 동안 추출하였다. 2mL의 PB(10mM, pH7.4)를 첨가하고 37℃에서 박막을 교반하여 표면에서 박리하였고, 분쇄, 20분 (200rmp) 초음파 처리하였다. 교반은 24시간 동안 계속되었고, 얻어진 베시클은 자가 가교결합 하였다. DLS 측정 자가 가교결합 베시클의 치수는 약 160nm이고, 입경분포는 0.24이다.
실시예 17. PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)와 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)에 기반한 자가 가교결합 베시클 GE11-CLPs의 제조
실시예 14에서 얻어진 표적 폴리머 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)와 실시예 2에서 얻어진 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)를 혼합하여 DMF에 용해시켰다. 실시에 15의 용제 치환법을 채용하여 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조하였다. 표적 폴리머의 PEG 분자량은 비표적 PED보다 길어야 하고, 표적 분자를 더 잘 수령하는 표면을 확보한다. 2개를 서로 다른 비율로 혼합하여 표면에 다른 표적 분자 함량을 가지는 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs를 제조할 수 있다. 본 실시예의 표적 폴리머 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)의 용량은 10~30wt.%이다. DLS로 측정한 제조된 자가 가교결합 폴리머 베시클의 치수는 약 85~130nm이고, 입경분포는 0.01~0.20이다.
실시예 18. FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)와 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)에 기반한 자가 가교결합 베시클 FA-CLPs의 제조
1.6mg의 실시예 2에서 얻어진 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k) DMF 용액(10mg/mL)과 0.4mg의 실시예 13에서 얻어진 FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 0.5mL의 Dichloromethane 또는 Acetonitrile 같은 저비점 유기용제에 녹이고, 실시예 17의 박막수화법을 채용하여 제조하여 얻어진 자가 가교결합 폴리머 베시클은 약 88nm이고, 입경분포는 0.08이다. 2개를 서로 다른 비율로 혼합하여 표면에 다른 표적 분자 함량을 가지는 자가 가교결합 폴리머 베시클 FA-CLPs를 제조할 수 있다. FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)의 용량은 5~30wt.%이다. 제조된 자가 가교결합 폴리머 베시클의 치수는 약 85~130nm이고, 입경분포는 0.01~0.20이다.
실시예 19. 표면에 transferrin이 결합된 자가 가교결합 베시클 transferrin-CLPs의 제조
실시예 8에 의해 제조된 Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-LA18.6k)와 P(CDC3.8k-LA18. 8k)-PEG4k-P(CDC3.8k-LA18.8k)를 혼합한 후, 4M 붕산 완충액(pH 8.0) 0.5mL를 가하여 용액 pH를 7.5~8.0으로 맞춘 다음, 다시 Mal 몰량의 1.5배의 transferrin을 넣고, 마이클 첨가 반응을 통해 본딩하고 30 ℃에서 2 일간 반응시킨 후, 투석하고, 실시예 16에 기재된 투석법에 따라 베시클 transferrin-CLPs를 제조하였다. DLS로 측정 결과는 115nm, 입경분포 0.12이다. 폴리펩타이드의 접지율은 핵자성 및 BCA 단백질 키트 시험에 의해 94%로 측정 계산되었다. 표적 폴리머와 비표적 폴리머는 볘시클 제조 과정 중에 질랑비 백분률에 따라 재료가 투입되며, 다른 표적분자의 자가 가교결합 베시클 transferrin-CLPs로 이용이 가능하다. 치수는 약 85~130nm이고, 입경분포는 0.01~0.20이다.
상술한 바와 유사한 제조방법을 채용하여 다양한 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조할 수 있고, 원료비율과 특성을 표2에 게시하였다.
표 2. 자가 가교결합 폴리머 베시클의 제조와 특성
Figure pct00017
실시예 20. 자가 가교결합 폴리머 베시클의 약물 적재와 체외 방출
용해치환법을 채용하여 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k) 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조하였다. DOX·HCl의 적재는 pH 구배법(pH Gradients)을 사용하였고, 베시클 내외 pH의 같지 않음을 이용하여 친수성 약물 DOX·HCl를 캡슐화하였다. 100μL의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k) DMF 용액 (10mg/mL)에 900μL의 시트르산 나트륨(sodium citrate)/시트르산(Citric Acid) 완충용액(10mM, pH 4.0)에 적가하였다. 37 ℃ (200 rmp)에서 셰이커 안에 5시간 방치한 후에, 0.05 mL의 PB(4 M, pH 8.1)를 넣고 pH 구배를 만든 다음, 즉시 DOX·HCl을 넣었다. 쉐이커에 5~10 시간 동안 두어 약물이 베시클에 들어갈 수 있게 하며 동시에 자가 가교결합하였다. 마지막으로 투석 주머니(MWCO 7000)에서 하룻밤 동안 투석하였다. 물은 5 번 바꾸었고 투석 매체(배지)는 PB (10mM, pH 7.4)이다. 다른 비율의 약 (10~30%)을 적재하는 자가 가교결합 베시클의 입경은 108~128nm이고, 입경 분포는 0.10~0.14이다. 형광분광기로 측정한 DOX·HCl의 봉입 효율은 68~85%이다. DOX·HCl의 체외 방출실험은 37℃의 항온(일정한 온도) 셰이커에서 흔들었다(200rpm). 각 그룹은 3개의 Parallel samples이 있다. 제1 그룹은, DOX·HCl를 적재한 자가 가교결합 베시클을 10mM GSH 모의 세포 내 환원 환경 PB (10mM, pH 7.4)에 첨가하였다. 제2 그룹은, DOX·HCl를 적재한 자가 가교결합 베시클은 PB (10mM, pH 7.4)에 있다; 약을 적재한 자가 가교결합 베시클의 농도는 30mg/L이고, 0.6ml을 취해서 투석 주머니(MWCO 7000)에 넣었다. 각 시험관에 상응하는(적절한) 투석용액 25mL를 넣고, 5.0mL 투석 주머니 외부 매체(배지)를 취해서 실험에 사용했다. 동시에 시험관에 5.0mL의 상응하는 매체를 부가하였고, 형광 측정기를 사용하여 용액 중 약물 농도를 측정하였다. 부가한 도 2는 DOX·HCl 누적 방출량과 시간의 관계를 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, 모의 종양 세포 내 GSH 첨가 후, 그 방출이 GSH가 첨가되지 않은 샘플보다 현저하게 빠르며, 이것은 약물 적재 자가 가교결합 베시클이 10mM의 GSH 존재 하에서 약물을 효과적으로 방출 할 수 있음을 나타낸다.
상술한 것과 같은 방법을 채용하여 DOX·HCl 적재된 자가 가교결합 폴리머 베시클 PEG5k-P(CDC4.9K-co-TMC19k)를 제조하였다. 다른 비율의 약 (10~30%)을 적재하는 자가 가교결합 베시클의 입경은 100~125nm이고, 입경 분포는 0.10~0.14이다. 형광분광기로 측정한 DOX·HCl의 봉입 효율은 60~80%이다.
용제치환법을 이용하여 Ally-PEG6k-P(CDC2.9k-CL14.2k) 자가 가교결합 폴리머 베시클을 제조하였다. 10μL의 taxol PTX DMF 용액(10mg/mL)와 90μL의 Ally-PEG6k-P(CDC2.9k-CL14.2k) DMF 용액(10mg/mL)을 혼합한 후에, 900μL 인산염 완충용액(10mM, pH7.4, PB)에 적가하였다. 37 ℃ (200 rmp)에서 셰이커 안에 하룻밤 동안 방치하여 자가 가교결합을 진행했다. 그 후에 투석 주머니(MWCO 7000)에 넣고 하룻밤 동안 투석하였다. 물은 5 번 바꾸었고 투석 매체(배지)는 PB (10mM, pH 7.4)이다. PTX의 함량은 0~20wt.%이고, 얻어진 자가 가교결합 베시클 치수는 130~170nm이고, 입경분포는 0.1~0.2이다. TEM으로 측정된 베시클 구조는 환원 민감적으로 가교결합을 해소하는 성질이 있다. PTX의 봉입 효율은 50~70%이다. 체외 방출 실험 설계는 위와 같고, GSH를 첨가한 후 소수성 약물 방출은 GSH가 첨가되지 않은 샘플보다 현저하게 빨랐다.
박막수화법을 이용하여 약을 적재하는 PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)에 기반한 자가 가교결합 폴리머 베시클 FA-CLPs를 제조하였고, pH 구배법으로 DOX·HCl를 적재했다. 1.6mg의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)와 FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 0.5mL의 Dichloromethane 또는 Acetonitrile 같은 저비점 유기용제에 녹이고, 25mL의 뾰족한 바닥 플라스크에서, 회전 김이 바닥부에서 박막을 형성한 후, 다시 0.1mBar의 진공 상태에서 24 시간 동안 추출하였다. 2mL의 시트르산 나트륨(sodium citrate)/시트르산(Citric Acid) 완충용액(10mM, pH4.0)에 첨가하고 37℃에서 박막을 교반하여 표면에서 박리하였고, 분쇄, 20분 (200rmp) 초음파 처리하였다. 교반은 24시간 동안 계속되었고, 가교결합 하였다. DLS 측정 자가 가교결합 베시클의 치수는 약 90nm이고, 입경분포는 0.10이다. 상술한 베시클 용액 중에 0.05 mL의 PB(4 M, pH 8.1)를 넣고 pH 구배를 만든 다음, 즉시 DOX·HCl을 넣었다. 쉐이커에 5~10 시간 동안 방치한 후에, 투석 주머니(MWCO 7000) 중 PB에서 하룻밤 동안 투석하였고 물은 5 번 바꾸었다. 다른 비율의 약 (10~30%)을 적재, 입경은 112~121nm이고, 입경 분포는 0.10~0.15, DOX·HCl의 봉입 효율은 61~77%이다. 체외 방출 실험 설계는 위와 같고, 10mM GSH를 첨가한 후, 약물 유효하게 방출하였고, 속도는 GSH가 첨가되지 않은 샘플보다 현저하게 빨랐다.
투석법을 채용하여 PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)를 기반으로 한 약물을 적재한 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs를 제조하였다. pH 구배법으로 에피루비신 하이드로클로라이드(Epi·HCl)를 넣었다.
80μL의 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)의 DMF 용액(10㎎/㎖)와 20μL의 GE11-PEG6.5k-P (CDC6k-co-TMC22.6k)의 DMF 용액(10㎎/㎖)을 균등하게 혼함 한 후, 투석 주머니 (MWCO 7000)에 직접 넣고, 시트르산 나트륨 / 시트르산 완충 용액 (10 mM, pH 4.0)에 37 ℃ 쉐이커에서 4 시간 동안 방치하여 자가 가교결합시킨 다음, 동일한 매체(배지)에 12 시간 동안 투석하였고, 물은 5번 바꾸었다. DLS로 측정된 가교결합된 베시클은 96 nm이었고 입경 분포는 0.18이었다. 상술한 소포체 용액에 0.05mL의 PB (4M, pH 8.5)를 첨가하여 pH 구배를 확립 한 후, 즉시 Epi·HCl을 첨가하고 5-10 시간 동안 쉐이커에 두었다. 그런 다음 투석 주머니 (MWCO 7000)에 넣고 PB에 5 번 밤새 투석 하였다. 다른 비율의 약을 적재하였고(10 % - 30 %), 입경 98-118nm, 입경 분포 0.10-0.15이며 DOX/HCl 봉입 효율은 64%~79%이다. Epi·HCl 체외 방출 실험 설계는 앞서 설명한 바와 같다. 그림 3에서와 같이, 10mM GSH를 첨가 한 후, 약물이 유효하게 방출되었으며, 속도는 GSH가 없는 샘플보다 확연히 빨랐다.
상술한 바와 유사한 제조 방법을 채용하여 독소루비신 하이드로클로라이드 (DOX·HCl), Epirubicin HCl(Epi·HCl), Irinotecan Hydrochloride(CPT·HCl), Mitoxantrone HCl(MTO·HCl)와 같은 다양한 친수성 항암 소분자 약물 및 유전자에 대한 다양한 자가 가교결합 폴리머 베시클 및 표적 자가 가교결합 폴리머 베시클을 연구할 수 있다. 그리고 소수성 함암제 파클리탁셀(paclitaxel(taxol)), 도세탁셀(Docetaxel), 올라파립(Olaparib)의 약물 적재량과 봉입효율은 표 3에 나와있다.
표 3. 자가 가교결합 폴리머 베시클과 표적 자가 가교결합 폴리머 베시클이 적재한 친수성 약물의 적재량, 봉입 효율
Figure pct00018
실시예 21. MTT 분석법에 의한 SKOV3 세포에 대한 빈 자가 가교결합 폴리머 베시클의 독성 테스트
MTT 분석법을 채용하고, SKOV3 난소암 세포를 사용하여 빈 베시클의 독성을 측정하였다. 그리고 5 x 104 개/mL 농도의 SKOV3 세포 종을 96-유공판에 구멍당 100μL를 넣고, 24 시간 후에 약 70 %가 세포부착(Cell adhesion)될 때까지 배양하였다. 그 다음, 실험군 각 구멍에 상이한 농도(0.5, 1.0mg/mL)를 함유하는 베시클 샘플을 구별하여 첨가하였다(실시예 15 및 실시예 19에 따른 빈 자가 가교결합 폴리머 베시클이 예시이다). 따로 Cell blank 대조공과 배양기 블랭크 공(4공 복제)을 설정하였다. 배양 24 시간 후, 각 구멍에 MTT(5.0mg/mL) 10μL를 첨가하고, 4 시간 더 배양 한 후, 각 구멍에 DMSO 150μL를 첨가하여 생성된 결정을 용해시키고, enzyme-labeled instrument(마이크로 플레이트 검측기)를 사용하여 492nm 곳에서 흡광도 값(A)을 측정하였다. 배양기 블랭크 공을 0으로 조절하고, 세포 생존율을 계산 하였다. 도 4는 자가 가교결합 폴리머 베시클의 세포 독성 결과이고, 자가 가교결합 폴리머 베시클의 농도가 0.5 에서 1.0mg/mL로 증가하면 SKOV3의 생존율은 92 %까지 높아짐을 알 수있다. 본 발명의 자가 가교결합 폴리머 베시클은 양호한 생체 적합성을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 22. MTT 분석법에 의한 SKOV3 난소암세포에 대한 재약(약을 적재하는) 자가 가교결합 폴리머 베시클의 독성 테스트
실시예 21과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다. 다만, 실험군 각 구멍에 샘플이 첨가될 때, DOX·HCl 적재 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k) 자가 가교결합 폴리머 베시클로, DOX·HCl이 적재되고 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)와 GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)로 구성되는 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs (그 중 GE11 함량은 각각 10%, 20%, 30%)를 각 대응 구멍에 투입하였다. DOX·HCl 농도 범위는 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40, 80μg/mL이고, 표적 분자 함량은 10%에서, 20%, 30%까지 이다. 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액을 대조군으로 사용하였다. 4시간 동안 공동 배양한 후에, 샘플을 빼서 신선 배양기(배지)로 교체하고, 44시간 계속 배양하였다. 이후에 MTT를 첨가하고, 실시예 21과 같이 처리하고 흡광도를 측정하였다. 도 5와 6은 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs의 SKOV3 세포에 대한 독성을 나타낸다. DOX·HCl을 적재한 20% GE11-CLPs 자가 가교결합 폴리머 베시클의 SKOV3 세포에 대한 준치사 농도(IC50)는 2.01μg/mL임을 볼 수 있다. 이는 PEG5k-P (CDC5.8k-co-TMC23k) 자가 가교결합 폴리머 베시클보다 훨씬 낮고 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액(里多) (14.23μg/mL)보다도 낮아서, 본 발명의 약재 표적 자가 가교결합 베시클이 난소암세포 표적에 효과적이고, 세포 내에서 약물을 방출하고 최종적으로 암세포를 죽일 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 23. MTT 분석법에 의한 A2780 세포에 대한 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클의 독성 테스트
실시예 21과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다. 다만, 실험군 각 구멍에 샘플이 첨가될 때, 다른 transferrin 함량, 다른 약물 양
자가 가교결합 폴러머 베시클로, CPT·HCl을 적재하고, Mal-PEG6k-P(CDC3.6k-LA18.6k)와 P(CDC3.8k-LA18.8k)-PEG4k-P(CDC3.8k-LA18.8k)로 제조된 자가 가교결합 폴리머 베시클 transferrin-CLPs(실시예 19)이 그 예이고, 각 대응 구멍에 투입하였다. CPT·HCl 농도 범위는 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40μg/mL이고, 표적 분자 함령은 10%에서, 20%, 30%까지 이다. P(CDC3.8k-LA18.8k)-PEG4k-P(CDC3.8k-LA18.8k) 재약 가교결합 폴리머 베시클과 유리 CPT·HCl 군을 대조군으로 사용하였다. 4 시간 동안 공동 배양 한 후, 샘플을 빼서 신선 배양기(배지)로 교체하고, 44시간 계속 배양하였다. 이후에 MTT를 첨가하고, 실시예 21과 같이 처리하고 흡광도를 측정하였다. 그 결과, A2780 세포에 대한 P(CDC3.8k-LA18.8k)-PEG4k-P(CDC3.8k-LA18.8k) 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클의 IC50는 4.15μg/mL였다. 특히, A2780 세포에 대한 CPT·HCl의 30 % transferrin-CLP의 IC50은 2.07μg/mL로, 자유 약물 CPT·HCl (4.11μg /mL)보다 낮았다.
본 발명의 재약 가교결합 폴리머 베시클은 난소암세포를 효과적으로 표적할 수 있고, 세포 내에서 약물을 방출하고, 암세포를 죽일 수 있고, 특히 표적 분자를 결합시킨 후, 난소암 세포의 특이성이 크게 향상되었고, 약물의 난소암세포 죽이는 능력을 현저하게 증가시킬 수 있다.
상술한 바와 유사한 제조 방법을 채용하여 난소암 세포에 대한 다양한 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클의 독성을 연구할 수 있었다. 약물은 친수성 항암 소분자 약물이고, 유전자 약물은 독소루비신 하이드로클로라이드 (DOX·HCl), Epirubicin HCl(Epi·HCl), Irinotecan Hydrochloride(CPT·HCl), Mitoxantrone HCl(MTO·HCL)이며, 소수성 함암제 파클리탁셀(paclitaxel(taxol)), 도세탁셀(Docetaxel), 올라파립(Olaparib)이다. 결과는 표 4에 나와있다.
실시예 24. 재약 자가 가교결합 베시클 (CLP 및 GE11-CLP)의 세포 엔도시토시스
유동세포계측법(流式法)을 채용하여 재약 베시클의 세포 엔도시토시스를 측정하였고, SKOV3 인간 난소암세포를 사용하였다. 2×105개/mL로 SKOV3 세포종을 6-유공판에 구멍당 100μL를 넣고, 24 시간 후에 약 70 %가 세포부착(Cell adhesion)될 때까지 배양하였다. 그 다음, 실험군 각 구멍에 재약 베시클 샘플 CLPs와 GE11-CLPs를 각각 넣고, 따로 Cell blank 대조공과 생리염수 대조공(2공 복제)을 설정하였다. 배양 4 시간 후, 각 구멍에 Pancreatin을 첨가하여 5분 동안 소화시키고, 생리염수로 3 회 세정하였다. 유동 세포 계측기로 488 nm에서 독소루비신의 형광 흡수 강도를 측정하였고, 생리염수군을 대조하여 세포 엔도시토시스 양을 계산하였다. 도 7은 재약 가교결합 베시클의 세포 섭취 결과이고, 표적 재약 자가 가교결합 베시클 세포 섭취량은 비표적 가교결합 베시클과 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액 보다 높음을 알 수 있고, 표적 자가 가교결합 베시클은 난소암세포를 적극적으로 섭취 엔도시토시스할 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 25. 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 (CLP 및 FA-CLPs)의 혈액 순환
모든 동물 실험 조작은 수조우 대학 동물실험센터의 규정에 따랐다. 실험은 먼저 체중 18~20g, 4~6주된 Balb/C 누드 마우스를 사용하였다. 베시클은 FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k) 및 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)를 상이한 비율로 혼합하여 제조하였고 FA-CLPs로 명명하였다. 폴리머 베시클 중의 FA 표적 비율이 20 %가 될 때, 입경은 100nm이고, 입경 분포는 0.10이고, FA20-CLPs로 명명했으며, 약물은 DOX·HCl이다. DOX·HCl 적재 CLPs 베시클, FA-CLPs 베시클 및 DOX·HCl을 미정맥을 통해 마우스 체내에 주입하였다(DOX 약물량은 10 mg/kg). 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 시간에 약 10μL의 혈액을 취하고 차이법으로 정확하게 혈액중량을 계산 한 다음, 다시 1 % 농도 트리톤 100μL와 추출액 (20mM DTT와 1M HCl을 함유한 DMF) 500μL를 가하였다. 그 다음 원심분리(20,000회전/분, 20분) 후, 상등액을 채취하고, 각 시점에서의 DOX·HCl 양을 형광으로 측정하였다. 계산에 따르면 재약 FA-CLPs 자가 가교결합 폴리머 베시클과 재약 CLPs 자가 가교결합 폴리머 베시클의 마우스 체내에서의 제거 반감기는 각각 4.23 및 4.16 시간 이었다. DOX·HCl은 단지 0.27 시간이었다. 따라서, 본 발명에 개시된 자가 가교결합 폴리머 베시클은 마우스 체내에서 안정하고, 비교적 긴 순환 시간을 가졌다. 기타 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클의 혈액 순환 실험의 조작과 계산 방법은 동일하고, 결과는 표 4에 표시하였다.
실시예 26. 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 CLPs 및 GE11-CLP의 혈액 순환
실시예 25와 같이, GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)와 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)를 혼합하여 자가 가교결합 베시클 GE11-CLPs를 제조하였고, GE11-CLPs자가 가교결합 베시클과 자가 가교결합 베시클 CLPs에 DOX·HCl을 넣은 후, 미정맥을 통해 Balb/C 누드 마우스에 주입하고, 그 혈액 순환을 연구하였다. DOX·HCl과 Doxorubicin hydrochloride 주사액을 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 GE11-CLPs 및 CLPs 베시클은 48 시간 후에 5.0 ID%/g으로 유지되었다. 계산에 따르면, GE11-CLPs 자가 가교결합 베시클 및 CLPs의 자가 가교결합 베시클의 마우스 체내에서의 제거 반감기는 각각 4.99 및 4.79 시간이었고, 그것은 마우스 체내에서 안정적이며 비교적 긴 순환 시간을 가졌다. 결과는 표 4에 표시하였다.
실시예 27. SKOV3 난소암 마우스에 대한 자가 가교결합 베시클 FA-CLPs의 생체 성상
생체 성상(이미징) 실험은 먼저 체중이 약 18~20g, 4~6주인 Balb/C 누드 마우스를 사용하였고, 5×106개 SKOV3 인간 난소암세포를 피하 주사하여 약 3~4주 후 종양 크기 100~200mm3에서 실험을 시작하였다. FA-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k) 및 PEG5k-P(CDC5.8k-co-TMC23k)를 1 : 5로 혼합하여 제조된 자가 가교결합 폴리머 베시클 FA20-CLPs와 자가 가교결합 베시클 CLPs가 예이다. 형광 물질 cy-7 표지된 FA20-CLPs 및 비표적 CLPs를 미정맥을 통해 마우스 체내에 주사 한 다음, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 시간의 상이한 시점에서 작은 동물 생체 성상기(영상기)를 이용하여 베시클의 행방을 추적하였다. 실험 결과, FA20-CLPs는 난소암 종양 부위에 빠르게 축적되었고, 형광은 48 시간 후에도 여전히 강했다. 이러한 결과는 FA20-CLPs가 능동적으로 표적하고, 난소암 종양 부위에 농축될 수 있으며 난소암 세포에 극히 강한 특이성을 가짐을 보여준다. 기타 자가 가교결합 폴리머 베시클의 생체 성상 실험의 조작과 계산 방법은 동일하고, 결과는 표 4에 표시 하였다.
Epi·HCL이 적재된, cy-7 표지의 CLPs를 제조하였고, 생체성상 실험 중 종양의 접종과 미정맥 투약은 위와 동일하다. 2개 모두 난소종양부위에서 매우 빠르게 축적될 수 있음을 발견하였고, CLPs는 4~6시간 내에 사라지고, GE11-CLPs는 48 시간 후에도 종양 부위의 형광이 여전히 매우 강하여, GE11-CLPs가 난소 종양 부위를 능동적으로 표적하고 농축될 수 있음을 나타낸다.
실시예 28. SKOV3 난소암 마우스에 대한 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 CLPs 와 transferrin-CLPs 의 생체 성상 실험
생체 성상 실험은 먼저 체중이 약 18~20g, 4~6주인 Balb/C 누드 마우스를 사용하였고, 5×106개 A2780 인간 난소암세포를 피하 주사하여 약 3~4주 후 종양 크기 100~200mm3에서 시작하였다. transferrin-PEG6.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k) 및 PEG5k-P(CDC3.7k-co-LA14.6k)를 혼합하여 제조한 표적 자가 가교결합 베시클 transferrin-CLPs 및 재약 자가 가교결합 베시클 CLPs는 Cy-5로 표지되고, 소수성 약물인 도세탁셀 DTX가 적재되었으며, 실시예 27과 동일하게 조작하여 생체 성상을 연구하였다. 실험 결과, DTX 적재 transferrin-CLPs가 종양 부위에 빠르게 축적될 수 있고, 종양 부위의 형광은 48 시간 후에도 여전히 강했다. transferrin-CLPs는 종양 부위를 능동적으로 표적하고 농축될 수 있음을 나타낸다. 그리고 재약 CLPs 자가 가교결합 베시클은 종양에 진입한 2시간 후에 매우 빨리 대사되며 그 강도가 낮아진다.
실시예 29. SKOV3 난소암 마우스에서 재약 가교결합 폴리머 베시클 CLPs 및 FA-CLPs의 체내 생체 분포
샘플 FA20-CLPs의 제조, 생물 분포 실험 중 종양의 접종 및 미정맥 투약은 실시예 27과 동일하게 하였다. FA20-CLPs 및 CLPs를 마우스 체내에 미정맥 주사하고(DOX·HCl : 10mg/kg), 12 시간 후에 마우스를 죽이고, 종양을 취하고, 심장, 간, 비장, 폐 및 신장 조직을 꺼냈다. 세척하고 무게를 잰 후에 1 % 농도 트리톤 500μL를 넣고 균질기(Homogenate machine)를 통해 갈았다. 다시 DME 추출(20mM DTT와 1M HCl을 함유) 900μL를 가하였다. 원심분리(20,000회전/분, 20분) 후, 상등액을 채취하고, 각 시점에서의 DOX·HCl 양을 형광으로 측정하였다. 도 8에서, 가로축은 조직 장기이고, 세로축은 종양 또는 조직 각 1g의 DOX·HCl이고, 총 DOX · HCl 주입량(ID%/g)이다. FA-CLP, CLP 및 DOX·HCl 주입 후 12 시간 동안 종양에 축적 된 DOX·HCl의 양은 각각 6.54, 2.53 및 1.02ID%/g이었으며, FA-CLPs는 CLPs 및 DOX·HCl의 3배, 6배였다. 재약 FA-CLPs는 적극적 표적을 통해 종양부위에 비교적 많이 축적되며, 난소암세포에 대한 현저한 특이성이 있고, 난소암세포를 죽이는데 유리하다. 결과는 표 4에 표시하였다.
실시예 30. SKOV3 난소암 마우스에서 재약 가교결합 폴리머 베시클 CLPs 및 GE11-CLPs 의 체내 생체 분포
종양 접종, 미정맥 투약과 동물의 조작은 실시예 27과 동일하게 하였다. DOX·HCl를 적재하는 GE11-CLPs, CLPs, 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액 DOX-LPs를 마우스 체내에 미정맥 주사하였다(DOX·HCl : 10mg/kg). 6 시간 후, GE11-CLPs, CLPs 및 DOX-LP에 의해 종양에 축적된 DOX·HCl 양은 각각 8.63, 3.52 및 1.82ID%/g이었고, GE11-CLPs는 후자 2개에 2 및 5 배였다. 재약 GE11CLP 적극적 표적을 통해 종양부위에 비교적 많이 축적되었다(도 9).
실시예 31. Balb/C 마우스에서 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs의 최대 내약 용량(MTD)
먼저 체중 약 18~20g, 4~6주된 Balb/C 마우스를 사용하였다. 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs와 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액 단위량을 주사하였다. 그 중 Doxorubicin의 농도는 각각 120mg/kg, 140mg/kg, 160mg/kg, 180mg/kg, 200mg/kg이었고, 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액의 농도는 20mg/kg이었다. 각 군에 5마리의 마우스를 최후의 10일간 매일 마우스의 정신상태를 관찰하고 체중을 측정하였다. 최대 내약 용량의 표준은 마우스의 우발적 사망과 마우스 체중이 15%를 밑도는 것이다. 도 10a 및 도 10b 각 군별 마우스의 체중 및 생존율의 변화로부터 알 수 있듯이, 재약 표적 자가 가교결합 베시클의 최대 받아들이 어려운 투여량은 160mg/kg이었고, 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액의 최대 내약 투여량은 20mg/kg이었다. 여기서 알 수 있듯이, 표적성 재약 자가 가교결합 베시클의 마우스에 대한 내약 수용 능력은 매우 높고, 치료의 창(Therapeutic window)을 크게 향상시켰다.
실시예 32. SKOV3 피하 난소암을 보유한 마우스에서의 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs 및 CLPs의 항암 효과, 체중 변화 및 생존율
먼저 체중 약 18~20g, 4~6주된 Balb/C 마우스를 사용하였으며, 5×106개 SKOV3 인간 난소암세포를 피하 주사하고, 약 2주 후 종양 크기 30~50mm3에서 실험을 시작하였다. GE11-PEG6.5k-P(CDC6k-co-TMC22.6k)와 PEG5k-P (CDC5.8k-co-TMC23k)를 1 : 5로 혼합하여 제조한 DOX·HCl 적재 표적 가교결합 베시클 GE11-CLPs, 비표적 CLPs, DOX-LPs 및 PBS를 미정맥 주사하였다. 도 11에서 볼 수 있듯이, GE11-CLPs 치료군에서 18일째에 종양이 유의하게 억제되는 반면, 재약 CLPs 군 종양은 성장하였고, 마우스의 체중이 거의 변하지 않았다. 비록 DOX-LPs도 종양 성장을 억제했지만, DOX-LPs 군의 마우스의 체중은 12일째에 18 % 감소하여 그것은 마우스에 대한 독성 부작용이 크다는 것을 알 수 있다. GE11-CLPs 치료군은 62일 후에 모두 생존했고, DOX-LPs 군은 42일째에 이미 모두 사망했으며, PBS 군도 42일째에 모두 사망했다. 따라서 재약 자가 가교결합 베시클은 종양을 효과적으로 억제하고 생쥐에게 독성 부작용이 없으며 종양 보유 마우스의 생존 시간을 연장시킨다.
실시예 33. SKOV3 피하 난소암을 보유한 마우스에서의 재약 표적 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs의 항암 효과, 체중 변화 및 생존율
피하 SKOV3 종양 모형의 확립, 미정맥 투약 방식과 데이터 수집은 실시예 32와 동일하게 하였다. DOX·HCl 적재 GE-CLPs, 독소루비신 리포솜 Doxorubicin hydrochloride 주사액과 PBS 단위량을 미정맥 주사하였다. 그 중의 DOX·HCl 적재 GE-CLPs 자기 가교결합 베시클의 독소루비신 양은 20mg/kg, 40mg/kg 및 60mg/kg 인 반면, DOX-LPs의 독소루비신 농도는 10mg/kg 및 15mg/kg이었다. 도 12에서 볼 수 있듯이, GE11-CLPs 독소루비신의 농도는 치료군에서 18일째에 60mg/kg이었고, 종양은 유의하게 억제되었다. 반면, 20mm/kg 및 40mg/kg에서의 독소루비신의 농도는 증가하였고 모든 군의 각 마우스 체중은 거의 변화가 없었다. DOX-LPs는 독소루비신 농도 10mg/kg 및 15mg/kg 단위량에서 종양의 성장을 억제하지 못했다. GE11-CLPs 치료군은 49일 후에 전부 생존했으며, DOX-LPs 군은 42일과 43일에 모두 사망했으며, PBS 군도 34 일째에 모두 사망했다.
실시예 34. A2780 피하 난소암을 보유한 마우스에서의 재약 표적 자가 가교결합 폴리머 베시클 transferrin-CLPs과 CLPs의 항암 효과, 체중 변화 및 생존율
피하 A2780 종양 모형의 확립, 미정맥 투약 방식과 데이터 수집은 실시예 32와 동일하게 하였다. 종양 크기 30~50mm3에서 실험을 시작하였다. transferrin-PEG6.5k-P(CDC3.8k-co-LA13.8k)와 PEG5k-P(CDC3.7k-co-LA14.6k)를 1 : 5로 혼합하여 CPT·HCl 적재 표적 자가 가교결합 베시클 transferrin-CLPs, 비표적 CLPs, 자유 CPT·HCl을 제조하였고, 이를 미정맥 주사하였다. cRGD-PEG6k-P(CDC4.6k-co-TMC18.6k)와 PEG5k-P(CDC4.9k-co-TMC19k)를 1 : 5로 혼합하여 제조 한 DOX·HCl 적재 자가 가교결합 베시클 cRGD-CLPs를 대조군으로 하였다. 결과는 transferrin-CLPs 치료 18일째에 종양이 유의하게 억제되었고, 반면 재약 CLPs 군 종양은 소량 성장하였으며, 마우스 체중은 거의 변화하지 않았다. cRGD-CLPs 군의 마우스의 체중은 변하지 않았지만, 종양 억제는 이전의 것보다 현저히 약했고, 종양의 크기는 이전 것의 3 배였으며, 이는 cRGD가 난소암에 대한 명확한 표적성이 없음을 나타낸다. 비록 CPT·HCl은 종양의 성장을 억제하지만, CPT·HCl 군의 마우스의 체중은 10일째에 18 % 감소했다. transferrin-CLPs 치료군은 72일 후에 전부 생존했고, CPT·HCl 군은 28일째에 이미 전부 사망했으며, PBS 군도 37일째에 전부 사망했다.
실시예 35. SKOV3 동위성 난소암을 보유한 마우스에서의 재약 표적 자가 가교결합 폴리머 베시클 GE11-CLPs과 CLPs의 항암 효과, 체중 변화 및 생존율
DOX·HCl 적재 자가 가교결합 베시클 GE11-CLPs, 비표적 CLPs, DOX-LPs 및 PBS를 SKOV3 동위성 난소암을 보유한 마우스에게 미정맥 주사하였다. GE11-CLPs 치료군은 16일 내에 종양 생물 발광 강도가 지속 감소하였으나, 재약 CLP 군 종양 생물 발광 강도는 증가하였고, 마우스이 체중은 거의 변하지 않았다. 비록 DOX-LPs도 종양 성장을 억제했지만 DOX-LPs 마우스의 체중은 4일째 21 % 감소했다. GE11-CLPs 치료군은 45일 후에 전부 생존했고, DOX-LPs 군은 모두 32일 째에 이미 전부 사망했으나, PBS 군도 23 일째에 전부 사망했다. 따라서, 표적 분자에 결합된 재약 자가 가교결합 베시클 GE11-CLPs가 효과적으로 동위성 난소암의 성장을 억제 할 수 있고, 독성 부작용이 없으며, 종양 보유 마우스의 생존 시간을 연장시킬 수 있다.
상술한 실험 방법과 유사한 방법을 채용하여 다른 약물을 다양하게 적재하는 자가 가교결합 폴리머 베시클이 난소암을 가지는 마우스에 주는 영향을 연구하였고, 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4. 난소암에 대한 재약 자가 가교결합 폴리머 베시클의 체내외 항종양 결과
Figure pct00019

Claims (10)

  1. 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머는 표적분자에 결합하는 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머로부터 제조되는 것으로서, 상기 표적분자는 GE11 폴리펩타이드、 엽산 FA、 트랜스페린 transferrin 또는 Herceptin 단백질이고; 상기 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학 구조식은 아래 구조식 중 하나인 것을 특징으로 하는, 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머.
    식 Ⅰ
    Figure pct00020

    식 Ⅱ
    Figure pct00021

    그 중 R1 은 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.

    R1 은 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
    Figure pct00022


    R2 는 하기 그룹 중에 선택된 어느 하나이다.
    Figure pct00023


    그 중, k는 113~170이고, x는 15~45이고, y는 80~300이고, m은 220~280이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학구조식이 식 Ⅰ일 때, 분자량은 30~55kDa이고, 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머의 화학구조식이 식 Ⅱ일 때, 분자량은 60~95kDa인 것을 특징으로 하는, 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머.
  3. 이하의 폴리머 제조로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 폴리머 베시클.
    (1) 청구항 1의 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머로부터 제조하여 얻어진다.
    (2) 청구항 1의 상기 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머로부터 제조하여 얻어진다.
    (3) 청구항 1의 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머와 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머로부터 제조하여 얻어진다.
    (4) 청구항 1의 상기 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머에서 제조된 베시클 표면에 표적분자를 본딩시킴으로써 얻어지고, 상기 표적분자는 GE11 폴리펩타이드、 엽산、 트랜스페린 또는 Herceptin 단백질이다.
  4. 제 3 항에 있어서, 자가 가교결합 폴리머 베시클이다. 상기 자가 가교결합 폴리머 베시클의 입경은 50~160나노미터인 것을 특징으로 하는 폴리머 베시클.
  5. 제 3 항에 있어서, 청구항 1의 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머와 디티오카보네이트 모노머를 함유하는 폴리머로부터 제조되고, 질량 백분율은, 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머가 1~40wt.%인 것을 특징으로 하는 폴리머 베시클.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 상기 임의 일종의 폴리머 베시클이 난소암 치료 약물의 담체로 작용하는 용도.
  7. 상기 난소암 치료 약물은 소분자 항암 약물인 것을 특징으로 하는 청구항 6의 응용.
  8. 상기 소분자 항암 약물은 파클리탁셀(paclitaxel(taxol)), 도세탁셀, 독소루비신, 올라파립, 제피티닙, 독소루비신 하이드로클로라이드(Doxorubicin hydrochloride), 에피루비신 하이드로클로라이드 (Epirubicin hydrochloride), 이리노테칸 하이드로클로라이드(Irinotecan Hydrochloride)인 것을 특징으로 하는 청구항 7의 응용.
  9. 난소암 치료의 나노미터 약물 제조를 위한 제 1 항 또는 제 2항의 상기 난소암 특이 표적 생분해성 양친매성 폴리머의 용도.
  10. 난소암 치료용 나노미터 약물의 제조를 위한 제 3 항의 상기 폴리머 베시클의 용도.
KR1020187028348A 2016-03-04 2017-03-03 난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도 KR102190093B1 (ko)

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