TW201444870A - 高度半乳糖基化的抗ｈｅｒ２抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

在一方面，本發明涉及高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其組合物。在一方面，本發明涉及具有高度半乳糖基化的抗HER2抗體群體，及其組合物。在一方面，本發明涉及製造與使用高度半乳糖基化抗HER2抗體與具有高度半乳糖基化的抗HER2抗體群體的方法。在某些具體實施例中，該抗HER-2抗體為曲妥珠單抗(trastuzumab)。

Description

高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其用途 【相關申請案】
本申請案主張美國專利法第119條(e)項之美國臨時申請案案號61/764,488之優先權，其題目為「高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其用途」，係於2013年2月13日提出申請，其整個揭露內容係以引用的方式全部併入本文中。
本發明部分涉及抗HER2抗體的領域。
HER2(人類表皮生長因子受體2，Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)，亦被稱為HER2/neu或ErbB2，是表皮生長因子受體家族的一員。HER2是一種與細胞膜結合的受體酪胺酸激酶，其可將自身與其他表皮生長因子受體家族的成員(HER1、HER2、HER3與HER4)二聚化。二聚化作用進而導致各種胞內途徑的活化。HER2是一種在各種癌細胞中過度表現的致癌基因，包括乳癌、卵巢癌、胃癌與子宮癌。HER2在癌細胞中的過度表現(「HER2+」癌症)是與不良預後有關。
HER2是單株抗體曲妥珠單抗(賀癌平(Herceptin))的標的，曲妥珠單抗可與HER2/neu受體胞外片段的第四結構域結合。曲妥珠單抗於 1998年由美國食品藥物管理局(FDA)批准，且已被用於治療HER2+乳癌與HER2+胃癌。然而，曲妥珠單抗對於多數帶有HER2+癌症的病患不具有治療效果。此外，以曲妥珠單抗治療的療程與心臟功能異常以及額外不希望得到的副作用有關。因此，具有改善治療特性的抗HER2抗體是被需要的。
在一方面，本發明涉及高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其組合物。在一方面，本發明涉及具有高度半乳糖基化的抗HER2抗體群體，及其組合物。在一方面，本發明涉及製造與使用高度半乳糖基化抗HER2抗體與具有高度半乳糖基化的抗HER2抗體群體的方法。在某些具體實施例中，該抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
在一方面，本發明提供一種抗HER2抗體，其中該抗體為高度半乳糖基化的。在某些具體實施例中，該抗體為高度岩藻糖基化的。在某些具體實施例中，該抗體包含單半乳糖基化N-聚醣。在某些具體實施例中，該抗體包含雙半乳糖基化N-聚醣。在某些具體實施例中，該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：1且，其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：2。在某些具體實施例中，該抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該抗體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。在某些具體實施例中，該抗體係於基因轉殖非人類哺乳動物中製造。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊。
在一方面，本發明提供一種本文所揭露之任一抗體的組合物，其中該組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，該組合物進一 步包含一醫藥上可接受之載劑。
在一方面，本發明提供一種組合物，包含抗體群體，其中該抗體為抗HER2抗體；且其中在該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少60%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少70%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少60%。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該群體包含具有單半乳糖基化N-聚醣的抗體。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該群體包含具有雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度比該群體中抗體的岩藻糖基化的程度的比例為1.0至1.4之間。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該群體中抗體的至少25%含有雙半乳糖基化N-聚醣，且該群體中抗體的至少25%含有單半乳糖基化N-聚醣。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：1且，其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：2。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該抗體為曲妥珠單抗。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該抗體係於一非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該抗體係於一基因轉殖非人類哺乳動物中製造。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為一山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為一山羊。在某些具體實施例中，該 組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，該組合物進一步包含一醫藥上可接受之載劑。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的補體依賴型細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)活性。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，在一個體體內的該抗體群體具有增加抑制HER2活性的能力。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加與HER2結合的能力。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加抑制HER2二聚化的能力。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。
在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為50%或更低。在本文所提供之任一組 合物的某些具體實施例中，當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為30%或更低。在本文所提供之任一組合物的某些具體實施例中，當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為10%或更低。
在一方面，本發明提供一種製造抗體群體的方法，包含：在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中表現抗體群體，以製造抗體群體，其中該抗體為抗HER2抗體，其中在該群體中的抗體的半乳糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞係於培養物中，且轉染包含編碼該抗體的序列之核酸。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞係於以基因工程改造以在其乳腺中表現包含編碼該抗體之序列的核酸的非人類哺乳動物中。在某些具體實施例中，該核酸包含SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬的乳腺上皮細胞。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞為山羊的乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供製造本文所揭露之任一抗體、抗體群體或組合物的乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供一種包含本文所揭露之任一乳腺上皮細胞的基因轉殖非人類哺乳動物。
在一方面，本發明提供一種方法，包含投與本文所揭露之任一抗體、抗體群體或組合物至需要其之個體。在某些具體實施例中，該個體患有癌症。在某些具體實施例中，該癌症為HER2+癌症。在某些具體實 施例中，該HER2+癌症為乳癌、卵巢癌、胃癌或子宮癌。
在一方面，本發明提供一種抗HER2的單株抗體組合物，其包含在該Fc糖化作用位置(Asn297，EU編號)上具有聚醣結構的抗HER2單株抗體，其中該聚醣結構具有超過60%的半乳糖含量。
首先描述圖式。應當理解的是，這些圖式僅為示例性的，且非實施本發明所必需。
圖1A與圖1B所示為來自2號山羊的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣的代表性寡醣特徵。
圖2所示為來自1號山羊在泌乳第7天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣的寡醣特徵。
圖3所示為來自1號山羊在泌乳第15天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣的寡醣特徵。
圖4所示為來自1號山羊在泌乳第30天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣的寡醣特徵。
圖5所示為來自1號山羊在不同泌乳天數時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖6所示為來自2號山羊在首次泌乳第7天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣的寡醣特徵。
圖7所示為來自2號山羊在首次泌乳第7天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖8所示為來自2號山羊在首次泌乳第15、49、84、112天時的高度半 乳糖基化曲妥珠單抗抗體群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖9所示為來自3號山羊在泌乳第7天時以及4號山羊在泌乳第3/4天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖10所示為來自5號山羊在泌乳第3天時以及6號山羊在泌乳第5、6、7天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖11所示為來自2號山羊在二次泌乳第8、15與29天時的高度半乳糖基化曲妥珠單抗群體的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖12所示為市售賀癌平®/曲妥珠單抗的N-聚醣寡醣比例的摘要。
圖13所示為比較由2號山羊在首次泌乳(NL1)與二次泌乳(NL2)不同天數時製造的曲妥珠單抗的唾液酸與甘露糖修飾以及主要形式的摘要。
圖14所示為在1至6號山羊中製造的曲妥珠單抗的唾液酸與甘露糖修飾以及主要形式的摘要。
圖15所示為以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體與已知表現HER2的SK-BR-3細胞結合。
圖16所示為與市售賀癌平®/曲妥珠單抗相比，以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體對SK-BR-3細胞具有相似的結合親和力。
圖17所示為基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體與在NK細胞上表現的CD16交互作用。
圖18所示為與市售賀癌平®/曲妥珠單抗相比，以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。
圖19所示為以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體降低BT-474細胞 的增殖。
在一方面，本發明提供一種抗HER2抗體，其中該抗體為高度半乳糖基化的。抗HER2抗體與HER2結合，且抗HER2抗體已在各種特徵為過度表現HER2的癌症(HER2+癌症)中被用來作為治療劑。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括一包含SEQ ID NO：1的重鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括一包含SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括一包含SEQ ID NO：1的重鏈以及一包含SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括由SEQ ID NO：1所組成的重鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括由SEQ ID NO：2所組成的輕鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體包括由SEQ ID NO：1所組成的重鏈以及由SEQ ID NO：2所組成的輕鏈。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
曲妥珠單抗的重鏈係提供於SEQ ID NO：1中：
曲妥珠單抗的輕鏈係提供於SEQ ID NO：2中：
應當進一步理解的是，在某些具體實施例中，本發明亦包括基於曲妥珠單抗的序列但包括提供該抗體與生物利用度、穩定性等有關的額外有利所需之特性的突變的抗體。
在一方面，本發明提供抗HER2抗體，其中該抗體為高度半乳糖基化的。在某些具體實施例中，本發明提供抗HER2抗體，其中該抗體為高度岩藻糖基化的。在某些具體實施例中，本發明提供抗HER2抗體，其中該抗體為高度半乳糖基化與高度岩藻糖基化的。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體包含一或多個單半乳糖基化N-聚醣。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體包含雙半乳糖基化N-聚醣。
在一方面，本發明提供一種抗HER2的單株抗體組合物，其包含在該Fc糖化作用位置(Asn297，EU編號)上具有聚醣結構的單株抗體，其中該聚醣結構具有超過60%的半乳糖含量。在一具體實施例中，該抗HER2 的單株抗體是純化的。該「EU編碼系統」或「EU索引」一般用於提及在一免疫球蛋白重鏈恆定區內的殘基(如，在Kabat等人，免疫學重要的蛋白的序列，第5版，公共衛生服務，國家衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991年)，所報告的EU索引，係明確地以引用的方式併入本文)。根據該EU編碼系統，在一抗體中的典型糖基化殘基位置為在位置297上的天門冬醯胺(「Asn297」)。
應當理解的是，本文所揭露之任一抗HER2單株抗體可為部分或全部純化的。
抗體可以在Fc區域的重鏈(Asn297)內的Fc-γ糖化作用位置上以N-聚醣被糖基化。一般而言，抗體包括二個重鏈，因此每個抗體可以有二個Fc-γ N-聚醣。不同的糖化作用模式已在該Fc-γ糖化作用位置上被觀察到，且在該位置上發現到的寡醣包括半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNac)、甘露糖、唾液酸、N-乙醯神經胺酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc或NANA)、N-羥乙醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic，NGNA)以及岩藻糖。在該Fc-γ糖化作用位置上發現的N-聚醣一般具有由無支鏈主鏈的第一N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)，其係附著於該抗體的天門冬醯胺上，附著於該第一GlcNac上的第二GlcNAc，以及附著於該第二GlcNac上的第一甘露糖所組成的共同核心結構。二個額外的甘露糖係附著於該GlcNAc-GlcNAc-甘露糖鏈的第一甘露糖上，以完成該核心結構且提供二個「手臂」以供額外的糖化作用。此外，岩藻糖殘基可附著於該N-連結的第一GlcNAc上。
該二手臂核心結構也被稱為「天線」。在血漿抗體中發現的 N-聚醣模體的「手臂」最常見的糖化作用類型為複合的類型，即由多於一種類型的單醣所組成。在到達此N-聚醣模體的生物合成途徑中，數個GlcNAc轉移酶將GlcNAc殘基附著於該聚醣核心的甘露糖上，該聚醣核心可被進一步地以半乳糖、唾液酸以及岩藻糖殘基所延伸。此糖化作用模體被稱為「複合的」結構。
在該N-聚醣核心結構的「手臂」上發現的一個第二糖化作用模體為一個「高甘露糖」模體，其係以額外的甘露糖(無論是附著作為支鏈或作為無支鏈的主鏈)為特徵。
一個第三糖化作用模體為一種混合結構，其中該手臂之一為取代的甘露糖，而另一手臂為複合的。
如本文所使用，「半乳糖基化」抗體意指任何在其N-聚醣之一內具有至少一半乳糖單醣的抗體。半乳糖基化抗體包括其中該二個N-聚醣各自在該N-聚醣模體各自的手臂上具有複合類型模體的抗體、其中該二個N-聚醣只在該N-聚醣模體的其中一手臂上具有複合類型模體的抗體、在該N-聚醣各自的手臂上具有帶有複合類型模體的N-聚醣的抗體，以及只在該N-聚醣模體的其中一手臂上具有帶有複合類型模體的N-聚醣的抗體。包括至少一半乳糖單醣的抗體包括帶有N-聚醣，如G1(一個半乳糖)、G1F(一個半乳糖、一個岩藻糖)、G2(二個半乳糖)以及G2F(二個半乳糖、一個岩藻糖)的抗體。此外，包括至少一個半乳糖單醣的N-聚醣可為唾液酸化或未唾液酸化的。應該進一步理解的是，該N-聚醣亦可在該複合聚醣模體的一或多個手臂內包含額外的半乳糖殘基，例如α-Gal，可能導致一具有四個半乳糖部分的N-聚醣。
如本文所使用，「高度半乳糖基化」抗體意指在該N-聚醣模體內包括至少二個半乳糖單醣的抗體。高度半乳糖基化抗體包括其中該二個N-聚醣各自在該N-聚醣模體各自的手臂上具有複合類型模體的抗體、其中該二個N-聚醣只在該N-聚醣模體的其中一手臂上具有一複合類型模體的抗體，以及在該N-聚醣各自的手臂上具有帶有複合類型模體的N-聚醣的抗體。因此，高度半乳糖基化抗體包括其中兩個N-聚醣各自在該聚醣模體(如，G1或G1F)內包括一個半乳糖的抗體、在該聚醣模體(如，G2或G2F)內包括至少一個帶有二個半乳糖的N-聚醣的抗體，以及在該聚醣模體(如，(i)帶有G1聚醣模體的N-聚醣以及帶有G2或G2F聚醣模體的N-聚醣或(ii)帶有G2或G2F的二個N-聚醣)內帶有3或4個半乳糖的抗體。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體在該聚醣模體中包括至少三個半乳糖單醣。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體在該聚醣模體中包括至少四個半乳糖單醣。
該N-聚醣的糖化作用模式可以本領域習知之各種方法來決定。例如，分析在蛋白質上的碳水化合物的方法已被描述於美國專利申請案US 2006/0057638與US 2006/0127950中。該分析在蛋白質上的碳水化合物的方法係以引用方式併入本文。
在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體係於一非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。在某些具體實施例中，該抗體係於基因轉殖非人類哺乳動物中製造。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊。
在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化抗體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞以外的細胞中製造。在某些具體實施例中，該抗體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞以外的細胞中製造且在製造後進行修飾以增加在該N-聚醣上半乳糖基的數目(如，透過酵素，如轉移酶，的作用)。
在一方面，本發明提供一種包含高度半乳糖基化抗體的組合物。在某些具體實施例中，該包含高度半乳糖基化抗體的組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，該包含高度半乳糖基化抗體的組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
在一方面，本發明提供包含在該Fc糖化作用位置(Asn297，EU編號)上具有聚醣結構的抗HER2單株抗體組合物的組合物，其中該單株抗體的聚醣結構具有超過60%的半乳糖含量。在某些具體實施例中，該包含抗HER2單株抗體組合物的組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，該包含抗HER2單株抗體組合物的組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
抗體的群體
在一方面，本發明提供一種包含一抗體群體的組合物，其中該抗體為抗HER2抗體，且其中在該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少60%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少70%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少60%。在某些具體實施例中，該群體包含具有單半乳糖基化N-聚醣的抗體。在某些具體實施例中，該群體包含具有雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。在某 些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度比該群體中抗體的岩藻糖基化的程度的比例為1.0至1.4之間。在某些具體實施例中，該群體中抗體的至少25%含有雙半乳糖基化N-聚醣，且該群體中抗體的至少25%含有單半乳糖基化N-聚醣。
在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含具有SEQ ID NO：1的重鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含具有SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含具有SEQ ID NO：1的重鏈以及具有SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含由SEQ ID NO：1所組成的重鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含由SEQ ID NO：2所組成的輕鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體包含由SEQ ID NO：1所組成的重鏈以及由SEQ ID NO：2所組成的輕鏈。在某些具體實施例中，該帶有高半乳糖基化程度的抗體群體的抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
當與蛋白質一起的情況下，N-聚醣的生物合成並非由模板所調節，而是主要依賴細胞中特定的糖基轉移酶的表現與活性。因此，糖蛋白，例如抗體的Fc區域，通常存在以作為在該相同的蛋白質主鏈上帶有不同聚醣之糖型的異質群體。
高度半乳糖基化的抗HER2抗體的群體為一抗體群體，其中 在該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%的半乳糖基化。在高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少60%。
如本文所使用，該半乳糖基化的程度係以下列公式來決定：
其中：- n代表一層析圖分析的N-聚醣高峰的數目，例如一正相高效液相層析圖(Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography，NP HPLC)頻譜- 「半乳糖數目」代表在對應於該高峰的聚醣的天線上的半乳糖模體的數目，以及- 「A數目」對應於該對應於高峰的聚醣形式的天線上的N-乙醯葡萄糖胺模體的數目(不包含該核心結構的二個N-乙醯葡萄糖胺模體)，以及- 「%相對面積」對應於該對應的高峰之下的面積%
在抗體群體中的抗體的半乳糖基化程度可以經由例如以下之方法決定，自該抗體釋出的N-聚醣、在層析圖上解析該N-聚醣、識別該對應於特定高峰的N-聚醣的寡醣模體、決定該高峰強度以及將數據應用於以上所提供之公式(亦見本文所提供的實驗部分)。
半乳糖基化的抗HER2抗體包括單半乳糖基化N-聚醣與雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。
在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該群體包含具有可能或可能未被唾液酸化的單半乳糖基化N-聚醣的抗體。在該 高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%的該抗體N-聚醣包含單半乳糖基化N-聚醣。在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，至少25%的該抗體包含單半乳糖基化N-聚醣。
在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該群體包含具有可能或可能未被唾液酸化的雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%的該抗體N-聚醣包含雙半乳糖基化N-聚醣。在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，至少25%的該抗體包含雙半乳糖基化N-聚醣。
在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該群體包含具有可能或可能未被唾液酸化的單半乳糖基化N-聚醣的抗體，以及具有可能或可能未被唾液酸化的雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至99%的該抗體N-聚醣包含單半乳糖基化N-聚醣，以及至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至99%的該抗體N-聚醣包含雙半乳糖基化N-聚醣。在該高度半乳糖基化的抗體N-聚糖的群體的某些具體實施例中，至少25%的該抗體N-聚糖包含單 半乳糖基化N-聚醣以及至少25%的該抗體包含雙半乳糖基化N-聚醣。
在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該群體包含高度岩藻糖基化的抗體。高度岩藻糖基化的抗體群體係為抗體群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%的岩藻糖基化。在該高度半乳糖基化的抗體群體的某些具體實施例中，該抗體N-聚醣的岩藻糖基化程度為至少50%。
如本文所用，該岩藻糖基化的程度係以下列公式來決定：
其中：- n代表一層析圖分析的N-聚醣高峰的數目，例如一正相高效液相層析圖(Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography，NP HPLC)頻譜，以及- 「若藻糖數目」代表在對應於該高峰的聚醣上的岩藻糖模體的數目，以及- 「%相對面積」對應於對應含有該岩藻糖模體的高峰之下的面積%。
岩藻糖基化的抗體包括在其N-聚醣之一中具有至少一岩藻糖單醣的抗體。岩藻糖基化的抗體包括在其每個N-聚醣中具有一個岩藻糖單醣的抗體。
在某些具體實施例中，本文所揭露之抗HER2抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少50%，且在 該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少50%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少50%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少60%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少70%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少80%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至少90%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。在某些具體實施例中，本文所揭露之抗體群體涉及一群體，其中在該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度為至100%，且在該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至100%。
在一方面，本發明涉及一種包含抗HER2抗體群體的組合物，在該群體中抗體N-聚醣在該Fc-γ-糖化作用位置被半乳糖基化的百分比 對上在該群體中抗體N-聚醣在該Fc-γ-糖化作用位置被岩藻糖基化的百分比具有一特定比例。在某些具體實施例中，本發明涉及一種包含抗體群體的組合物，其中該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度比該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度的比例為介於0.5至2.5之間、介於0.6至2.0之間、介於0.7至1.8之間、介於0.8至1.6之間，或介於1.0至1.4之間。在某些具體實施例中，本發明涉及一種包含抗體群體的組合物，其中該群體中抗體N-聚醣的半乳糖基化的程度比該群體中抗體N-聚醣的岩藻糖基化的程度的比例為介於1.0至1.4之間，例如1.2。
在某些具體實施例中，該具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。在某些具體實施例中，該抗HER2抗體群體係於基因轉殖非人類哺乳動物中製造。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。在某些具體實施例中，該非人類哺乳動物為山羊。
在某些具體實施例中，該具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞以外的細胞中製造。在某些具體實施例中，該抗HER2抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞以外的細胞中製造後進行修飾以增加在該抗體群體中半乳糖基的數目(如，透過酵素，如轉移酶，的作用)。
在一方面，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物。在某些具體實施例中，該包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體的組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，該包 含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體的組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
抗體群體的製造
在一方面，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度(如，至少60%)的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的半乳糖基化程度。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係在細胞培養物中製造。如本文所使用，當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體相比時，「在細胞培養物中製造的」抗體意指在標準製造細胞株(如，CHO細胞)，但排除乳腺上皮細胞，中製造的抗體。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為90%或更低、80%或更低、70%或更低、60%或更低、50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為50%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為30%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為10%或更低。
在一方面，本發明提供包含具有高岩藻糖基化程度(如，至少60%)的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的岩藻糖基化程度。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係在細胞培養物中製造。如本文所使用，當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體相比時，「在細胞培養物中製造的」抗體意指在標準製造細胞株(如，CHO細胞)，但排除乳腺上皮細胞，中製造的抗體。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度為90%或更低、80%或更低、70%或更低、60%或更低、50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度為50%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度為30%或更低。在某些具體實施例中，當與在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的岩藻糖基化的程度為10%或更低。
在一方面，本發明提供包含具有高半乳糖基化與岩藻糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相 比時，該抗體群體具有增加的半乳糖基化與岩藻糖基化程度。
抗體
在某些具體實施例中，「抗體」乙詞可指包含至少二條重(H)鏈與二條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈由一條重鏈變異區(本文縮寫為HCVR或VH)與一條重鏈恆定區所組成。該重鏈恆定區由CH1、CH2以及CH3這三個區域所組成。每條輕鏈由一條輕鏈變異區(本文縮寫為LCVR或VL)與一條輕鏈恆定區所組成。該輕鏈恆定區由一個CL區域所組成。該VH與VL區域可以進一步被細分為高度變異區，稱為互補性決定區(complementarity determining regions，CDR)，而介於其中的為較保守的區域，稱為骨幹區(framework region，FR)。每個VH與VL由三個CDRs與四個FRs所組成，自胺基端至羧基端照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該重鏈與輕鏈的變異區包含與抗原相互作用的結合區。在某些具體實施例中，該抗原為HER2。該抗體的恆定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(如，作用細胞)與標準補體系統的第一組成部分(C1q)。當二個蛋白質以化學計量與帶有適當組態的自我組裝方式表現時，可形成一個成熟有作用的抗體分子。
「抗體」乙詞亦指包含其抗原結合片段。製備抗體與抗原結合片段的方法為本領域所熟知(見，如，Sambrook等人，「分子選殖：實驗室手冊」(第二版)，冷泉港實驗室出版社(1989年)；Lewin，「基因IV」，牛津大學出版社，紐約(1990年)，以及Roitt等人，「免疫學」(第二版)，高爾醫學出版社，倫敦，紐約(1989年)，專利文獻WO2006/040153、WO2006/122786，以及WO2003/002609)。如本文所使用，抗體的「抗原結 合片段」意指保留專一性結合抗原，如HER2，之能力的抗體的一或多個部分。已證實抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。包含在抗體的「抗原結合片段」乙詞之內的結合片段之實例包括(i)Fab片段，其為由該VL、VH、CL與CH1區域所組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，其為包含由在鉸鏈區的雙硫鍵所連結的二個Fab片段之雙價片段；(iii)由該VH與CH1區域組成的Fd片段；(iv)由抗體之單臂的VL與VH區域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989年)自然期刊，第341卷：第544-546頁)，其由VH區域組成；以及(vi)分離的互補性決定區(CDR)。此外，雖然該Fv片段的兩個區域，即V與VH，係由不同的基因所編碼，但是以重組的方法這兩個區域可以被連結，這是透過可以將這兩個區域做成單一蛋白鏈的合成連接子所達成，其中該VL與VH區域配對以形成單價分子(被稱為單鏈Fv(single chain Fv，scFv)；見，如Bird等人(1988年)科學雜誌第242卷：第423-426頁；以及Huston等人(1988年)美國國家科學院院刊，第85卷：第5879-5883頁)。這樣的單鏈抗體也要是被包含在一抗體的「抗原結合部分」乙詞之中。這些抗體片段係使用常規方法而得，例如蛋白水解片段方法，如在J.Goding，單株抗體：原理與實踐，第98-118頁(紐約學術出版社，1983年)中所述者，其在此以引用的方式以及以本領域技術人員所知悉的其他技術的方式併入。該片段以如同完整抗體之篩選方式篩選以供使用。
在某些具體實施例中，該抗體係為同型IgG、IgA或IgD的。在進一步的具體實施例中，該抗體係選自於由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE所組成之群組或具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE的免疫球蛋白恆定及/或變異 區。在其他具體實施例中，該抗體為雙專一性或多專一性抗體。根據替代的具體實施例，本發明之抗體可以被修飾為在雙專一性抗體，或一多專一性抗體的形式中。「雙專一性抗體」乙詞意指包括任何試劑，如蛋白質、胜肽，或蛋白質或胜肽錯合物，其具有二個不同的結合專一性，係結合於，或與(a)細胞表面抗原，以及(b)作用細胞的表面上的Fc受體交互作用。「多專一性抗體」乙詞意指包括任何試劑，如蛋白質、胜肽，或蛋白質或胜肽錯合物，其具有多於二個的不同的結合專一性，係結合於，或與(a)細胞表面抗原，(b)作用細胞的表面上的Fc受體，以及(c)至少一種其他的組分交互作用。據此，本發明包括，但不限於，雙專一性、三專一性、四專一性，以及其他多專一性抗體，其係直接對細胞表面抗原，以及作用細胞上的Fc受體專一。「雙專一性抗體」乙詞進一步包括雙抗體(diabodies)。雙抗體為雙價、雙專一性抗體，其中該VH與VL區域係在一個單一的多胜肽鏈上表現，但使用一個短到無法使在同一鏈上的這兩個區域之間進行配對的連接子，因此迫使這些區域與另一鏈上的互補區域配對，且創造兩個抗原結合位置(見如，Holliger,P.等人(1993年)，美國國家科學院院刊，第90卷：第6444-6448頁；Poijak,R.J.等人(1994年)，結構期刊，第2卷，第1121-1123頁)。
「抗體」乙詞亦包含抗體的不同類型，如重組抗體、單株抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或其混合物。
在某些具體實施例中，該抗體為重組抗體。如本文所使用，「重組抗體」乙詞意指包括以重組方法製備、表現、創造或分離的抗體，例如自基因轉殖了其他物種的免疫球蛋白基因之動物中分離的抗體，使用轉染至一宿主細胞中的重組表現載體表現的抗體，自重組、組合抗體庫中 分離的抗體，或以包含將免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列中的任何其他方法製備、表現、創造或分離的抗體。
在其他具體實施例中，該抗體可為嵌合或人源化抗體。如本文所使用，「嵌合抗體」乙詞意指結合非人類(如，小鼠、大鼠、兔)抗體的部分與人類抗體的部分的抗體。如本文所使用，「人源化抗體」乙詞意指僅保留來自與人類框架區域有關的親本抗體的抗原結合CDRs的抗體(見，Waldmann，1991年，科學期刊，第252卷：第1657頁)。當在活體內施用以診斷、預防或治療等根據本發明之應用時，這種保留鼠類抗體的結合專一性的嵌合或人源化抗體被預期具有降低的免疫原性。
在某些具體實施例中，該抗體為人類抗體。如本文所使用，「人類抗體」乙詞意指包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的變異與恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(如，在活體外以隨機或位置特定的突變誘發或在活體內以體細胞突變所引入的突變)。使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統的基因轉殖小鼠來產生人類抗體。全人源單株抗體亦可以免疫基因轉殖了大部分人類免疫球蛋白重鏈與輕鏈基因座的小鼠來製備。見，如美國專利號5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584及其所引用之文獻，這些文獻的內容皆以引用之方式併入本文中。這些動物已經經過基因修飾，例如在內源性(如，鼠類)抗體的製造中具有一功能缺失。這些動物進一步被修飾以包含所有或部分人類生殖系免疫球蛋白基因座，使得這些動物的免疫作用導致製造針對目標抗原的全人源抗體。在這些小鼠(如，XenoMouse小鼠(Abgenix公司)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm公司))的免 疫作用之後，根據標準融合瘤技術製備單株抗體。這些單株抗體具有人類免疫球蛋白胺基酸序列，因此當投與在人類時，不會引發人類抗小鼠抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)反應。如同本文所提供之任何抗體，該人類抗體可為單株抗體。
在某些具體實施例中，該抗體為全長抗體。在某些具體實施例中，該全長抗體包含重鏈與輕鏈。在某些具體實施例中，該抗體為抗HER2抗體。在某些具體實施例中，該重鏈包含SEQ ID NO：1，且該輕鏈包含SEQ ID NO：2。在某些具體實施例中，該抗體為曲妥珠單抗。
CDC活性
在一方面，該包含具有高半乳糖基化程度(如，至少60%)的抗HER2抗體群體的組合物具有高補體依賴型細胞毒性(CDC)活性。在一方面，該包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物具有高抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性。在某些具體實施例中，該包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物具有高補體依賴型細胞毒性(CDC)活性與高抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性。
在某些具體實施例中，當與具有低度半乳糖基化的抗體群體相比時，該具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體具有增加的補體依賴型細胞毒性(CDC)活性。在某些具體實施例中，該具有高半乳糖基化程度的抗體群體與該具有低度半乳糖基化的抗體群體係針對相同的抗原決定位。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗體群體與該具有低度半乳糖基化的抗體群體係由相同的核酸所編碼。在某些具體實施例中，該核酸編碼該抗體曲妥珠單抗。
如本文所使用，具有低度半乳糖基化的抗體群體(為「低半乳糖」)意指一抗體群體其中在該群體中該抗體的半乳糖基化程度為少於50%、少於40%、少於30%、少於20%、少於10%、至0%。
在某些具體實施例中，當與具有低度半乳糖基化的抗體群體相比時，該具有高半乳糖基化程度的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少l0倍高、高達至少100倍高或更高的CDC活性。
在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化的抗體群體係為高度岩藻糖基化的(具有高岩藻糖基化的程度)。在某些具體實施例中，當與低度半乳糖且低度岩藻糖(具有低半乳糖基化與岩藻糖基化的程度)的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且高度岩藻糖基化的抗體群體具有增加的補體依賴型細胞毒性(CDC)活性。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化且高度岩藻糖基化的抗體群體與該低半乳糖且低岩藻糖的抗體群體係針對相同的抗原決定位。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化且高度岩藻糖基化的抗體群體與該低半乳糖且低岩藻糖的抗體群體係由相同的核酸所編碼。在某些具體實施例中，該核酸編碼該抗體曲妥珠單抗。
如本文所使用，低岩藻糖或具有低岩藻糖基化程度的抗體群體意指一抗體群體其中在該群體中該抗體的岩藻糖基化程度為少於50%、少於40%、少於30%、少於20%、少於10%、至0%。
在某些具體實施例中，當與低半乳糖且低岩藻糖的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且高度岩藻糖基化的抗體群體具有至少1.1倍 高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的CDC活性。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有增加的補體依賴型細胞毒性(CDC)活性。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。在某些具體實施例中，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體與該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體可由相同的核酸編碼。在某些具體實施例中，該核酸編碼該抗體曲妥珠單抗。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的CDC活性。
在一方面，本文所揭露之抗體群體的組合物具有高(補體依賴型細胞毒性)CDC活性。透過各種機制，抗體可作為治療劑，而其中之一就是透過CDC活性。某些與目標細胞受體結合的治療性的抗體亦可結合該補體途徑的蛋白質。與補體蛋白質結合造成補體的層層傳遞(透過C1-錯合物活化)，該傳遞最終導致一「膜攻擊錯合物」的形成，而造成細胞裂解以及與該治療性的抗體結合的細胞的死亡(見如，Reff M.E.血液期刊，1994年，第83卷：435頁)。
在某些具體實施例中，與不具有增加的補體依賴型細胞毒性(CDC)活性的抗體群體相比時，具有增加的補體依賴型細胞毒性(CDC)活性的抗體群體，係為誘導大量細胞裂解的抗體群體。決定CDC增加程度的方法為本領域習知且通常基於決定細胞裂解的量。用於決定CDC活性的商業套組可購自例如Genscript公司(皮斯卡特維，紐澤西州，美國)。
ADCC活性
在一方面，當與具有低度半乳糖基化的抗體群體相比時，該具有高半乳糖基化程度(如，至少60%)的抗HER2抗體群體，具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性。在某些具體實施例中，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於一非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。
在某些具體實施例中，當與低半乳糖的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化的抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)程度。在某些具體實施例中，當與低半乳糖的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的ADCC活性。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體 群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)程度。在某些具體實施例中，當與一非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的ADCC活性。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)程度。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。
在一方面，本文所揭露之抗體群體的組合物具有高ADCC活性。透過各種機制，抗體可作為治療劑，而其中之一就是透過ADCC活性。與一目標細胞上的細胞受體結合，且包括Fc糖化作用位置的治療性的抗體亦可結合該Fc-受體，而導致表現該Fc-受體的細胞固定至該目標細胞上。抗體的Fc區域的結合親和力通常依賴該Fc糖化作用位置的糖化作用之性質。該FC受體係於數種免疫細胞上被發現，包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球，以及肥胖細胞。與該Fc受體結合導致該誘導細胞激素(例如IL-2)與吞噬作用的免疫細胞殺死該目標細胞。在某些具體實施例中，與不具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性的抗體群體相比，具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性的抗體群體係為顯示增加與表現CD16的細胞結合的抗體群體。在某些具體實施例中，與不具有增加 的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性的抗體群體相比，具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)活性的抗體群體係為顯示增加誘導IL-2產生(如，在自然殺手細胞中)的抗體群體。用於決定ADCC活性的商業套組可購自例如Genscript公司(皮斯卡特維，紐澤西州，美國)與Promega公司(麥迪遜，威斯康辛州，美國)。
抗HER2活性
在一方面，當與具有低度半乳糖基化的抗體群體相比時，該具有高半乳糖基化程度(如，至少60%)的抗HER2抗體群體，具有增加的抑制HER2活性的能力。在某些具體實施例中，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於一非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的抑制HER2活性的能力。
在一方面，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的與HER2結合的能力。
在一方面，本發明提供包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的組合物，其中該抗體群體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造，且其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的抑制HER2二聚化的能力。
在某些具體實施例中，當與低半乳糖的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化的抗體群體具有增加的抑制HER2活性、與HER2結合及/或 抑制HER2二聚化的能力。在某些具體實施例中，當與低半乳糖的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的抑制HER2活性、與HER2結合及/或抑制HER2二聚化的能力。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有增加的抑制HER2活性、與HER2結合及/或抑制HER2二聚化的能力。在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有至少1.1倍高、至少1.2倍高、至少1.3倍高、至少1.4倍高、至少1.5倍高、至少1.6倍高、至少1.7倍高、至少1.8倍高、至少1.9倍高、至少2倍高、至少3倍高、至少5倍高、至少10倍高、高達至少100倍高或更高的抑制HER2活性、與HER2結合及/或抑制HER2二聚化的能力。
在某些具體實施例中，當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該高度半乳糖基化且於乳腺上皮細胞中製造的抗體群體具有增加的抑制HER2活性、與HER2結合及/或抑制HER2二聚化的能力。在某些具體實施例中，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。
在某些具體實施例中，該於乳腺上皮細胞中製造的抗HER2抗體群體在個體體內抑制HER2活性的能力優於在非乳腺上皮細胞中製造 的抗體。決定在個體體內HER2活性的程度可經由，例如，將該抗體群體投與至患有以HER2過度表現為特徵的疾病(例如HER2+乳癌)的個體體內來評估。在某些具體實施例中，該於乳腺上皮細胞中製造的抗HER2抗體群體與HER2結合的能力優於在非乳腺上皮細胞中製造的抗體。在某些具體實施例中，該於乳腺上皮細胞中製造的抗HER2抗體群體抑制HER2二聚化的能力優於在非乳腺上皮細胞中製造的抗體。用於決定抑制HER2活性、與HER2結合以及HER2二聚化的程度的分析已被廣泛建立(見如Bookman等人，臨床腫瘤學期刊，第21卷，第2期(1月15日)，2003年：第283-290頁；Gee等人，放射學期刊，2008年9月；第248卷第3期：第925至935頁；DeFazio-Eli等人，乳癌研究期刊，2011年，第13卷：R44頁)。
非人類哺乳動物乳腺上皮細胞與基因轉殖動物
在一方面，本發明提供一種製造高度半乳糖基化抗HER2抗體或具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供一種製造高度半乳糖基化抗HER2抗體或具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體群體的基因轉殖非人類哺乳動物。
在一方面，本發明涉及一種製造糖基化抗體的哺乳動物乳腺上皮細胞。本文提供了在哺乳動物乳腺上皮細胞中製造糖基化抗體的方法。該方法可經由在細胞培養物中培養乳腺上皮細胞(在活體外或離體)而完成。該方法亦可在基因轉殖動物(在活體內)中完成。
在某些具體實施例中，該哺乳動物乳腺上皮細胞係在基因轉殖動物體內。在某些具體實施例中，該哺乳動物乳腺上皮細胞已經過基 因工程改造而在基因轉殖動物，例如小鼠或山羊，的乳汁中表現重組抗體。為了達到此目標，編碼該重組蛋白的基因表現可以是，例如，在山羊β酪蛋白調節因子的控制下進行。在小鼠與山羊乳汁兩者中的重組蛋白，例如抗體，的表現已在先前被建立了(見如美國專利申請號US-2008-0118501-A1)。在某些具體實施例中，該表現係針對個別製造乳汁蛋白的乳腺導管上皮細胞進行優化。
可以製造重組抗體的基因轉殖動物可根據本領域習知之方法產生(見如美國專利號5,945,577與美國專利申請號US-2008-0118501-A1)。適合基因轉殖表現的動物，包括，但不限於山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。適合的動物也包括牛、山羊、綿羊與豬，其係分別與乳牛、山羊、綿羊與豬(或swine)的不同種類有關。適合的動物也包括有蹄類動物。如本文所使用，「有蹄類動物」係為或與有蹄典型地草食性四足哺乳動物有關，包括，但不限於，綿羊、豬、山羊、牛與馬。適合的動物也包括乳業動物，例如山羊與牛，或小鼠。在某些具體實施例中，該適合基因轉殖表現的動物為山羊。
在一具體實施例中，基因轉殖動物的產生係經由產生包含目標構築體的初代細胞，並接著將初代細胞的細胞核以核轉移到除核卵母細胞中達成。而包含目標構築體的初代細胞的產生係經由將包含目標抗體，如曲妥珠單抗的重鏈與輕鏈，的編碼序列之單一構築體注射或轉染至初代細胞中，或經由將包含抗體，如曲妥珠單抗，的重鏈與輕鏈之編碼序列的個別構築體與初代細胞共轉染或共注射而達成。這些細胞接著被擴展且被定性以評估基因轉殖的拷貝數、基因轉殖結構的完整性與染色體整合 位點。帶有所欲之基因轉殖拷貝數、基因轉殖結構的完整性與染色體整合位點的細胞接著被用來進行核轉移以製造基因轉殖動物。如本文所述，「核轉移」意指一種選殖方法，其中來自供體細胞的細胞核被轉植到除核卵母細胞中。
在哺乳動物乳腺上皮細胞中表現的抗體的編碼序列的獲得可以經由篩選基因組物質的基因庫或衍生自所選動物(例如人類、牛或小鼠)的反轉錄訊息RNA，來自如NCBI，Genbank的序列資料庫，或經由使用本領域習知之方法，如胜肽圖譜法，以獲得抗體的序列來進行。該序列可以被選殖到適當的質體載體中，並且在適當的宿主生物體，如E.coli，中擴增。如本文所使用，「載體」可以是任何數目的核酸，其中目標序列可以被插入在內，並透過限制酶切與連接作用以在不同的遺傳環境之間運輸或在宿主細胞中表現。載體一般由DNA所組成，雖然RNA載體也是可用的。載體包括，但不限於，質體與噬菌質體。選殖載體為可以在宿主細胞中複製的載體，其特徵還在於該載體可能在其上的一或多個內切酶限制位點以確切的方式被切，且目標DNA序列可以被連接在其內，使得該新重組的載體保留其在該宿主細胞中複製的能力。表現載體為經由限制酶切與連接作用可將目標DNA序列插入其內使其操作地與調節序列連接並可能被表現為RNA轉錄物的載體。載體可進一步包含一或多個適合用於辨識已被或未被轉型或轉染該載體的細胞的標記序列。標記包括，例如，增加或減少對抗生素或其他化合物之抵抗性或敏感性的蛋白質的編碼基因，其活性可以本領域習知之標準分析法(如，β-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酶)所偵測的酵素的編碼基因，以及明顯影響轉型或轉染細胞、宿主、菌落或噬菌斑的表現型 的基因。
抗體或目標抗體的重鏈與輕鏈的編碼序列可以被操作地連結至可以使編碼序列在基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中表現的控制序列。在擴增該載體之後，該DNA構築體可以被去除，自該載體的剩餘物中被純化，以及引入可用來製造基因轉殖動物的表現載體。該基因轉殖的動物將具有整合到其基因組的目標基因轉殖蛋白。
適合用於直接製造基因轉殖動物的乳汁的DNA序列可帶有衍生自天然來源的乳蛋白的5’端啟動子區域。因此，該啟動子是在激素與組織專一性因子的控制下，且在泌乳乳腺組織中最為活躍。在某些具體實施例中，所用之啟動子為乳汁專一性啟動子。如本文所使用，「乳汁專一性啟動子」為在將蛋白質分泌到乳汁的細胞(如，乳腺上皮細胞)中自然地直接表現基因的啟動子，且包括，例如，酪蛋白啟動子，如α-酪蛋白啟動子(如，α S-1酪蛋白啟動子與α S2酪蛋白啟動子)、β-酪蛋白啟動子(如，山羊β酪蛋白基因啟動子(DiTullio，生物科技學期刊，第10卷：第74-77頁，1992年))、γ-酪蛋白啟動子、κ-酪蛋白啟動子、乳清酸性蛋白(whey acidic protein，WAP)啟動子(Gorton等人，生物科技學期刊，第5卷：第1183-1187頁，1987年)、β-乳球蛋白啟動子(Clark等人，生物科技學期刊，第7卷：第487-492頁，1989年)與α-乳白蛋白啟動子(Soulier等人，FEBS LETTS期刊，第297卷：第13頁，1992年)。也包括於此定義者為在乳腺組織中專一性地活化的啟動子，例如，舉例來說，小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)的長末端重複(long terminal repeat，LTR)啟動子。在某些具體實施例中，該啟動子為山羊β酪蛋白啟動子。
啟動子可以被操作地連接到引導蛋白前導序列產物的DNA序列，該蛋白前導序列引導在整個乳腺上皮細胞中的該基因轉殖蛋白分泌到乳汁中。如本文所使用，當編碼序列與調節序列(如，啟動子)被說成是「操作地連結」或「操作地連接」時，他們以這樣的方式被連接以將該編碼序列的表現或轉錄作用置於該調節序列的影響或控制之下。如本文所使用，「前導序列」或「訊號序列」是編碼蛋白分泌訊號的核酸序列，且當操作地連接到編碼基因轉殖蛋白的下游核酸分子時會引導分泌作用。該前導序列可為天然的人類前導序列、人工衍生的前導序列，或可獲自用以引導該基因轉殖編碼序列的轉錄作用之啟動子的相同基因，或者獲自另一通常分泌自細胞，如哺乳動物乳腺上皮細胞，的蛋白質。在某些具體實施例中，3’端序列，其可衍生自天然分泌的乳蛋白，可以被添加以促進mRNA的穩定性。
在某些具體實施例中，為了製造含有用於以核轉移製造基因轉殖山羊的構築體(如，編碼曲妥珠單抗抗體)的初代細胞株，該重鏈與輕鏈構築體可以被轉染到初代山羊皮膚上皮細胞內，其被擴展且被充分定性以評估基因轉殖的拷貝數、基因轉殖結構的完整性與染色體整合位點。如本文所使用，「核轉移」意指一種選殖方法，其中來自供體細胞的細胞核被轉植到除核卵母細胞中。
選殖會造成基因轉殖動物的多樣性-每隻動物能製造抗體或其他目標基因構築體。該製造方法包括使用該選殖的動物與這些動物的後代。選殖亦包含胎兒的核轉移、核轉移、組織與器官移植以及嵌合後代的創造。選殖過程的步驟包含轉移細胞的基因組，如含有插入除核卵母細胞的目標基因轉殖的初代細胞。如本文所使用，「基因轉殖」意指以手段被 插入細胞的核酸分子的任何片段，或其祖先，且變成自該細胞發展為動物的基因組的部份。這樣的基因轉殖可包括對該基因轉殖動物而言為部分或全部外源(即，外來的)的基因，或可代表具有與該動物之內生性基因一致性的基因。適合作為卵母細胞的哺乳動物來源包括山羊、綿羊、乳牛、豬、兔、天竺鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、非人類靈長類動物等。較佳地，卵母細胞係獲自有蹄類動物，且最佳地為山羊或牛。卵母細胞分離的方法為本領域習知者。本質上，該程序包含自哺乳動物，如山羊，的卵巢或生殖道分離卵母細胞。有蹄類動物卵母細胞的一個現成的來源係來自以激素誘導的雌性動物。為了成功地使用如基因工程、核轉移與選殖等技術，在卵母細胞被用於作為核轉移的受體細胞之前，以及在卵母細胞被以精子細胞受精以發展成為胚胎之前，這些細胞較佳地可在活體內成熟。細胞分裂中期II階段的卵母細胞，其已在活體內成熟，已被成功地用於核轉移技術中。基本上，成熟中期II的卵母細胞係在發情開始後或注射人類絨毛膜促性腺素(human chorionic gonadotropin，hCG)或類似的激素後數小時，自非超排卵或超排卵的動物中以手術方式取得。
在某些具體實施例中，該基因轉殖動物(如，山羊)與乳腺上皮細胞細透過顯微注射所產生。在山羊中的顯微注射已在例如美國專利號US7,928,064中被描述。簡言之，在立體顯微鏡上自輸卵管PBS沖洗液中收集受精的山羊卵子，且於含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培養基中清洗。在原核仁可見的情況下，該胚胎可被立即進行顯微注射。若無法看見原核仁，可將該胚胎置於培養基中進行短暫培養，直到可見到該原核仁(Selgrath等人，動物繁殖學，1990年，第1195至1205頁)。單細胞山羊 胚胎被置於玻璃載玻片上油滴下的一微滴培養基中。具有二個可見原核仁的受精卵可在具有固定檯面的直立顯微鏡上被固定於火焰拋光的手持微量吸管上。使用細玻璃微針將存在於注射緩衝液中的編碼適當抗體的構築體微注射到原核仁內(Selgrath等人，動物繁殖學，1990年，第1195至1205頁)。微注射之後，將存活的胚胎置於培養物中且培養至該受體動物準備進行胚胎轉移(Selgrath等人，動物繁殖學，1990年，第1195至1205頁)。
因此，在一方面，本發明提供一種製造本文所揭露之抗體或抗體群體的乳腺上皮細胞。在某些具體實施例中，該抗體包含具有SQ ID NO：3的核酸與具有SEQ ID NO：4的核酸。在某些具體實施例中，該具有SQ ID NO：3的核酸與該具有SEQ ID NO：4的核酸相連接。本文所使用之「相連接」意指核酸實際上連接在一起，如在相同載體之內或在大致上相同的基因組位置之內。在某些具體實施例中，上述該乳腺上皮細胞係在基因轉殖非人類哺乳動物中。在某些具體實施例中，該基因轉殖非人類哺乳動物為山羊。
編碼曲妥珠單抗的重鏈的核酸序列係提供於SEQ ID NO：3內：
編碼曲妥珠單抗的輕鏈的核酸序列係提供於SEQ ID NO：4內：
在另一方面，本發明提供一種基因轉殖抗體，及其群體，的製造方法，該方法包含在基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中表現由核酸構築體編碼的基因轉殖抗體。在某些具體實施例中，本發明之抗體的製造方法包含： (a)將編碼抗HER2抗體的基因轉殖DNA構築體轉染至非人類乳腺細胞；(b)選擇細胞，其中該抗HER2基因轉殖DNA構築體已被插入該細胞的基因組中；以及(c)執行第一核轉移程序以產生異質結合該抗HER2抗體並且可以在其乳汁內表現該抗體的非人類基因轉殖哺乳動物。
在某些具體實施例中，該抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
在某些具體實施例中，該基因轉殖DNA構築體包含SEQ ID NO：3及/或SEQ ID NO：4。在某些具體實施例中，該非人類基因轉殖哺乳動物為山羊。
在另一方面，本發明提供一種下列之方法：(a)提供以基因工程改造以表現抗HER2抗體的非人類基因轉殖哺乳動物；(b)在該非人類基因轉殖哺乳動物的乳汁中表現該抗HER2抗體；以及(c)分離在該乳汁中表現的抗HER2抗體。
在某些具體實施例中，該抗HER2抗體包含具有SEQ ID NO：1的重鏈與具有SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該抗HER2抗體為曲妥珠單抗。
一種用於預測該表現於乳腺的重組蛋白質之量與質的工具是透過對泌乳的誘導(Ebert KM，1994年)。誘導泌乳可用於來自基因轉殖產物早期之蛋白質，而非來自因懷孕所造成的第一次自然泌乳之蛋白質的表現及分析，因懷孕所造成的第一次自然泌乳至少需一年以後。泌乳的誘導 可以激素或首動完成。
在某些具體實施例中，本文所提供之糖基化抗體的組合物進一步包含乳汁。在某些具體實施例中，本文所提供之方法包括自基因轉殖動物的乳汁中分離抗體群體的步驟。自基因轉殖動物的乳汁中分離抗體的方法為本領域習知者，且被描述於例如Pollock等人，免疫學方法期刊，第231卷，第1-2期，1999年12月10日，第147-157頁。在某些具體實施例中，本文所提供的方法包括純化帶有所需量的半乳糖基化之糖基化抗體的步驟。
治療方法、醫藥組合物、劑量與投與
在一方面，本發明提供包含投與高度半乳糖基化抗HER2抗體、高度半乳糖基化抗HER2抗體的組合物、具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗體群體、或包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗體群體的組合物至需要其之個體的方法。在某些具體實施例中，該半乳糖基化抗HER2抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該個體罹患癌症。在某些具體實施例中，該個體罹患以過度表現HER2為特徵的癌症(HER2+癌症)。決定癌症的HER2狀態的方法為本領域中的常規技術，例如，有二個FDA批准的市售套組可用(Dako公司的HercepTestTM套組與Ventana公司的Pathway Her-2套組)。在某些具體實施例中，該HER2+癌症為乳癌、卵巢癌、胃癌或子宮癌。
在一方面，本發明提供包含投與高度半乳糖基化抗HER2抗體、高度半乳糖基化抗HER2抗體的組合物、具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗體群體、或包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗 體群體的組合物至需要其之個體的方法。在某些具體實施例中，該半乳糖基化抗HER2抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該個體罹患乳癌、膽道癌、膀胱癌、腦癌包括神經膠母細胞瘤與神經管胚細胞瘤、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、血液系統腫瘤包括急性淋巴細胞和骨髓性白血病、T-細胞急性淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、愛滋病相關的白血病與成人T細胞白血病淋巴瘤、上皮內腫瘤包括波文氏症(Bowen’s disease)與佩吉特氏病(Paget’s disease)、肝癌、肺癌、淋巴瘤包括霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)與淋巴細胞性淋巴瘤、神經母細胞瘤、口腔癌包括鱗狀細胞癌、卵巢癌包括上皮細胞、基質細胞、生殖細胞和間質細胞產生者、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤，纖維肉瘤與骨肉瘤、皮膚癌包括黑色素瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sacroma)、基底細胞癌與鱗狀細胞癌、睾丸癌包括胚腫瘤如精原細胞瘤、非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、基質瘤與生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌包括甲狀腺腺癌與髓質癌，以及腎癌包括腺癌或威爾姆斯瘤(Wilms tumor)。
在一方面，本發明提供包含投與高度半乳糖基化抗HER2抗體、高度半乳糖基化抗HER2抗體的組合物、具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗體群體、或包含具有高半乳糖基化程度的抗HER2抗體之抗體群體的組合物至需要其之個體的方法。在某些具體實施例中，該半乳糖基化抗HER2抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該方法進一步包括投與除了該抗HER2抗體之外的化學治療劑。化學治療劑包括胺甲蝶呤、長春新鹼、阿德力黴素、順鉑、含有氯乙亞硝脲的非糖類、5-氟尿嘧啶、絲裂 黴素C、博來黴素、多柔黴素、達卡巴嗪、紫杉醇、弗拉吉林、葡甲胺GLA、戊柔比星、亞硝脲氮芥與聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基轉移酶抑制劑、法尼基轉移酶抑制劑、基質金屬蛋白酶、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐斯樸達/PSC833、諾消靈/米托蒽醌、Metaret/蘇拉明、巴馬司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA2516/馬立馬司他、BB2516/馬立馬司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、必醫你舒/OK-432、AD 32/戊柔比星、美他特龍/鍶衍生物、泰道/替莫唑胺、阿霉素脂質體/微脂體多柔黴素、Yewtaxan/紫杉醇，紫杉醇/太平洋紫杉醇、截瘤達/卡培他濱、氟鐵龍/去氧氟尿苷、Cyclopax/紫杉醇口服、口服紫杉烷、SPU-077/順鉑、HMR 1275/夫拉平度、CP-358(774)/表皮生長因子受體、CP-609(754)/RAS致癌基因抑製劑、BMS-182751/口服鉑、優福定(替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增強劑、開普拓/左旋咪唑、Camptosar/伊立替康、圖莫得/雷替曲塞、樂司他丁/克拉屈濱、Paxex/紫杉醇、Doxil/微脂體多柔黴素、Caelyx/微脂體多柔黴素、達拉濱/氟達拉濱、表阿霉素/泛艾黴素、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/雙萘、LU 103793/海兔毒素、Caetyx/微脂體多柔黴素、健擇/吉西他濱、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘種子、CDK4與CDK2抑製劑、PARP抑製劑、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/異環磷醯胺、威猛/替尼泊苷、伯爾/卡鉑、Plantinol/順鉑、泛必治/依托泊苷、ZD 9331、泰索帝/多西他賽、鳥嘌呤阿拉伯糖苷的前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、烷基化劑如美法侖(與 環磷醯胺、氨魯米特、天門冬醯胺酶、硫酸布他卡因、卡鉑、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、更生黴素、柔紅黴素鹽酸、雌莫司汀磷酸鈉、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷，氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羥基脲(羥基脲)、異環磷醯胺、干擾素α-2a、α-2B、醋酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類似物)、洛莫司汀(CCNU)、鹽酸氮芥(氮芥)、硫醇嘌呤、美司那、米托坦(o.p’-DDD)、鹽酸米托蒽醌、奧曲肽、普卡黴素，鹽酸甲基芐肼、鏈佐星、他莫昔芬檸檬酸鹽、硫鳥嘌呤、塞替派、硫酸長春鹼、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、紅血球生成素、六甲嘧胺(HMM)、介白素2、米托胍腙(甲基-GAG；甲基乙二醛二腺；MGBG)、噴司他丁(2’去氧柯福黴素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)與硫酸長春地辛，但不限於此。
在一方面，本發明提供一種包含定量之抗體或抗體群體的醫藥組合物以及醫藥上可接受之載體、稀釋劑或載劑。在某些具體實施例中，該組合物包含乳汁。
在一方面，本發明提供一種治療個體的方法，包含投與個體組合物，所提供的量可有效治療該個體所罹患或有風險會罹患之一疾病。在一具體實施例中，該個體為人類。在另一具體實施例中，該個體為非人類動物，如一狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊或靈長類動物。
根據涉及投與需要治療的個體治療有效量的本文所提供之抗體的具體實施例，「治療有效的」或「對治療有效的量」表示抑制或逆轉疾病狀態(如，治療癌症)所需之抗體或組合物的量。確定治療有效量特定而言取決於該藥物的毒性與功效等因子。這些因子將取決於其他因子例如效力、相對生物利用度、病患體重、不良副作用的嚴重性以及較佳的投與方 式，而有所不同。使用本領域習知的方法可確定毒性。利用相同的指導可確定功效。例如，可透過癌症進展的減少來測量功效。因此，一醫藥有效量是由臨床醫師所認為在毒理學上可耐受但有效的量。
劑量可被適當地調整以達到所需之藥物(如，抗HER2抗體)含量，局部或全身性的，取決於投與的方式。在個體對某個劑量的反應不足的情況下，可施用較高的劑量(或經由一個不同的、更局部化的遞送途徑的有效較高劑量)至該病患允許忍受的範圍。可計劃每天使用多劑量以達到抗體的適當全身性含量。適當全身性含量可透過，例如測量該病患體內該藥物之高峰或持續的血漿含量來確定。「劑量」與「用量」在本文可互換使用。
在某些具體實施例中，投與一個體的抗體或醫藥組合物的量為50至500mg/kg、100至400mg/kg、或200至300mg/kg每週。在一具體實施例中，投與一個體的抗體或醫藥組合物的量為250mg/kg每週。在某些具體實施例中，在第一週時投與一個體400mg/kg的起始劑量，接著在接下來的幾週投與該個體250mg/kg的劑量。在某些具體實施例中，投與速度小於10mg/分鐘。在某些具體實施例中，在以其他治療劑治療之前至少一個小時前投與一個體該抗體或醫藥組合物。在某些具體實施例中，在投與該抗體或醫藥組合物之前先給與預處理。
在某些具體實施例中，所提供的組合物是被應用於活體內。根據在活體內預期投與的方式，所用的組合物可為固體、半固體或液體形式，例如，片劑、丸劑、粉劑、膠囊製劑、凝膠製劑、軟膏製劑、液體製劑、懸浮製劑，或其類似物。較佳地，該組合物以適合單一投與的精確用 量數的單位劑量形式投與。根據所需製劑形式，該組合物亦可包括醫藥上可接受之載劑或稀釋劑，其係定義為以水為基底的載劑，通常用於配製投與動物或人類的醫藥組合物。選擇不會影響目標人類重組蛋白質生物活性的稀釋劑。這類稀釋劑的實例有蒸餾水、生理食鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液與Hank’s溶液。相同的稀釋劑可被用於重新懸浮已凍乾的目標重組蛋白質。此外，該醫藥組合物亦可包括其他藥用劑、藥劑、載劑、佐劑、無毒、無治療性、非免疫原性的穩定劑等。這類稀釋劑或載劑的有效量為就成分的溶解性、生物活性等獲得一醫藥上可接受之製劑的有效量。在某些具體實施例中，本文所提供的組合物是無菌的。
在活體內治療期間可透過任何數量的途徑投與，包括口服、腸胃外、肌肉、鼻內、舌下、氣管內、吸入、眼、陰道與直腸。也可使用囊內的、靜脈內，以及腹腔內的投與途徑。本領域技術人員辨識到，依照要被治療的病症的不同，投與途徑也不同。例如，本文之組合物或抗體可經由口服、腸胃外或局部投與。在一具體實施例中，本文之組合物或抗體經由靜脈輸入方式投與。
當需要將組合物以全身性方式遞送，該組合物可配製為用於腸胃外注射的投與方式，如推注或連續輸注。注射用製劑可以單位劑量形式存在，如在安瓿中或在多劑量容器中，並加入防腐劑。該組合物可為懸浮液、溶液或在油性或水性載體內的乳劑，且可已包含配製劑，如懸浮、穩定及/或分散劑。
用於腸胃外投與的醫藥製劑包括以水可溶形式存在的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的懸浮液可製備為適當的油性注射懸 浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三酸甘油酯，或脂質體。水性注射懸浮液可包含增加該懸浮液黏度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇，或葡聚糖。視情況，該懸浮液亦可包含適當的穩定劑或增加該組合物之溶解度而可製備高濃縮溶液的試劑。另外，該活性組合物在使用之前可為粉末形式，而可與適當的載體組成，如無菌無致熱原水。
對於口服投與，該醫藥組合物可採取下列形式，例如，透過常規方法以醫藥上可接受之賦形劑如結合劑(如，預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)製備的片劑或膠囊；填充劑(如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石或矽石)；崩解劑(如，馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)；或潤濕劑(如，十二基硫酸鈉)。片劑可以本領域習知的方法進行包覆。口服用液體製劑可以採取的形式有，例如，溶液、糖漿或懸浮液，或其在使用前以乾產品呈現，用以與水或其他適當載體組成。這種液體製劑的製備可透過常規方法加上醫藥上可接受之添加劑如懸浮劑(如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(如，甲基或丙基-對羥基苯甲酸酯或山梨酸)。該製劑也可適當地含有緩衝鹽、調味劑、著色劑和甜味劑。該一成分或多成分可被化學修飾，使得該抗體的口服遞送是有效的。一般而言，擬進行的化學修飾是將至少一分子貼附到該抗體上，其中該分子可以(a)抑制蛋白質水解；以及(b)從胃或腸吸收到血流中。增加該抗體的整體穩定性與增加在體內循環的時間也是期望的目標。這類分子的實例包括：聚乙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚 物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮與聚脯胺酸。Abuchowski與Davis，1981年，「可溶性聚合物-酵素加成物」在：酵素作為藥物，Hocenberg和Roberts編著，Wiley-Interscience出版社，紐約，紐約，第367-383頁；Newmark等人，1982年，應用生物化學期刊，第4卷：第185-189頁。其他可以使用的聚合物為聚-1,3-二氧戊環與聚-1,3,6-三氧辛環(tioxocane)。較佳用於醫藥的使用，如上所指出的，為聚乙二醇分子。用於口服組合物中，釋放的位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸，或迴腸)，或大腸。本領域技術人員具有不會在胃中溶解，但會在十二指腸或在腸中其它地方釋出物質的可用配方。較佳地，所述釋放將避免胃部環境的有害作用，無論是透過抗體的保護作用，或是透過將生物活性物質在胃之外的環境中，如在腸中釋放。
對於口腔投與，該組合物可採取以常規方式配製的片劑或錠劑的形式。
對於吸入投與，根據本發明，供使用的組合物可以由加壓包呈現的氣溶膠噴霧或噴霧器來被方便地遞送，並使用合適的推進劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適合的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以經由提供一閥門以遞送計量的量來確定。膠囊與例如用於吸入器或吹入器的明膠的卡匣可配製成含有該組合物與合適的粉末基質如乳糖或澱粉的粉末混合物。
本文還可預想的為肺部給藥。該組合物可被遞送到哺乳動物的肺部，當吸入並穿過肺部上皮內層到血流中。預想用於本發明的實踐中的是一大範圍的設計用於治療性產品之肺部給藥的機械裝置，包括但不限 於噴霧器、計量劑量吸入器與粉末吸入器，所有的這些都是本領域技術人員所知悉的。
還可以設想本文所揭露之醫藥組合物的經鼻遞送。經鼻遞送可在將該治療性產品投與到鼻部後，使本發明之醫藥組合物直接通行到血流中，而無需在肺中沉積該產品。用於經鼻遞送的製劑包括帶有葡聚醣或環糊精的製劑。
該組合物也可配製成直腸或陰道組合物，如栓劑或保留灌腸劑，如含有常規栓劑基質如可可脂或其它甘油酯。
該醫藥組合物還可包括合適的固體或凝膠相載劑或賦形劑。這類載劑或賦形劑的實例包括但不限於碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、澱粉、纖維素衍生物、明膠與如聚乙二醇的聚合物。
合適的液體或固體醫藥製劑形式為，例如，用於吸入的水或鹽溶液、微膠囊、蝸形體、包覆到顯微金顆粒、包含在脂質體中、噴霧劑、氣霧劑、用於植入到皮膚上的丸劑，或者一尖銳物體上乾燥以被劃入皮膚中。該醫藥組合物還包括顆粒劑、散劑、片劑、包衣片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、乳膏、滴劑或長期釋放活性組合物的製劑，其製備賦形劑與添加劑及/或助劑，例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑或增溶劑係如上所述通常地被使用。該醫藥組合物適合用於各種藥物遞送系統。對於藥物遞送方法的簡要綜述，見Langer，科學期刊，第249卷：第1527-1533頁，1990年，其以引用方式併入本文。
該抗體與視情況的其它療法可以本身(淨)投與或以醫藥上可接受之鹽類的形式。當用於藥物中，該鹽類應當是醫藥上可接受的，但 非醫藥上可接受之鹽類可方便地用於製備該醫藥上可接受之鹽類。這樣的鹽類包括，但不限於，那些由下列酸所製備者：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、丁烯二酸、醋酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸，以及苯磺酸。再者，這些鹽類可以製備成鹼金屬或鹼土金屬鹽，如羧酸基團的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
合適的緩衝劑包括：醋酸與鹽類(1-2% w/v)；檸檬酸與鹽類(1-3% w/v)；硼酸與鹽類(0.5-2.5% w/v)；以及磷酸與鹽類(0.8-2% w/v)。合適的防腐劑包括氯化烷基二甲基苄基銨(0.003-0.03% w/v)；氯丁醇(0.3-0.9% w/v)；對羥苯甲酸甲酯(0.01-0.25% w/v)以及硫柳汞(0.004-0.02% w/v)。
本發明之醫藥組合物含有有效量的抗體以及包括在醫藥上可接受之載劑內的視情況的治療劑。醫藥上可接受之載劑乙詞意指一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或膠囊充填物質，其係適合投與至一人類或其他脊椎動物。載劑乙詞表示一有機或無機成分、天然或合成的，與活性成分結合以便於應用。該醫藥組合物的成分也能夠與本發明之組合物混合，且彼此，以沒有任何會顯著損害所要之醫藥功效的相互作用的方式混合。
該治療劑，特定而言包括但不限於抗體，可在顆粒中被提供。如本文所使用，顆粒意指奈米或微米顆粒(或在某些情況下更大)，其可存在於該抗體的全部或部分中，或其他與該抗體一起投與的治療劑。除了治療劑之外，該顆粒可包括經常用於藥學與醫藥領域的物質，包括，但不僅限於，易侵蝕的、不易侵蝕的、可生物降解的，或不能生物降解的物質或其組合。該顆粒可以是含有在溶液或半固體狀態之抗體的微膠囊。該顆 粒實際上可以是任何形狀的。
抗體的製造方法
在一方面，本發明提供製造高度半乳糖基化抗HER2抗體與具有高半乳糖基化程度的抗體群體的方法。
在一方面，本發明提供一種製造抗體群體的方法，包含：在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中表現抗體群體，以製造抗體群體，其中該抗體為抗HER2抗體，且其中在該群體中的抗體的半乳糖基化的程度為至少70%。在某些具體實施例中，該抗HER2抗體為曲妥珠單抗。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞係於培養物中，且轉染包含編碼該抗體的序列之核酸。在某些具體實施例中，該核酸包含SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞係於以基因工程改造以在其乳腺中表現包含編碼該抗體之序列的核酸的非人類哺乳動物中。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬的乳腺上皮細胞。在某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞為山羊的乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供表現本文所揭露之高度半乳糖基化抗HER2抗體或具有高半乳糖基化程度的抗體群體的乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供一種包含表現本文所揭露之高度半乳糖基化抗HER2抗體或具有高半乳糖基化程度的抗體群體之乳腺上皮細胞的基因轉殖非人類哺乳動物。
在一方面，本發明提供一種用於製造糖基化抗體或糖基化抗體群體的方法，該方法包含在基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中表現由核 酸構築體編碼的糖基化抗體。在一具體實施例中，哺乳動物乳腺上皮細胞是經過基因工程改造可在其乳汁中表現抗體的非人類哺乳動物乳腺上皮細包。在又一具體實施例中，該哺乳動物乳腺上皮細胞是在培養物中的哺乳動物乳腺上皮細胞。
在另一具體實施例中，該方法包含：(a)提供以基因工程改造以表現抗體的非人類基因轉殖哺乳動物；(b)在該非人類基因轉殖哺乳動物的乳汁中表現該抗體；(c)分離在該乳汁中表現的抗體；以及(d)偵測該分離的抗體上半乳糖的存在。
在另一具體實施例中，該方法包含在乳腺上皮細胞中製造糖基化抗體群體，使得該製造的糖基化抗體群體包含特定比例的半乳糖基化作用(如，至少70%、至少80%、至少90%，或更高)。在某些具體實施例中，該抗體為抗HER2抗體。在某些具體實施例中，該糖基化的抗體包含具有SEQ ID NO：1的重鏈與具有SEQ ID NO：2的輕鏈。在某些具體實施例中，該方法在體外進行。在其它具體實施例中，該方法在體內，如在基因轉殖山羊的乳腺中進行。
在某些具體實施例中，上述方法進一步包含用於誘導泌乳的步驟。在其它具體實施例中，該方法進一步包含附加的分離及/或純化步驟。在其它具體實施例中，該方法進一步包含用於比較所得的抗體與在細胞培養物，如非乳腺細胞培養物，中製造的抗體的糖化作用模式的步驟。在進一步的具體實施例中，該方法進一步包含用於比較所得的抗體與由非乳腺上皮細胞所製造的抗體的糖化作用模式的步驟。這樣的細胞可以是一細胞 培養物的細胞。在某些具體實施例中，糖化作用模式為存在於一抗體或抗體群體上的半乳糖的量。在某些具體實施例中，該方法進一步包含比較存在於糖基化抗體群體內的半乳糖的百分比與存在於以細胞培養物，如非乳腺細胞培養物，中製造的糖基化抗體群體內的半乳糖的百分比。用於評估該抗體的糖化作用模式的實驗技術可以是本領域通常技藝者所知悉的，或是本文所提供者，例如在以下實施例中所述。這樣的方法包括，如，液相層析質譜法、串聯質譜法，以及西方墨點分析法。
在某些具體實施例中，該抗體的獲得可透過自本文所提供之製得的基因轉殖動物或自該基因轉殖動物的後代的乳汁中收集該抗體而得。在某些具體實施例中，由該基因轉殖哺乳動物製造的抗體被製造的量為每公升所得的乳汁中至少具有1公克。有利地，根據本發明之方法每公升乳汁可製造至少4公克。在某些具體實施例中，本文所述之方法每公升可製造至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70公克。在某些具體實施例中，本文所述之方法每公升可製造至少60公克。在某些具體實施例中，本文所述之方法每公升可製造至少70公克。
除非本文另有界定之外，本發明所使用之科學與技術術語應具有由本領域之通常技術人員所通常理解的含義。再者，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。本發明之方法與技術係根據本領域習知之常規方法所通常進行的。一般而言，與所用之命名法有關的，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學以及蛋白質與核酸化學與本文所述之雜交技術皆為本領域所知悉且常用的。本發明之方法與技術的一般執行係根據本領域習知之常規方法以及在 各種一般且更為特定的參考文獻中所描述者，除非另有指明，否則這些參考文獻在本發明整個說明書中被引用並討論。
本發明進一步由下列實施例所闡釋，該實施例不應以任何方式被解釋為進一步限制。本申請案中所引用的所有參考文獻(包括圖書資料參考文獻、已授權的專利、公開的專利申請案，以及共同申請中的專利申請案)的全部內容在此以引用的方式明確地被併入本文。
實施例
材料與方法
製造曲妥珠單抗的基因轉殖山羊的產生
產生在其基因組中包括編碼曲妥珠單抗抗體的核酸序列的基因轉殖山羊。該製造曲妥珠單抗的山羊係以傳統顯微注射技術(見，如美國專利號US 7,928,064)產生。編碼該重鏈與該輕鏈的cDNA(SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4)係與β酪蛋白表現載體連接以得到構築體BC2601 HC與BC2602 LC。在這些質體中，編碼曲妥珠單抗的核酸序列係於一促進曲妥珠單抗在山羊的乳腺中表現的啟動子的控制下。移除該原核序列且將DNA顯微注射至預先植入山羊的胚胎內。接著將這些胚胎轉移至假性懷孕的雌性內。篩選出存在該基因轉殖之所得到的後代。帶有兩種鏈者被確認為基因轉殖創始者。
當年齡適當時，培育這些創始動物。在懷孕與分娩後收集其乳汁。分娩後開始泌乳的時程為以天計算(如，第7天)。在每個時間點自乳汁中純化曲妥珠單抗抗體並如本文所述分析其特性。
實施例1：以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗
經由自抗體中釋放該N-聚醣並在一管柱上運作分析該被釋放的寡醣(「寡醣特徵」)以確定在基因轉殖山羊的乳汁中製造的曲妥珠單抗抗體的糖化作用模式。
圖1-圖4與圖6顯示來自1號山羊(圖2-圖4)與2號山羊(圖1與圖6)的以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體中釋放的N-聚醣寡醣。該單醣基係以下列描述：黑色方格：N-乙醯葡萄糖胺(GlcNac)
三角形：岩藻糖
灰色圓圈：甘露糖
白色圓圈：半乳糖
灰色菱形：N-羥乙醯神經胺酸(NGNA)：一唾液酸
白色菱形：N-乙醯神經胺酸(NANA)：一唾液酸。
圖1顯示了從在2號山羊的乳汁中製造的基因轉殖曲妥珠單抗抗體釋放的N-聚醣寡醣的代表性層析圖。圖1顯示了製造的主要N-聚醣寡醣(在圖1A中21個，而在圖1B中20個)，14個在其N-聚醣鏈中具有至少1個半乳糖，與7個具有2個半乳糖的寡醣。這些寡醣中的6個為純寡甘露糖。圖1亦顯示出製造的主要寡醣，其中9個為岩藻糖基化的。
圖2-圖4顯示了在泌乳第7天(圖2)、泌乳第15天(圖3)與泌乳第30天(圖4)時，從在1號山羊中採收的乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體釋放的N-聚醣寡醣的層析圖。
從在1號山羊的乳汁中製造的曲妥珠單抗抗體分離出的所有N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖5中。圖5亦以表格形式列出單半乳糖基 化的總百分比、雙半乳糖基化的百分比、總半乳糖基化(單半乳糖基化+雙半乳糖基化)的百分比、根據以上提供的公式所計算的半乳糖基化的百分比、根據以上提供的公式所計算的岩藻糖基化的百分比，以及在1號山羊中製造的曲妥珠單抗抗體的半乳糖基化對岩藻糖基化的比例。該結果亦摘要於下列表1中：
圖6顯示了在泌乳第7天時，從在2號山羊中採收的乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體釋放的N-聚醣寡醣的層析圖。
從在泌乳第7天時的2號山羊的乳汁中製造的曲妥珠單抗抗體分離出的所有N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖7中。圖7亦以表格形式列出單半乳糖基化的總百分比、雙半乳糖基化的百分比、總半乳糖基化(單半乳糖基化+雙半乳糖基化)的百分比、根據以上提供的公式所計算的半乳糖基化的百分比、根據以上提供的公式所計算的岩藻糖基化的百分比，以及在泌乳第7天的2號山羊中製造的曲妥珠單抗抗體的半乳糖基化對岩藻糖基化的比例。圖8呈現了從在泌乳第15、49、84與112天時的2號山羊的乳汁中製造的曲妥珠單抗抗體分離出的不同N-聚醣寡醣的相對百分比。該結果 亦摘要於下列表2中：
實施例2：在其他動物中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗的糖化作用分析
存在於在泌乳第7天時的3號山羊與在泌乳第3/4天時的4號山羊的乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體的不同N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖9中，也摘要於下表3中。
存在於在泌乳第3天時的5號山羊與在泌乳第5、6、7天時的6號山羊的乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體的不同N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖10中，也摘要於下表4中。
存在於在二次泌乳第8、15及29天時的2號山羊的乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體的不同N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖11中，也摘要於下表5中。
存在於市售賀癌平®/曲妥珠單抗的不同N-聚醣寡醣的相對百分比描述於圖12中，也摘要於下表6中。
表6：市售賀癌平®/曲妥珠單抗製造的數據摘要單半乳糖(%) 35.5
圖13所示為比較由2號山羊在首次泌乳(NL1)與二次泌乳(NL2)不同天數時製造的曲妥珠單抗的唾液酸與甘露糖修飾以及主要形式的摘要。
圖14所示為在1至6號山羊中製造的曲妥珠單抗的唾液酸與甘露糖修飾以及主要形式的摘要。
實施例3 以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗的特性
比較在山羊乳汁中以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗與市售賀癌平®/曲妥珠單抗的功能特徵。對與表現HER2的細胞株的結合親和力、在NK細胞上的CD16以及C1q蛋白進行定量。此外，評估這些抗體透過抗體依賴型細胞調節的細胞毒性(Antibody-dependent Cell-Mediated Cytotoxicity，ADCC)與補體依賴型細胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)以誘導表現HER2的細胞株裂解的能力，以及評估這些抗體抑制細胞增殖的能力。
對於以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B、市售賀癌平®/曲妥珠單抗(羅氏大藥廠)，在表現HER2的SK-BR-3細胞株上的抗體辨識也是相同的順序(任意解離常數，Kd，2-6μg/ml)。以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗抗體與NK細胞表現的CD16受體結合且批次A的IC50值為30μg/ml，而批次B的IC50值為25 μg/ml。相較之下，賀癌平®/曲妥珠單抗的IC50值為37μg/ml，這表示以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗的結合是在市售賀癌平®/曲妥珠單抗的IC50值的範圍之內。類似地，每個受測抗體透過抗體依賴型細胞調節的細胞毒性(ADCC)以誘導SK-BR-3細胞裂解的能力也是可相比的。
每個受測抗體調節SK-BR-3細胞上補體依賴型細胞毒性(CDC)活性的能力也是可相比的。市售賀癌平®/曲妥珠單抗、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A與批次B分別誘導55、55與50%的BT-474細胞上的生長抑制。
材料與方法
與表現HER2的SKBR-3細胞株的結合分析
試劑
- 抗-HER2抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
- 目標細胞
‧SK-BR-3細胞
方法
將2 x 105個細胞與100μl的抗-HER2抗體(10μg/ml)在4℃下培養30分鐘。清洗之後，以與藻紅蛋白耦合的山羊抗-人類(H+L)抗體(100μl的1：100稀釋倍數)來偵測人源化HER2單株抗體，並於4℃下培養30分鐘。清洗之後，以流式細胞儀(FC500，Beckman Coulter公司)分析細胞。
相對解離常數(Kd)的確定-與細胞表面抗原結合的抗體
試劑
- 抗-HER2抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
方法
將2 x 105個細胞與100μl不同濃度(最終濃度為0至50μg/ml)的與Alexa 488耦合的抗-HER2抗體在4℃下培養30分鐘。清洗之後，以流式細胞儀(FC500，Beckman Coulter公司)分析細胞。
使用PRISM軟體來計算最大結合(Bmax)與任意解離常數(Kd)的數值。以μg/ml表示的任意Kd並不代表通常以nM來表示的真正的親和力數值，但是提供了研究的抗體之間強度的順序。
與NK細胞表現的CD16的量化交互作用之分析
試劑
- 抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
- 以負面耗盡法(Miltenyl生技公司)純化萃取自一健康捐贈者的周邊血液的NK作用細胞
- 目標細胞
‧SK-BR-3細胞
方法
使用與抗CD16抗體(3G8選殖系)競爭分析法來測量與NK細胞表現的CD16結合的單株抗體。
以負面耗盡法(Miltenyl)自健康捐贈者的周邊血液純化的NK細胞與不同濃度(0至83μg/ml)的抗HER2抗體(賀癌平®或以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗)，與一固定濃度的結合PE之抗CD16抗體3G8(3G8-PE)共同培養。清洗之後，以流式細胞儀分析結合在NK細胞上的CD16受體之3G8-PE。以結合的百分比表示觀察到的平均螢光值(mean fluorescence values，MFI)，其中100%為不添加一受測抗體所觀察到的值，其對應於G38結合的最大量，且0%對應於沒有3G8-PE抗體時的MFI。使用PRISM軟體計算每種帶測抗體的IC50，即誘發抑制50%的3G8抗體結合所需的抗體濃度。
抗體依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)分析
試劑
- 抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
‧抗遺傳型FVIII抗體(一種以大鼠融合瘤YB2/0製造的嵌合抗因子VIII抗體)，也稱為「抗-id FVIII(抗體)」。
- 作用細胞
‧以負面耗盡法(Miltenyl生技公司)純化萃取自一健康捐贈者的周 邊血液的NK作用細胞。
- 目標細胞
‧SK-BR-3細胞
方法
將SK-BR-3目標細胞與NK細胞以及增加濃度的抗HER2抗體種於96孔盤中，作用細胞/目標細胞：10/1。
培養16小時後，透過量化釋放到來自該裂解的目標細胞的上清液中的胞內酵素乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，以層析法測量以抗HER2抗體誘導的目標細胞裂解。
分析
根據下列方程式計算裂解百分比：裂解百分比=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]
其中ER與SR分別代表實驗性與自發性LDH的釋放；而NC代表自然的細胞毒性。
該結果(裂解百分比)被表示為該抗體濃度(0-5000ng/ml)的函數。使用PRISM軟體來計算Emax，即最大裂解百分比，與EC50，即誘導50%的最大裂解的抗體的量。
補體依賴型細胞毒性(CDC)分析
試劑
- 抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
‧抗-id FVIII抗體
- 目標細胞
‧SK-BR-3細胞
方法
將目標細胞與增加濃度的抗HER2抗體(0至25000ng/ml)在含有作為補體來源的小兔血清(稀釋至1/10)的環境下共同培養。在37℃下培養1小時後，以螢光儀(羅氏應用科學公司)測量透過裂解目標細胞而釋放到上清液的LDH的量，且用以計算由受測抗體調節的CDC活性的百分比。
分析
根據下列方程式計算裂解百分比：裂解百分比=ER-SA
ER：實驗性反應
SA：當目標細胞培養於補體存在、沒有抗體的環境下所獲得之自發性活性。
結果以裂解百分比表示，做為該抗體濃度的函數。
C1q蛋白結合分析
試劑
- 抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
‧抗-id FVIII抗體
- C1q蛋白(Sigma公司)
- 兔抗人類C1q蛋白多株抗體(DAKO公司)
- 豬抗兔IgG HRP多株抗體(DAKO公司)
- 2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(Sigma公司)
- 溶於PBS的1% SDS(Fluka公司)
方法
簡言之，將增加濃度(0至10μg/ml)的抗HER2抗體塗布在96孔盤上，置於4℃下整夜。以PBT(PBS、BSA 1%，Tween-20 0.05%)進行飽和作用1小時後，加入稀釋為2μg/ml的人類C1q蛋白且在室溫下培養1小時。然後，透過塗布兔抗人類C1q蛋白多株抗體，接著以結合辣根過氧化酶(horse radish peroxidase，HRP)的豬抗兔IgG多株抗體來辨識結合的C1q蛋白。加入受質ABTS，接著與過氧化酶反應，以形成一可在波長405nm下讀取的藍綠色反應產物。加入與在該孔內的受質等體積的1%SDS以終止反應。
細胞增殖分析
試劑
- 抗體：
‧賀癌平®(曲妥珠單抗)(羅氏大藥廠)
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A
‧以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B
‧抗-id FVIII抗體
- 目標細胞
‧BT-474細胞
方法
以1 x 104細胞/孔的濃度將目標細胞種於96孔盤內，且與增加濃度(0至100μg/ml)的抗HER2抗體於37℃下培養72小時。所有的稀釋皆在細胞培養基中進行(最終體積為100μL/孔)。
喜樹鹼(1μg/ml)，為一種抑制DNA酵素拓樸異構酶I(topoisomerase I，topo I)的細胞毒性喹啉鹼，係用來作為在相同條件下抑制細胞增殖的正對照組。
分析
以可決定活細胞數目的「細胞滴度96水性單溶液細胞增殖分析」(PROMEGA公司)比色法在第3天時測量細胞增殖量。簡言之，該MTS受質被細胞生物還原為有色的甲臢。甲臢產物的量，以在波長490nm下的吸光值測量，與在培養物中的活細胞數目直接成正比。
每孔加入20μl的MTS。根據該特定細胞株的代謝作用培養2小時後，以一96孔盤讀取儀記錄在波長490nm下的吸光值。以細胞生長的百分比或抑制增殖的百分比表示結果，其中100%對應於在沒有抗體的情況下的目標細胞增殖作用。
結果
與表現HER2的細胞株的結合
如圖15所示，相較於負對照組，以白色顯示，市售賀癌平®/曲妥珠單抗以及二個批次的以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗，批次A與B，皆被辨識到，且與表現HER2的SK-BR-3細胞株結合。
相對Kd的確定
進行四個獨立的結合分析，且該分析的平均值以圖16表示，而相對應之數據則顯示於表7與8。以每個受測抗體濃度(0-50μg/ml)的平均螢光強度(MFI)來表示抗HER2抗體與表現HER2的SK-BR-3細胞膜的結合。任意Kd並不代表真正的親和力數值(nM)，但提供了所研究的抗體之間的強度的比較順序。如表7所示，以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B以及市售賀癌平®/曲妥珠單抗的平均任意Kd值(給予50%的高原值的濃度)各為6.16μg/ml、3.99μg/ml以及1.95μg/ml。由於賀癌平的IgG濃度未定且可能影響Kd值的確定，這些實驗顯示市售賀癌平®/曲妥珠單抗以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗對表現HER2的細胞具有相似的結合作用。
衍生自4個實驗的平均值的結果分別以MFI以及μg/ml表示。
與由NK細胞表現的CD16的交互作用
使用3G8-PE單株抗體以競爭性分析來研究每個抗HER2抗體與由NK細胞表現的CD16結合的能力。圖17所示為市售賀癌平®、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B的競爭性CD16結合數據，其中CD16+ NK細胞與增加量的抗HER2抗體以及與PE結合的抗CD16+ 3G8單株抗體一起培養。3G8結合的百分比的計算方式如材料與方法部分所述。市售賀癌平®、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B之將3G8-PE單株抗體的結合降低到50%所需之單株抗體的量分別為37、30與25μg/ml(圖17、表9)。以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗與CD16的結合與市售賀癌平®與CD16的結合相似。
ADCC的評估
如圖18所示，由市售賀癌平®、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B所誘導的SK-BR-3細胞的最大裂解分別為64、71以及68%。該數據係以三個獨立實驗 的平均值來呈現，且細胞裂解百分比被表示為該抗體濃度(0-5000ng/ml)的函數。市售賀癌平®、以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B的EC50值，半數最大有效濃度，分別為0.57、0.28以及0.36ng/ml(表11)。這些數據顯示，這三個受測的抗HER2抗體的ADCC活性與其與NK細胞表現的CD16之結合非常相似。使用抗Id FVIII抗體作為負對照組且其並不調節顯著的細胞裂解作用。
CDC的評估
評估由該抗HER2的抗體所調節的在SK-BR-3細胞上的CDC活性。該結果顯示，由市售賀癌平®或以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗在SK-BR-3細胞上所誘導的CDC活性是相似的。
C1q蛋白的結合
以ELISA評估以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗以及市售賀癌平®/曲妥珠單抗與C1q蛋白結合的能力。結果顯示，市售賀癌平®/曲妥珠單抗以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗與人類C1q蛋白結合，如表13所示。
細胞增殖分析
評估該抗HER2抗體抑制BT-474細胞增殖的能力。於人源化的抗HER2抗體或一負對照組抗體(抗-id FVIII)的存在下72小時後測量一目標細胞增殖的百分比，並以三個分析的平均值來呈現。100%的數值對應於在沒有抗體存在下細胞增殖的量。數據呈現於圖19以及表14中。
負對照組抗體(抗-id FVIII)誘導少於10%的BT-474細胞增殖抑制作用。相較之下，將BT-474細胞與市售賀癌平®/曲妥珠單抗、以基因 轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次A以及以基因轉殖方式製造的曲妥珠單抗批次B共同培養，分別造成55、55以及50%的生長抑制。
其他具體實施例
所有在本說明書中揭露的特徵可以任何組合進行組合。在本說明書中揭露的每個特徵可以提供相同、等效或類似目的之替代特徵所置換。因此，除非另有說明，否則所揭露的每個特徵都僅為一般系列的等效或類似特徵的一個示例。
從上面之描述，本領域技術人員可以容易地確定本發明的必要特徵，且在不脫離其精神與範圍下，可對本發明以進行各種改變與修改，以使其適應各種用途及條件。因此，其他具體實施例也在申請專利範圍內。
<110> 法國分裂與生物技術實驗室
<120> 高度半乳糖基化的抗HER2抗體及其用途
<130> L0719.70006WO00
<150> 61/764488
<151> 2013-02-13
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
<210> 4
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4

Claims (48)

  1. 一種抗HER2抗體，其中該抗體為高度半乳糖基化的。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體為高度岩藻糖基化的。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含單半乳糖基化N-聚醣。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其中該抗體包含雙半乳糖基化N-聚醣。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：1，且其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：2。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體，其中該抗體為曲妥珠單抗。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體，其中該抗體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗體，其中該抗體係於基因轉殖非人類哺乳動物中製造。
  9. 如申請專利範圍第8或9項之抗體，其中該非人類哺乳動物為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體，其中該非人類哺乳動物為山羊。
  11. 一種包含如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體的組合物，進一步包含乳汁。
  12. 一種包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體的組合物，進一步包含醫藥上可接受之載劑。
  13. 一種組合物，包含：抗體群體；其中該抗體為抗-HER2抗體；以及其中在該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少50%。
  14. 如申請專利範圍第13項之組合物，其中該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少60%。
  15. 如申請專利範圍第13項之組合物，其中該群體中抗體的半乳糖基化的程度為至少70%。
  16. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之組合物，其中該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少50%。
  17. 如申請專利範圍第13至15項中任一項之組合物，其中該群體中抗體的岩藻糖基化的程度為至少60%。
  18. 如申請專利範圍第13至17項中任一項之組合物，其中該群體包含具有單半乳糖基化N-聚醣的抗體。
  19. 如申請專利範圍第13至18項中任一項之組合物，其中該群體包含具有雙半乳糖基化N-聚醣的抗體。
  20. 如申請專利範圍第13至19項中任一項之組合物，其中該群體中抗體的半乳糖基化的程度比該群體中抗體的岩藻糖基化的程度的比例為1.0至1.4之間。
  21. 如申請專利範圍第13至20項中任一項之組合物，其中該群體中抗體的至少25%含有雙半乳糖基化N-聚醣，且該群體中抗體的至少25%含有單半乳糖基化N-聚醣。
  22. 如申請專利範圍第13至21項中任一項之組合物，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：1，且其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：2。
  23. 如申請專利範圍第13至22項中任一項之組合物，其中該抗體為曲妥珠單抗。
  24. 如申請專利範圍第13至23項中任一項之組合物，其中該抗體係於非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中製造。
  25. 如申請專利範圍第13至24項中任一項之組合物，其中該抗體係於基因轉殖非人類哺乳動物中製造。
  26. 如申請專利範圍第24或25項之組合物，其中該非人類哺乳動物為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。
  27. 如申請專利範圍第26項之組合物，其中該非人類哺乳動物為山羊。
  28. 如申請專利範圍第13至27項中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含乳汁。
  29. 如申請專利範圍第13至28項中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
  30. 如申請專利範圍第24至29項中任一項之組合物，其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的補體依賴型細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)活性。
  31. 如申請專利範圍第24至30項中任一項之組合物，其中當與非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體相比時，該抗體群體具有增加的抗體依賴型細胞的細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。
  32. 如申請專利範圍第30至31項中任一項之組合物，其中該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體群體係於細胞培養物中製造。
  33. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之組合物，其中當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為50%或更低。
  34. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之組合物，其中當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為30%或更低。
  35. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之組合物，其中當與在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度相比時，該非在乳腺上皮細胞中製造的抗體的半乳糖基化的程度為10%或更低。
  36. 一種製造抗體群體的方法，包含：在非人類哺乳動物的乳腺上皮細胞中表現抗體群體，以製造抗體群體；其中該抗體為抗HER2抗體；其中在該群體中的抗體的半乳糖基化的程度為至少50%。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該乳腺上皮細胞係於培養物中，且轉染包含編碼該抗體的序列之核酸。
  38. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該乳腺上皮細胞係於以基因工程改造以在其乳腺中表現包含編碼該抗體之序列的核酸的非人類哺乳動物中。
  39. 如申請專利範圍第37或38項之方法，其中該核酸包含SEQ ID NO：3 與SEQ ID NO：4。
  40. 如申請專利範圍第36至39項中任一項之方法，其中該乳腺上皮細胞為山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬的乳腺上皮細胞。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該乳腺上皮細胞為山羊的乳腺上皮細胞。
  42. 一種製造如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或如申請專利範圍第13至35項任一項之組合物的抗體群體的乳腺上皮細胞。
  43. 一種包含如申請專利範圍第42項之乳腺上皮細胞的基因轉殖非人類哺乳動物。
  44. 一種方法，包含投與如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體或如申請專利範圍第11至35項中任一項之組合物至一需要其之個體。
  45. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該個體患有癌症。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該癌症為HER2+癌症。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該HER2+癌症為乳癌、卵巢癌、胃癌或子宮癌。
  48. 一種抗HER2的單株抗體組合物，包含在該Fc糖化作用位置(Asn297，EU編號)上具有聚醣結構的抗HER2單株抗體；其中該聚醣結構具有超過60%的半乳糖含量。
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