JP5328019B2 - 抗体依存性細胞障害活性を増強させた抗体、その調製法および使用法 - Google Patents
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Description
クリネス(Clynes)ら、2000,Nat.Med.,6:443-446 クリネス(Clynes)ら、1998,PNAS,95:652-656 ヴ(Wu)ら、1997,J.Clin.Invest.,100:1059-1070 カートロン(Cartron)ら、2002,Blood,99:754-758 トレオン(Treon)ら、2005,J.Clin.Oncol.,23:474-481 アノリック(Anolik)ら、2003,Arthritis Rheum.,48,455-459 ルイス(Louis)ら、2004,A.Phar.Ther.,19:511-519
別の実施形態では、抗体の糖質が修飾され、高マンノース型グリコシル化パターンを示す。さらに別の実施形態では、抗体の少なくともひとつの鎖がオリゴマンノースを含有し、かつ、フコシル化されないように抗体が修飾されている。また別の実施形態では、抗体の主要糖質がフコシル化されていないように抗体が修飾されている。ひとつの実施形態では、抗体の主要な糖質は、非フコシル化オリゴマンノースである。別の実施形態では、主要糖質は、フコシル化されていないMan5である。また別の実施形態では、抗体の糖質のうちでフコースを含むものは40%未満であるように修飾されている。さらに別の実施形態では、抗体の糖質のうちでフコースを含むものは30%、20%、10%またはそれ未満であるように修飾されている。 ひとつの実施形態では、フコースは1,6−フコースである。別の実施形態では、抗体の糖質のうちの少なくとも60%がフコシル化されていないオリゴマンノースであり、かつ、抗体の糖質のうちでフコースを含むものが40%未満であるように抗体が修飾されている。更なる実施形態では、抗体の糖質のうちの63%がフコシル化されていないオリゴマンノースであり、抗体の糖質のうちの16%がコアフコース含有G1Fであり、さらに、抗体の糖質のうちの21%がコアフコース含有G2Fであるように抗体が修飾されている。
(a)所望するトランスジェニック抗体をコードしている導入遺伝子DNAコンストラクトを用い、ヒト以外のほ乳類細胞にトランスフェクトし;
(b)前記導入遺伝子DNAコンストラクトがゲノム内に挿入されている細胞を選択し;さらに、
(c)1回目の核転移操作を行い、所望するトランスジェニック抗体のヘテロ接合体を作出し、それが乳汁中に発現できる、
各工程を含む。
(a)抗体を発現するように操作されたヒト以外のトランスジェニックほ乳類を提供し、
(b)ヒト以外のトランスジェニックほ乳類の乳汁中に前記抗体を発現させ;さらに、
(c)前記乳汁中に発現された前記抗体を単離する、
各工程を含む。
本発明の別の態様においては、抗体の産生法が提供され、これは、抗体を発現するように操作された乳房上皮細胞から抗体を回収し、該抗体のADCC活性を測定する工程を含む。ひとつの実施形態では、回収抗体のADCC活性を、乳房以外の上皮細胞内で発現させた抗体のADCC活性と比較する工程をさらに含む。
(a)所望するトランスジェニック抗体をコードしている導入遺伝子DNAコンストラクトを用いてヒト以外のほ乳類細胞にトランスフェクトし;
(b)細胞のゲノム内に前記導入遺伝子DNAコンストラクトが挿入されている細胞を選択し;さらに、
(c)第一の核移植工程を行い、ヒト以外のトランスジェニックほ乳類の所望のトランスジェニック抗体のヘテロ接合を作出し、それによって乳汁中に該抗体を発現できる、
各工程を含む。
(a)抗体を発現するように操作された、ヒト以外のトランスジェニックほ乳類を作出し;
(b)ヒト以外の前記トランスジェニックほ乳類の乳汁中に抗体を発現させ;さらに、
(c)乳汁中に発現された抗体を単離する
各工程を含む。
卵母細胞の供給源として適切なほ乳類には、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、ヒト以外の霊長類などが含まれる。卵母細胞は有蹄類から入手することが好ましく、ヤギまたはウシが最も好ましい。卵母細胞の単離法は当分野において周知である。基本的には、該方法は、ヤギなどのほ乳類の卵巣または生殖管から卵母細胞を単離することを含む。有蹄類卵母細胞を容易に入手できる供給源としては、ホルモン誘導した雌動物がある。遺伝子操作、核移植およびクローニングなどの技術を都合よく利用するためには、卵母細胞は、インビボで成熟していることが好ましく、その後、それらの細胞を核移植用のレシピエント細胞として利用し、精子による受精が行われて胚へと発達する。インビボで成熟した中期II相の卵母細胞が核移植技術における格好の材料として使用されている。基本的には、成熟中期II卵母細胞は、発情の開始、または、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)もしくは類似のホルモンの注射から数時間経過後の非過剰排卵個体または過剰排卵個体から外科的に採取する。
トランスジェニック技術によって動物ゲノムを修飾することにより、グリコシル化パターンが修飾された組換えタンパク質の製造に関する新たな方法が提供される。トランスジェニック家畜の乳汁中でヒト組換え薬剤を産生させることにより、微生物バイオリアクターまたは動物細胞バイオリアクターに関する問題点の多くが解決する。例えば、微生物バイオリアクターでは、翻訳後修飾が行われない、タンパク質の折りたたみが不適切である、精製コストがかかるなど、動物細胞バイオリアクターでは、元手がかかる、培養培地が高価、収率が低いなどの問題がある。本発明のいくつかの実施形態では、トランスジェニック動物の乳汁中において抗体をトランスジェニック産生することの利用を含むが、そのようなトランスジェニック動物は、該抗体分子のグリコシル化パターンを最適化するような所望する遺伝子のホモ接合である。
ハイブリドーマ由来のmRNAのシークエンシング
RNAは、Qiagen RNeasy Mini Kit(カタログ番号#74104)を用いて調製した。4日目に培養物のうちの13mlを5分間遠心分離し、PBS中に懸濁した。これを再度5分間遠心分離した。ペレットは、6μlのμ−MEを含む600μlのRNeasy RLT中に再懸濁した。溶解物は、22gの針に5回通し、600μlの70%EtOHを加えて混合した。700μlのアリコートをRNeasyカラムに2回かけ、30秒間遠心分離し、700μlのRW1で洗浄した。これを500μlのPPEで2回洗浄し、1分間乾燥させ、さらに、50μlの水で2回溶出させた。
IgGの4つの主要サブクラスに対するヒト定常領域配列を含む導入遺伝子発現ベクターを構築した。これらのベクターは、乳房特異的導入遺伝子発現を確実に行わせるためのヤギβ−カゼインプロモーター、ならびに、その他の5'および3'制御配列を有する。キメラ抗体変異体は、マウス抗ヒトCD137抗体の可変領域を挿入することによって構築した。マウスの抗CD137 H鎖およびL鎖は、対応する可変領域をシークエンシングすることによって確認した。マウス免疫グロブリンの多様なファミリーに属する5'コード領域由来の配列を表すオリゴヌクレオチドの集団を整理した。マウス免疫グロブリンの配列は、個々に、5'プライマーとして使用し、ハイブリドーマRNAから調製したcDNAを増幅させ、さらに、得られたPCR生成物をクローニングおよびシークエンシングした。3'PCRプライマーは、定常領域の既知の配列から調製した。PCRプライマーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいたことから、得られた増幅配列は、発現ベクターに挿入できた。これらの配列をコンストラクトに挿入し、キメラタンパク質をコードしている遺伝子を作成した。
上述の方法に従って得られた可変領域を用い、ヒトIgG1抗体内のヒト可変領域を置換した。本発明のひとつの実施形態では、IgG1発現ベクター内のヒト可変領域配列をマウスの可変領域配列と一緒に使用することにより、キメラヒト化抗体を作出した。 抗体発現ベクターは、天然のグリコシル化可能な型のIgG1 H遺伝子を含んでいた。IgG1グリコシル化部位は、CH2ドメイン内の297番の位置にあるAsn残基である。IgG1 H鎖の非グリコシル化型は、遺伝子配列内の部位特異的突然変異によってAsn297をGln297に変えることによって作成した。これによって3つのコンストラクトが得られた:L鎖、グリコシル化H鎖および非グリコシル化H鎖である。各コンストラクトの2つの型を用いて試験を行った。各コンストラクトは、制限酵素マッピングおよびサザンブロット分析によって評価し、トランスジェニック動物の作出に使用した。さらに、コンストラクトを一過性トランスフェクション実験に使用し、遺伝子操作したキメラタンパク質の生物活性を調べた。
重鎖キメラの構築を目的として、マウスIgG2a定常領域をヒトIgG1定常領域で置換したが、このとき、マウスリーダー配列を伴ったヒト抗体配列を含むBC2083発現ベクターを使用した(プラスミド1)。スプライスドナーサイトは、GからAへのサイレント突然変異によって排除した。サイレント突然変異とは、C末端付近のグリシンに対するコードを変化させない突然変異である。可変領域付近にあるBC2083発現ベクターにユニーク部位を入れた。N末端にDraIIIおよびPmIIIを導入し、ApaIは、重鎖定常領域のアミノ部分中に存在している。これらの遺伝子は、プライマーを用い、CMV-Zeo由来のzeo遺伝子をPCRすることによってBC2083のXhoI部位にクローニングし、p80 BC2083 zeo(プラスミド2)を得た。制限酵素部位をプラスミドに速やかに挿入するこの方法は、zeo遺伝子によって供与されるゼオシン耐性を利用したものである。ゼオシン耐性については、NZYCM寒天中、25μg/mlのゼオシンを用いて選択した。
軽鎖用には、発現ベクターとしてBC1060(プラスミド6)を使用した。可変領域をヒトκ定常領域へ融合させることを目的として、マウスのJ領域に2つの制限酵素部位を順に作出した。KpnI部位は、グリシンに対するコドンをGGGもしくはGGCからGGTに変えることによって導入した。ロイシンに対するコード配列は、CTGからCTTに変えることによってHindIII部位を作出した(プラスミド8)。
軽鎖用の一過性発現ベクターの構築を目的として、p104 BC1060 LC chim(プラスミド11)由来のXhoIフラグメントをpCEP4のXhoI部位に連結することにより、p106およびp107 pCEP4-Mayo-LC(#2203)(プラスミド12)を得た。陽性コロニーは、オリゴCEPFおよびKVCを用いたPCRによって検出した。
使用した抗CD137抗体は、マウス乳汁中に発現された。マウスで発現させるために、BC2197(p100 BC2083 heavy)および(BC2198)p104 BC1060軽鎖に使用した構築技術を利用した。同様に、親プラスミドは、重鎖に対してはBC2083を、軽鎖用にはBC1060を使用した。基本的には、親プラスミドのリーダー配列を含む可変領域は、抗CD137抗体cDNAの重鎖および軽鎖の可変領域由来のcDNA配列よ交換した。発現ベクターの定常領域は、重鎖はIgG1に、および軽鎖はκ鎖に、クローニングした配列で置換した。
使用した抗体の重鎖は、インビトロジェン(Invitrogen)社から購入したcDNAからクローニングした。PfuTurboを用いたPCRは、胎盤cDNAおよび以下に示すプライマーを用いて行った。C末端プライマー61960C11は、野生型配列と比較すると塩基が変化しており、スプライス供与部位が破壊されている。993pのフラグメントをZeroBluntにクローニングした。配列は、Glm(3)からなるひとつの配列であることを示していた。ヒト血清由来のγグロブリンに関しては、継承的な差異がある(グラブ(Grubb)、1956;グラブ(Grubb)およびローレル(Laurell)、1956)。Kmに関しても同様な系がある(κマーカー、以前はInvと称されており、eInhibitrice Virmiを表す)。これは、コーカサス系アロタイプGlm(f)またはGlm(3)であり、出発プラスミド中に見出されたようなアフリカ系アロタイプGlm(z)またはGlm(17)の代わりである。
ヤギ皮膚の新鮮な生検サンプル由来の線維芽細胞は、インビトロ一次培養で維持した。概説すると、Ca++不含およびMg++不含リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で皮膚サンプルを細かく刻み、EDTA中、希釈トリプシンを用いて採収して細胞1つずつの懸濁液にし、37℃で培養した。コンフルエント細胞をトリプシン処理し、継代培養した。細胞のアリコートは、将来的な使用に備えて液体窒素中で低温保存した。
トランスフェクトした細胞は、導入遺伝子(例えば、β−カゼイン、キメラ抗CD137HおよびL鎖のcDNAなど)に対する特異的プローブを用いたサザンブロット分析によって特性付けを行い、導入遺伝子のコピー数を確認し、再配列の可能性を判断した。各細胞系はFISH法による分析も行い、単一組込みを確認し、染色体の位置を決定した。細胞遺伝学的分析を行って細胞系の核型を確認した。
間期FISH法については、拡張した各コロニー由来の数百個の細胞をフィルター上に固定し、ハイブリダイゼーションを行って導入遺伝子特異的ジゴキシゲニンラベルプローブを増幅させた。中期FISH法については、細胞をLab Tek Chamber slides(ヌンク(Nunk)社、ニューヨーク州ロチェスター)上で培養し、5−ブロモ−2'−デオキシウリジン(BrdU)を用いて複製バンディングを行った。プローブの結合は、FITC−コンジュゲート抗ジゴキシゲニンで検出し、染色体は、4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)を用いて交差染色した。画像は、Zeiss Axioskop microscope(ツァイス・イメージング(Zeiss Imaging)、米国ニューヨーク州ソーンウッド)、Hamamatsu digital camera(ハママツ(Hamamatsu)、米国ニューヨーク州ブリッジウォーター)、およびImage Pro-Plus software(メディア・サイバネティクス(Media Cybernetics)、米国メリーランド州シルバー・スプリングス)を用いて捉えた。大多数のプローブは比較的大きく、検出が容易であった。個々のIgG H鎖およびL鎖に対するプローブは、比較的短いcDNA配列によってコードされており、それ自身で良好な解析を得るには小さすぎた。これらの小さいプローブは、ヤギβ−カゼインに対する乳汁特異的プロモーター由来の配列と混合した。
ドナートランスフェクト繊維芽細胞系について細胞遺伝学的分析を行った。導入遺伝子プローブは、ニック翻訳により、ジゴキシゲニン−dUTPを用いてラベルした。変性染色体に結合するプローブは、FITC−コンジュゲート抗ジゴキシゲニンまたはホースラディッシュパーオキシダーゼ−コンジュゲート抗ジゴキシゲニンを用い、次にFITC−コンジュゲートチラミドを使用することによって検出した。染色体結合パターンは、DAPIを用いて可視化した。ヤギには60個の染色体があり、それらはすべて端部動原体型(動原体が中心寄りではなく一方の末端に存在する)である。中期の展開に関して、染色体の消失、重複もしくは大量の再配列などの大きな異常の出現を調べた。トランスジェニックヤギの第一世代を作出するために使用した細胞系は、核型としては正常であり、β−カゼイン御プロモーターおよびその他の基本的調節要素と共に、構造的に完全な形のキメラ抗CD137H鎖およびL鎖遺伝子を有していた。
キメラ抗ヒトCD137抗体のグリコシル化型および非グリコシル化型を作成した。生物活性の試験に十分な量の抗体を乳汁から精製した後、それらは基本的に同レベルで産生されたものの、2つの型の活性特性は異なっていることがわかった。
トランスジェニックマウス内で誘導可能な系の可能性を調べるための実際的な方法としては、第一世代(F1)マウスの乳汁中に発現されたトランスジェニックタンパク質を評価することが挙げられる。数種のトランスジェニック動物では、マイクロインジェクション後、元になる導入遺伝子コンストラクトが細胞分裂中に染色体部位に組み込まれることが確認されている。故に、始祖個体はキメラであり、導入遺伝子の発現レベルに影響を与えることができる。これらの染色体組み込み部位は、次世代で分離し、安定で均質なトランスジェニック動物系が形成される。故に、F1マウスは、導入遺伝子の発現、およびそれらが産生する生物学的生成物の安定性を決定するためにふさわしいモデルである。さらに、マウスに乳汁を分泌させるためには、それらを成熟させ(約2ヶ月を要する)、交尾させ、出産させねばならない。分析後、分泌レベルが安定しており、使用したコンストラクトが有効であったことを判断する。
予め規定した遺伝子を有するトランスジェニックヤギは、当分野で日常的に行われている核移植技術を用いて作出した。核移植では、最初の数世代でみられる導入遺伝子モザイク現象に伴う問題を排除できるが、これは、導入遺伝子細胞系由来のすべての動物が十分に遺伝子転換されていなければならないからである。導入遺伝子コンストラクトは、標準的なトランスフェクト法(例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなど)で一次細胞系に導入した。組換え一次細胞系については、導入遺伝子のコピー数、組込みおよび組込み部位などの重要な性質についてインビトロでスクリーニングを行った後、トランスジェニック動物の作出に使用した。雌のヤギ皮膚繊維芽細胞を用い、トランスフェクトされたトランスジェニック細胞を作り、これを核移植用の核ドナーとして使用し、すべて雌の子を得た。故に、組換えタンパク質を含む乳汁は、F0ヤギから直接得られた。乳汁中の生物活性生成物の相対および絶対レベルはウェスタンブロット分析によって測定した。
抗体の精製および特性付け
4つの別異のキメラ抗CD137抗体を作成した。ひとつの変異体は、Asn297をグルタミンに突然変異させることによって非グリコシル化した。この抗体変異体は、作用試験において負の対照としたが、これは、非グリコシル化IgGsはFcレセプターに結合しない、またはADCCにおいて不活性であることが知られているからである(ノーズ(Nose)ら、1983)。別の2つの変異体は乳汁から調製し、ひとつはマウス乳汁由来、もうひとつはヤギ乳汁由来であった。4番目の抗体変異体は、ヒト細胞系HEK 293細胞内で発現させた。
アスパラギン結合オリゴ糖類は、1%のβ−メルカプトエタノール含有の50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中、PNGaseを用い、37℃で一晩かけて解離させた。サンプルは、Voyger-DE PRO Biospectrometory Workstation(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社、米国カリフォルニア州フォスターシティ)を用い、マトリックス補助レーザー着脱イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)マススペクトロメトリー(MS)分析によって分析した。MALDI-TOF MS分析は、陽イオン中、反射モードで2,5−ジヒドロキシ安息香酸/2−ヒドロキシ−5−メトキシ安息香酸(9:1、v/v)マトリックスを用いて行った。マウス乳汁由来抗体中の主要糖質(63%)は、非フコシル化Man5であった。図1は、PNGase F分解によって酵素から解離されたN−グリカン類のMALDI-TOF MS分析を示している。マウス乳汁由来の抗体から得られた結果と細胞培養由来の抗体から得られたそれを比較すると、マウス乳汁由来の抗体の主要オリゴ糖はMan5であることが明かである。Man5は、5マンノース残基および2GlcNAc残基を有する。
ことが知られている(チトラル(Chitlaru)ら、2002;チトラル(Chitlaru)ら、1998)。
キメラ抗体の別異の型の結合については、FACS分析によって評価した。5%FBS含有PBS中、1μg/mlの抗体を加えて2×105個の細胞をインキュベートした。抗体は、1:100希釈したFITCラベルヤギ抗ヒトFc(ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラブス(Jackson Immuno Research Labs))を用いて検出し、FACSCalibur(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))によって分析した。図5に示すデータは、試験したすべての抗体は、起源によらず同様に抗原に結合したことを示している。抗DNP抗体の対照は、予想通り結合しなかった。
CD16aを用いたIgG1の相互作用の動態は、BIAcore 2000装置およびCM5センサーチップ(バイオコア(BIOCORE)、スウェーデン国ウプサラ)上での表面プラスモン共鳴によって測定した。NHS/EDCカップリング条件を用いてチップ上に抗HPC4抗体を固定した。抗体濃度をpH5.0において20〜50μg/mlにすることにより、11,000RUのチップが得られた。30μg/mlのタンパク質を3分間かけて注入し、0.15MのNaClおよび0.005%(v/v)のP20界面活性剤を含むpH7.4の10mM Hepes緩衝液(HBS-P緩衝液、BIA core AB)に1mMのCaCl2を添加した溶液を流速5μl/分で流すことにより、CD16a-HPC4がこの抗体表面に捕獲された。次に、被験抗体を上記の結合緩衝液で希釈して濃度を50μg/mlとし、流速を20μl/分として、捕獲されたCD16a上に1分間かけて注入した。解離は3分間モニターした。次に、HBS-P緩衝液中で調製した5mMのEDTAを3分間注入することによって該表面を変性させた後、次の捕獲−結合−変性のサイクルに移行した。図13は、乳汁由来の抗体が細胞由来の抗体よりも結合力が強いことを示している。この増強されたADCC活性は、NK細胞レセプターであるCD16に対する親和性の上昇を反映したものであるのかを確認するために、測定を行った。表面プラスモン共鳴測定を用い、固定されたCD16に対するの多様な抗体の結合を測定した。乳汁由来抗体は、細胞由来抗体よりも結合が強かった(図13)。
ヒト腎癌細胞786-Oおよびヒト胚生腎(HEK)293細胞はATCCから購入した。786-Oは、腎細胞腺癌由来の癒着性上皮細胞である(ウィリアムズ(Williams)ら、1978,In Vitro,14:779-786)。細胞は、1.5g/Lの炭酸ナトリウム、4.5g/L のグルコース、10mMのHEPESおよび10mMのピルビン酸ナトリウムを含有するように調製した2mMのL−グルタミン添加RPMI 1640培地(90%)+ウシ胎仔血清(FBS)(10%)中で増殖させた。
乳汁由来抗体および細胞培養由来抗体の相対ADCC活性を調べることを目的として、起源を異にする同一の抗体を調製した。4つの別異の型のキメラ抗CD137抗体を調製した。ひとつの変異体は、Asn297をグルタミンに突然変異させることによって非グリコシル化されていた。この抗体変異体は負の対照としたが、これは、非グリコシル化IgGsはFcレセプターに結合しない、またはADCCにおいて不活性であることが知られているからである(ノーズ(Nose)ら、1983,PNAS 80:6632-6636)。別の2つの変異体は乳汁から調製し、ひとつはマウス乳汁由来、もうひとつはヤギ乳汁由来であった。4番目の抗体変異体は、一過性にトランスフェクトしたヒト細胞系HEK 293細胞内で発現させた。
Claims (24)
- 抗体のADCC活性を増強させる方法であって、
非ヒトほ乳類の乳房上皮細胞において抗体を産生させることにより、前記抗体のグリコシル化を修飾する工程を含み、
前記抗体がIgGアイソタイプであること、及び、乳房以外の上皮細胞で発現される抗体と比較してADCCが増強されることを特徴とする方法。 - 前記ほ乳類乳房上皮細胞が、乳汁中に抗体を発現するように操作された非ヒトほ乳類に由来することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記抗体が、抗体鎖の少なくとも1本がフコースを含まないように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記抗体が、抗体鎖の1本がフコースを含まないように修飾されることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 前記抗体が、オリゴマンノースまたは追加のオリゴマンノースを含むように修飾されることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 前記抗体が、オリゴマンノースまたは追加のオリゴマンノースを含むように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の糖鎖が高マンノース型グリコシル化パターンを示すように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記抗体が、抗体鎖の少なくとも1本がオリゴマンノースを含みかつフコシル化されていないように修飾されることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 前記抗体が、抗体鎖の1本がオリゴマンノースを含み、かつフコシル化されていないように修飾されることを特徴とする請求項8記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の主要糖鎖がフコシル化されていないように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記主要糖鎖が、非フコシル化オリゴマンノースであることを特徴とする請求項10記載の方法。
- 前記主要糖鎖が、非フコシル化Man5であることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の糖鎖の40%未満がフコースを含むように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の少なくとも30%が少なくとも1つのオリゴマンノースを有するように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 増強されたADCC活性を有する抗体を生産する方法であって、
(a)乳汁中に抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニックほ乳類の乳汁から抗体を回収し、さらに
(b)前記抗体のADCC活性を測定する、
工程を含み、乳房以外の上皮細胞で発現される抗体と比較してADCCが増強されることを特徴とする方法。 - (c)前記回収した抗体のADCC活性を、細胞培養中に発現された抗体のADCC活性と比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニックほ乳類が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはリャマであることを特徴とする請求項16記載の方法。
- 増強されたADCC活性を有する抗体を生産する方法であって、
(a)抗体を発現するように操作された非ヒト哺乳類の乳房上皮細胞から抗体を回収し、
(b)前記抗体のADCC活性を測定する、
工程を含み、乳房以外の上皮細胞で発現される抗体と比較してADCCが増強されることを特徴とする方法。 - (c)前記回収した抗体のADCC活性を、乳房以外の上皮細胞内で発現された抗体のADCC活性と比較する工程をさらに含むことを特徴とする請求項18記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の少なくとも40%、50%、60%または70%が少なくとも1つのオリゴマンノースを含むように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記オリゴマンノースが、Man5、Man6、Man7およびMan8から選択されることを特徴とする請求項14または20記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳類の乳房上皮細胞が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはリャマ由来であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記抗体が、該抗体の糖鎖の50%、40%、30%、20%、10%または5%未満がフコースを含むように修飾されることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 細胞培養に由来する抗体または乳房以外の上皮細胞に由来する抗体と比較してIgGアイソタイプの抗体のADCC活性を増強させるための非ヒト哺乳類の乳房上皮細胞の使用方法であって、前記乳房上皮細胞が、乳汁中に抗体を発現するように操作された非ヒト哺乳類の細胞であり、該乳房上皮細胞において抗体を産生させることにより、前記抗体のグリコシル化パターンが修飾されることを特徴とする使用方法。
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